JP2003533223A - Cell line expressing α2δ2 calcium channel subunit - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットと結合する化合物の結合能力を決定する方法が開示される。本方法は、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを提供し、前記サブユニットを前記化合物と接触させ、さらに前記サブユニットと結合する前記化合物の結合能力を決定することを含む。   (57) [Summary] Disclosed are methods for determining the binding ability of a compound that binds to the α2δ2 subunit of a calcium channel. The method includes providing an α2δ2 subunit of a calcium channel, contacting the subunit with the compound, and determining the binding ability of the compound to bind to the subunit.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 本発明は、電圧依存カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを発現する細
胞株に関する。本発明では、前記細胞株はまた別のカルシウムチャネルサブユニ
ットを発現することができ、さらに前記細胞とガバペンチン、ガバペンチン類似
体、プレガバリンまたはプレガバリン類似体との結合を決定（determine）でき
る。The present invention relates to cell lines expressing the α2δ2 subunit of voltage-dependent calcium channels. In the present invention, the cell line may express another calcium channel subunit and may further determine the binding of the cell with gabapentin, a gabapentin analog, pregabalin or a pregabalin analog.

【０００２】[0002]

【従来記述】[Conventional description]

電圧依存性カルシウムチャネルは、生理学的プロセス、例えば神経伝達物質の
放出、ホルモンの分泌、筋収縮、および遺伝子転写と関連付けられてきた。機能
的チャネルは少なくとも３つのサブユニット（α１、α２δおよびβサブユニッ
トを含む）を必要とする。前記チャネルはまたγサブユニットを含むことができ
る。電圧依存カルシウムチャネルには、電気生理学的性質および薬理学的特性を
基準に定義されたいくつかの公知のタイプが存在する。前記タイプは、Ｌ−、Ｎ
−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−およびＴ−タイプである。各々のタイプは、主としてそのチ
ャネル組成によって定義される。α１サブユニットタイプは、チャネルがＬ−、
Ｎ−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−またはＴ−タイプのいずれであろうと、そのチャネル決定
基に含まれている。α１サブユニットの活性は、α２δおよびβサブユニットに
よって調節される。チャネル活性はさらに第四のサブユニットγによって調節さ
れることがある。Voltage-gated calcium channels have been associated with physiological processes such as neurotransmitter release, hormone secretion, muscle contraction, and gene transcription. Functional channels require at least three subunits, including α1, α2δ and β subunits. The channel can also include a gamma subunit. There are several known types of voltage-dependent calcium channels defined on the basis of their electrophysiological and pharmacological properties. The type is L-, N
-, P / Q-, R- and T-types. Each type is defined primarily by its channel composition. The α1 subunit type has a channel of L-,
Whether of the N-, P / Q-, R- or T-type is included in the channel determinant. The activity of the α1 subunit is regulated by the α2δ and β subunits. Channel activity may be further regulated by the fourth subunit γ.

【０００３】 分子生物学的技術によって、電圧依存カルシウムチャネルの作用メカニズムの
解明が可能になった。前記サブユニットの各々の遺伝子が単離されクローニング
された。これまでのところ、異なるα１サブユニットをコードする９つの遺伝子
が知られている。α１サブユニットはカルシウムイオンが通過するポアを形成す
る。α１サブユニットは電圧センサーを含み、これはまたチャネルタイプと密接
な関係を有するある種の薬剤または毒素との特異的結合の原因となるものである
。α１ポアを通過するチャネル電流は、β、γまたはα２δサブユニットの会合
によって調節される。弁別的にスプライスされる４つの細胞内βサブユニット遺
伝子が存在する。トランスメンブレンγサブユニットについては２つの遺伝子が
知られており、１つは骨格筋に、新規な遺伝子は脳で発現される。α２δは、最
初ただ１つのアイソフォームが特定されただけであった。しかしながら、最近、
２つの新規なα２δ遺伝子、α２δ２およびα２δ３が特定された。これら遺伝
子は、最初のα２δ１遺伝子に対して５５．６％および３０．３％の相同性を有
する（Klugbauer et al., J. Neuroscience 19(2):684-691(1999)）。α２およ
びδタンパク質は同じ遺伝子よって発現される。このタンパク生成物は翻訳後に
切断され、最終的なα２およびδタンパク質はジスルフィド結合によって連結さ
れる。トランスメンブレンδタンパク質はα２タンパク質を細胞膜に固定する。Molecular biology techniques have made it possible to elucidate the mechanism of action of voltage-dependent calcium channels. The gene for each of the subunits was isolated and cloned. So far, nine genes encoding different α1 subunits are known. The α1 subunit forms a pore through which calcium ions pass. The α1 subunit contains a voltage sensor, which is also responsible for the specific binding of certain drugs or toxins that are closely related to channel type. Channel currents through the α1 pore are regulated by the association of β, γ or α2δ subunits. There are four intracellular β subunit genes that are differentially spliced. Two genes are known for the transmembrane γ subunit, one is expressed in skeletal muscle and the new gene is expressed in the brain. α2δ was initially the only isoform identified. However, recently
Two new α2δ genes have been identified, α2δ2 and α2δ3. These genes have 55.6% and 30.3% homology to the original α2δ1 gene (Klugbauer et al., J. Neuroscience 19 (2): 684-691 (1999)). The α2 and δ proteins are expressed by the same gene. This protein product is post-translationally cleaved and the final α2 and δ proteins are linked by disulfide bonds. The transmembrane delta protein anchors the alpha2 protein to the cell membrane.

【０００４】 研究では、α２δ１サブユニットは、鎮痙薬、ガバペンチン［１−（アミノメ
チル）シクロヘキサン酢酸］に対する結合部位を含んでいることが示されている
（Gee et al., J. Biol. Chem. 271(10):5786-5776(1996)）。ガバペンチンは、
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）類似体である。ガバペンチンは、癲癇治療および発
作頻度の減少で動物モデルおよびヒトの患者の両方において有効である。ガバペ
ンチンの正確な作用メカニズムは不明のままである。最近の実験で、ガバペンチ
ンはまたα２δ２サブユニットにも結合することが示された。Studies have shown that the α2δ1 subunit contains a binding site for the antispasmodic, gabapentin [1- (aminomethyl) cyclohexaneacetic acid] (Gee et al., J. Biol. Chem. 271 (10): 5786-5776 (1996)). Gabapentin is
It is a γ-aminobutyric acid (GABA) analog. Gabapentin is effective both in animal models and in human patients in treating epilepsy and reducing seizure frequency. The exact mechanism of action of gabapentin remains unclear. Recent experiments have shown that gabapentin also binds to the α2δ2 subunit.

【０００５】 機能的チャネルは、細胞内でカルシウムチャネルサブユニットを発現させるこ
とによって形成させることができる。この技術は、チャネルの作用に対する種々
の分子の影響を決定するために役立つ。米国特許5,712,158号および米国特許5,7
70,447号には、ガバペンチンのカルシウムチャネルサブユニットとの結合特性を
解明するために有用な安定な細胞株が記載されている。前記細胞株はβサブユニ
ットおよび最初のα２δ（今はα２δ１と称される）を高レベルで発現する。細
胞に任意のα１サブユニットをトランスフェクトすることによって、機能的なカ
ルシウムチャネルの形成がもたらされ、このカルシウムチャネルは、ガバペンチ
ンおよびガバペンチン関連化合物の結合の評価に用いることとができる。Functional channels can be formed by expressing calcium channel subunits intracellularly. This technique serves to determine the effect of various molecules on the action of channels. US Patent 5,712,158 and US Patent 5,7
No. 70,447 describes stable cell lines useful for elucidating the binding properties of gabapentin to calcium channel subunits. The cell line expresses high levels of the β subunit and the initial α2δ (now referred to as α2δ1). Transfection of cells with any α1 subunit results in the formation of functional calcium channels that can be used to assess binding of gabapentin and gabapentin-related compounds.

