JP2003524184A - 血液凝固測定用の電気化学センサー、対応する血液凝固測定システム、および血液凝固測定方法 - Google Patents

血液凝固測定用の電気化学センサー、対応する血液凝固測定システム、および血液凝固測定方法

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JP2003524184A JP2001562186A JP2001562186A JP2003524184A JP 2003524184 A JP2003524184 A JP 2003524184A JP 2001562186 A JP2001562186 A JP 2001562186A JP 2001562186 A JP2001562186 A JP 2001562186A JP 2003524184 A JP2003524184 A JP 2003524184A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、血液凝固を測定するための、固相化学分析に基づく電気化学センサーに関する。本発明のセンサーは、乾燥試薬のほかに、不活性支持体上に少なくとも２個の電極を含む。本発明は、試薬が、カルボキシル末端でアミド結合によりフェニレンジアミン残基に結合しておりかつトロンビンにより切り離されるペプチド残基を含むトロンビン基質を含有する点に特徴がある。本発明はまた、１個の上記センサーおよび通常の測定機器を含む血液凝固測定システムに関する。本発明はさらに、本発明のセンサーを用いる血液凝固測定方法、並びに、カルボキシル末端でアミド結合によりフェニレンジアミン残基に結合しておりかつトロンビンにより切り離されるペプチド残基を含むトロンビン基質を含有する血液凝固測定用の試薬にも関する。上記試薬は、染料オキシドレダクターゼ（例えば、グルコース染料オキシドレダクターゼ）をさらに含む点に特徴がある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、不活性支持体上に少なくとも２個の電極を有し、かつ乾燥試薬を含
む、血液凝固を測定するための固相化学分析に基づくセンサーに関する。本発明
はさらに、電気化学センサーおよび電流測定機器を含む血液凝固測定システムに
関する。また、本発明は、電気化学センサーを用いて血液凝固を測定する方法に
関する。
【０００２】 EP-B 0 441 222は、アナライト（測定対象物質）またはオキシドレダクターゼ
の電気化学的測定のための方法ならびにセンサー電極システムを開示している。
この特許明細書には、電極上での測定すべきアナライトのレドックス反応におい
て電子担体として働く被還元性物質の役割が記載されている。典型的なアナライ
トはグルコース、乳酸、またはレドックス酵素（例えば、グルコースデヒドロゲ
ナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ）である。
【０００３】 プロテアーゼおよび抗プロテアーゼを測定するための電気化学的方法は、EP-B
0 018 002から知られている。この方法は、芳香族もしくは複素環式アミンまた
はポリアミンが結合しているオリゴペプチドから成る、プロテアーゼまたは抗プ
ロテアーゼの基質を用いるものである。測定すべき酵素がカルボキシ末端アミノ
酸とアミンまたはポリアミンの間の結合を切断し、放出されたアミンまたはポリ
アミンの量が電気化学的に測定される。溶解状態にある血液凝固カスケードの自
由移動性成分の測定が記載されている。
【０００４】 血液凝固検査用の電気化学センサーは、C. Bissonらによる「全血における凝
固パラメーターを評価するための微量分析装置 (A microanalytical device for
the assessment of coagulation parameters in whole blood)」、Technical D
igest Solid-State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head Island, Sout
h Carolina, USA, June 8-11, 1998 より知られている。この出版物は、電流測
定検出を伴った電気化学凝固センサーを使用することの可能性について一般的に
記載しているが、例えば、用いる基質の詳細については記載していない。さらに
、記載された電極および検査装置は製造するのが複雑で、市場にとって魅力のな
いものである。
【０００５】 一般的には、先行技術は、電気化学凝固センサーならびに対応する血液凝固検
