JP2003521499A - タウオパチーの診断 - Google Patents
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Abstract
Description
び/または鑑別診断のための新奇な方法を提供する。本発明は、本発明の方法に
おける標準化に用いることができるホスホペプチドも提供する。
同じ病態生理学的機序、すなわち構造タンパク質であるタウの関与と関連付けら
れている。微小管関連タンパク質であるタウは、たとえば、アルツハイマー病に
関連する、対合らせんフィラメント(PHP)および神経原繊維タングル(neur
ofibrillar tangles)(NFT)の主要なタンパク質成分である〔Brion et al.
, 1985;Delacourte & Defossez, 1986;Grundke-Iqbal et al., 1986;Kosik e
t al., 1986;Wood et al., 1986;Kondo et al., 1988〕。タウタンパク質は、
異なるイソ型で存在し、うち4〜6種類は、成人の脳に見出されるが、胎児脳に
は、一つのイソ型のみが検出されるにすぎない。イソ型の多様性は、選択的mR
NAスプライシングによって、ヒト第17染色体上のただ一つの遺伝子から生成
される〔Himmler, 1989;Goedert et al., 1989;Andreadis et al., 1992〕。
タウタンパク質の、分子クローニングから推論された限りで最も目を引く特徴は
、分子のカルボキシル末端部に生じる、31または32アミノ酸のストレッチで
あって、3または4回反復されることができる。追加的な多様性は、タウ分子の
NH2末端部での29または58アミノ酸長の挿入によって生成される〔Goedert
et al., 1989〕。in vivoで、タウは、タウの反復領域(255〜381)内の
その微小管結合ドメインが関与する相互作用によって、ニューロンの軸索区画で
の微小管集成および安定性を促進する〔Lewis et al., 1988〕。正常な状況下で
は、成人の脳は、タウ1モルあたり2〜3モルのリン酸塩を含有する〔Selden &
Pollard, 1983;Ksiezak-Reding et al., 1992〕。ラットおよびヒトで研究さ
れた限りで、正常タウの異なる部位のリン酸化は、発生状態に左右される〔Lee
et al., 1991;Bramblett et al., 1993;Goedert et al., 1993〕。リン酸化の
結果として生じる60、64および68kDaのタウ変異体が、脳の神経原繊維タ
ングルを示す部域で検出されている〔Delacourte et al., 1990;Goedert et al
., 1992;Flament et al., 1990;Greenberg & Davies, 1990〕。これらの脳は
、タウ1モルあたり6〜8モルのリン酸塩を含有する〔Ksiezak-Reding et al.,
1992〕。PHPから単離されたタウ(PHP−タウ)では、リン酸化は、いく
つかの位置で発生する〔Iqbal et al., 1989;Lee et al., 1991;Hasegawa et
al., 1992;Hanger et al., 1998;Buee et al., 1999〕。
一次性変性痴呆であって、42〜75%の罹患率を有する〔Brun, 1993;Gustaf
son, 1993;Ebly et al., 1994〕。前頭側頭痴呆(FTD)は、病理学的には、
ピック病、第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆、散発性FTD
、および運動ニューロン病が存在する、臨床的状態である。Mannら〔2000〕によ
る小規模な研究によれば、FTDの37症例中16は、タウ免疫組織化学に基づ
いて、タウオパチーとして分類することができた。繊維状タウという病理学、す
なわち神経原繊維タングルは、一貫してADに見出されるが〔Tomlinson & Cors
ellis, 1984〕、FTDにも見出されることがある〔Spillantini & Geodert, 19
98〕。病的なタウタンパク質は、ADおよびFTDにともに見出されるが〔Verm
ersche et al., 1995;Delacourte et al., 1996〕、脳組織についての研究は、
タウの病理学は、ADとFTDとでは異なり、おそらくリン酸化の程度に関連す
ることを示唆した〔Delacourte et al., 1996〕。タウの病理に関連するその他
の形態の痴呆は、進行性核上麻痺(PSP)、皮質基底変性(CBD)および亜
急性硬化性汎脳炎を包含する。これらのタウオパチーの病理学における過剰リン
酸化の役割は、現在は、充分に理解されていない。加えて、プロリン領域に集中
した特異的ホスホ部位の、リン酸化の程度の正確な決定は、様々な困難に遭遇し
ている。これらの困難のため、これらのタウオパチーを特異的に検出するための
正確な方法は、依然として欠如している。
である。
たは第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の診断方法を提供する
ことは、本発明のもう一つの目的である。
、本発明のもう一つの目的である。
ることは、本発明のもう一つの目的である。
者における神経毒性と対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法を提供すること
は、本発明のもう一つの目的である。
者における神経毒性と対比しての、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側
頭痴呆、および/または第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の
鑑別診断の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
う一つの目的である。
目的である。
プチドを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
ことは、本発明のもう一つの目的である。
う一つの目的である。
よび/または一定の処置の有効性の決定のための、ペプチド、方法、および/ま
たは診断キットを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
:前頭側頭痴呆、AD:アルツハイマー病、SAE:皮質下動脈硬化性脳症、P
D:パーキンソン病、Prob:蓋然性のある、Poss:可能性のある、N:個体数、
M:男性、F:女性、y:年齢、CSF:脳脊髄液。
