JP2003530391A

JP2003530391A - ペルシキニン、その製造方法および医薬としてのその使用

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Publication number: JP2003530391A
Application number: JP2001575568A
Authority: JP
Inventors: コルデュラ・ホプマン; ミヒャエル・クルツ; ギュンター・ミュラー; ルイジ・トーティ
Original assignee: アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-24
Publication date: 2003-10-14
Also published as: CZ20023310A3; CN1199959C; TR200401739T4; NO20024772L; AU2006203704B8; ATE269855T1; CN1418203A; EP1274698B1; HK1052005A1; YU74002A; AU5621901A; SK14322002A3; AU784902B2; RU2002129890A; US6596518B2; CA2405066A1; WO2001077094A1; SI1274698T1; EP1142886A1; HUP0300327A3

Abstract

(57)【要約】本発明は真菌ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）の培養によって得ることができるペルシキニンと称する化合物およびその製薬上許容できる塩に関する。本発明はペルシキニンの製造方法、微生物ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）、ペルシキニンおよびその製薬上許容できる塩を製薬上使用すること、特にリパーゼの阻害剤として使用すること、並びにペルシキニンまたはその製薬上許容できる塩を含有する医薬品組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はバシジオマイセートステレウムコンプリカタム（Stereum complicatu
m）、ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）の培養によって得ることができ
るペルシキニン（Percyquinnin）と称される化合物に関し、またその製薬上許容
できる塩および誘導体に関する。本発明はペルシキニンを製造するための方法、
真菌ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）、ペルシキニンおよびその製薬上
許容できる塩および誘導体を製薬上使用すること、特にリパーゼ阻害剤としての
使用、そしてペルシキニンまたはその製薬上許容できる塩もしくは誘導体を含有
する医薬品組成物に関する。

【０００２】脂質代謝は通常、合成および分解の間の微妙なバランスを維持する。このバラ
ンスが崩れると高脂血症が起きる可能性があり、これは次いでアテローム性動脈
硬化、高血圧、糖尿病などを惹起するおそれがある。脂質代謝の調節成分はこれ
らの病状を制御するのに有用であると期待される。インシュリン非依存性糖尿病
（ＮＩＤＤＭ）での脂肪分解の阻害は高血糖を減少すると想定される。エネルギ
ー源として脂肪を利用する際の最初の結果は、リパーゼ例えばホルモン感受性リ
パーゼおよびモノアシルグリセロールリパーゼによるトリアシルグリセロールの
加水分解である。トリアシルグリセロールの分解により血中のグリセロールおよ
び脂肪酸のレベルを上昇させる。リパーゼ阻害剤は、少ない副作用で血漿脂肪酸
のレベルおよび高血糖の双方を低下させることが期待される。

【０００３】肥満および高コレステロール血症はある程度、高栄養価の脂肪の摂取と関連が
ある。トリグリセリドの吸収の鍵となる酵素は、膵臓リパーゼである。従って、
膵臓リパーゼを阻害すると、脂肪の吸収の阻害を生じるであろう。

【０００４】ペルシキニンと称する新規な化合物は脂肪分解を阻害することが現在分かって
いる。本発明は従って、ペルシキニン、すなわち式

【化２】の化合物に関し、またすべての立体異性体および互変異性体の形を含むエステル
、エーテルおよび明らかな化学的同等物のような、誘導体およびその製薬上許容
できる塩に関する。

【０００５】ペルシキニンは分子式Ｃ₁₂Ｈ₁₆Ｏ₃（２０８Ｄａ）を有し、表１および２中に
示す、その１つまたはそれ以上の物理化学データおよびその¹ＨＮＭＲスペクト
ルデータおよびその¹³ＣＮＭＲデータのような以下に示すスペクトル特性によ
って特性が把握される。ペルシキニンは、ラクトンのα−位置にヒドロキシルメチル部分と２,３−イ
ソペンチル側鎖とを有するアニレートされた（annelated）５員環をもつ新規な
β−ラクトンと記述することができる。ペルシキニンは、これまで報告されてい
ない新規な構造を有する。ケミカルアブストラクトの文献検索によると、ペルシ
キニンが新規な化合物であることが確定した。他のいかなる化合物もペルシキニ
ンの構造的特徴を示さない。