【０００６】 本発明の目的は、カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを安定に発現する
新規な細胞株を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ガバペンチン
、ガバペンチン類似体、プレガバリン、プレガバリン類似体、およびＧＡＢＡの
３−アルキル誘導体とα２δ２サブタイプとの特異的結合を説明することである
。An object of the present invention is to provide a novel cell line that stably expresses the calcium channel α2δ2 subunit. Yet another object of the present invention is to describe the specific binding of gabapentin, gabapentin analogs, pregabalin, pregabalin analogs, and 3-alkyl derivatives of GABA with the α2δ2 subtype.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】[Problems to be Solved by the Invention]

本発明は、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットへの化合物の結合能力
を決定する方法を提供するもので、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニット
を用意し、前記α２δ２サブユニットを前記化合物と接触させ、そして前記化合
物の前記α２δ２サブユニットとの結合能力を決定することを含む。The present invention provides a method for determining the binding ability of a compound to the α2δ2 subunit of a calcium channel, which comprises providing the α2δ2 subunit of a calcium channel, contacting the α2δ2 subunit with the compound, and Determining the binding ability of the with the α2δ2 subunit.

【０００８】図面の説明 図１は、ヒトα２δ２のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでの分子クローニング
の模式図である。 図２は、ヒトα２δの組織分布のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ヒトの種々の組織
に由来する１ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡ（CLONTECH）をＰＣＲ（９４℃で１分、５５
℃で１分および７２℃で２分を３５サイクル）で増幅した。作製したＰＣＲ生成
物は、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）のＤＮＡフラグメン
トである。DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a schematic drawing of the molecular cloning of human α2δ2 in the pCDNA3.1 expression vector. FIG. 2 shows RT-PCR analysis of the tissue distribution of human α2δ. PCR was performed using 1 ng of double-stranded cDNA (CLONTECH) derived from various human tissues (1 minute at 94 ° C., 55 minutes).
Amplification was carried out at 35 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes). The generated PCR products were 958 to 2165 (hα2δ1) and 2534 to 3643 (hα2δ2).
) And 1920 to 3272 nucleotides (hα2δ3) DNA fragment.

【０００９】 図３は、ヒトα２δの組織分布のノザンブロット分析を示す。ノザンブロット
は材料と方法の項で述べたように実施した。ヒトマルチ組織ブロット（CLONTECH
）を、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）から合成したジゴキ
シゲニン標識ｃＤＮＡでハイブリダイズさせた。マーカーＲＮＡの位置は左に表
示されている。FIG. 3 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ. Northern blots were performed as described in Materials and Methods. Human Multi Tissue Blot (CLONTECH
) From 958 to 2165 (hα2δ1) and 2534 to 3643 (hα2δ2)
) And 1920 to 3272 nucleotides (hα2δ3) synthesized with digoxigenin-labeled cDNA. The position of the marker RNA is indicated on the left.

【００１０】 図４は、ヒトおよびマウスα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す
。種々のヒト組織（Ａ，０．５μｇ）およびマウス組織（Ｂ，１００μｇ）の膜
タンパク質を４％から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NOVEX）にロードし、ウェス
タンブロット分析に付した（材料と方法の項を参照されたい）。抗α２δモノク
ローナル抗体またはα２δ２およびα２δ３に対するポリクローナル抗体をプロ
ーブとして用いてブロットを分析した。FIG. 4 shows a Western blot analysis of the tissue distribution of human and mouse α2δ. Membrane proteins of various human tissues (A, 0.5 μg) and mouse tissues (B, 100 μg) were loaded on 4% to 20% SDS-PAGE (NOVEX) and subjected to Western blot analysis (see Materials and Methods). See section). Blots were analyzed using anti-α2δ monoclonal antibodies or polyclonal antibodies against α2δ2 and α2δ3 as probes.

【００１１】 図５は、α２δｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の膜と［³Ｈ
］ガバペンチンとの結合を示す。ｐｃＤＮＡ３．１（コントロール）、ｐｃＤＮ
Ａ３．１／ブタα２δ１構築物（ｐα２δ１）、およびｐｃＤＮＡ３．１／ヒト
α２δ２構築物（ｈα２δ２）の２０μｇをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクト
した。膜は、［³Ｈ］ガバペンチン結合アッセイ（材料と方法の項を参照された
い）用に調製した。データは、別個の３アッセイ（各測定についてそれぞれ３組
ずつ）の平均である。材料と方法の項で述べたように、同じ膜（１００μｇ）を
対応する抗体によるウェスタンブロット分析に付した。FIG. 5 shows the membrane of COS-7 cells transfected with α2δ cDNA and [ ³ H
] It shows the binding with gabapentin. pcDNA3.1 (control), pcDN
COS-7 cells were transfected with 20 μg of the A3.1 / porcine α2δ1 construct (pα2δ1) and the pcDNA3.1 / human α2δ2 construct (hα2δ2). Membranes were prepared for the [ ³ H] gabapentin binding assay (see Materials and Methods section). Data are the average of 3 separate assays (3 sets for each measurement). The same membranes (100 μg) were subjected to Western blot analysis with the corresponding antibodies as described in the Materials and Methods section.

【００１２】 図６は、α２およびδサブユニット間のジスルフィド結合の破壊を示す。各サ
ンプル（ｐα２δ１は０．５μｇおよびｈα２δ２は５μｇ）の膜タンパク質の
等量を１００ｍＭのＤＴＴの存在下または非存在下で１０分間インキュベートし
、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロット
は、抗α２δ１抗体（左）または抗α２δ２抗体（右）のいずれかをプローブと
して分析した。マーカータンパク質の位置は右に表示されている。FIG. 6 shows the disruption of disulfide bonds between the α2 and δ subunits. Equal amounts of membrane proteins of each sample (0.5 μg for pα2δ1 and 5 μg for hα2δ2) were incubated for 10 minutes in the presence or absence of 100 mM DTT, separated by non-reducing SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. . Blots were analyzed with either anti-α2δ1 antibody (left) or anti-α2δ2 antibody (right) as probes. The position of the marker protein is displayed on the right.

【００１３】 図７は、ブタα２δ１（Ａ）およびヒトα２δ２（Ｂ）を過剰産生しているＨ
ＥＫ２９３細胞の膜と［³Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャー
ド分析を示す。細胞膜は、ＧＫＳ０２（ブタα２δ１のための安定な細胞株）お
よびＧＫＳ０７（ヒトα２δ２のための安定な細胞株）から調製した。特異的な
［³Ｈ］ガバペンチン結合は材料と方法の項で述べたように実施した。結合活性
は、タンパク質１ｍｇ当たりの結合ガバペンチンのピコモルとして表した。各結
合反応は、２０μｇのＧＫＳ０２膜タンパク質または１０μｇのＧＫＳ０７膜タ
ンパク質を含んでいた。データは３アッセイの平均である。FIG. 7 shows H overproducing porcine α2δ1 (A) and human α2δ2 (B).
Scatchard analysis of the binding of [ ³ H] gabapentin (GBP) to the membrane of EK293 cells is shown. Cell membranes were prepared from GKS02 (stable cell line for porcine α2δ1) and GKS07 (stable cell line for human α2δ2). Specific [ ³ H] gabapentin binding was performed as described in Materials and Methods. Binding activity was expressed as picomoles of bound gabapentin per mg of protein. Each binding reaction contained 20 μg GKS02 membrane protein or 10 μg GKS07 membrane protein. Data are averages of 3 assays.

