JP4287582B2 - Ｍｉｎ６細胞下位株 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、インスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６の、長期間の継代培養に耐えて機能を維持する新たな下位株に関し、更に詳しくはグルコース応答性の良好なＭＩＮ６ｍ９細胞株に関する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
膵β細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害は、２型糖尿病の発生における重要な一要因であることが知られている。２型糖尿病は、膵β細胞からのインスリン分泌の障害及び標的組織におけるインスリンの作用の障害の両方によって特徴づけられる多機能障害であるが、何れの欠陥が主たるものであるのかは決定されていない。しかしながら、欠陥のあるβ細胞機能自身が２型糖尿病の発病に重要であることを示唆する証拠が蓄積されてきた。
【０００３】
例えば、２型糖尿病の幾つかのサブタイプは、インスリン機能に関与する遺伝子とは別の、β細胞で発現される遺伝子の突然変異によって引き起こされることが見出されている。これらは、若者の成人発症型糖尿病の幾つかのサブタイプ（ＭＯＤＹ１〜５）を含んでいる。ＭＯＤＹ１，２，３，４，及び５は、それぞれ、肝細胞核因子（ＨＮＦ）４α、グルコキナーゼ（ＧＫ）、ＨＮＦ１α、インスリンプロモーター因子１（ＩＰＦ−１）、及びＨＮＦ１βにおける突然変異によって引き起こされ、それらは何れもインスリンの合成及び分泌並びにβ細胞の発生を含む、膵β細胞機能に関係している。
【０００４】
加えて、母体から伝えられるミトコンドリア遺伝子の突然変異が、おそらくＡＴＰ産生の欠陥のために、インスリン分泌障害による糖尿病を引き起こすと考えられている。インスリン分泌は、血液中のグルコース濃度の制御に決定的であるから、インスリン合成及び／又はインスリン分泌に関与している膵β細胞における遺伝子発現の変化によるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害は、２型糖尿病の発症に十分寄与し得る。
【０００５】
グルコース誘導性のインスリン分泌の障害に関与する遺伝子を同定するための一つの方法は、正常被験者のβ細胞における遺伝子発現を、グルコース誘導性のインスリン分泌の障害を有する２型糖尿病患者のそれらと比較することであるが、しかしこれは現実的でない。なぜならば、ヒト被験者からの膵島は得るのが困難だからである。別のアプローチは、例えば正常のインスリン応答を示す細胞株と障害された応答を示す細胞株のような、異なったインスリン分泌プロフィールを示す２つの異なった細胞株の間で、遺伝子の発現を比較することである。
【０００６】
ＭＩＮ６細胞株は、グルコースその他の分泌促進物質に対するインスリン分泌応答を維持している数少ないβ細胞株の一つであり（Miyazaki J et al., Endocrinology 127:126-132(1990), Ishihara H et al., Diabetologia 36:1139-1145(1993)）、インスリン分泌の機構の研究において繁用されている。しかしながら、実験中において、継代していくうちにＭＩＮ６からのグルコース誘導性のインスリン分泌が突然失われる例がこれまでしばしば認められており、それはグルコース応答性の乏しい細胞の過剰増殖か又はグルコース誘導性のインスリン分泌を担う遺伝子発現低下による可能性がある。従って、グルコースに対し異なったインスリン分泌応答を示すＭＩＮ６細胞のサブクローニングは、それらの間での遺伝子の発現の比較とグルコースに対するインスリン分泌応答の障害に関係する遺伝子の同定とを可能にするであろう。また、そのようなＭＩＮ６細胞下位株は、２型糖尿病の治療薬の開発に有力な手段を提供することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景の下で、本発明は、繰り返しの継代培養に耐えて当初の機能を一貫して維持することのできるインスリン分泌細胞株を提供することを目的とし、特に、そのような安定な細胞株であってグルコース応答性の良好な株を含有しない細胞株を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明等は、インスリン分泌β細胞株であるＭＩＮ６細胞から上記の目的にかなう下位株を樹立することを試みた。その結果、限界希釈法を用いたＭＩＮ６からの単一細胞を起源とするコロニー培養と、グルコース誘導性インスリン分泌を指標とするこれらのコロニーのスクリーニングとを組み合わせることによって、グルコース誘導性のインスリン分泌特性において明瞭に異なり、且つ度重なる継代培養を経ても機能的特性が維持されるという特徴を備えた、２つの下位株（「ＭＩＮ６ｍ９」及び「ＭＩＮ６ｍ１４」と命名。それぞれ、「ｍ９」及び「ｍ１４」と略す）を樹立することに成功した。
【０００９】
すなわち本発明は、先ず、ＭＩＮ６細胞株を限界希釈し培養して得ることのできるモノクローナル細胞株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とする細胞株（ｍ９）を提供する。
【００１０】
本発明のｍ９細胞株は、モノクローナル細胞株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大せず、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が６±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25 ｍＭではインスリン分泌量が7.5±2.5ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とする細胞株（ｍ１４）は含んでいない。
【００１１】
従って、本発明は、ＭＩＮ６細胞株より誘導される下位株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とし、且つ、同一条件でインキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大せずグルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が６±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25 ｍＭではインスリン分泌量が7.5±2.5ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にある細胞を含有しないことを更に特徴とする細胞株をも提供する。
【００１２】
上記の各細胞株の各々において、該ＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液の好ましい組成は、塩化ナトリウム119 ｍＭ、塩化カリウム4.74 ｍＭ、塩化カルシウム2.54 ｍＭ、塩化マグネシウム 1.19 ｍＭ、リン酸二水素カリウム 1.19 ｍＭ、炭酸水素ナトリウム 25 ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ 10 ｍＭである。
【００１３】
本発明のＭＩＮ６ｍ９細胞株は、多数回の反復継代培養に耐えて優れたグルコース誘導性インスリン分泌機能を安定に維持できる。このため、ｍ９細胞株は、２型糖尿病の治療薬の開発において、候補化合物のスクリーニングシステムとして、及びそれに基づく化合物設計のために、有利に利用することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
上記の通り、ｍ９細胞は、グルコースに応答して濃度依存性にインスリン分泌を増大させ、その分泌特性は正常の膵島と同様であった。一方、ｍ１４細胞は、後述のように、グルコースに対し（及びα−ケトイソカプロン酸に対しても）弱い応答性しか示さなかったが、膜の脱分極後のインスリン分泌は正常を維持している。乳酸分泌及びグルコース消費は、ｍ１４細胞において促進されており、そしてｍ１４細胞は、グルコースによって産生されるＡＴＰはカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のアンカップラーである）によって影響を受けない。
【００１５】
本発明のｍ９細胞について、グルコース応答性の低い細胞（ｍ１４）との対比でのｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにより、後述のように、顕著に異なったレベルで発現している10個の遺伝子が見出された。これらの遺伝子は、グルコース誘導性インスリン分泌の分子的基礎を明らかにするのに有用であると共に、２型糖尿病治療剤候補化合物の作用の評価及び分子設計において、ｍ９細胞のグルコース誘導性インスリン分泌に与える各種化合物の影響を、それらの遺伝子の発現の変動と関連づけて評価することを可能にする。このことは、ｍ９細胞を利用した２型糖尿病治療薬の開発を促進するものである。
以下、実施例により、本発明のＭＩＮ６ｍ９細胞株の調製及びその生理学的特徴につき具体的に説明する。
【００１６】
【実施例】
＜ＭＩＮ６細胞のサブクローニング＞
ＭＩＮ６細胞を、10％の熱不活性化胎仔牛血清、50μＭ の２−メルカプトエタノール、100 ｍｇ／ｌのストレプトマイシン及び60.5ｍｇ／ｌの硫酸ペニシリンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、25 ｍＭのグルコース）中で、５％ＣＯ2／95％空気の湿潤した条件で37℃にて培養した。ＭＩＮ６細胞からの細胞のサブクローニングは限界希釈法により行った。要するに、細胞を希釈し、単一の細胞から発した別個のコロニーを形成するようにペトリ皿中で培養した。各コロニーをとり、新たなペトリ皿中で更に培養してクローン細胞を得た。次いで細胞をグルコース誘導性インスリン分泌を指標としてスクリーニングした。基準は、３ ｍＭグルコースによる場合との比較したとき、25ｍＭグルコースによるインスリン分泌の有意な増加とした。
【００１７】
（結果）
本発明者等は、ＭＩＮ６細胞から総計42の細胞株をサブクローンした。これらのうち、グルコースに対する応答良好株及び応答不良株として、それぞれＭＩＮ６ｍ９（工業技術院生命工学工業技術研究所：ＦＥＲＭ Ｐ−１８０８１）及びｍ１４と本発明者等が命名した２つの細胞株を選択した。これら２つの細胞株の形態における唯一の相違は、ｍ１４細胞が概して丸く、一方ｍ９細胞は幾分不規則な形状をしていることである（図１を参照）。細胞増殖率はｍ１４よりｍ９の方が僅かに高かった。双方の細胞株とも、18回の継代培養で樹立され、以下の通りその機能的特性が確認された。
【００１８】
＜インスリン分泌の測定＞
細胞を播種し（１×105個／ウェル、48ウェルプレート）、ＤＭＥＭ中で２日間予備培養した。実験当日に、細胞を、0.5％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液（ＫＲＨ：119 ｍＭの塩化ナトリウム、4.74 ｍＭの塩化カリウム、2.54 ｍＭの塩化カルシウム、1.19 ｍＭの塩化マグネシウム、1.19 ｍＭのリン酸二水素カリウム、25 ｍＭの炭酸水素ナトリウム、及び10 ｍＭのHEPES、ｐＨ7.4）（ＢＳＡ−ＫＲＨ）で一回洗浄した。同じ緩衝液中で細胞を５ ｍＭのグルコースと共に30分間予備インキュベートした。BSA-KRHで２回洗浄の後、細胞をBSA-KRH中で種々濃度のグルコース及び／又はα−ケトイソカプロン酸塩（ＫＩＣ）（解糖系を迂回する非グルコースのインスリン分泌促進剤）と共に２時間インキュベートした。次いで培地の一部をとり、エンザイムイムノアッセイ（EIA）キット（三井製薬工業）による免疫反応性のインスリンの測定のためにBSA-KRHで適度に希釈した。氷冷KRHで細胞を３回洗浄し、タンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いた細胞タンパク質量の定量のために、200μｌの１Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。分泌されたインスリン量は、細胞数やＤＮＡ含量ではなく細胞タンパク質量によって標準化した。ｍ９及びｍ１４細胞のタンパク質含量は実際上等価だからである〔ｍ９については0.21±0.029タンパク質／106細胞、ｍ１４については0.20±0.010 ｍｇタンパク質／106細胞（平均±平均偏差）〕。細胞インスリンは、酸性エタノールの添加により抽出し（Ishihara H et al., Diabetologia 36: 1139-1145 (1993) を参照）、その量はEIAにより定量した。また、2.8ｍＭのグルコース存在下において、30ｍＭ塩化カリウム及び250μＭジアゾキシドの添加により、細胞の脱分極を誘導し、インスリン分泌量を同様に測定した。
