JP2023519365A - 存在量が異なる分析物を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料中の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該試料における存在量のレベルが異なる方法を提供し、当該方法は、(i)前記試料から複数のアリコートを準備すること、および、(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことによって、各アリコートにおいて分析物の異なるサブセットを検出することと、を含み、各サブセットの分析物は、試料における予測存在量に基づいて選択される。【選択図】図1
Description
本発明は、試料中の、当該試料における存在量のレベルが異なる複数の分析物を検出する方法を提供する。本方法では、試料のアリコートが複数準備され、各アリコートにおいて、試料における予測存在量に基づいて選択された分析物サブセットが検出される。また、試料中の分析物を検出する方法であって、分析物に特異的なレポーター核酸分子を検出することによって分析物が検出される、方法が提供される。本方法では、レポーター核酸分子を増幅するためにPCR反応が行われ、このPCRにおいては、内部コントロールが用いられる。本発明の方法は、近接伸長アッセイ(PEA)において特に有用である。
背景
最新のプロテオミクス的手法では、少量の試料から多くの異なるタンパク質(またはタンパク質複合体)を検出できることが必要とされる。このためには、多重解析を行う必要がある。試料中のタンパク質の多重検出を実現し得る一般的な方法としては、近接伸長アッセイ(PEA)および近接ライゲーションアッセイ(PLA)がある。PEAおよびPLAは、WO01/61037に記載されており、またPEAは、さらに、WO03/044231、WO2004/094456、WO2005/123963、WO2006/137932、およびWO2013/113699に記載されている。しかしながら、よくあるように、目的のタンパク質が広い濃度範囲で存在する場合は、高濃度のタンパク質からのシグナルに低濃度のタンパク質からのシグナルが埋もれてしまい、その結果、低濃度で存在するタンパク質を検出できなくなるため、課題が提起される。
最新のプロテオミクス的手法では、少量の試料から多くの異なるタンパク質(またはタンパク質複合体)を検出できることが必要とされる。このためには、多重解析を行う必要がある。試料中のタンパク質の多重検出を実現し得る一般的な方法としては、近接伸長アッセイ(PEA)および近接ライゲーションアッセイ(PLA)がある。PEAおよびPLAは、WO01/61037に記載されており、またPEAは、さらに、WO03/044231、WO2004/094456、WO2005/123963、WO2006/137932、およびWO2013/113699に記載されている。しかしながら、よくあるように、目的のタンパク質が広い濃度範囲で存在する場合は、高濃度のタンパク質からのシグナルに低濃度のタンパク質からのシグナルが埋もれてしまい、その結果、低濃度で存在するタンパク質を検出できなくなるため、課題が提起される。
本発明は、広い濃度範囲で試料中に存在する分析物(例えば、タンパク質)を確実に検出し、多重検出法の精度を向上し得る検出方法を提供する。本発明の方法は、上記のPEAまたはPLAに適用され得るが、分析物多重検出で用いられるその他の技術に適用されてもよい。
PEAおよびPLAは、近接アッセイであり、「近接プロービング」の原理に依拠するものである。これらの方法では、複数(すなわち、2つ以上、通常は2つまたは3つ)のプローブの結合によって分析物が検出される。これらのプローブは、分析物に結合することで近接すると(これ故、「近接プローブ」である)、シグナルを発生させる。典型的には、近接プローブのうちの少なくとも1つが、プローブの分析物結合ドメイン(または分析物結合部)に連結された核酸ドメイン(または核酸部)を含み、シグナルの発生には、核酸部の間、および/または核酸部と他のプローブが保持するさらなる機能部との間の相互作用が必要とされる。よって、シグナルの発生は、プローブ間(より詳細には、これらが保持する核酸部/核酸ドメイン間または他の機能部/機能ドメイン間)の相互作用に依存しており、それ故、必要なプローブが分析物に結合した場合にのみ、シグナルが発生する。その結果、検出システムの特異性が向上する。
PEAでは、プローブ対の分析物結合ドメインに連結された核酸部は、プローブ同士が近接すると(すなわち、標的に結合すると)互いにハイブリダイズし、その後、核酸ポリメラーゼによって伸長する。伸長産物は、レポーター核酸を形成し、これを検出することによって、特定の分析物(関連するプローブ対が結合した分析物)が目的の試料中に存在することが証明される。PLAでは、プローブ対のプローブが標的に結合すると、プローブ対の分析物結合ドメインに連結された核酸部が近接し、核酸部同士のライゲーションが起こり得るか、または、これらの核酸部は、近接すると核酸ドメインにハイブリダイズすることができる別途添加されたオリゴヌクレオチドのライゲーションの鋳型として、ともに機能し得る。その後、ライゲーション産物は増幅され、レポーター核酸として働く。PEAまたはPLAを用いた分析物多重検出は、各プローブの核酸部に独自のバーコード配列を含ませることで実現されてもよい。特定の分析物に対応するレポーター核酸分子は、それが含有するバーコード配列によって同定されてもよい。本発明の方法は、多重PEA法および多重PLA法において特に有用である。
本発明の方法は、プロテオミクスが利用される少なくともいずれかの分野において有用であり得、特に、バイオマーカーの同定や定量の観点から、診断において有用であり得る。現代のオーダーメード医療では、例えば腫瘍学の分野において、大規模なバイオマーカーパネルを評価できることが必要とされる。オーダーメード医療がこれまで以上に普及するにつれて、試料中の多くの(広範な濃度範囲にわたる)バイオマーカーを正確に同定および定量できることの重要性が高まってきている。本発明は、このニーズに対応するものである。
発明の概要
この目的のために、第1の態様において、本発明は、試料中の複数の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なる方法を提供し、当該方法は、
(i)前記試料から複数のアリコートを準備することと、
(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことによって、各アリコートにおいて前記分析物の異なるサブセットを検出することと、を含み、各サブセットの前記分析物は、前記試料における予測存在量に基づいて選択される。
この目的のために、第1の態様において、本発明は、試料中の複数の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なる方法を提供し、当該方法は、
(i)前記試料から複数のアリコートを準備することと、
(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことによって、各アリコートにおいて前記分析物の異なるサブセットを検出することと、を含み、各サブセットの前記分析物は、前記試料における予測存在量に基づいて選択される。
第2の態様において、本発明は、試料中の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該分析物に特異的なレポーター核酸分子を検出することによって検出される、方法を提供し、当該方法は、前記レポーター核酸分子のPCR産物を生成するためのPCR反応を行うことと、当該PCR産物を検出することと、を含み、
前記PCR反応のために内部コントロールが準備され、当該内部コントロールは、
(i)所定の量で存在し、かつ、前記レポーター核酸分子と同じプライマーによって増幅されるコントロール核酸分子であるか、このような核酸分子を含んでいるか、またはこのような核酸分子を生成させる、別個の成分、ならびに/あるいは、
(ii)各レポーター核酸分子および/または各コントロール核酸分子に存在する、各分子に固有の分子バーコード(unique molecular identifier、UMI)配列、である。
前記PCR反応のために内部コントロールが準備され、当該内部コントロールは、
(i)所定の量で存在し、かつ、前記レポーター核酸分子と同じプライマーによって増幅されるコントロール核酸分子であるか、このような核酸分子を含んでいるか、またはこのような核酸分子を生成させる、別個の成分、ならびに/あるいは、
(ii)各レポーター核酸分子および/または各コントロール核酸分子に存在する、各分子に固有の分子バーコード(unique molecular identifier、UMI)配列、である。
第3の態様において、本発明は、試料中の分析物を検出する方法であって、前記分析物は当該分析物に対するレポーター核酸分子を検出することによって検出される、方法を提供し、当該方法は、前記レポーター核酸分子のPCR産物を生成するためのPCR反応を行うことと、当該PCR産物を検出することと、を含み、内部コントロールが前記PCR反応に含まれ、当該内部コントロールは、所定の量で存在し、かつ、コントロール核酸分子であるか、コントロール核酸分子を含んでいるか、またはコントロール核酸分子を生成させるものであり、前記コントロール核酸分子は、前記レポーター核酸分子の逆配列である配列を含む。
詳細な説明
上記詳述したように、本発明の第1の態様は、試料中の複数の分析物を検出するための方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なる方法を提供する。本方法は、分析対象となる分析物の存在量に従ってグループ化された、別個のアッセイセットを行うことに依拠する。
上記詳述したように、本発明の第1の態様は、試料中の複数の分析物を検出するための方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なる方法を提供する。本方法は、分析対象となる分析物の存在量に従ってグループ化された、別個のアッセイセットを行うことに依拠する。
したがって、別の観点では、本明細書に開示される方法は、試料中の複数の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なり、当該方法は、
前記試料から得た別個の複数のアリコートそれぞれにおいて分析物のサブセットを検出するために、別個のアリコートそれぞれに対して別個のブロックのアッセイを行うこと、を含み、各サブセットの分析物は、試料における予測存在量に基づいて選択される、方法と定義されてもよい。
前記試料から得た別個の複数のアリコートそれぞれにおいて分析物のサブセットを検出するために、別個のアリコートそれぞれに対して別個のブロックのアッセイを行うこと、を含み、各サブセットの分析物は、試料における予測存在量に基づいて選択される、方法と定義されてもよい。
したがって、個々のアリコートに対して行われる各アッセイブロックは、多重アッセイである。よって、分析物サブセット(すなわち、いずれか1つの特定のアリコートにおいて検出されるように指定された分析物サブセット)における複数の分析物を検出するための多重アッセイは、「存在量別ブロック」と見なされてもよい。よって、本明細書において用いられる「存在量別ブロック」なる用語は、検出対象となる(すなわち、分析対象となる)試料中の分析物の特定のグループ、またはサブセットを検出するために行われるひとまとまりのアッセイ(アッセイブロック)(または、一組のアッセイ(アッセイセット))であって、分析物は、試料における存在量、すなわち試料における期待存在量もしくは予測存在量、または相対存在量に基づいて各アッセイブロック(またはアッセイセット)に割り当てられる、アッセイブロック(またはアッセイセット)のことをいう。換言すると、アッセイは、存在量に基づいて、グループ化または「ブロック化」される。よって、例えば、低レベル存在量、高レベル存在量、または程度が様々な中間レベルの存在量などに基づいて、異なるアリコート、または異なる存在量別ブロックが、特定の分析物サブセットの検出のために指定されてもよい。このことは、アッセイブロックまたはアッセイセットにおける各分析物の存在量が、同じまたはほぼ同じであるということを意味するものではない。存在量は、ブロックまたはセットにおける異なる分析物/アッセイ間で変動していてもよく、かつ/または異なる試料間で変動していてもよい。
本明細書において(本発明のすべての態様に関して)用いられる「分析物」なる用語は、本発明の方法によって検出することが望まれる、あらゆる物質(例えば、分子)または物体(entity)を意味する。よって、分析物とは、本発明のアッセイ方法の「標的」、すなわち、本発明の方法を用いて検出またはスクリーニングされる物質である。
したがって、分析物は、検出することが望まれる生体分子または化合物であってもよく、例えば、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸分子あるいは低分子であってもよく、有機分子および無機分子を含みうる。分析物は、細胞、もしくはウイルスを含む微生物、またはそれらの断片もしくは生成物であってもよい。このため、分析物は、特異的な結合パートナー(例えば、親和性結合パートナー)を開発することができるあらゆる物質または物体であり得るということが理解されるであろう。必要となるのは、分析物が、少なくとも2つの結合パートナー(より具体的には、少なくとも2つの近接プローブの分析物結合ドメイン)に同時に結合可能であるということだけである。
近接プローブに基づくアッセイは、タンパク質またはポリペプチドの検出に特に有用である。よって、特定の対象の分析物としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはプリオンなどのタンパク性の分子、あるいはタンパク質成分またはポリペプチド成分などを含むあらゆる分子、あるいはそれらの断片が挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態において、分析物は、完全にタンパク性の分子または部分的にタンパク性の分子であり、最も特に好ましいのはタンパク質である。すなわち、分析物は、好ましくは、タンパク質であるか、またはタンパク質を含む。
分析物は、単一分子であってもよいし、2つ以上の分子サブユニットを含有する複合体であってもよい。分子サブユニットは、互いに共有結合していてもよいし、していなくてもよい。分子サブユニットは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。よって、このような複合体分析物は、細胞または微生物以外に、タンパク質複合体であってもよいし、タンパク質と1種以上のそれ以外の生体分子とを含む生体分子複合体であってもよい。よって、このような複合体は、ホモ多量体であってもよいし、ヘテロ多量体であってもよい。タンパク質などの分子の凝集体、例えば、同じタンパク質の凝集体または異なるタンパク質の凝集体も、標的分析物とすることができる。分析物は、タンパク質またはペプチドと、DNAまたはRNAなどの核酸分子との複合体であってもよい。特定の対象としては、タンパク質と核酸との間の相互作用、例えば、転写因子などの制御因子とDNAまたはRNAとの間の相互作用であってもよい。よって、特定の実施形態において、分析物は、タンパク質-核酸複合体(例えば、タンパク質-DNA複合体、またはタンパク質-RNA複合体)である。別の実施形態において、分析物は、非核酸分析物であるが、これが意味するのは、核酸分子を含まない分析物である。非核酸分析物としては、上記のように、タンパク質およびタンパク質複合体、小分子、ならびに脂質が挙げられる。
本発明の方法は、試料中の複数の分析物を検出することに関する。複数の分析物は、同じ種類のものであってもよい(例えば、すべての分析物が、タンパク質またはタンパク質複合体であってもよい)し、異なる種類のものであってもよい(例えば、分析物の一部がタンパク質であり、他がタンパク質複合体、脂質、タンパク質-DNA複合体またはタンパク質-RNA複合体などであってもよいし、このような種類の分析物の任意の組み合わせであってもよい)。
本開示において用いられる「複数の(multiple)」なる用語は、その標準的な定義に従って、1つより多い(すなわち、2つ以上である)ことを意味する。しかしながら、本発明の第1の態様の方法は、試料の複数(すなわち、少なくとも2つ)のアリコートに対して、別個の多重反応を行うことを必要とする。本明細書において用いられる「多重(multiplex)」なる用語は、複数(すなわち、少なくとも2つ)の異なる分析物が、同時に分析されるアッセイ、より具体的には試料の同じアリコートにおいてまたは同じ反応混合物において、分析されるアッセイのことを指して用いられる。よって、本発明の第1の態様の方法にしたがって検出しようとしている分析物の数は、最小で4(試料の2つのアリコートそれぞれにおいて、検出対象となる分析物が2つ)であるということは、明らかである。しかしながら、4つよりもかなり多くの分析物が、本方法にしたがって検出されることが好ましい。好ましくは、少なくとも10個、20個、50個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、または1500個以上の分析物が、本方法にしたがって検出される。
「検出すること(detecting)」または「検出された(detected)」なる用語は、本明細書において、分析物の有無を決定する(すなわち、目的の試料に標的分析物が存在するか否かを決定する)あらゆる手段を含んで広く用いられる。したがって、本発明の方法を行って、試料中の目的の特定の分析物を検出することを試みたが、試料中に存在しないために分析物が検出されないような場合であっても、「分析物を検出する」ステップは、やはり行われている。何故なら、試料における分析物の有無が評価されているからである。分析物を「検出する」ステップは、その検出が成功したこと、すなわち、分析物が実際に検出されることに依存しない。
分析物を検出することは、試料における分析物の濃度または存在量を測定することを、任意の形態でさらに含んでいてもよい。標的分析物の絶対濃度が求められてもよいし、標的分析物の濃度を、その試料または他の試料における他の標的分析物(または他の複数の標的分析物)の濃度と比較する目的で、分析物の相対濃度が求められてもよい。
よって、「検出する」は、分析物の有無またはその量を、いかなる方法であっても決定、測定、評価、または分析することを含んでいてもよい。定量的および定性的な決定、測定、または評価が含まれ、半定量的な決定を含まれる。このような決定、測定、または評価は、例えば、試料中の2つ以上の異なる分析物が検出されている場合には、相対的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。そのため、試料中の標的分析物を定量するという文脈で用いられる場合、「定量する」なる用語は、絶対的定量化のことを指すこともできるし、相対的定量化のことを指すこともできる。絶対的定量化は、既知濃度のコントロール分析物を1つ以上含ませること、および/または標的分析物の検出レベルを既知のコントロール分析物と照合すること(例えば、標準曲線の作成による)によって、成されてもよい。あるいは、相対的定量化は、2つ以上の異なる標的分析物間で検出されたレベルまたは量を比較することによって、前記2つ以上の異なる標的分析物のそれぞれの相対的定量化、すなわち互いに対する定量化を提供することにより、成されてもよい。本発明の方法において、定量化を実現することができる方法について、さらに以下で説明する。
本発明の方法は、試料中の複数の分析物を検出するためのものである。目的の試料は、どのようなものであっても、本発明にしたがって分析され得る。すなわち、目的の分析物を含有するまたは含有し得るあらゆる試料であって、目的の分析物を含有しているか否かを決定するため、および/または試料における目的の分析物の濃度を決定するために、解析することが望まれるあらゆる試料である。