出方法の簡便で信頼できるスターティングポイントを提供していない、と言える
。
【０００６】 こうした問題を解決するために、本発明は、特許請求の範囲に記載したような
、電気化学センサー、血液凝固測定システム、ならびに血液凝固の測定方法を提
供する。好ましい実施形態は従属請求項に示されている。
【０００７】 本発明によるセンサーは固相化学分析に基づく分析エレメントである。このセ
ンサーは少なくとも２個の電極を含み、そのうちの少なくとも１個の電極がいわ
ゆる作用電極である。好ましい実施形態において、このセンサーは、Ag／AgCl参
照電極のような古典的参照電極を含まないが、少なくとも１個の作用電極と１個
の対向電極を含んでいる。電極は、金属、貴金属、合金、グラファイトなどの従
来のどのような電極材料で構成してもよいが、金やパラジウムのような貴金属ま
たはグラファイトから構成することが好ましい。センサーの各種電極は同一の材
料から構成しても、異なる材料で構成してもよい。特に好ましい実施形態では、
このセンサーは１個の作用電極と１個の対向電極を含み、両電極ともパラジウム
から作られる。
【０００８】 本発明によるセンサーの乾燥試薬は、例えば、化合物(I)：
【化２】 をトロンビン基質として含有する。ここで、Argはアルギニンを示し、Proはプロ
リンを示し、そしてGlyはグリシンを示す。Tosはアミノ保護基トシルに相当する
。一般に、トロンビンにより切断され得る残基はどれも、本発明に従うトロンビ
ン基質のペプチド残基として使用することができ、該基質からフェニレンジアミ
ンが放出されて、電気化学的に測定される。
【０００９】 酵素トロンビンは、凝固カスケードの最後のプロテアーゼであり、タンパク質
であるプロトロンビンから血液凝固のときだけ形成される。したがって、トロン
ビンの酵素活性を測定することによって血液の凝固をモニタリングし、ひいては
凝固時間を測定することが可能である。
【００１０】 EP-B 0441 222 に記載されるように、トロンビン基質が切断されると、p-アミ
ノアニリン（フェニレンジアミン）が形成され、これがセンサーの作用電極上で
酸化される。こうして放出された電子を検出する。基本的に、EP-B 0441 222 に
２型の電子担体（または媒介物質）として記載されている化合物はすべて、本発
明に従うトロンビン基質の電気化学的に検出可能な部分として使用することがで
きる。
【００１１】 本発明においては、上記試薬にグルコース-染料-オキシドレダクターゼ（Gluc
DOR）を増幅系として添加することが特に有利であると判明した。GlucDORは検査
すべき血液中に存在するグルコースを酸化し、この酸化過程でトロンビン活性に
より放出された２型電子担体を電子受容体として使用する。
【００１２】 この反応スキームは次のとおりである：
【化３】
【００１３】 ２型電子担体の一次酸化生成物はキノンジイミンであり、この化合物はグルコ
ース-染料オキシドレダクターゼ（GlucDOR）のような染料オキシドレダクターゼ
によってp-アミノアニリンの形でリサイクルされ、こうして、再び作用電極に電
子を伝達することができる。したがって、もとのシグナルをかなり増幅すること
が可能である。GlucDORに加えて、キノンジイミンをフェニレンジアミンに変換
しうる他の酵素（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、またはグルコースオキ
シダーゼや乳酸オキシダーゼのようなオキシダーゼ類）が存在する。そのために
（GlucDORに対するグルコースに相当する）別の特別な基質（例えば、酵素アル
コールデヒドロゲナーゼに対してはアルコール、乳酸オキシダーゼに対しては乳
酸）が必要となる。それゆえ、場合により、この基質を適量で試薬調製物に配合
することができる。
【００１４】 血液凝固の電気化学的測定は準電位静的に、好ましくは２電極システム（一方
の電極は同時に参照電極および対向電極として働き、他方の電極は作用電極とし
て働く）を使って、行われる。この２電極システムに一定の電圧を印加して電流
を経時的に測定する。この方法は電流測定法とも呼ばれている。血液凝固時間を
測定するには、電流の時間経過を測定し、凝固測定を開始してからどのくらいの
時間経過後に測定電流が所定の閾値を超えるかを調べる。この時間が凝固時間の
尺度となる。
【００１５】 電流測定法のほかに、電圧測定法を使用することも可能である。この場合には
、２電極間の電圧を一定となるようには設定せず、むしろ電圧を初期値から最終
値まで線形に変化させて、その後初期値にもどるようにする。この方法は全測定
