JP2003524419A - 近接プロービング方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
プローブ(proximity probe)を用いて、溶液中で、1または数種の分析物を検
出および/または定量するための、高感度、迅速かつ便利な分析に関する。
薬から効率よく分離することに依存する。分析の感度は、この分離と、用いられ
たレポーターの能力に決定的に依存する。分離に関して、サンドイッチELIS
Aにおけるように、検出のための二次親和性試薬とともに、分析物に対する固定
化親和性試薬を含む固相が通常用いられる。結合していない検出試薬を洗い落と
す操作において、ストリンジェンシー(stringency)を慎重に釣り合わせなけれ
ばならない。洗浄についての高ストリンジェンシーでは、分析物の検出シグナル
が減少する犠牲のもとにバックグラウンドはより低くなり、低ストリンジェンシ
ーにおいて、検出の確率は高くなるが、バックグラウンドがより高くなるという
犠牲がある。
分析物との表面への結合は、時間のかかるプロセスであり、洗浄工程は、正確な
結果を得るために正確かつ再現可能にサンプル間で制御されなければならない。
固相分析はまた、均質分析(homogenous assay)よりオートメーション化が難し
い。
。例えば、シンチレーション近接分析(scintillation proximity assay)(1
)および蛍光共鳴エネルギー転移に基づく分析(2,3)などの均質分析がある
。しかしながら、これらの分析はシグナル対ノイズ比が低いため、感度が低い問
題がある。
用いた超高感度イムノアッセイおよびキットが記載されている。2種の分析物が
同時に結合することによって相互作用産物が生じ、該産物は増幅反応においてテ
ンプレートとして作用し得るように選択されることができ、二重認識の必要条件
により特異性を高め、非特異的シグナルの危険性を低減させることができる。こ
のイムノアッセイは固形支持体上で行われる。
us one tube assay)において、溶液状の、1または数種の分析物を検出および
定量する能力を特徴とする。分析物に対して親和性を有する結合部分と反応官能
基(reactive functionality)とを含むいわゆる近接プローブがサンプル溶液に
加えられる。その後、これらのプローブは、それぞれ相互作用することが可能に
なり、2以上の近接プローブが同じ個々の分析物分子に結合した場合、より大き
く相互作用する。近接プローブは複数の部位で分析物と結合可能であるため、分
析物は、互いに接近した反応プローブを結合させ、局所濃度が増加することによ
りそれらの相互作用能力を高めることによって、触媒のようなやり方で作用する
。連結された官能基間の相互作用により、2次的な反応で検出可能なシグナルを
生じる。
結合可能な、タンパク質、核酸、または、任意の他の関心分子であり得る。1以
上の分析物が、検出/定量され得る。また、1つの分析物からなる凝集体(1つ
のタイプのタンパク質またはペプチド類からなる多量体複合体)も、検出/定量
することができ、さらに互いに接近する2種以上の異なる分子の複合体も検出/
定量することができる。
、近接プローブは2つの異なるタンパク質に結合するが、これら2つのタンパク
質が互いに接近する場合、近接性を得る。
の形成によって引き起こされる。いくつかの例として、アルツハイマー病、パー
キンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、運動ニューロン疾患、およびハンチ
ントン病が挙げられる(4)。これらの病気の進行に伴い、ますます多くの凝集
体が形成される。これらの凝集体が病気の初期段階で検出されれば、適切な医療
的治療を患者に与えることができる。スクラピーを引き起こすプリオンタンパク
質の存在の検出は、凝集体形成性タンパク質の他の例である(5)。これらの凝
集体は、近接プロービングのための理想的な分析ターゲットである。凝集体は同
じタンパク質の多くのコピーを含むため、このタンパク質に特異的な近接プロー
ブは凝集体に沿った多数の部位で結合する。それによって、これらの近接プロー
ブは、凝集体を結合させる際に近接性を得る。高感度の近接プロービングによっ
て、このような凝集体の形成を病気の初期段階で検出することができる。本発明
はまた、抗体および抗原のような異なるタイプのタンパク質を含むタンパク質凝
集体の検出/定量にも関する。食物中の伝染性プリオンタンパク質凝集体の存在
も、非常に重要である。BSE(ウシ海綿状脳炎)およびヒトに対するCJD(
クロイツフェルト−ヤコブ病)の原因となる感染性因子を本発明に従って検出/
定量することに対して高い重要性を有することが期待される。
チド、レクチン、核酸、炭水化物、可溶性細胞表面受容体、ファージディスプレ
イまたはリボゾームディスプレイからコンビナトリアル的に誘導されたタンパク
質、または、その他いずれかのタイプの結合部分であり得る。結合部分の組み合
わせを使用してもよい。
連結は共有結合の架橋または非共有結合の架橋でよく、例えばストレプトアビジ
ン−ビオチン連結である。近接プローブが、例えばペアでターゲット分析物に結
合した場合、互いに近づくために、連結された核酸も互いに近づく。核酸を結合
させたこれらターゲットの近接は、これら核酸間の様々な検出可能な相互作用を
促進するのに利用される。この核酸の相互作用は、分析の第2段階において検出
される。多くの場合、核酸相互作用の量の第2の検出は、相互作用生産物の特異
的な増幅を伴う。
分に連結された一定の核酸配列を有し、同時に、もう一方の結合部分は、3’末
端で結合部分に連結された核酸配列を有する。このように、5’近接プローブは
、第2の結合部分の5’フォスフェートと相互作用により反応可能な、自由な3
’ヒドロキシルを有する。
アで反応することができる。本検出方法では、近接プローブは、低濃度でサンプ
ルに加えられる。近接プローブの濃度は、近接プローブが互いに近くにない場合
、近接プローブが過度に互いに反応することのないような低い濃度に調節される
。しかし、2以上の近接プローブが分析物に結合する場合、高い局所濃度により
プローブ間の相互作用が促進され、バックグラウンドシグナルと無関係に分析物
を上回る検出シグナルが生じる。
検出するために増幅工程を必要とする。生成したこれら核酸間のライゲーション
は、様々な反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換反応(strand