【００１４】 図８は、［³Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）結合活性による細胞株のスクリーニ
ングを示す。ＨＥＫ２９３細胞にヒトα２δ２をトランスフェクトした。単一ク
ローンをＧ４１８耐性によって選別した。“２９２３”は親細胞ＨＥＫ２９３で
あり、“２Ｌ”は、ブタα２δ１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞であ
る。FIG. 8 shows screening of cell lines for [ ³ H] gabapentin (GBP) binding activity. HEK293 cells were transfected with human α2δ2. Single clones were selected by G418 resistance. “2923” is the parental cell HEK293 and “2L” is the HEK293 cell stably expressing porcine α2δ1.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

本明細書で用いられるように、ガバペンチン類似体には、アルキル置換ガバペ
ンチン類似体、橋かけガバペンチン類似体および複素環式ガバペンチン類似体（
例えばBryans et al.（J. Med. Chem. 41:1838-1845(1998)が記載したようなも
の）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。 類似体とは、“同様な電子
構造をもつが異なる原子を有する化合物”と定義される（Grant et al., Chemic
al Dictionary, 5^th ed., McGraw-Hill, 1987）。ガバペンチンは以下の構造を
有する：As used herein, gabapentin analogs include alkyl-substituted gabapentin analogs, bridged gabapentin analogs and heterocyclic gabapentin analogs (
Examples include, but are not limited to, Bryans et al. (As described by J. Med. Chem. 41: 1838-1845 (1998)). Analogues are defined as "compounds with similar electronic structure but different atoms" (Grant et al., Chemic
al Dictionary, 5 ^th ed., McGraw-Hill, 1987). Gabapentin has the following structure:

【化１】 [Chemical 1]

【００１６】 ガバペンチン類似体の例は上掲書（Bryans wet al.）に記載されてあり、以下
が含まれる（ただしこれらに限定されない）： 下記の構造を有する分子：Examples of gabapentin analogs are described in Bryans wet al., Supra, and include (but are not limited to): Molecules having the structure:

【化２】 [Chemical 2]

【００１７】 この類似体は、シクロヘキサン環の３位でアルキル化される。類似体は、１か
ら４つの炭素原子を有するアルキル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されて
あってもよい。類似体はまた、下記の構造を有する分子であってもよい：This analog is alkylated at the 3-position on the cyclohexane ring. The analogue may be alkylated at any position on the carbocycle with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. The analog may also be a molecule having the structure:

【化３】 [Chemical 3]

【００１８】 この類似体はガバペンチン環の３位でアルキル置換される。 このタイプの分子には、プレガバリン[0018]   This analog is alkyl substituted at the 3-position on the gabapentin ring.   This type of molecule includes pregabalin

【化４】 その類似体、およびＧＡＢＡの３−アルキル誘導体が含まれる。[Chemical 4] Included are analogs thereof, and 3-alkyl derivatives of GABA.

【００１９】材料と方法 ブタα２δ１（ｐα２δ１）ｃＤＮＡは、J. Brown（J.P. Brown, V.U.K. Di
ssanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem., 255:236-243(1
998)）から入手したものである。マウスα２δ３（ｍα２δ３）ｃＤＮＡは、F.
Hoffman（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. Marais, M. Hobom, F. Hofmann, J.
Neurosci. 19:684-691(1999)）から分与された。α２δ１に対するモノクロー
ナル抗体は Afinity Bioreagents, Inc. から購入した。α２δ２およびα２δ
３に対するポリクローナル抗体は、Sanra Duffy（Pfizer）から入手したもので
ある。ヒトおよびマウスのマルチ組織ブロットおよびｃＤＮＡは CLONTECH から
購入した。マウスの組織は Pel-Freez Biologicals から購入した。ＰＣＲ試薬
はInvitrogenから入手した。ＥＣＬウェスタンブロットキットはAmershamから入
手した。リポフェクタミン、増殖培養液、制限酵素は、Life Technologiesから
入手した。ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ−７細胞株はＡＴＣＣより入手した。他の
全ての化学薬品はSigmaから得た。 Materials and Methods Porcine α2δ1 (pα2δ1) cDNA is described in J. Brown (JP Brown, VUK Di
ssanayke, AR Briggs, MR Milic, N. Gee, Anal. Biochem., 255: 236-243 (1
998)). The mouse α2δ3 (mα2δ3) cDNA is F.
Hoffman (N. Klugbauer, L. Lacinova, E. Marais, M. Hobom, F. Hofmann, J.
Neurosci. 19: 684-691 (1999)). Monoclonal antibody against α2δ1 was purchased from Afinity Bioreagents, Inc. α2δ2 and α2δ
The polyclonal antibody against 3 was obtained from Sanra Duffy (Pfizer). Human and mouse multi-tissue blots and cDNA were purchased from CLONTECH. Mouse tissues were purchased from Pel-Freez Biologicals. PCR reagents were obtained from Invitrogen. The ECL Western Blot Kit was from Amersham. Lipofectamine, growth medium, restriction enzymes were obtained from Life Technologies. HEK293 and COS-7 cell lines were obtained from ATCC. All other chemicals were obtained from Sigma.

【００２０】 ヒトα２δ２サブユニットのクローニング：ヒトα２δ２（ｈα２δ２）ｃＤ
ＮＡは、ヒトの脳のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させた。寄託
されたGenBankのｈα２δ２サブユニットのＤＮＡ配列（受託番号 AF042792）を
基に、４つのオーバーラップＤＮＡフラグメント（これはｈα２δ２ｃＤＮＡの
完全な開放読み枠のヌクレオチド１４−９９４（フラグメントＨ）、８４５−１
８１６（フラグメントＦ）、１５１７−２７９１（フラグメントＤ）、および２
６８１−３７９０(フラグメントＣ)をカバーする）をＰＣＲによって作製し、続
いて、ＴＡクローニングキットを用いて発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１でクロー
ニングした。プライマー対の配列は以下を用いた： Cloning of human α2δ2 subunit : human α2δ2 (hα2δ2) cD
NA was amplified by PCR from a human brain cDNA library. Based on the DNA sequence of the deposited hα2δ2 subunit of GenBank (accession number AF042792), there are four overlapping DNA fragments (which are nucleotides 14-994 (fragment H), 845-1 of the complete open reading frame of hα2δ2 cDNA).
816 (fragment F), 1517-2791 (fragment D), and 2
681-3790 (covering Fragment C)) was generated by PCR and subsequently cloned with the expression vector pcDNA3.1 using the TA cloning kit. The sequences of the primer pairs used were:

【００２１】 ５′−ＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣ−３′（配列識別
番号１）および５′−ＴＡＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴ−３
′(配列識別番号２)（フラグメントＨ）； ５′−ＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣ−３′(配列識別
番号３)および５′−ＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡ−３
′(配列識別番号４)（フラグメントＦ）； ５′−ＣＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＴ−３′（配列識別
番号５）および５′−ＧＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＣ−３
′(配列識別番号６)（フラグメントＤ）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′（配列識別
番号７）および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−３
′(配列識別番号８)(フラグメントＣ)。前記４つのフラグメントは、内部の固有
の制限酵素部位、ｎｔ７９１（PflMI）、１３９５（ＸbaＩ）、および２６２８
（ＨpaＩ）で切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitrogen, Carlsbod, CA）
中のＨind III／ＸhoＩ部位で組み立てた（図１参照）。5'-TCTTGAATGGAAACATGGCGGTGC-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-TATACCAGGGTCTCCTTCGGACAT-3
5'-ATGTGTTTCATGGAAAACCCGCAGAC-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-AGCCGTTCAGGTCAATGGCAAACA-3.
5'-CCATCCGCATCAACACACAGGAAT-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-GTAAGTCCTCATTTGTTAACCTCGC-3' (SEQ ID NO: 4) (fragment F);
5'-CTGAGAAGTTTCAAGGTGCTAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-GATGGTGATTTTGGGTGCCAAAACACC-3' (SEQ ID NO: 6) (fragment D);
'(Sequence ID No. 8) (fragment C). The four fragments contain internal unique restriction enzyme sites, nt791 (PflMI), 1395 (XbaI), and 2628.
Cleaved with (HpaI) and pcDNA3.1 vector (Invitrogen, Carlsbod, CA)
It was assembled at the HindIII / XhoI site (see Figure 1).