【００１９】
（結果）
ｍ９細胞からのインスリン分泌はグルコースによって濃度依存的に促進され（図２）、これは元のＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌と同等であった。ｍ９細胞はまた、α−ケトイソカプロン酸によっても濃度依存的にインスリンを分泌した（図３）。更には、正常な膵島と同様に、グリベンクラミド及びアセチルコリンの刺激効果もｍ９細胞には認められた（データは示さず）。これとは対照的に、ｍ１４細胞からのインスリン分泌は、グルコース（図２）とＫＩＣ（図３）の何れを増加しても応答は乏しく、その一方で低グルコース領域（１〜５ ｍＭ）でのｍ１４細胞からのインスリン分泌は、ｍ９細胞からのそれより高かった（図２）。2.8ｍＭのグルコース、30 ｍＭの塩化カリウム及び250μＭのジアゾキシドの存在下では、しかしながら、ｍ１４細胞はｍ９細胞とほぼ同じ量のインスリンを分泌した（図４：平均±平均偏差（ｎ＝４））。図５は、ｍ９細胞及びｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌に対する３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ：ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤である）の効果を示す。グルコース誘導性インスリン分泌は、100μＭ IBMXにより両細胞株において同様（ＩＢＭＸ不存在下のそれに比し２〜３倍増大）に増強された。更には、フォルスコリン（アデニレートサイクラーゼのアクティベーターである）及び８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（膜透過性のｃＡＭＰ類縁体である）も、ＩＢＭＸと同様の効果を示した（データは示さず）。両細胞におけるこれらのインスリン分泌の特性は、少なくとも40回の継代を経ても維持された（データは示さず）。ｍ１４細胞の細胞内インスリン含量は、ｍ９細胞のそれの半分であった（ｍ１４では41.1±5.47。対してｍ９では81.9±12.9 ｍＵ／ｍｇタンパク質；ｎ＝８〜９；ｐ＜0.01）。
【００２０】
＜培地中のグルコース及び乳酸の測定＞
グルコースはその代謝物によってインスリン分泌を促進するものであることから、本発明者等は、以下のように両細胞株の代謝上の特徴を調べた。
48ウェルのプレート中で細胞を１×105個／ウェルの密度で培養した。培養１、３及び５日後、培地の一部をとり0.3 mol／ｌの過塩素酸の添加により除蛋白した。得られた遠心上清につき、キット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて乳酸とグルコースのアッセイを行った。
【００２１】
（結果）
図６は、各細胞培地中の乳酸及びグルコースの濃度の変化を示している。ｍ１４細胞によるグルコース消費はｍ９細胞に比して遥かに高いが（図６、右）、ｍ１４から培地中へ放出された乳酸は、ｍ９細胞からのそれより有意に高かった（図６、左）（平均±平均偏差（ｎ＝６））。
【００２２】
＜細胞ＡＴＰ含量、及び呼吸鎖によるＡＴＰ合成の測定＞
細胞ＡＴＰ含量は、インスリン分泌実験と同じ条件下に測定した。すなわち、ミトコンドリアの酸化的リン酸化のアンカップラーであるカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ：Sigma, St. Louis, MO）の存在下又は不存在下に細胞を、グルコースと共に又はグルコースなしで２時間インキュベートした。次いで細胞を氷冷KRHで２回洗浄し、100μｌの細胞培養物溶解試薬（Promega, Madison, WI）で溶解させ、溶解物を収集した。ＡＴＰ量は、ＡＴＰバイオルミネッセンス アッセイキット（Roche Diagnostics）で、メーカーのマニュアルに従って測定した。
【００２３】
ジギトニンを透過させた細胞における呼吸鎖によるＡＴＰ合成の測定を行った。要するに、剥離した細胞をHAMs F10培地に懸濁させ、室温にて30分間維持した。細胞を洗浄し、150ｍＭ塩化カリウム、25ｍＭトリス塩酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、10ｍＭリン酸二水素カリウム、１ｍＭ ＡＤＰ、0.1％ＢＳＡ、20μｇ／ｍｌジギトニン、10ｍＭマレイン酸塩、及び10ｍＭグルタミン酸塩（ｐＨ7.4）中に懸濁させた。37℃にて10分間反応を持続させ、そして0.5Ｍ（最終濃度）のＰＣＡを加えて反応を終了させて、氷上で15分冷却した。次いで細胞を集め、ＡＴＰ量を上記のようにして測定した。ミトコンドリア以外によるＡＴＰ産生量を排除するため、10μＭのＣＣＣＰの存在下におけるＡＴＰ量をその不存在下におけるＡＴＰ量から引いた。
【００２４】
＜酵素活性のアッセイ＞
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、次のようにして測定した。すなわち、細胞抽出物をグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ10.0）中で１ｍＭ乳酸、５ｍＭＮＡＤ、50ｍＭグルタミン酸塩、及び10単位／ｍｌグルタメート−ピルベートトランスアミナーゼと共に25℃にてインキュベートした。340ｎｍの吸光度を読むことによりＮＡＤＨ生成速度をモニターした。酵素活性は、nmol ＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質として表した。
【００２５】
グルコースリン酸化活性の測定のためには、破壊した細胞を遠心して上清を、0.5ｍＭ ＮＡＤ、５ｍＭ ＡＴＰ、１単位／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び0.5又は50ｍＭグルコースを含むトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ7.4）中で30にてインキュベートした。340ｎｍの吸光度を読むことによりＮＡＤＨ生成速度をモニターした。酵素活性は、nmol ＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質として表した。
【００２６】
（結果）
ｍ１４細胞のグルコース消費はｍ９細胞よりも遙かに大きかったが（図６）、25ｍＭグルコースにより刺激した後の細胞内ＡＴＰ量の増加については、両細胞株の間で有意な差はなかった（図７）。ｍ９細胞のＡＴＰ含量は、10μＭ ＣＣＣＰによって大幅に低下したが、同化合物はｍ１４細胞におけるＡＴＰ産生には影響を及ぼさなかった（図７）。この観察に合致するように、非酸化的グルコース代謝物である乳酸は、ｍ１４培地における方が、ｍ９細胞培地におけるよりも高い（図６）。表１に示すように、細胞のＬＤＨ活性もまた、ｍ１４細胞において高かった。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ミトコンドリアの酸化的リン酸化システムの機能的容量を調べるため、ジギトニンを透過させたｍ９及びｍ１４細胞において、呼吸鎖によって駆動されるＡＴＰ合成を測定した。マレイン酸塩及びグルタミン酸塩で刺激したとき、ＣＣＣＰ感受性のＡＴＰ産生（ＣＣＣＰなしでのＡＴＰ産生−10μＭＣＣＣＰ存在下でのＡＴＰ産生）は、ｍ１４では減少せず、ｍ９細胞に比して却って増強された（図８）。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１及びチトクロームｃオキシダーゼサブユニット２ｍＲＮＡによる評価によれば、ｍ９及びｍ１４のミトコンドリア遺伝子の発現には、差はなかった（図９）。
【００２９】
＜電気生理学的分析＞
単一チャネル記録は、切り出した裏返し膜パッチ形態で行った [Kawaki J., et al., Diabetes, 48:2001-2006(1999)]。細胞内溶液は、110ｍＭアスパラギン酸カリウム、30ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＧＴＡ、0.084ｍＭ塩化カルシウム、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.2）。ピペット溶液は、140ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、及び５ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.4）。
【００３０】
細胞の膜電位は、電流クランプモードで穿孔パッチクランプ法 [Gonoi T., et al., J. Biol. Chem., 269:16989-16922(1994)] によって測定した。細胞外溶液は、125ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、1.3ｍＭリン酸二水素カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び2.8ｍＭグルコースを含有した（ｐＨ7.4）。ピペット溶液は、130ｍＭアスパラギン酸カリウム、10ｍＭ塩化カリウム、10ｍＭ ＥＧＴＡ、10ｍＭ ＭＯＰＳ及び100μｇ／ｍｌニスタチンを含有した（ｐＨ7.2）。
【００３１】
電圧依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）を通る全細胞Ba2+電流は、次のようにして記録した。すなわち、Ba2+をＶＤＣＣ電流の電荷キャリアーとして用いた。細胞外溶液は、40ｍＭ水酸化バリウム、20ｍＭ４−アミノピリジン、90ｍＭ水酸化テトラエチルアンモニウム、10ｍＭ塩化テトラエチルアンモニウム、140ｍＭメタンスルフォネート、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.4）。ピペット溶液は、10ｍＭ塩化セシウム、130ｍＭアスパラギン酸セシウム、10ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＡＴＰマグネシウム、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.2）。細胞を、−60ｍＶの維持電圧に保ち、400ｍｓの長さの、１ステップ10ｍＶの方形パルスを−40〜＋70ｍＶの間で４秒毎に適用した。記録は、EPC-7アンプ（List Electronics, Darmstadt, Germany）を用いて行った。
【００３２】
（結果）
図１０に示すように、ｍ１４細胞の標準化したピークＫATPチャネルコンダクタンスは、ｍ９のそれより有意に低く、このことは、細胞膜上の機能的ＫATPチャネルの数がｍ１４において相対的に少ないことを示している。しかしながら、Kir6.4及びSUR1（β細胞ＫATPチャネルの構成要素である）のｍＲＮＡレベルについては、ｍ９とｍ１４との間で有意な差はなかった（図９、Ｃ）。β細胞のＫATPチャネルによっｔ測定される膜静止電位は、ｍ９に比してｍ１４において有意に高かった（図１１）。
【００３３】
＜細胞内カルシウム濃度［Ｃａ2+］iの測定＞
154ｍＭ塩化ナトリウム、6.2ｍＭ塩化カリウム、3.3ｍＭ塩化カルシウム、1.5ｍＭリン酸二水素カリウム、1.6ｍＭ硫酸マグネシウム、12.4ｍＭ炭酸水素ナトリウム、20ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び2.8ｍＭグルコースを含有する緩衝液（ｐＨ7.4）中で、細胞に、２μＭのフラ−２−アセトキシメチルエステル（Dojindo, Kumamoto, Japan）を50分間負荷し、次いで、細胞を顕微鏡の台に載せた。約37℃にて、還流速度約１ｍｌ／分であった。［Ｃａ2+］iは測定は、二重励起波長法（340／380ｎｍ）により行った。［Ｃａ2+］iの較正は、既知濃度のＣａ2+を含有する溶液の液滴につき、較正キット（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて較正した。510ｎｍにおける蛍光発光をモニターし、コンピュータ化した画像プロセッサー（Argus-50/CA; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan）により、10秒毎に比のディジタル計算を行った。