displacement amplification)(6)、NASBA(7)、RNA転写(8)
、インベーダー法(invader assay)(9)などによって、容易に増幅可能であ
る。従って、これらの増幅反応は、2つの核酸がライゲーションによって架橋さ
れた場合にのみ生成物を与えるように設計される。これは、PCRまたはSDA
に関するプライマーを、接合した核酸それぞれに一つずつ設置することによって
なされる。増幅反応は、配列特異的なTaqManプローブ(10)もしくは分
子ビーコンプローブ(molecular beacons probe)(11)によって、または、
例えばSYBR greenのような非配列特異的な挿入蛍光染料(intercalat
ing fluorescent dyes)を用いることによって(12)、リアルタイムで続けら
れ得る。生じた生成物も、ゲルでの電気泳動によって定量され得る。
増幅の必要なしに直接分析され得る。その際、様々な方法が用いられ得る。例え
ば、一体化した2種の核酸配列のうちの第1番目の配列が、固定化オリゴヌクレ
オチドプローブにハイブリダイゼーションによって結合可能な配列を含むように
設計され得る。オリゴヌクレオチドプローブを結合するときに、第2番目の核酸
配列も結合し得る。それは、これらの2種が、今や、ライゲーションによって連
結されているからである。結合していない全ての配列は洗い落とされ、第2番目
の配列に特異的な標識ハイブリダイゼーションプローブがライゲーション生成物
を結合し、検出する。
そこで、一体化した配列成分は協同的に結合し、それによって、一体化していな
い核酸に比べてオリゴヌクレオチドプローブに対して強く結合する。このような
プローブは、DNAマイクロアッセイにおいて、一体化した配列成分で選択的に
核酸を結合させるように構築され得る(13)。
び/または定量する方法に関し、a)2以上の近接プローブを分析物上の個々の
結合部位に結合させ、ここで、近接プローブは結合部分とそれに(接合(conjug
ated)された、またはビオチン−ストレプトアビジン結合のような結合を介して
)連結された核酸(また場合によっては反応官能基とも呼ばれる)から構成され
;b)結合部分を分析物に結合させ、核酸が互いにごく接近する場合にそれぞれ
を相互作用させ;c)核酸間の相互作用の程度を検出および/または定量し、た
だし、結合部分および分析物のすべてが核酸を含むとは限らないことを特徴とす
る。
るためのキットに関し、分析物に対する親和性を有する結合部分を含み、かつそ
れぞれ相互作用可能な核酸(反応官能基)を各々備えた近接プローブペアを含む
。好ましい実施形態において、1つの核酸は自由な3’末端を有し、他方は自由
な5’末端を有する。
キットを使用することに関する:すなわち、この目的は、 リガンド受容体相互作用アンタゴニストに関して、ハイスループットスクリー
ニング法でスクリーニングする目的; 溶液中の未知の分析物を競合的に検出および/または定量する目的; 大規模プール中でリガンド候補をスクリーニングする目的; 大規模ライブラリーから薬剤候補をスクリーニングする目的; 感染性因子を検出する目的である。
をスクリーニングする方法に関し、 a)受容体リガンドに対して親和性を有する結合部分、および、 b)それに(接合された、またはビオチン−ストレプトアビジン結合のような結
合を介して)結合した核酸 を有する2種の近接プローブと、受容体−リガンドおよびその受容体、ならびに
リガンド受容体相互作用アンタゴニストが存在する可能性のあるサンプルとを、
ハイスループットスクリーニング法で反応させ;ここで、陽性シグナルは、アン
タゴニストが存在する場合に生じることを特徴とする。
a)分析物に対して親和性を有する結合部分、および b)それに結合した核酸 を含む近接プローブと、核酸を結合させた分析物とを未知の分析物を含む溶液中
で反応させ; 未知の分析物と競合して、核酸を結合させた分析物を結合部分に結合させ; 核酸を互いに結合させ;そして 核酸間の結合結果の量を検出および定量し、ここで、反応からのシグナルは、
未知の分析物の濃度に逆比例することを特徴とする。
し、 核酸(反応官能基)に連結された受容体と、核酸(反応官能基)に連結された
その受容体−リガンドとを反応させ; 核酸を互いに相互作用させ; 核酸間の相互作用の程度を検出および/または定量し、ここで、受容体リガン
ド複合体をブロックする分子が存在する場合、検出シグナルが減少することを特
徴とする。
いる場合、ハイブリダイズしたテンプレート鎖(DNAスプリントまたはスプリ
ントテンプレートとも呼ばれる)に依存する。ライゲーションされる2種のオリ
ゴヌクレオチドは、1方のオリゴヌクレオチドの3’末端を他方のオリゴヌクレ
オチドの5’フォスフェートに並ばせるように、テンプレートにハイブリダイズ
しなければならない。
くの近接プローブのペアにハイブリダイズし、ライゲーションを促進し得る。し
かし、近接プローブオリゴヌクレオチドそれぞれがライゲーションテンプレート
を結合した場合、単一のライゲーションテンプレートはライゲーション可能な末
端のペアを繋がないため、ライゲーションは起こらない。ライゲーションテンプ
レートが高濃度で加えられる場合、1対1のハイブリダイゼーションの確率は高
くなる。しかし、近接プローブがそれらのターゲットに結合した場合、それらの
オリゴヌクレオチドの高い局所濃度により適切なライゲーション基質の生成が助
長される。このメカニズムは、分析物の存在下でライゲーションを促進し、抗原
非存在下での近接プローブの不活性化に役立ち、シグナル対ノイズ比を改善する
。
である。不正確に設計された場合、ライゲーションテンプレートは、重合のため
のテンプレートとして、DNAポリメラーゼのような増幅酵素によって使用され
る可能性がある。ライゲーションテンプレートを鋳型される、この伸長は間違っ
た生成物を生じさせることがある。この問題を解決するために、DNAオリゴヌ
クレオチドを、T4DNAリガーゼ酵素を用いるテンプレートとして、RNAオ
リゴヌクレオチドとライゲーションできる。TaqDNAポリメラーゼは、重合
のためのテンプレートとしてRNAを用いることができないため、このようなラ
イゲーションテンプレートでの重合から間違ったPCR産物は生じ得ない。2つ
の短いハイブリダイゼーション領域(例えば10+10)を有するDNAスプリ
ントも、RNAスプリントのような働きをする。しかし、ハイブリダイゼーショ
ンが弱いために、それらは融解温度が低く、PCRにおける高温で重合のテンプ
レートにならない。