【０００６】ペルシキニンは培養番号ＳＴ００１８３７と称する微生物（以下、ＳＴ００
１８３７と称する）の培養によって得ることができる。ペルシキニンを製造する
のに使用するこの真菌は、米国の Pike 郡の Mississippi State Park の Percy
Quinn で収集された。この真菌ＳＴ００１８３７は Basidiomycetes 種 Stere
um complicatum 目に属し、また２０００年２月１１日にドイツの Braunschweig
のGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ-Deutsche S
ammlung von Mikroorganishen Zellkulturen GmbH）に預託され、また寄託番号
ＤＳＭ１３３０３号が与えられている。

【０００７】従って、本発明は１つまたはそれ以上の炭素源および１つまたはそれ以上の窒
素源、そして場合によっては栄養無機塩および／または痕跡量の元素を含有する
栄養培地中で好気性条件下で Basidiomycete 種ＳＴ００１８３７、その突然変
異体および変異株からペルシキニンと称される新規な化合物を製造し、引き続い
てこの化合物を単離し、慣用の方法で精製する方法をさらに提供する。

【０００８】栄養培地は炭素、窒素および栄養無機塩の源泉を含有するのが好ましい。炭素
源は例えば澱粉、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜
、グリセロール、ラクトースまたはガラクトース、好ましくはグルコースである
。窒素源は例えば大豆ミール、落花生ミール、酵母エキス、ビーフエキス、ペプ
トン、麦芽エキス、コーンスティープ液、ゼラチンまたはカサミオン酸（casami
on acid）、好ましくは麦芽エキスおよび酵母エキスである。栄養無機塩は例え
ばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素アンモニウム、塩化
ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウ
ムまたは硫酸マグネシウム、好ましくは硫酸水素アンモニウムである。

【０００９】ＳＴ００１８３７の培養は温度２０〜３５℃およびpH３.０〜８.０で実施す
ることができる。ＳＴ００１８３７は２５℃（±１℃）およびpH３〜５で培養
されるのが好ましい。本発明のリパーゼ阻害剤ペルシキニンの最適な収率が得られる場合、ＳＴ０
０１８３７の培養は、９６〜３００時間にわたって実施することができる。例え
ば振盪フラスコ内で、また実験用発酵器内で、浸漬条件下で２１６〜２６４時間
発酵することにより培養を実施するのが特に好ましい。発酵の進行およびペルシ
キニンの生成は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってまた培養液の
生理活性を測定することにより検出することができる。得られる培養液中でペル
シキニンは培養濾液中および菌糸体中に、好ましくは菌糸中に存在する。

【００１０】ペルシキニンは既知の分離技術を用いて単離することができる。従って、ペル
シキニンは、エチルアセテート、ジクロロメタン、クロロホルムまたはブタノー
ルのような水不混合性溶媒によるpH５〜８での抽出によって、あるいは『Dianio
n HP-20（登録商標）』または『ＭＣＬ（登録商標）Gel CHP-20P』（Mitsubishi
Chemical Industries Limited, Japan）、『Amberlite XAD（登録商標）』（Ro
hm and Haas Industries U.S.A.）のようなポリマー樹脂、活性炭を用いる疎水
性相互作用クロマトグラフィーによって、またはイオン交換クロマトグラフィー
によってpH５〜８で、培養物濾液から回収することができる。好ましい方法はMC
L（登録商標）Gel CHP-20P上でのクロマトグラフィーである。活性物質はメタノ
ール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノールもしくはイソプロパノール
のような水混合性溶媒による、またはエチルアセテート、ジクロロメタン、クロ
ロホルムもしくはブタノールのような水不混合性溶媒によるpH５〜８での抽出に
よって菌糸体から回収することもでき、また好ましい方法はメタノールでの抽出
である。抽出物の濃縮および凍結乾燥によって活性的な粗製物質が得られる。