【００３４】
［Ｃａ2+］iは、ｍ９細胞においては25ｍＭグルコースに応答して劇的に高まったが、ｍ１４細胞においては［Ｃａ2+］iに有意な変化は観察されなかった（図１２）。更に、ｍ９細胞及びｍ１４細胞におけるＶＤＣＣの電流−電圧関係を図１３に示す。ｍ１４細胞におけるＶＤＣＣ内向き電流は、ｍ９細胞のそれに比して有意に小さかった。
【００３５】
＜ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー＞
グルコース誘導性インスリン分泌の障害に関与する遺伝子を同定するために、本発明者等は、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法によりｍ９とｍ１４との間で遺伝子発現を比較した。
独立に単離した２組の総ＲＮＡを、以下の反応を２列行うのに使用した。第１鎖ｃＤＮＡは、300ｎｇの総ＲＮＡを用いて、75 pmol の９通りのＴ11ＶＶ（ここにＶはa, c 又はgである）アンカードプライマーと共にSuperscript IITM (Life Technologies, Rockville, MD) によって合成した。次に、10 ｎｇのｃＤＮＡを、Perkin Elmer Thermal Cycler（Perkin Elmer, Norwalk, CT）中で40サイクルのＰＣＲ（0.025 Ｕ／μｌの Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、12.5μＭのdNTP、0.2μCi／μｌのα−［35S］dＡＴＰ、0.5μＭの上流プライマー、及び2.5μＭの下流プライマー、総反応液量20μｌ）による増幅を行った（変性94℃×30秒、アニーリング40℃×120秒、延長72℃×90秒）。この反応において、９通りの下流アンカードプライマー（各ｃＤＮＡ合成に用いたプライマーと同一）を上流プライマーとしての24通りのランダムな任意のデカマー（ディファレンシャルディスプレーキット：宝酒造）と組み合わせて用いた。次いで、次いで２列行ったＰＣＲ産物を変性条件下に５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをWhatman 3MM紙（Whatman International Ltd., Maidstone, England）上に固定化して乾燥させた後、ゲルにKodak X-OMAT ARフィルム（Eastman-Kodak, Rochester, NY）を48〜72時間曝露した。サブクローン細胞株のどちらか一方に独特なバンドを切り出して水で抽出した。得られたDNA断片を、元のプライマーセット及び上記と同じ温度条件の下にＰＣＲにより更に増幅した。ＰＣＲ産物をSuprecTM-02（宝酒造）で精製し、pGEM-T Easy Vectors（Promega）中へサブクローンした。次いで、得られたクローンをＲＮＡブロット分析にかけた。配列決定は、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 及び ＤＮＡシーケンサー モデル377（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。これらの配列を、BLAST ネットワークサービスを用いて、the National Center for Biotechnology Informationにある配列と比較した。
【００３６】
（結果）
上記のように、アンカードプライマーと任意プライマーとの216（９×24）通りの組み合わせを用いて、ｍ９細胞とｍ１４細胞とで差別的に発現された98個の独特のバンドが逆転者酵素ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出された。これらのうち10のクローンにおいて、これら２つの細胞株の間で５倍を超える相違が確認された（図１４参照）。クローンｇ−１、ｇ−２及びｇ−３は、ｍ１４細胞においては発現が低かった。クローンｐ−１及びｐ−２は、ｍ１４細胞において過剰発現していた。
【００３７】
＜ＲＮＡブロット分析＞
ｍ９及びｍ１４細胞からの10μｇの総ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動にかけた。このＲＮＡをナイロン膜に移しとり紫外線架橋した。この膜を、マウスグルコキナーゼ（ＧＫ）（GenBank Acc. No. L38990, nt 98-652）、マウスヘキソキナーゼ（ＨＫ）（J05277, nt 1464-1903）、ハムスタースルフォニルウレア受容体１（ＳＵＲ１）（L40623, nt 3126-4049）、マウスKir6.2（U73626, nt 753-1427）、マウスＧＬＵＴ１（M23384, nt 473-885）、マウスＧＬＵＴ２（X15684, nt 297-955）、マウスＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＮＤ１）（J01420, n5 2761-3061）、マウスチトクロームｃオキシダーゼサブユニット２（ＣＯＸ２）（J01420, nt 7016-7500）、又はマウスβアクチン（X03672, nt 571-1170）のｃＤＮＡに対応するα-［32Ｐ］ｄＣＴＰ−標識プローブとハイブリダイズさせた。これらのプローブを標識するのには、Megaprimeランダムプライマー標識キット（Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用した。ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにより得られたｃＤＮＡを、同様に標識し、ハイブリダイゼーション用プローブとして用いた。-70℃にて、Kodak X-OMAT AR filmをブロットで露光した。
【００３８】
（結果）
ＲＮＡブロット分析は、高Ｋｍグルコースリン酸化酵素であるグルコキナーゼｍＲＮＡの発現が、ｍ９細胞に較べｍ１４細胞において顕著に低下していることを明らかにした（図９、Ｂ上段）。これに対し、低Ｋｍ酵素であるヘキソキナーゼｍＲＮＡは、ｍ１４細胞において顕著に増加した（図９、Ｂ下段）。50ｍＭグルコースの存在下（グルコキナーゼ＋ヘキソキナーゼの活性を表す）において、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間にグルコースリン酸化活性における差は見られなかったが、0.5ｍＭグルコースの存在下（ヘキソキナーゼ活性を表す）においては、ｍ１４細胞において活性が有意に高かった（表１を参照）。グルコキナーゼ活性（50ｍＭグルコース下でのグルコースリン酸化活性−0.5ｍＭグルコース下での活性）は、ｍ１４細胞において極度に低かった（表１）。
【００３９】
ＧＬＵＴ１ ｍＲＮＡの発現は、ｍ９細胞及びｍ１４細胞の双方に検出されたが、これに対して、ＧＬＵＴ２ ｍＲＮＡの発現は、何れの細胞株においても検出されなかった（図９、Ｄ）。ｍ９及びｍ１４のｃＤＮＡからのＧＬＵＴ２のＰＣＲ産物は、30サイクルの増幅で僅かに検出されたに過ぎなかったのに対し、ＧＬＵＴ１のＰＣＲ産物は、25サイクルの増幅で明瞭に検出された（データは示さず）。ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ２のｍＲＮＡの発現に関し、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間には有意な差はなかった。。
【００４０】
＜配列決定及びデータベース分析＞
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーによって得られたクローンを同定するために配列決定とデータベース調査とを行った。
配列決定は、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 及びDNAシーケンサー model 377 （Applied Biosystems）を用いて実施した。決定された配列をBLASTネットワークサービスを用いて、the National Center for Biotechnology Informationのデータベース中にある配列と比較した。
【００４１】
（結果）
結果を表２にまとめる。
【表２】
DLK：デルタ様タンパク質前駆体、Pref-1：前脂肪細胞因子−１、
EST：エクスプレッション シークエンス タグ、
E3KARP：Na+/H+エクスチェンジャー３キナーゼＡ調節タンパク質、
CCK：コレシストキニン
【００４２】
５個のクローンの配列は既知の遺伝子を現している。クローンg-1、g-2、及びg-3は、ｍ９細胞においてのみ発現されており、スタニオカルシン（STC）、デルタ様タンパク質前駆体（DLK）／前脂肪細胞因子１（Pref-1）、及びKIAA0480を、それぞれ表していた。クローンp-1及びp-2は、ｍ１４細胞において過剰発現されており、Na+／H+エクスチェンジャー３キナーゼＡ制御タンパク質（E3KARP）及びコレシストキニン-Ｂ（CCK-B）受容体を、それぞれ表していた。４個は、EST配列にのみ一致したに止まり、１個はGenBankデータベースの如何なる配列とも一致しなかった。
【００４３】
＜未知クローンの種々組織におけるＲＮＡブロット分析＞
上記の未知クローンの遺伝子発現の組織分布を決定するために、マウス組織のＲＮＡブロット分析を行った（図１５）。クローンg-4は、卵巣、脳、腎臓及び精巣において発現されていた。クローンg-5は、卵巣及び精巣において発現されていた。クローンp-3の発現は、卵巣、肺、腎臓、小腸、及び精巣において観察された。クローンp-4は、脳においてのみ発現されていた。クローンp-5においてはハイブリダイゼーションシグナルは検出されなかった（データは示さず）。
【００４４】
＜統計解析＞
これら２つのグループ間の統計学的な有意差は、非対Students t test によって判定した。差は、Ｐ＜0.05のとき有意であると見なした。
【００４５】
（考察）
上記研究において、本発明者等はＭＩＮ６細胞から導かれる２つの下位株を樹立し、特徴を明らかにした。一方は、ｍ９と命名したが、元のＭＩＮ６細胞と同様の特徴を有し、継代の反復後もグルコース誘導性のインスリン分泌を維持する。他方は、ｍ１４と命名したが、グルコース応答性のインスリン分泌が障害されている。ｍ１４細胞の細胞内インスリン含量はｍ９のそれの50％まで低下している。ｍ１４細胞の障害された分泌は、この細胞内グルコースの低下のみでは説明できない。なぜなら25 ｍＭ（最大下刺激）のグルコースにおけるインスリン分泌量の差は、３倍以上であり、分泌プロフィールはｍ９細胞とは質的に異なっていたからである。更には高Ｋ＋により刺激されるインスリン分泌は、これら両細胞株においてほぼ同一であり（図４）、このことは、ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害の主要な要因が膜脱分極より末端の、すなわち電位依存性Ca2+チャネル活性化やインスリン顆粒のCa2+誘導性エキソサイトーシスの異常ではないことを示唆している。
【００４６】