、AD:アルツハイマー病、PD:パーキンソン病、SAE:皮質下動脈硬化性
脳症。 *** 値は、対照についての値と比較して有意に異なる(p<0.001)。 ** 値は、対照についての値と比較して有意に異なる(p<0.01)。 * 値は、対照についての値と比較して有意に異なる(p<0.05)。
おけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較することによって該個体がタ
ウオパチーに罹患していることを推論する工程であって、対照個体における該比
率と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の変化が指標である工程とを
含む方法に関する。
する方法であって、
チーに罹患している個体で得られたホスホタウ(181)/総タウの比率とか、
または対照個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較することに
よって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程、非タウオパチ
ーに罹患している個体、または対照個体における該比率と比較したホスホタウ(
181)/総タウの比率の変化が指標である工程と を含む方法にも関する。
Dに罹患している患者からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウの比率は
、対照個体からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウ比と比較して有意に
変化するとの知見に基づく。本発明は、さらに、ADに罹患している患者からの
CSF中のホスホタウ(181)/総タウの比率は、卒中に罹患している患者か
らのCSF中のホスホタウ(181)/総タウ比と比較して有意に変化するとの
知見にも基づく。タウオパチーの患者におけるホスホタウ(181)/総タウ比
が変化することの表示は、個体におけるタウオパチーの診断、および/または非
タウオパチーに罹患している個体と対比しての、タウオパチーに罹患している個
体の鑑別診断のための診断試験の開発に向けての基盤を形成する。
頭側頭痴呆、および第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆)は、
最も一般的な形態のタウオパチーである。したがって、本発明は、タウオパチー
が、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および第17染色体連
関パーキンソン病による前頭側頭痴呆である、上記のいかなる方法にも関する。
その他のタウオパチーは、進行性核上麻痺(PSP)、皮質基底変性(CBD)
および亜急性硬化性汎脳炎を包含するが、これらに限定されない。
法であって、
おけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較して、対照個体における該比
率と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の変化が指標となることによ
って、該個体がアルツハイマー病に罹患していることを推論する工程と を含む方法に関する。
。本発明の実施態様では、該非タウオパチーは、非タウオパチー神経変性である
。非タウオパチー神経変性は、神経学的疾患のタウオパチーに関連しないいかな
る形態でもある。非タウオパチー神経変性は、血管性痴呆、クロイツフェルト−
ヤコブ病、卒中、および/または白血病の患者における神経毒性を包含するが、
これらに限定されない。
ー病を個体において鑑別診断する方法であって、
している個体で得られたホスホタウ(181)/総タウの比率と比較することに
よって、該個体が卒中ではなくアルツハイマー病に罹患していることを推論する
工程であって、卒中に罹患している個体における該比率と比較したホスホタウ(
181)/総タウの比率の変化が指標である工程、 を含む方法に関する。
てのタウ分子を包含する。アミノ酸配列に関する番号付けは、タウの最長のイソ
型であるhTau40を参考にする〔Goedert et al., 1989〕。
含する。
と対比してのタウオパチーの鑑別診断のための、神経学的マーカーとして用いる
ためのタウおよびホスホタウ(181)に関する。
におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を決定することができる。
検出することができる。個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率をin
vitroで検出する方法は、
チーに罹患している個体からのサンプル中のホスホタウ(181)/総タウの比
率とか、または対照個体からのサンプル中のホスホタウ(181)/総タウ比と
比較することによって、該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工
程であって非タウオパチーに罹患している個体、または対照個体における該比率
と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の変化が指標である工程と を含む。
(181)タンパク質を含む体液、脳抽出物、末梢血その他いかなるサンプルも
意味する。本発明の一実施態様では、ホスホタウ(181)/総タウの比率は、
患者の体液サンプル中のホスホタウ(181)/総タウの比率の分析によって、
in vitroで決定する。用語「体液」は、人体内に存在する、ホスホタウ(181
)タンパク質を含む血液、リンパ、尿および脳脊髄液(CSF)を包含するが、
これらに限定されないすべての体液を意味する。本発明のもう一つの実施態様で
は、ホスホタウ(181)/総タウの比率は、患者から採取した脳脊髄液(CS
F)サンプル中で決定する。したがって、本発明は、
と;
チーに罹患している個体からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウの比率
とか、または対照個体からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウ比と比較
することによって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程であ
って、非タウオパチーに罹患している個体からのCSF中のか、または対照個体
からのCSF中の該比率と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の変化
が指標となることによって、 を含む上記の方法に関する。