よって、あらゆる生物学的試料または臨床試料が、本発明にしたがって解析されてもよく、例えば、、生物のあらゆる細胞試料もしくは組織試料、または生物由来のあらゆる細胞試料もしくは組織試料、あるいはそれら由来のあらゆる体液または調製物だけでなく、細胞培養物や、細胞標本、細胞破砕物などの試料が、本発明にしたがって解析されてもよい。土壌試料および水試料などの環境試料、または食品試料も、本発明にしたがって解析されてもよい。試料は、新たに調製されてもよいし、例えば保存のために、任意の簡便な方法で前処理されていてもよい。
よって、代表的な試料としては、生体分子またはその他の所望の分析物もしくは標的分析物を含有し得るあらゆる物質が挙げられ、例えば、食品およびその関連製品、臨床試料、および環境試料が含まれる。試料は、生体試料であってもよく、原核細胞または真核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、およびオルガネラなどを含む、ウイルス性物質または細胞物質を含まれ得る。よって、このような生体物質は、あらゆる種類の哺乳動物細胞および/または哺乳動物以外の動物細胞、植物細胞、藍藻を含む藻類、真菌類、細菌類、原生動物などを含み得る。
試料は、臨床試料であることが好ましく、例えば、全血や、血漿、血清、バフィコート、および血液細胞等の血液由来の生成物、尿、糞便、脳脊髄液またはその他の体液(例えば、呼吸器の分泌物、唾液、乳など)、組織、生検材料などである。試料は、血漿試料または血清試料であることが特に好ましい。よって、本発明の方法は、例えば、バイオマーカーの検出に用いられてもよいし、病原体由来の分析物に関して試料を分析するのに用いられてもよい。試料は、特に、ヒト由来であってもよいが、本発明の方法は、非ヒト動物由来の試料(すなわち、獣医学的試料)に同様に適用されてもよい。試料は、本発明の方法で用いるために、何らかの簡便な方法または所望の方法、例えば細胞融解や細胞除去などによって前処理され、調製されたものであってもよい。
本発明の第1の態様の方法は、試料中の、当該試料における存在量のレベルが異なる複数の分析物を検出するためのものである。すなわち、分析物は、異なる濃度で、またはある濃度範囲で、試料中に存在する。試料中のそれぞれの分析物すべて(every analyte)が、他の分析物すべて(other every analyte)と実質的に異なる濃度で存在する必要はなく、むしろ、すべての分析物(all analyte)が、実質的に同じ濃度で存在するわけではない。試料中の分析物は、ある濃度範囲で存在しているが、ある一定の分析物が、非常に近い濃度で存在していてもよい。
分析物は、いくつかの桁にまたがる濃度範囲にわたって、試料中に存在していてもよい。例えば、最も高い濃度で試料中に存在している(または、存在していると見込まれる)分析物は、最も低い濃度で試料中に存在している(または、存在していると見込まれる)分析物の濃度の約1000倍の濃度で存在していてもよい(または存在していると見込まれてもよい)。例えば、試料中の分析物は、互いに比較した濃度が約10倍、約100倍、約1000倍、またはそれ以上、異なっていてもよく、もちろん、その倍率は、それらの間のどの値でもよい。臨床試料においては、分析物は、いくつかの桁数の範囲にまたがって存在していてもよく、例えば、3桁、4桁、5桁、または6桁以上であってもよい。
異なる分析物、より具体的には異なる分析物に対するアッセイ、を一緒にブロック化またはグループ化するのに用いられる存在量のレベルまたは値は、試料中に存在する(または、存在することが見込まれる)分析物の絶対レベルまたは絶対濃度にのみ依存しなくてもよい。アッセイ方法の性質、異なる分析物に対する分析性能の違いなどを含む、他の要因が考慮されてもよい。例えば、抗体または他の結合剤に基づく検出アッセイの場合、分析物に対する抗体の親和性、またはアビディティなどに依存してもよい。異なる分析物に対するアッセイ間のこのような変動が、考慮されてもよい。例えば、存在量は、アッセイにおいて検出される分析物の存在量を、アッセイの出力値または測定値に換算して反映したものであってもよい。したがって、サブセットにおける分析物を選択する際にその基準となる予測存在量は、少なくとも、試料中の分析物の予測されるレベルまたは予測される濃度に依存するものであってもよいが、さらに、またはそれに代えて、特定の検出アッセイにおいて決定される存在量の予測レベルまたは予測値に依存するものであってもよい。換言すると、試料中の分析物の存在量は、見かけの存在量であってもよいし、検出アッセイに依存する理論上の存在量であってもよい。分析物の見かけの存在量は、用いられるアッセイによって変動してもよく、特にそのアッセイの感度によって、変動してもよい。
本方法は、試料のアリコートを複数(すなわち、少なくとも2つ)準備することを含む。すなわち、試料の一部が別々の複数のものとして準備される。試料は、(試料全体が分取されるように)複数のアリコートに分割されてもよいし、試料全体を用いることなく、試料の一部をアリコートとして準備してもよい。アリコートは、同サイズまたは同量であってもよいし、異なるサイズまたは異なる量であってもよいし、一部のアリコートが同サイズであり、その他が異なるサイズであってもよい。
アリコートのうちの少なくとも一部が希釈されていてもよい。例えば、試料を、1:2、1:4、1:5、1:10などに希釈してもよい。特に、アリコートを10倍ずつ希釈していってもよい。すなわち、1つ以上のアリコートが10倍(1:10)に希釈され、1つ以上のアリコートが100倍(1:100)に希釈され、そして1つ以上のアリコートが1000倍(1:1000)に希釈されてもよい。必要であれば、さらなる希釈(例えば、1:10,000、または1:100,000)が行われてもよいが、一般に、最大で1:1000の希釈で十分であることが、予想され得る。1つ以上のアリコートが希釈されなくてもよい(本明細書において、1:1という)。
ある特定の実施形態において、10倍希釈を連続で行って、1:1、1:10、1:100、および1:1000に希釈したアリコートを準備してもよい。この実施形態において、1:10希釈は、希釈していない試料を10倍希釈することで行われる。1:100希釈、および1:1000希釈は、(それぞれ)希釈していない試料を直接100倍希釈および1000倍希釈することで行われてもよいし、1:10で希釈したアリコートを連続して10倍希釈することで行われてもよい(すなわち、1:10に希釈したアリコートを10倍希釈して1:100に希釈したアリコートを得、1:100に希釈したアリコートを10倍希釈して1:1000に希釈したアリコートを得てもよい)。試料の希釈(および、実際のところ、本発明の方法全体にわたる分注ステップのすべて)は、手動で行われてもよいし、自動式分注ロボット(例えば、SPTラボテック・モスキートなど)を用いて行われてもよい。
試料の希釈は、任意の適当な希釈剤を用いて行われてもよく、希釈剤は、分析される試料の種類に依存してもよい。例えば、希釈剤は、水であってもよいし、生理食塩水であってもよいし、緩衝溶液、特に、生物学的に適合した緩衝化合物を含む緩衝溶液(すなわち、用いられる検出アッセイに適合した緩衝液、例えば、PEAまたはPLAに適合した緩衝液)であってもよい。適切な緩衝化合物としては、例えば、HEPES、Tris(すなわち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、リン酸二ナトリウムなどが挙げられる。希釈剤として用いるのに適した緩衝液としては、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、TBS(トリス緩衝生理食塩水)、HBS(HEPES緩衝生理食塩水)などが挙げられる。用いられる緩衝液(または他の希釈剤)は、汚染分析物(contaminant analyte)を含有しないように、精製した溶媒(例えば、水)で作成されなければならない。よって、希釈剤は、滅菌済であるべきであり、希釈剤として、または希釈剤の基剤として、水を用いる場合には、用いられる水は、好ましくは超純水(例えば、ミリQ水)である。
任意の適切な数のアリコートが、試料から提供されてもよい。上述の通り、少なくとも2つのアリコートが提供されるが、たいていの実施形態においては、2つよりも多く提供されることになる。ある特定の実施形態においては、上記詳述したように、4つのアリコートが提供されてもよく、これらは、希釈されていない試料のアリコートと、試料を1:10、1:100、および1:1000に希釈したアリコートである。試料の希釈を増やすことや減らすことが望まれる場合には、提供されるアリコートは、これより多くてもよいし少なくてもよい。さらに、行われる特定のアッセイにおける要望/要求に応じて、各希釈率において1つ以上のアリコートが提供されてもよい。
複数のアリコートが試料から提供されると、各アリコートにおける標的分析物のサブセットを検出するために、別個の多重アッセイが各アリコートに対して行われる。別個の多重アッセイは、各アリコートが別個に解析されるように(すなわち、複数のアリコートが、多重反応の際に混合しないように)、各アリコートに対して行われる。準備されたすべてのアリコートにわたって、多重アッセイが行われると、すべての標的分析物が検出される。すなわち、すべてのアリコートにわたってアッセイが行われて、対象の試料に各標的分析物が存在するか存在しないかが決定される。しかしながら、ある特定の分析物を検出するための個々のアッセイは、1つのアリコートに対してのみ行われてもよい。よって、分析物の異なるサブセットが、各アリコートにおいて検出される。換言すると、異なる分析物が、各アリコートにおいて検出される。好ましくは、各アリコートにおいて検出されるサブセットは、全く異なるものである。すなわち、各標的分析物は、分析物サブセット間で重複しないように、1つのアリコートのみで検出される。しかしながら、いくつかの実施形態においては、適切であると思われる場合には、特定の分析物が複数のアリコートにおいて検出されてもよい。この例では、サブセット間で分析物の重複がいくらかあり、その中で、ある分析物は複数の分析物サブセットに存在するが、他の分析物は1つのサブセットにのみ存在するであろう。
各サブセットの分析物は、試料における予測存在量(すなわち、濃度)に基づいて選択される。すなわち、同様の濃度で試料中に存在することが見込まれ得る分析物は、同じサブセットに含まれて、そして同じ多重反応で解析されてもよい。逆に、異なる濃度で試料中に存在することが見込まれ得る分析物は、異なるサブセットに含まれて、そして異なる多重反応で解析されてもよい。各分析物は、試料中に同様の濃度(例えば、特定の桁数の濃度)で存在することが見込まれる分析物のサブセットに割り当てられる。そして、各分析物サブセットは、分析物の見込み濃度を考慮して、適切な倍率で希釈された試料アリコートにおいて検出される。よって、最も低濃度で存在することが見込まれる分析物は、希釈されていないアリコートにおいて検出されてもよいし、希釈率の低いアリコートにおいて検出されてもよく、最も高濃度で存在することが見込まれる分析物は、最も希釈されたアリコートにおいて検出され、これらの極限値の間の濃度で存在することが見込まれる分析物は、「中間の」希釈率のアリコートにおいて検出される。
上述の通り、いくつかの実施形態において、ある特定の分析物が、複数のサブセットに含まれていてもよい。これは、例えば、分析物の見込み濃度が、本質的に、2つのサブセットの見込み濃度の間であって、明確にそのいずれかに「属さ」ないような場合であり得る。この例において、前記分析物は、両方のサブセットに含まれてもよい。分析物が著しく広い濃度範囲で試料中に存在し得ることが分かっている場合には、前記分析物は2つ(またはそれ以上)のサブセットに含まれていてもよい。
各サブセットの分析物が試料中における予測存在量に基づいて選択されると仮定すると、各サブセットにおける分析物の数は異なる場合があるということが理解されるであろう。あるいは、各サブセットにおける分析物の数は、適宜、同じである場合がある。
試料中の各分析物の存在量/濃度は、解析対象となる試料種における各分析物の正常なレベルに関しての公知の事実に基づいて予測されてもよい。例えば、試料が血漿試料または血清試料(あるいはその他の体液試料)である場合には、その中の分析物の濃度は、これらの体液中の種の公知の濃度に基づいて予測されてもよい。目的となる可能性のある広範な分析物の正常血漿濃度は、https://www.olink.com/resources-support/document-download-center/から入手できる。しかしながら、上述の通り、特定のサブセット(ブロック)に分析物を割り当てるのに用いられる存在量の値は、アッセイに依存し得、また、そのアッセイで得られる結果(例えば、測定値)に依存し得る。
上記詳述したように、各アリコートに対して多重反応が行われて、アリコート中の解析対象となるサブセットのすべての分析物が検出される。上述の通り、「多重」なる用語は、少なくとも2つの異なる分析物が同時に分析されるアッセイを意味する。しかしながら、好ましくは、2つよりもかなり多くの分析物が、各多重反応において分析される。例えば、各多重反応では、少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、またはそれ以上の分析物が分析されてもよい。ある特定の多重反応では、この数よりも多い分析物、例えば、少なくとも70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、またはそれ以上の分析物が分析されてもよい。
本発明の本態様の特定の実施形態においては、分析物は、各アリコートにおいて、各分析物に特異的なレポーター核酸分子を検出することによって、検出される。この実施形態においては、試料中に特定の分析物が存在することにより、特定の分析物に対応することがわかっている特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子が、検出アッセイの際に産生される。特定のヌクレオチド配列が検出されることは、その配列が対応する分析物が試料中に存在することを示す。よって、「レポーター核酸分子」とは、検出アッセイの際にそれが合成されることが、特定の分析物が試料中に存在することを示す核酸分子である。レポーター核酸分子は、RNA分子であってもよいし、DNA分子であってもよい。好ましくは、DNA分子である。
レポーター核酸分子は、当該技術分野の検出アッセイにおいて公知のあらゆる手段によって生成されてもよい。例えば、2つ(またはそれ以上)の核酸が互いにライゲーションすることで生成されて、試料中にその分析物が存在することを示す特有のヌクレオチド配列が形成されてもよい。あるいは、レポーター核酸分子は、鋳型となる核酸分子に沿って、提供された核酸分子が伸長することで生成されてもよい。伸長とライゲーションとを組み合わせて用いてもよい。
よって、レポーター核酸分子は、各アリコートに対して多重検出アッセイが行われている間に生成される。レポーター核酸分子を生成するためには、このような核酸分子を生成することで作用するあらゆる検出アッセイが用いられてもよい。特定の実施形態では、レポーター核酸分子は、近接伸長アッセイ(PEA)において生成される。すなわち、各アリコート、ひいては試料において、分析物を検出するために、多重PEAが行われてもよい。別の実施形態では、レポーター核酸分子は、近接ライゲーションアッセイ(PLA)において生成される。すなわち、各アリコートにおいて分析物を検出するために、多重PLAが行われてもよい。上述の通り、PEAおよびPLAを行うための方法は、当該技術分野において公知である。行われる検出アッセイがPEAであることが特に好ましい。
レポーター核酸分子の生成後、検出を容易にするために、好ましくは増幅される。レポーター核酸分子の増幅は、好ましくはPCRによって行われるが、その他の核酸増幅方法が利用されてもよく、例えば、ループ介在等温増幅(LAMP)などが利用されてもよい。
上述の通り、各レポーター核酸分子は、特定の分析物に特異的である。よって、レポーター核酸分子は、与えられた分析物を同定するものであり、より具体的には、分析物を検出し得る同定(ID)配列、またはタグとして機能する配列またはドメインを含有していてもよい。ID配列は、例えば、さらに以下で詳述するように、プローブまたはプライマー等に対する結合部位として機能することで、検出されてもよいし、より直接的には、配列決定を行うことによって検出されてもよい。したがって、別の表現では、この特異性は、1つ以上のバーコード配列がレポーター核酸分子に存在することによって、実現されてもよい。概して、バーコード配列は、レポーターひいては検出された分析物を同定する、レポーター核酸分子内にあるヌクレオチド配列として定義され得る。検出アッセイにおいて生成された各レポーター核酸分子の全体は、固有のものであってもよく、この場合において、レポーター核酸分子の全体がバーコード配列と見なされてもよい。より一般的には、レポーター核酸分子のより小さい部分の1つ以上が、バーコード配列として働く。
試料中の分析物は、多重検出アッセイの際に生成されたレポーター核酸分子内の特定のバーコード配列を検出することによって、検出される。これは、いくつかの方法で実現され得る。まず第一に、特定のバーコード配列は、多重検出アッセイの間に生成されたすべてのレポーター核酸分子の配列決定を行うことによって検出されてもよい。生成されたレポーター核酸分子のすべてについて配列決定を行うことによって、生成された異なるレポーター核酸分子のすべてを、バーコード配列によって同定してもよく、これによって、試料中に存在するすべての分析物を同定し得る(この同定は、各標的分析物に対応することがわかっているレポーター核酸分子が検出されるか否かに基づく)。核酸配列決定法は、レポーター核酸の検出/解析の好ましい方法である。
レポーター核酸分子を検出するための他の適切な方法としては、PCRに基づく方法が挙げられる。例えば、「タックマン(TaqMan)」プローブを利用する定量PCRが行われてもよい。この例では、レポーター核酸分子(または、バーコード配列を含む各レポーター核酸分子の少なくとも一部)が増幅され、各バーコード配列に相補的なプローブが提供されるが、異なるプローブは、それぞれ、異なる識別可能な蛍光物質に結合されている。その後、特定のバーコードが増幅されたかどうかに基づいて、各バーコード(ひいてはレポーター核酸分子、さらには分析物)の有無を決定することができる。しかしながら、上述したようなPCRに基づく方法は、比較的少数の異なる配列を同時に解析することにのみ適していることが明らかであるものの、バーコード配列を解読するためのプローブを用いる組み合わせ的方法が知られており、多重化容量をある程度拡張するのにこの方法が用いられてもよい。核酸配列決定法には、一度の試行で同定することができる配列数に実際のところ制限はなく、PCRを用いる検出よりも高いレベルでの多重反応を可能にするため、配列決定法が、レポーター核酸分子を検出するための好ましい方法である。
好ましくは、ハイスループットDNA配列決定法の一形態を用いて、レポーター核酸分子を検出する。合成による配列決定法は、好ましいDNA配列決定方法である。合成技術による配列決定法としては、例えば、パイロ配列決定法、リバーシブルダイターミネーター配列決定法、およびイオントレント配列決定法が挙げられ、これらはいずれも、本方法において利用し得る。好ましくは、レポーター核酸は、超並列DNA配列決定法を用いて配列決定される。超並列DNA配列決定法は、特に、合成による配列決定法(例えば、上記のリバーシブルダイターミネーター配列決定法、パイロ配列決定法、またはイオントレント配列決定法)に適用され得る。リバーシブルダイターミネーター法を用いる超並列DNA配列決定法は、好ましい配列決定方法である。リバーシブルダイターミネーター法を用いる超並列DNA配列決定法は、例えば、イルミナ(Illumina)(登録商標)ノバセク(NovaSeq)(商標)システムを用いて行われ得る。