【００１１】本発明の阻害剤であるペルシキニンは粗製物質から例えば以下のように回収す
ることができる：以下の技術、つまり順相クロマトグラフィー（固定相としてアルミナまたはシ
リカゲルを用い、石油エーテル、エチルアセテート、メチレンクロライド、アセ
トン、クロロホルム、メタノールまたはこれらの組み合わせのような溶出剤を用
い、またＮＥｔ₃のようなアミンを添加する）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ
−１８とも称されるジメチルオクタデシルシリルシリカゲルまたはＲＰ−８とも
称されるジメチルオクチルシリルシリカゲルのような逆相シリカゲルを固定相と
して使用し、また水、緩衝剤つまりリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩（pH２〜８）
およびメタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフランのような有
機溶媒またはこれらの溶媒の組み合わせのような溶出剤を使用する）、メタノー
ル、クロロホルム、アセトン、エチルアセテートまたはこれらの組み合わせのよ
うな溶媒中の Sephadex（登録商標）LH-20（Pharmacia Chemical Industries, S
weden）、TSKgel Toyopearl HW（TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan）または
水中の Sephadex（登録商標）G-10 および G-25 のような樹脂を使用するゲル透
過クロマトグラフィーを用いる分別によるか；あるいは水、メタノール、エタノ
ール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、
アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム、エチルアセテート、石油エ
ーテル、ベンゼンおよびトルエンのような溶媒の２つまたはそれ以上からなる２
相溶出剤系を用いる向流クロマトグラフィーによる。これらの技術は反復して用
いることができるか、また異なる技術の組み合わせを用いることができる。好ま
しい方法は逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）上でのクロマトグラフィーである。

【００１２】ペルシキニン化合物は製薬上許容できる塩および誘導体、本発明によってすべ
てカバーされる同様なエステルおよびエーテルそして他の明らかな化学的同等
物へと転化されることができる。塩および誘導体は当業者に知られた標準的な方
式によって製造されることができる。例えばナトリウム塩およびカリウム塩のよ
うな塩はペルシキニンを好適なナトリウム塩基またはカリウム塩基で処理するこ
とにより製造することができる。

【００１３】エステルおよびエーテルは文献、例えば Advanced Organic Synthesis, 4^th E
dition, J. March, John Wiley & Sons., 1992 中に記載されている方法によっ
て製造することができる。エステルはカルボン酸または例えばアミノ酸例えばロ
イシン、グリシンまたはアラニンとの反応によって製造できる。アミノ酸のアミ
ノ基はエステル化の後に脱保護され、あるいは例えばホルミル基によって保護さ
れることができる。エステル化は文献（Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 1958
, 80, 6204; Arrieta et al. Synth. Commun 1983, 13, 471）中に記載されてい
るように、脱水和剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在で
実施することができる。

【００１４】二重結合は文献、例えば Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. Mar
ch, John Wiley & Sons., 1992, p. 771-775 中に、あるいはR. Bloch et al.,
J. Org. Chem. 1987, 52, 4603-4605 中に示されている方法によって還元するこ
とができる。二重結合はH.O. House in “Modern Synthetic Reactions", W.A.
Benjymin, Inc., New York(1972), pp 446-452 によって記載されている方法に
よって水添ハロゲン化することができる。ヒドロキシル化誘導体は文献、例えば
Chem, Rev, 1980, 80, 187 中に記載のようにＯｓＯ₄のような反応剤との二重結
合の反応によって製造することができる。

【００１５】誘導体は例えば、Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. March, Joh
n Wiley & Sons., 1992, p 826 中に、またはA.J. Pearson et al., J. Org. Ch
em. 1986, 51, 2505-2511 中に記載のようなＭＣＰＢＡでの酸化による二重結合
のエポキシドへの転化によって製造することもできる。

【００１６】誘導体はイソペンテニル側鎖の二重結合をオゾン分解することにより製造する
こともできる。後処理方法の如何によってこれをアルデヒド（例えばＺｎ／ＨＯ
Ａｃまたはジメチルスルフィド／メタノールを用いて）に、カルボン酸（例えば
Ｈ₂Ｏ₂を用いて）にまたはアルコール（例えばＬｉＡｌＨ₄またはＮａＢＨ₄を用
いて）にすることができる［W. Curruthers, “Some Modern Methods of Organi
c Synthesis", Cambridge University Press(1971), Chpt. 6; White, King and
O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591(1971); Bailey, P.S., “Ozonisation in O
rganic Chemistry", Vol. 1 and Vol. 2, New York, Academic Press(1978, 198
2)］。このようにして製造したアルデヒドは、文献でWiitig反応として知られる
ように、ホスホランと反応させることにより、炭素原子４〜１０個を有する側鎖
を導入することができる。新規に導入される鎖は、H.J. Bestmann et al., “Se
lected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Product
s", Topics in Current Chemistry 109, 85(1983)に記載されているように官能
基として例えばＯＲ¹（Ｒ¹＝Ｈまたは炭素原子１〜４個のアルキル）、ＮＲ²Ｒ³ （Ｒ²Ｒ³＝Ｈまたは炭素原子１〜４個のアルキル）、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを
有してよい。