方法によってか、または別途、機能アッセー〔Bramblett et al., 1992〕によっ
ても定量することができる。総タウを特異的に認識する、いかなるモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体も、総タウの定量に用いてよい。正常および異常に
リン酸化されたタウを認識する抗体は、Alz50〔Ghanbari et al., 1990〕
、HT7〔Mercken et al., 1992〕、およびAT120〔Vandermeeren et al.,
1993〕を包含する。しかし、総タウを認識する、当技術に公知のその他の抗体
も、用いることができる。総タウの定量のための、非常に迅速で、利用者が扱い
やすい方法は、INNOTEST hTau-Ag(Innogenetics, Gent、ベルギー国)である。
公知のいかなる方法によっても定量することができる。好適実施態様では、ホス
ホタウ(181)は、少なくとも下記の工程:
(181)を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させる工程と;
(181)を特異的に認識するモノクローナル抗体(一次抗体すなわち捕捉抗体
)と接触させる工程と;
スホタウ(181)を特異的に認識するモノクローナル抗体(二次抗体すなわち
検出抗体)と接触させる工程と;
ップリングのいずれかのための、当業者には公知である可能ないかなるマーカー
とも接触させる工程と;
タウタンパク質またはホスホペプチドと接触させる工程と を含む、サンドウィッチELISAによって定量することができる。
めのマーカーもしくは基を有する。
合」または「抗原−抗体複合体を生成する」は、抗原と抗体との結合が、該抗体
および抗原の免疫学的特性に留意するすべての条件下で生じることと解されるも
のとする。
タウ(181)とは免疫学的複合体を形成できるが、トレオニン181でのリン
酸化を欠くタウ分子とは形成できないことと解されるものとする。
ホスホタウ(181)の定量のための該方法に用いることができる。ホスホタウ
(181)の定量に用いるのに好適なモノクローナル抗体は、AT270(WO95
/17429のもとに刊行された国際特許願)である。しかし、ホスホタウ(181)
を特異的に認識する、当技術に公知のその他の抗体も用いることができる。
プチドを用いることができる。これは、脳からの抽出、またはin vitroでの正常
タウのリン酸化のような、いかなる方法によっても得ることができる。プロリン
領域に集中された特異的ホスホ部位のリン酸化の程度を正確に決定することは困
難であるため、本発明の実施態様では、合成ホスホペプチドを標準化のために用
いる。該合成ホスホペプチドは、免疫アッセーに用いられた抗体と免疫学的複合
体を形成することができなければならない。
つのエピトープを含み、サンドウィッチELISAにおいて、該モノクローナル
抗体との免疫学的複合体を容易に形成する、ホスホペプチドにも関する。以前の
研究は、ペプチドは、一定のモノクローナル抗体に対するエピトープを含むが、
該モノクローナル抗体は、必ずしも該ペプチドを認識しないことを示していた〔
DeLeys et al., 1996〕。本発明者らは、該エピトープを認識するモノクローナ
ル抗体との免疫学的複合体を実際に形成できるような、二つのエピトープを有す
るホスホペプチドを画定することができた。加えて、本発明者らは、該ホスホペ
プチドが、サンドウィッチELISAにおいて、それらを認識するモノクローナ
ル抗体との免疫学的複合体を形成できるような、二つのエピトープをともに画定
することができた。
物を意味しない。本発明の一実施態様では、該ホスホペプチドの長さは、15〜
100アミノ酸である。本発明の好適実施態様では、該ホスホペプチドは、20
〜50アミノ酸を含む。本発明のもう一つの好適実施態様では、該ホスホペプチ
ドは、30〜40アミノ酸を含む。
)が記載したとおりの、古典的化学合成のような、当技術に公知のいかなる方法
によっても、実施例の項に記載されたような、商業的に入手できるいかなる方法
によっても、またはSambrookら(1989)が記載したような組換えDNA手法によ
っても生成することができる。
ある。本発明のホスホペプチドの使用は、本発明者らが、特定のホスホイソ型と
のホスホペプチドの関係を決定し、特定のホスホ部位のリン酸化の程度を査定す
るのを可能にした(例1、1.5を参照されたい)。本発明のホスホペプチドの
使用は、タウの特定の分子形態を標準化された方法で定量するのを可能にするこ
とになる。
る。それらは、たとえば、ジ−tert−ブチルジイソプロピルジイソプロピルホス
ホアミダイトとの反応、および保護されていないセリンおよびトレオニン残基の
tert−ブチルヒドロペルオキシドによる酸化によって、集成後に製造することが
できる。また、ペプチド合成の際に、リン酸化されたアミノ酸を組み込むことに
よって製造することもできる。最近では、集成後リン酸化なしにホスホペプチド
を直接合成するための、新たなリン酸化セリン誘導体(N−α−Fmoc−O−ベン
ジル−L−ホスホセリン)が商業的に入手できる(Calbiochem-Novabiochem AG,
San Diego, CA 92121)。
ル抗体AT270との免疫学的複合体を容易に形成するホスホペプチドであって
、少なくとも、
の変異配列を含む、上記のとおりのホスホペプチドに関する。用語「変異配列」
は、配列番号:3で表されるペプチドの、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換
もしく欠失による、HT7およびAT270モノクローナル抗体を依然として認
識する、いかなる変種もしくはフラグメントも意味する。この用語は、糖鎖形成
、アセチル化、リン酸化、脂肪酸などによる修飾のような、ペプチドの翻訳後修
飾を具体的に意味せず、かつ除外もしない。この定義に包含されるのは、たとえ
ば、アミノ酸の1種類またはそれ以上の類似体(非天然アミノ酸を包含する)を
含むペプチド、置換された連関を有するペプチド、突然変異させたその改作、シ
ステイン残基の間にジスルフィド結合を有するペプチド、ビオチニル化されたペ
プチドはもとより、当技術に公知のその他の修飾である。
定する方法に用いる用途に関する。
法に、該ホスホペプチドを用いる用途に関する。
用いる用途に関する。
該ホスホペプチドを用いる用途に関する。
は、該個体のタウオパチーに対する、薬物の試験もしくはスクリーニングに、治
療上の追跡に、および/または一定の治療の効果を評価するのに用いることもで
きる。
は、該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を決定する工程と、そ