当該技術分野で公知の通り、超並列DNA配列決定法は、複数(例えば、数千、数百万、またはそれ以上)のDNA鎖を並行して、すなわち同時に、配列決定する技術である。超並列DNA配列決定法では、標的DNA分子を、固体表面、例えばフローセルの表面またはビーズに固定化する必要がある。その後、固定化された各DNA分子は、個々に配列決定される。通常は、リバーシブルダイターミネーター配列決定法を採用する超並列DNA配列決定法は、固定化表面としてフローセルを利用し、パイロ配列決定法またはイオントレント配列決定法を採用する超並列DNA配列決定法は、固定化表面としてビーズを利用する。
当業者には公知であるように、超並列配列決定法におけるDNA分子の表面への固定化は、通常、分子の末端に1つ以上の配列決定アダプターを付加することによって達成される。よって、本発明の方法は、レポーター核酸分子に配列決定用のアダプター(配列決定アダプター)を1つ以上付加することを含んでいてもよい。
一般的には、配列決定アダプターは、核酸分子(特に、DNA分子)である。この例では、アダプター配列に相補的な短いオリゴヌクレオチドを固定化表面(例えば、ビーズまたはフローセルの表面)に結合させて、アダプター配列を介した標的DNA分子の表面へのアニーリングを可能にする。あるいは、例えば、ビオチンおよびアビジン/ストレプトアビジンなどのその他の結合パートナー対を用いて、標的DNA分子を固定化表面に結合させてもよい。この場合、ビオチンを配列決定アダプターとして用い、固定化表面に結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを用いてビオチン配列決定アダプターを結合してもよいし、その逆であってもよい。
よって、配列決定アダプターは、通常は10~30ヌクレオチド長(例えば、15~25ヌクレオチド長、または20~25ヌクレオチド長)である、短いオリゴヌクレオチド(好ましくはDNA)であってもよい。上記詳述したように、配列決定アダプターの目的は、標的DNA分子の固定化表面へのアニーリングを可能にすることであるので、核酸アダプターのヌクレオチド配列は、固定化表面に結合された結合パートナーの配列によって決定される。これの他に、核酸配列決定アダプターのヌクレオチド配列には特に制約はない。
配列決定アダプターは、PCR増幅中に、本発明のレポーター核酸分子に付加されてもよい。核酸配列決定アダプターの場合、一方または両方のプライマーに配列決定アダプターヌクレオチドを含ませることによって、これを達成することができる。あるいは、配列決定アダプターが非核酸配列決定アダプター(例えば、タンパク質/ペプチドまたは小分子)である場合には、アダプターは、一方または両方のPCRプライマーに結合されていてもよい。あるいは、配列決定アダプターは、レポーター核酸分子に配列決定アダプターを直接ライゲーションまたは結合させることによって、レポーター核酸分子に付加されてもよい。好ましくは、本方法で用いられる1つ以上の配列決定アダプターは、核酸配列決定アダプターである。
1つ以上の核酸配列決定アダプターが、1つ以上のライゲーションステップおよび/または増幅ステップにおいて、レポーター分子に付加されてもよい。よって、例えば、2つの配列決定アダプターがレポーター核酸分子に付加される(各末端に1つずつ)場合、これらは、1ステップで(例えば、どちらもが配列決定アダプターを含有する一対のプライマーを用いるPCR増幅によって)付加されてもよいし、2ステップで付加されてもよい。この2ステップは、同じ方法で行われてもよいし、異なる方法で行われてもよい。例えば、第1の配列決定アダプターがライゲーションによってレポーター核酸分子に付加され、第2の配列決定アダプターがPCR増幅によって付加されてもよいし、その逆でもよい。または、第1の増幅反応を行って第1の配列決定アダプターをレポーター核酸分子に付加し、その後、第2の増幅反応によって第2の配列決定アダプターをレポーター核酸分子に付加してもよい。
上述の通り、1つ以上の配列決定アダプターがレポーター核酸分子に付加されてもよい。これは、1つまたは2つの配列決定アダプターを意味する。配列決定アダプターは、DNA分子の末端に付加されるので、1つのDNA分子(例えば、レポーター核酸)に付加することができる配列決定アダプターの最大数は、2である。よって、1つの配列決定アダプターが、レポーター核酸分子の一方の末端に付加されてもよいし、2つの配列決定アダプターが、レポーター核酸分子の各末端に1つずつ付加されてもよい。特定の実施形態において、イルミナP5アダプターおよびイルミナP7アダプターが用いられる。すなわち、P5アダプターがレポーター核酸分子の一方の末端に付加され、P7アダプターが他方の末端に付加される。P5アダプターの配列を配列番号1(AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA)に示し、P7アダプターの配列を配列番号2(CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT)に示す。
よって、本発明の特定の実施形態においては、少なくとも第1の(すなわち、少なくとも1つの)配列決定アダプターをレポーター核酸分子に付加するために、レポーター核酸分子に対して、少なくとも第1の(すなわち、少なくとも1回の)PCR増幅を行う。上述の通り、レポーター核酸分子は、検出反応の際に、レポーター核酸分子が対応する標的分析物(すなわち、レポーター核酸分子の生成によってその存在が示される分析物)の存在に応答して産生される。さらに上述した通り、レポーター核酸分子は、その検出を可能にするまたは改善するために、好ましくは増幅される。
よって、この増幅は、1つ以上の配列決定アダプターのレポーター核酸分子への付加と組み合わせられてもよい。これは、少なくとも1つの配列決定アダプターを含むプライマー対を用いてレポーター核酸分子を増幅することによって、達成されてもよい。この例では、プライマー対の少なくとも一方のプライマーが、レポーター核酸分子に結合する配列の上流に、配列決定アダプターを含む。よって、配列決定アダプターは、通常、これを含有するいずれかのプライマーの5’末端に位置している。
特定の実施形態において、増幅ステップは、1つの配列決定アダプターがレポーター核酸分子の一方の末端に付加されるように、一方のプライマーが配列決定アダプターを含んでいるプライマー対を用いて行われる。
別の実施形態において、増幅ステップは、配列決定アダプターが、一度の増幅ステップでレポーター核酸分子の各末端に付加されるように、両方のプライマーが配列決定アダプターを含んでいるプライマー対を用いて行われる。
別の実施形態において、2つの別個の増幅反応を行うことで、レポーター核酸分子の各末端に配列決定アダプターを付加する。この際、各増幅ステップによって、異なる配列決定アダプターが、分子の異なる末端に付加される。
別の実施形態において、最初の増幅ステップは、配列決定アダプターを含まないプライマーを用いて行われる。その後、上述したように、増幅されたレポーター核酸分子に対して1つ以上のさらなる増幅反応を行って、分子の各末端に配列決定アダプターを付加する。
上記詳述したように、検出アッセイの際に生成された各レポーター核酸分子は、特定の分析物に対応するバーコード配列を含んでいてもよい。よって、試料中に異なる分析物が存在することに応答して、異なる配列を有するレポーター核酸分子が生成される。それでもなお、多重化を容易にするために、検出アッセイの際に生成されるすべてのレポーター核酸分子は、同じプライマー対を用いてすべての異なるレポーター核酸分子を増幅することができるように、共通のプライマー結合部位を共有することが好ましい。
ただ1つの配列決定アダプターが分子に付加される第1のPCR増幅をレポーター核酸分子に対して行う場合には、増幅されたレポーター核酸分子(すなわち、第1のPCR増幅の産物)に対して第2のPCR増幅を行って、第2の配列決定アダプターを付加してもよい。よって、この実施形態において、第1のPCR増幅が、一方のプライマーが配列決定アダプターを含むプライマー対を用いて行われ、これによって、第1の配列決定アダプターがレポーター核酸分子の一方の末端に付加される。その後、異なるプライマー対を用いて第2のPCR増幅が行われる。第2のプライマー対では、一方のプライマーが第2の配列決定アダプターを含む。第2の配列決定アダプターは、第1の配列決定アダプターとは異なっている、すなわち、異なる配列を有する。第2の配列決定アダプターを含むプライマーは、第2の配列決定アダプターが、第1の配列決定アダプターとは反対の末端においてレポーター核酸分子に付加されるように、第1の配列決定アダプターを含む末端とは反対の末端において、レポーター核酸分子に結合する。
第1のPCR増幅の産物を増幅するのに必要であれば、第2のプライマー対の第2のプライマーは、第1のPCR増幅の際に第1の配列決定アダプターが付加されたレポーター核酸分子の末端に結合することができるように、第1の配列決定アダプターの配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、レポーター核酸分子に第1の配列決定アダプターを付加するために第1のPCR増幅で用いられる第1の配列決定アダプターを含むプライマーは、第2のPCR増幅においても用いられる。すなわち、第1のPCR増幅および第2のPCR増幅において、同じプライマー(第1の配列決定アダプターを含む)が用いられてもよい。
レポーター核酸分子の両方の末端に配列決定アダプターを付加するために、2回のPCR増幅を連続して行う実施形態において、第1のPCRの産物は、第2のPCRを行う前に精製されてもよい。PCR産物を精製するための標準的な方法が、当該技術分野において知られている。
上述の通り、イルミナP5配列決定アダプターおよびイルミナP7配列決定アダプターは、本発明で用いる好ましい配列決定アダプター対である。特定の実施形態において、P5配列決定アダプターは、第1のPCR増幅においてレポーター核酸分子に付加され、P7配列決定アダプターは、第2のPCR増幅においてレポーター核酸分子に付加される。別の実施形態において、P7配列決定アダプターは、第1のPCR増幅においてレポーター核酸分子に付加され、P5配列決定アダプターは、第2のPCR増幅においてレポーター核酸分子に付加される。
レポーター核酸分子に配列決定アダプターを付加するために行われる1回または2回のPCR増幅のうちの少なくとも一方は、飽和状態まで行われることが好ましい。当該技術分野においてよく知られているように、サイクル数に対するPCR増幅産物量は、「S」字を描く。最初、アンプリコン濃度が徐々に増加し、その後、指数関数的増幅位相に到達し、その間は、産物量は、増幅サイクル毎に(ほぼ)倍増する。指数関数的位相の後、線形位相に到達し、そこでは、産物量は、指数関数的にではなく、直線的に増加する。最後に、プラトーに到達し、そこでは、産物量は、反応の設定や用いる成分の濃度などから判断される、最大可能レベルに到達する。
本発明において、飽和PCRは、概して、指数関数的位相を超えたPCR、すなわち、線形位相にあるかまたはプラトーに達したPCRであると考えられてもよい。特定の実施形態において、本明細書において用いられる「飽和」とは、増幅サイクルをさらに行ったとしてもそれ以上の産物が生成されないように、最大可能な産物が得られるまで反応を行うこと(すなわち、産物量がプラトーに達するまで反応を行うこと)を意味する。例えば、プライマーが枯渇したり、dNTPが枯渇したりするなど、反応成分が枯渇すると、飽和に達し得る。反応成分が枯渇すると、反応速度が低下し、その後プラトー状態に入る。一般的ではないが、ポリメラーゼが消耗すると(すなわち、ポリメラーゼがその活性を失った場合には)、飽和に達し得る。DNAポリメラーゼ濃度が指数関数的増幅を維持するのに十分でなくなるほどアンプリコン濃度が高レベルに達した場合、すなわち、ポリメラーゼ分子よりもアンプリコン分子が多くなった場合にも、飽和に達し得る。この例では、プライマーおよびdNTPが反応ミックス中に十分残っている限り、増幅は、線形位相に入ってその状態を維持する。
特定の実施形態において、配列決定アダプターをレポーター核酸分子に付加するために、2回のPCR増幅が行われ、これらの反応のどちらもが、飽和状態まで行われる。別の実施形態において、2回のPCR増幅のうち第1のPCR増幅のみが、飽和状態まで行われる。あるいは、2回のPCR増幅のうち第2のPCR増幅のみが、飽和状態まで行われる。2回のPCR増幅のうち第1のPCR増幅のみが、飽和状態まで行われることが、特に好ましい。
PCR増幅は、飽和状態であると仮定することができるように、単にPCR増幅のサイクルを多く行うことによって、飽和状態まで行われてもよい。例えば、少なくとも25サイクル、30サイクル、35サイクル、またはそれ以上行われたPCR増幅は、そのステージまでに指数関数的増幅位相が終了するという点において、その終点までに飽和状態に達したと仮定することができる。あるいは、定量PCR(qPCR)によって、飽和状態を測定することができる。例えば、すべてのレポーター核酸分子に共通する配列に結合するプローブを用いて、タックマンPCRを行ってもよいし、SYBRグリーンなどの、二重鎖DNAに結合すると色が変化する染料を用いて、qPCRを行ってもよい。このように反応を追跡して、飽和状態に達するのに必要な最小の増幅サイクル数を求めることができる。いずれにしても、増幅されたレポーター核酸分子をさらに処理することが(配列決定までに)必要だとすると、配列決定用レポーター核酸分子を生成するために実験で用いられるアリコートとは別のアリコートにおいて、飽和点を同定するために、いずれかのこのような実験的qPCRを行う必要があるであろう。何故なら、タックマンプローブまたはインターカレーション染料は、本方法のさらなるステップに干渉しやすいからである。
上記詳述したように、目的の試料の各アリコートに対して、別個の多重反応が行われる。試料において異なるレベルで存在する分析物を検出するために、各アリコートが用いられる。レポーター核酸分子は、最初、試料中の各分析物の量に対応した量で生成されることになる。よって、高濃度で存在する分析物に対しては、高濃度のレポーター核酸分子が生成されると見込むことができ、低濃度で存在する分析物に対しては、低濃度のレポーター核酸分子を見込むことができる。生成されるレポーター核酸分子の量は、試料中に存在する対応する分析物の量に比例することになると見込むことができる。例えば、第2の分析物の濃度の10倍の濃度で試料中に存在する第1の分析物に対しては、第2の分析物に対するレポーター核酸分子の10倍、第1の分析物に対するレポーター核酸分子が生成されることになると見込むことができる。よって、試料中に低濃度で存在すると見込まれる分析物を検出するのに用いられるアリコートよりも、試料中に高濃度で存在すると見込まれる分析物を検出するのに用いられるアリコートにおいて、レポーター核酸分子がはるかに大量に生成されることになる。
このレポーター核酸の量の違いが、レポーター核酸分子を同定する解析ステップ(例えば、配列決定ステップ)まで持ち越される場合には、最も大量に存在するレポーター核酸分子が、少量で存在するレポーター核酸分子のシグナルを「消し去る」ことが起こり得、その結果、試料中に少量で存在する分析物の検出が不十分となるであろう。
飽和状態まで行うPCRにおいて、各多重反応によって得られたレポーター核酸分子を増幅することは、アリコート間のレポーター核酸濃度の違いを除くということを意味する。いったん飽和状態に達すると、各アリコートには、本質的に同じ量のレポーター核酸分子が存在することになる。このことは、試料中に存在する各分析物に対して、同様の量のレポーター核酸分子が存在することを意味し、ひいては、レポーター核酸分子を解析する際に、すべてのレポーター核酸分子(ひいてはそれらに対応する分析物)が検出されるはずだということを意味する。
上述の通り、本方法で用いられる多重検出アッセイは、目的の試料の複数のアリコートに対して別個に行われる。その後、多重検出アッセイの産物を用いて、標的分析物のうちのどれが試料中に存在しているのかが同定される。上記詳述したように、これは、異なる分析物に対応し、例えば配列決定法によって解析されて、どのレポーター核酸分子が存在しているのか(ひいては、どの分析物が試料中に存在しているのか)が決定される、レポーター核酸分子を用いて達成されてもよい。各試料アリコートに対して行われる各多重反応を別個に解析することが可能である。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、各アリコートからの反応産物(すなわち、多重検出アッセイの産物)は、プールされる(すなわち、混合される)。換言すると、このようなプールステップにおいて、別個の「存在量別ブロック」がプールされると見なすことができる。これにより、試料のアリコートすべてに対して、単一の解析反応(例えば、配列決定反応)を可能にすることによって、反応産物のより効率的な解析が可能となる。
多重検出アッセイの産物がレポーター核酸分子である場合には、レポーター核酸分子をまず増幅し(例えば、PCRによって)、増幅産物をプールすることが好ましい。場合によっては、プールにおいて、さらなる増幅ステップを行ってもよい。
別個の多重検出アッセイのそれぞれによって生成されたレポーター核酸分子に対して、上述したように、核酸分子に第1の配列決定アダプターが付加される第1のPCR増幅を別個に行い、その産物をプールすることが、特に好ましい。換言すると、別個のアリコートそれぞれにおいて、検出アッセイを行ってレポーター核酸分子を生成し、レポーター核酸分子に対して、レポーター核酸分子の増幅およびその一方の末端への第1の配列決定アダプターの付加の両方を行う第1のPCR反応を行う。この第1の増幅反応の産物をプールする。必要に応じて、別個に行った第1のPCR反応それぞれの産物を、プールする前に精製してもよい。あるいは、別個の第1のPCR反応の産物をプールし、その後、プール中のすべてのPCR産物を一緒に精製してもよい。しかしながら、第2のPCR増幅へと進む前に第1のPCR増幅の産物を精製することは、必要条件ではない。
別個の多重検出アッセイのそれぞれによって生成されたレポーター核酸分子に対して、上述したように、核酸分子に第1の配列決定アダプターが付加される第1のPCR増幅を別個に行い、その産物をプールすることが、特に好ましい。換言すると、別個のアリコートそれぞれにおいて、検出アッセイを行ってレポーター核酸分子を生成し、レポーター核酸分子に対して、レポーター核酸分子の増幅およびその一方の末端への第1の配列決定アダプターの付加の両方を行う第1のPCR反応を行う。この第1の増幅反応の産物をプールする。必要に応じて、別個に行った第1のPCR反応それぞれの産物を、プールする前に精製してもよい。あるいは、別個の第1のPCR反応の産物をプールし、その後、プール中のすべてのPCR産物を一緒に精製してもよい。しかしながら、第2のPCR増幅へと進む前に第1のPCR増幅の産物を精製することは、必要条件ではない。
プール後に、プールした第1のPCR増幅の産物に対して、第2のPCR増幅を行う。第2のPCRを用いて、上記詳述したように、第1のPCRの産物の増幅およびレポーター核酸分子への第2の配列決定アダプターの付加の両方を行う。第1のPCRの産物をプールする場合、増幅されたレポーター核酸分子が、プール時にほぼ同じ量で各アリコートに存在するように、第1のPCRを飽和状態まで行うことが重要である。プールした第1のPCR増幅の産物に対して行われる第2のPCR増幅も飽和状態まで行うかどうかは重要ではないが、必要であれば、そのようにしてもよい。好ましい実施形態において、第1のPCR増幅および第2のPCR増幅の両方が、飽和状態まで行われる。
他の実施形態において、別個のアリコートそれぞれに対して、別個の多重検出アッセイが行われる。その後、各アリコートにおいて生成されたレポーター核酸分子に対して、飽和状態まで各アリコートに対して別個に行われる単一のPCR反応を行い、レポーター核酸分子の各末端に配列決定アダプターを付加する(各レポーター核酸分子の各末端に対して、1つの配列決定アダプターが付加される)。その後、このPCR反応の産物をプールし、配列決定する。