ほとんど必要としないT4RNAリガーゼによるものか、または、化学的ライゲ
ーションを用いて重合反応を開始することができない末端を結合させることであ
る。
レオチドから生じたバックグラウンドシグナルは、ダミーオリゴヌクレオチドを
加えることによって減少し得る。このオリゴヌクレオチドは、通例的なライゲー
ションにおいて用いられるのと同じライゲーションテンプレートにより、ターゲ
ットの結合部分に接合したオリゴヌクレオチドのどちらともライゲーションする
能力を有する。しかしながら、このダミーオリゴヌクレオチドと近接プローブオ
リゴヌクレオチドとの間のライゲーションは、ダミーオリゴヌクレオチドがPC
Rで必要とされるプライマー部位を含まないように設計されているため、PCR
反応をまったく起こさない。ダミーオリゴヌクレオチドの濃度は、非ターゲット
結合近接プローブオリゴヌクレオチドと容易にライゲーションするが、その高い
局所濃度が原因で、ターゲット結合近接プローブとライゲーションにおいて競合
しないように最適化される。
てターゲットを検出する場合、殆どの分析物をプローブと結合させるのに十分な
高い濃度で近接プローブを用いてプレインキュベーションすることが好ましい。
続いて、このプレインキュベーションを、大量の冷緩衝液で迅速に希釈し、その
後この希釈液の一部をライゲーション反応混合物に加える。このライゲーション
反応混合物は、テンプレート、ATPおよびリガーゼ酵素を含む。ライゲーショ
ンミックスはまた、上述の検出成分を含むことができる。低い温度により、存在
する近接プローブ−ターゲット複合体の解離を極小化することができ、同時に、
大量の希釈により近接プローブオリゴヌクレオチドの濃度を低下させ、それによ
ってそれらの反応性を低め、バックグラウンドシグナルを極小化することができ
る。希釈はまた、真の陽性シグナルをわずかながら減少させることがある。
のタンパク質を含む。DNAアプタマーを用いる場合、それらが分析物以外に溶
液中の他のタンパク質と非特異的に結合してしまうために問題を引き起こす。分
析は、バックグラウンドを増やさないように可能な限り少ないプローブを用いる
べきであり、サンプルが複雑である場合、より多くのプローブの供給が必要なた
めに、プローブに結合した分析物からのシグナルが減少し、バックグラウンドは
増加する。これは、分析物に特異的なプローブによる非特異的相互作用を排除す
るブロッキング分子を加えることによって解決され得る。このような分子は、特
異的なものと似ているが分析物またはライゲーション可能な末端に対する高い親
和性を持っていないアプタマーであり得る。
よるものである。これは、プローブが非特異的に結合し得るタンパク質の量を顕
著に減らし、それによってより低濃度のプローブを用いることができる。この場
合、分析物も希釈されるが、近接プロービングの感度が高いため、それでもなお
良好な検出および定量を提供する。
々な方法があり、図1〜8にいくつかの例を示す。これらの相互作用の例はまた
組み合わせて用いられ得る。ライゲーション反応は、酵素で触媒されるライゲー
ションに限定されず、化学的ライゲーションによってなされることができるか、
または触媒的なRNAもしくはDNAによって触媒されることができる。
し得る分析である。この場合、2部位でタンパク質を結合する結合部分はSel
ex(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)誘導ア
プタマーである(16)。これらは、ターゲットタンパク質に向けての親和性に
関して非常に大きなランダムコンビナトリアルライブラリーから繰り返し選択さ
れた単鎖オリゴヌクレオチドであり、この場合、PDGFのB鎖である(17)
。アプタマーの配列は、結合部分のほかにも追加のポリヌクレオチド配列を含む
ように、容易に延長される。この延長部は、上述の反応官能基を含む。1つのア
プタマーは、5’ホスフェート基の5’延長末端を有し、他のアプタマーは3’
ヒドロキシルの3’延長末端を有する。これら2つの延長部は、テンプレート鎖
にハイブリダイズする場合、ライゲーション反応により一体化され得る(図10
)。
る。これらが低濃度である場合、反応効率は2つの近接プローブにともに結合可
能な分子(分析物)が存在し、それにより、それらの局所濃度を増加させ、反応
官能基または延長部間の反応を促進させることによって、顕著に高められる。P
DGFは、2つのアプタマーを、それぞれ3’または5’延長部と一緒にするこ
とによって、「触媒」のように機能する。近接プローブが5pMの濃度で加えら
れる場合、有効な濃度における増加は、近接プローブがPDGFを結合した場合
、1500万倍と推定される。
n分析のサイクルしきい値(Ct値)に比例する。PDGF BBはホモ二量体
であるため、同じ結合部分(selexアプタマー)が両方の近接プローブに対
して用いられ得る。統計的に、2プローブ/1PDGF複合体の半分は、3’プ
ローブ/PDGF/5’プローブ型であり、一方で、3’プローブ/PDGF/
3’プローブおよび5’プローブ/PDGF/5’プローブ複合体は検出可能な
シグナルを生じない。
第1のミックスはインキュベートミックスであり、該ミックスと、未知のサンプ
ルとを1〜2時間室温でインキュベートする。このミックスは、2種のプローブ
(selexアプタマーおよびライゲーション可能な配列)を含む。インキュベ
ート後、ライゲーションミックスを5分間室温で加える。このミックスは、リガ
ーゼ酵素、ライゲーションテンプレート、およびATPを含む。ライゲーション
反応は、反応物を80゜で20分加熱することによって不活性化させる。最後に
、増幅/検出ミックスは、PCRプライマー、TaqManプローブ、dNTP
およびDNAポリメラーゼを含む。PCR増幅はTaqMan分析によりリアル
タイムで検出され、Ct値はサンプル中に存在するPDGF量を反映する。Ct
値は、PCR反応が、産物の生産される増幅の臨界量に達するしきい値である。
図11は、PBSM緩衝液中のPDGF−BBの希釈に関するCt値を示す。高
いCt値は、低い、または検出不可能なPDGF−BB濃度に相当する。
is−HCl pH8.3、BSA 0.01%、3mM MgCl2、7.5
pM プローブ A1cおよびA2c。1μLのサンプルをこのミックスに加え
る。
s−HCl pH8.3、3mM MgCl2、0.8mM ATP、20nM
ライゲーションテンプレート、3ヴァイスユニット(Weiss unit)のT4DNA
リガーゼ。
l、10mM Tris−HCl pH8.3、0.4mM MgCl2、0.