【００２２】 ＲＴ−ＰＣＲ：種々の組織に由来する二本鎖ｃＤＮＡ調製物（CLONTECH）を用
いて、９４℃１分、５５℃１分、さらに７２℃２分の３５サイクルでＰＣＲ反応
を実施した。前記反応は、１ｎｇのｃＤＮＡ、１０ｐＭのプライマー、１ｍＭの
ｄＮＴＰおよび１×ＰＣＲ緩衝液を含む溶液（５０μＬ容積）中で実施した。前
記反応混合物の１０μＬを１％アガロースゲルに装荷した。ヒトα２δ１、α２
δ２およびα２δ３のためのプライマー対はそれぞれ以下のとおりであった： RT-PCR : A double-stranded cDNA preparation (CLONTECH) derived from various tissues was used to carry out a PCR reaction in 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes. . The reaction was carried out in a solution (50 μL volume) containing 1 ng of cDNA, 10 pM of primer, 1 mM of dNTP and 1 × PCR buffer. 10 μL of the reaction mixture was loaded on a 1% agarose gel. Human α2δ1, α2
The primer pairs for δ2 and α2δ3 were respectively as follows:

【００２３】 ５′−ＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣ−３′(配列識別
番号９)および５′−ＡＣＡＡＡＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＧ−３
′（ｎｔ９５８から２１６５；受託番号 M76559）（配列識別番号１０）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′(配列識別
番号１１)および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−
３′（ｎｔ２５３４から３６４３；受託番号 AF042792）(配列識別番号１２)；
並びに ５′−ＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＣ−３′(配列識別
番号１３)および、５′−ＣＡＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧ
−３′（ｎｔ１９２０から３２７２；受託番号 AJ272213）（配列識別番号１４
）。 ヒトα２δ１、α２δ２およびα２δ３の予想されるＰＣＲ生成物の長さは、１
２０８、１１１０および１３５２ｂｐであった。これらのプライマーは、対応す
るＰＣＲ生成物のシークェンシング分析によって決定したとおり、α２δの各サ
ブタイプに特異的であった。5′-GACGCGGTGAATAACATCACACGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-ACAAATCGTGCTTTCACTCCCTTG-3
'(Nt 958 to 2165; accession number M76559) (sequence identification number 10); 5'-CTGAGAAGTTCAAGGTGCTAGCACA-3' (sequence identification number 11) and 5'-GATGGTGATTTGGGTGCCCAACACC-
3 '(nt 2534 to 3643; accession number AF042792) (SEQ ID NO: 12);
And 5'-CGTGTCCTTGGCAGATGAATGGTC-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-CATCTCAGTCAGTGTCACCTTTGAG
-3 '(nt 1920 to 3272; accession number AJ272213) (SEQ ID NO: 14
). The expected PCR product lengths for human α2δ1, α2δ2 and α2δ3 are 1
It was 208, 1110 and 1352 bp. These primers were specific for each subtype of α2δ, as determined by sequencing analysis of the corresponding PCR products.

【００２４】 ノザンブロット分析：マルチ組織ノザンブロット（CLONTECH）を製造元の推奨
にしたがってハイブリダイズさせ洗浄した。α２δのサブタイプに特異的なジゴ
キシゲニン標識プローブをＰＣＲで作製し、１０ｍＬのイージーハイブ（EasyHy
b, Boehringer Mannheim）で５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ＲＴ−ＰＣＲ
用に使用するプライマー対と同じプライマー対を用いてプローブを作製した。ブ
ロットを２回（最初は２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで室温で５分、続いて０
．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６８℃で１５分）洗浄した。発現の検出は
製造元（Boehringer Mannheim）の指示にしたがった。 Northern blot analysis : Multi-tissue Northern blots (CLONTECH) were hybridized and washed according to the manufacturer's recommendations. A digoxigenin-labeled probe specific for the α2δ subtype was prepared by PCR, and 10 mL of EasyHyb
b, Boehringer Mannheim) at 50 ° C. overnight. RT-PCR
Probes were made using the same primer pairs that were used for. Blot twice (first with 2 × SSC and 0.1% SDS for 5 minutes at room temperature, followed by 0
． Wash with 1 × SSC and 0.1% SDS at 68 ° C. for 15 minutes). Detection of expression was according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim).

【００２５】 細胞培養およびトラスフェクション：ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞をそ
れぞれＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。前記培養液に９５％
空気および５％ＣＯ２を有する湿潤化したインキュベーター中で３７℃で５０単
位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１０％熱
不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した。ＣＯＳ−７細胞への一過性トランス
フェクションのために、２０μｇのプラスミドＤＮＡ（ベクターまたはα２δ挿
入物を含む同じベクター）を３０μＬのリポフェクチンとインキュベートした。
混合物を１．５ｍＬの血清非含有培養液中で前記細胞に重ね、５時間インキュベ
ートした。ＦＢＳを前記培養皿に添加して最終濃度を１０％にした。培養液を次
の朝、交換した。トランスフェクション後４８時間で、膜の調製のために細胞を
採集した。ブタα２δ１およびヒトα２δ２のＨＥＫ２９３細胞への安定なトラ
ンスフェクションの場合は、トランスフェクション後４８時間で８００μｇ／ｍ
ＬのＧ４１８（ゲンタシン）を細胞に添加したことを除き、一過性のトランスフ
ェクションのための方法と同じ方法を適用した。２つのクローン、ＧＫＳ０２お
よびＧＫＳ０７は、それぞれブタα２δ１およびヒトα２δ２の最高の発現を示
し、更なる結合実験のために選択した。前記細胞株はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１８
２３を有する。さらに、α２δ２タンパク質結合アッセイの発現用ホストには真
核細胞発現系、例えば酵母、昆虫細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、
ＨＥＫ２９３など）もまた含まれる。 Cell culture and transfection : COS-7 and HEK293 cells were cultured in DMEM and RPMI1640 medium, respectively. 95% in the culture solution
Supplemented with 50 units / mL penicillin, 50 μg / mL streptomycin, and 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. in a humidified incubator with air and 5% CO 2. For transient transfection of COS-7 cells, 20 μg of plasmid DNA (vector or same vector with α2δ insert) was incubated with 30 μL of lipofectin.
The mixture was layered on the cells in 1.5 mL of serum-free medium and incubated for 5 hours. FBS was added to the culture dish to a final concentration of 10%. The culture medium was changed the next morning. Forty-eight hours after transfection, cells were harvested for membrane preparation. For stable transfection of porcine α2δ1 and human α2δ2 into HEK293 cells, 800 μg / m 48 h after transfection
The same method was applied as for transient transfection, except that L G418 (gentasin) was added to the cells. Two clones, GKS02 and GKS07, showed the highest expression of porcine α2δ1 and human α2δ2, respectively, and were selected for further binding experiments. The cell line is ATCC No. PTA-18
Have 23. In addition, eukaryotic expression systems such as yeast, insect cells and mammalian cells (CHO, COS-7,
HEK293 etc.) are also included.

