JP2005110664A - 核酸シグナルの増幅による標的ｄｎａの存在を検出する方法、及び免疫学的配位子の検出又は定量する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 標的ＤＮＡの検出を行うのに、標的ＤＮＡの増幅を行わずに、標的ＤＮＡの塩基配列に規制されない標的ＤＮＡの検出方法を提供する。
【解決手段】 標的ＤＮＡに対し相補的な塩基配列と相補的でない任意に選択可能な塩基配列とが結合している標的ＤＮＡ検出用プローブを用い、該プローブにおける標的ＤＮＡに相補的でない塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させる。標的ＤＮＡの塩基配列が異なっていても、増幅産物は全て同じ塩基配列のプローブで検出することができる。該標的ＤＮＡの存在を検出する方法を免疫学的配位子の検出又は定量に適用できる。
【選択図】 無し

Description

本発明は、標的ＤＮＡ自体を増幅することなく、任意に設定可能で且つ予め設定したオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させて標的ＤＮＡの存在を検出する方法に関する。さらに本発明は、該標的ＤＮＡの存在を検出する方法を適用して免疫学的配位子の検出又は定量する方法に関する。

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は多数のデオキシリボヌクレオチドが重合した核酸であり、デオキシリボヌクレオチドが直鎖状に連結されて、遺伝子コードを構成する。ＤＮＡは遺伝子の本体であり、遺伝子は、互いに相補的な塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡがハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡの状態で存在している。

現在までに多くのＤＮＡ増幅技術が開発され、極微量ＤＮＡを検出、分析する道具として広く利用されている。ある特定の塩基配列を検出する遺伝子検査や、微量のＤＮＡを分析するための特定の塩基配列の増幅は、研究分野、臨床分野、産業分野での需要が高まっており、必要不可欠な技術になっている。もっとも汎用されているＤＮＡ増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が知られている（非特許文献１）。

ＰＣＲは標的ＤＮＡ及びその相補鎖にハイブリダイズするように設計された２種類のプライマーを使用する。温度を上昇及び低下させることにより、プライマーと標的ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライマーの３’末端が複製開始点となり、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で標的ＤＮＡを鋳型としてデオキシリボヌクレオチドを付加することによりポリメラーゼ反応が進行する。このようにして合成された鎖を、温度を上昇させることにより標的ＤＮＡから解離させ、さらに温度を低下させることによりもう一方のプライマーとハイブリダイズさせると、合成された鎖を鋳型として同様の反応が進行する。このように温度変化を繰り返すことにより標的ＤＮＡを２本鎖として増幅することができる。

同様に温度変化の繰り返しを必要とする標的ＤＮＡの増幅方法としてリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が実用化されているが、詳細は特許文献１に記載されている。ＬＣＲは標的ＤＮＡにハイブリダイズするように設計した２つのプローブ対を用意し、標的ＤＮＡとハイブリダイズした２つのプローブを連結することにより新しい鎖を合成する方法である。ＰＣＲ及びＬＣＲは温度変化を必要とするために特別な装置が必要なことや、温度変化の１サイクルに数分を要するため、サイクル数が多いと反応時間が長くなる問題点が指摘されている。

上記の問題点を改善すべく、温度変化を必要としない等温でのＤＮＡ増幅技術も開発されてきている。鎖置換型増幅方法（ＳＤＡ法）は標的ＤＮＡにハイブリダイズするプライマー５’側に制限酵素認識配列を付加し、その下流の塩基配列が標的ＤＮＡとハイブリダイズするように設計される（非特許文献２）。プライマーと標的ＤＮＡがハイブリダイズするとプライマーの３’末端が複製開始点となり、標的ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ反応が進行すると同時に、標的ＤＮＡの３’末端が複製開始点となりプライマーの制限酵素認識配列を鋳型としてポリメラーゼ反応が進行する。その際、制限酵素による標的ＤＮＡ側の鎖の切断を回避するために特定の位置に修飾ヌクレオチドを取りこませるようにしておく。このように形成された２本鎖ＤＮＡに制限酵素が作用すると、プライマーを含む鎖にのみ切断（ニッキング）がおこり、３’末端が形成されるため、標的ＤＮＡを鋳型として新たに鎖置換型のポリメラーゼ反応が進行する。標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズするようなプライマーを同時に反応系に加えておけば等温で標的ＤＮＡが２本鎖の状態で増幅されてくる。

しかし、ＳＤＡ法ではプライマーと標的ＤＮＡのハイブリダイズはプライマーの制限酵素認識配列の下流で起こり、標的ＤＮＡの３’末端が複製開始点となりプライマーの制限酵素認識配列の相補鎖が合成されてくるようにするために、 標的ＤＮＡを予め断片化しておく必要が生じる。このような手間を除去した改良ＳＤＡ法も開発されているが（特許文献２）、その場合４種類のプライマーを設計する必要が生じてしまう。ＳＤＡ法では制限酵素によりニッキングが引き起こされるために制限酵素認識配列の適当な位置をホスホロチオエート結合（いわゆるＳ化結合）等に置換する方法がとられる。この修飾によりＳ化された鎖は制限酵素による切断から回避され、その相補鎖にのみ切断が引き起こされる。ＳＤＡ法は使用する酵素により反応温度を３７度付近から６５度付近までの範囲で反応を進行させうるが、プライマー同士の非特異的な相互作用を回避することや反応速度上昇のため、６０度付近の高温で反応させることが望ましいとされている。高温での反応に使用可能な耐熱性の鎖置換型ポリメラーゼと制限酵素及び制限酵素認識配列のニッキングに必要なＳ化の位置は特許文献３に詳細に記載されている。それによると、ニッキングの形成はすベての制限酵素で可能では無く、制限酵素の種類が限られるとある。

Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｌａｍｐ法）は第一増幅産物がループ構造をとることにより自己増幅が可能なＤＮＡ増幅方法である（非特許文献３）。しかし、４種類の特殊な構造のプライマーを必要とし、増幅産物が、増幅の標的とされた領域が繰り返されたサイズの一定しないＤＮＡである。

Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ法）はプライマーの５’側がＤＮＡ構造をとり、３’側がＲＮＡ構造をとるキメラプライマーが使用される（特許文献４）。プライマーと標的ＤＮＡがハイブリダイズとするとプライマー３’末端が複製開始点となり、標的ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ反応が進行すると同時に、反応液中に添加してあるＲＮａｓｅＨにより、プライマー配列中の標的ＤＮＡとハイブリダイズしているＲＮＡ構造の一部が切断される。これにより生じたプライマー配列の３’末端が複製開始点となり、連続的に標的ＤＮＡの相補鎖が合成される。標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズするようなプライマーを同時に反応系に加えておけば等温で標的ＤＮＡが２本鎖の状態で増幅されてくる。しかし、ＤＮＡとＲＮＡからなるキメラプライマーの合成は一般的に汎用されておらず、さらに、取り扱いを注意しなければＲＮＡ部分が容易に分解されてしまう恐れがあり、現状では一般的に普及するには至っていない。