33mM dNTP、1×緩衝液A、1μM フォワードプライマー、1μM
リバースプライマー、83nM TaqManプローブ、1.56ユニットのア
ンプリタックゴールドポリメラーゼ(AmpliTaq Gold polymerase)(Perkin-Elm
er)。
)を45回である。
加えることができる。インキュベートミックスは、サンプルおよび反応プローブ
を含む同じままである。好ましくは、インキュベートは少量で行われ、ライゲー
ション/検出ミックスを加えると、体積が顕著に増加し、それにより非結合近接
プローブは希釈され、それらの反応性が減少する。しかしながら、短時間のライ
ゲーション反応の間、新しい平衡状態が整う時間がないため、分析物−結合近接
プローブはそれらの高い局所濃度および高い反応性を保つ。
ーブの混合したライゲーション/検出の変型の結果を示す。ここで、インキュベ
ートミックスは、1μLのサンプルを含む10μL中に、20pMのアプタマー
A1cおよびA2cを含んでいた。40μLのライゲーションおよび検出ミック
スを加え、室温で5分放置し、その後、サンプルを加熱することによってPCR
反応を開始し、同時に、それによってライゲーション反応を止めた。ライゲーシ
ョン/検出ミックスは、T4DNAリガーゼ、ライゲーションテンプレート(1
0+10)40nM、ATP、TaqGold DNAポリメラーゼ、dNTP
、PCRプライマー、およびTaqManプローブを含んでいた。
きの量の増加により達成される。この方法はまた、容器を第二の添加により開け
ないため、汚染の危険を極小化でき、さらに、分析の感度は希釈効果により高め
られる。1×10E−19モルのPDGF−BBが、図12に示される分析で検
出された。これは、PDGF−BBに関する市販のELISAの報告された感度
よりも、およそ500倍の感度の増加である。
が、その代わりに第1の親和性試薬を介して結合できる。2つの結合部位を有す
る分析物の場合、第1の親和性試薬が分析物を結合し、近接プローブはこの第1
の試薬に結合する(図13)。この方法は、ターゲット結合部分として抗体を用
いてここで例示された万能近接プローブを設計する場合に有利である。
近接プローブを製造することによって解決し得る。これらは、結合部分の第2の
ペアを含み、それぞれ第1の結合性抗体ペアのFc領域(定常領域)へ一回結合
することができる。Fc領域は、様々な特異性を有する多くの異なる抗体におい
て不変である。従って、核酸はこれら第2の結合部分に接合し、多くの異なる分
析物の検出に広く用いることができる。第1の抗体ペアは分析物とともにインキ
ュベートされ、第2の反応結合性試薬が加えられ、高い局所濃度のとき優先的に
反応させることができる(図13)。
分析を用いることによって解決し得る。ここで、精製した一定量の分析物そのも
のが核酸に接合され、1つの存在結合部分は他の反応的な核酸に接合される。こ
れら2つの接合を、未知量の分析物を含有するサンプル混合物中で反応させるこ
とができるとき、サンプル中の未知量の接合していない分析物は近接プローブの
結合部分に結合することに対して競合し、それによって、接合した核酸の反応の
確率を減少させる。この場合、反応からのシグナルは、分析物の濃度に逆比例す
る。
ペアを用いて検出し得る。これらの近接プローブペアは、他のペアからそれらを
区別するために特有な核酸配列を有する。
および同じライゲーションジャンクションを有するが、特有の識別配列を有する
。異なるPCRプライマー部位および異なるライゲーションジャンクションが用
いられる場合、交差反応性のために、避けなければならない間違ったPCR産物
が生じる危険が著しく増える。PCR中、異なるタンパク質の存在を示す異なる
アンプリコン(amplicon)は同時に増幅される。これら異なるPCR産物は、例
えばDNAマイクロアッセイ、マススペクトロメトリー、ゲル電気泳動(異なる
長さの産物)などのような様々な方法のいずれかによって検出され得る。真の陽
性ライゲーションは、真の陽性として評価するために、配列認識タグ形状のオリ
ゴヌクレオチドの正しいペアを双方とも含まなければならない(図14)。ある
種のタンパク質の存在に対応する特有の増幅産物を分類するために、DNAマイ
クロアレイを用いることができる。
してcDNA発現クローンをスクリーニングすることによって見出され得る。こ
のようなスクリーニングは通常、既知の受容体が固定された様々な固相様式で実
行される。
クリーニングする代替手段を提供する。1つは、未知の受容体のリガンドによる
結合をブロックするような方法において、既知の受容体と結合可能な抗体を必要
とする。オリゴヌクレオチドは受容体に接合し、それは抗体に結合した第2のオ
リゴヌクレオチドにライゲーション可能である。一組のサンプル混合物に受容体
および抗体を加え、存在の可能性のある受容体のリガンドと相互作用させる。ラ
イゲーションミックスをサンプルに加え、そして、受容体のリガンドがサンプル
中に存在する場合、オリゴヌクレオチド間の近接性の不足が原因で、受容体のリ
ガンドの存在下で受容体−抗体複合体を形成できないため、オリゴヌクレオチド
のライゲーションは無効になる。それゆえに、存在の可能性のあるリガンドを含
むサンプルは、より小さいシグナルを与える。この方法は、受容体およびそれら
のリガンドに限定されず、関心のある生物学的分子の全タイプに用いられ得る。
で、薬剤候補もスクリーニングできる。例えば、受容体およびそのリガンドは、
両方ともオリゴヌクレオチドと接合する。競合的薬剤候補を含む混合物中、オリ
ゴヌクレオチド間のライゲーションは、受容体のリガンド複合体を形成できない
ため、阻害される。従って、大規模な薬剤候補ライブラリーは受容体およびその
リガンドの最小限の材料使用でスクリーニングされ得る。
ローブを用いることによって、近接プロービングをこのような非常に少量の因子
の検出に用いられ得る。2つのプローブは、これらが表面上に豊富であり、かつ
互いの近くに密集している場合、同じターゲットに結合するように設計されるこ
とができる。2つのプローブはまた、因子上の2つの異なるターゲットにも結合
し得るが、互いに近くであることが必要である。
が達成され得る。この分析は、シグナルを生じさせるために、2以上のライゲー
ション結果を要求するように設計される。3つの結合部分が同時に分析物を結合
できる場合、それぞれ異なる接合核酸配列を有する3つの異なる近接プローブを
製造する。3’延長部を有する1つ(A)、5’延長部を有する1つ(B)、な
らびに、3’および5’延長部両方を有する1つ(C)である。Aの3’末端は
Cの5’末端にライゲーションし、Cの3’末端はBの5’末端にライゲーショ
ンする。PCR検出の場合、AおよびB上に設置されたプライマーにより、Cプ
ローブ全体をおおうPCR産物を得る。好ましくは、Cプローブは、Cプローブ
に接合された核酸上での重合を容易にするために、1本鎖DNAアプタマー結合
部分を用いて構築される。
で見られるように、2回のライゲーション結果を必要とするため、1回の結果に
比べて、間違った陽性シグナルによるバックグラウンドライゲーションを少なく
することができる。分析の最適化中、近接プローブ濃度の減少にともなって、2
プローブシステムを用いた二乗根に比べて、濃度の三乗根(third root)なので
、バックグラウンドライゲーションの可能性は減少する。
が、分析物を二量体化することによって近接を造ることができ、それらの検出を
可能にする。これは、近接プローブに組み入れられたアプタマーを基礎とする結
合部分と、分析物を二量体化する抗体によって例示され得る。
部位に結合する。検出を可能にするために、近接プロービングは少なくとも2つ
のプローブをそれぞれのターゲットに結合させることを必要とするため、これら
一価のターゲットは検出がより難しくなる。これは、インキュベート混合物に2
つのターゲットを同時に結合させることのできる2価の抗体(または他の親和性
試薬)を加えることによって、克服し得る。抗体はselexアプタマーから離
れた部位で結合するはずであり、それによって、抗体、2種のターゲットタンパ
ク質、および2種のライゲーション可能なselexアプタマーを基礎とする近
接プローブとからなる5つの分子の複合体が形成できる。
とによって得られたそれらの近接プローブによって促進される。このシステムは
、ターゲットおよびselexアプタマーの一定量を用いることによって、抗体
自身を検出および定量するのに代替可能に用いられ得る。
ニングする場合、候補化合物の莫大なライブラリーをスクリーニングするのに、
高感度、特異的かつ迅速な試験システムが有利である。これはしばしば、ハイス
ループットスクリーニングと呼ばれる。
LA検出システムがどのように再設計(redesign)されるかを示す例である。こ
のスクリーニング原理を、PDGF−BBおよびその受容体相互作用によってこ
こに例示する。PDGF−BBおよび近接プローブのインキュベートミックスに
可溶性受容体の余剰量を加えることにより、プローブのPDGFに対する結合は
受容体によってブロックされ、シグナルは生じない。しかしながら、受容体へ結
合する分子が競合するようにインキュベートミックスに加えられる場合、PDG
Fは「自由」になり、シグナルを生じる近接プローブへ近づきやすくなる。
アルファ受容体を結合させることが可能であるため、PDGF−AAを用いてア
ンタゴニストの動作を模擬させた。6.4pMのPDGF−BBを、5pMのア
プタマーを基礎とする近接プローブおよび2.5nMの可溶性PDGF−アルフ
ァ受容体(余剰量)とともにインキュベーションした。アプタマーではなく受容
体に結合するPDGF−AAを100nM加えると、その時点で近接プローブに
近づきやすい「自由」になったPDGF−BBから、3倍のシグナル増加が生じ
た。
method of immunoassay. Direct and inhibition mode detection with human
albumin and rabbit antihuman albumin., Mol Immunol 1979 Apr; 16(4): 265-
7 2) Szollosi J, Damjanovich S, Matyus L, Application of fluorescence reso