れを、健康な対照個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較する
工程とを含む。一実施態様では、ホスホタウ(181)および総タウは、in viv
o造影によって定量することができる。ホスホタウ(181)および総タウは、A
rbitら(1995)、Tamadaら(1995)、Wakabayashiら(1995)、Huangら(1996)
Sandrockら(1996)、Marianiら(1997)が記載した脳造影法を包含するが、こ
れらに限定されない、非侵襲的方法によって、in situで定量することができる
。これらのin vivo造影法は、それぞれ特異的に、ホスホタウ(181)を認識
するか、または総タウを認識する、標識化された抗体を用いることによって、ホ
スホタウ(181)および総タウの定位および定量を許し得る。
の試験もしくはスクリーニングに、治療上の追跡に、および/または一定の治療
の効果を評価するためのin vivo造影用マーカーとして用いることもできる。
類の抗体を含む、個体におけるタウオパチーの診断、および/または非タウオパ
チーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための診断キットに関する。
なくとも:
ペプチドを含む、上記のとおりの診断キットに関する。
なくとも:
なくとも:
づき、
ーナル抗体(一次抗体)と;
;
ためのマーカーと;
二次抗体とマーカーとの免疫学的反応を実施するのに適する緩衝液と;
タウオパチーの鑑別診断のための請求項15〜17のいずれか一項に記載の診断
キットの使用に関する。
び/または第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の診断に用いる
ための上記の診断キットの使用に関する。
/または白血病の患者における神経毒性と対比してのアルツハイマー病、ピック
病、散発性前頭側頭痴呆、および/または第17染色体連関パーキンソン病によ
る前頭側頭痴呆の鑑別診断に用いるための上記の診断キットの使用に関する。
のタウオパチーの鑑別診断用の診断キットの製造のための、神経学的マーカーと
して用いるための総タウおよびホスホタウ(181)の使用にも関する。
上の追跡、および/または一定の治療の有効性の決定に用いるための本発明のホ
スホペプチド、方法および/または診断キットの使用にも関する。
ない限り、単語「含む」、ならびに「含み」および「含んで」のような変化形は
、記述された完全体もしくは工程、または記述された完全体もしくは工程の群の
包含を意味するが、その他のいかなる完全体もしくは工程、または完全体もしく
は工程の群の除外も意味しないと解されることになる。
国における常識的な一般的知識の一部を形成することの承認、またはそのいかな
る形態の示唆でもなく、かつそれとしても解してはならない。
、例示する。しかし、これらの実施例は、例示的であり、いかなる方法でも本発
明を限定するとして解することはできない。
現系(Innogenetics, Gent、ベルギー国)内に増幅した。PCR産物の配列は、
配列決定によって確認した。変化は、コドン中の第三塩基対でのみ観察されたに
すぎない:Pro182でCAAに代えてCAG、Ala227でGCAに代えてGCG、お
よびAsn251でAATに代えてAAC。アミノ酸配列に関するすべての番号付けは
、最長のタウイソ型:hTau40を参照する〔Goedert et al., 1989〕。SacII部位
(アミノ酸第154〜155位)およびPstI部位(第242〜243位)に充填
することによるフレームシフト突然変異種の構成に基づいて、欠失突然変異種を
作成した。
ビオチニル化されたペプチドとして、実施した。サンドウィッチELISAのた
めのペプチドAc- PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE-NH2(第154〜1
87位)(配列番号:3)の大規模合成は、自社で、Neosystems(Strasbourg、
フランス国)によって合成した。品質管理は、RP−HPLC(逆相高圧液体ク
ロマトグラフィー)(純度>99%)、質量分析計による分析(平均MW=3,
454.8)、およびアミノ酸分析(正味ペプチド含量=84.3%)を含む。
tems, San Diego, CA92121)または紙上で、手動でペプチドを合成した。紙上で
合成されたペプチドについては、ジメチルアミノピリジンの存在下で、Fmoc−β
−アラニンの対称無水物(9−フルオレニルメトキシカルボニル−β−アラニン
)を用いて、紙を誘導体化した。Fmoc基を除去した後、第二のβ−アラニン残基
を、TBTU〔=2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1′,3
,3′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート〕による活性化後に加
えた。次いで、ペプチドを、スポットとして手動で合成した。
ホスホロアミダイトとの集成後反応、および保護されていないセリンおよびトレ
オニン残基のtert−ブチルヒドロペルオキシドによる酸化によって製造した。最
近では、集成後リン酸化なしにホスホペプチドを直接合成するための、新たなリ
ン酸化セリン誘導体(N−α−Fmoc−O−ベンジル−L−ホスホセリン)が商業
的に入手できる(Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121)。固体の
支持体から剥離した後に、逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC
)によって、ペプチドおよびホスホペプチドを精製した。ペプチドの品質は、質
量分析によって確認した。
93b〕、HT7〔Mercken et al., 1992〕、BT2〔Vandermeeren, et al., 199
3a〕およびAT270〔Goedert et al., 1994〕について記載されている。ペプ
チド−抗体相互作用を捕捉アッセーによって定量するために、ストレプトアビジ
ン(Roche Diagnostics, Brussels、ベルギー国)を、50mM炭酸緩衝液、pH9
.5中で5μg/mlで終夜被覆した。ブロックした後、ビオチニル化ペプチドを加
え、タウ抗体によって検出した。セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリン
グさせた第二の抗体を用いて、免疫反応を定量した。
被覆免疫プレートを、サンプルまたは標準75μlとともに、同時にビオチニル