上記に示した各ＤＮＡ増幅方法は、標的ＤＮＡの塩基配列そのものを増幅する方法である。従って、プライマー或いはプローブの配列は標的ＤＮＡの塩基配列に強く規制され、非特異的な増幅が起こりにくい配列の組合せを選択するのがしばしば困難である。増幅産物を検出する際にしばしばＤＮＡプローブが利用される。これは増幅産物と相補的な塩基配列を持ったＤＮＡプローブに増幅産物をハイブリダイズさせて検出する方法であり、増幅産物を特異的に検出できる非常に有効な手段である。

しかしながら、上記に示したＤＮＡ増幅方法では、増幅産物を検出するときに使用されるプローブの配列も標的ＤＮＡの塩基配列の規制を受けると同時に、数種類の標的ＤＮＡのうち少なくとも一種類の標的ＤＮＡが存在することを知りたいスクリーニング検査等でも、増幅産物を検出するためのＤＮＡプローブを標的ＤＮＡの種類と同じ数用意する必要が生じてしまう。ある特定の塩基配列を増幅して分析するためには、標的ＤＮＡの塩基配列をそのまま増幅する必要があるが、 臨床及び産業分野でのＤＮＡ増幅技術の使用目的は、大部分が標的ＤＮＡの存在の有無を判定することにある。例えば、臨床分野では患者の疾患の原因となるウイルス、 細菌の存在を遺伝子の存在で判定したり、各種疾患に係る遺伝子の存在を調べる手段としてＤＮＡ増幅技術が使用されており、産業分野では食品中の食中毒菌の存在を遺伝子の存在により判定する手段としてＤＮＡ増幅技術が使用されている。

特許文献５にはオリゴヌクレオチドの等温でのｉｎ ｓｉｔｕ合成方法が掲載されている。それによると、鋳型或いはプライマーとなるオリゴヌクレオチドを修飾することにより、その相補鎖をニッキングすることが可能になり、１本鎖状のオリゴヌクレオチドを連続的に合成することができるとある。しかし、該文献に記載の方法は、増幅される塩基配列は、標的ＤＮＡの部分に限定されるため、検出に適するような任意の塩基配列となるようにデザインすることはできない。

欧州特許出願公開０３２０３０８号 特公平８−７６号公報 特開平７−２８９２９８号公報 ＷＯ００／５６８７７号パンフレット ＷＯ９２/ ０５２８７号パンフレット Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９，３９２−３９６；１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ. １２

本発明の目的は、標的ＤＮＡの検出を行うのに、標的ＤＮＡの増幅を行わずに、標的ＤＮＡの塩基配列に規制されない標的ＤＮＡの検出方法を提供することであり、加えて、標的ＤＮＡの塩基配列が異なっていても、増幅産物は全て同じ塩基配列のプローブで検出することが可能な標的ＤＮＡの検出方法を提供することであり、さらに加えて本発明の目的は、２本鎖標的ＤＮＡの存在の有無を、標的ＤＮＡの塩基配列に規制されない任意の長さ及び配列を持つＤＮＡとして、増幅することにより判定する標的ＤＮＡの検出方法を提供することである。さらに、本発明の別の目的は標的ＤＮＡの存在を検出する方法を適用して免疫学的配位子の検出又は定量する方法を提供することである。

標的ＤＮＡの塩基配列そのものを増幅、検出する方法よりも標的ＤＮＡが存在することによって増幅されてくる任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを検出する方法が実現できれば、該検出方法はより効率的且つ応用範囲が広いものになることに本発明者らは着目し、標的ＤＮＡを検出するのに、標的ＤＮＡ自体を増幅しないで検出することが可能である方法を見出した。

即ち、本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、標的ＤＮＡに対し相補的な塩基配列と相補的でない任意に選択可能な塩基配列とが結合している標的ＤＮＡ検出用プローブを用い、該標的ＤＮＡ検出用プローブにおける標的ＤＮＡに相補的でない塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させることを特徴とする。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法において、使用する標的ＤＮＡ検出用プローブは、３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側部分が標的ＤＮＡに相補的でない任意に選択可能な塩基配列であることを特徴とする。さらに本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法において、使用する標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含むことを特徴とする。

本発明の望ましいより具体的な標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、
１）３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡと相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含む標的ＤＮＡ検出用プローブを用意し、
２）該標的ＤＮＡ検出用プローブと標的ＤＮＡとをハイブリダイズし、
３）前記２）工程で得られたハイブリダイズしている標的ＤＮＡ検出用プローブの３’末端の伸長反応を行わせ、
４）前記３）工程で得られたハイブリダイスしている標的ＤＮＡの制限酵素認識部位に制限酵素を作用させてニッキングを行い、
５）前記４）工程で得られたニッキングにより生じた標的ＤＮＡの切断部位の３’末端を複製開始点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、標的ＤＮＡの３’末端の伸長反応を行うことにより、５’アーム配列を含む標的ＤＮＡ検出用プローブとの相補鎖からなる２本鎖を作製し、
６）前記５）工程で得られた２本鎖の制限酵素認識部位に制限酵素を作用させてニッキングを行うことにより標的ＤＮＡを切断し、
７）前記６）工程で得られたニッキングにより生じた標的ＤＮＡの切断部位の３’末端を複製開始点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、標的ＤＮＡの３’末端の伸長反応を行うことにより、５’アーム配列を含む標的ＤＮＡ検出用プローブとの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを作製すると同時に、５’アーム配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを遊離させ、
８）前記６）及び７）工程を繰り返すことにより、５’アーム配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させることを特徴とする。

１．本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法によれば、標的ＤＮＡ自体の増幅を行わないので、標的ＤＮＡの塩基配列に規制されない標的ＤＮＡの検出方法を提供することができる。

２．加えて本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法によれば、標的ＤＮＡの塩基配列が異なっていても、増幅産物は全て同じ塩基配列のプローブで検出することができるため、スクリーニング検査に有用である。

すなわち、標的ＤＮＡの塩基配列自体を増幅し、プローブにより検出する従来の方法では、プローブの塩基配列は標的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を持つ必要があるため、数種類の標的ＤＮＡをそれぞれ増幅して検出する際には、プローブの種類を標的ＤＮＡの種類の数と同じだけ準備する必要が生ずると同時に、増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションも各増幅産物について別々の反応系で行う必要がある。

これに対して本発明は、標的ＤＮＡの塩基配列が異なっていても増幅産物は同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして増幅することができる。そのため、数種類の標的ＤＮＡを単一種類のプローブで同一の反応系で検出することが可能となる。例えば、数種類の標的ＤＮＡのうち少なくとも１種類の存在の検出（スクリーニング検査）を行う場合に効果的である。

さらに発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法に用いる検査薬を作製する場合には、増幅産物を検出するためのプローブは１種類準備しておけば、如何なる標的ＤＮＡの検出にも適用できるため、試薬開発の労力、本発明の検出方法のプロセスが単純化され、コスト的にも利点がある。

３．さらに加えて本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法によれば、標的ＤＮＡに対し標的ＤＮＡに相補的な塩基配列と相補的でない任意に選択可能な塩基配列とが結合している標的ＤＮＡ検出用プローブを用いているため、検出に適した塩基配列を有する標的ＤＮＡ検出用プローブをデザインすることができる。