時間にわたって数回繰り返すことができる。
【００１６】 電圧測定法では、電流を電圧に対してプロットし、これを繰り返すと電流−電
圧曲線の繰り込まれたセット(nested set)（シクロボルタンモグラム）が得られ
る。電圧範囲が適切であるならば、これらの曲線中に電子担体の酸化ピークと還
元ピークが形成される。こうしたピークの高さは、その他のレドックス活性物質
がカバーされた電位範囲で共酸化または共還元されないがゆえに付加的に電流に
寄与するという条件で、電子担体の濃度に直接比例する。そのような干渉は、濃
度変化を測定する場合、無視しうる。
【００１７】 最大ピークの電流値、または個々の電流電圧ループの曲線（電荷回転に対応す
る）で囲まれた面積を時間に対してプロットする場合は、サイクル期間により与
えられた時間ラスターにおいて測定期間にわたる電子担体の濃度変化の図を得る
こともできる。その後、この情報を、例えば電流測定法におけると同様に、使用
することで、血液凝固時間を決定することができる。
【００１８】 プロテアーゼ（例えば、トロンビン）の酵素活性の測定に基づく血液凝固試験
のためには、次の一般式(II)：
【化４】 で表されるオリゴペプチド誘導体を使用する。この場合、X1、X2およびX3は、保
護基を含みうる天然または人工アミノ酸を表す。配列X1-X2-X3は所望の用途（例
えば、トロンビンによる検出）に従って選択され、さまざまな目的について多く
の刊行物に記載されている（例えば、U. Beckerら, Clin. Chem., 30(4), 524-5
28 (1984); M.-C. Boutonら, Eur. J. Biochem., 229(2), 526-532 (1995); H.D
. Bruhnら, "Hamostaseologie", 15(1), 54-56 (1995); E. De Candiaら, Throm
b. Haemostssis, 77(4), 735-740 (1997); P.L. Colemanら, Clin. Chem., 29(4
), 603-608 (1983); J. DiMaioら, J. Med. Chem., 35, 3331-3341 (1992); A.
Frigolaら, J. Clin. Pathol., 32(1), 21-25 (1979); P.J. Gaffneyら, Thromb
. Res., 10(4), 549-556 (1977); J. Hofsteengeら, Biochem. J., 237, 243-25
1 (1986); R. Lottenbergら, Thromb. Res., 28, 313-332 (1982); M.K. Ramjee
, Anal. Biochem., 277, 11-18 (2000); J.J. Slon-Usakiewiczら, Biochem. 36
, 13494-13502 (1997); S.A. Sonderら, Clin. Chem. 32(6), 934-937 (1986);
C. Soriaら, Thromb. Res., 19(3), 435-440 (1980); T. Steinmetzerら, J. Me
d. Chem., 42, 3109-3115 (1999); A. Tripodiら, Clin. Chem., 30(8), 1392-1
395 (1984); J.I. Wittingら, Thromb. Res., 46(4), 567-574 (1987); EP-B 0
018 002; 米国特許第5,108,890号; 米国特許第5,190,862号;EP-A 0 280 610; EP
-B 0 144 744 を参照されたい）。さらに、これらのアミノ酸配列のいくつかは
、各種凝固因子を検出するために様々な会社から市販されており、例えば、Pent
apharm Ltd (スイス国バーゼル）またはChromogenix Germany, Haemochrom Diag
nostica GmbH（ドイツ国エッセン）から入手可能である。
【００１９】 成分X4-X5は脱離基としてアミノ酸配列X1-X2-X3に結合されており、例えば、
凝固因子（すなわち、トロンビン）のタンパク質加水分解活性により切断される
。希望する検出原理に応じて、タンパク質加水分解活性の検出に用いられる成分
X4-X5は着色されるか（光度測定）、蛍光性であるか（特に、M.K. Ramjee, Anal
. Biochem., 277, 11-18 (2000)を参照）、または電気活性である（EP-B 0 018
002を参照）。