【００２６】 膜の調製：膜は組織または培養細胞から調製した。細胞は２回冷ＰＢＳで洗浄
し、続いてトリス（５ｍＭ，ｐＨ７．４）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、ＰＭＳＦ（０
．１ｍＭ）、ロイペプチン（０．０２ｍＭ）、およびペプスタチン（０．０２ｍ
Ｍ）を含む冷緩衝液で削り落とした。細胞を氷上で３０分インキュベートし、続
いて超音波処理を３０から４０秒実施した。組織から膜を調製する場合は、組織
を小さな細片にスライスし、１０秒間隔で４回超音波処理した。得られた組織ま
たは細胞のホモジネートを７５０から１０００×ｇで１０分間遠心し、続いて、
上清を５００００×ｇで３０分遠心した。生じたペレットを上記の緩衝液と同じ
ものに再度懸濁させた。 Membrane preparation : Membranes were prepared from tissues or cultured cells. The cells were washed twice with cold PBS, followed by Tris (5 mM, pH 7.4), EDTA (5 mM), PMSF (0
． 1 mM), leupeptin (0.02 mM), and pepstatin (0.02 m
It was scraped off with cold buffer containing M). The cells were incubated on ice for 30 minutes, followed by sonication for 30-40 seconds. When preparing a membrane from tissue, the tissue was sliced into small pieces and sonicated 4 times at 10 second intervals. The resulting tissue or cell homogenate is centrifuged at 750 to 1000 xg for 10 minutes, followed by
The supernatant was centrifuged at 50,000 xg for 30 minutes. The resulting pellet was resuspended in the same buffer as above.

【００２７】 ウェスタンブロット分析：前記細胞膜（ＧＫＳ０７細胞については０．５μｇ
、ＧＫＳ０２細胞については５μｇ、一過性にトランスフェクトした細胞または
組織については１００μｇ）を４％から２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、半
乾燥トランスファーユニットを用いてニトロセルロースメンブレンに移した。前
記のメンブレンをウサギ抗α２δ１、α２δ２およびα２δ３抗体のいずれかと
１時間室温でインキュベートし、続いて１×ＰＢＳで洗浄した。前記のブロット
を抗ウサギＩｇＧと１時間インキュベートし、さらに製造元の推奨する方法にし
たがってＥＣＬ反応により展開させた。 Western blot analysis : the cell membrane (0.5 μg for GKS07 cells)
, GKS02 cells, 5 μg, transiently transfected cells or tissues 100 μg) were separated by 4% to 20% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes using a semi-dry transfer unit. The membrane was incubated with any of the rabbit anti-α2δ1, α2δ2 and α2δ3 antibodies for 1 hour at room temperature, followed by a wash with 1 × PBS. The blot was incubated with anti-rabbit IgG for 1 hour and further developed by ECL reaction according to the method recommended by the manufacturer.

【００２８】 結合アッセイ：放射能リガンド結合アッセイは、２０ｎＭの［³Ｈ］ガバペン
チンの存在下でインキュベートした膜タンパク質を用いて実施した。膜（一過性
にトランスフェクトした細胞のタンパク質については１００μｇ、ＧＫＳ０２細
胞については２０μｇ、ＧＫＳ０７細胞については１０μｇ）を１０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ´−［２−エタンスルホ
ン酸］）（ｐＨ７．４）中で４０から５０分室温でインキュベートし、続いて予
め湿らせたＧＦ／Ｃメンブレンでろ過し、３ｍＬの氷冷トリス緩衝液（５０ｍＭ
，ｐＨ７．４）で迅速に５回洗浄した。前記フィルターを乾燥させ、液体シンチ
レーションカウンターで計測した。非特異的結合を決定するために、前記結合ア
ッセイは１０μＭのプレガバリンの存在下で実施した（N.S. Gee, J.P. Brown,
V.U. Dissanayake, J. Offord, R. Thurlow, G.N. Woodruff, J. Biol. Chem. 2
71:5768-5776）。特異的結合は、全結合から非特異的結合を差し引いて得られた
。クローン＃７は最高のα２δ２サブユニット発現クローンと決定された。結合
アッセイはまた、α２δ２サブタイプ選択的阻害剤のスクリーニングのために、
ヒトおよび他の哺乳類種由来のリコンビナントおよび／または精製α２δ２タン
パク質を用いて実施することができる。 Binding Assay : Radioligand binding assays were performed with membrane proteins incubated in the presence of 20 nM [ ³ H] gabapentin. Membranes (100 μg for proteins of transiently transfected cells, 20 μg for GKS02 cells, 10 μg for GKS07 cells) with 10 mM HE
Incubate in PES (N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid]) (pH 7.4) for 40 to 50 minutes at room temperature followed by pre-wet GF / C membrane. Filter and filter with 3 mL of ice-cold Tris buffer (50 mM
, PH 7.4) and rapidly washed 5 times. The filters were dried and counted with a liquid scintillation counter. To determine non-specific binding, the binding assay was performed in the presence of 10 μM pregabalin (NS Gee, JP Brown,
VU Dissanayake, J. Offord, R. Thurlow, GN Woodruff, J. Biol. Chem. 2
71: 5768-5776). Specific binding was obtained by subtracting non-specific binding from total binding. Clone # 7 was determined to be the highest α2δ2 subunit expressing clone. The binding assay can also be used to screen for α2δ2 subtype selective inhibitors,
It can be performed with recombinant and / or purified α2δ2 proteins from humans and other mammalian species.