すなわち、ＤＮＡのハイブリダイゼーションはその塩基組成によって、結合強度、非特異の有無などが大きく影響を受けることが知られている。例えば、ＰＣＲ用のプライマー設計において、単純に増やしたい領域の両端の配列を持つプライマーを設計してもＰＣＲで増幅されてこないことや、増幅高率が著しく低いこと、或いは非特異的なハイブリダイゼーションが顕著に現れることが多々ある。これはプライマーと標的ＤＮＡとの特異的なハイブリダイゼーションが高率よく行われていないことが原因である。したがって、プライマーに適した配列を探す必要がある。

これと同じことが増幅産物と増幅産物を検出するためのプローブとのハイブリダイゼーションにも当てはまる。標的ＤＮＡの塩基配列自体を増幅する場合、増幅産物の塩基配列は当然ながら標的ＤＮＡの塩基配列に規制されるので、自由に選択することができない。従って、増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションは必ずしも非特異が少なく適度な結合力を持っているとは限らない。例えば、増幅産物或いはプローブ自身で分子内高次構造をとってしまうことがある。該分子内高次構造はハイブリダイゼーション高率を著しく低下させる。

これに対して本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法では、増幅産物は任意の自由な塩基配列にすることが可能であるため、実験により選抜することにより、標的ＤＮＡ検出用プローブとのハイブリダイゼーションに適した塩基配列にすることが可能である。

４．本発明における標的ＤＮＡ検出用プローブを用いた標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、免疫学的配位子又は免疫学的抗配位子、具体的には、抗原又は抗体の検出又は定量を行う方法に適用できる。

本発明の核酸シグナルの増幅による標的ＤＮＡの存在を検出する方法の原理を図面を用いて次に説明する。

反応工程Ｉ（２本鎖標的ＤＮＡを変性処理により１本鎖標的ＤＮＡに解離させる反応工程）：
図１に示すように、制限酵素の認識配列を有する２本鎖標的ＤＮＡを変性処理により解離させて１本鎖標的ＤＮＡを製造する。該変性処理には、熱処理、アルカリ処理、脱塩処理、ホルムアミド処理、尿素処理等が挙げれらる。

反応工程II（標的ＤＮＡ検出用プローブと１本鎖標的ＤＮＡをハイブリダイズさせる反応工程）：
１本鎖標的ＤＮＡの制限酵素の認識配列を含めた配列部分と相補的な塩基配列と、該配列の５’側に導入された任意の塩基配列であって、１本鎖標的ＤＮＡの塩基配列とは相補的ではない塩基配列とからなる標的ＤＮＡ検出用プローブを予め作製する。標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列において、１本鎖標的ＤＮＡの塩基配列とは相補的ではない塩基配列を「５’アーム配列」と呼ぶ。該標的ＤＮＡ検出用プローブにおける制限酵素の認識配列の切断部位に、ホスホロチオエート結合を導入することにより、制限酵素により切断されないようにしておく。図２に示すように、該標的ＤＮＡ検出用プローブと、前記工程Ｉで得られた１本鎖標的ＤＮＡを温度降下によりハイブリダイズさせる。

反応工程III （制限酵素による標的ＤＮＡのニッキングを引き起こす反応工程）：
前記反応工程IIで得られた反応物にポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）と制限酵素を存在させることにより、図３に示すようにポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）による標的ＤＮＡ検出用プローブの３’末端の伸長反応と、制限酵素による標的ＤＮＡ側のみの切断（ニッキング）を行う。ポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）と制限酵素の添加順序は任意であり、同時であってもよい。ポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）による標的ＤＮＡ検出用プローブの３’末端の伸長反応により、ハイブリダイゼーションが安定化する。制限酵素により切断される部位は、標的ＤＮＡ側のみの制限酵素認識部位であり、標的ＤＮＡ検出用プローブ側の制限酵素認識部位にはホスホロチオエート結合が導入されているため、切断されない。

反応工程IV（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる反応工程）：
前記反応工程III で得られたニッキングにより生じた標的ＤＮＡ側の３’末端を図３に示すように鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが複製開始点として認識し、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列を含む制限酵素認識配列より上流の配列を鋳型として鎖置換型ポリメラーゼ反応が進行する。

反応工程Ｖ（２本鎖の制限酵素認識配列の標的ＤＮＡ側のニッキング工程）：
前記反応工程IVにより形成された２本鎖に対して、制限酵素を作用させることにより、標的ＤＮＡ側のみの切断（ニッキング）を行う（図４）。

反応工程VI（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ反応工程）：
前記反応工程Ｖで生じた標的ＤＮＡの切断部位である３’末端を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが複製開始点として認識し、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列を含む制限酵素認識配列より上流の配列を鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる反応が進行する（図４）。

反応工程VII （鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、制限酵素による５’アーム配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルの増幅反応工程）：
反応工程Ｖと反応工程VIを交互に繰り返すことにより、５’アーム配列の相補鎖を含む核酸シグナルが連続的に生産され、増幅される（図４）。

反応工程VIII（増幅された５’アーム配列の相補鎖を含む核酸シグナルの検出）：
反応工程VII において増幅された５’アーム配列を含む核酸シグナルの検出には、公知の核酸の検出方法であれば何でもよい。本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法において、製造される増幅産物は標的ＤＮＡ検出用プローブを鋳型としてヌクレオチドを付加することにより得られるが、その際、既知の様々な修飾ヌクレオチド、例えば、ビオチン標識、 蛍光標識、ＤＩＧ標識等の標識されたヌクレオチドを取り込ませることができる。例えば、増幅された核酸シグナルとプローブとのハイブリダイゼーションによる検出方法には次の核酸シグナルの検出法１、２が適用できる。

プローブとのハイブリダイゼーションによる核酸シグナルの検出法１：
該方法は、５’アーム配列の相補鎖の増幅過程で、蛍光標識したｄＮＴＰを取り込ませることにより増幅産物を蛍光標識して核酸シグナルを検出する方法である。該方法によれば、反応液中に４種類の塩基に対応するｄＮＴＰの他に蛍光標識したｄＮＴＰを加えておけば増幅産物中にある割合で蛍光標識ｄＮＴＰが取り込まれるので、核酸シグナルの検出が可能となる。

核酸シグナルの別の検出法には、２種のプローブを用いて蛍光を取り込まずに検出する方法がある。例えば、一つは増幅産物をトラップするための固相プローブと、もう一つは蛍光シグナルを放つプローブからなる２種のプローブを準備する。この二つのプローブは増幅産物配列中の異なる位置にハイブリダイズするように設計されるため、増幅産物に同時にハイブリダイズすることができる。増幅産物はネイティブな状態を保てるため、増幅反応高率が低下したり、制限酵素の認識が低下するという不都合がないメリットがある。