【００２０】 成分X4-X5は本発明の範囲内において電気活性であり、すなわち、電子の放出
または取込みを伴って電極で変換され得る。X4-X5は、好ましくは、Ag／AgCl電
極に対して350mVの最大酸化電位を有し、電気化学的測定により検出可能である
。
【００２１】 これに関連して、X4は、オリゴペプチド配列 NまたはNHとの結合を形成する原
子または基であってよい。
【００２２】 成分X5は、次の構造(III)：
【化５】 をもつことができ、ここで、R1およびR2は、互いに独立して、アルキル、ヒドロ
キシアルキル、アルコキシアルキル、ホスホルアミドアルキル、ポリヒドロキシ
アルキル、スルホンアルキルまたは水素であり、R3およびR4は、OH、O-アルキル
、アルキル、H、ハロゲン、NR1R2、COOR、CONR1R2、SR1、NR1-CO-R1、O-CO-R1で
ある。
【００２３】 X4＝NまたはNHであるタイプのペプチド基質は、例えば、次の特許または特許
公開明細書に記載されている：JP-A 56042597; JP-A 58090535; WO-A 86/01209;
米国特許第5,059,525号; JP-A 61112096; JP-A 03157353。
【００２４】 あるいは、X5は次の構造(IV)：
【化６】 をもつことができ、ここで、R1〜R3は式IIIに関して先に示した意味を有する。
【００２５】 X4＝NRであるタイプのペプチド基質は知られている（例えば、JP-A 03271299;
EP-B 0 350 915; P. Kurzhalsら, Acta Pharm. Nord., 1(5), 269-78 (1989);
米国特許第4,797,472号; EP-B 0 224 254; WO-A 87/05608; EP-B 0 170 797; EP
-B 0 167 980; EP-B 0 152 872; EP-B 0 076 042; JP-A 52148032を参照された
い）。
【００２６】 X5はまた、次の構造(V)：
【化７】 をもつことができ、ここで、R1〜R3は式IIIおよびIVに関して先に示した意味を
有する。
【００２７】 X4＝NR、Oであるタイプのペプチド基質は知られている（例えば、T. Morimoto
ら, Pept. Chem., Vol. date 1989, 27th., 387-390 (1999); N. Nishinoら, Pe
pt. Chem., Vol. date 1988, 26th., 21-24 (1989); B.J. Johnsonら, J. Org.
Chem., 35(1), 255-257 (1970)を参照されたい）。
【００２８】 好ましい実施形態において、ペプチド基質は一般式VI：
【化８】 [式中、 R1は、アルキル基または水素を表し、 R2は、ヒドロキシアルキル基または水素を表し、 R3は、水素、ハロゲン、アルコキシまたはアルキルチオを表す] で表されるトロンビン基質である。
【００２９】 適当なプロテアーゼ基質は、一般に、血液凝固系のプロテアーゼによって切り
離されるペプチド残基を含み、該ペプチド残基がそのカルボキシ末端で置換アニ
リン（特に、フェニレンジアミン残基）にアミド結合を介して結合されている化
合物である。
【００３０】 凝固時間そのものを測定する、または、その目的のためにプロテアーゼである
トロンビンの活性を測定する、いわゆるグローバルな試験に加えて、当業者に公
知の別の適切な基質を、他の凝固試験（例えば、抗因子Xa試験）の基礎として、
あるいは個々の凝固因子の測定のために使用することができる。そのためには、
基質のペプチド部分を、測定しようとするプロテアーゼに適合させる必要がある
。本発明に従う凝固または個々の凝固因子の電気化学的測定の場合には、電気化
学的に測定しうるペプチド基質の切断産物が形成されて検出されることが重要で
ある。
【００３１】 グローバルな試験として、特に次の試験が挙げられる：PT（プロトロンビン時
間試験）、aPTT（活性化部分プロトロンビン時間試験）、およびACT（活性化凝
固時間試験）。
【００３２】 本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明することにする。実施例はすべてサ
ンプル材料として全血を用いて記載されているが、本発明によるセンサーおよび
方法は、試験担体の調製物にまたはサンプルにカルシウムが添加される場合には
クエン酸血漿にも適している。さらに、試薬を電極に固定させる（アクチベータ
ーと基質の両方を電極に塗布し、続いて乾燥する）実施例に記載の方法のほかに
、本発明によれば、試薬を直接電極にではなく、電極の近くに、例えば平らな基