【００２９】結果 α２δ転写物の組織分布：ｈα２δ１、ｈα２δ２およびｈα２δ３ｍＲＮＡ
の組織分布を先ずＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。これらのプローブは、α２
δの３つのサブタイプを特異的に増幅させるためにデザインした。図２で示した
ように、ｈα２δ１、ｈα２δ２およびｈα２δ３の予想サイズ（１２０８，１
１０および１３５２ｂｐ）とよく一致するただ１つのＰＣＲ生成物が、検査した
ほとんど全ての組織に出現した。より高レベルのｈα２δ２転写物が、脳を含む
他のいずれの組織よりも肺で認められた。ＰＣＲ生成物は対応するα２δと同一
の配列を示したので、広範囲の組織分布はｈα２δｍＲＮＡ発現の普遍的特色を
示している。しかしながら、ここで用いたＲＴ−ＰＣＲ条件では、種々の組織間
でのα２δｍＲＮＡレベルの定量的見積もりが得られなかったので、ノザン分析
が各サブタイプのｈα２δｍＲＮＡの相対量を見積もるために必要である。ノザ
ンブロットは、ｈα２δ１がはるかに多く骨格筋で発現されることを除いて、３
つのｈα２δ遺伝子全てが、脳、心臓、および筋肉でほぼ等しくよく発現される
ことを示した（図３）。これら３つの組織の他に、もっとも豊富なｈα２δ２転
写物が肺で認められた。肺でｈα２δ２ｍＲＮＡがもっとも高く発現されること
は、上記のＲＴ−ＰＣＲの結果と一致し、最近の報告（B. Gao, Y. Sekido, A.
Maximov, M. Saad, E. Forgacs, F. Latif et al., J. Biol. Chem. 275:12237-
12242(2000)）とも合致したが、初期の観察（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. M
arais, M. Hobom, F. Hofmann, J. Neurosci. 19:684-691(1999)）とは異なって
いる。本研究では、我々はまた少量のｈα２δ１およびｈα２δ３ｍＲＮＡを肝
臓および腎臓でそれぞれ検出した。我々の研究室および他の研究室の結果（Klug
bauer, 上掲書(1999); Gao, 上掲書(2000); 我々の未発表データ）は、マウスの
α２δ３（ｍα２δ３）の発現は脳に限定されることを示した。ｈα２δ３の脳
以外の他の組織における発現もまたα２δ３発現の種における相違を示唆してい
る。 Results Tissue distribution of α2δ transcripts : hα2δ1, hα2δ2 and hα2δ3 mRNA
Tissue distribution was first examined by RT-PCR analysis. These probes are α2
Designed to specifically amplify the three subtypes of δ. As shown in FIG. 2, expected sizes of hα2δ1, hα2δ2, and hα2δ3 (1208,1
Only one PCR product, which was in good agreement with 10 and 1352 bp), appeared in almost all tissues examined. Higher levels of hα2δ2 transcripts were found in lungs than in any other tissue, including brain. The wide range of tissue distributions is a universal feature of hα2δ mRNA expression, as the PCR products showed identical sequences to the corresponding α2δ. However, the RT-PCR conditions used here did not provide a quantitative estimate of α2δ mRNA levels among different tissues, so Northern analysis is necessary to estimate the relative amount of hα2δ mRNA for each subtype. Northern blots show 3 except that hα2δ1 is much more expressed in skeletal muscle.
All four hα2δ genes were shown to be approximately equally well expressed in brain, heart, and muscle (Figure 3). In addition to these three tissues, the most abundant hα2δ2 transcript was found in lung. The highest expression of hα2δ2 mRNA in the lung was consistent with the results of RT-PCR described above, and was recently reported (B. Gao, Y. Sekido, A.
Maximov, M. Saad, E. Forgacs, F. Latif et al., J. Biol. Chem. 275: 12237-
12242 (2000)), but early observations (N. Klugbauer, L. Lacinova, E. M.
arais, M. Hobom, F. Hofmann, J. Neurosci. 19: 684-691 (1999)). In this study, we also detected small amounts of hα2δ1 and hα2δ3 mRNA in liver and kidney, respectively. Results of our lab and other labs (Klug
bauer, supra (1999); Gao, supra (2000); our unpublished data) have shown that mouse α2δ3 (mα2δ3) expression is restricted to the brain. Expression of hα2δ3 in tissues other than brain also suggests species differences in α2δ3 expression.

【００３０】 脳では、ｈα２δ１、ｈα２δ２、およびｈα２δ３が、検査した脳の全ての
部分（小脳、大脳皮質、髄質、後頭極、前頭葉、側頭葉および被殻を含む）で検
出された。大脳皮質よりも小脳でより高レベルのｈα２δ２転写物が認められ、
一方、ｈα２δ３については反対であった。ｈα２δ１については、そのｍＲＮ
Ａは前記２つの領域にほぼ均等に分布していた。これら２つの脳の領域における
前記３つのアイソフォームの発現パターンは、以前のin situハイブリダイゼー
ションの結果と一致していた（Klugbauer, 上掲書(1999); M. Hobom, S. Dai, E
. Marais, L. Lacinova, F. Hofmann, N. Klugbauer, Eur. J. Neurosci., 12:1
217-1226(2000)）。さらに、α２δｍＲＮＡの３つのサブタイプはいずれも脊髄
で見出されるが、脳で認められるレベルより低かった。In the brain, hα2δ1, hα2δ2, and hα2δ3 were detected in all parts of the brain examined, including the cerebellum, cerebral cortex, medulla, occipital pole, frontal lobe, temporal lobe and putamen. Higher levels of hα2δ2 transcripts were found in the cerebellum than in the cerebral cortex,
On the other hand, the opposite was true for hα2δ3. For hα2δ1, its mRN
A was distributed almost evenly in the two areas. The expression patterns of the three isoforms in these two brain regions were consistent with previous in situ hybridization results (Klugbauer, supra (1999); M. Hobom, S. Dai, E.
Marais, L. Lacinova, F. Hofmann, N. Klugbauer, Eur. J. Neurosci., 12: 1
217-1226 (2000)). Furthermore, all three subtypes of α2δ mRNA were found in the spinal cord but below the levels found in the brain.

【００３１】 α２δタンパク質の組織分布：タンパク質レベルはｍＲＮＡの定常状態レベル
の関数であるが、個々の遺伝子のｍＲＮＡとタンパク質の相対量はいつも比例す
るとは限らない。前記相対量は翻訳後調節を反映することがある（V.N. Jackson
, N.T. Price, L. Carpenter, A.P. Halestrap, Biochem. J., 324:447-453(199
7)）。組織間のヒトおよびマウスのα２δサブユニットの相対レベルを調べるた
めに、α２δの個々のサブタイプタンパク質に対して作製した抗体をウェスタン
ブロットに用いた。等量のタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに装荷し
た。ｈα２δ１の普遍的分布と一致して、ヒトおよびマウス組織のウェスタンブ
ロットは、ｈα２δ１およびｍα２δ１タンパク質は両方とも広範囲に分布する
ことを示したが、一方、ｈα２δ１は肺および空腸には検出されなかった。対照
的に、ｈα２δ３タンパク質は脳でのみ検出され、肺、精巣、大動脈、脾臓、空
腸、および腎臓では検出されなかった（図４Ａ）。同様に、ｍα２δ３タンパク
質は脳でのみ検出され、心臓、腎臓、肺臓、すい臓、胃、脾臓、胸腺、卵巣、下
垂体、甲状腺、および前立腺では検出されなかった。驚くべきことには、肺での
ｈα２δ２転写物の顕著な発現（図２および３）とは対照的に、ｈα２δ２タン
パク質は脳で顕著に認められ、ｈα２δ２タンパク質のレベルは肺では検出可能
ではなかった（図４Ａ）。脳の他に、低レベルのｈα２δ２タンパク質がまた大
動脈、精巣および心室筋に見出された。精巣には２つの免疫反応バンドが存在す
るようであり、１つは予想したｈα２δ２の分子量（１７５ｋＤａ）であり、他
方はわずかに小さい分子量を示した。この小さい分子量のタンパク質は心室筋で
検出された優勢なバンドと類似しているようであった。以前にｐα２δ１で観察
されたように、この小さいバンドは、α２δタンパク質から解離したα２サブユ
ニットまたはα２δ２のアイソフォームを示しているのかもしれない（J.P. Bro
wn, V.U.K. Dissanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem.,
255:236-243(1998); M. Wang, J. Offord, D.L. Oxender, T.Z. Su, Biochem. J
. 342:313-320(1999)）。さらに、２つの免疫反応バンドはまた抗α２δ２抗体
によってマウスの心臓で検出されたが、この場合は優勢なバンドは他の組織で見
出されたものより大きな分子量を有していた（図４Ｂ）。 Tissue distribution of α2δ protein : Although protein levels are a function of steady-state levels of mRNA, the relative amounts of mRNA and protein in individual genes are not always proportional. The relative amount may reflect post-translational regulation (VN Jackson
, NT Price, L. Carpenter, AP Halestrap, Biochem. J., 324: 447-453 (199
7)). To examine the relative levels of human and mouse α2δ subunits between tissues, antibodies raised against the individual α2δ subtype proteins were used in Western blots. Equal amounts of protein were loaded on SDS polyacrylamide gels. Consistent with the universal distribution of hα2δ1, Western blots of human and mouse tissues showed that hα2δ1 and mα2δ1 proteins were both widely distributed, whereas hα2δ1 was not detected in lung and jejunum. In contrast, the hα2δ3 protein was detected only in the brain and not in the lung, testis, aorta, spleen, jejunum, and kidney (Fig. 4A). Similarly, the mα2δ3 protein was detected only in the brain and not in the heart, kidney, lung, pancreas, stomach, spleen, thymus, ovary, pituitary, thyroid, and prostate. Surprisingly, in contrast to the significant expression of hα2δ2 transcripts in the lung (FIGS. 2 and 3), the hα2δ2 protein was found prominently in the brain, and levels of hα2δ2 protein were not detectable in the lung. (FIG. 4A). In addition to the brain, low levels of hα2δ2 protein were also found in the aorta, testis and ventricular muscle. There appear to be two immunoreactive bands in the testis, one with the expected hα2δ2 molecular weight (175 kDa) and the other with a slightly lower molecular weight. This small molecular weight protein appeared to resemble the predominant band detected in ventricular muscle. As previously observed with pα2δ1, this small band may represent an α2 subunit dissociated from the α2δ protein or an isoform of α2δ2 (JP Bro
wn, VUK Dissanayke, AR Briggs, MR Milic, N. Gee, Anal. Biochem.,
255: 236-243 (1998); M. Wang, J. Offord, DL Oxender, TZ Su, Biochem. J.
. 342: 313-320 (1999)). In addition, two immunoreactive bands were also detected in the mouse heart by anti-α2δ2 antibodies, where the predominant band had a higher molecular weight than that found in other tissues (Fig. 4B). .