プローブとのハイブリダイゼーションによる核酸シグナルの検出法２：
前記検出法１と同様な方法で、増幅産物にビオチン標識ｄＮＴＰを取り込ませ増幅産物をビオチン標識する。次いでアビジン或いはストレプトアビジンに酵素を結合しておけば、ビオチン−アビジン或いはビオチン−ストレプトアビジン結合したものを酵素反応により検出することができる。該酵素反応に用いる酵素の種類には、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等が挙げられる。

本発明における「標的ＤＮＡ」とは、検出したいものがＤＮＡである場合はＤＮＡを、検出したいものがＲＮＡの場合は、ＲＮＡを鋳型として逆転写したＤＮＡを意味することとする。したがって、本発明における標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、検出したいものが、ＤＮＡだけではなく、ＲＮＡの場合には予め逆転写酵素によりＲＮＡからＤＮＡを合成することより、ＲＮＡの検出も可能である。

本発明における「２本鎖ＤＮＡ」とは、互いに相補的な塩基配列が水素結合により隣り合わせに結合したＤＮＡを意味し、任意の塩基配列を持つ２本鎖ＤＮＡ、遺伝子をコードしている２本鎖ＤＮＡ及び遺伝子の一部をコードしている２本鎖ＤＮＡが含まれる。

さらに本発明における「１本鎖ＤＮＡ」とは、相補的な塩基配列の塩基対結合を解離させたときに２つ以上の分子に分離しないＤＮＡをいう。

本発明における相補的な塩基配列としては、全ての塩基配列が完全に相補的である必要は無く、反応温度においてハイブリダイズするのに十分な相補性があれば良い。

本発明に使用する標的ＤＮＡ検出用のプローブは、必ずしもデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である必要は無く、該標的ＤＮＡ検出用プローブの少なくとも一部が塩基対の相補性と同様の特異性をもった物質、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等であっても良い。したがって、本発明に使用する標的ＤＮＡ検出用プローブの少なくとも１部がＰＮＡ、又はＲＮＡである場合を含む。本発明に使用する標的ＤＮＡ検出用プローブにおいて、ヌクレオチドの連結はホスオジエステル結合である必要は無く、ホスホロチオエート結合等のポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）による連結が可能な全ての結合が可能である。

本発明の標的ＤＮＡ検出用プローブにおける５’アーム配列は少なくとも一種類のデオキシリボヌクレオチドから構成されることが可能であり、長さ及び配列は任意である。

本発明における標的ＤＮＡ検出用プローブに含まれる制限酵素認識配列は、制限酵素による認識が可能であるが、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾され、制限酵素による切断から保護されて、２本鎖ＤＮＡとしたときにニッキングが可能な全ての制限酵素による認識配列を含む。

本発明において「ニッキング」とは、２本鎖のＤＮＡのうちの１本鎖の特定部位を保護し、残りの１本鎖の制限酵素認識部位を制限酵素により切断することをいう。

前記反応工程VII からの増幅産物（「第１増幅産物」と呼ぶ）を、その塩基配列と相補的な塩基配列が、Ｓ化した制限酵素認識配列を中心に５’側と３’側に連なった増幅用プローブの３’側にハイブリダイズさせ、さらに、該増幅産物の３’末端を複製起点としたポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）反応と、それに引き続く制限酵素によるニッキングを連続的に行うことにより第１増幅産物と同一の塩基配列を持つ第２増幅産物が連続的に生産され、該第２増幅産物もまた増幅用プローブにハイブリダイズするため、増幅産物が指数関数的に増幅されることになる。

本発明において使用される制限酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが共に耐熱性を有すること、好ましくは、６０℃の高温で酵素反応を行うことができる耐熱性を有することが非特異的な増幅産物の生産を抑え、さらに反応速度を上昇させるために望ましい。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法に使用される標的ＤＮＡ及び標的ＤＮＡ検出用プローブに存在する制限酵素認識配列には、好ましくは、ＢｓｒＳＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ及びＢｓｏＢＩからなる群より選択される制限酵素により認識される配列を挙げることができる。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法に使用される鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼには、好ましくは、Ｂｃａ又はＢｓｔをあげることができる。

前記反応工程IIにおける標的ＤＮＡ検出用プローブと標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションはプローブの制限酵素認識配列より０又は１塩基以上５’側から、３’末端までが標的ＤＮＡの塩基配列と相補的であることが制限酵素が効率よく制限酵素認識配列を認識するのに望ましい。

前記の場合は、標的ＤＮＡの塩基配列中にニッキングを引き起こすことができる好ましい制限酵素認識配列が存在する場合のプローブを設計し、５’アーム配列の相補鎖の連続的な合成を行っているが、２本鎖標的ＤＮＡ配列中にニッキングを引き起こし得る制限酵素認識部位が無い場合は、図５に示す処理を行うことにより５’アーム配列の相補鎖を含む核酸の連続的な合成ができる。

即ち、図５に示すように、ニッキングを引き起こし得ない制限酵素認識部位を探す。ニッキングを引き起こし得ない制限酵素認識部位が制限酵素Ａで切断される部位（制限酵素Ａ認識部位）である場合、２本鎖標的ＤＮＡを制限酵素Ａで切断する。

次いで、切断された２本鎖標的ＤＮＡを熱処理等による変性処理により、２本鎖標的ＤＮＡを解離させて、制限酵素Ａによる切断位置に３’末端を有する１本鎖標的ＤＮＡを得る。

標的ＤＮＡの塩基配列中の制限酵素Ａ認識部位とは別の種類の、標的ＤＮＡの塩基配列とは相補的でない制限酵素認識配列（制限酵素Ｂ認識配列と呼ぶ）を標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列中に設けておく。該標的ＤＮＡ検出用プローブ中の制限酵素Ｂ認識配列は、配列中にホスホロチオエート結合を導入（Ｓ化）することにより、制限酵素Ｂにより切断されない。標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列は、５’側から順に、５’アーム配列、５’アーム配列中の３’側に含まれニッキングを引き起し得るＳ化した制限酵素認識配列、及び、前記工程の１本鎖標的ＤＮＡと相補的な塩基配列とを結合した塩基配列からなる。このような標的ＤＮＡ検出用プローブと、前記工程で得られた１本鎖標的ＤＮＡをハイブリダイズさせる。

次いで、ポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）を作用させることにより、１本鎖標的ＤＮＡ由来の制限酵素Ａによる切断末端の３’末端から伸長反応が進行し、５’アーム配列と相補的な塩基配列が形成される。

次いで、制限酵素Ｂを作用させることにより、５’アーム配列と相補的な塩基配列中に含まれ、標的ＤＮＡ側の塩基配列に含まれる制限酵素Ｂ認識部位をニッキングする。

次いで、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより、標的ＤＮＡ側の制限酵素Ｂ切断部位の３’末端を複製開始点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが認識し、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列を含む制限酵素Ｂ認識配列より上流の配列を鋳型として鎖置換型ポリメラーゼ反応が進行する。このようなＤＮＡポリメラーゼと制限酵素の作用により、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列の切断された相補鎖を連続的に生産することができる。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法で用いるＤＮＡポリメラーゼには鎖置換活性を有すると同時に５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を欠損したものを用いる。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法は上記のように反応工程別に説明しているが、反応系には、本発明で使用する全ての酵素を同時に存在させて反応を行うことができる。反応温度は、使用する酵素の温度条件により３０度付近から７０度付近までの範囲が好ましいが、非特異的な増幅産物の生産を抑え、さらに反応速度を上昇させる意味では６０度付近の高温で行われることがさらに望ましい。