膵β細胞においては、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ２及びグルコースリン酸化酵素であるグルコキナーゼ（GK）が、グルコース濃度の検知において重要な役割を演じている。ｍ１４細胞におけるＧＬＵＴ２の発現レベルはｍ９細胞と異ならないが、GKのｍＲＮＡ発現レベルは低下しており、ヘキソキナーゼ（HK）のそれは上昇している（データは示さず）。しかしながら、ＫＩＣによるインスリン分泌誘導の障害、乳酸産生速度の亢進、及びグルコース誘導性ＡＴＰ産生に対するＣＣＣＰの阻害効果の顕著な低下という知見は、ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性インスリン分泌の障害が、GKの発現レベルの低下のみでは説明できず、ｍ１４細胞にTCAサイクル内又はそれ以降の異常があることを示唆している。これらの代謝像はミトコンドリアのDNAを枯渇させたβ細胞株のそれに似てはいるものの（Tsuruzoe K. et al., Diabetes 47:621-631(1998), Soejima A. et al., J Biol Chem 271:374-380(1996), Kennedy ED. et al, Diabetes 47:374-380 (1998)）、ｍ１４細胞は、ｍ９細胞と比較してミトコンドリア遺伝子の同等量を発現し（データは示さず）そして生存にビルビン酸又はウリジンの追加を必要としないことから、独特である。驚くべきことに、インスリン分泌応答において大きな相違があるにも拘わらず、グルコースは細胞内ＡＴＰを何れの細胞においても殆ど同じ程度に増加させた。ｍ９細胞におけるＡＴＰは、おおむねミトコンドリアでの酸化的リン酸化によって産生されたが、ｍ１４細胞におけるＡＴＰはそうではなかった（図７）。グルコース処理速度はｍ１４細胞において著しく亢進されていることから（図６）、ＡＴＰは主として非酸化的経路を介して（すなわち解糖それ自身によって）産生されているようである。内向き整流Kir6.2及びスルホニルウレア受容体SUR1よりなるβ細胞のＡＴＰ感受性Ｋ+チャネルは、グルコース誘導性インスリンｂ分泌におけるＡＴＰの重要な標的である。しかしながら、Kir6.2及びSUR1のｍＲＮＡの発現レベルは、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間で差がなかった（データは示さず）。こうして、ｍ９細胞との比較において、ｍ１４細胞は、グルコース誘導性インスリン分泌の障害をもたらすまだ同定されていない機構によるグルコース代謝の障害とエネルギー産生の障害との両方を持っている。
【００４７】
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法は、異なった表現型を有する２つの被検物の間の遺伝子発現の差を検出するのに効果的である。使用するプライマーの限界とＲＴ−ＰＣＲによる定量の限界のために、この方法は、異なって発現されている遺伝子のすべてを検出することはできない。実際、ＲＮＡブロッティング（データは示さず）によって見出されたGK及びHKの遺伝子発現におけるｍ９細胞とｍ１４細胞との相違は、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法によっては見逃された。それにも拘わらず、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーは、この目的に有用である。なぜならこの方法は、差引きハイブリッド形成法等のような他の方法と同じだけ多くの遺伝子をカバーできるからである。
【００４８】
本発明者等は、10個の遺伝子がｍ９細胞とｍ１４細胞との間で全く異なって発現されていることをｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法により突き止めた。これらのうち、STC及びDLK/Pref-1は、特に興味深い。なぜならばそれらはカルシウム動員又は細胞分化の制御に関与している筈だからである。STCは、硬骨魚類において最初に発見されたカルシウム制御ホルモンであり（Wager GF et al, Mol Cell Endocrionl 79:129-138(1991)）、ヒト及びマウスの両方における分化した脳ニュウロンにおけるその高い発現が、最近明らかにされた（Olsen HS et al., Proc Natl Acat Sci USA 93:1792-1796(1996), Zhang KZ et al., Ann J Pathol 153:439-445(1998)）。Zhang等はこの分子が、膜透過カルシウム流出を制御し、終末へと分化したニューロンにおける高カルシウム血症に対する保護に貢献していることを示唆している（Zhang KZ et al., Ann J Pathol 153:439-445(1998)）。DLKは、ホメオティックタンパク質のEGF様ファミリー膜貫通タンパク質であり（Lee YL et al., Biochim Biophys Acta 1261:223:232(1995)）、Pref-1は同じ遺伝子の変種産物である（Smas CM et al., Cell 73:725-734(1993)）。発生中の膵臓において、Pref-1は、初期において大半の上皮細胞中で発現されるが、その発現は後にはβ細胞にのみ限定される。更には、Pref-1の切り離された形である胎児抗原−１（FA-1）は、成人膵臓においてβ細胞のインスリン分泌顆粒中にインスリンと共に同時局在する。Pref-1/FA-1は、従って、β細胞のオートクリン増殖因子としての役割を有しそれらの分化及び増殖を制御している可能性がある（Nielsen JH et al., J Mol Med 77:62-66(1999), Jensen CH et al., Eur J Biochem 225:83-92(1994)）。
【００４９】
グルコースに応答したインスリン分泌は、膵β細胞の最も重要な機能である。グルコースがその代謝によってβ細胞からのインスリン分泌を誘導することから、グルコース代謝の経路に関与する分子の異常がインスリン分泌の障害を引き起こして２型糖尿病を発生させるということもあり得る。例えば、MODY2の発病の原因部位は、GK遺伝子中の突然変異であり、GK欠損遺伝子はまたグルコースに対するインスリン分泌応答の障害を有する。グルコース代謝に関係する分子の欠陥に加えて、膵臓の調節及び発生に関与する他の因子の障害が、インスリン分泌特性における異常を引き起こし得る。インスリン分泌β細胞は最終的且つ高度に分化していることが知られているからである。実際、β細胞特異的遺伝子の発現の調節を介してβ細胞機能に影響を及ぼすHNFs転写因子は、MODY1、3、及び5の原因となる遺伝子である（Yamagata K et al., Nature 384:458-460(1996), Yamagata K et al., Nature 384:455-458(1996), Horikawa Y et al., Nat Genet 1997 17:384-385(1997)）。加えて、他のβ細胞特異的転写因子であるIPF-1（これは膵臓前駆細胞の運命を決定し並びにインスリン遺伝子の転写を調節する）における突然変異は、MODY4の原因となる（Stoffers DA et al., Nat Genet 1997 17:138-139(1997)）。MODY患者の生理学的研究は、グルコース誘導性インスリン分泌が、正常被験者に比して有意に低下していることを明らかにしており、それのことは、β細胞のインスリン分泌応答が、グルコース代謝の変化によってのみならずβ細胞発生又は分化の変化によっても影響を受ける可能性があることを示している。従って、STC又はDLK/Pref-1の発現レベルの低さがｍ１４細胞におけるインスリン分泌に影響を及ぼしている可能性がある。
【００５０】
表２に掲げられた残りの遺伝子は、３個の既知遺伝子及び５個の未知遺伝子である。KIAA0480は、Kazuma DNAリサーチインスティテュートによって特徴づけがなされたｃＤＮＡクローンであるが、その機能は未だ知られていない。このｃＤＮＡは1252個のアミノ酸をコードしており、該タンパク質は細胞骨格関連タンパク質モチーフ（Riehemann K et al., Trends Biochem Sci 18:82-83(1993）及びリン酸結合ループ（Saraste M et al., Trenads Biochem Sci 15:430-434(1990）を含んでいる。E3KARPは、３型Na+／H+エクスチェンジャー（exchanger）（NHE3）であるが（Yun CH et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:3010-3015(1997)）、β細胞中にはNHE3が存在するという証拠はない。しかしながら、E3KARPが、他のタンパク質と結合することによって細胞機能に影響を及ぼしている可能性はあり得る。なぜなら、それは２個のPDZドメインを含んでおり且つNHE3以外のタンパク質と相互作用するとの報告があるからである（Hall RA et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:8496-8501(1998)）。CCK-B受容体は、中枢神経系における主要なCCK受容体であるが（Wank SA et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:8691-8695(1992)）、リガンドを有しない受容体の上向き調節の影響は予測困難である。これら５個の未知クローンのうち、クローンg-5及びp-4の発現は、２、３の組織に限定されており、そのことは独特の機能があることを示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞の形態を示す顕微鏡写真。
【図２】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞のグルコースに対する応答を示すグラフ。
【図３】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞のＫＩＣに対する応答を示すグラフ。
【図４】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞の膜脱分極による影響を示すグラフ（n=4）。
【図５】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌に対する３−イソブチル−１−メチルキサンチンの効果を示すグラフ。
【図６】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞培地中の乳酸及びグルコースの濃度の変化を示すグラフ（n=6）。
【図７】 25ｍＭグルコース及び10μＭ ＣＣＣＰのＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞の細胞内ＡＴＰ量に対する影響を示すグラフ。
【図８】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞のＣＣＣＰ感受性のＡＴＰ産生を示すグラフ。
【図９】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における、グルコース誘導性インスリン分泌に関与するｍＲＮＡの発現を示す、ＲＮＡブロット。
【図１０】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるピークＫATPチャネルコンダクタンスを示すグラフ。
【図１１】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における膜静止電位を示すグラフ。
【図１２】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における25ｍＭグルコースの細胞内Ｃａ2+濃度に対する影響を示すグラフ。
【図１３】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるＶＤＣＣの電流−電圧関係を示すグラフ。
【図１４】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞についてのｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにおける主たる相違を示す。
【図１５】 未知遺伝子のマウス組織分布を示すＲＮＡブロット分析。
本発明は、インスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６の、長期間の継代培養に耐えて機能を維持する新たな下位株に関し、更に詳しくはグルコース応答性の良好なＭＩＮ６ｍ９細胞株に関する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
膵β細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害は、２型糖尿病の発生における重要な一要因であることが知られている。２型糖尿病は、膵β細胞からのインスリン分泌の障害及び標的組織におけるインスリンの作用の障害の両方によって特徴づけられる多機能障害であるが、何れの欠陥が主たるものであるのかは決定されていない。しかしながら、欠陥のあるβ細胞機能自身が２型糖尿病の発病に重要であることを示唆する証拠が蓄積されてきた。
【０００３】