【００１７】ペルシキニンは２μＭのＩＣ₅₀でリパーゼを阻害する（ＮＢＤ検定、実施例６
参照）。本発明はペルシキニンを、そのラセミ酸塩、ラセミ混合物および純粋な鏡像体
の形で使用することにも関し、またそのジアステレオ異性体およびこれの混合物
に関する。

【００１８】製薬上許容できる塩は、それがベースとする最初の化合物と比較して水中の溶
解度が大きいので医学的応用にとくに好適である。この塩は製薬上許容できる陰
イオンまたは陽イオンを有さねばならない。ペルシキニンの製薬上許容できる好
適な付加塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩、硝酸塩および
硫酸塩のような無機酸の塩、そして例えば酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息
香酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グリコ
ール酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩（lactbionic acid）、
マレイン酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、ｐ−トルエンス
ルホン酸塩、酒石酸塩およびトリフルオロ酢酸塩のような有機酸の塩である。医
学的目的には塩化物を使用するのが特に好ましい。製薬上許容できる好適な塩基
性塩は、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩およびカリウム塩のよ
うな）およびアルカリ土類金属塩（マグネシウム塩およびカルシウム塩のような
）である。

【００１９】製薬上許容できない陰イオンを有する塩もまた、製薬上許容できる塩を製造ま
たは精製するためのおよび／または非治療的な、例えばインビトロの応用に使用
するための有用な中間体として、本発明の範囲に属する。本記載で用いる『生理学的に機能する誘導体』という用語は、例えばヒトのよ
うな哺乳動物に投薬する際に本発明の化合物またはその活性的な代謝産物を（直
接または間接に）生成する、本発明の化合物の生理学的に許容される任意の誘導
体をさす。

【００２０】本発明の別な局面はペルシキニンのプロドラッグを使用することである。この
ようなプロドラッグはインビボでペルシキニンへと代謝されうる。このプロドラ
ッグはそれ自体、活性があってもなくてもよい。ペルシキニンは例えば無定形のおよび結晶性多形の形態として、様々な多形の
形態で存在してもよい。ペルシキニンのすべての多形形態は本発明の範囲に属し
、本発明のさらなる局面をなす。以下でペルシキニンという場合はすべて、上記したペルシキニンを指し、また
本明細書に記載するその塩、溶媒和物および生理学的に機能する誘導体を指す。

【００２１】所望の生物学的効果を実現するのに必要なペルシキニンの量は、多数の因子、
例えば、選定した特定の化合物、意図する用途、投与の方式および患者の臨床状
態に関係する。１日あたりの投与量は一般に１日および体重１kgあたり０.３〜
１００mg（典型的には３〜５０mg）の範囲にあり、例えば３〜１０mg／kg／日で
ある。静脈内投与量は例えば０.３〜１.０mg／kgの範囲にあり、これは１キログ
ラムおよび１分あたり１０〜１００ngの輸液として投薬されるのが好適でありう
る。この目的にとって好適な輸液はミリリットルあたり例えば０.１ng〜１０mg
、典型的には１ng〜１０mgを含有してよい。単独の投与量は例えば１mg〜１０ｇ
の活性成分を含有してよい。従って、注射用のアンプルは例えば１〜１００mgを
含有してよく、また例えば錠剤またはカプセルのような経口投薬されることがで
きる単一投与製剤は１.０〜１０００mg、典型的には１０〜６００mgを含有して
よい。製薬上許容できる塩の場合、上記の重量データは塩から誘導されるアミノ
チアゾールイオンの重量を基準とする。ペルシキニンは上記した状態そのものの
予防または治療のために化合物として使用することができるが、許容されうる担
体との医薬組成物の形であるのが好ましい。担体はもちろん、組成物の他の成分
との許容性の意味で許容性をもたねばならず、また患者の健康を害してはならな
い。担体は固形または液体あるいはこれら両方であってよく、また活性成分を０
.０５〜９５重量％含有してよい単一投与物として例えば錠剤として、化合物と
ともに処方されるのが好ましい。本発明の医薬組成物は、成分を薬理学的に許容
できる担体および／または賦形剤と混合することから本質的になる既知の製薬方
法の１つによって製造することができる。