本発明は、前記の標的ＤＮＡの存在を検出する方法に用いられる標的ＤＮＡ検出用プローブ自身も発明とする。即ち、本発明の標的ＤＮＡ検出用プローブは、３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含むものである。

また、本発明は、下記の（１）〜（３）の材料が組み合わされたキットである。該キットは下記の（１）〜（３）の全ての材料が一つの系に存在して含まれる形態、及び（１）〜（３）の少なくとも１種以上の材料が残りの材料と独立して存在する形態から選ばれる。
（１）３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含む標的ＤＮＡ検出用プローブ、
（２）制限酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素、及び、
（３）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸。

本発明における標的ＤＮＡ検出用プローブを用いた標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、免疫学的配位子又は免疫学的抗配位子、具体的には、抗原又は抗体の検出又は定量を行う方法に適用できる。例えば、（１）固相化免疫学的配位子と、該固相化免疫学的配位子に結合性を有する免疫学的抗配位子が含まれていると疑われる試料と、該免疫学的抗配位子と結合性を有し且つ任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合している免疫学的配位子とを接触させることにより免疫複合体を形成し、（２）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、前記の本発明の方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出することにより、検出した標的ＤＮＡに基づき、免疫学的抗配位子を検出又は定量することができる。該免疫学的抗配位子の検出又は定量方法において、固相化免疫学的配位子と標的ＤＮＡが結合した免疫学的配位子の反応性は、異なっていてもよく、或いは同一であってもよい。

本発明において、「免疫学的配位子」と「免疫学的抗配位子」は、互いに結合性を有し、抗原又は抗体の何れか一方を意味する。

前記、免疫学的抗配位子の検出又は定量方法において、固相に抗体又は抗原の何れか一方を固定化する手段には、特許第３１９７２７７号に示されている固定化手段を適用してもよい。即ち、抗体又は抗原にオリゴヌクレオチドを結合させたもの（前者）を調製し、一方、該オリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドを固相に固定化したもの（後者）を調製し、前者のオリゴヌクレオチド導入抗体又は抗原と、後者の相補的オリゴヌクレオチド固定化抗体とを予め反応させて、抗原或いは抗体を固定化した固相を調製するか、或いは、前者と後者を混合して結合反応を行うことと並行しながら、免疫反応を進行させて、固相に抗体又は抗原を固定化してもよい。

本発明の免疫学的配位子又は免疫学的抗配位子の検出又は定量を行う方法は、具体的には、抗原の検出又は定量を行う方法は、次のようにして行うことができる。例えば、図６に抗原の検出プロセスの概略図を示すように、（１）固相化抗体を用意し、（２）該固相化抗体に結合性を有する抗原が含まれていると疑われる試料を該固相化抗体に接触させることにより、抗原を固相化抗体に捕捉させ、（３）該固相化抗体に結合した抗原における結合部位とは別の部位で結合する同種又は異種の抗体であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合した抗体を、前記工程で固相化抗体に捕捉された抗原に接触させることにより免疫複合体を形成し、（４）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、前記方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出する。検出した標的ＤＮＡに基づき、抗原を検出又は定量することができる。

また、本発明の免疫学的配位子又は免疫学的抗配位子の検出又は定量を行う方法は、抗体の検出、例えば、ウィルス感染症等の抗体検査等に適用することができる。本発明の抗体を検出又は定量する方法は、例えば、図７の抗体の検出プロセスの概略図に示すように、（１）固相化抗原を用意し、（２）該固相化抗原に結合性を有する抗体が含まれていると疑われる試料を該固相化抗原に接触させることにより、抗体を固相化抗原に捕捉させ、（３）該抗体に結合性を有する抗体であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合した抗体を、前記工程で固相化抗原に捕捉された抗体に接触させることにより免疫複合体を形成し、（４）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、前記方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出する。検出した標的ＤＮＡに基づき、抗体を検出又は定量することができる。

また、上記とは別の本発明の抗体の検出又は定量する方法は、例えば、図８の抗体の検出プロセスの概略図に示すように、（１）固相化抗原と、該固相化抗原に結合性を有する抗体が含まれていると疑われる試料と、該抗体に結合性を有する抗原であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合している抗原と、を接触させることにより免疫複合体を形成し、（２）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出する。検出した標的ＤＮＡに基づき、抗体を検出又は定量することができる。

１）２本鎖標的ＤＮＡの調製
図９に標的ＤＮＡとなる大腸菌（Ｏ１５７ Ｈ７）のベロ毒素１型（ＶＴ１）遺伝子断片の塩基配列を示す。図９の塩基配列において、ＢｓｒＳ１認識配列とＢｓｒＳ１切断部位を示す。図９に示した遺伝子断片の２本鎖塩基配列を構成する各１本鎖塩基配列を配列番号１及び配列番号２に示す。ＶＴ１遺伝子の塩基配列はＮＣＢＩデータベース（アクセッションナンバーはＬＯ４５３９）から入手した。該データベース上で、＋３７８１〜＋３８４０に位置する長さ６０ｍｅｒの塩基配列と同じ配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｓｓｌ）（配列番号１）を合成した。該塩基配列はデータベース上の＋３７９５〜＋３８０１の位置にＢｓｒＳ１認識配列を含む。さらに、該塩基配列と完全に相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｓｓ２）（配列番号２）を合成した。合成した各オリゴヌクレオチドは１００ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解した。各オリゴヌクレオチド溶液をそれぞれ１０μＬづつ取り出し混合した後、９４℃で３分間熱処理を行い、緩やかに室温に戻した。この操作により、各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、２本鎖ＤＮＡを形成したことを２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を用いた電気泳動後のエチジウムブロマイド染色により確認した。該電気泳動のチャートを図１０に示す。図１０によれば、ＳｓｌとＳｓ２をハイブリダイゼーションさせると、各々単独で泳動させたときの移動度よりも高分子領域に強いバンドが検出された。この結果は、Ｓｓ１とＳｓ２がハイブリダイズしたことにより２本鎖ＤＮＡが形成され、電気泳動の移動度が変化するとともに、エチジウムブロマイドによる染色が強くなったことを示しており、確かに２本鎖ＤＮＡが形成されていることが確認できた。

２）標的ＤＮＡ検出用プローブの調製
標的ＤＮＡ検出用プローブは、５’末端から下流にかけて任意の塩基配列（５’アーム配列）を有し、該５’アーム配列の下流に２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖とハイブリダイズするために必要な塩基配列を持ち、さらに該塩基配列の５’側は制限酵素認識配列を含有するように設計した。標的ＤＮＡ検出用プローブが標的ＤＮＡの一方の鎖とハイブリダイズし、２本鎖ＤＮＡを形成したときに、制限酵素による切断から標的ＤＮＡ検出用プローブを保護するために制限酵素による切断部位の結合をホスホロチオエート結合にした。図１１及び配列番号３に標的ＤＮＡを検出するために合成した標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列を示す。特に、図１１に該標的ＤＮＡ検出用プローブにおける５’アーム配列、ＢｓｒＳ１認識配列、標的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の各部位を示す。