例えば、２型糖尿病の幾つかのサブタイプは、インスリン機能に関与する遺伝子とは別の、β細胞で発現される遺伝子の突然変異によって引き起こされることが見出されている。これらは、若者の成人発症型糖尿病の幾つかのサブタイプ（ＭＯＤＹ１〜５）を含んでいる。ＭＯＤＹ１，２，３，４，及び５は、それぞれ、肝細胞核因子（ＨＮＦ）４α、グルコキナーゼ（ＧＫ）、ＨＮＦ１α、インスリンプロモーター因子１（ＩＰＦ−１）、及びＨＮＦ１βにおける突然変異によって引き起こされ、それらは何れもインスリンの合成及び分泌並びにβ細胞の発生を含む、膵β細胞機能に関係している。
【０００４】
加えて、母体から伝えられるミトコンドリア遺伝子の突然変異が、おそらくＡＴＰ産生の欠陥のために、インスリン分泌障害による糖尿病を引き起こすと考えられている。インスリン分泌は、血液中のグルコース濃度の制御に決定的であるから、インスリン合成及び／又はインスリン分泌に関与している膵β細胞における遺伝子発現の変化によるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害は、２型糖尿病の発症に十分寄与し得る。
【０００５】
グルコース誘導性のインスリン分泌の障害に関与する遺伝子を同定するための一つの方法は、正常被験者のβ細胞における遺伝子発現を、グルコース誘導性のインスリン分泌の障害を有する２型糖尿病患者のそれらと比較することであるが、しかしこれは現実的でない。なぜならば、ヒト被験者からの膵島は得るのが困難だからである。別のアプローチは、例えば正常のインスリン応答を示す細胞株と障害された応答を示す細胞株のような、異なったインスリン分泌プロフィールを示す２つの異なった細胞株の間で、遺伝子の発現を比較することである。
【０００６】
ＭＩＮ６細胞株は、グルコースその他の分泌促進物質に対するインスリン分泌応答を維持している数少ないβ細胞株の一つであり（Miyazaki J et al., Endocrinology 127:126-132(1990), Ishihara H et al., Diabetologia 36:1139-1145(1993)）、インスリン分泌の機構の研究において繁用されている。しかしながら、実験中において、継代していくうちにＭＩＮ６からのグルコース誘導性のインスリン分泌が突然失われる例がこれまでしばしば認められており、それはグルコース応答性の乏しい細胞の過剰増殖か又はグルコース誘導性のインスリン分泌を担う遺伝子発現低下による可能性がある。従って、グルコースに対し異なったインスリン分泌応答を示すＭＩＮ６細胞のサブクローニングは、それらの間での遺伝子の発現の比較とグルコースに対するインスリン分泌応答の障害に関係する遺伝子の同定とを可能にするであろう。また、そのようなＭＩＮ６細胞下位株は、２型糖尿病の治療薬の開発に有力な手段を提供することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景の下で、本発明は、繰り返しの継代培養に耐えて当初の機能を一貫して維持することのできるインスリン分泌細胞株を提供することを目的とし、特に、そのような安定な細胞株であってグルコース応答性の良好な株を含有しない細胞株を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明等は、インスリン分泌β細胞株であるＭＩＮ６細胞から上記の目的にかなう下位株を樹立することを試みた。その結果、限界希釈法を用いたＭＩＮ６からの単一細胞を起源とするコロニー培養と、グルコース誘導性インスリン分泌を指標とするこれらのコロニーのスクリーニングとを組み合わせることによって、グルコース誘導性のインスリン分泌特性において明瞭に異なり、且つ度重なる継代培養を経ても機能的特性が維持されるという特徴を備えた、２つの下位株（「ＭＩＮ６ｍ９」及び「ＭＩＮ６ｍ１４」と命名。それぞれ、「ｍ９」及び「ｍ１４」と略す）を樹立することに成功した。
【０００９】
すなわち本発明は、先ず、ＭＩＮ６細胞株を限界希釈し培養して得ることのできるモノクローナル細胞株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とする細胞株（ｍ９）を提供する。
【００１０】
本発明のｍ９細胞株は、モノクローナル細胞株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大せず、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が６±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25 ｍＭではインスリン分泌量が7.5±2.5ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とする細胞株（ｍ１４）は含んでいない。
【００１１】
従って、本発明は、ＭＩＮ６細胞株より誘導される下位株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とし、且つ、同一条件でインキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大せずグルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が６±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25 ｍＭではインスリン分泌量が7.5±2.5ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にある細胞を含有しないことを更に特徴とする細胞株をも提供する。
【００１２】
上記の各細胞株の各々において、該ＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液の好ましい組成は、塩化ナトリウム119 ｍＭ、塩化カリウム4.74 ｍＭ、塩化カルシウム2.54 ｍＭ、塩化マグネシウム 1.19 ｍＭ、リン酸二水素カリウム 1.19 ｍＭ、炭酸水素ナトリウム 25 ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ 10 ｍＭである。
【００１３】
本発明のＭＩＮ６ｍ９細胞株は、多数回の反復継代培養に耐えて優れたグルコース誘導性インスリン分泌機能を安定に維持できる。このため、ｍ９細胞株は、２型糖尿病の治療薬の開発において、候補化合物のスクリーニングシステムとして、及びそれに基づく化合物設計のために、有利に利用することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
上記の通り、ｍ９細胞は、グルコースに応答して濃度依存性にインスリン分泌を増大させ、その分泌特性は正常の膵島と同様であった。一方、ｍ１４細胞は、後述のように、グルコースに対し（及びα−ケトイソカプロン酸に対しても）弱い応答性しか示さなかったが、膜の脱分極後のインスリン分泌は正常を維持している。乳酸分泌及びグルコース消費は、ｍ１４細胞において促進されており、そしてｍ１４細胞は、グルコースによって産生されるＡＴＰはカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のアンカップラーである）によって影響を受けない。
【００１５】
本発明のｍ９細胞について、グルコース応答性の低い細胞（ｍ１４）との対比でのｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにより、後述のように、顕著に異なったレベルで発現している10個の遺伝子が見出された。これらの遺伝子は、グルコース誘導性インスリン分泌の分子的基礎を明らかにするのに有用であると共に、２型糖尿病治療剤候補化合物の作用の評価及び分子設計において、ｍ９細胞のグルコース誘導性インスリン分泌に与える各種化合物の影響を、それらの遺伝子の発現の変動と関連づけて評価することを可能にする。このことは、ｍ９細胞を利用した２型糖尿病治療薬の開発を促進するものである。
以下、実施例により、本発明のＭＩＮ６ｍ９細胞株の調製及びその生理学的特徴につき具体的に説明する。
【００１６】
【実施例】
＜ＭＩＮ６細胞のサブクローニング＞
ＭＩＮ６細胞を、10％の熱不活性化胎仔牛血清、50μＭ の２−メルカプトエタノール、100 ｍｇ／ｌのストレプトマイシン及び60.5ｍｇ／ｌの硫酸ペニシリンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、25 ｍＭのグルコース）中で、５％ＣＯ2／95％空気の湿潤した条件で37℃にて培養した。ＭＩＮ６細胞からの細胞のサブクローニングは限界希釈法により行った。要するに、細胞を希釈し、単一の細胞から発した別個のコロニーを形成するようにペトリ皿中で培養した。各コロニーをとり、新たなペトリ皿中で更に培養してクローン細胞を得た。次いで細胞をグルコース誘導性インスリン分泌を指標としてスクリーニングした。基準は、３ ｍＭグルコースによる場合との比較したとき、25ｍＭグルコースによるインスリン分泌の有意な増加とした。
【００１７】
（結果）
本発明者等は、ＭＩＮ６細胞から総計42の細胞株をサブクローンした。これらのうち、グルコースに対する応答良好株及び応答不良株として、それぞれＭＩＮ６ｍ９（工業技術院生命工学工業技術研究所：ＦＥＲＭ Ｐ−１８０８１）及びｍ１４と本発明者等が命名した２つの細胞株を選択した。これら２つの細胞株の形態における唯一の相違は、ｍ１４細胞が概して丸く、一方ｍ９細胞は幾分不規則な形状をしていることである（図１を参照）。細胞増殖率はｍ１４よりｍ９の方が僅かに高かった。双方の細胞株とも、18回の継代培養で樹立され、以下の通りその機能的特性が確認された。
【００１８】
＜インスリン分泌の測定＞
細胞を播種し（１×105個／ウェル、48ウェルプレート）、ＤＭＥＭ中で２日間予備培養した。実験当日に、細胞を、0.5％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液（ＫＲＨ：119 ｍＭの塩化ナトリウム、4.74 ｍＭの塩化カリウム、2.54 ｍＭの塩化カルシウム、1.19 ｍＭの塩化マグネシウム、1.19 ｍＭのリン酸二水素カリウム、25 ｍＭの炭酸水素ナトリウム、及び10 ｍＭのHEPES、ｐＨ7.4）（ＢＳＡ−ＫＲＨ）で一回洗浄した。同じ緩衝液中で細胞を５ ｍＭのグルコースと共に30分間予備インキュベートした。BSA-KRHで２回洗浄の後、細胞をBSA-KRH中で種々濃度のグルコース及び／又はα−ケトイソカプロン酸塩（ＫＩＣ）（解糖系を迂回する非グルコースのインスリン分泌促進剤）と共に２時間インキュベートした。次いで培地の一部をとり、エンザイムイムノアッセイ（EIA）キット（三井製薬工業）による免疫反応性のインスリンの測定のためにBSA-KRHで適度に希釈した。氷冷KRHで細胞を３回洗浄し、タンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いた細胞タンパク質量の定量のために、200μｌの１Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。分泌されたインスリン量は、細胞数やＤＮＡ含量ではなく細胞タンパク質量によって標準化した。ｍ９及びｍ１４細胞のタンパク質含量は実際上等価だからである〔ｍ９については0.21±0.029タンパク質／106細胞、ｍ１４については0.20±0.010 ｍｇタンパク質／106細胞（平均±平均偏差）〕。細胞インスリンは、酸性エタノールの添加により抽出し（Ishihara H et al., Diabetologia 36: 1139-1145 (1993) を参照）、その量はEIAにより定量した。また、2.8ｍＭのグルコース存在下において、30ｍＭ塩化カリウム及び250μＭジアゾキシドの添加により、細胞の脱分極を誘導し、インスリン分泌量を同様に測定した。
【００１９】
（結果）