nance energy transfer in the clinical laboratory: routine and research.
Cytometry 1998 Aug 15; 34(4):159-79 3) Ueda H, Kubota K, Wang Y, Tsumoto K, Mahoney W, Kumagai I, Nagamune T
, Homogenous noncompetitive immunoassay based on the energy transfer bet
weenfluorolabeled antibody variable domains (open sandwich fluoroimmunoa
ssay)., Biotechniques 1999 Oct; 27(4):738-42 4)Koo EH, Lansbury PT Jr, Kelly JW, Amyloid disease: abnormal protein ag
gregation in neurodegeneration., Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Aug 31;96
(18):9989-90 5) Prusiner SB, McKinley MP, Bowman KA, Bolton DC, Bendheim PE, Groth DF
, Glenner GG, Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent
rods., Cell 1983 Dec;35(2 Pt 1):349-58 6) Nadeau JG, Pitner JB, Linn CP, Schram JL, Dean CH, Nycz CM, Real-Time
, Sequence-Specific Detection of Nucleic Acids during Strand Displacemen
t Amplification. Anal Biochem 1999 Dec 15;276(2):177-187 7) van Deursen PB, Gunther AW, van Riel CC, van der Eijnden MM, Vos HL,
van Gemen B, van Strijp DA, Tackent NM, Bertina RM, A novel quantitative
multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14
mRNA levels in human monocytes. Nucleic Acid Res 1999 Sep 1;27(17):e15
8) White SR, et al., Signal amplification system for DNA hybridization a
ssays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin.,
Nucleic Acid Res. 1999 Oct 1;27(19):e25 9) Kwiatkowski RW, Lyamichev V, de Arruda M, Neri B, Clinical, Genetic,
and Pharmacogenetic Application of the Invader Assay., Mol Diagn 1999 De
c;4(4):353-364 10) Gibson, U.E., heid, C.A., Williams, P.M. Genome Res., 6, 995-1001 11) Tyagi, S. Kramer, F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon
hybridization, Nat Biotechnol(1996), 14, 3, 303-8 12) Steuerwald N, Cohen J, Herrera RJ, Brenner CA, Analysis of gene expr
ession in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescen
ce monitored RT-PCR. Mol Hum Reprod 1999 Nov;5(11):1034-9 13) Gentalen E, Chee M, A novel method for determining linkage between D
NA sequences: hybridization to paired probe assays., Nucleic Acids Res 1
999 Mar 15;27(6):1485-91 14) Baner J, Nilsson M, Mendel-Hartvig M, Landegren U, Signal amplificat
ion of padlock probes by rolling circle replication., Nucleic Acids Res
1998 Nov 15;26(22):5073-8 15) Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary BP, Lan
degren U, Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized D
NA detection., Science 1994 Sep 30;265(5181):2085-8 16) Gold, L. Polisky, B. Uhlenbeck, O. Yarus, M., Diversity of oligonucl
eotide functions. Annu Rev Biochem, 1995, 64, 763-97 17) Green, L. S. Jellinek, D. Jenison, R. Ostman, A. Heldin, C.H. Janjic
, N., Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain,
Biochemistry, 1996, 35, 45, 14413-24
のための、テンプレートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す。
このライゲーションは、PCRプライマーを近接プローブオリゴヌクレオチドそ
れぞれに一つずつ設置することによる増幅によって検出され得る。 図2b)は、近接プローブオリゴヌクレオチド間にライゲーションされる追加
のオリゴヌクレオチドを示す。
DNAポリメラーゼが触媒する「充填(fill-in)」反応、それに続く、近接プ
ローブペアのライゲーションを示す。
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド(z)の使用を示す。他の2つのオ
リゴヌクレオチド(xおよびy)は、互いに近接プローブにハイブリダイズし、
ライゲーションし、特異的に検出されるx−z−yオリゴヌクレオチドを形成す
る。近接プローブが互いに近くない場合、1つのオリゴヌクレオチドzは全ての
近接プローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。これは、x−z−yラ
イゲーション産物を形成できなくし、x−zおよびz−yのみが形成される。
ローブオリゴヌクレオチドのテンプレートとすることによる、(パッドロックプ
ローブ(padlock probe)をライゲーションさせた)環状DNAの生成を示す。
環状DNAはローリングサークル増幅によって増幅され得る(14)。
ヌクレオチドにハイブリダイズすることによってテンプレートとし、(パッドロ
ックプローブをライゲーションさせた)環を生じるライゲーションを示す。環状
DNAは、第2の近接プローブオリゴヌクレオチドが形成された環に近接する場
合、ローリングサークル増幅するために容易に開始される。近接は、ターゲット
結合によって提供される。
つの近接プローブオリゴヌクレオチドのライゲーションを示す。T4RNAリガ
ーゼは、テンプレートを用いないライゲーション(non templated ligation)を
触媒することができ、近接プローブオリゴヌクレオチドが互いに近い場合に好ま
しい。
ト化を示す。2つの近接プローブオリゴヌクレオチドは、互いに弱くハイブリダ
イズし、このハイブリダイゼーションは、分析物の結合によって協同的に安定化
される。このハイブリダイゼーションと、それに続く重合反応とは、近接プロー
ブが近い場合に好ましく起こるように最適化される。
る、同じ分析物に結合する3つの近接プローブのライゲーションを示す。近接プ
ローブオリゴヌクレオチドは、ライゲーションされ、増幅のためのプライマー部
位は3つのオリゴヌクレオチド全てをつなぐように配置される。
A1cおよびA2cにより結合されたPDGF−BBの概略図である。PDGF
−BBを結合するアプタマー配列は、タンパク質の近くに示される。PCR検出
に用いられるTaqManプローブ配列を示す。近接プローブ間のライゲーショ
ンジャンクションは、A1cの3’末端およびA2cの5’末端の間に線で示し
た。プライマー部位は囲んだ。
用いたPDGF−BBの近接プロービングの結果である。希釈系からのサンプル
1μLを分析した。ライゲーションの量は、5’エキソヌクレアーゼTaqMa
nPCR分析によって定量された。高いCt値は、少量のライゲーション生成P
CRテンプレートに相当する。
たPDGF−BBの近接プロービングの結果である。高いCt値は、少量のライ
ゲーション生成PCRテンプレートに相当する。
万能近接プローブの例である。
。陽性シグナルは、2つのマッチング配列識別タグ(ID:AおよびID:B)
が一体化する場合に生じる。2つのPCRプライマーが示されており、1つは、
DNAマイクロアレイハイブリダイゼーション前に単鎖化生成物を生成するため
のビオチン残基を含み、他方は、検出のための蛍光マーカーを有する。
Claims (18)