該標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列は、５’末端から下流にかけて１２塩基の配列番号４に示される５’アーム配列（ＴＧＴＡＴＡＧＴＣＧＧＴ）を有し、５’アーム配列の下流は２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖をハイブリダイズするのに必要な配列番号５に示される塩基配列（ＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡｓＴＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＡＣ）が連なった全長５４ｍｅｒの標的ＤＮＡ検出用プローブを設計した。該塩基配列中の５’側は、２本鎖を形成したときに、制限酵素ＢｓｒＳ１により認識される配列番号６に示される配列（ＡＣＴＧＧＡｓＴ）を有する。なお、ｓはホスホロチオエート結合を示し、ｓＴはホスホロチオエート結合で修飾されたＴを示す。ＢｓｒＳ１による認識をより確実なものにするため、ＢｓｒＳ１認識配列の上流６塩基目までが標的ＤＮＡとハイブリダイズする構造になっている。

従って、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’末端からＢｓｒＳ１認識部位の上流７塩基までが５’アーム配列であり、ＢｓｒＳ１認識部位の上流６塩基目から標的ＤＮＡ検出用プローブの３’末端にかけてが標的ＤＮＡとハイブリダイズするための塩基配列となる。また、ＢｓｒＳ１による切断部位である標的ＤＮＡ検出用プローブのＡ−Ｔ間の結合は切断から保護されるようにホスホロチオエート結合（ｓで標記）が導入されている。

３）２本鎖標的ＤＮＡの検出
２本鎖標的ＤＮＡの検出系の構築にあたり、次の試薬を準備した。

１０×バッファー：５００ｍＭ ＫＣｌ，１. ０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０を含む溶液
１０ｍＭ ｄＮＴＰ
１０μＭ 標的２本鎖ＤＮＡ
５０μＭ 標的ＤＮＡ検出用プローブ
酵素溶液：１Ｍ ＮａＣｌ、 ５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、４Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、５Ｕ ＢｓｒＳ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含む溶液

上記成分を、次に示す反応系で反応させた。すなわち３７μＬの滅菌水に５μＬの上記１０×バッファー、１μＬの上記１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの上記１０μＭ標的２本鎖ＤＮＡ、１μＬの上記５０μＭ標的ＤＮＡ検出用プローブを加え、９４℃で３分間熱処理後、６０℃で１分間インキュベートした。続いて５μＬの前記酵素溶液を加え、６０℃で９０分間インキュベートすることで反応を進行させた。増幅産物の検出はアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色により確認した（図１２）。

理論通りの反応が進行していれば、増幅産物は標的ＤＮＡ検出用プローブのＢｓｒＳ１認識配列から上流の配列の相補鎖であり、この増幅産物は５’アーム配列の相補鎖を含むはずである。増幅産物が、５’アーム配列の相補鎖を含む配列であることを確かめるために、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’末端から下流にかけて１５塩基までの塩基配列と同一の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｄｐ）を合成した。該オリゴヌクレオチドと増幅産物を９４℃の熱処理後に緩やかに室温に戻し、電気泳動後のエチジウムブロマイド染色により、ハイブリダイゼーションが起きていることを確かめた。

即ち、ＴＥに溶解した５０μＭの、５’アーム配列を持つ長さ１５塩基の配列番号９に示されるオリゴヌクレオチド ＴＧＴＡＴＡＧＴＣＧＧＴＴＡＣ（Ｄｐ：略語）を準備し、これを１０μＬに対し、反応後のサンプルを１０μＬ混ぜ、９４℃で３分間保持した。緩やかに室温に戻した後、アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した。該電気泳動のチャートを図１３に示す。図１３に示すように、反応産物のみを泳動した時に検出されるバンドに比べ、反応産物とＤｐをハイブリダイゼーション処理したサンプルを泳動したときは、異なる移動度に強いバンドが検出された。このことは反応産物とＤｐがハイブリダイズし、移動度が変化したと同時に、部分的に２本鎖が形成されたためにエチジウムブロマイドが結合しやすくなりバンドが濃くなったことを示している。即ち、反応サンプルをＤｐとハイブリダイズさせると、反応サンプルを単独で泳動したときに比べ低分子領域に強いバンドが検出されることから、反応産物は確かに５’アーム配列の相補鎖を含むことが確認できる。

尚、実施例における前記「１）２本鎖標的ＤＮＡの調整」の欄で説明した図１０では、互いに相補的な塩基配列の１本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせた２本鎖ＤＮＡは電気泳動で、より高分子側に移動するが、 図１３では２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡよりも低分子側に移動していることが分かる。このことは、１本鎖ＤＮＡの移動度は分子量の他に分子内高次構造が関係してくるため、塩基組成により移動度が大きく異なり、従って高分子であるはずの２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡよりも低分子側に位置したためと考えられる。

１）ＤＮＡ結合抗体の調製
ｉ．Ｂ型肝炎ウィルスに対するウサギ抗体のＦ（ａｂ’）² 化
Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原に対するウサギポリクローナル抗体（抗ＨＢｓＡｇ抗体）（イムノプローブ社製）を次のようにしてペプシンで消化して、Ｆ（ａｂ’）² を調製した。すなわち、２．７ｍｇの該抗体を０．８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に溶解したものと、０．０５ｍｇの２％ペプシン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）を０．０５ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に溶解したものを混合し、３７℃で１２時間インキュベートした。続いて、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（担体はＢＩＯＳＥＰＲＡ社製のＡｃＡ４４を使用）により、Ｆ（ａｂ’）² をＦｃのペプシン消化物と分離することにより精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １０，０００ＭＷＣＯ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた限外ろ過により１．１４ｍｇ／ｍＬまで濃縮して、Ｆ（ａｂ’）² の濃縮液を得た。

ii. オリゴヌクレオチドへのマレイミド基の導入
１２７μＬのＴＥに２００ｎｍｏｌｓの、５’末端にアミノ基を導入した配列番号７のオリゴヌクレオチドを溶解したものと、３．１ｍｇの１Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（同仁化学研究所製）を２５．４μＬのジメチルホルムアミドに溶解させたものを混合し、３７℃で１時間インキュベートしてオリゴヌクレオチドのアミノ基を介してマレイミド基を導入した。続いて、この混合液に５０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２と１ｍＬのエタノールを加え−８０℃で３０分インキュベートした後、１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離し、マレイミド基を導入したオリゴヌクレオチドを沈殿させ、上清を除いた後、１００μＬの０．１Ｍリン酸衝液ｐＨ６．０に溶解して、マレイミド基導入オリゴヌクレオチド溶液を得た。