さらに別の実施形態において、別個のアリコートそれぞれに対して、別個の多重検出アッセイが行われる。その後、各アリコートにおいて生成されたレポーター核酸分子に対して、2回のPCR増幅を行う。これらの両方は、各アリコートに対して別個に行われる。第1のPCRを用いて第1の配列決定アダプターをレポーター核酸分子に付加し、第2のPCRを用いて第2の配列決定アダプターをレポーター核酸分子(第1の配列決定アダプターとは反対のレポーター核酸分子の末端)に付加する。その後、第2のPCRの産物をプールし、配列決定する。この実施形態において、PCR増幅の少なくとも一方が、各アリコートに対して飽和状態まで行われることが重要である。各アリコートにおいて同じ反応が飽和状態まで行われる限り、第1のPCRまたは第2のPCRのいずれかが飽和状態まで行われてもよいし、両方のPCRが飽和状態まで行われてもよい。
別個の多重反応それぞれから、増幅されたレポーター核酸分子をプールする場合、プールに添加される別個の多重反応それぞれからの増幅産物の量は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。別個の多重反応それぞれから得た増幅産物を、同量、プールに添加してもよい。これは、各多重反応からの完全な増幅反応混合物をプールに添加することによって達成されてもよいし、あるいは、各増幅反応混合物から同じ規定量を分取して、プールに添加してもよい。この例では、例えば、試料から3つのアリコートが準備され、それぞれに対して別個の多重検出アッセイが行われて、各アリコートからの増幅されたレポーター核酸分子をプールする場合には、プールの3分の1ずつが、各アリコートに由来することになる。同様に、試料から4つのアリコートが準備される場合には、プールの4分の1ずつが、各アリコートに由来することになる。
あるいは、別個の多重反応それぞれから得た増幅産物を、異なる量で、プールに添加してもよい。「異なる量の増幅産物」とは、単に、プールに添加される増幅産物の量が、すべてのアリコート/多重検出アッセイにわたって同じではないということを意味する。よって、各多重検出アッセイで得られた増幅産物を異なる量でプールに添加するような場合であってもよいし、あるいは、一部のアリコートからは異なる量の増幅産物が添加されるように、すべてではなく一部のアリコートから同量の増幅産物が添加されてもよい。例えば、試料から3つのアリコートが準備され、それぞれに対して別個の多重検出アッセイが行われて、各アリコートからの増幅されたレポーター核酸分子をプールする場合には、3つのアリコートすべてから、異なる量の増幅産物がプールに添加されてもよい。あるいは、2つのアリコートから同量の増幅産物がプールに添加され、第3のアリコートからは異なる量の増幅産物が添加されてもよい。同様に、例えば、試料から4つのアリコートが準備される場合には、4つのアリコートすべてから、異なる量の増幅産物がプールに添加されてもよい。あるいは、3つのアリコートから同量の増幅産物がプールに添加され、第4のアリコートからは異なる量の増幅産物が添加されてもよい。2つのアリコートから同量の増幅産物がプールに添加される場合には、他の2つのアリコートからは異なる量の増幅産物がプールに添加されてもよいし、2つのアリコートから同じ量(第1量)の増幅産物がプールに添加され、他の2つのアリコートからは第1量とは異なる同じ量(第2量)がプールに添加されてもよい。
様々なアリコートから異なる量の増幅産物がプールに添加される場合には、各アリコートからの添加量は、好ましくは、それぞれのアリコートで検出された分析物の数に比例する。よって、例えば、第1のアリコートにおいて、第2のアリコートの2倍の分析物が検出された場合には、第1のアリコートからは、第2のアリコートの2倍の量がプールに添加される。これは、アリコート全体にわたって、試料において検出された各分析物に対し同量の増幅産物をプールに添加することと見なし得る。例えば、3つのアリコートにわたって100個の分析物が検出され、そのうち50個が第1のアリコート、30個が第2のアリコート、20個が第3のアリコートで検出された場合には、プールの50%が第1のアリコートに由来し、30%が第2のアリコートに由来し、20%が第3のアリコートに由来するように、3つのアリコートからは5:3:2の比率でプールに添加される。
本発明の第1の態様の方法は、複数の試料を並行して解析するために用いられてもよい。複数の試料を並行して解析する場合、その試料は、同じ種類のものであってもよいし、異なる種類のものであってもよい。好ましくは、例えばすべてが血漿試料である、またはすべてが唾液試料であるなど、すべての試料が同じ種類のものである。各試料において検出される分析物セットも、同じであってもよいし、異なっていてもよい。好ましくは、各試料において同じ分析物セットが検出され、すべての試料において特定の分析物のそれぞれが、同じレポーター核酸分子を用いて同定される。複数の試料を並行して解析することは、本方法の各ステップを本質的に同時に各試料に対して行いながら、複数の試料を同時に解析することを意味する。
複数の試料を並行して解析する場合、上記詳述したように、各試料から複数のアリコートが準備され、各アリコートにおいて分析物のサブセットが検出される。好ましくは、各試料からは同数のアリコートが準備される。例えば、各試料から3つのアリコートが準備されてもよいし、各試料から4つのアリコートが準備されてもよい。しかしながら、これは必須ではなく、例えば、いくつかの試料からは2つのアリコートが準備され、他の試料からは3つのアリコートが準備され、また他の試料からは4つのアリコートが準備され、さらに他の試料からは5つのアリコートが準備されるといったような、異なる試料から異なる数のアリコートが準備される場合があってもよい。
上述の通り、各試料において同じ分析物セットが検出され、各試料から同数のアリコートが準備されることが好ましい。対応する各試料アリコート(すなわち、希釈率が同じ各試料からのアリコート)において、同じ分析物のサブセットが検出されるように、各試料において、分析物が同じようにアリコートに分割されることがさらに好ましい。
本発明の第1の態様の方法を用いて複数の試料を並行して解析する場合、レポーター核酸分子を上述したように増幅し、特定の試料それぞれにおける増幅産物を上述したようにプールして、第1のプールを生成してもよい。よって、第1のプールが、各試料に対して別個に生成されてもよく、各第1のプールは、その試料に対して行われたすべての多重検出アッセイによる増幅産物(すなわち、その試料に対して準備されたすべてのアリコートからの増幅産物)を含有する。
一実施形態において、各試料に対して生成された別個の第1のプールは、続く解析を容易にするために、さらにプールされてもよい。このような実施形態において、第1のプールステップの後、各第1のプールの増幅産物に試料インデックスが付加される。試料インデックスは、増幅産物が由来する元試料を同定するヌクレオチド配列である。よって、各試料に由来する増幅産物に対する試料インデックス配列として、異なるヌクレオチド配列が用いられる。増幅産物の配列決定が続いて行われる場合、試料インデックスは、個々のレポーター核酸分子がそれぞれどの試料からのものなのかを示すこととなる。試料インデックスとしては、どのようなヌクレオチド配列が用いられてもよい。試料インデックス配列は、どのような長さであってもよいが、例えば3~12ヌクレオチド、4~10ヌクレオチド、または4~8ヌクレオチドなど、比較的短いことが好ましい。
よって、別個の第1のプールそれぞれにおいて増幅産物を標識するために、異なる試料インデックス配列が用いられる。しかしながら、個々の第1のプールそれぞれの中では、試料インデックス配列は同じものである。試料インデックス配列は、適切な方法であれば、どのような方法で増幅産物に付加されてもよく、例えば、試料インデックスは、増幅反応(例えば、PCRによる)中に付加されてもよいし、ライゲーション反応中に付加されてもよい。とりわけ、増幅されたレポーター核酸分子が超並列DNA配列決定法で解析され、その両末端に配列決定アダプターを必要とする場合には、試料インデックス配列が最終的にレポーター核酸分子の末端に位置するようには、付加することはできない。
上述の通り、レポーター核酸分子に対して、第1の配列決定アダプターをレポーター分子に付加することを含む第1のPCR増幅を行い、その後、レポーター核酸分子をプールして第1のプールを作成することが好ましい。これは、複数の試料を並行して解析する場合も同じである。上述したように、各試料のアリコートそれぞれに対して別個に第1のPCR増幅を行い、レポーター核酸分子の一方の末端に第1の配列決定アダプターを付加することが好ましい。上述したように、各試料のアリコートを別個にプールして、各試料毎に別個の第1のプールを得る。
別個の第1のプールが得られると、試料インデックスを付加する。上述の通り、これは、増幅またはライゲーションによって達成されてもよい。どのように試料インデックスが付加されたとしても、レポーター核酸分子において、第1の配列決定アダプターを有する末端とは反対の末端に付加される。各レポーター核酸分子の末端に試料インデックスを付加するためにライゲーションステップが行われてもよいが、好ましくは、試料インデックスの付加は、通常はPCRによって行われる、増幅によって達成される。試料インデックスは、増幅産物に試料インデックスが組み込まれるように、一方のプライマーが試料インデックス配列を含むプライマー対を用いて増幅を行う間に、付加される。
試料インデックスの付加は、レポーター核酸分子に試料インデックスを付加するためだけに行われる専用の増幅ステップにおいて行われてもよい。その後、レポーター核酸分子に第2の配列決定アダプターを付加するために、必要に応じて、さらなる増幅ステップが行われてもよい。この例では、第2の配列決定アダプターは、試料インデックスが存在するのと同じ末端において、レポーター核酸分子に付加される。よって、通常、これによって、試料インデックスは、増幅およびアダプター標識されたレポーター核酸分子において、第2の配列決定アダプターよりも内部で、当該配列決定アダプターのすぐ隣に位置することになる。
しかしながら、好ましくは、上記詳述したように、第1のPCR増幅の産物をプールして第1のプールを得た後、第1のプール(すなわち、第1のPCR増幅の産物)に対して、試料インデックスおよび第2の配列決定アダプターの両方をレポーター核酸分子に付加する第2のPCR増幅産物を行う。よって、第1のプールそれぞれに対して、第2のPCR増幅が別個に行われる。すなわち、解析された試料それぞれに対して、第2のPCRが別個に行われる。
この実施形態において、第2のPCR増幅は、試料インデックス配列および第2の配列決定アダプターの両方が同時にレポーター核酸分子に付加されるように、一方のプライマーが試料インデックス配列および第2の配列決定アダプターの両方を含有するプライマー対を用いて行われる。第2の配列決定アダプターと試料インデックス配列とを含むプライマーは、その5’末端に第2の配列決定アダプターを有する。試料インデックス配列は、第2の配列決定アダプターに隣接するように、第2の配列決定アダプターの下流、通常はすぐ下流に位置するが、隣接していることは必要ではない。よって、第2のPCR増幅の産物は、2つの配列決定アダプター(各末端に1つずつ)と、第2の配列決定アダプターより内部にある試料インデックスとを含有する。
第2のPCRは、共通の第1のプライマーと、解析された複数の試料にわたって異なっている固有の第2のプライマーとを用いてもよい。換言すると、一方のプライマー(同じプライマー)は、すべての試料にわたって用いられて、第1のPCR増幅で第1の配列決定アダプターが付加されたレポーター核酸分子の末端に結合する。異なる第2のプライマーが各試料に用いられ、ここで、第2のプライマーは、試料毎に固有の試料インデックス配列を含む。
第2のPCR増幅の後、各試料毎に生成されたインデックス付き第1のプール自体をプールして(すなわち、互いに添加して、または混合して)、第2のプールを作成する。第2のプールは、DNA配列決定に用いられる。よって、単一のDNA配列決定反応を行うことで、各試料毎に生成されたレポーター核酸分子を同定することができる。レポーター核酸分子に付加された試料インデックスによって、各核酸分子の元となる試料を突き止めることが可能になり、その結果、各試料にどの分析物が存在するのかを決定することができる。DNA配列決定の前に、第2のPCRの増幅産物を精製して、増幅反応で残った過剰なプライマーなどを除去することが好ましい。この精製ステップは、本方法において1つの試料が解析されるか複数の試料が解析されるかにかかわらず、行われてもよい。複数の試料を解析し、配列決定の前に第2のPCR増幅の産物をプールする場合には、第2のPCRの産物は、プールする前に精製されてもよいし、プールした後に精製されてもよい。すなわち、第2のPCRを各第1のプールに対して行い、産物をプールして第二のプールを生成し、その後、単一の精製反応で、第2のプールのPCR産物を一緒に精製してもよい。あるいは、第2のPCRを各第1のプールに対して行い、各第2のPCRで得られた産物を別個に精製し、その後、精製された第2のPCR増幅の産物をプールしてもよい。
上述の通り、各レポーター核酸分子は、特定の分析物と関連する少なくとも1つのバーコード配列を含む。よって、通常は配列決定法によってそのバーコード配列を検出することで、特定のレポーター核酸分子それぞれが検出される。本発明の第1の態様の方法を用いて1つの試料を解析する場合、多重検出アッセイで生成されたレポーター核酸分子をすべて検出するために必要なのは、そのバーコードを検出することだけである。特定のバーコードがそれぞれ検出されることは、それに対応する分析物が試料中に存在していることを示す。本方法を用いて複数の試料を並行して解析する場合、増幅後、各レポーター核酸分子は、バーコード配列および試料インデックスの両方を含む。この実施形態において、各レポーター核酸分子の検出は、バーコード配列および試料インデックスの両方を検出することを含む。試料インデックスの検出は、レポーター核酸分子がどの試料に由来するのかを示し、バーコードの検出は、その試料中に特定の分析物が存在することを示す。よって、レポーター核酸分子を検出することによって、解析された各試料に存在する分析物の同定が可能となる。
上述の通り、本方法のための配列決定は、通常、超並列DNA配列決定法によって行われる。この目的のために、第2のPCR増幅の精製産物(またはそのアリコート)を、例えば水酸化ナトリウムを用いて変性させて、一本鎖DNA分子を得る。変性(一本鎖)DNAは、必要に応じて、適切な緩衝液を用いて希釈されてもよい。適切な希釈緩衝液は、一般に、DNA配列決定プラットフォームとともに提供されるか、またはDNA配列決定プラットフォームの製造者によって提供される。その後、変性DNAは、その配列決定アダプターを固体担体(例えば、ビーズまたはフローセル)から突出する相補配列にハイブリダイズさせることで、固体担体上に配置される。DNAが固体担体上に配置されると、選択された方法を用いて、DNA配列決定が行われる。
上述した方法によって、試料中の各分析物の検出が可能となる。本方法によって、各試料毎に、各サブセット内の分析物のレベルを比較することも可能となる。すなわち、解析された特定の試料アリコートそれぞれにおける分析物のレベルを比較することが可能となる。個々のアリコートそれぞれにおいて、生成された異なるレポーター核酸分子それぞれのレベルは、その各分析物のレベルに比例する(例えば、第1の分析物が、特定のアリコートにおいて、第2のアリコートの2倍のレベルで存在する場合には、第1の分析物に対応するレポーター核酸分子は、第2の分析物に対応するレポーター核酸分子の2倍生成されることになる)。このようなレポーターレベルの違いは、例えば配列決定などのレポーター検出を行う際に検出されることになり、これによって、試料中に存在する分析物の相対量を比較することが可能となるが、これは、同じアリコートで検出された分析物の場合のみである。
試料中に存在するすべての分析物の相対量を比較することができれば(すなわち、異なるアリコートで検出された分析物を比較することができれば)、好都合である。異なる試料中に存在する分析物の相対量を比較することができれば、さらに好都合である。これは、各アリコートに内部コントロールを含ませることで達成することができる。各試料のアリコートそれぞれに、同じ内部コントロールを含ませる。内部コントロールは、アリコートの希釈率に応じて、異なる濃度で、試料の各アリコートに含まれる。内部コントロールの濃度は、アリコートの希釈率に比例する。よって、例えば、希釈されていない試料のアリコートにおいて、特定の所与の濃度で内部コントロールを用いる場合には、1:10希釈された試料のアリコートでは、希釈されていない試料で用いた濃度の10分の1の濃度で内部コントロールを用いる、などのようにする。これによって、アリコート間で分析物の相対濃度を直接的に比較することが可能となり、その一方で、内部コントロールのシグナルが、アリコートで検出された分析物のシグナルを埋もれさせたり、そのようなシグナルに埋もれたりすることが、確実になくなる。何故なら、各アリコートで検出された分析物に適した濃度で、内部コントロールが各アリコートに存在するからである。
内部コントロールは、コントロールレポーター核酸分子であるか、または、コントロールレポーター核酸分子の生成をもたらすものである。各レポーター核酸分子の量をコントロールレポーターと比較することで、異なるアリコートで解析された分析物の相対量,および/または異なる試料からの分析物の相対量を、比較することができる。これを実現できるのは、各レポーター核酸分子とコントロールレポーターとの間の相対的な違いを比較可能であるからである。
例えば、異なる試料からの2つの異なるレポーター核酸分子が、コントロールレポーターに対して同じ相対レベルで存在する場合(例えば、2分の1または3分の1、あるいは2倍または3倍)には、このことは、2つのレポーター核酸分子によって示される分析物が、2つの試料において本質的に同じ濃度で存在していることを示している。同様に、コントロールレポーターに対する特定のレポーター核酸分子の比率が、コントロールレポーターに対する異なる試料からの同じレポーター核酸分子の比率の2倍である場合(例えば、第1の試料において、コントロールレポーターの2倍のレベルでレポーター分子が存在し、第2の試料において、コントロールレポーターと本質的に同じレベルでレポーター分子が存在する場合)には、このことは、特定のレポーター核酸分子によって示される分析物が、第2の試料において存在するレベルの約2倍のレベルで第1の試料に存在していることを示している。
内部コントロールとして用いられ得る様々な選択肢がある。適切なコントロールは、用いられる検出技術次第であってもよい。いずれかの検出アッセイにおいて、内部コントロールは、添加された分析物、すなわち、解析される各アリコートに規定濃度で添加されたコントロール分析物であってもよい。コントロール分析物は、多重検出アッセイの前にアリコートに添加され、試料中の他の分析物と同様に、各アリコートにおいて検出される。特に、コントロール分析物の検出は、上述したように、コントロール分析物に特異的なコントロールレポーター核酸分子の生成につながり得る。コントロール分析物が用いられる場合には、コントロール分析物は、目的の試料に存在し得ない分析物である。例えば、人工の分析物であってもよいし、試料が動物(例えば、ヒト)由来である場合には、コントロール分析物は、目的の動物には存在しない、異なる種に由来する生体分子であってもよい。特に、コントロール分析物は、非ヒトタンパク質であってもよい。コントロール分析物の例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、およびシアン蛍光タンパク質(CFP)などの蛍光タンパク質が挙げられる。