【００２２】本発明の医薬組成物は経口、直腸経由、局所、口腔経由（例えば舌下）および
腸管外（例えば皮下、筋肉内、皮内または静脈内）の投与にとって好適である組
成物であるが、最も好適な投薬方式は個々の場合ごとに処置されるべき症状の性
質および重篤度にそして各々の場合に使用するペルシキニンの性質に依存する。
コートされた製剤およびコートされた徐放性製剤もまた本発明の範囲に属する。
耐酸性および耐胃液性の製剤が好ましい。好適な耐胃液コーティングは、セルロ
ースアセテートフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレートおよびメタクリル酸およびメチルメタクリレー
トの陰イオンポリマーからなる。

【００２３】経口投薬にとって好適な医薬化合物は、それぞれが規定の量のペルシキニンを
含有する例えばカプセル、カシェ剤、菱形錠剤または錠剤のような個別の単位形
態をとってよく、粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の溶液ま
たは懸濁液として、あるいは水中油滴型または油中水滴型の乳濁液としてであっ
てよい。すでに述べたようにこれらの組成物は、活性成分および担体（１つまた
はそれ以上の追加の成分からなってよい）が互いに接触される工程を包含する好
適な任意の製薬方法によって製造することができる。一般に本組成物は活性成分
を液体および／または微細に分散された固形の担体と均一にそして均質に混合す
ることにより製造され、その後、生成物は必要なら成形される。従って、例えば
錠剤は化合物の粉末または顆粒を、適切なら１つまたはそれ以上の追加の成分と
ともに圧縮または成形することにより製造することができる。圧縮された錠剤は
、例えば粉末または顆粒のような自由に流動する形の化合物を、適切ならバイン
ダー、潤滑剤、不活性の希釈剤および／または１つ（またはそれ以上の）界面活
性剤／分散剤とともに好適な機械中で錠剤化することにより製造することができ
る。成形された錠剤は粉末状であり、不活性の液体希釈剤によって湿潤されてい
る化合物を好適な機械中で成形することにより製造することができる。

【００２４】口腔経由（舌下）投薬に好適な医薬組成物は、香味料、通常蔗糖、およびアラ
ビアゴムまたはトラガカントとともにペルシキニンを含有しなめることのできる
錠剤、およびゼラチンおよびグリセロールまたは蔗糖およびアラビアゴムのよう
な不活性の基剤中に化合物を含有する菱形錠剤からなる。

【００２５】非経口投与に好適な医薬組成物は、対象とされるレシピエントの血液と好まし
くは等張であるペルシキニンの無菌の水性調合液からなるのが望ましい。この調
合液は静脈内投与が好ましいが、ただし皮下、筋肉内または皮内注射もまた行う
ことができる。この調合液は化合物を水と混合し、得られる溶液を無菌にまた血
液と等張にすることにより製造することができる。本発明の注射可能な組成物は
一般に０.１〜５重量％の活性化合物を含有する。直腸経由投薬のために好適な
医薬組成物は単一投与量の座薬の形であるのが好ましい。これはペルシキニンを
１つまたはそれ以上の慣用の固形の担体例えばカカオバターと混合し、得られる
混合物を成形することにより製造することができる。

【００２６】皮膚への局所的使用に好適な医薬組成物は、膏薬、クリーム、ローション、ペ
ースト、スプレイ、エアロゾルまたはオイルの形であるのが好ましい。使用する
ことができる担体はペトロラタン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコ
ールおよびこれらの物質の２つまたはそれ以上の組み合わせである。活性成分は
一般に組成物の０.１〜１５重量％例えば０.５〜２％の濃度で存在する。

【００２７】経皮投与もまた可能である。経皮投与のために好適な医薬組成物は患者の表皮
と長期間にわたる密接な接触に好適な単一な硬膏の形であってよい。この種類の
硬膏は、適切なら緩衝され、接着剤中に溶解されおよび／または分散されている
か、ポリマー中に分散されている水溶液中に活性成分を含有するのが好ましい。
好適な活性成分濃度は約１〜３５％、好ましくは約３〜１５％である。特定のオ
プションとして、活性成分は例えばPharmaceutical Reserch, 2(6): 318(1986)
に記載されているようにエレクトロトランスポートまたはイオントフォレーシス
によって放出されることができる。以下は本発明を例示する実施例であるが、本発明の範囲を限定するものでない
。