iii. Ｆ（ａｂ’）² の還元操作によるＦａｂ’の調製
前記工程ｉ．で調製したＦ（ａｂ’）² の濃縮液を１．３ｍＬ（該濃縮液中Ｆ（ａｂ’）² が１．４８ｍｇ含まれる）と、１３３μＬの１００ｍＭのメルカプトエチルアミン（５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解）を混合し、３７℃で９０分間インキュベートすることでＳ−Ｓ結合をＳＨ基に還元してＦａｂ’を調製した。得られたＦａｂ’は５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ６．０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製のＰＤ１０カラムを使用）により精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １０，０００ＭＷＣＯ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた限外ろ過により４．８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。

iv. Ｆａｂ’とマレイミド基導入オリゴヌクレオチドの結合
前記工程ii. で調製したマレイミド基導入オリゴヌクレオチド４０ｎｍｏｌｓと、前記工程iii.で調製したＦａｂ’０．７２ｍｇを混合し、３７℃で１時間インキュベートすることで、マレイミド基とＳＨ基の結合反応を行わせ、オリゴヌクレオチド結合させたＦａｂ’、すなわち、ＤＮＡ結合抗ＨＢｓＡｇ抗体を調製した。得られたＤＮＡ結合抗ＨＢｓＡｇ抗体は５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（担体はＢＩＯＳＥＰＲＡ社製のＡｃＡ４４を使用）により精製した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０，０００ＭＷ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた限外ろ過により０．３７ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。

２）サンドイッチ法による免疫反応後にオリゴヌクレオチドを検出する免疫測定系の構築
マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製のＦ８ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＬＯＯＳＥ（商品名））を用いたＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の免疫測定系を次のようにして構築した。

すなわち、５０μｇ／ｍＬの濃度でｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ：略語）に溶解した抗ＨＢｓＡｇ抗体をポリスチレン製の前記マイクロタイタープレートのウェルに１００μＬ分注し、２３℃で２時間インキュベートすることでウェル表面に抗ＨＢｓＡｇ抗体を固相した。ウェル内の溶液を捨て、４００μＬのＰＢＳで洗浄した後、ウェルに０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬ加え２３℃で１時間インキュベートし、ウェル表面のブロッキングを行った。ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳで１００μｇ／ｍＬの濃度に調製したＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）１００μＬをウェルに加え、２３℃で２時間インキュベートした。これとは別にネガティブコントロールとして、ＨＢｓＡｇの入っていないＰＢＳを加えて２３℃で２時間インキュベートしたものも準備した。ＨＢｓＡｇ含有溶液を捨て、４００μＬのＰＢＳによるウェルの洗浄を３回繰り返した後、５０μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解したＤＮＡ結合抗ＨＢｓＡｇ抗体（オリゴヌクレオチド導入抗体溶液）を１００μＬ加え、２３℃で２時間インキュベートした。次いで、該オリゴヌクレオチド導入抗体溶液を捨て、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後ＰＢＳを捨て、ＤＮＡ結合抗ＨＢｓＡｇ抗体のＤＮＡを標的ＤＮＡとして、核酸シグナルの増幅反応を次のようにして行った。

すなわち、１００μＬの核酸シグナル増幅用緩衝液（６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９，６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）と、配列番号８に示され及び詳細な配列構成が図１４に示される標的ＤＮＡ検出用プローブ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ加え、６０℃で３分間プレインキュベートした後、２０ＵのＢｓｒＳ１及び１．５ＵのＢｓｔＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え６０℃で２時間インキュベートした。図１４に示される標的ＤＮＡ検出用プローブは、５’末端から１８塩基の５’アーム配列を持ち、その下流に制限酵素ＢｓｒＳ１による認識配列と標的ＤＮＡ配列と相補的な配列が連なっている。ＢｓｒＳ１認識配列中のＡ−Ａ間の結合はＢｓｒＳ１による切断を避けるためにホスホロチオエート結合が導入されている。

インキュベート後のサンプルを用いて２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色の結果を示す写真を図１５として示す。図１５によれば、ＨＢｓ抗原を加えていない免疫測定系の反応産物（レーン１）ではバンドが認められないのに対し、ＨＢｓ抗原を加えた免疫測定系の反応産物（レーン２）ではバンドが認められる。

さらに、図１５に示されるバンドが５’アーム配列の相補鎖を含むことを確認する実験を次のようにして行った。すなわち、ＨＢｓ抗原を加えた免疫測定系の反応産物３μＬと、５０ｐｍｏｌｓ／μＬの５’アーム配列（図１４参照）中の５’末端から下流に向けて１５塩基の配列をもつ配列番号９に示されるオリゴヌクレオチド（Ｄｐ）５μＬとを混合し、９４℃で３分間インキュベートした後、緩やかに室温に戻した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色すると、両者を単独で泳動したときと比較して、強いバンドが認められた。得られたエチジウムブロマイド染色したものの写真を図１６に示す。図１６において、レーン１はＤｐ２５０ｐｍｏｌｓ、レーン２はＨＢｓ抗原を加えた免疫測定系の反応産物３μＬ、レーン３はＤｐ２５０ｐｍｏｌｓとＨＢｓ抗原を加えた免疫測定系の反応産物３μＬをハイブリダイズさせたサンプルを示す。

図１６によれば、Ｄｐ単独（レーン１）或いは反応産物単独（レーン２）では殆どバンドが認められないが、Ｄｐと反応産物がハイブリダイズしたもの（レーン３）では、２本鎖ＤＮＡを形成したことを示しており、反応産物が確かに５’アーム配列の相補鎖を含むことが確認できる。本実施例２によれば、抗体に導入されたＤＮＡを標的ＤＮＡとして核酸シグナル増幅反応を実施することにより、免疫反応の検出に応用できることが確認できる。

本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、極微量のＤＮＡを検出したり、極微量のＤＮＡをスクリーニング検査するための研究分野、臨床分野、産業分野において有用である。本発明の標的ＤＮＡの存在を検出する方法は、抗体又は抗原の検出に適用できるので、免疫学的検査に有用である。具体的には、疾病の原因となるウィルス（例、ＳＡＲＳウィルス等）や細菌の存在の検出、食品中の食中毒菌の存在の検出、プールや銭湯、風呂場等でのレジオネラ菌等の有害な菌やウイルスの検出、また、ウイルス兵器や細菌兵器の検査にも利用可能性がある。