ｍ９細胞からのインスリン分泌はグルコースによって濃度依存的に促進され（図２）、これは元のＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌と同等であった。ｍ９細胞はまた、α−ケトイソカプロン酸によっても濃度依存的にインスリンを分泌した（図３）。更には、正常な膵島と同様に、グリベンクラミド及びアセチルコリンの刺激効果もｍ９細胞には認められた（データは示さず）。これとは対照的に、ｍ１４細胞からのインスリン分泌は、グルコース（図２）とＫＩＣ（図３）の何れを増加しても応答は乏しく、その一方で低グルコース領域（１〜５ ｍＭ）でのｍ１４細胞からのインスリン分泌は、ｍ９細胞からのそれより高かった（図２）。2.8ｍＭのグルコース、30 ｍＭの塩化カリウム及び250μＭのジアゾキシドの存在下では、しかしながら、ｍ１４細胞はｍ９細胞とほぼ同じ量のインスリンを分泌した（図４：平均±平均偏差（ｎ＝４））。図５は、ｍ９細胞及びｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌に対する３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ：ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤である）の効果を示す。グルコース誘導性インスリン分泌は、100μＭ IBMXにより両細胞株において同様（ＩＢＭＸ不存在下のそれに比し２〜３倍増大）に増強された。更には、フォルスコリン（アデニレートサイクラーゼのアクティベーターである）及び８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（膜透過性のｃＡＭＰ類縁体である）も、ＩＢＭＸと同様の効果を示した（データは示さず）。両細胞におけるこれらのインスリン分泌の特性は、少なくとも40回の継代を経ても維持された（データは示さず）。ｍ１４細胞の細胞内インスリン含量は、ｍ９細胞のそれの半分であった（ｍ１４では41.1±5.47。対してｍ９では81.9±12.9 ｍＵ／ｍｇタンパク質；ｎ＝８〜９；ｐ＜0.01）。
【００２０】
＜培地中のグルコース及び乳酸の測定＞
グルコースはその代謝物によってインスリン分泌を促進するものであることから、本発明者等は、以下のように両細胞株の代謝上の特徴を調べた。
48ウェルのプレート中で細胞を１×105個／ウェルの密度で培養した。培養１、３及び５日後、培地の一部をとり0.3 mol／ｌの過塩素酸の添加により除蛋白した。得られた遠心上清につき、キット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて乳酸とグルコースのアッセイを行った。
【００２１】
（結果）
図６は、各細胞培地中の乳酸及びグルコースの濃度の変化を示している。ｍ１４細胞によるグルコース消費はｍ９細胞に比して遥かに高いが（図６、右）、ｍ１４から培地中へ放出された乳酸は、ｍ９細胞からのそれより有意に高かった（図６、左）（平均±平均偏差（ｎ＝６））。
【００２２】
＜細胞ＡＴＰ含量、及び呼吸鎖によるＡＴＰ合成の測定＞
細胞ＡＴＰ含量は、インスリン分泌実験と同じ条件下に測定した。すなわち、ミトコンドリアの酸化的リン酸化のアンカップラーであるカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ：Sigma, St. Louis, MO）の存在下又は不存在下に細胞を、グルコースと共に又はグルコースなしで２時間インキュベートした。次いで細胞を氷冷KRHで２回洗浄し、100μｌの細胞培養物溶解試薬（Promega, Madison, WI）で溶解させ、溶解物を収集した。ＡＴＰ量は、ＡＴＰバイオルミネッセンス アッセイキット（Roche Diagnostics）で、メーカーのマニュアルに従って測定した。
【００２３】
ジギトニンを透過させた細胞における呼吸鎖によるＡＴＰ合成の測定を行った。要するに、剥離した細胞をHAMs F10培地に懸濁させ、室温にて30分間維持した。細胞を洗浄し、150ｍＭ塩化カリウム、25ｍＭトリス塩酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、10ｍＭリン酸二水素カリウム、１ｍＭ ＡＤＰ、0.1％ＢＳＡ、20μｇ／ｍｌジギトニン、10ｍＭマレイン酸塩、及び10ｍＭグルタミン酸塩（ｐＨ7.4）中に懸濁させた。37℃にて10分間反応を持続させ、そして0.5Ｍ（最終濃度）のＰＣＡを加えて反応を終了させて、氷上で15分冷却した。次いで細胞を集め、ＡＴＰ量を上記のようにして測定した。ミトコンドリア以外によるＡＴＰ産生量を排除するため、10μＭのＣＣＣＰの存在下におけるＡＴＰ量をその不存在下におけるＡＴＰ量から引いた。
【００２４】
＜酵素活性のアッセイ＞
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、次のようにして測定した。すなわち、細胞抽出物をグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ10.0）中で１ｍＭ乳酸、５ｍＭＮＡＤ、50ｍＭグルタミン酸塩、及び10単位／ｍｌグルタメート−ピルベートトランスアミナーゼと共に25℃にてインキュベートした。340ｎｍの吸光度を読むことによりＮＡＤＨ生成速度をモニターした。酵素活性は、nmol ＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質として表した。
【００２５】
グルコースリン酸化活性の測定のためには、破壊した細胞を遠心して上清を、0.5ｍＭ ＮＡＤ、５ｍＭ ＡＴＰ、１単位／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び0.5又は50ｍＭグルコースを含むトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ7.4）中で30にてインキュベートした。340ｎｍの吸光度を読むことによりＮＡＤＨ生成速度をモニターした。酵素活性は、nmol ＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質として表した。
【００２６】
（結果）
ｍ１４細胞のグルコース消費はｍ９細胞よりも遙かに大きかったが（図６）、25ｍＭグルコースにより刺激した後の細胞内ＡＴＰ量の増加については、両細胞株の間で有意な差はなかった（図７）。ｍ９細胞のＡＴＰ含量は、10μＭ ＣＣＣＰによって大幅に低下したが、同化合物はｍ１４細胞におけるＡＴＰ産生には影響を及ぼさなかった（図７）。この観察に合致するように、非酸化的グルコース代謝物である乳酸は、ｍ１４培地における方が、ｍ９細胞培地におけるよりも高い（図６）。表１に示すように、細胞のＬＤＨ活性もまた、ｍ１４細胞において高かった。
【００２７】
【表１】
ミトコンドリアの酸化的リン酸化システムの機能的容量を調べるため、ジギトニンを透過させたｍ９及びｍ１４細胞において、呼吸鎖によって駆動されるＡＴＰ合成を測定した。マレイン酸塩及びグルタミン酸塩で刺激したとき、ＣＣＣＰ感受性のＡＴＰ産生（ＣＣＣＰなしでのＡＴＰ産生−10μＭＣＣＣＰ存在下でのＡＴＰ産生）は、ｍ１４では減少せず、ｍ９細胞に比して却って増強された（図８）。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１及びチトクロームｃオキシダーゼサブユニット２ｍＲＮＡによる評価によれば、ｍ９及びｍ１４のミトコンドリア遺伝子の発現には、差はなかった（図９）。
【００２９】
＜電気生理学的分析＞
単一チャネル記録は、切り出した裏返し膜パッチ形態で行った [Kawaki J., et al., Diabetes, 48:2001-2006(1999)]。細胞内溶液は、110ｍＭアスパラギン酸カリウム、30ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＧＴＡ、0.084ｍＭ塩化カルシウム、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.2）。ピペット溶液は、140ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、及び５ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.4）。
【００３０】
細胞の膜電位は、電流クランプモードで穿孔パッチクランプ法 [Gonoi T., et al., J. Biol. Chem., 269:16989-16922(1994)] によって測定した。細胞外溶液は、125ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、1.3ｍＭリン酸二水素カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び2.8ｍＭグルコースを含有した（ｐＨ7.4）。ピペット溶液は、130ｍＭアスパラギン酸カリウム、10ｍＭ塩化カリウム、10ｍＭ ＥＧＴＡ、10ｍＭ ＭＯＰＳ及び100μｇ／ｍｌニスタチンを含有した（ｐＨ7.2）。
【００３１】
電圧依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）を通る全細胞Ba2+電流は、次のようにして記録した。すなわち、Ba2+をＶＤＣＣ電流の電荷キャリアーとして用いた。細胞外溶液は、40ｍＭ水酸化バリウム、20ｍＭ４−アミノピリジン、90ｍＭ水酸化テトラエチルアンモニウム、10ｍＭ塩化テトラエチルアンモニウム、140ｍＭメタンスルフォネート、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.4）。ピペット溶液は、10ｍＭ塩化セシウム、130ｍＭアスパラギン酸セシウム、10ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＡＴＰマグネシウム、及び10ｍＭ ＭＯＰＳを含有した（ｐＨ7.2）。細胞を、−60ｍＶの維持電圧に保ち、400ｍｓの長さの、１ステップ10ｍＶの方形パルスを−40〜＋70ｍＶの間で４秒毎に適用した。記録は、EPC-7アンプ（List Electronics, Darmstadt, Germany）を用いて行った。
【００３２】
（結果）
図１０に示すように、ｍ１４細胞の標準化したピークＫATPチャネルコンダクタンスは、ｍ９のそれより有意に低く、このことは、細胞膜上の機能的ＫATPチャネルの数がｍ１４において相対的に少ないことを示している。しかしながら、Kir6.4及びSUR1（β細胞ＫATPチャネルの構成要素である）のｍＲＮＡレベルについては、ｍ９とｍ１４との間で有意な差はなかった（図９、Ｃ）。β細胞のＫATPチャネルによっｔ測定される膜静止電位は、ｍ９に比してｍ１４において有意に高かった（図１１）。
【００３３】
＜細胞内カルシウム濃度［Ｃａ2+］iの測定＞
154ｍＭ塩化ナトリウム、6.2ｍＭ塩化カリウム、3.3ｍＭ塩化カルシウム、1.5ｍＭリン酸二水素カリウム、1.6ｍＭ硫酸マグネシウム、12.4ｍＭ炭酸水素ナトリウム、20ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び2.8ｍＭグルコースを含有する緩衝液（ｐＨ7.4）中で、細胞に、２μＭのフラ−２−アセトキシメチルエステル（Dojindo, Kumamoto, Japan）を50分間負荷し、次いで、細胞を顕微鏡の台に載せた。約37℃にて、還流速度約１ｍｌ／分であった。［Ｃａ2+］iは測定は、二重励起波長法（340／380ｎｍ）により行った。［Ｃａ2+］iの較正は、既知濃度のＣａ2+を含有する溶液の液滴につき、較正キット（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて較正した。510ｎｍにおける蛍光発光をモニターし、コンピュータ化した画像プロセッサー（Argus-50/CA; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan）により、10秒毎に比のディジタル計算を行った。
【００３４】
［Ｃａ2+］iは、ｍ９細胞においては25ｍＭグルコースに応答して劇的に高まったが、ｍ１４細胞においては［Ｃａ2+］iに有意な変化は観察されなかった（図１２）。更に、ｍ９細胞及びｍ１４細胞におけるＶＤＣＣの電流−電圧関係を図１３に示す。ｍ１４細胞におけるＶＤＣＣ内向き電流は、ｍ９細胞のそれに比して有意に小さかった。
【００３５】
＜ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー＞
グルコース誘導性インスリン分泌の障害に関与する遺伝子を同定するために、本発明者等は、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法によりｍ９とｍ１４との間で遺伝子発現を比較した。