体上の電極の隣に塗布して乾燥させることが可能である。この場合、試薬は測定
中に血液サンプルによって電極まで運ばれる。あるいはまた、試薬をフリース、
紙、膜などの多孔質材料に含浸させること、例えば試薬を分離可能な形態で含浸
させることが可能である。この場合には、血液または血漿サンプルが電極との接
触前にこれらの材料を通って流れ、この過程で試薬を取り込む必要がある。また
、試薬の個々の成分を試験担体の異なる区画に配置すること、例えば電極上もし
くは電極のすぐ隣にトロンビン基質を配置するが、アクチベーターは該基質から
空間的に隔てて（例えば、電極からさらに離して）配置すること、あるいは両物
質を異なる層（例えば、膜またはフリース）に含浸させることも可能である。
【００３３】実施例 実施例１ PT試験用の凝固センサーの製造 I. 電気化学的機能の説明 a) 「トップドーシング(top dosing)」サンプル適用のための２電極システムを
開く。2個のPd電極を有する構成物を平らにする。Ag/AgClペースト(型：Acheson
Electrodag 6037 SS)をPd電極の全領域にわたって施すことで、このPd電極の全
表面をAg/AgClで覆う。 電気化学作用は、好ましくは２電極システムとして準電位静的に起こる。この
２電極システムにおいて、Ag/AgCl電極は同時に参照電極および対向電極として
機能し、かつPd電極が作用電極として機能する。 一定の電圧をこの２電極システムに印加し、電流を経時的に測定する。
【００３４】 b) 銀-塩化銀参照電極の、対向電極で還元され得る可溶性物質(2型媒介物質)に
よる置換： 被還元性の可溶性物質(対向電極で電子を受け取る物質)を用いることで、対向
電極を通る電流輸送を確実にする。同時に、作用電極に到達することができる還
元電位を、この物質の還元電位により、また、作用電極と対向電極間のセンサー
に印加された定電圧によって制限する。作用電極において酸化によって検出され
るp-アミノアニリンは、達成可能な酸化電位内でなければならない。仮説的な銀
-塩化銀参照電極に対する作用電極での電位は、作用電極(この場合はアノード)
を通る電流と対向電極(この場合はカソード)を通る電流が強さの点で同一となる
ようなものでなければならない。同時に、被還元性物質は、作用電極において達
成可能な最大酸化電位内で被酸化性であってはならない。なぜなら、さもなけれ
ば該物質が先の酵素反応において切断されたp-アミノアニリンのシグナル上に重
なるからである。
【００３５】II. PT試験用の固相化学分析フォーマットの製造 a) バルク試薬の調製： 調製物1：実施例１.I.a)で説明したAg/AgCl電極の構成：
【００３６】 調製物2：実施例１.I.b)に従って2型媒介物質と共に用いる
【００３７】 b) 計量および乾燥 これらの懸濁液5μlを実施例１.I.a)およびb)で説明したセンサー上に計量し
て供給し、ベルトドライヤー上で、または乾燥キャビネット中で30〜50℃で乾燥
した。調製物１は、実施例１.I.a)に記載のセンサーに好適であり、調製物２は
、実施例１.I.b)に記載のセンサーに好適である。
【００３８】 c) このようにして得られたセンサーを用いて血液凝固を測定する場合、図１に
示すような関数曲線(電流対時間)が得られる。図２は、参照電極を有するセンサ
ーの関数曲線を示す。
【００３９】実施例２ ACT試験用の固相化学分析フォーマットの製造 a) バルク試薬の調製 調製物(代替物1)：
【００４０】 調製物(代替物2)：
【００４１】 b) 計量および乾燥 これらの懸濁液のうちの1つ5μlを、実施例１で説明したセンサー上に計量し
て供給し(変形1a、すなわちAg/AgCl参照電極を有する)、ベルトドライヤー上で
、または乾燥キャビネット中で30〜50℃で乾燥した。
【００４２】実施例３ 測定シグナルの増幅： p-アミノアニリン(フェニレンジアミン)が、凝固カスケードの作用によってト
ロンビン基質から放出される。これは作用電極上で酸化され、このプロセスで放
出された電子を検出する。一次酸化生成物はキノンジイミンである。グルコース
-染料-オキシドレダクターゼ(GlucDOR)などの染料-オキシドレダクターゼによる
この酸化生成物のフェニレンジアミンへの酵素的リサイクルにより、電極上での
新しい酸化が可能になり、従って元のシグナルの増幅が可能となる。
【００４３】 a) バルク試薬の調製： 増幅酵素GlucDOR用の基質として必要であるグルコースは、サンプルの一成分
である(約10mM)。従って、グルコースは調製物に含めなかった。しかしながら、