制限酵素の認識配列を有する２本鎖標的ＤＮＡを変性処理により解離させて１本鎖標的ＤＮＡを製造する工程図である。 １本鎖標的ＤＮＡ検出用プローブと、１本鎖標的ＤＮＡを温度降下によりハイブリダイズさせる工程図である。 ポリメラーゼ（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）による標的ＤＮＡ検出用プローブの３’側の伸長反応と、制限酵素による標的ＤＮＡ側のみの切断（ニッキング）を行う工程図である。 ニッキングにより生じた標的ＤＮＡ側の３’末端を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが複製開始点として認識し、標的ＤＮＡ検出用プローブの５’アーム配列を含む制限酵素認識配列より上流の配列を鋳型として鎖置換型ポリメラーゼ反応が進行するプロセス図である。 好ましい制限酵素認識配列が標的ＤＮＡの塩基配列中に存在しない場合の標的ＤＮＡの塩基配列中の制限酵素認識配列とは別の種類の、標的ＤＮＡの塩基配列とは相補的でない制限酵素Ｂ認識配列を標的ＤＮＡ検出用プローブ中に設け、鎖置換型ポリメラーゼ反応を進行させるプロセス図である。 本発明の抗原の検出プロセスの概略図である。 本発明の抗体の検出プロセスの概略図である。 本発明の別の抗体の検出プロセスの概略図である。 標的となる大腸菌（Ｏ１５７ Ｈ７）のベロ毒素１型（ＶＴ１）遺伝子断片の塩基配列及びＢｓｒＳ１認識配列とＢｓｒＳ１切断部位の各領域を示す図である。 各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、２本鎖ＤＮＡを形成したことを確認するための電気泳動後のエチジウムブロマイド染色を示す写真である。 標的ＤＮＡを検出するために合成した、標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列、５’アーム配列を示し、特に、ＢｓｒＳ１認識配列、標的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の各領域を示す図である。 増幅産物を電気泳動後にエチジウムブロマイド染色したものを示す写真である。 反応産物とＤｐがハイブリダイズしたものと、反応産物のみのものとを比較する電気泳動後のエチジウムブロマイド染色を示す写真である。 ＤＮＡ結合抗ＨＢｓＡｇ抗体のＤＮＡを標的ＤＮＡとして検出するために合成した、標的ＤＮＡ検出用プローブの塩基配列を示し、特に、５’アーム配列、ＢｓｒＳ１認識配列、標的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の各領域を示す図である。 免疫測定系の反応産物を電気泳動後にエチジウムブロマイド染色したものを示す写真である。 免疫測定系の反応産物とＤｐがハイブリダイズしたものと、反応産物のみのものとを比較する電気泳動後のエチジウムブロマイド染色を示す写真である。

Claims (13)

1. 標的ＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列と相補的でない任意に選択可能な塩基配列とが結合している標的ＤＮＡ検出用プローブを用い、該標的ＤＮＡ検出用プローブにおける標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させることを特徴とする標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
2. 前記標的ＤＮＡ検出用プローブは、３’側部分が標的ＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側部分が標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列であることを特徴とする請求項１記載の標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
3. 前記標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含むことを特徴とする請求項１記載の標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
4. （ａ）３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含む標的ＤＮＡ検出用プローブを用意し、
   （ｂ）該標的ＤＮＡ検出用プローブと標的ＤＮＡとをハイブリダイズし、
   （ｃ）前記（ｂ）工程で得られたハイブリダイズしている標的ＤＮＡ検出用プローブの３’末端の伸長反応を行わせ、
   （ｄ）前記（ｃ）工程で得られたハイブリダイスしている標的ＤＮＡの制限酵素認識部位に制限酵素を作用させてニッキングを行い、
   （ｅ）前記（ｄ）工程で得られたニッキングにより生じた標的ＤＮＡの切断部位の３’末端を複製開始点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、標的ＤＮＡの３’末端の伸長反応を行うことにより、５’アーム配列を含む標的ＤＮＡ検出用プローブとの相補鎖からなる２本鎖を作製し、
   （ｆ）前記（ｅ）工程で得られた２本鎖の制限酵素認識部位に制限酵素を作用させてニッキングを行うことにより標的ＤＮＡを切断し、
   （ｇ）前記（ｆ）工程で得られたニッキングにより生じた標的ＤＮＡの切断部位の３’末端を複製開始点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、標的ＤＮＡの３’末端の伸長反応を行うことにより、５’アーム配列を含むＤＮＡ検出用プローブとの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを作製すると同時に、５’アーム配列の塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを遊離させ、
   （ｈ）前記（ｆ）及び（ｇ）工程を繰り返すことにより、５’アーム配列の塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる核酸シグナルを増幅させることを特徴とする標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
5. 前記制限酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが共に耐熱性を有することを特徴とする請求項４記載の標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
6. 前記制限酵素認識配列がＢｓｒＳＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ及びＢｓｏＢＩからなる群より選択される制限酵素により認識される配列である請求項３又は４記載の標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
7. 前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼがＢｃａおよびＢｓｔから選択される請求項４又は５記載の標的ＤＮＡの存在を検出する方法。
8. ３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含む標的ＤＮＡ検出用プローブ。
9. 下記の（１）〜（３）の材料が組み合わされたキットであって、（１）〜（３）の全ての材料が一つの系に存在して含まれる形態、及び（１）〜（３）の少なくとも１種以上の材料が残りの材料と独立して存在する形態から選ばれたキット：
   （１）３’側部分が２本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であり、且つ、５’側が該標的ＤＮＡの塩基配列に相補的でない任意に選択可能な塩基配列（５’アーム配列と呼ぶ）である標的ＤＮＡ検出用プローブであって、且つ、該標的ＤＮＡ検出用プローブは、標的ＤＮＡに存在する制限酵素認識配列とハイブリダイズ可能な塩基配列部分を有し、且つ、該塩基配列部分は制限酵素による切断から保護されるように修飾された塩基配列を少なくとも１種類含む標的ＤＮＡ検出用プローブ、
   （２）制限酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素、及び、
   （３）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸。
10. （１）固相化免疫学的配位子と、
    該固相化免疫学的配位子に結合性を有する免疫学的抗配位子が含まれていると疑われる試料と、
    該免疫学的抗配位子と結合性を有し、且つ、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合している免疫学的配位子と、
    を接触させることにより免疫複合体を形成し、
    （２）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法により検出した標的ＤＮＡに基づき、免疫学的抗配位子を検出又は定量する方法。
11. （１）固相化抗体を用意し、
    （２）該固相化抗体に結合性を有する抗原が含まれていると疑われる試料を該固相化抗体に接触させることにより、抗原を固相化抗体に捕捉させ、
    （３）該固相化抗体に結合した抗原における結合部位とは別の部位で結合する同種又は異種の抗体であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合した抗体を、前記工程で固相化抗体に捕捉された抗原に接触させることにより免疫複合体を形成し、
    （４）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出することにより、検出した標的ＤＮＡに基づき、抗原を検出又は定量する方法。
12. （１）固相化抗原を用意し、
    （２）該固相化抗原に結合性を有する抗体が含まれていると疑われる試料を該固相化抗原に接触させることにより、抗体を固相化抗原に捕捉させ、
    （３）該抗体に結合性を有する抗体であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合した抗体を、前記工程で固相化抗原に捕捉された抗体に接触させることにより免疫複合体を形成し、
    （４）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出することにより、検出した標的ＤＮＡに基づき、抗体を検出又は定量する方法。
13. （１）固相化抗原と、
    該固相化抗原に結合性を有する抗体が含まれていると疑われる試料と、
    該抗体に結合性を有する抗原であって、任意の塩基配列の標的ＤＮＡを結合している抗原と、
    を接触させることにより免疫複合体を形成し、
    （２）該免疫複合体における標的ＤＮＡに対して、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法により標的ＤＮＡ検出用プローブを適用して標的ＤＮＡを検出することにより、検出した標的ＤＮＡに基づき、抗体を検出又は定量する方法。