独立に単離した２組の総ＲＮＡを、以下の反応を２列行うのに使用した。第１鎖ｃＤＮＡは、300ｎｇの総ＲＮＡを用いて、75 pmol の９通りのＴ11ＶＶ（ここにＶはa, c 又はgである）アンカードプライマーと共にSuperscript IITM (Life Technologies, Rockville, MD) によって合成した。次に、10 ｎｇのｃＤＮＡを、Perkin Elmer Thermal Cycler（Perkin Elmer, Norwalk, CT）中で40サイクルのＰＣＲ（0.025 Ｕ／μｌの Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、12.5μＭのdNTP、0.2μCi／μｌのα−［35S］dＡＴＰ、0.5μＭの上流プライマー、及び2.5μＭの下流プライマー、総反応液量20μｌ）による増幅を行った（変性94℃×30秒、アニーリング40℃×120秒、延長72℃×90秒）。この反応において、９通りの下流アンカードプライマー（各ｃＤＮＡ合成に用いたプライマーと同一）を上流プライマーとしての24通りのランダムな任意のデカマー（ディファレンシャルディスプレーキット：宝酒造）と組み合わせて用いた。次いで、次いで２列行ったＰＣＲ産物を変性条件下に５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをWhatman 3MM紙（Whatman International Ltd., Maidstone, England）上に固定化して乾燥させた後、ゲルにKodak X-OMAT ARフィルム（Eastman-Kodak, Rochester, NY）を48〜72時間曝露した。サブクローン細胞株のどちらか一方に独特なバンドを切り出して水で抽出した。得られたDNA断片を、元のプライマーセット及び上記と同じ温度条件の下にＰＣＲにより更に増幅した。ＰＣＲ産物をSuprecTM-02（宝酒造）で精製し、pGEM-T Easy Vectors（Promega）中へサブクローンした。次いで、得られたクローンをＲＮＡブロット分析にかけた。配列決定は、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 及び ＤＮＡシーケンサー モデル377（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。これらの配列を、BLAST ネットワークサービスを用いて、the National Center for Biotechnology Informationにある配列と比較した。
【００３６】
（結果）
上記のように、アンカードプライマーと任意プライマーとの216（９×24）通りの組み合わせを用いて、ｍ９細胞とｍ１４細胞とで差別的に発現された98個の独特のバンドが逆転者酵素ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出された。これらのうち10のクローンにおいて、これら２つの細胞株の間で５倍を超える相違が確認された（図１４参照）。クローンｇ−１、ｇ−２及びｇ−３は、ｍ１４細胞においては発現が低かった。クローンｐ−１及びｐ−２は、ｍ１４細胞において過剰発現していた。
【００３７】
＜ＲＮＡブロット分析＞
ｍ９及びｍ１４細胞からの10μｇの総ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動にかけた。このＲＮＡをナイロン膜に移しとり紫外線架橋した。この膜を、マウスグルコキナーゼ（ＧＫ）（GenBank Acc. No. L38990, nt 98-652）、マウスヘキソキナーゼ（ＨＫ）（J05277, nt 1464-1903）、ハムスタースルフォニルウレア受容体１（ＳＵＲ１）（L40623, nt 3126-4049）、マウスKir6.2（U73626, nt 753-1427）、マウスＧＬＵＴ１（M23384, nt 473-885）、マウスＧＬＵＴ２（X15684, nt 297-955）、マウスＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＮＤ１）（J01420, n5 2761-3061）、マウスチトクロームｃオキシダーゼサブユニット２（ＣＯＸ２）（J01420, nt 7016-7500）、又はマウスβアクチン（X03672, nt 571-1170）のｃＤＮＡに対応するα-［32Ｐ］ｄＣＴＰ−標識プローブとハイブリダイズさせた。これらのプローブを標識するのには、Megaprimeランダムプライマー標識キット（Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用した。ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにより得られたｃＤＮＡを、同様に標識し、ハイブリダイゼーション用プローブとして用いた。-70℃にて、Kodak X-OMAT AR filmをブロットで露光した。
【００３８】
（結果）
ＲＮＡブロット分析は、高Ｋｍグルコースリン酸化酵素であるグルコキナーゼｍＲＮＡの発現が、ｍ９細胞に較べｍ１４細胞において顕著に低下していることを明らかにした（図９、Ｂ上段）。これに対し、低Ｋｍ酵素であるヘキソキナーゼｍＲＮＡは、ｍ１４細胞において顕著に増加した（図９、Ｂ下段）。50ｍＭグルコースの存在下（グルコキナーゼ＋ヘキソキナーゼの活性を表す）において、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間にグルコースリン酸化活性における差は見られなかったが、0.5ｍＭグルコースの存在下（ヘキソキナーゼ活性を表す）においては、ｍ１４細胞において活性が有意に高かった（表１を参照）。グルコキナーゼ活性（50ｍＭグルコース下でのグルコースリン酸化活性−0.5ｍＭグルコース下での活性）は、ｍ１４細胞において極度に低かった（表１）。
【００３９】
ＧＬＵＴ１ ｍＲＮＡの発現は、ｍ９細胞及びｍ１４細胞の双方に検出されたが、これに対して、ＧＬＵＴ２ ｍＲＮＡの発現は、何れの細胞株においても検出されなかった（図９、Ｄ）。ｍ９及びｍ１４のｃＤＮＡからのＧＬＵＴ２のＰＣＲ産物は、30サイクルの増幅で僅かに検出されたに過ぎなかったのに対し、ＧＬＵＴ１のＰＣＲ産物は、25サイクルの増幅で明瞭に検出された（データは示さず）。ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ２のｍＲＮＡの発現に関し、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間には有意な差はなかった。。
【００４０】
＜配列決定及びデータベース分析＞
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーによって得られたクローンを同定するために配列決定とデータベース調査とを行った。
配列決定は、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 及びDNAシーケンサー model 377 （Applied Biosystems）を用いて実施した。決定された配列をBLASTネットワークサービスを用いて、the National Center for Biotechnology Informationのデータベース中にある配列と比較した。
【００４１】
（結果）
結果を表２にまとめる。
【表２】
EST：エクスプレッション シークエンス タグ、
E3KARP：Na+/H+エクスチェンジャー３キナーゼＡ調節タンパク質、
CCK：コレシストキニン
【００４２】
５個のクローンの配列は既知の遺伝子を現している。クローンg-1、g-2、及びg-3は、ｍ９細胞においてのみ発現されており、スタニオカルシン（STC）、デルタ様タンパク質前駆体（DLK）／前脂肪細胞因子１（Pref-1）、及びKIAA0480を、それぞれ表していた。クローンp-1及びp-2は、ｍ１４細胞において過剰発現されており、Na+／H+エクスチェンジャー３キナーゼＡ制御タンパク質（E3KARP）及びコレシストキニン-Ｂ（CCK-B）受容体を、それぞれ表していた。４個は、EST配列にのみ一致したに止まり、１個はGenBankデータベースの如何なる配列とも一致しなかった。
【００４３】
＜未知クローンの種々組織におけるＲＮＡブロット分析＞
上記の未知クローンの遺伝子発現の組織分布を決定するために、マウス組織のＲＮＡブロット分析を行った（図１５）。クローンg-4は、卵巣、脳、腎臓及び精巣において発現されていた。クローンg-5は、卵巣及び精巣において発現されていた。クローンp-3の発現は、卵巣、肺、腎臓、小腸、及び精巣において観察された。クローンp-4は、脳においてのみ発現されていた。クローンp-5においてはハイブリダイゼーションシグナルは検出されなかった（データは示さず）。
【００４４】
＜統計解析＞
これら２つのグループ間の統計学的な有意差は、非対Students t test によって判定した。差は、Ｐ＜0.05のとき有意であると見なした。
【００４５】
（考察）
上記研究において、本発明者等はＭＩＮ６細胞から導かれる２つの下位株を樹立し、特徴を明らかにした。一方は、ｍ９と命名したが、元のＭＩＮ６細胞と同様の特徴を有し、継代の反復後もグルコース誘導性のインスリン分泌を維持する。他方は、ｍ１４と命名したが、グルコース応答性のインスリン分泌が障害されている。ｍ１４細胞の細胞内インスリン含量はｍ９のそれの50％まで低下している。ｍ１４細胞の障害された分泌は、この細胞内グルコースの低下のみでは説明できない。なぜなら25 ｍＭ（最大下刺激）のグルコースにおけるインスリン分泌量の差は、３倍以上であり、分泌プロフィールはｍ９細胞とは質的に異なっていたからである。更には高Ｋ＋により刺激されるインスリン分泌は、これら両細胞株においてほぼ同一であり（図４）、このことは、ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌の障害の主要な要因が膜脱分極より末端の、すなわち電位依存性Ca2+チャネル活性化やインスリン顆粒のCa2+誘導性エキソサイトーシスの異常ではないことを示唆している。
【００４６】
膵β細胞においては、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ２及びグルコースリン酸化酵素であるグルコキナーゼ（GK）が、グルコース濃度の検知において重要な役割を演じている。ｍ１４細胞におけるＧＬＵＴ２の発現レベルはｍ９細胞と異ならないが、GKのｍＲＮＡ発現レベルは低下しており、ヘキソキナーゼ（HK）のそれは上昇している（データは示さず）。しかしながら、ＫＩＣによるインスリン分泌誘導の障害、乳酸産生速度の亢進、及びグルコース誘導性ＡＴＰ産生に対するＣＣＣＰの阻害効果の顕著な低下という知見は、ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性インスリン分泌の障害が、GKの発現レベルの低下のみでは説明できず、ｍ１４細胞にTCAサイクル内又はそれ以降の異常があることを示唆している。これらの代謝像はミトコンドリアのDNAを枯渇させたβ細胞株のそれに似てはいるものの（Tsuruzoe K. et al., Diabetes 47:621-631(1998), Soejima A. et al., J Biol Chem 271:374-380(1996), Kennedy ED. et al, Diabetes 47:374-380 (1998)）、ｍ１４細胞は、ｍ９細胞と比較してミトコンドリア遺伝子の同等量を発現し（データは示さず）そして生存にビルビン酸又はウリジンの追加を必要としないことから、独特である。驚くべきことに、インスリン分泌応答において大きな相違があるにも拘わらず、グルコースは細胞内ＡＴＰを何れの細胞においても殆ど同じ程度に増加させた。ｍ９細胞におけるＡＴＰは、おおむねミトコンドリアでの酸化的リン酸化によって産生されたが、ｍ１４細胞におけるＡＴＰはそうではなかった（図７）。グルコース処理速度はｍ１４細胞において著しく亢進されていることから（図６）、ＡＴＰは主として非酸化的経路を介して（すなわち解糖それ自身によって）産生されているようである。内向き整流Kir6.2及びスルホニルウレア受容体SUR1よりなるβ細胞のＡＴＰ感受性Ｋ+チャネルは、グルコース誘導性インスリンｂ分泌におけるＡＴＰの重要な標的である。しかしながら、Kir6.2及びSUR1のｍＲＮＡの発現レベルは、ｍ９細胞とｍ１４細胞との間で差がなかった（データは示さず）。こうして、ｍ９細胞との比較において、ｍ１４細胞は、グルコース誘導性インスリン分泌の障害をもたらすまだ同定されていない機構によるグルコース代謝の障害とエネルギー産生の障害との両方を持っている。
【００４７】