原理的にはグルコースを添加することが可能である。
【００４４】 b) 計量および乾燥 この懸濁液5μlを、実施例１.I.aで説明したセンサー上に計量して供給し、ベ
ルトドライヤー上で、または乾燥キャビネット中で30〜50℃で乾燥した。
【００４５】実施例４ 電気化学ACT試験 a) 試験構成物 本実施例で用いられる試験構成物(センサー)は、実施例１.I.b)で説明したセ
ンサー(2型媒介物質の使用)に相当した。
【００４６】 b) バルク試薬の調製
【００４７】 c) 計量および乾燥 この懸濁液5μlを、a)で説明したセンサー上に計量して供給し、ベルトドライ
ヤー上で、または乾燥キャビネット中で30〜50℃で乾燥した。
【００４８】 d) ACT試験についての測定結果 上記のセンサーで、1ml当たり1〜6Uのへパリンを添加した(ヘパリンスパイク(
heparin spike))全血サンプルを用いて、ACT試験を実施した。電位300mVを印加
し、閾値0.5μAで時間を読み取った。結果を以下の表に示す：
【００４９】実施例５ 電気化学aPTT試験 a) 試験構成物： 本実施例で用いる試験構成物は、実施例１.I.b)で説明した構成物に相当した
。
【００５０】 b) バルク試薬の調製：
【００５１】 c) 計量および乾燥 この懸濁液5μlを、実施例１.I.b)で説明したセンサー上に計量して供給し、
ベルトドライヤー上で、または乾燥キャビネット中で30〜50℃で乾燥した。
【００５２】 d) aPTT試験についての測定結果 上記のセンサーで、1ml当たり0〜0.35Uのへパリンを添加した(ヘパリンスパイ
ク)全血サンプルを用いて、aPTT試験を実施した。電位300mVを印加し、閾値0.5
μAで時間を読み取った。結果を以下の表に示す：
【００５３】実施例６ ヘマトクリットの影響の補正 I. 方法の説明： クロノアンペロメトリー測定法またはボルタンメトリー測定法において、アナ
ライトとして全血を用いる場合には、酸化または還元により生じた電流はヘマト
クリットに影響される。従って、凝固時間を測定するための規定の電流閾値に基
づく評価方法においては、ヘマトクリット次第で異なる凝固時間が測定される。
【００５４】 ヘマトクリットは特殊な測定アルゴリズムによって測定することができ、これ
を用いて電流測定値を補正する。この目的のために、実際のクロノアンペロメト
リー測定の前に、血液で湿らせたセンサーの見かけ上の抵抗値の簡単な測定が行
われる。このために、周波数が2kHzで振幅が約10mVの交流電圧を作用電極と対向
電極の間に印加し、センサー中を流れる交流の実効値を測定する。血液サンプル
で満たしたセンサーの見かけ上の抵抗値Zは、印加した電圧の実効値を交流の実
効値で割算することによって得られる。この見かけ上の抵抗値Zは温度と血液の
ヘマトクリットにより変化する。従って、サーモスタット等温条件下では、実際
の電子担体（媒介物質）濃度に非依存的に血液中のヘマトクリットを測定するこ
とが可能である。
【００５５】 次いで実際のクロノアンペロメトリー検出測定の電流値(imess)を、以下の式
を用いて補正し、こうしてヘマトクリット含量に非依存的な結果(icorr)を得る
ことができる： Icorr = imess X ((Z − Zmedian) x 0.001 + 1) [式中、Zは実際の測定の見かけ上の抵抗値であり、Zmedianは多くの血液サンプ
ルの平均の見かけ上の抵抗値であり、バッチ補正の結果として導き出される。]
【００５６】 II. 実験方法 II.1. PT試験用の固相化学分析フォーマットの調製： ヘマトクリットの影響についての補正を、例としてPT試験を用いて示す。本実
施例に用いる試験構成物は、実施例１のIb)で説明した構成物に相当した。用い
た調製物は、実施例１のIIa)の項で説明した調製物2と同一であった。
【００５７】 II.2. ヘマトクリット値の設定 新鮮な静脈血を氷浴上で0℃まで冷却した。卓上遠心分離機でアリコートを赤
血球と細胞ペレットに分離した。血漿の一部分を取り除き、残りの血漿に細胞を
再懸濁することによって、高いヘマトクリットを設定した。すでに説明した同じ
血液の別のアリコートから得られた血漿を添加することによって、低いヘマトク
リットを得た。
【００５８】 実験結果を以下の表に示す：
【００５９】実施例７ ボルタンメトリー法 説明したアンペロメトリー測定法に加えて、またボルタンメトリー測定法を用
いることも可能である。この場合、電極間の電圧は一定になるように設定されて
いない。逆に電圧は初期値から最終値まで直線的に変化させ、その後、初期値に
戻される。このプロセスは、全測定期間にわたって数回繰り返すことができる。