内部コントロールの他の例は、多重検出アッセイで生成されるレポーター核酸分子と同じ全体構造を有する二重鎖DNA分子である。すなわち、DNA分子は、当該DNA分子をコントロールレポーター核酸分子として同定するバーコード配列と、分析物の検出に応答して生成される他のすべてのレポーター核酸が共有し、増幅反応で用いられるプライマーの結合を可能にする、共通のプライマー結合部位と、を含む。とりわけ、コントロールDNA分子は、配列決定アダプターも試料インデックスも含まない。これらの配列決定アダプターや試料インデックスは、上述したように、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子に付加されるのと同時に(例えば、PCR増幅において)、コントロールDNA分子に付加される。
このようにコントロールとして用いられる二重鎖DNA分子を、本明細書では検出コントロールという。何故なら、分析物濃度を評価する(上述したように、コントロールと濃度を比較することによる)のに有用であるだけでなく、上述したように、分析物検出の際に生成されるレポーター核酸分子が増幅され、標識され、検出される(例えば、配列決定によって)ことを、確認できるからである。レポーター核酸分子を解析する(例えば、配列決定する)際に検出コントロールが検出されない場合には、このことは、検出方法が失敗していることを示す。例えば、増幅ステップが失敗している場合もあるし、配列解析反応が失敗している場合もある。検出コントロールは、好ましくは、多重検出アッセイを行う前に各アリコートに添加される。
本方法の特定の実施形態において、コントロール分析物および検出コントロールの両方が、各アリコートに添加される。この例では、コントロール分析物に対するバーコード配列は、検出コントロールに対するバーコード配列と明らかに異なるものであり、その結果、2つの内部コントロールを個々に同定することができる。
上述の通り、多重検出アッセイは、多重近接伸長アッセイまたは多重近接ライゲーションアッセイであることが好ましく、最も好ましくは、多重近接伸長アッセイである。これらについては、上で簡単に説明している。上述の通り、これらの技術の両方が、対になった近接プローブの使用に依拠している。
本明細書において、近接プローブは、分析物に特異的な分析物結合ドメインと、核酸ドメインと、を含む存在物と定義される。「分析物に特異的」とは、分析物結合ドメインが、特定の標的分析物を特異的に認識して結合すること、すなわち、他の分析物または他の部分に結合する場合よりも高い親和性で、標的分析物に結合すること、を意味する。分析物結合ドメインは、好ましくは抗体であり、特にモノクローナル抗体である。抗原結合ドメインを含む抗体断片または抗体の誘導体も、分析物結合ドメインとして用いるのに適している。このような抗体断片または誘導体としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびscFvなどの分子が挙げられる。
Fab断片は、抗体の抗原結合ドメインからなる。個々の抗体は、2つのFab断片を含有するものと見なされてもよく、Fab断片のそれぞれは、軽鎖と、それが結合した重鎖のN末端部分とからなる。よって、Fab断片は、完全な軽鎖と、それが結合した重鎖のVHドメインおよびCH1ドメインと、を含有する。Fab断片は、パパインを用いて抗体を消化することによって得られてもよい。
F(ab’)2断片は、抗体のFab断片2つと重ドメインのヒンジ領域とからなり、2つの重鎖を連結するジスルフィド結合を含む。換言すると、F(ab’)2断片は、2つのFab断片が共有結合を介して連結されたものと見なすことができる。F(ab’)2断片は、ペプシンを用いて抗体を消化することによって得られてもよい。F(ab’)2断片を還元すると、2つのFab’断片が得られ、これらは、断片を他の分子に結合させるのに有用であり得る追加的なスルフヒドリル基を含有するFab断片と見なすことができる。ScFv分子は、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを融合させることで産生される合成コンストラクトである。典型的には、この融合は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方を含む融合タンパク質を産生するように抗体遺伝子を設計することによって、組み換え的に成される。
近接プローブの核酸ドメインは、DNAドメインであってもよいし、RNAドメインであってもよい。好ましくは、DNAドメインである。それぞれの近接プローブ対における近接プローブの核酸ドメインは、典型的には、互いにハイブリダイズするように、または1つ以上の共通のオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするように(一対の近接プローブの両方の核酸ドメインがハイブリダイズし得る)、設計される。したがって、核酸ドメインは、少なくとも部分的には一本鎖でなければならない。ある実施形態において、近接プローブの核酸ドメインは、全体的に一本鎖である。他の実施形態において、近接プローブの核酸ドメインは、部分的に一本鎖であり、一本鎖の部分および二本鎖の部分の両方を含む。
近接プローブは、典型的には近接プローブ対として提供され、それぞれが標的分析物に特異的である。上述の通り、標的分析物は、単一の存在物であってもよく、特に単一タンパク質であってもよい。この実施形態において、近接対のプローブは、どちらも標的分析物(例えば、タンパク質)に結合するが、エピトープは異なる。エピトープは重複しておらず、その結果、近接プローブ対の一方のプローブがエピトープに結合しても、近接プローブ対の他方のプローブがエピトープに結合するのを干渉または阻害することはない。あるいは、上述の通り、標的分析物は、タンパク質複合体などの複合体であってもよく、この場合、近接プローブ対の一方のプローブが複合体の一方の要素に結合し、近接プローブ対の他方のプローブが複合体の他方の要素に結合する。プローブは、タンパク質の相互作用部位(すなわち、互いに相互作用しているタンパク質の部位)とは異なる部位において、複合体に含まれるタンパク質に結合する。
上述の通り、近接プローブは、近接プローブ対として提供され、それぞれが標的分析物に特異的である。このことは、各近接プローブ対において、両方のプローブが、同じ分析物に特異的な分析物結合ドメインを含んでいることを意味する。用いられる検出アッセイは、多重アッセイであるので、各検出アッセイには複数の異なるプローブ対が用いられ、各プローブ対は、異なる分析物に特異的である。すなわち、異なるプローブ対それぞれの分析物結合ドメインは、異なる標的分析物に特異的である。
各近接プローブの核酸ドメインは、プローブが用いられる方法に応じて設計される。近接伸長アッセイの様式の代表的な例を図1に模式的に示し、これらの実施形態を以下で詳細に説明する。通常、近接伸長アッセイにおいては、一対の近接プローブが標的分析物に結合すると、2つのプローブの核酸ドメインが互いに近接し、相互作用する(すなわち、直接的または間接的に、互いにハイブリダイズする)。2つの核酸ドメイン間の相互作用によって、少なくとも1つの遊離3’末端を含む核酸二重鎖(すなわち、二重鎖内の核酸ドメインのうちの少なくとも一方が伸長可能な3’末端を有する)が得られる。アッセイミックスへの核酸ポリメラーゼ酵素の添加、またはアッセイミックス内での核酸ポリメラーゼ酵素の活性化により、少なくとも1つの遊離3’末端が伸長する。よって、二重鎖内の核酸ドメインのうちの少なくとも一方は、それと対になった核酸ドメインを鋳型として伸長する。得られた伸長産物は、本明細書において用いられるレポーター核酸分子であり、伸長産物を産生した近接プローブ対が結合した分析物の存在を示すバーコード配列を含む。
図1のバージョン1は、「従来の」近接伸長アッセイを示し、各近接プローブの核酸ドメイン(矢印で示す)は、その5’末端において分析物結合ドメイン(上下逆さの「Y」で示す)に付加されており、これによって、遊離の3’末端が2つ残されている。当該近接プローブがそれぞれの分析物(図中、分析物は示さず)に結合すると、3’末端において相補的であるプローブの核酸ドメインは、ハイブリダイズして相互作用することができる、すなわち二重鎖を形成することができる。アッセイ混合物への核酸ポリメラーゼ酵素の添加、またはアッセイ混合物内での核酸ポリメラーゼ酵素の活性化により、各核酸ドメインを、他方の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として伸長させることができる。上記詳述したように、得られる伸長産物は、検出されることでプローブ対が結合した分析物を検出する、レポーター核酸分子である。
図1のバージョン2は、別の近接伸長アッセイを示し、第1の近接プローブの核酸ドメインは、その5’末端において分析物結合ドメインに付加され、第2の近接プローブの核酸ドメインは、その3’末端において分析物結合ドメインに付加されている。これによって、第2の近接プローブの核酸ドメインは、遊離の5’末端(とがっていない矢印で示す)を有することになり、この5’末端は、典型的な核酸ポリメラーゼ酵素(3’末端のみを伸長させる)を用いて伸長させることはできない。第2の近接プローブの3’末端は、効果的に「ブロック」されている。すなわち、この3’末端は、分析物結合ドメインに結合しており、それによってブロックされているため、「遊離」ではなく、伸長させることはできない。この実施形態において、近接プローブが分析物上のそれぞれの分析物結合標的に結合すると、3’末端において相補性を有する領域を共有するプローブの核酸ドメインは、ハイブリダイズして相互作用することができる、すなわち二重鎖を形成することができる。しかしながら、バージョン1とは対照的に、第1の近接プローブ(遊離の3’末端を有する)の核酸ドメインのみが、第2の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として伸長されて、伸長産物(すなわち、レポーター核酸分子)を得ることができる。
図1のバージョン3では、バージョン2のように、第1の近接プローブの核酸ドメインは、その5’末端において分析物結合ドメインに付加され、第2の近接プローブの核酸ドメインは、その3’末端において分析物結合ドメインに付加されている。これによって、第2の近接プローブの核酸ドメインは、遊離の5’末端(とがっていない矢印で示す)を有することになり、この5’末端は、伸長させることはできない。しかしながら、この実施形態において、各近接プローブの分析物結合ドメインに付加されている核酸ドメインは、相補性を有する領域を有していなので、二重鎖を直接形成することはできない。その代わり、各近接プローブの核酸ドメインと相同な領域を有する第3の核酸分子が提供される。この第3の核酸分子は、核酸ドメイン間で「分子架橋」または「スプリント(splint)」として働く。この「スプリント」オリゴヌクレオチドは、核酸ドメイン間の間隙に架橋し、それらを間接的に相互作用させる。すなわち、各核酸ドメインは、スプリントオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する。
よって、近接プローブが、分析物上の各分析物結合標的に結合すると、プローブの核酸ドメインのそれぞれがスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることで相互作用する、すなわち、スプリントオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する。したがって、第3の核酸分子またはスプリントは、近接プローブの一方に設けられた部分的に二重鎖である核酸ドメインの第2の鎖と見なされ得ると考えることができる。例えば、近接プローブの一方に、部分的に二重鎖である核酸ドメインが設けられていてもよく、この核酸ドメインは、一方の鎖の3’末端を介して分析物結合ドメインに付加され、他方の(付加されていない)鎖は、遊離の3’末端を有する。よって、このような核酸ドメインは、遊離の3’末端を含む末端一本鎖領域を有する。この実施形態において、第1の近接プローブ(遊離の3’末端を有する)の核酸ドメインは、「スプリントオリゴヌクレオチド」(または、他方の核酸ドメインの一本鎖3’末端領域)を鋳型として、伸長されてもよい。あるいは、または、さらには、スプリントオリゴヌクレオチド(すなわち、付加されていない鎖、または3’一本鎖領域)の遊離の3’末端は、第1の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として、伸長されてもよい。
上記説明から明らかなように、一実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、アッセイの別個の要素として提供されてもよい。換言すると、スプリントオリゴヌクレオチドは、反応ミックスに別個に添加されてもよい(すなわち、近接プローブとは別に、分析物を含有する試料に添加されてもよい)。そうであっても、近接プローブの一部である核酸分子にハイブリダイズするものであり、このような核酸分子に接触するとハイブリダイズすることになるので、別個に添加されたとしても、なお部分的に二重鎖である核酸ドメインの鎖であると見なされ得る。あるいは、スプリントは、近接プローブの核酸ドメインのうちの1つに前もってハイブリダイズさせておいてもよい。すなわち、近接プローブを試料に接触させる前にハイブリダイズさせておいてもよい。この実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、直接的に、近接プローブの核酸ドメインの一部であると見なすことができる。すなわち、核酸ドメインは、部分的に二重鎖である核酸分子であり、例えば、近接プローブは、二重鎖である核酸分子を分析物結合ドメインに連結させ(好ましくは、核酸ドメインは、一本鎖で分析物結合ドメインに結合している)、当該核酸分子を改変して、部分的に二重鎖である核酸ドメイン(他の近接プローブの核酸ドメインにハイブリダイズ可能な一本鎖の突出部を有する)を生成することによって、作成されてもよい。
それ故、本明細書において定義される近接プローブの核酸ドメインの伸長は、「スプリント」オリゴヌクレオチドの伸長も包含する。好都合には、伸長産物がスプリントオリゴヌクレオチドの伸長によって生じたものである場合、得られた伸長核酸鎖は、核酸分子の2本の鎖の間の相互作用によって(2本の核酸鎖がハイブリダイズすることによって)のみ、近接プローブ対に連結される。それ故、これらの実施形態において、伸長産物は、例えば、温度の上昇、塩濃度の低下などの変性条件を用いて、近接プローブ対から解離させ得る。
図1のバージョン3で描かれたスプリントオリゴヌクレオチドは、第2の近接プローブの核酸ドメインの全長に対して相補的であるように示されているが、これはあくまでも例示であって、スプリントは、近接プローブの核酸ドメインの末端(または末端付近)と二重鎖を形成することができるものであればよく、すなわち、2つのプローブの核酸ドメイン間に架橋を形成するものであればよい。
別の実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に援用されるWO2007/107743に記載されているように、第3の近接プローブの核酸ドメインとして提供されてもよく、これによって近接プローブアッセイの感度および特異性をさらに向上できるということが実証されている。
図1のバージョン4は、バージョン1の変形であり、第1の近接プローブの核酸ドメインは、その3’末端に、第2の近接プローブの核酸ドメインに完全には相補的でない配列を含む。よって、当該近接プローブがそれぞれの分析物に結合すると、プローブの核酸ドメインはハイブリダイズして相互作用することができる、すなわち、二重鎖を形成することができるが、第1の近接プローブの核酸ドメインの3’末端の最端部(遊離の3’水酸基を含む核酸分子の部位)は、第2の近接プローブの核酸ドメインにハイブリダイズすることができないため、一本鎖のハイブリダイズしていない「フラップ(flap)」として存在する。核酸ポリメラーゼ酵素を添加または活性化すると、第2の近接プローブの核酸ドメインのみを、第1の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として伸長させ得る。
図1のバージョン5は、バージョン3の変形と見なしてもよい。しかしながら、バージョン3とは対照的に、両方の近接プローブの核酸ドメインは、その5’末端において、それぞれの分析物結合ドメインに付加されている。この実施形態において、核酸ドメインの3’末端は、相補的ではなく、それ故、近接プローブの核酸ドメインは、相互作用したり、直接二重鎖を形成したりすることができない。その代わり、各近接プローブの核酸ドメインと相同な領域を有する第3の核酸分子が提供される。この第3の核酸分子は、核酸ドメイン間で「分子架橋」または「スプリント」として働く。この「スプリント」オリゴヌクレオチドは、核酸ドメイン間の間隙に架橋し、それらを間接的に相互作用させる。すなわち、各核酸ドメインは、スプリントオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する。よって、近接プローブが、各分析物に結合すると、プローブの核酸ドメインのそれぞれがスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして相互作用する、すなわち、スプリントオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成する。
バージョン3にしたがって、第3の核酸分子またはスプリントは、近接プローブの一方に設けられた部分的に二重鎖である核酸ドメインの第2の鎖と見なされ得ると考えることができる。好ましい例では、近接プローブの一方に、部分的に二重鎖である核酸ドメインが設けられていてもよく、この核酸ドメインは、一方の鎖の5’末端を介して分析物結合ドメインに付加され、他方の(付加されていない)鎖は、遊離の3’末端を有する。よって、このような核酸ドメインは、少なくとも1つの遊離の3’末端を含む末端一本鎖領域を有する。この実施形態において、第2の近接プローブ(遊離の3’末端を有する)の核酸ドメインは、「スプリントオリゴヌクレオチド」を鋳型として、伸長されてもよい。あるいは、または、さらには、スプリントオリゴヌクレオチド(すなわち、付加されていない鎖、または第1の近接プローブの3’一本鎖領域)の遊離の3’末端は、第2の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として、伸長されてもよい。
バージョン3に関連して上述したように、スプリントオリゴヌクレオチドは、アッセイの別個の要素として提供されてもよい。一方、近接プローブの一部である核酸分子にハイブリダイズするものであり、このような核酸分子に接触するとハイブリダイズすることになるので、別個に添加されたとしても、なお部分的に二重鎖である核酸ドメインの鎖であると見なされ得る。あるいは、スプリントは、近接プローブの核酸ドメインのうちの1つに前もってハイブリダイズさせておいてもよい。すなわち、近接プローブを試料に接触させる前にハイブリダイズさせておいてもよい。この実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、直接的に、近接プローブの核酸ドメインの一部であると見なすことができる。すなわち、核酸ドメインは、部分的に二重鎖である核酸分子であり、例えば、近接プローブは、二重鎖である核酸分子を分析物結合ドメインに連結させ(好ましくは、核酸ドメインは、一本鎖で分析物結合ドメインに結合している)、当該核酸分子を改変して、部分的に二重鎖である核酸ドメイン(他の近接プローブの核酸ドメインにハイブリダイズ可能な一本鎖の突出部を有する)を生成することによって、作成されてもよい。
それ故、本明細書において定義される近接プローブの核酸ドメインの伸長は、「スプリント」オリゴヌクレオチドの伸長も包含する。好都合には、伸長産物がスプリントオリゴヌクレオチドの伸長によって生じたものである場合、得られた伸長核酸鎖は、核酸分子の2本の鎖の間の相互作用によって(2本の核酸鎖がハイブリダイズすることによって)のみ、近接プローブ対に連結される。それ故、これらの実施形態において、伸長産物は、例えば、温度の上昇、塩濃度の低下などの変性条件を用いて、近接プローブ対から解離させ得る。