【００２８】

【実施例】

実施例１培養株ＳＴ００１８３７の維持ａ）維持培地の組成成分を加熱によって完全に溶解した後、得られる溶液を１２１℃で２０分殺菌
し、ペトリ皿中に分注した（１５ml／ディッシュ）。固化の後、プレートに出発
培養物を接種し、良好な生長が認められるまで２５℃でインキュベートした。以
下の保存段階のために、十分に生長した培養株を使用した。維持培地麦芽エキス２.００％酵母エキス１.００％グルコース１.００％ (NH₄)₂HPO₄ ０.０５％寒天２.００％

【００２９】ｂ）−１３５℃での保存：無菌の１０％ＤＭＳＯ溶液１.５mlを２mlの凍結用バイアル中に注入した。維
持寒天プレートから２cm²の寒天片を採取し、ＤＭＳＯ溶液に加え、−１３５℃
まで段階的に冷凍して（１℃／分）保存した。

【００３０】ｃ）液体窒素中での保存：無菌の５０％グリセロール溶液１.５mlを２mlの凍結用バイアルに注入した。
維持寒天プレートから２cm²の寒天片を採取し、グリセロール溶液に添加し、段
階的に−８０℃まで冷凍し（１℃／分）、次いで液体窒素中で保存した。

【００３１】実施例２振とうフラスコ中での培養株ＳＴ００１８３７号の培養振とうフラスコ中の種培養の調製種培地（下記参照）をいくつかの３００mlの振とうフラスコに１００mlの量で
分注し、１２１℃で２０分オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却し、
６日目の寒天プレート培養物から採取した２cm²の寒天片か、または１つの保存
用バイアル（−１３５℃または液体窒素）の内容物に接種した。１４０rpmの回
転振とう機上で２５℃で９６時間にわたってインキュベーションを実施した。

【００３２】接種用培地コーンスティープ液０.５０％トマトペースト４.００％オートミール１.００％グルコース１.００％微量元素１.００ml pH ６.８

【００３３】微量元素溶液 FeSO₄×7H₂O ０.１０００％ MnSO₄×1H₂O ０.１０００％ CuCl₂×2H₂O ０.００２５％ CaCl₂×2H₂O ０.０１００％ H₃BO₃ ０.００５６％ (NH₄)₆Mo₇O₂₄×4H₂O ０.００１９％ ZnSO₄×7H₂O ０.０２００％

【００３４】製造条件製造培地（下記参照）をいくつかの３００mlの振とうフラスコ中に１００mlの
量で分注し、１２１℃で２０分オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却
し、４日目の接種用培養物を接種した。１４０rpmの回転振とう機上で２５℃に
おいて２４０時間インキュベーションした。阻害剤であるペルキシニンの製造は
、実施例６記載のように、リパーゼの阻害に対する生理活性試験およびＨＰＬＣ
分析によって測定した。製造用培地麦芽エキス２.００％酵母エキス０.２０％グルコース１.００％ (NH₄)₂HPO₄ ０.０５％

【００３５】実施例３発酵槽（１２Ｌ）における培養株ＳＴ００１８３７の培養振とうフラスコにおける接種用培養物の調製接種用培地を数個の２Ｌ三角フラスコに５００mlずつ分注し、１２１℃で３０
分間オートクレーブ処理した。実施例２記載のように接種用培養物を培養した。
大量発酵製造用培地の組成：１２Ｌ発酵槽に、８Ｌの製造用培地および発泡防止剤としてのDesmophen^(R)を
発酵槽１０Ｌにつき１ml加えて、in situで１２１℃４５分間滅菌し、２５℃（
±１℃）に冷却した後、上記の接種用培養物０.５Ｌ（１２Ｌ発酵槽の６.２５％
である）を接種した。発酵は以下のパラメータによって操作した。温度：２５℃ 撹拌：３００rpm（v_tip＝1.57 m/s）曝気：０.５vvm 収得時間：２３７時間リパーゼ阻害剤であるペルキシニンの製造は、実施例６記載のようにリパーゼ
阻害試験により測定した。培養液の最終pHは３〜４であった。実施例４記載の方
法によって、培養液を回収し、遠心分離して、そしてペルキシニン化合物を培養
濾液と菌糸体から単離および精製した。