この方法では、次に電圧に対する電流をプロットする。これを繰り返すと、電流
−電圧曲線の繰り込まれたセット(nested set)(シクロボルタンモグラム(cyclov
oltammograms))が得られる。電圧範囲が適切である場合には、電子担体の酸化ピ
ークと還元ピークがこれらの曲線において形成される。
【００６０】 このような連続的なボルタンモグラムの例を図２に示す。電位範囲100〜600mV
とその逆にわたる掃引(sweep)を、全測定期間にわたって繰り返した。
【００６１】 他のレドックス活性物質がカバーされた電位範囲で共酸化または共還元されず
、従って付加的に電流に寄与する場合には、これらのピークの高さは電子担体の
濃度に正比例する。濃度変化を測定する場合には、このような干渉は無視するこ
とができる。
【００６２】 ピーク最大の電流値、または個々の電流電圧ループの曲線(電荷回転(charge t
urnover)に対応する)によって囲まれる面積を時間に対してプロットすると、サ
イクル期間によって与えられる時間ラスターにおいて測定期間にわたる電子担体
の濃度変化の図が得られる。連続的で周期的なボルタンモグラムの電荷含量(電
流値の総計／測定密度)を、図３において経時的にプロットする。標準的な凝固
範囲とMarcumar被験者(血液凝固が遅れる)の結果との時間経過における差異を見
ることができる。
【００６３】 周期的なボルタンモグラムの電荷が増大し始める時間と、これが如何に迅速に
起こるかは、凝固時間を測定したり読み取るために、大きな関心が寄せられてい
る。すなわち、このことは、凝固がいつ始まるのか（トロンビンがいつ活性化さ
れるのか）、また、これが如何に迅速に起こるのか（「如何に迅速に」は、如何
に多くのトロンビンが追加的に活性化されるのか）を意味する。この理由のため
に、図４に示すように、時間導関数が図３の曲線から計算される（すなわち、dQ
／dt）。最大の勾配が時間導関数における最大値である。最大値の時間tを凝固
時間として読み取ることができる。
【００６４】 次に、図３および図４に示した例について以下の結果が得られる：
【図面の簡単な説明】
【図１】 凝固時間が短いサンプルと凝固時間が長いサンプルについて血液凝固を測定し
たときの関数曲線(電流対時間)を示した図である。
【図２】 センサーを用いて測定したときの連続的なボルタンモグラムを示した図である
。
【図３】 連続的で周期的なボルタンモグラムの電荷含量(電流値の総計／測定密度)を経
時的にプロットした図である。標準的な凝固範囲とMarcumar被験者(血液凝固が
遅れる)の結果との時間経過における差異を見ることができる。
【図４】 図３の曲線から計算される時間導関数（すなわち、dQ／dt）を示した図である
。最大の勾配が時間導関数における最大値であり、最大値の時間tを凝固時間と
して読み取ることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月３日（２００２．９．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/48 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/86 27/46 ３３６Ｍ 27/30 ３５３Ｒ (31)優先権主張番号 １００ １６ ７７５．６ (32)優先日 平成12年４月４日(2000．4．4) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒンデラング，フリッツ ドイツ連邦共和国 67316 カールズベル グ，カールウエグ 74 (72)発明者 コッツァン，ホルガー ドイツ連邦共和国 68526 ラーデンベル グ，ブレスラウアー シュトラーセ 77 (72)発明者 ホルン，カリナ ドイツ連邦共和国 64665 アルスバッハ −ヘーンライン ，アルテ ベルグシュト ラーセ 91 (72)発明者 ノルトメイヤー，クリスティン ドイツ連邦共和国 68305 マンハイム， ケッテラーウェグ ６ Ｆターム(参考） 2G045 AA10 BA11 CA26 FB05 JA01 2G054 AA07 AB02 BA02 CA21 4B029 AA07 BB16 FA13 4B063 QA01 QQ03 QQ36 QR58 QR82 QS36 QS39 QX01 QX04

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 不活性支持体上に少なくとも２個の電極を有し、かつ乾燥試