- 【請求項1】 溶液中の1以上の分析物を検出および/または定量する方法
であって、 a)2以上の近接プローブを分析物の各結合部位に結合させ、ここで、近接プロ
ーブは結合部分とそれに連結された核酸とで構成されており; b)結合部分を分析物に結合させ、核酸が互いにごく接近している場合、当該核
酸を互いに相互作用させ; c)核酸間の相互作用の程度を検出および/または定量することからなり、 ただし、結合部分および分析物のすべてが核酸を含むとは限らない、 ことを特徴とする、溶液中の1以上の分析物を検出および/または定量する方法
。 - 【請求項2】 相互作用した核酸の増幅、および、増幅産物の検出/定量を
さらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 近接プローブの結合部分が、モノクローナルもしくはポリク
ローナル抗体のようなタンパク質、レクチン、可溶性細胞表面受容体、ファージ
ディスプレイもしくはリボソームディスプレイからコンビナトリアル的に誘導さ
れたタンパク質、ペプチド、炭化水素、アプタマーのような核酸、またはそれら
の組み合わせから選択される、請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 分析物が、タンパク質、タンパク質凝集体、プリオン、およ
び/または核酸である、請求項1、2または3に記載の方法。 - 【請求項5】 近接プローブの結合部分に対する結合部位が、1つの同じ分
析物上であるか、または、2つの近接した分析物上である、請求項1、2,3ま
たは4に記載の方法。 - 【請求項6】 結合部分が抗体であり、前記抗体の各々は、分析物に対して
結合特異性を有する別の抗体を介して分析物に結合し、結合部分は別の抗体のF
cタンパク質に対して方向付けられる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 結合部分に連結された核酸の相互作用が、共通のスプリント
テンプレートへのハイブリダイゼーションおよび核酸末端のライゲーションによ
る、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 溶液中の1以上の分析物を検出および定量するためのキット
であって、 分析物に対する親和性を有する結合部分を含み、かつそれぞれ相互作用可能な
核酸(反応官能基)を各々備えた近接プローブペア;そして、場合により、 核酸をつなぐためのリガーゼおよびスプリントテンプレート、 核酸のそれぞれとハイブリダイズするプライマー を含む、溶液中の1以上の分析物を検出および定量するためのキット。 - 【請求項9】 分析物に対して親和性を有する抗体の第1ペアである、結合
部分の第1ペア;および、 抗体の第1ペアのFcタンパク質に対して方向付けられる抗体の第2ペアであ
る、結合部分の第2ペア、 を含む、請求項8に記載のキット。 - 【請求項10】 3種の近接プローブを含み、1は3’が自由な核酸を有し
(A)、1は5’が自由な核酸を有し(B)、ならびに、1は3’および5’両
方が自由な核酸を有し(C)、ここで、Aの3’末端は、Cの5’末端と相互作
用し、Cの3’末端はBの5’末端と相互作用する、請求項8に記載のキット。 - 【請求項11】 結合部分はアプタマーであり、それぞれアプタマー結合部
位を1つだけ有する2つの分析物を二量体化するための2価の親和性試薬をさら
に含む、請求項8に記載のキット。 - 【請求項12】 識別のための特異的結合部分および特有な核酸配列をそれ
ぞれ有する近接プローブの数ペアを含む、請求項8に記載のキット。 - 【請求項13】 ハイスループットスクリーニング法で、リガンド−受容体
相互作用アンタゴニストに関してスクリーニングするための、請求項1〜7のい
ずれかに記載の方法および/または請求項8〜12のいずれかに記載のキットの
使用。 - 【請求項14】 溶液中の未知の分析物を競合的に検出および/または定量
するための、請求項1〜7のいずれかに記載の方法および/または請求項8〜1
2のいずれかに記載のキットの使用。 - 【請求項15】 大規模プール中でリガンド候補をスクリーニングするため
の、請求項1〜7のいずれかに記載の方法および/または請求項8〜12のいず
れかに記載のキットの使用。 - 【請求項16】 大規模ライブラリーから薬物候補をスクリーニングするた
めの、請求項1〜7のいずれかに記載の方法および/または請求項8〜12のい
ずれかに記載のキットの使用。 - 【請求項17】 感染性因子を検出するための、請求項1〜7のいずれかに
記載の方法および/または請求項8〜12のいずれかに記載のキットの使用。 - 【請求項18】 感染性因子をヒトおよび動物のための食物中で検出する、
請求項17に記載の使用。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008518605A (ja) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 同種の分析物検出 |
JP2009523430A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | ソマロジック・インコーポレーテッド | 試験試料の多重化分析 |
JP2010521652A (ja) * | 2006-12-04 | 2010-06-24 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 組成物、装置、および関連する方法 |
JP2013532294A (ja) * | 2010-07-15 | 2013-08-15 | オリンク アーベー | 遮断試薬及びその使用のための方法 |
JP2017537645A (ja) * | 2014-12-19 | 2017-12-21 | アプライズ バイオ, インコーポレイテッド | 細胞の選択された部分集団中の複数エピトープを識別するための方法 |
JP2018533944A (ja) * | 2015-10-21 | 2018-11-22 | オリンク プロテオミクス エービー | 近接プローブの作成方法 |
US11512341B1 (en) | 2011-01-31 | 2022-11-29 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
US11560585B2 (en) | 2011-01-31 | 2023-01-24 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
Families Citing this family (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070166741A1 (en) | 1998-12-14 | 2007-07-19 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
DE60207700T2 (de) * | 2001-04-23 | 2006-08-10 | Eiken Kagaku K.K. | Analyseverfahren mit intermolekularer wechselwirkung eines reporters (markers) |
WO2003062786A2 (en) * | 2001-08-20 | 2003-07-31 | Regenesis Bioremediation Products | Biosensor for small molecule analytes |
CA2462625A1 (en) * | 2001-10-03 | 2003-04-10 | Iseao Technologies Limited | Methods for detection of target molecules and molecular interactions |
GB0212544D0 (en) * | 2002-05-30 | 2002-07-10 | Microsens Biophage Ltd | Methods for detection of target molecules and molecular interactions |
CA2462819A1 (en) * | 2001-11-23 | 2003-05-30 | Simon Fredriksson | Method and kit for proximity probing with multivalent proximity probes |
US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
US7595160B2 (en) | 2004-01-13 | 2009-09-29 | U.S. Genomics, Inc. | Analyte detection using barcoded polymers |
EP1704256A4 (en) * | 2004-01-13 | 2008-01-16 | Us Genomics Inc | DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANALYTES IN SOLUTION USING POLYMERS |
JP2007524410A (ja) * | 2004-01-23 | 2007-08-30 | リングヴィテ エーエス | ポリヌクレオチドライゲーション反応の改良 |
EP1774035A4 (en) * | 2004-06-14 | 2009-02-18 | Univ Leland Stanford Junior | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF ANALYTES USING PROXIMITY PROBES |
WO2007004982A1 (en) * | 2005-07-06 | 2007-01-11 | Forskarpatent I Uppsala Ab | Method for localization of nucleic acid associated molecules and modifications |