化AT270とともに4℃で終夜温置した。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼで標識化したストレプトアビジン(RDI, Flanders, NJ、米国)を30分
間加えた。反応は、0.9NのH2SO450μlの添加によって停止した。
ついての41,065の計算分子量を用いて、pg/mlをpMに変換した。
、PstIおよびSacII部位に基づいて、欠失突然変異体を構築した。試験した抗体
、すなわちHT7、AT120、BT2およびタウ1は、すべて、プロリンに富
む領域に位置する(hTau40上で第154〜242位、データは示さず)。エピト
ープをさらに明確にするために、小さい重複ペプチドを合成した。第一工程では
、8個のアミノ酸が重複する、9アミノ酸長の48のペプチドを、ピン上に合成
した。配列は、155〜208位にわたった。AT120、HT7、BT2およ
びタウ1を試験した。5種類の抗体中4種類をマッピングすることができ、HT
7の最小エピトープは、PPGQK(第159〜163位)(配列番号:1)で
あったが、BT2およびタウ1の反応性は、識別不能であった:DRSGYS(
第193〜198位)(配列番号:6)(図1a)。AT120は、これらのペ
プチド上でマッピングできなかったため、第206〜232位からの配列を網羅
する、新たな1セットのペプチドを紙上に合成した。12アミノ酸長の、11ア
ミノ酸と重複する合計16のペプチドが、この領域を網羅するのに必要とされた
。AT120の最小エピトープは、配列PPTREPK(第218〜224位)
(配列番号:7)(図1b)によって規定される。
網羅する合成ホスホペプチドに対して確認した。これらのペプチドの配列を、表
1に要約する。これらの部位のうち12個所に対応する非リン酸化ペプチドを、
並行して分析した(図2)。AT270のみが、ホスホ−Thr181および/ま
たはホスホ−Thr175を含むホスホペプチドと反応した。これらのペプチドを
、捕捉アッセーで滴定し終えたとき、AT270は、ホスホ−Thr181のそれ
と比較して、ホスホ−Thr175を含むペプチドとモルベースで18倍、反応性
が乏しかった(結果は示さず)。最後に、第166〜196位の領域を網羅する
、15アミノ酸長のビオチニル化リン酸化ペプチドを用いて、最小エピトープを
画定した。免疫反応性ペプチドを図1cに示し、AT270の最小エピトープは
、PPAPKT(p)P(第176〜182位)(配列番号:2)であった。
を合成した。この配列は、HT7(第159〜163位)およびAT270(第
176〜182位)のエピトープ、ならびにHT7エピトープに対するN末端、
およびAT270に対するC末端の追加の5アミノ酸を網羅する。このホスホペ
プチドの正確な濃度を、アミノ酸分析を用いて決定した〔Blennow et al., 1995
〕。この濃度に基づくと、ペルオキシダーゼに基づくELISAの測定範囲は、
精密プロファイリングを用いて5〜300pMであった。アッセー内およびアッセ
ー間の変動係数は、10%未満であった。
に関連するかを決定するために、異なる5種類のPHF−タウプレパラートを、
それぞれのアッセーで同時に定量した。PHF−タウは、Goedertら(1992)に
従い、PHF−タウを脳抽出物上清から選択的に沈降させるために1%N−ラウ
ロイルサルコシナートを用いて、調製した。AD患者の側頭皮質(PHF−A〜
D)または海馬(PHF−E)からの組織を、Born-Bunge脳バンク(Dr. P. Cra
s, Antwerp、ベルギー国)から入手した。
プレパラート間で異なった。最高のホスホタウレベルを有するPHF−タウプレ
パラートが、100%に近いリン酸化の程度を有すると仮定すると、ホスホタウ
(181)/総タウ比は、リン酸化の程度の少なくとも3.3倍の過大評価とな
る。にもかかわらず、ホスホタウ(181)/総タウの比率が、リン酸化の程度
を過大評価することを斟酌すると、CSF−タウからのタウ中のThr181のリ
ン酸化の状態は、多くとも59±18%(1.952/3.3)であって、正常な条件下
での脳由来タウについてのThr181のリン酸化状態〔20〜30%;Watanabe
et al., 1993;Matsuo et al., 1994〕と密接に一致する。
ホタウ(181)を決定するアッセーにおける、標準化のためのホスホペプチド
の使用 2.1:患者 研究に含めたのは、FTDの患者18名(年齢範囲:48〜77歳)、ADの
患者60名(年齢範囲:可能性がある68〜88歳、蓋然性があるのは58〜9
0歳)、皮質下動脈硬化性脳症の患者17名(SAE:血管性痴呆の推定される
一形態)(年齢範囲:67〜84歳)、PDの患者15名(年齢範囲:59〜8
2歳)、および対照17名(年齢範囲:68〜80歳)であった。彼らの特徴を
、表2に要約する。
受けさせ、痴呆またはPDの患者についての予測的長期研究から、連続的に補充
した。臨床的診断を確定し、CSFのサンプリングを実施した。次いで、Instit
ute of Clinical Neuroscience, Sahlgrenska University Hospital, Moelndal
、スウェーデン国で神経化学的分析を実施した。精神的疾患の診断および統計マ
ニュアル〔Association AP, 1987〕または生化学的基準に従って、特定されない
痴呆(たとえば混合痴呆)、重い精神医学的疾病(たとえば精神***病)の病歴
、慢性アルコール中毒、明確な非退行性神経学的疾病(たとえば正常圧水頭症)
、重い頭部損傷の病歴、重いCNS内感染、全身性疾病(たとえば悪性腫瘍)、
および痴呆の二次的原因(たとえば甲状腺機能低下症)を有する患者は、除外し
た。大規模な脳梗塞および/または多数の空隙を有する患者も除外した。含まれ
た患者は、すべて、病歴、身体的、神経学的および精神医学的検査、血液のスク
リーニング検査室用試験(痴呆のその他の原因、たとえば甲状腺機能低下症を除
外するのに妥当な検査室用試験)CSFの定型的分析(たとえば細胞学)、EC
G、胸部X線、EEG、脳のコンピュータ化断層撮影(CT)または磁気共鳴造
影(MRI)、単一光子放射コンピュータ化断層撮影(SPECT)または133
キセノン吸入手法〔Cortexplorer; Risberg & Gustafson, 1983〕を用いた局所
的脳血流(CBF)の調査を包含する、臨床的調査を受けた。
Brun et al., 1994〕に従って診断した。FTD患者は、いずれも、梗塞の徴候
が皆無であり、数人のFTD患者に白質の軽い変化が見出されたにすぎない。
, 1984〕に従って、除外によってなされた。AD患者を、NINCDS−ADR
DAの基準によって定義されるとおり、蓋然ADの1群、および可能ADの1群
に区分した。