    薬を含む、血液凝固または個々の凝固因子を測定するための固相化学分析に基づ
    く電気化学センサーであって、該試薬が、血液凝固系のプロテアーゼにより切り
    離すことができる、カルボキシル末端でアミド結合により置換アニリン（特にフ
    ェニレンジアミン残基）に結合されたペプチド残基を含むプロテアーゼ基質を含
    有することを特徴とする、上記電気化学センサー。
  2. 【請求項２】 同一の材料で構成されている２個の電極を含むことを特徴と
    する、請求項１に記載の電気化学センサー。
  3. 【請求項３】 前記電極の材料がパラジウムであることを特徴とする、請求
    項２に記載の電気化学センサー。
  4. 【請求項４】 前記プロテアーゼがトロンビンであり、前記プロテアーゼ基
    質がトロンビン基質であることを特徴とする、請求項１または３に記載の電気化
    学センサー。
  5. 【請求項５】 トロンビン基質が式VI： 【化１】 [式中、 R1は、アルキル基または水素を表し、 R2は、ヒドロキシアルキル基または水素を表し、 R3は、水素、ハロゲン、アルコキシまたはアルキルチオを表す] で表される化合物であることを特徴とする、請求項４に記載の電気化学センサー
    。
  6. 【請求項６】 前記試薬が、キノンジアミンのフェニレンジアミンへの変換
    を触媒することができる染料-オキシドレダクターゼをさらに含有することを特
    徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
  7. 【請求項７】 染料-オキシドレダクターゼがグルコース-染料-オキシドレ
    ダクターゼであることを特徴とする、請求項６に記載の電気化学センサー。
  8. 【請求項８】 電気化学センサーおよび電流測定機器を含む血液凝固測定用
    のシステムであって、該センサーとして請求項１〜７のいずれか１項に記載のセ
    ンサーを使用することを特徴とする、上記システム。
  9. 【請求項９】 電気化学センサーを用いて血液凝固を測定する方法であって
    、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサーに一定の電圧を印加し、検査す
    べき血液サンプルを該センサーに加え、それにより試薬と電極を湿らせ、その後
    電極間を流れる電流を経時的に測定することを特徴とする、上記方法。
  10. 【請求項１０】 プロトロンビン時間（PT）、活性化部分プロトロンビン時
    間（aPTT）、または活性化凝固時間（ACT）を測定するために用いることを特徴
    とする、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 血液凝固時間の測定が、インピーダンス測定を用いて、ヘ
    マトクリットの影響について補正されることを特徴とする、請求項９または１０
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 血液凝固系のプロテアーゼにより切り離すことができる、
    カルボキシル末端でアミド結合によりフェニレンジアミン残基に結合されたペプ
    チド残基を含むプロテアーゼ基質を含有する血液凝固測定用の試薬であって、染
    料-オキシドレダクターゼを含むことを特徴とする、上記試薬。
  13. 【請求項１３】 染料-オキシドレダクターゼがグルコース-染料-オキシド
    レダクターゼであることを特徴とする、請求項１２に記載の試薬。
  14. 【請求項１４】 前記プロテアーゼがトロンビンであり、前記プロテアーゼ
    基質がトロンビン基質であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の
    試薬。
  15. 【請求項１５】 電気化学センサーを用いて血液凝固を測定する方法であっ
    て、直線的に変化する電圧を請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサーに印
    加し、検査すべき血液サンプルを該センサーに加え、それにより試薬と電極を湿
    らせ、その後電極間を流れる電流を経時的に測定することを特徴とする、上記方
    法。
  16. 【請求項１６】 血液凝固時間の測定が、インピーダンス測定を用いて、ヘ
    マトクリットの影響について補正されることを特徴とする、請求項１５に記載の
    方法。
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