EP1762627A1 (de) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion |
WO2007044903A2 (en) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Stratagene California | Binary signal detection assays |
WO2007054515A1 (en) * | 2005-11-14 | 2007-05-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Method for detecting microorganisms |
GB0605584D0 (en) * | 2006-03-20 | 2006-04-26 | Olink Ab | Method for analyte detection using proximity probes |
WO2007117444A2 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Yinghe Hu | Protein detection by aptamers |
JP2009545317A (ja) * | 2006-08-01 | 2009-12-24 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | 分析物および核酸の検出 |
US20110136099A1 (en) | 2007-01-16 | 2011-06-09 | Somalogic, Inc. | Multiplexed Analyses of Test Samples |
US8975026B2 (en) | 2007-01-16 | 2015-03-10 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
US7947447B2 (en) | 2007-01-16 | 2011-05-24 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
GB0918712D0 (en) * | 2009-10-26 | 2009-12-09 | Axis Shield Diagnostics Ltd | An assay |
GB201004292D0 (en) | 2010-03-15 | 2010-04-28 | Olink Ab | Assay for localised detection of analytes |
US20120004132A1 (en) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Affymetrix, Inc. | Detection of Nucleic Acids and Proteins |
US10669569B2 (en) | 2010-10-15 | 2020-06-02 | Navinci Diagnostics Ab | Dynamic range methods |
EP2633081B1 (en) * | 2010-10-29 | 2017-01-11 | Olink Bioscience AB | Proximity ligation technology for western blot applications |
EP2466310A1 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-20 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH | Means and methods for detecting double-strand breaks |
EP2665815B1 (en) | 2011-01-17 | 2017-08-09 | Life Technologies Corporation | Enzymatic ligation of nucleic acids |
DK2665833T3 (en) * | 2011-01-17 | 2017-07-24 | Life Technologies Corp | WORKING PROCEDURE FOR DETECTING LIGANDS USING NUCLEIC ACIDS |
GB201101621D0 (en) | 2011-01-31 | 2011-03-16 | Olink Ab | Method and product |
US10597701B2 (en) | 2011-05-11 | 2020-03-24 | Navinci Diagnostics Ab | Unfolding proximity probes and methods for the use thereof |
GB201107863D0 (en) | 2011-05-11 | 2011-06-22 | Olink Ab | Method and product |
GB201108678D0 (en) | 2011-05-24 | 2011-07-06 | Olink Ab | Multiplexed proximity ligation assay |
US9029086B2 (en) * | 2012-01-26 | 2015-05-12 | Masood Kamali Moghaddam | Detection of single and multimodal analytes |
GB201201547D0 (en) | 2012-01-30 | 2012-03-14 | Olink Ab | Method and product |
WO2014076214A1 (en) | 2012-11-14 | 2014-05-22 | Olink Ab | Rca reporter probes and their use in detecting nucleic acid molecules |
US10174366B2 (en) | 2012-11-14 | 2019-01-08 | Olink Bioscience Ab | Localised RCA-based amplification method |
GB201320145D0 (en) | 2013-11-14 | 2014-01-01 | Olink Ab | Localised RCA-based amplification method using a padlock-probe |
GB201321123D0 (en) | 2013-11-29 | 2014-01-15 | Linea Ab Q | Amplification of circular molecules |
GB201401885D0 (en) | 2014-02-04 | 2014-03-19 | Olink Ab | Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR) |
WO2016141040A1 (en) * | 2015-03-02 | 2016-09-09 | The Regents Of The University Of California | Homogenous entropy-driven biomolecular assay (heba) |
BR112017022329A2 (pt) | 2015-04-17 | 2018-07-17 | Univ California | métodos para detectar aglutinação e composições para uso na prática do mesmo |
US11459598B2 (en) | 2015-10-20 | 2022-10-04 | Quateris Llc | Multiplex DNA immuno-sandwich assay (MDISA) |
WO2017147483A1 (en) | 2016-02-26 | 2017-08-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Multiplexed single molecule rna visualization with a two-probe proximity ligation system |
WO2017218881A1 (en) * | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Proximity Biosciences, Llc | Method for aptamer pair selection |
GB201614023D0 (en) | 2016-08-16 | 2016-09-28 | Olink Bioscience Ab | Double-stranded circle probes |
CN110546510A (zh) | 2016-10-21 | 2019-12-06 | 塞尔达治疗手术有限公司 | 预后方法和在所述方法中有用的试剂盒 |
GB201621514D0 (en) | 2016-12-16 | 2017-02-01 | Q-Linea Ab | Padlock probe detection method |
CN111139285A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-05-12 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒 |
WO2021034971A1 (en) * | 2019-08-19 | 2021-02-25 | Brickbio, Inc. | Methods and compositions for analyte detection and quantification |
CN115066434A (zh) * | 2019-12-03 | 2022-09-16 | 阿拉玛生物科学公司 | 核酸连接的免疫-夹心测定(nulisa) |