として、非狭窄−情動疾患、および前頭認識機能不全;(b)歩行障害(運動失
調および/または運動機能不全);(c)病巣性の神経学的徴候;(d)高血圧
および糖尿病のような血管性危険因子、または全身性血管病の存在;(e)MR
IまたはCTでの、二側散在性の皮質下−傍室深白質変化(>2mm)、小窩性梗
塞、拡大した心室系、および1個所を越える皮質梗塞の不在。基準は、他の研究
者〔Bennett et al., 1990〕が示唆したものと矛盾しなかった。SAE患者のう
ち15名は、皮質梗塞が皆無であり;残余の4名は、1個所の皮質梗塞があった
。
れた。PD患者は、すべて、運動緩慢、硬直および静止時振戦という三つの特徴
のうち少なくとも二つを示し、すべてのPD患者が、L−ドーパ投与に応答性で
あった。痴呆の何らかの徴候を示したPD患者は、皆無であり、すべて、27以
上のミニ精神状態検査(MMSE)〔Folstein et al., 1975〕の評点を有した
。
もなされた。患者のうち、その時点で痴呆を(たとえばコリンエステラーゼ阻害
剤によって)治療していたものは皆無であった。
の程度を評価した。
に含めた。
えばリウマチ様関節炎、伝染病)の病歴、症状もしくは徴候のない個体からなっ
た。MMSEを用いて、その認識状態を評価し、28未満の評点のものは、除外
した。
会が、研究を承認した。患者(またはその最近縁の親類)および対照は、すべて
、ヘルシンキ宣言の条項に従って実施される研究に参加するための、告知された
同意を与えた。
空で実施した。最初のCSF12mlを、ポリプロピレン管に捕集し、静かに混合
して、勾配効果〔Blennow et al., 1993〕を回避した。同時に、血清サンプルを
採取した。1μlあたり500を越える赤血球を有するCSFは、すべて、排除
した。CSFおよび血清サンプルを、2,000xgで10分間遠心分離して、
細胞その他の不溶性物質を除去した。次いで、アリコートを、生化学分析まで−
80℃で貯蔵した。
phelometer Analyzer(Behringwerke AG, Marburg、ドイツ国)を用いて実施し
た。CSF/血清アルブミン比〔Tibbling et al., 1977〕を、〔CSFアルブ
ミン(mg/L)/血清アルブミン(g/L)〕として算出し、血液脳関門(BBB)
機能の尺度として用いた。
t al., 1995〕とおり、総タウ(正常タウおよびPHF−タウの双方)を測定す
るよう構成した、サンドウィッチELISA(INNOTEST hTau-Ag:Innogenetics
, Gent、ベルギー国)を用いて決定した。
1P)によって決定した。
F−ホスホタウ)に関する群比較には、パラメトリック統計学を用いた。完全要
因多重分散分析を、それぞれ、従属変数としてCSF−タウおよびCSF−ホス
ホタウを、共変量として年齢、持続期間、および痴呆の重篤度を、因子として診
断カテゴリー(蓋然および可能AD、FTD、PD、SAE、および正常な加齢
)を用いて実施した。変動に寄与しない因子は、解析から除外し、再演算を実施
した。事後比較は、不等nについてのターキーの事後検定を用いて実施した。
<0.05)で有意に低かった。蓋然ADの患者は、可能ADの患者より有意に
痴呆性であった(p<0.05)。CSF/血清アルブミン比(痴呆群について
のみ)および性別に関しては、いかなる患者群または対照群間にも差が見出され
なかった(表2)。
びCSF−ホスホタウ(181) CSF−タウは、蓋然ADおよび可能ADで、FTD(p<0.001)、P
D(p<0.001)、SAE(p<0.001)および対照(p<0.001
)と比較して、またFTDで、SAE(p<0.01)と比較して有意に増加し
た(表3;図4)。
PD(p<0.001)、SAE(p<0.001)および対照(p<0.00
79)と比較して、また可能ADで、FTD(p<0.001)およびSAE(
p<0.001)と比較して有意に増加したが、対照と比較して増加しなかった
。さらに、CSF−ホスホタウ(181)は、対照と比較して、FTD(p<0
.0001)およびSAE(p<0.0001)でも有意に減少した(表3;図
5)。
断群で相関させた(蓋然および可能AD:r=0.86、p<0.001;FT
D:r=0.66、p<0.01;SAE:r=0.58、p<0.05;PD
:r=0.62、p<0.05;対照:r=0.65、p<0.01;図6)。
0.001;1.16±0.24)、可能AD(p<0.001;1.10±0
.20)およびFTD(p<0.001;0.88±0.34)で、対照(全3
群についてp<0.001;1.95±0.60)、PD(全3群についてp<
0.001;1.92±0.42)およびSAE(全3群についてp<0.00
1;1.96±1.08)と比較して、有意に減少していることが見出された。
F−ホスホタウ(181)およびCSF−総タウレベルの決定 3.1:患者 CSF−総タウおよびCSF−ホスホタウ(181)を、急性虚血性の患者2
2名(男子16名、女子6名、平均年齢±SD:65.7±9.2歳)からの長
期的CSFサンプルで検査した。患者は、すべて、以前に記載されたとおり〔Ta
rkowski et al., 1999〕、標準化された方法で評価した。可能なときは、CSF
サンプルを、5回の機会に捕集した:入来から0〜1日(n=9)、2〜3日(
n=18)、7〜9日(n=22)、3週(n=21)、および3〜5ヶ月(n
=21)。
3.3±7.4歳)、および健康な対照17名(男子4名、女子13名、平均年
齢±SD:68.6±7.5歳)を調べた。平均年齢は、対照群よりADで有意
に(p<0.05)に高かった。「蓋然AD」の診断は、NINCDS−ADR
DAの基準〔McKhann et al., 1984〕に従って、除外によって下した。臨床的評
価および診断手順は、別途詳述されている〔Andreasen et al., 1998, 1999〕。
痴呆の程度は、MMSE〔Folstein, 1975〕を用いて評価し、AD群で23.8
±4.4であった。対照群は、精神医学的または神経学的疾患、悪性疾患または
全身性障害の病歴、症状もしくは徴候のない個体からなった。28未満のMMS
E評点の個体は、除外した。臨床診断は、すべて、生化学的分析の結果を知らず
に実施され、その逆もなされた。
al., 1999〕、コンピュータ化断層撮影(CT)および磁気共鳴造影(MRI)
によって検査した。大きさ(cm2で表す)をCTによって、また体積(mlで表す
)をMRTによって決定した。
、2群間の比較にMann-WhitneyのU検定を用いた。補正には、Spearman相関係数
を用いた。
の最近縁の親類)および対照は、すべて、ヘルシンキ宣言の条項に従って実施さ
れる研究に参加するための、告知された同意を与えた。