図1のバージョン5で描かれたスプリントオリゴヌクレオチドは、第1の近接プローブの核酸ドメインの全長に対して相補的であるように示されているが、これはあくまでも例示であって、スプリントは、近接プローブの核酸ドメインの末端(または末端付近)と二重鎖を形成することができるものであればよく、すなわち、近接プローブの核酸ドメイン間に架橋を形成するものであればよい。
別の実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に援用されるWO2007/107743に記載されているように、第3の近接プローブの核酸ドメインとして提供されてもよく、これによって近接プローブアッセイの感度および特異性をさらに向上できるということが実証されている。
図1のバージョン6は、本発明の最も好ましい実施形態である。図示の通り、プローブ対の両方のプローブが、部分的に一本鎖である核酸分子に結合している。短い核酸鎖が、その5’末端を介して分析物結合ドメインに結合している。分析物結合ドメインに結合している短い核酸鎖は、互いにハイブリダイズしていない。むしろ、短い核酸鎖のそれぞれは、長い核酸鎖にハイブリダイズしており、この長い核酸鎖は、その3’末端に一本鎖の突出部を有している(すなわち、長い核酸鎖の3’末端は、分析物結合ドメインに結合している短鎖の5’末端を超えて延びている。2本の長い核酸鎖の突出部は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。2本の長い核酸分子の3’末端が互いに完全にハイブリダイズしている場合には、図示の通り、二重鎖は、2つの遊離3’末端を含んでいるが、長い核酸分子の3’末端は、長い核酸分子の一方の3’末端の最端部が、他方と相補的でなく、フラップを形成するように、つまり、二重鎖が遊離の3’末端を1つだけ含有するように、バージョン4のように設計されてもよい。互いに相互作用する2本の長い核酸分子は、分析物結合ドメインに直接結合している2本の短いオリゴヌクレオチド間に、一緒に架橋を形成するという点で、スプリントオリゴヌクレオチドと見なされ得る。
核酸ポリメラーゼの添加または活性化により、スプリントオリゴヌクレオチドの一方または両方の遊離の3’末端が伸長する。とりわけ、いずれかのスプリントオリゴヌクレオチドは、他方のスプリントオリゴヌクレオチドを鋳型として伸長する。よって、一方のスプリントオリゴヌクレオチドを伸長させると、他方の「鋳型」スプリントオリゴヌクレオチドは、分析物結合ドメインに結合する短鎖から移動する。
好ましい実施形態において、分析物結合ドメインに直接結合している短い核酸鎖は、「共通鎖」である。すなわち、多重検出アッセイに用いられるすべての近接プローブに、同じ鎖が直接結合している。そのため、各スプリントオリゴヌクレオチドは、共通鎖にハイブリダイズする配列からなる「共通部位」と、プローブに特有のバーコード配列を含む「固有部位」と、を含む。このような近接プローブ、およびこれらを作成する方法は、WO2017/068116に記載されている。
すべての近接検出アッセイ技術において、個々の近接プローブそれぞれの核酸ドメインは、(PEAバージョン6について上述したように)特定のプローブを同定する固有のバーコード配列を含むことが好ましい。この場合、レポーター核酸分子(近接伸長アッセイでは、伸長産物)は、各近接プローブの固有バーコード配列を含む。よって、これら2つの固有バーコード配列は、レポーター核酸分子のバーコード配列を一緒に形成する。換言すると、レポーター核酸分子のバーコード配列は、2つのプローブバーコード配列の組み合わせであるかこれを含むものであり、近接プローブのバーコード配列を組み合わせて、レポーター核酸分子が生成される。よって、2つのプローブバーコード配列の特定の組み合わせを検出することによって、特定のレポーター核酸分子が検出される。
分析物の検出に多重近接伸長アッセイを用いる場合、追加的な内部コントロールである、伸長コントロールを用いることが好ましい。伸長コントロールは、伸長可能な遊離の3’末端を有する二重鎖を含む核酸ドメインに結合している分析物結合ドメインを含む、単一のプローブである。好ましくは、伸長コントロールは、分析物結合ドメインをただ1つだけ含むこと以外は、標的分析物に結合すると2つの実験用プローブ間に形成される二重鎖と本質的に等価な構造を有する。伸長コントロールに用いられる分析物結合ドメインは、目的の試料に存在する可能性がある分析物を認識しない。適切な分析物結合ドメインは、ヤギIgG、マウスIgG、ウサギIgGなどの、市販のポリクローナルなイソタイプコントロール抗体である。
図2は、本発明で用いることができる伸長コントロールの例を示す。パートAからパートFは、それぞれ、図1のPEAアッセイのバージョン1からバージョン6で用いることができる伸長コントロールに相当する。伸長コントロールは、伸長ステップが意図された通りに行われていることを確認するために用いられる。伸長コントロールが伸長することによって、伸長コントロールレポーター核酸分子であると同定され得るように固有のバーコードを含む、レポーター核酸分子が得られる。本発明の第1の態様の方法において多重PEAが用いられる場合、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールのすべてが、アッセイに用いられる(すなわち、各アリコートに添加される)ことが好ましい。他の実施形態において、例えば、コントロール分析物と伸長コントロール、コントロール分析物と検出コントロール、または伸長コントロールと検出コントロールなど、2つの内部コントロールのみが用いられる。
上記詳述したように、近接伸長アッセイにおいては、一方または両方の近接プローブの核酸ドメインが、他方の近接プローブの核酸ドメインを鋳型として伸長することによって、レポーター核酸分子が生成される。好ましい実施形態において、PCR増幅において、伸長反応が行われる。すなわち、換言すると、PCR増幅を含む、単一の反応を行うことで、レポーター核酸分子を生成する近接プローブの核酸ドメインの伸長と、生成したレポーター核酸分子への第1の配列アダプターの付加を含むレポーター分子の増幅と、の両方を行う。この実施形態においては、反応を、変性ステップから開始する(PCRでは一般的である)のではなく、レポーター核酸分子が生成される伸長ステップから開始する。その後、レポーター分子の変性から始まる通常のPCRを行って、レポーター核酸分子を増幅する。上記詳述したように、PCRは、レポーター核酸分子の末端にある共通配列に結合する共通プライマーを用いて行われ、プライマーのうちの1つは、配列決定アダプターを含む。あるいは、PCRは、上記詳述したように、一度の試行でレポーター核酸分子の各末端に配列決定アダプターを付加するために、いずれもが配列決定アダプターを含むプライマーを用いて行われてもよい。
使用可能な異なるレポーター核酸バーコード配列よりも多い分析物を、試料中で検出することが望まれる場合がある。この場合、近接プローブの複数のパネル(すなわち、少なくとも2つのパネル)が用いられ得る。各パネルは、異なる近接プローブ対のセットを含む。すなわち、各パネルの近接プローブ対は、異なる分析物セットに結合する。通常、各パネルの近接プローブ対は、完全に異なる分析物セットに結合する。すなわち、異なるパネルの近接プローブ対が結合する分析物は、重複しない。よって、近接プローブの各パネルは、異なる分析物グループを検出するためのものである。
上述の通り、近接プローブの各パネルは、異なる近接プローブ対のセットを含む。個々のパネルそれぞれにおいて、各プローブは、異なる核酸ドメインを含む(すなわち、各プローブは、異なる配列を有する核酸ドメインを含む)。よって、各プローブ対は、異なる核酸ドメイン対を含み、そのため、パネル内の各プローブ対毎に、固有のレポーター核酸分子が生成される。しかしながら、異なるパネルそれぞれにおいて、プローブ対に同じ核酸ドメイン(および、通常は同じ核酸ドメイン対合)が用いられる。すなわち、異なるパネルにおいて、プローブ対は、同じ核酸ドメイン対を含む。これは、各パネルにおいて、同じレポーター核酸分子が生成されることを意味する。しかしながら、レポーター核酸分子は、異なるプローブ対を用いて各パネルによって生成されるので、同じレポーター核酸分子は、プローブの各パネルにおいて異なる分析物が存在していることを示す。
プローブの各パネルによって同じレポーター核酸分子が生成されるので、プローブの各パネルを用いる多重検出アッセイには、別個の試料アリコートを準備しなければならない。すなわち、多重検出アッセイは、プローブの各パネルを用いて行われ、異なるプローブのパネルを用いる多重検出アッセイは、試料の異なるアリコートにおいて行われる。単一のプローブパネルに関して上記詳述したように、プローブの各パネルに対して、複数の試料アリコートが異なる希釈率で準備され、各パネルの異なる分析物サブセットが、各アリコートにおいて検出される。上記詳述したように、各アリコートにおいて検出される分析物のサブセットは、試料における予測濃度に基づいて決定される。
プローブの各パネルによって同じレポーター核酸分子が生成されるので、プローブの各パネルを用いる多重検出アッセイには、別個の試料アリコートを準備しなければならない。すなわち、多重検出アッセイは、プローブの各パネルを用いて行われ、異なるプローブのパネルを用いる多重検出アッセイは、試料の異なるアリコートにおいて行われる。単一のプローブパネルに関して上記詳述したように、プローブの各パネルに対して、複数の試料アリコートが異なる希釈率で準備され、各パネルの異なる分析物サブセットが、各アリコートにおいて検出される。上記詳述したように、各アリコートにおいて検出される分析物のサブセットは、試料における予測濃度に基づいて決定される。
別個のプローブパネルそれぞれを用いて生成されたレポーター核酸分子は、処理されて(すなわち、増幅され、場合によっては配列決定アダプターで標識されるなど)、上記詳述したように検出される。特定の実施形態において、上記詳述したように、レポーター核酸分子はPCRによって増幅され、配列決定アダプターがレポーター核酸分子の両端に付加され、試料インデックスが各レポーター核酸分子に付加される。この実施形態において、上述したように、各アリコートにおいて別個に第1のPCRを行い、レポーター核酸分子を増幅し、レポーター核酸分子の一方の末端に第1の配列決定アダプターを付加することが好ましい。その後、上述したように、特定のプローブパネルを用いて生成された各試料からの増幅レポーター核酸分子をプールし、複数の第1のプールを別個に生成する。別個の第1のプールのそれぞれは、特定のプローブパネルを用いて分析された特定の試料のすべてのアリコートで行った第1のPCR増幅の産物を含む。
その後、別個の第1のプールのそれぞれで第2のPCR増幅を行い、第2の配列決定アダプターおよび試料インデックスを各レポーター核酸分子に付加する。第2のPCRの後、同じプローブパネルを用いて異なる試料から生成されたPCR産物自体を、パネルプールとして知られる、第2のプールにプールする。各第1のプール全体を合わせてパネルプールとしてもよいし、各第1のプールの一部のみを合わせてもよい。よって、各パネルプールは、分析された試料すべてから特定のプローブパネルを用いて生成されたレポーター核酸分子を含む。
その後、配列決定アダプターおよび試料インデックスを含む、増幅されたレポーター核酸分子を、上述したように配列決定する。各パネルプールは、別個に配列決定される。これは、上述の通り、各プローブパネルにおいて同じレポーター核酸分子が生成されるが、これらのレポーター核酸分子は、各プローブパネルにおいて異なる分析物を示すからである。異なるプローブパネルを用いて生成され、よって異なる分析物を示す同一のレポーター核酸分子を、配列レベルで区別することは不可能である。したがって、この実施形態においては、各パネルプールを別個に配列決定することが必須である。
本方法の別の実施形態において、一方のPCR増幅の際に、レポーター核酸分子にパネルインデックス配列が付加される。特定の近接プローブパネルを用いて生成されたすべてのレポーター核酸分子を(すべての試料にわたって)同定するために、同じパネルインデックス配列が用いられる。パネルインデックスおよび試料インデックスを組み合わせると、検出アッセイに用いられたすべてのプローブのパネルにわたって、各試料にどの分析物が存在しているのかを正確に同定することが可能になる。したがって、各レポーター核酸分子に、パネルインデックスおよび試料インデックスの両方が付加されると、すべての試料およびプローブパネルにわたって、検出アッセイで生成されたすべてのPCR産物をプールして一緒に配列決定することができる。
あるいは、各プローブパネルを用いて生成されたレポーター核酸分子を、異なる試料インデックスを用いて標識してもよい。用いられた各試料インデックスが、特定の試料に対して固有のものとなるように、異なる試料それぞれに対して、異なる試料インデックス配列を選択して用いる。しかしながら、所与の試料のいずれにおいても、異なるプローブパネルそれぞれを用いて生成されたレポーター核酸分子が、異なる試料インデックスで標識される。よって、この実施形態において、試料インデックスは、各レポーター核酸分子毎に、試料およびプローブパネルの両方を同定するという2つの機能を果たす。よって、レポーター核酸分子に存在する特定の試料インデックスは、そのレポーターを特定のプローブパネルと結びつけ、レポーター核酸分子の試料インデックスおよびバーコード配列の組み合わせが、件のレポーター核酸分子の生成へとつながった分析物を同定するように機能する。
本方法のさらなる実施形態においては、上記詳述したように、各プローブパネルにおいて、同じ核酸ドメインがプローブに用いられる。しかしながら、各パネルが異なるレポーター核酸分子を生成するように、各パネルには異なる核酸ドメイン対が含まれる。上述の通り、各プローブの核酸ドメインは、固有のバーコード配列を含む。各パネルにおいて異なるように核酸ドメインを対にすることによって、検出アッセイで生成されるレポーター核酸分子において、異なる組み合わせのバーコード配列が対になる。これは、パネル毎に異なるレポーター核酸分子が生成されるということを意味する。この方法は、各プローブパネルによって異なるレポーター核酸分子が生成されることから、パネルインデックス配列を全く必要とせずに、配列レベルでこれらを区別することができるという利点を有する。この実施形態においては、上記詳述したように、各試料からのPCR産物がすべてプールされ、試料インデックスが付加され、その後、すべての試料およびプローブパネルからのインデックス付きPCR産物のすべてが、合わせて単一のプールとされ、配列決定される。
上述の通り、この実施形態の利点は、すべての試料およびパネルからのレポーター核酸分子のすべてをプールして、各パネルに由来するのはどのレポーター核酸分子なのかを同定するためのパネルインデックスを必要とすることなく、これらを一緒に配列決定することができるということである。しかしながら、各パネルによって同じレポーター核酸分子が生成されるように、同じ核酸ドメイン対を有するプローブ対を各パネルに対して用いることの利点は、対ではない2つの核酸分子がハイブリダイズした結果生じるどのような核酸分子も、非特異的バックグラウンドとして同定することができるということである。各プローブパネルによって異なるレポーター核酸分子が生成される場合には、生成された核酸分子のどれがバックグラウンドであるかを正確に決定することは、もはや不可能である。
上述の通り、第2の態様において、本発明は、試料中の分析物を検出する方法であって、分析物に特異的なレポーター核酸分子を検出することで分析物が検出される、方法を提供し、当該方法は、レポーター核酸分子のPCR産物を生成するためのPCR反応を行うことと、PCR産物を検出することと、を含み、
PCR反応用に内部コントロールが準備され、当該内部コントロールは、
(i)所定の量で存在し、かつ、レポーター核酸分子と同じプライマーによって増幅されるコントロール核酸分子である、またはこのような核酸分子を含んでいる、またはこのような核酸分子を生成させる、別個の成分、ならびに/あるいは、
(ii)各レポーター核酸分子に存在する、各分子特有の固有分子識別子(UMI)配列、である。
PCR反応用に内部コントロールが準備され、当該内部コントロールは、
(i)所定の量で存在し、かつ、レポーター核酸分子と同じプライマーによって増幅されるコントロール核酸分子である、またはこのような核酸分子を含んでいる、またはこのような核酸分子を生成させる、別個の成分、ならびに/あるいは、
(ii)各レポーター核酸分子に存在する、各分子特有の固有分子識別子(UMI)配列、である。
この本発明の第2の態様の詳細は、すべて、第1の態様と同じであってもよい(例えば、分析物、試料、レポーター核酸分子およびこれを生成するのに用いられる技術、レポーター核酸分子の検出など)。
この第2の態様において、内部コントロールは、レポーター核酸分子のPCR産物を生成するために行うPCRに存在する成分または配列である。上述の通り、内部コントロールは、所定の量で存在し、かつ、レポーター核酸分子と同じプライマーによって増幅されるコントロール核酸分子である、またはこのような核酸分子を含んでいる、またはこのような核酸分子を生成させる、別個の成分であってもよい。
内部コントロールが、所定の量で反応中に存在する別個の成分である場合、内部コントロールは、上述したように、特に、コントロール分析物であってもよいし、伸長コントロールであってもよいし、検出コントロールであってもよい。上記詳述したように、コントロール分析物は、試料に添加され、コントロール分析物に特異的なコントロールレポーター核酸分子を検出することによって検出される、分析物である。
本発明の第2の態様の方法において、分析物は、好ましくは、例えば上記詳述したPEAまたはPLA、最も好ましくはPEAにおいて近接プローブを用いて検出される。よって、コントロール分析物を内部コントロールとして用いる場合、コントロール分析物を検出するための近接プローブが含まれなければならない。コントロール特異的な近接プローブがコントロール分析物に結合することで、コントロールレポーター核酸分子が生成される。
上記したように、伸長コントロールが用いられてもよい。上記詳述したように、伸長コントロールは、単一のコントロールプローブであり、PEAの伸長段階の際にコントロールレポーター核酸分子を生成する。
一般的に言えば、内部コントロールは、一分子であっても、複数の分子であってもよく、試料に添加されて、後にPCR反応で増幅されるコントロールレポーター核酸分子を生成させるものである。
また、上記したように、検出コントロールが用いられてもよい。上記詳述したように、検出コントロールは、試料に添加されてPCR反応で増幅される、コントロールレポーター核酸分子である。検出コントロールは、分析物の存在に応答して生成されるレポーター核酸分子と同じ全体構造を有する二重鎖DNA分子である。本発明の第1の態様と同様、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールのすべてが、本方法において用いられることが好ましい。特定の実施形態において、2種類の内部コントロールが用いられてもよく、そのための選択肢が上述されている。