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法は、異なった表現型を有する２つの被検物の間の遺伝子発現の差を検出するのに効果的である。使用するプライマーの限界とＲＴ−ＰＣＲによる定量の限界のために、この方法は、異なって発現されている遺伝子のすべてを検出することはできない。実際、ＲＮＡブロッティング（データは示さず）によって見出されたGK及びHKの遺伝子発現におけるｍ９細胞とｍ１４細胞との相違は、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法によっては見逃された。それにも拘わらず、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーは、この目的に有用である。なぜならこの方法は、差引きハイブリッド形成法等のような他の方法と同じだけ多くの遺伝子をカバーできるからである。
【００４８】
本発明者等は、10個の遺伝子がｍ９細胞とｍ１４細胞との間で全く異なって発現されていることをｍＲＮＡディファレンシャルディスプレー法により突き止めた。これらのうち、STC及びDLK/Pref-1は、特に興味深い。なぜならばそれらはカルシウム動員又は細胞分化の制御に関与している筈だからである。STCは、硬骨魚類において最初に発見されたカルシウム制御ホルモンであり（Wager GF et al, Mol Cell Endocrionl 79:129-138(1991)）、ヒト及びマウスの両方における分化した脳ニュウロンにおけるその高い発現が、最近明らかにされた（Olsen HS et al., Proc Natl Acat Sci USA 93:1792-1796(1996), Zhang KZ et al., Ann J Pathol 153:439-445(1998)）。Zhang等はこの分子が、膜透過カルシウム流出を制御し、終末へと分化したニューロンにおける高カルシウム血症に対する保護に貢献していることを示唆している（Zhang KZ et al., Ann J Pathol 153:439-445(1998)）。DLKは、ホメオティックタンパク質のEGF様ファミリー膜貫通タンパク質であり（Lee YL et al., Biochim Biophys Acta 1261:223:232(1995)）、Pref-1は同じ遺伝子の変種産物である（Smas CM et al., Cell 73:725-734(1993)）。発生中の膵臓において、Pref-1は、初期において大半の上皮細胞中で発現されるが、その発現は後にはβ細胞にのみ限定される。更には、Pref-1の切り離された形である胎児抗原−１（FA-1）は、成人膵臓においてβ細胞のインスリン分泌顆粒中にインスリンと共に同時局在する。Pref-1/FA-1は、従って、β細胞のオートクリン増殖因子としての役割を有しそれらの分化及び増殖を制御している可能性がある（Nielsen JH et al., J Mol Med 77:62-66(1999), Jensen CH et al., Eur J Biochem 225:83-92(1994)）。
【００４９】
グルコースに応答したインスリン分泌は、膵β細胞の最も重要な機能である。グルコースがその代謝によってβ細胞からのインスリン分泌を誘導することから、グルコース代謝の経路に関与する分子の異常がインスリン分泌の障害を引き起こして２型糖尿病を発生させるということもあり得る。例えば、MODY2の発病の原因部位は、GK遺伝子中の突然変異であり、GK欠損遺伝子はまたグルコースに対するインスリン分泌応答の障害を有する。グルコース代謝に関係する分子の欠陥に加えて、膵臓の調節及び発生に関与する他の因子の障害が、インスリン分泌特性における異常を引き起こし得る。インスリン分泌β細胞は最終的且つ高度に分化していることが知られているからである。実際、β細胞特異的遺伝子の発現の調節を介してβ細胞機能に影響を及ぼすHNFs転写因子は、MODY1、3、及び5の原因となる遺伝子である（Yamagata K et al., Nature 384:458-460(1996), Yamagata K et al., Nature 384:455-458(1996), Horikawa Y et al., Nat Genet 1997 17:384-385(1997)）。加えて、他のβ細胞特異的転写因子であるIPF-1（これは膵臓前駆細胞の運命を決定し並びにインスリン遺伝子の転写を調節する）における突然変異は、MODY4の原因となる（Stoffers DA et al., Nat Genet 1997 17:138-139(1997)）。MODY患者の生理学的研究は、グルコース誘導性インスリン分泌が、正常被験者に比して有意に低下していることを明らかにしており、それのことは、β細胞のインスリン分泌応答が、グルコース代謝の変化によってのみならずβ細胞発生又は分化の変化によっても影響を受ける可能性があることを示している。従って、STC又はDLK/Pref-1の発現レベルの低さがｍ１４細胞におけるインスリン分泌に影響を及ぼしている可能性がある。
【００５０】
表２に掲げられた残りの遺伝子は、３個の既知遺伝子及び５個の未知遺伝子である。KIAA0480は、Kazuma DNAリサーチインスティテュートによって特徴づけがなされたｃＤＮＡクローンであるが、その機能は未だ知られていない。このｃＤＮＡは1252個のアミノ酸をコードしており、該タンパク質は細胞骨格関連タンパク質モチーフ（Riehemann K et al., Trends Biochem Sci 18:82-83(1993）及びリン酸結合ループ（Saraste M et al., Trenads Biochem Sci 15:430-434(1990）を含んでいる。E3KARPは、３型Na+／H+エクスチェンジャー（exchanger）（NHE3）であるが（Yun CH et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:3010-3015(1997)）、β細胞中にはNHE3が存在するという証拠はない。しかしながら、E3KARPが、他のタンパク質と結合することによって細胞機能に影響を及ぼしている可能性はあり得る。なぜなら、それは２個のPDZドメインを含んでおり且つNHE3以外のタンパク質と相互作用するとの報告があるからである（Hall RA et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:8496-8501(1998)）。CCK-B受容体は、中枢神経系における主要なCCK受容体であるが（Wank SA et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:8691-8695(1992)）、リガンドを有しない受容体の上向き調節の影響は予測困難である。これら５個の未知クローンのうち、クローンg-5及びp-4の発現は、２、３の組織に限定されており、そのことは独特の機能があることを示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞の形態を示す顕微鏡写真。
【図２】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞のグルコースに対する応答を示すグラフ。
【図３】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞のＫＩＣに対する応答を示すグラフ。
【図４】 ＭＩＮ６ｍ９細胞とＭＩＮ６ｍ１４細胞の膜脱分極による影響を示すグラフ（n=4）。
【図５】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるグルコース誘導性のインスリン分泌に対する３−イソブチル−１−メチルキサンチンの効果を示すグラフ。
【図６】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞培地中の乳酸及びグルコースの濃度の変化を示すグラフ（n=6）。
【図７】 25ｍＭグルコース及び10μＭ ＣＣＣＰのＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞の細胞内ＡＴＰ量に対する影響を示すグラフ。
【図８】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞のＣＣＣＰ感受性のＡＴＰ産生を示すグラフ。
【図９】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における、グルコース誘導性インスリン分泌に関与するｍＲＮＡの発現を示す、ＲＮＡブロット。
【図１０】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるピークＫATPチャネルコンダクタンスを示すグラフ。
【図１１】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における膜静止電位を示すグラフ。
【図１２】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞における25ｍＭグルコースの細胞内Ｃａ2+濃度に対する影響を示すグラフ。
【図１３】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞におけるＶＤＣＣの電流−電圧関係を示すグラフ。
【図１４】 ＭＩＮ６ｍ９細胞及びＭＩＮ６ｍ１４細胞についてのｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーにおける主たる相違を示す。
【図１５】 未知遺伝子のマウス組織分布を示すＲＮＡブロット分析。
Claims (6)
- 工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１８０８１として寄託されたＭＩＮ６ｍ９細胞株。
- ＭＩＮ６細胞株を25ｍＭのグルコースを含む培地中で限界希釈し培養して得ることのできるモノクローナル細胞株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とする細胞株。
- 該ＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液の組成が、塩化ナトリウム119 ｍＭ、塩化カリウム4.74 ｍＭ、塩化カルシウム2.54 ｍＭ、塩化マグネシウム 1.19 ｍＭ、リン酸二水素カリウム 1.19 ｍＭ、炭酸水素ナトリウム 25 ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ 10 ｍＭである、請求項２の細胞株。
- ＭＩＮ６細胞株を25ｍＭのグルコースを含む培地中で限界希釈し培養することにより誘導される下位株であって、所定濃度のグルコース及び0.5％の牛血清アルブミン含有のｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液中で37℃にて２時間インキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大し、グルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が４±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25ｍＭではインスリン分泌量が25±５ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にあることを特徴とし、且つ、同一条件でインキュベートしたとき該培地中のグルコース濃度５〜25 ｍＭの間で細胞タンパク質重量あたりのインスリン分泌量がグルコース濃度に依存して増大せずグルコース濃度５ｍＭではインスリン分泌量が６±２ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質、グルコース濃度25 ｍＭではインスリン分泌量が7.5±2.5ｍＵ／時／ｍｇ細胞タンパク質の範囲にある細胞を含有しないことを更に特徴とする細胞株。
- 該ＨＥＰＥＳ平衡Krebs-Ringer重炭酸塩緩衝液の組成が、塩化ナトリウム119 ｍＭ、塩化カリウム4.74 ｍＭ、塩化カルシウム2.54 ｍＭ、塩化マグネシウム 1.19 ｍＭ、リン酸二水素カリウム 1.19 ｍＭ、炭酸水素ナトリウム 25 ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ 10 ｍＭである、請求項４の細胞株。
- 工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１８０８１として寄託されたＭＩＮ６ｍ９細胞株である、請求項２ないし５の何れかの細胞株。
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