を、ポリプロピレン管に捕集し、静かに混合して、場合による勾配効果を回避し
た〔Blennow, 1993〕。1μlあたり500を越える赤血球を有する、CSFサン
プルを排除した。CSFサンプルを、2,000xgで10分間遠心分離して、
細胞その他の不溶性物質を除去し、次いで、生化学分析まで−80℃で貯蔵した
。
lennow et al., 1995〕とおり、総タウ(正常タウおよびPHF−タウの双方)
を測定するよう構成した、サンドウィッチELISA(INNOTEST hTau-Ag:Inno
genetics, Gent、ベルギー国)を用いて決定した。CSF−ホスホタウ(181
)のレベルを、上記のとおり、INNOTESTホスホタウ(181P)によって決定し
た。
ウ(181)およびCSF−総タウ 卒中患者では、CSF−総タウは、急性発作の2〜3日後に(24.4±7.
4pM;p=0.002)、0〜1日(平均年齢±SD:5.4±1.2pM)と比
較して顕著な増加を示し、7〜9日(24.1±4.3pM;p<0.0001)
、および3週間後(25.0±4.1pM;p<0.0001)には上昇したまま
であり、次いで、3〜5ヶ月後(8.5±1.2pM;p=0.35)に正常レベ
ルに復帰した(図8)。基線で採取したCSFサンプルによる患者9名について
の、CSF−総タウについての個々の値を図9に示す。
±3.1pM)と、2〜3日(10.9±1.0pM)、7〜9日(13.0±2.
1pM)、3週間(11.5±2.0pM)または3〜5ヶ月(10.6±2.0pM
)との間に有意差はなかった(図8)。基線で採取したCSFサンプルによる患
者9名についての、CSF−ホスホタウ(181)についての個々の値を図9に
示す。
(8.3±2.8pM)(p<0.0001)と比較して有意に増加した。CSF
−ホスホタウ(181)も、蓋然AD(20.5±6.5pM)では、対照(15
.9±5.7pM)(p<0.05)と比較して有意に増加した。
93、p<0.0001)および対照群(r=0.72、p<0.01)で正の
相関関係がある(図10)。卒中群では、この相関関係は、0〜1日(r=0.
63、p<0.001)および3ヶ月後(r=0.80)の方が、2〜3日(r
=0.54)、7〜9日(r=0.58)、特に3週間後(r=0.15)より
強かった。
/CSF−総タウの比率の間には、卒中患者と比較して差があることは、明らか
である。アルツハイマー病患者(y=0.82±4.39、r=0.90、p<
0.0001)、および卒中患者(y=0.17±8.09、r=0.415、
p<0.0001)から得られた値についての回帰分析は、有意な差(p<0.
001)を示した。
との間には、正の相関関係があった(r=0.72;p<0.01)が、CSF
−ホスホタウ(181)との相関は、有意ではなかった(r=0.349)。M
RIによって測定した限りでの梗塞の体積と、CSF−総タウの最大値と間にも
、正の相関関係があった(r=0.66;p<0.05)が、CSF−ホスホタ
ウ(181)との相関関係は、有意ではなかった(r=0.59)。
よびAT270の精密マッピングを示す図である。免疫反応性ペプチドのみを示
す。A:ピン上で合成されたペプチド上のマッピング。8アミノ酸が重複する4
8のノナペプチドを用いて、155〜208のタウ領域を網羅した。B:紙上で
のペプチド合成。12アミノ酸長の重複する16ペプチドが、領域202〜23
2のAT120エピトープを画定する。C:領域166〜196を網羅するビオ
チニル化ホスホペプチド(リン酸化されたトレオニンを示す)上のAT270抗
体のマッピング。
Thr181に対するAT270の特異性を示すグラフである。1μg/mlの濃度の
ストレプトアビジンで被覆したプレート上に、ビオチニル化ホスホペプチドを捕
捉した。AT270は、ペルオキシダーゼとカップリングさせた二次抗体を介し
て検出した。ペプチドの配列を、表1に示す。
ベル(AT270−(HT7−BT2)アッセイ)との関係を示すグラフである
。いくつかのPHF−タウプレパラートを異なる希釈で検定した。数字は、PH
F−タウプレパラートの約0.5のOD450に相当する希釈からの、異なる2枚
のプレート上で二重に検定したとおりの生のデータを示す。グラフ上の棒は、標
準偏差である。PHF−A〜Dは、アルツハイマー病の脳の前頭側頭皮質に由来
し、PHF−Eは、海馬領域から調製した。
症におけるCSF−総タウの散乱プロットを示すグラフである。
症におけるCSF−ホスホタウ(181)の散乱プロットを示すグラフである。
を包含する相関関係のプロットを示すグラフである。
症の患者からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウ比の散乱プロットを示
すグラフである。
(181)(右)を示すグラフである。柱は平均値であり、棒はSDである。異
なる時点でのサンプル数;0〜1日:n=9、2〜3日:n=18、7〜9日:
n=22、3週:n=21、3〜5月:n=21。0〜1日と比較した有意度;
CSF−タウについては、2〜3日:p=0.002、7〜9日:p<0.00
01、3週:p<0.0001、3〜5月:p=0.035、CSF−ホスホタ
ウについては、0〜1日と比較していかなる時点でも有意差はなかった。
F−総タウ(左)およびCSF−ホスホタウ(181)(右)の個々の値を示す
グラフである。
びに急性卒中の患者(n=22、サンプル数=91)(右)におけるCSF−総
タウとCSF−ホスホタウ(181)との相関関係を示すグラフである。
Claims (20)
- 【請求項1】 個体におけるタウオパチーを診断する方法であって、 ・該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を決定する工程と; ・得られた該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を、対照個体に
おけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較することによって該個体がタ
ウオパチーに罹患していることを推論する工程であって、対照個体における該比
率と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の変化が指標である工程と を含む方法。 - 【請求項2】 個体における非タウオパチーと対比してのタウオパチーを鑑
別診断する方法であって、 ・該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を測定する工程と; ・得られた該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を、非タウオパ