上記詳述したように、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールのすべてが、コントロールレポーター核酸分子を生成させる、またはコントロールレポーター核酸分子である。本発明の特定の実施形態において、コントロールレポーター核酸分子は、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列である配列を有する。とりわけ、コントロールレポーター核酸分子は、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列を有するが、逆相補的配列を有するものではない。コントロールレポーター核酸分子は、単に、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列を有するだけであるので、コントロールレポーター核酸分子が件のレポーター核酸分子にハイブリダイズすることはできない。これによって、コントロールレポーター核酸分子と、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子との間の、不要なハイブリダイズ相互作用を防止しつつ、コントロールレポーター核酸分子と、分析物の検出に応答して生成される逆配列レポーター核酸分子との間の類似性を最大レベルで維持することが可能になり、これはPCR増幅における利点である。分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列である配列を有するコントロールレポーター核酸分子は、好ましくは、本発明の第1の態様の方法においても用いられる。
上記した通り、本発明のこの態様の方法は、内部コントロールとして、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールを用いることが好ましい。これらの3つのコントロールが一緒に機能するためには、コントロールによって生成/提供されるコントロールレポーター核酸分子が、互いに区別可能でなければならない、すなわち、すべて異なる配列を有さなければならない、ということは明らかである。本発明の方法で用いられるコントロールレポーター核酸分子は、それぞれ、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列を有することが好ましい。この場合、明らかに、コントロールレポーター核酸分子は、それぞれ、分析物の検出に応答して生成される異なるレポーター核酸分子の逆配列を有する。
あるいは、内部コントロールは、増幅反応の別個の成分ではなく、各レポーター核酸分子に存在する固有分子識別子(UMI)配列であってもよく、これは、各分子に固有のものである。このことは、分析物の検出の際に生成される個々のレポーター核酸分子それぞれが、UMI配列を含むということを意味する。より具体的には、個々のレポーター核酸分子それぞれが、異なるUMIを有するということが理解されるであろう。UMIは、分析物を検出または同定するための手段としてレポーター核酸分子に存在する、例えばバーコードなどのいかなる配列にも付加される。上記詳述したように、分析物は、本発明の第2の態様の方法にしたがって、近接伸長アッセイにより検出されることが好ましい。PEAについては、これに用いられ得るプローブを含めて、上述されている。詳述したように、分析物は、それぞれが分析物に結合する、近接プローブ対を用いて検出される。プローブ対のプローブは、両方が、プローブが認識する分析物に特異的なバーコード配列を含む核酸ドメインを含んでいる。
通常、PEAを行う場合、検出対象となる各分析物に対する複数の同一プローブ対が、試料に適用される。「同一の」プローブ対とは、標的分析物に結合する各同一プローブ対が、その分析物が試料中に存在することを示す、同一のレポーター核酸分子を生成させるように、複数のプローブ対のすべてが、同じ分析物結合分子対および同じ核酸ドメイン対を含むことを意味する。
UMI配列を内部コントロールとして利用する場合、特定の分析物それぞれを検出するのに用いられるプローブは、同一ではない。特定の分析物結合分子対が用いられる一方、個々のプローブのそれぞれ、すなわち、少なくとも、対になっている2つの分析物結合分子のうちの特定の1つを含む個々のプローブのそれぞれは、異なる、固有の核酸ドメインを含む。各核酸ドメインは、その内部にUMI配列が存在することで、固有のものとなる。このことは、特定の分析物分子に結合する特異的プローブ対のそれぞれが、固有のレポーター核酸分子を生成させるということを意味する。近接プローブ対が結合した個々の分析物分子毎に、固有のレポーター核酸分子が生成される。これによって、試料中に存在する分析物量の絶対的定量が可能となる。何故なら、特定の分析物に対して生成された固有のレポーター核酸分子の数に基づいて、検出された分析物分子の正確な数を数えることができるからである。
定量を可能にするだけでなく、検出アッセイにおいて生成されるレポーター核酸分子の数を逆算できるようにすることにより、測定値の解像度を向上させるので、UMIが好都合な場合がある。UMIは、レポーター核酸分子(例えば、PEAの伸長産物)が何回増幅されたかを確認することを可能にする。したがって、同じ分析物に対するレポーター分子のためのUMIレベルの差異を検出することができる。例えば、同じ分析物に対する個々のレポーター核酸分子のそれぞれは、バーコード配列は同じであるが、UMIは異なっていてもよい。異なるUMIレベルの差異を検出することによって、PCR反応において起こり得るあらゆるバイアスを検出し、その理由を説明することができる。
解像度の改善は、コントロール核酸分子においても有用または有益な場合がある。したがって、UMIは、代替として、または追加として、コントロール核酸分子に含まれてもよい。よって、UMIは、例えば、上述したような検出コントロール分子である、個々のコントロールレポーター核酸分子のそれぞれに、付加されているという意味において、含まれてもよい(個別のコントロール核酸分子のそれぞれは、異なるUMIを有していることが理解されるであろう)。あるいは、UMIが、生成されるコントロールレポーター核酸分子に含まれるように、例えば、伸長コントロールまたはコントロール分析物など、異なるICコントロール様式毎にUMIを適宜含ませることができる。例えば、UMIは、伸長反応の鋳型として働く伸長コントロールの核酸ドメインの核酸配列内に含まれていてもよいし、伸長反応のプライマーとして働くドメインの一部の配列に含まれていてもよい。類似的に、コントロール分析物の場合、UMIは、コントロールレポーター核酸に取り込まれるように、コントロール分析物を検出するのに用いられる近接プローブの核酸ドメインのうちの一方または両方に含まれていてもよい。
UMIがコントロール核酸に含まれている場合には、それらを用いて、正規化の解像度を向上させることができる。例えば、UMIによって、上述したように、あらゆるPCRバイアスを説明することが可能になる。これによって、非常に厳密な値を正規化に用いることが可能になる場合がある。よって、データの品質の向上または保証のためのツールとしてUMIを用いてもよい。
例示的な一実施形態において、コントロールレポーター核酸分子は、分析物の検出に応答して生成されるレポーター核酸分子の逆配列である配列と、UMIと、を含む。
UMI配列は、本発明の第1の態様の方法で用いられる近接プローブに用いられてもよい。
本発明の第2の態様の方法は、同じ試料中の複数の分析物の検出に適用されてもよい(実際に、これが好ましい)。上記詳述したように、複数の検出アッセイにおいて、複数の分析物が検出されてもよい。分析物に特異的なレポーター核酸分子の検出に基づいて、異なる分析物のそれぞれを検出する。上記詳述したように、異なる分析物のそれぞれに対するレポーター核酸は、固有のバーコード配列を有し、分析物に対する特異性を付与するが、同じプライマーを用いて単一のPCRですべてのレポーター核酸分子を増幅できるように、すべてのレポーター核酸が共通のプライマー結合部位を含むことが好ましい。レポーター核酸分子のPCR増幅は、上記詳述したように、少なくとも1つ(すなわち、1つまたは2つ)の配列決定アダプターをレポーター核酸分子の末端に付加することを含んでいてもよい。
上記詳述したように、同じ試料中の複数の分析物を検出する場合、試料中の分析物の予測存在量に基づき、試料の異なるアリコートにおいて、上記詳述したように、異なる分析物のサブセットを検出してもよい。この実施形態において、各アリコートに対して別個にPCRを行う。上記詳述したように、その後、PCR産物をプールしてもよい。
本発明の第2の態様の方法は、複数の試料中の一分析物を検出するために用いられてもよいし、複数の分析物を検出するために用いられてもよい。この実施形態においては、別個にPCRを行って、各試料から生成されるレポーター核酸分子を増幅する。各試料の別個のアリコートにおいて、異なる分析物サブセットを検出する場合、各試料の別個のアリコートに対して、別個にPCRを行う。同じプライマーを用いて、すべての試料中のすべての分析物に対して生成されたレポーター核酸分子を増幅する。
複数の異なる試料および/または複数の異なる試料アリコートに対して、複数のPCR増幅を別個に行う場合、内部コントロールがPCRミックスに存在する別個の成分であるときは、その成分は、上述したように、アリコートの希釈率に比例する濃度で、各アリコート中に存在する。希釈率が異なるアリコート間において、内部コントロールの濃度が異なる一方、異なる試料からの、希釈率が同じアリコートでは、内部コントロールの濃度は同じである(本発明の第1の態様においても同様である)。これによって、上記詳述したように、各試料/アリコート中に存在する各分析物の相対量を比較することが可能になる。
本発明の第2の態様の方法において、PCR反応は、飽和状態まで行われることが好ましい。PCR反応の飽和状態については、上述している。これは、上述したように、各試料の複数のアリコートに対して検出アッセイを行ない、分析物のサブセットを各アリコートにおいて検出しつつ、1つ以上の試料において存在量のレベルが異なる複数の分析物を検出するのに本方法を用いる場合に、特に好都合である。PCRを飽和状態まで行うことと、内部コントロールとしてPCRミックスの別個の成分を用いることとを組み合わせることは、本発明の特に好ましい実施形態である。上記詳述したように、PCRを飽和状態まで行うことによって、異なる試料アリコート間におけるレポーター核酸分子の濃度の違いを除くことができる。飽和状態に達すると、各反応において存在するレポーター核酸分子の全体濃度は、本質的に同じになる。反応中に内部コントロールを含むことによって、異なるアリコートまたは異なる試料において検出された分析物の相対レベルの比較が、確実にできるようになる。
上述の通り、本発明の第2の態様においては、分析物特異的なプローブを用いて、1つ以上の分析物を検出することが特に好ましい。分析物の検出にこのようなプローブを用いる場合、内部コントロールは(PCR混合物の別個の成分であれば)、通常、プローブを試料に添加する前、またはプローブを試料に添加するのと同時に、試料に添加される。あるいは、上記のように、内部コントロールは、各プローブ内に存在するUMI配列を構成するものであってもよい。
好ましくは、各分析物に特異的なレポーター核酸分子を生成する近接アッセイ(例えば、PEAまたはPLA、特に、PEA)によって、1つ以上の分析物を検出する。この実施形態においては、少なくとも伸長コントロールが含まれることが好ましい。上述の通り、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールのすべてが含まれることが最も好ましい。
好ましくは、各分析物に特異的なレポーター核酸分子を生成する近接アッセイ(例えば、PEAまたはPLA、特に、PEA)によって、1つ以上の分析物を検出する。この実施形態においては、少なくとも伸長コントロールが含まれることが好ましい。上述の通り、コントロール分析物、伸長コントロール、および検出コントロールのすべてが含まれることが最も好ましい。
本発明の第2の態様の好ましい実施形態において、本方法は、試料中の、当該試料における存在量のレベルが異なる複数の分析物を検出するためのものであって、当該方法は、
(i)前記試料から複数のアリコートを準備することと、
(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことで、各アリコートにおいて分析物のサブセットを検出することと、を含み、各サブセットの分析物は、試料における予測存在量に基づいて選択され、
各アリコートは、少なくとも1つの内部コントロールを含む。
(i)前記試料から複数のアリコートを準備することと、
(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことで、各アリコートにおいて分析物のサブセットを検出することと、を含み、各サブセットの分析物は、試料における予測存在量に基づいて選択され、
各アリコートは、少なくとも1つの内部コントロールを含む。
この実施形態のすべての部分は、本発明の第1の態様に関して上記定義された通りであってもよい。内部コントロールは、上記定義されたどのような内部コントロールであってもよい。
上述の通り、元の試料に対する希釈率が異なる複数のアリコートにおいて、分析物サブセットを検出する場合、異なる量の内部コントロールを添加する。各アリコートに添加される内部コントロールの量は、そのアリコートで検出される分析物サブセットの予測存在量によって決定される。上記詳述したように、このことは、実際には、各アリコートで用いられる内部コントロールの量は、アリコートの希釈率に比例するということを意味する。
本発明の第2の態様の方法で生成されるレポーター核酸分子(すなわち、より正確には、レポーター核酸分子の増幅の結果得られるPCR産物)は、DNA配列決定によって検出されることが好ましい。最も好ましくは、上述したように、超並列DNA配列決定法が用いられる。
本発明の第3の態様は、試料中の分析物を検出する方法であって、分析物に対するレポーター核酸分子を検出することで分析物が検出される、方法を提供し、当該方法は、レポーター核酸分子のPCR産物を生成するためのPCR反応を行うことと、当該PCR産物を検出することと、を含み、内部コントロールがPCR反応に含まれ、当該内部コントロールは、所定の量で存在し、かつ、コントロール核酸分子であり、またはコントロール核酸分子を含み、またはコントロール核酸分子を生成させ、コントロール核酸分子は、レポーター核酸分子の逆配列である配列を含む。
本発明の第3の態様のすべての特徴は、本発明の第1の態様および/または第2の態様に関連して述べた通りであってもよい。
本発明は、以下の限定しない実施例および図面を参照することで、さらに理解され得る。
実施例1-例示的な実験プロトコル
ステップ1-試料の調製およびインキュベーション
48個から96個の血漿試料のそれぞれからの16個のアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートで、最大16個の近接プローブプール(4つの384プローブ対パネルのそれぞれについて、4つの存在量別ブロック)のそれぞれとインキュベートする。
・前もっての希釈を必要とするアッセイを含むプローブプールに対して、試料を1:10、1:100、1:1000、および1:2000に前もって希釈しておいてもよい。
・希釈および血漿試料のインキュベーション溶液への分注は、手動で行うこともできるし、または、分注ロボット、例えばラボテック社のモスキート(登録商標)HTSなどによって行うこともできる。インキュベーション溶液は、プレートのウエルに分注される。
・各ウエルの底において、3μlのインキュベーションミックスに1μlの試料を添加し、プレートを接着フィルムで密封して、室温、400×gで1分間回転させ、4℃で一晩インキュベートする。
・上記の分注ロボットを用いる場合には、試料の体積を0.2μlに、インキュベーションミックスの体積を0.6μlに減らしてもよい(5分の1)。
ステップ1-試料の調製およびインキュベーション
48個から96個の血漿試料のそれぞれからの16個のアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートで、最大16個の近接プローブプール(4つの384プローブ対パネルのそれぞれについて、4つの存在量別ブロック)のそれぞれとインキュベートする。
・前もっての希釈を必要とするアッセイを含むプローブプールに対して、試料を1:10、1:100、1:1000、および1:2000に前もって希釈しておいてもよい。
・希釈および血漿試料のインキュベーション溶液への分注は、手動で行うこともできるし、または、分注ロボット、例えばラボテック社のモスキート(登録商標)HTSなどによって行うこともできる。インキュベーション溶液は、プレートのウエルに分注される。
・各ウエルの底において、3μlのインキュベーションミックスに1μlの試料を添加し、プレートを接着フィルムで密封して、室温、400×gで1分間回転させ、4℃で一晩インキュベートする。
・上記の分注ロボットを用いる場合には、試料の体積を0.2μlに、インキュベーションミックスの体積を0.6μlに減らしてもよい(5分の1)。
ステップ2-近接伸長およびPCR1増幅
PwoDNAポリメラーゼを用いて、伸長および増幅を行う。すべての伸長産物の増幅のために共通のプライマーを用いてPCR1を行う。
インキュベーションプレート(ステップ1より)を室温にし、400×gで1分間遠心分離する。伸長ミックス(超純水、DMSO、PwoDNAポリメラーゼ、およびPCR1溶液を含む)をプレートに添加してから、プレートを密封し、軽くボルテックスして、400×gで1分間遠心分離する。その後、PEA反応および前増幅(50℃で20分、95℃で5分、(95℃で30秒、54℃で1分、60℃で1分)×25サイクル、10℃で保持)のためにサーマルサイクラーに載置する。好ましくは、分注ロボット、例えば、サーモ・サイエンティフィック(商標)マルチドロップ(商標)コンビ・リージェント・ディスペンサーなどを用いて、プレートに伸長ミックスを分注してもよい。フォワード共通プライマーは、イルミナP5配列決定アダプター配列(配列番号1)を含む。
PwoDNAポリメラーゼを用いて、伸長および増幅を行う。すべての伸長産物の増幅のために共通のプライマーを用いてPCR1を行う。
インキュベーションプレート(ステップ1より)を室温にし、400×gで1分間遠心分離する。伸長ミックス(超純水、DMSO、PwoDNAポリメラーゼ、およびPCR1溶液を含む)をプレートに添加してから、プレートを密封し、軽くボルテックスして、400×gで1分間遠心分離する。その後、PEA反応および前増幅(50℃で20分、95℃で5分、(95℃で30秒、54℃で1分、60℃で1分)×25サイクル、10℃で保持)のためにサーマルサイクラーに載置する。好ましくは、分注ロボット、例えば、サーモ・サイエンティフィック(商標)マルチドロップ(商標)コンビ・リージェント・ディスペンサーなどを用いて、プレートに伸長ミックスを分注してもよい。フォワード共通プライマーは、イルミナP5配列決定アダプター配列(配列番号1)を含む。
ステップ3-存在量別ブロックのプール
384プローブ対パネル由来の4つの存在量別ブロックのそれぞれから得たPCR1産物を、一緒にプールする。これによって、384プローブ対パネル毎に、一試料当たり最大4つのPCR1プールが得られる。
各ブロックから異なる量を取り出して、ブロック間のアッセイの相対レベルを揃えることができる。PCR1産物は、手動でプールすることもできるし、分注ロボットによってプールすることも出来る。
384プローブ対パネル由来の4つの存在量別ブロックのそれぞれから得たPCR1産物を、一緒にプールする。これによって、384プローブ対パネル毎に、一試料当たり最大4つのPCR1プールが得られる。
各ブロックから異なる量を取り出して、ブロック間のアッセイの相対レベルを揃えることができる。PCR1産物は、手動でプールすることもできるし、分注ロボットによってプールすることも出来る。
ステップ4-PCR2インデックス付加
48個から96個のリバースプライマーを含むプライマープレートを用意する(通常、96ウエルプレートの各ウエルに1つのプライマー)。各リバースプライマーは、「イルミナP7」配列決定アダプター配列(配列番号2)と、試料インデックスバーコードとを含む。異なる試料それぞれからのPCR1産物に対して、固有のバーコード配列を用いる。好ましくは、同じ血漿試料(384プローブ対パネル毎)を含む最大4つのPCR1プールのそれぞれは、同定およびデータ処理を容易にするために、同じ試料インデックスを付加される。「イルミナP5」配列決定アダプター配列を含むフォワード共通プライマー(PCR1で用いるのと同じフォワードプライマー)を、PCR2溶液に加える。