【００３６】実施例４ペルシキニンの単離および精製培養液（３リットル）を回収し、遠心分離して菌糸体（２０ｇ）と培養濾液と
を分離した。菌糸体をメタノール（３リットル）で抽出し、活性抽出物をプール
し、減圧下で５０mlまで濃縮した。粗製物を以下の条件を用いて分取ＨＰＬＣに
よって精製した。１）カラム：MCl(登録商標) Gel CHP-20P (BioCart, 50×100mm; Kronlab) 溶出剤：(Ａ) Ｈ₂Ｏ (Ｂ) ＭｅＯＨ勾配：０分９５％(Ａ) ５％(Ｂ) ５分９５％(Ａ) ５％(Ｂ) ４５分０％(Ａ) １００％(Ｂ) 流量：４５ml／分検出：２２０および２５４nm

【００３７】活性のあるフラクションは１７分後に溶出した。フラクションを集めて、減圧
下で濃縮し、冷凍乾燥した。以下の条件を用いて分取ＨＰＬＣによって最終的精製を行った。

【００３８】１）カラム：Purospher Star RP-18e(５μ、125×25mm, Merck) 溶出剤：(Ａ) 0.1％ＴＦＡ (Ｂ) ＣＨ₃ＣＮ勾配：０分９５％(Ａ) ５％(Ｂ) ５分９５％(Ａ) ５％(Ｂ) ４５分０％(Ａ) １００％(Ｂ) 流量：３８ml／分検出：２１０および３００nm ペルシキニン含有フラクションは２１分後に溶出した。プールしたフラクショ
ンを減圧下で濃縮し、冷凍乾燥した。

【００３９】２）カラム：Purospher RP-18e(５μ、125×25mm, Merck) 溶出剤：(Ａ) 0.1％ＴＦＡ (Ｂ) ＣＨ₃ＣＮ勾配：０分８０％(Ａ) ２０％(Ｂ) １０分８０％(Ａ) ２０％(Ｂ) １０.１分７５％(Ａ) ２５％(Ｂ) １７分７５％(Ａ) ２５％(Ｂ) １７.１分７０％(Ａ) ３０％(Ｂ) ５０分７０％(Ａ) ３０％(Ｂ) ５５分０％(Ａ) １００％(Ｂ) １００分０％(Ａ) １００％(Ｂ) 流量：５ml／分検出：２１０nm

【００４０】ペルシキニン含有フラクションは３７分後に溶出した。フラクションを集めて
減圧下で濃縮し、冷凍乾燥した。２０ｇの菌糸体からの全収量はペルシキニン化
合物２mgであった。ペルシキニンの物理化学特性およびスペクトル特性を表１および２に示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】実施例５リパーゼの調製および精製オスのラット（Wistar、２２０〜２５０ｇ）の脂肪細胞を文献に記載されてい
るコラゲナーゼ処理によって単離した。１０匹のラットの脂肪細胞を、それぞれ
５０mlの均質化緩衝剤（２５ml Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH７.４、０.２５Ｍスクロ
ース、１mMＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１０μg／mLのロイペプチン、１０μg／mL
のアンチペイン、２０μg／mLのペプスタチン）で浮遊させて３回洗浄した。そ
の後、１０mlの均質化緩衝剤を添加した。脂肪細胞をテフロン^(Ｒ)製ガラス装置
（Braun-Melsungen）内で１５００rpmおよび１５℃で均質化した。均質な製造物
を遠心分離した（Sorvall SM24管、５００rpm、１０分、４℃）。上方の脂肪層
とペレットとの間の層を分離し、再度遠心分離した。下方の層の分離を反復し、
２０００rpmおよび４℃で４５分間３回目の遠心分離を実施した。得られる母液
に１ｇのSepharose（Pharmacia-Biotech、CL-6B、２５mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌで５
回洗浄、pH７.４、１５０mMのＮａＣｌ）を加えた。４℃で６０分間インキュベ
ーションした（１５分間隔で振とうした）後、溶液を遠心分離した（Sorvall SM
24管、３０００rpm、１０分、４℃）。上層を酢酸によってpH５.２に調整し、４
℃で３０分間インキュベーションした。沈殿を遠心分離によって単離し、２.５m
lの２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH７.０、１mM ＥＤＴＡ、６５mM ＮａＣｌ、１
３％スクロース、１mM ＤＴＴ、１０μg／mLのロイペプチン／ペプスタチン／ア
ンチペイン中に懸濁させた。