【００３２】 α２およびδタンパク質のジスルフィド結合：α２δ１のα２およびδ１サブ
ユニットはジスルフィド結合によって連結されていることが示された（Wang, 上
掲書(1999)）。δ領域のアミノ酸配列は、α２δ１とα２δ２間でより保存され
ていないので、α２δ２タンパク質が翻訳後２つのサブユニットに切断されるか
否かを知ることは興味のあるところである。そのような可能性を調べるために、
ｐα２δ１（ＧＫＳ０２）およびｈα２δ２（ＧＫＳ０７）タンパク質を過剰発
現しているＨＥＫ２９３細胞株の細胞膜を、ゲル電気泳動の前に１００ｍＭＤＴ
Ｔで処理するかまたは未処理のままにした。ＤＴＴの存在下では、ｐα２δ１お
よびｈα２δ２タンパク質の両者はα２として予想した位置にシフトし、ｐα２
δ１の場合のように、ｈα２δ２もまたジスルフィド結合により連結された２つ
のサブユニットから成ることを示唆している（図６）。 Disulfide Bonds in α2 and δ Proteins : The α2 and δ1 subunits of α2δ1 have been shown to be linked by disulfide bonds (Wang, supra (1999)). Since the amino acid sequence of the δ region is less conserved between α2δ1 and α2δ2, it is of interest to know whether the α2δ2 protein is cleaved into two subunits after translation. To investigate such a possibility,
The cell membrane of the HEK293 cell line overexpressing the pα2δ1 (GKS02) and hα2δ2 (GKS07) proteins was treated with 100 mM DT before gel electrophoresis.
Treated with T or left untreated. In the presence of DTT, both the pα2δ1 and hα2δ2 proteins shift to the position predicted for α2, pα2
As in the case of δ1, it is suggested that hα2δ2 also consists of two subunits linked by a disulfide bond (Fig. 6).

【００３３】 ［³Ｈ］ガバペンチンの結合：クローン化ｈα２δ２のガバペンチン結合特性
を決定するために、ｐα２δ１、ｈα２δ２およびベクターｐｃＤＮＡ３．１を
一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から膜を単離した。対応するα２
δタンパク質の発現はウェスタンブロットで調べた。図５に示したように、ｐα
２δ１による細胞のトランスフェクションは、ガバペンチン結合の顕著な増加を
もたらした。同様に、ｈα２δ２を発現する細胞は、約４倍のガバペンチン結合
活性の増加を示した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをトランスフェクトした細
胞でわずかな結合活性の増加が観察されたが、統計学的分析では前記の小さな変
化は有意であるとは示されなかった。 [ ³ H] Gabapentin Binding : To determine the gabapentin binding properties of cloned hα2δ2, membranes were isolated from COS-7 cells transiently transfected with pα2δ1, hα2δ2 and the vector pcDNA3.1. . Corresponding α2
Expression of delta protein was examined by Western blot. As shown in FIG. 5, pα
Transfection of cells with 2δ1 resulted in a marked increase in gabapentin binding. Similarly, cells expressing hα2δ2 showed an approximately 4-fold increase in gabapentin binding activity. A slight increase in binding activity was observed in cells transfected with pcDNA3.1 vector alone, but statistical analysis did not show that the small changes were significant.

【００３４】 ｐα２δ１およびｈα２δ２のガバペンチン結合Ｋ_Dおよび結合特性を細胞株
ＧＫＳ０２（ｐα２δ１）およびＧＫＳ０７（ｈα２δ２）で決定した。安定的
にｐα２δ１を発現しているＨＥＫ細胞では、［³Ｈ］ガバペンチンは、以前の
報告（Gee, 上掲書(1996)）で示したように、Ｋ_D値７２±９ｎＭで単一部位集団
に結合した（図７Ａ）。同様に、単一結合部位集団はまたｈα２δ２を含む膜に
も観察されたが（図７Ｂ）、Ｋ_D値はｐα２δ１（１５６±２５ｎＭ）よりも高
かった。ｈα２δ２の薬理学的特性を決定するために、いくつかの化合物を［³
Ｈ］ガバペンチン結合について競合させるために選択した。同様な（しかし同一
ではない）競合プロフィールがα２δタンパク質の２つのサブタイプで認められ
た（表１）。例えば、α２δの両サブタイプとの結合は、Ｌ−ロイシンはそのＤ
−鏡像体よりもはるかに強力であったので立体特異的である。ＢＣＨ（Ｌ系トラ
ンスポートのモデル基質）およびフェニルアラニンの親和性は両サブタイプタン
パク質に対して弱かった。他方、α２δ２とのガバペンチンの結合は、ｐα２δ
１（１４９ｎＭ）と比較して（Ｓ＋）−３−イソブチルＧＡＢＡ（プレガバリン
）に対してより感受性が高く、ＩＣ₅₀値は９６ｎＭであった。[0034] Piarufa2deruta1 and gabapentin binding K _D and binding properties of Etchiarufa2deruta2 determined in cell lines GKS02 (pα2δ1) and GKS07 (hα2δ2). In HEK cells stably expressing pα2δ1, [ ³ H] gabapentin was expressed in a single site population with a K _D value of 72 ± 9 nM, as shown in a previous report (Gee, supra (1996)). Bound (Figure 7A). Similarly, a single binding site population was also observed on membranes containing hα2δ2 (FIG. 7B), but K _D values were higher than pα2δ1 (156 ± 25 nM). In order to determine the pharmacological properties of hα2δ2, several compounds [ ³
H] gabapentin was selected to compete for binding. Similar (but not identical) competition profiles were observed for the two subtypes of α2δ protein (Table 1). For example, L-leucine binds to its D by binding to both α2δ subtypes.
It is stereospecific because it was much more powerful than the enantiomer. The affinity of BCH (model substrate for L-based transport) and phenylalanine was weak for both subtype proteins. On the other hand, the binding of gabapentin to α2δ2 is pα2δ
It was more sensitive to (S +)-3-isobutyl GABA (pregabalin) compared to 1 (149 nM) with an IC ₅₀ value of 96 nM.