フォワード共通プライマー、プライマープレートからの単一のリバース(試料インデックス)プライマー、およびDNAポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼまたはPwoDNAポリメラーゼ)を含有するPCR2溶液に、各PCR1プールを接触させる。プライマーが枯渇するまで、PCRによって増幅を行う(95℃で3分、(95℃で30秒、68℃で1分)×10サイクル、10℃で保持)。
プールされたPCR1産物の理論上の最終濃度は、1μMである(すべてのプライマーを使用)。PCR2のために、PCR1のアンプリコンを1:20で希釈し、各PCR2反応における開始濃度を50nMとする。各PCR2プライマーの濃度は、500nMである。このため、PCR2プライマーは、3.3サイクル(10倍増幅)後に枯渇するはずである。
48個から96個のリバースプライマーを含むプライマープレートを用意する(通常、96ウエルプレートの各ウエルに1つのプライマー)。各リバースプライマーは、「イルミナP7」配列決定アダプター配列(配列番号2)と、試料インデックスバーコードとを含む。異なる試料それぞれからのPCR1産物に対して、固有のバーコード配列を用いる。好ましくは、同じ血漿試料(384プローブ対パネル毎)を含む最大4つのPCR1プールのそれぞれは、同定およびデータ処理を容易にするために、同じ試料インデックスを付加される。「イルミナP5」配列決定アダプター配列を含むフォワード共通プライマー(PCR1で用いるのと同じフォワードプライマー)を、PCR2溶液に加える。
フォワード共通プライマー、プライマープレートからの単一のリバース(試料インデックス)プライマー、およびDNAポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼまたはPwoDNAポリメラーゼ)を含有するPCR2溶液に、各PCR1プールを接触させる。プライマーが枯渇するまで、PCRによって増幅を行う(95℃で3分、(95℃で30秒、68℃で1分)×10サイクル、10℃で保持)。
プールされたPCR1産物の理論上の最終濃度は、1μMである(すべてのプライマーを使用)。PCR2のために、PCR1のアンプリコンを1:20で希釈し、各PCR2反応における開始濃度を50nMとする。各PCR2プライマーの濃度は、500nMである。このため、PCR2プライマーは、3.3サイクル(10倍増幅)後に枯渇するはずである。
ステップ5-最終プール
同じ384プローブ対パネルに属する48個から96個のインデックス付き試料プールのすべてを、各試料から同量を加えて、一緒にプールする。これによって、384プローブ対パネル毎に、最大4つのプール(すなわち、ライブラリ)が得られる。
同じ384プローブ対パネルに属する48個から96個のインデックス付き試料プールのすべてを、各試料から同量を加えて、一緒にプールする。これによって、384プローブ対パネル毎に、最大4つのプール(すなわち、ライブラリ)が得られる。
ステップ6-精製および定量(任意)
磁気ビーズを用いて別個にライブラリを精製し、精製されたライブラリの総DNA濃度を、DNA検量線を用いてqPCRで決定する。より長いDNA断片に優先的に結合するAMPureXPビーズ(ベックマン・コールター、米国)を、製造者のプロトコルにしたがって用いてもよい。AMPureXPビーズは、長いPCR産物に結合するが、短いプライマーには結合しない。よって、残っているプライマーからPCR産物を精製することが可能になる。
PCR2プライマーが枯渇するということは、この精製ステップが必要ではない場合があるということを意味する。
磁気ビーズを用いて別個にライブラリを精製し、精製されたライブラリの総DNA濃度を、DNA検量線を用いてqPCRで決定する。より長いDNA断片に優先的に結合するAMPureXPビーズ(ベックマン・コールター、米国)を、製造者のプロトコルにしたがって用いてもよい。AMPureXPビーズは、長いPCR産物に結合するが、短いプライマーには結合しない。よって、残っているプライマーからPCR産物を精製することが可能になる。
PCR2プライマーが枯渇するということは、この精製ステップが必要ではない場合があるということを意味する。
ステップ7-品質管理(任意)
各(精製済)ライブラリの小アリコートを、DNA増幅の成功を確認するために、アジレント・バイオアナライザー(アジレント、米国)で製造者の説明書にしたがって解析する。
各(精製済)ライブラリの小アリコートを、DNA増幅の成功を確認するために、アジレント・バイオアナライザー(アジレント、米国)で製造者の説明書にしたがって解析する。
ステップ8-配列決定
イルミナプラットフォーム(例えば、ノブセク(NoveSeq)プラットフォーム)を用いて、ライブラリの配列決定を行う。最大4つのライブラリ(384プローブ対パネルのそれぞれから得た)のそれぞれを、フローセルの別個の「レーン」で流す。用いられるフローセルおよびシークエンサーのサイズおよびモデルに応じて、最大4つのライブラリは、並行して配列決定されてもよいし、異なるフローセルにおいて順次(1つずつ)配列決定されてもよい。
イルミナプラットフォーム(例えば、ノブセク(NoveSeq)プラットフォーム)を用いて、ライブラリの配列決定を行う。最大4つのライブラリ(384プローブ対パネルのそれぞれから得た)のそれぞれを、フローセルの別個の「レーン」で流す。用いられるフローセルおよびシークエンサーのサイズおよびモデルに応じて、最大4つのライブラリは、並行して配列決定されてもよいし、異なるフローセルにおいて順次(1つずつ)配列決定されてもよい。
ステップ9-データ出力
バーコード(各レポーター核酸分子由来)および試料インデックス(試料インデックスプライマー由来)の配列をデータ中で同定し、カウントし、合計して、公知のバーコード-アッセイ-試料キーにしたがってアラインメント/標識する。
・「一致するバーコード」は、対となった2つのPEAプローブ間の相互作用を表す。カウントは、PEAにおける相互作用の数に相関する。
・各アッセイおよび試料のカウントについては、試料間で比較を行うことができるように、内部参照コントロールを用いて正規化しなければならない。
・4つの存在量別ブロックのそれぞれは、ブロック毎に特有の内部参照コントロールを有する。
384プローブ対パネルのそれぞれは、読み出されるレーンに基づいて、分離される。各パネルは、同じ96個の試料インデックスと、同じ384個のバーコードの組み合わせと、内部参照コントロールと、を含む。
バーコード(各レポーター核酸分子由来)および試料インデックス(試料インデックスプライマー由来)の配列をデータ中で同定し、カウントし、合計して、公知のバーコード-アッセイ-試料キーにしたがってアラインメント/標識する。
・「一致するバーコード」は、対となった2つのPEAプローブ間の相互作用を表す。カウントは、PEAにおける相互作用の数に相関する。
・各アッセイおよび試料のカウントについては、試料間で比較を行うことができるように、内部参照コントロールを用いて正規化しなければならない。
・4つの存在量別ブロックのそれぞれは、ブロック毎に特有の内部参照コントロールを有する。
384プローブ対パネルのそれぞれは、読み出されるレーンに基づいて、分離される。各パネルは、同じ96個の試料インデックスと、同じ384個のバーコードの組み合わせと、内部参照コントロールと、を含む。
実施例2-存在量別ブロックを用いる場合および用いない場合のPEA
多重PEAを行って(上記バージョン6で説明した構造を有する核酸ドメインに結合した抗体を含むプローブを用いる)、血漿試料中の367個のタンパク質を検出した。各プローブは、固有のバーコード配列を含有していた。367アッセイのすべてを含む近接プローブプールを試料と共にインキュベートし、比較として、血漿試料それぞれからの4つのアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートにおいて、4つの近接プローブプール(367アッセイを含む4つの存在量別ブロック)のそれぞれと共にインキュベートした。
存在量別ブロックを用いない近接プローブプールの場合にステップ3を省略した以外は、上述したようにPEAを行った。伸長産物の増幅中に、異なる試料それぞれからのレポーター核酸分子に対する固有の試料インデックスと一緒に、P5配列決定アダプターおよびP7配列決定アダプターを産物の各末端に付加し、イルミナ・ノバセク・プラットフォームを用いたリバーシブルダイターミネーター配列決定技術を採用した超並列DNA配列決定法によって、すべての伸長産物の配列決定を行った。367アッセイを含むプローブプールから得た伸長産物およびプールされた存在量別ブロックから得た合計367アッセイの伸長産物を、別個のフローセルで、別々の時間に配列決定した。
多重PEAを行って(上記バージョン6で説明した構造を有する核酸ドメインに結合した抗体を含むプローブを用いる)、血漿試料中の367個のタンパク質を検出した。各プローブは、固有のバーコード配列を含有していた。367アッセイのすべてを含む近接プローブプールを試料と共にインキュベートし、比較として、血漿試料それぞれからの4つのアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートにおいて、4つの近接プローブプール(367アッセイを含む4つの存在量別ブロック)のそれぞれと共にインキュベートした。
存在量別ブロックを用いない近接プローブプールの場合にステップ3を省略した以外は、上述したようにPEAを行った。伸長産物の増幅中に、異なる試料それぞれからのレポーター核酸分子に対する固有の試料インデックスと一緒に、P5配列決定アダプターおよびP7配列決定アダプターを産物の各末端に付加し、イルミナ・ノバセク・プラットフォームを用いたリバーシブルダイターミネーター配列決定技術を採用した超並列DNA配列決定法によって、すべての伸長産物の配列決定を行った。367アッセイを含むプローブプールから得た伸長産物およびプールされた存在量別ブロックから得た合計367アッセイの伸長産物を、別個のフローセルで、別々の時間に配列決定した。
血漿試料のうちの1つの結果を、図3および図4で見ることができる。以下の表は、同じ血漿試料において存在量別ブロックを用いた場合と用いない場合の、最大のアッセイ(カウント)と最小のアッセイ(カウント)との間の比を示す。存在量別ブロックにおける比は、367アッセイすべてのプールの比よりも有意に低く、このことは、これらのアッセイの測定値は、より適した様式でフローセル上のスペースを用いて得られる(低存在量アッセイではカウントが多く、高存在量アッセイではカウントが少なくなる)ということを意味する。
実施例3-存在量別ブロックを用いた、異なる存在量のアッセイによる試料のPEA
多重PEAを行って(上記バージョン6で説明した構造を有する核酸ドメインに結合した抗体を含むプローブを用いる)、54個の血漿試料中の372個のタンパク質を検出した。各プローブは、固有のバーコード配列を含有していた。血漿試料それぞれからの4つのアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートにおいて、4つの近接プローブプール(372アッセイを含む4つの存在量別ブロック)のそれぞれと共にインキュベートした。
上述したようにPEAを行った。伸長産物の増幅中に、異なる試料それぞれからのレポーター核酸分子に対する固有の試料インデックスと一緒に、P5配列決定アダプターおよびP7配列決定アダプターを産物の各末端に付加し、イルミナ・ノバセク・プラットフォームを用いたリバーシブルダイターミネーター配列決定技術を採用した超並列DNA配列決定法によって、すべての伸長産物の配列決定を行った。
図5の結果は、試料間でばらつきが大きいタンパク質の低域、または54個の試料のすべてにわたって比較的存在量が低いアッセイを、シグナル低下(ロバストな量、例えば100カウントを下回るカウント)のために犠牲にすることなく、存在量が広範囲にわたるタンパク質標的を試料中で検出することができるということを示す。
多重PEAを行って(上記バージョン6で説明した構造を有する核酸ドメインに結合した抗体を含むプローブを用いる)、54個の血漿試料中の372個のタンパク質を検出した。各プローブは、固有のバーコード配列を含有していた。血漿試料それぞれからの4つのアリコートを、96ウエルまたは384ウエルのインキュベーションプレートにおいて、4つの近接プローブプール(372アッセイを含む4つの存在量別ブロック)のそれぞれと共にインキュベートした。
上述したようにPEAを行った。伸長産物の増幅中に、異なる試料それぞれからのレポーター核酸分子に対する固有の試料インデックスと一緒に、P5配列決定アダプターおよびP7配列決定アダプターを産物の各末端に付加し、イルミナ・ノバセク・プラットフォームを用いたリバーシブルダイターミネーター配列決定技術を採用した超並列DNA配列決定法によって、すべての伸長産物の配列決定を行った。
図5の結果は、試料間でばらつきが大きいタンパク質の低域、または54個の試料のすべてにわたって比較的存在量が低いアッセイを、シグナル低下(ロバストな量、例えば100カウントを下回るカウント)のために犠牲にすることなく、存在量が広範囲にわたるタンパク質標的を試料中で検出することができるということを示す。
Claims (23)
- 試料中の複数の分析物を検出する方法であって、前記分析物は、当該試料において存在量のレベルが異なり、前記方法は、
(i)前記試料から複数のアリコートを準備すること、および
(ii)各アリコートに対して別個の多重アッセイを行うことによって、前記分析物の異なるサブセットを検出すること、を含み、各サブセットの前記分析物は、前記試料における予測存在量に基づいて選択される、方法。 - 前記分析物は、非核酸分析物である、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物は、タンパク質であるか、またはタンパク質を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記分析物は、各アリコートにおいて、各分析物に特異的なレポーター核酸分子を検出することによって検出される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子は、各アリコートに対して行われる前記多重検出アッセイで生成される、請求項4に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子は、PCRによって増幅され、好ましくは、核酸配列決定法によって検出される、請求項4または5に記載の方法。
- 1つ以上の配列決定用アダプターが、1つ以上の増幅ステップおよび/またはライゲーションステップで前記レポーター核酸分子に付加される、請求項6に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子に対して少なくとも第1のPCR反応を行って、少なくとも第1の核酸配列決定用アダプターを付加する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記第1のPCR反応のPCR産物に対して第2のPCR反応を行って、第2の核酸配列決定用アダプターを付加する、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも1つのPCR反応が、飽和状態まで行われる、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記別個の多重アッセイの反応産物、または、前記反応産物が核酸分子である場合にはその増幅産物をプールして、第1のプールを作成し、前記第1のプールにおいて前記反応産物または増幅産物が増幅される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重アッセイの反応産物は、レポーター核酸分子であり、前記方法は、
個別のアリコートそれぞれに対して別個に行われる第1のPCR反応において前記レポーター核酸分子を増幅して、第1のPCR産物を生成することと、個々のアリコートから前記第1のPCR産物をプールして、第1のプールを作成することと、前記第1のプールに対して第2のPCR反応を行うことと、を含む、請求項11に記載の方法。 - 前記反応産物またはその増幅産物は、異なる量で前記第1のプールに添加される、請求項11または12に記載の方法。
- 複数の異なる試料に対して、別個に並行して前記方法を行って、各試料について反応産物またはその増幅産物を生成し、各試料について別個の第1のプールが作成され、増幅反応および/またはライゲーション反応によって前記第1のプールの産物に試料インデックスが付加される、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
- 各試料について作成された前記別個の第1のプールは、第1のPCR産物を含み、前記各試料の第1のプールに対して行われる前記第2のPCR反応において、前記第1のPCR産物に試料インデックスが付加される、請求項14に記載の方法。
- 前記各試料について生成されたインデックス付き第1のプールを一緒にプールして、核酸配列決定を行うための第2のプールを作成する、請求項14または15に記載の方法。
- 前記PCR反応は、各アリコートに内部コントロールを含む、請求項6から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子は、近接プローブ検出アッセイ、特に近接伸長アッセイ(PEA)において生成される、請求項4から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子は、少なくとも1つのバーコード配列を含み、前記レポーター核酸分子の検出は、前記少なくとも1つのバーコード配列を検出すること、場合によっては試料インデックスと共に検出すること、を含み、
好ましくは、前記レポーター核酸分子は、一対の近接プローブの核酸ドメインに由来するバーコード配列の組み合わせを含み、前記レポーター核酸分子の検出は、前記バーコード配列の組み合わせの検出を含む、請求項4から16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試料は、血漿試料または血清試料である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物は、近接プローブ対を用いて検出され、各近接プローブは、
(i)分析物に特異的な分析物結合ドメインと、
(ii)核酸ドメインと、を含み、
各プローブ対のプローブの両方は、同じ分析物に特異的な分析物結合ドメインを含み、各プローブ対は、異なる分析物に特異的であり、各プローブ対は、前記一対の近接プローブが各分析物に近接結合すると、前記近接プローブの核酸ドメインが相互作用してレポーター核酸分子を生成するように設計されており、
少なくとも2つの近接プローブ対パネルが用いられ、各パネルは、分析物の異なるグループを検出するためのものであり、前記グループ内の前記分析物の異なるサブセットを検出するために、前記試料の別個のアリコートが各パネルに対して準備され、
(a)各パネルにおいて、それぞれのプローブ対は、異なる核酸ドメイン対を含み、(b)異なるパネルにおいて、前記プローブ対は、同じ核酸ドメイン対を含む、請求項18から請求項20のいずれか一項に記載の方法。 - 異なる試料からの分析物を検出するための方法であって、各試料について生成された前記レポーター核酸分子の増幅によって生成された前記PCR産物に、試料インデックスが付加され、
同じ近接プローブ対パネルを用いて異なる試料のそれぞれから生成された前記PCR産物は、核酸配列決定用パネルプールにプールされ、各パネルを用いて生成された前記PCR産物は、別個のパネルプールにプールされ、
各パネルプールは、別個に配列決定される、請求項21に記載の方法。 - 前記核酸配列決定法が、超並列DNA配列決定法である、請求項7から22のいずれか一項に記載の方法。
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