チーに罹患している個体で得られたホスホタウ(181)/総タウの比率とか、
または対照個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率と比較することに
よって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程、非タウオパチ
ーに罹患している個体、または対照個体における該比率と比較したホスホタウ(
181)/総タウの比率の変化が指標である工程と を含む方法。 - 【請求項3】 タウオパチーの診断用、および/または非タウオパチーと対
比してのタウオパチーの鑑別診断用の診断キットの製造のための、神経学的マー
カーとしてのタウおよびホスホタウ(181)の使用。 - 【請求項4】 該非タウオパチーが、非タウオパチー神経変性である、請求
項2又は3に記載の方法。 - 【請求項5】 該非タウオパチーが、血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコ
ブ病、卒中、および/または白血病の患者における神経毒性である、請求項2〜
4のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項6】 タウオパチーが、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭
側頭痴呆、および/または第17染色体関連パーキンソン病による前頭側頭痴呆
である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項7】 下記の工程: ・該個体から脳脊髄液サンプルを得る工程と; ・該脳脊髄液サンプル中のホスホタウ(181)/総タウの比率を決定する工程
と; ・得られた該個体におけるホスホタウ(181)/総タウの比率を、非タウオパ
チーに罹患している個体からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウの比率
とか、または対照個体からのCSF中のホスホタウ(181)/総タウの比率と
比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程
であって、非タウオパチーに罹患している個体からのCSF中のか、または対照
個体からのCSF中の該比率と比較したホスホタウ(181)/総タウの比率の
変化が指標となる工程と を含む請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項8】 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法において神経学的
マーカーとして用いるためのタウおよびホスホタウ(181)。 - 【請求項9】 モノクローナル抗体HT7およびモノクローナル抗体AT2
70との免疫学的複合体を容易に形成するホスホペプチドであって、少なくとも
、 ・HT7の最小エピトープ:PPGQK(配列番号1);および ・AT270の最小エピトープ:PPAPKT(p)P(配列番号2) を含む、ホスホペプチド。 - 【請求項10】 該ホスホペプチドが、下記の配列: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE(配列番号:3) または依然としてHT7およびAT270モノクローナル抗体に結合する条件で
の変異配列を含む、請求項9記載のホスホペプチド。 - 【請求項11】 ホスホタウ(181)のレベルを測定する方法における請
求項9又は10に記載のホスホペプチドの使用。 - 【請求項12】 請求項1〜7のいずれか一項に記載のタウオパチーの診断
、および/または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法に
おける請求項9又は10に記載のホスホペプチドの使用。 - 【請求項13】 ホスホタウ(181)のレベルを測定するための診断キッ
トの製造のための請求項9又は10に記載のホスホペプチドの使用。 - 【請求項14】 請求項1〜7のいずれか一項に記載のタウオパチーの診断
、および/または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための
診断キットの製造のための請求項9又は10に記載のホスホペプチドの使用。 - 【請求項15】 個体におけるタウオパチーの診断、および/または非タウ
オパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための診断キットであって、少
なくとも: ・ホスホタウ(181)を特異的に認識する抗体と; ・タウを認識する抗体と を含む診断キット。 - 【請求項16】 個体におけるタウオパチーの診断、および/または非タウ
オパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のために、ホスホタウ(181)
のレベルを測定するための診断キットであって、少なくとも請求項9又は10に
記載のペプチドを含む診断キット。 - 【請求項17】 少なくとも: ・ホスホタウ(181)を特異的に認識する抗体と; ・タウを認識する抗体と; ・請求項9又は10に記載のペプチドと を含む請求項15又は16に記載の診断キット。
- 【請求項18】 タウオパチーの診断、および/または非タウオパチーと対
比してのタウオパチーの鑑別診断のための請求項15〜17のいずれか一項に記
載の診断キットの使用。 - 【請求項19】 アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆および
/または第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の診断のため、お
よび/または血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中および/または白
血病の患者における神経毒性と対比してのアルツハイマー病、ピック病、散発性
前頭側頭痴呆および/または第17染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴
呆の鑑別診断に用いるための請求項15〜17のいずれか一項に記載の診断キッ
トの使用。 - 【請求項20】 薬物の試験もしくはスクリーニングのための、診断追跡の
ための、および/または一定の処置の有効性の決定のための請求項1〜19のい
ずれか一項に記載のホスホペプチド、方法および/または診断キットの使用。
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