【００４４】懸濁液を、２５mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、pH７.４、５０％グリセロール、１mM
ＤＴＴ、１０μg／mlのロイペプチン／ペプスタチン／アンチペインで４℃で一
晩塩析した後、ヒドロキシアパタイトカラムに吸収（１０mM リン酸カリウム、p
H７.０、３０％グリセロール、１mM ＤＴＴで平衡化した懸濁液１mlにつき０.１
ｇ）させた。カラムを平衡化緩衝剤で４回洗浄した（流速：２０〜３０ml／時間
）。０.５Ｍリン酸カリウム緩衝液によってリパーゼを溶出した。製造物を塩析
し、限外濾過（Amicon Diaflo PM 10）によって４℃で濃縮した（５〜１０回）
。半精製したリパーゼは、−７０℃で４〜６週間保存可能であった。

【００４５】実施例６生理活性アッセイ蛍光性脂質アナログであるモノ−ＮＢＤ−アシルグリセロール（ＮＡＧ）を基
質として使用した。これはリン脂質が小胞への取込まれる際に、４８１nmから５
５０nmへ変化するものである。ＤＭＳＯに溶解した試験化合物をアッセイ緩衝液
（２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pH７.４、１５０mM ＮａＣｌ）によって１：５に
希釈した。この溶液２.５μlに、超音波処理した基質溶液（アッセイ緩衝液１ml
につき、２０μgホスファチジルコリン、１０μlホスファチジルイノシトール、
５０μg ＮＡＧを含有する）１８０μlを添加した。３０℃、１５分間のプレイ
ンキュベーションの後、アッセイ緩衝液中で予め１：２に希釈した酵素溶液２０
μlを添加し、直ちに４８５nｍで吸光度を測定した。３０℃、６０分間のインキ
ュベーションの後、再び吸光度を測定した。４８０nmにおける吸光度の増大で酵
素活性を評価した。新たに溶解した試験化合物の濃縮物を１０個用意してＩＣ₅₀ 値を測定した。データ解析用にElsvier-BiosoftのソフトウェアパッケージのGRA
PHITを使用した。ペルキシニンは２μmでリパーゼをＩＣ₅₀阻害した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｐ 17/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ギュンター・ミュラードイツ連邦共和国65843ズルツバハ．イム・ハインデル１ (72)発明者ルイジ・トーティドイツ連邦共和国65239ホーホハイム・アム・マイン．フランクフルターシュトラーセ５．カイザーホーフガレリーＦターム(参考） 4B064 AE44 CA05 CE08 CE10 DA01 4C048 TT08 UU01 XX01 XX03 XX04 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 BA02 GA17 NA14 ZC20 ZC33 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式【化１】で示される化合物であるペルシキニンおよびそのすべての立体異性体および互変
異性体の形の製薬上許容できる塩および誘導体。
【請求項２】炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で好気性条件下で
真菌ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）を培養し、続いて慣用の方法で単
離および精製することにより得ることができる分子式Ｃ₁₂Ｈ₁₆Ｏ₃を有する化合
物であるペルシキニン、そしてそのすべての立体異性体および互変異性体の形の
製薬上許容できる塩および誘導体。
【請求項３】炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で好気性条件下で
バシジオマイセート種ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０３）を培養し、続い
て慣用の方法で単離および精製することからなる、請求項１または２に記載のペ
ルシキニン、またはその塩もしくは誘導体の製造方法。
【請求項４】バシジオマイセート種ＳＴ００１８３７（ＤＳＭ１３３０
３）。
【請求項５】医薬として使用するための請求項１または２に記載のペルシ
キニンまたはその製薬上許容できる塩もしくは誘導体。
【請求項６】有効量の請求項１または２に記載のペルシキニンまたはその
製薬上許容できる塩もしくは誘導体と、製薬上許容できる担体とからなる医薬組
成物。
【請求項７】リパーゼ阻害剤として使用するための、請求項１または２に
記載のペルシキニンまたはその製薬上許容できる塩もしくは誘導体。