【００３５】[0035]

【表１】 [Table 1]

【００３６】 図８はまた、ヒトα２δ２タンパク質を発現する安定な細胞株のスクリーニン
グを示す。 本明細書で開示した本発明の形態は目下の好ましい実施態様を構成しているが
、多くの他の形態も可能である。本明細書では、本発明の全ての可能な同等物ま
たは派生物を記載することを意図していない。本明細書で用いられる用語は限定
ではなく単なる記述であり、本発明の範囲を逸脱することなく多様な変更を為し
えることは理解されよう。FIG. 8 also shows the screening of stable cell lines expressing human α2δ2 protein. While the form of the invention disclosed herein constitutes the presently preferred embodiment, many other forms are possible. This document is not intended to describe every possible equivalent or derivative of the invention. It is understood that the terms used in this specification are merely descriptive rather than limiting, and that various changes can be made without departing from the scope of the present invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ヒトα２δ２のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでの分子クローニングの模式図
である。FIG. 1 is a schematic diagram of molecular cloning of human α2δ2 with pCDNA3.1 expression vector.

【図２】 ヒトα２δの組織分布のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。[Fig. 2]   3 shows RT-PCR analysis of the tissue distribution of human α2δ.

【図３Ａ】 ヒトα２δ１の組織分布のノザンブロット分析を示す。FIG. 3A   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ1.

【図３Ｂ】 ヒトα２δ１の組織分布のノザンブロット分析を示す。FIG. 3B   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ1.

【図３Ｃ】 ヒトα２δ２の組織分布のノザンブロット分析を示す。[Fig. 3C]   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ2.

【図３Ｄ】 ヒトα２δ２の組織分布のノザンブロット分析を示す。[Fig. 3D]   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ2.

【図３Ｅ】 ヒトα２δ３の組織分布のノザンブロット分析を示す。[FIG. 3E]   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ3.

【図３Ｆ】 ヒトα２δ３の組織分布のノザンブロット分析を示す。[Fig. 3F]   4 shows Northern blot analysis of the tissue distribution of human α2δ3.

【図４Ａ】 ヒトα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す。FIG. 4A   3 shows a Western blot analysis of the tissue distribution of human α2δ.

【図４Ｂ】 マウスα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す。FIG. 4B   3 shows a Western blot analysis of the tissue distribution of mouse α2δ.

【図５】 α２δｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の膜と［³Ｈ］ガバペ
ンチンとの結合を示す。FIG. 5 shows the binding of [ ³ H] gabapentin to the membrane of COS-7 cells transfected with α2δ cDNA.

【図６】 α２およびδサブユニット間のジスルフィド結合の破壊を示す。[Figure 6]   Disruption of the disulfide bond between the α2 and δ subunits is shown.

【図７】 ブタα２δ１（Ａ）およびヒトα２δ２（Ｂ）を過剰産生しているＨＥＫ２９
３細胞の膜と［³Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャード分析を
示す。FIG. 7: HEK29 overproducing porcine α2δ1 (A) and human α2δ2 (B)
Scatchard analysis of [ ³ H] gabapentin (GBP) binding to membranes of 3 cells.

【図８】 ［³Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）結合活性による細胞株のスクリーニングを示
す。FIG. 8 shows screening of cell lines for [ ³ H] gabapentin (GBP) binding activity.

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA11 BA80 CA04 CA20 DA02 DA03 EA04 GA13 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR77 QR80 QX07 4B065 AA90X AA90Y AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA05 CA24 CA46 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) G01N 33/50 C12N 15/00 ZNAA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK) , ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE, TR), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML) , MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE , KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF F terms (reference) 2G045 AA40 4B024 AA11 BA80 CA04 CA20 DA02 DA03 EA04 GA13 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR77 QR80 QX07 4B065 AA90X AA90Y AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA05 CA24 CA46

Claims (18)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 化合物とカルシウムチャネルα２δ２サブユニットを発現し
ている細胞株との結合能を決定する方法であって、 カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを発現している細胞を用意し； この細胞を化合物と接触させ；さらに この化合物の細胞との結合能を決定する ことを含む上記方法。1. A method for determining the binding ability between a compound and a cell line expressing a calcium channel α2δ2 subunit, which comprises preparing a cell expressing a calcium channel α2δ2 subunit; Contacting with; further determining the ability of the compound to bind to cells. 【請求項２】 化合物がガバペンチンである請求項１の方法。2. The method of claim 1, wherein the compound is gabapentin. 【請求項３】 化合物がガバペンチン類似体である請求項１の方法。3. The method of claim 1, wherein the compound is a gabapentin analog. 【請求項４】 ガバペンチン類似体が、１から４つの炭素原子を有するアル
キル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されている請求項３の方法。4. The method of claim 3, wherein the gabapentin analog is alkylated with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms at any position on the carbocycle. 【請求項５】 ガバペンチン類似体が、ガバペンチンの３−アルキル置換体
である請求項３の方法。5. The method of claim 3, wherein the gabapentin analog is a 3-alkyl substituted version of gabapentin. 【請求項６】 化合物がプレガバリンである請求項１の方法。6. The method of claim 1, wherein the compound is pregabalin. 【請求項７】 化合物が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の３−アルキル誘導
体である請求項１の方法。7. The method of claim 1, wherein the compound is a 3-alkyl derivative of γ-aminobutyric acid (GABA). 【請求項８】 カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを発現している
安定な細胞株。8. A stable cell line expressing the α2δ2 subunit of the calcium channel. 【請求項９】 ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１８２３の請求項８の細胞株。9. The cell line of claim 8 having ATCC number PTA-1823. 【請求項１０】 化合物とカルシウムチャネルα２δ２サブユニットとの結
合能を決定する方法であって、 カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを用意し； このα２δ２サブユニットを化合物と接触させ；さらに この化合物のα２δ２サブユニットとの結合能力を決定する ことを含む上記方法。10. A method for determining the binding ability between a compound and a calcium channel α2δ2 subunit, which comprises preparing a calcium channel α2δ2 subunit; contacting this α2δ2 subunit with a compound; and further forming an α2δ2 subunit of this compound. Such a method comprising determining binding capacity with. 【請求項１１】 化合物がガバペンチンである請求項１０の方法。11. The method of claim 10, wherein the compound is gabapentin. 【請求項１２】 化合物がガバペンチン類似体である請求項１０の方法。12. The method of claim 10, wherein the compound is a gabapentin analog. 【請求項１３】 ガバペンチン類似体が、１から４つの炭素原子を有するア
ルキル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されている請求項１２の方法。13. The method of claim 12, wherein the gabapentin analog is alkylated with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms at any position on the carbocycle. 【請求項１４】 ガバペンチン類似体が、ガバペンチンの３−アルキル置換
体である請求項１２の方法。14. The method of claim 12, wherein the gabapentin analog is a 3-alkyl substituted version of gabapentin. 【請求項１５】 化合物がプレガバリンである請求項１０の方法。15. The method of claim 10, wherein the compound is pregabalin. 【請求項１６】 化合物が、ＧＡＢＡの３−アルキル誘導体である請求項１
０の方法。16. The compound is a 3-alkyl derivative of GABA.
0 way. 【請求項１７】 α２δ２サブユニットが精製タンパク質である請求項１０
の方法。17. The α2δ2 subunit is a purified protein.
the method of. 【請求項１８】 α２δ２サブユニットがリコンビナントタンパク質である
請求項１０の方法。18. The method according to claim 10, wherein the α2δ2 subunit is a recombinant protein.