GB201919032D0 (en) | 2019-12-20 | 2020-02-05 | Cartana Ab | Method of detecting an analyte |
GB201919029D0 (en) | 2019-12-20 | 2020-02-05 | Cartana Ab | Method of detecting an analyte |
GB202004469D0 (en) | 2020-03-27 | 2020-05-13 | Olink Proteomics Ab | Controls for proximity detection assays |
KR20220160093A (ko) | 2020-03-27 | 2022-12-05 | 오링크 프로테오믹스 에이비 | 다양한 풍부도의 분석물을 검출하는 방법 |
GB202004472D0 (en) | 2020-03-27 | 2020-05-13 | Olink Proteomics Ab | Method for detecting analytes of varying abundance |
GB202017873D0 (en) | 2020-11-12 | 2020-12-30 | Olso Unversitetssykehus Hf | Method of determining DLBCL prognosis |
GB202018503D0 (en) | 2020-11-25 | 2021-01-06 | Olink Proteomics Ab | Analyte detection method employing concatamers |
CN113945720A (zh) * | 2021-09-26 | 2022-01-18 | 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 | 基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒 |
WO2023122345A1 (en) * | 2021-12-23 | 2023-06-29 | California Institute Of Technology | Suppression of non-specific signals by exonucleases in fish experiment |
GB202213930D0 (en) | 2022-09-23 | 2022-11-09 | Xu Bo | Padlock blocking oligonucleotide |
WO2024100258A1 (en) | 2022-11-11 | 2024-05-16 | Olink Proteomics Ab | Library of proximity probes and method of use |
EP4382534A1 (en) | 2022-12-06 | 2024-06-12 | Biomérieux | Synthetic peptide for use in an immunomolecular assay |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510669A (ja) * | 1991-09-13 | 1994-12-01 | サイトセル・リミテッド | 核酸伸長検定 |
US5846709A (en) * | 1993-06-15 | 1998-12-08 | Imclone Systems Incorporated | Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
JPH11508040A (ja) * | 1995-06-16 | 1999-07-13 | ランデグレン,ウルフ | 分析物に付着したときに架橋する2種類の試薬によるイムノアッセイとキット |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
CA1323293C (en) * | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
EP1216417A1 (de) * | 1999-09-28 | 2002-06-26 | Evotec OAI AG | Quantitative analyse und typisierung subzellulärer partikel |
-
2000
- 2000-02-18 SE SE0000538A patent/SE516272C2/sv not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-16 EP EP01906476A patent/EP1255861B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-16 AU AU34300/01A patent/AU783644B2/en not_active Expired
- 2001-02-16 WO PCT/SE2001/000341 patent/WO2001061037A1/en active IP Right Grant
- 2001-02-16 CA CA002400384A patent/CA2400384A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-16 JP JP2001559873A patent/JP4804691B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-16 DE DE60134957T patent/DE60134957D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-16 AT AT01906476T patent/ATE402269T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510669A (ja) * | 1991-09-13 | 1994-12-01 | サイトセル・リミテッド | 核酸伸長検定 |
US5846709A (en) * | 1993-06-15 | 1998-12-08 | Imclone Systems Incorporated | Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
JPH11508040A (ja) * | 1995-06-16 | 1999-07-13 | ランデグレン,ウルフ | 分析物に付着したときに架橋する2種類の試薬によるイムノアッセイとキット |
Cited By (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008518605A (ja) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 同種の分析物検出 |
JP2009523430A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | ソマロジック・インコーポレーテッド | 試験試料の多重化分析 |
JP2010521652A (ja) * | 2006-12-04 | 2010-06-24 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 組成物、装置、および関連する方法 |
JP2013532294A (ja) * | 2010-07-15 | 2013-08-15 | オリンク アーベー | 遮断試薬及びその使用のための方法 |
US11708599B2 (en) | 2011-01-31 | 2023-07-25 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
US11781171B1 (en) | 2011-01-31 | 2023-10-10 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
US11939624B2 (en) | 2011-01-31 | 2024-03-26 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Method for labeling ligation products with cell-specific barcodes II |
US11932902B2 (en) | 2011-01-31 | 2024-03-19 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Barcoded beads and method for making the same by split-pool synthesis |
US11512341B1 (en) | 2011-01-31 | 2022-11-29 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
US11932903B2 (en) | 2011-01-31 | 2024-03-19 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Kit for split-pool barcoding target molecules that are in or on cells or cell organelles |
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JP2018533944A (ja) * | 2015-10-21 | 2018-11-22 | オリンク プロテオミクス エービー | 近接プローブの作成方法 |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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