JP2003514535A - 複合リノール酸を製造する方法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、複合リノール酸、特に、そのシス−９、トランス−１１異性体をリノール酸から発酵により製造する方法に関する。本発明はまた、この方法により製造された産物に関する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、複合リノール酸を製造するための方法に関する。特に、複合リノー
ル酸、とりわけそのシス−９、トランス−１１異性体をリノール酸から発酵によ
り製造する方法を開示する。
ル酸、とりわけそのシス−９、トランス−１１異性体をリノール酸から発酵によ
り製造する方法を開示する。
【０００２】
（発明の背景）
ＣＬＡは、複合リノール酸の種々の異性体についての包括的用語である。その
２つの異性体（シス−９、トランス−１１異性体、すなわちボビン酸およびトラ
ンス−１０、シス−１２異性体）にのみ生物学的活性が認められている。合成的
に製造された市販のＣＬＡは、すべての異なるＣＬＡ異性体を一般的に含有し、
ｃ９,ｔ１１異性体は４０％に過ぎない。一方、ミルクはｃ９,ｔ１１−１８：２
異性体を８０％含有する。
２つの異性体（シス−９、トランス−１１異性体、すなわちボビン酸およびトラ
ンス−１０、シス−１２異性体）にのみ生物学的活性が認められている。合成的
に製造された市販のＣＬＡは、すべての異なるＣＬＡ異性体を一般的に含有し、
ｃ９,ｔ１１異性体は４０％に過ぎない。一方、ミルクはｃ９,ｔ１１−１８：２
異性体を８０％含有する。
【０００３】
いくつかの研究報告によると、動物脂肪は、とりわけ試験動物において癌を阻
止し、生長因子に影響を与え、生体内での脂肪組織の量を調節し得る脂肪酸を含
有する。ハンバーガー肉を調べて、Michael Pariza は、複合リノール酸（ＣＬ
Ａ）と検定された脂肪酸が含有されていることを発見した。動物試験でＣＬＡ含
有食を摂取した群で、対照群に比して乳癌、胃癌、大腸癌の発生が減少した（Pa
riza, M.W., Loretz, L.J., Storkson, J.M., Holland, N.C., Mutagens and mo
dulator of mutagenesis in fried ground beef, Cancer Res. (Suppl.), 1983,
43: 2444s-2446s; Pariza, M.W., Hargraves, W.A., A beef-derived mutagene
sis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumors by 7, 12-dim
ethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 1985, 1985, 6: 591-593)。ヒト細胞の
組織培養においても、ＣＬＡは癌細胞の発育を阻害し得る。ＣＬＡがどのように
作用し得るかはまだ未知であるが、ＣＬＡが腫瘍形成の種々の段階、多くの生長
因子、肝での癌原性物質の代謝に対して作用を有することが知られている。ＣＬ
Ａが抗酸化物質として作用することも示唆されており（Ip, C., Chin, S.F., Sc
imeca, J.A., Pariza, M.W., Mammary cancer prevention by congugated dieno
ic derivatives of linoleic acid, Cancer Res., 1991, 51: 6118-6124)、これ
によりこの化合物が遊離基の有害作用から細胞膜を保護するのであろう。この化
合物のコレステロール低下作用も調べられ、この物がコレステロール低下剤のよ
うに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の量を下げないことが分かっている（Lee,
K.N., Kritchevsky, D., Pariza, M.W., Conjugated linoleic acid and ather
osclerosis in rabbits, Atherosclerosis, 1994, 108: 19-25)。ＣＬＡは、脂
肪組織を分割することがわかっているので、減量剤にも好適であり得る（Park e
t al., Changes in Body Composition in Mice during Feeding and Withdrawal
of Conjugated Linoleic Acid, Lipids, 1999, 34: 243-248)。
止し、生長因子に影響を与え、生体内での脂肪組織の量を調節し得る脂肪酸を含
有する。ハンバーガー肉を調べて、Michael Pariza は、複合リノール酸（ＣＬ
Ａ）と検定された脂肪酸が含有されていることを発見した。動物試験でＣＬＡ含
有食を摂取した群で、対照群に比して乳癌、胃癌、大腸癌の発生が減少した（Pa
riza, M.W., Loretz, L.J., Storkson, J.M., Holland, N.C., Mutagens and mo
dulator of mutagenesis in fried ground beef, Cancer Res. (Suppl.), 1983,
43: 2444s-2446s; Pariza, M.W., Hargraves, W.A., A beef-derived mutagene
sis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumors by 7, 12-dim
ethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 1985, 1985, 6: 591-593)。ヒト細胞の
組織培養においても、ＣＬＡは癌細胞の発育を阻害し得る。ＣＬＡがどのように
作用し得るかはまだ未知であるが、ＣＬＡが腫瘍形成の種々の段階、多くの生長
因子、肝での癌原性物質の代謝に対して作用を有することが知られている。ＣＬ
Ａが抗酸化物質として作用することも示唆されており（Ip, C., Chin, S.F., Sc
imeca, J.A., Pariza, M.W., Mammary cancer prevention by congugated dieno
ic derivatives of linoleic acid, Cancer Res., 1991, 51: 6118-6124)、これ
によりこの化合物が遊離基の有害作用から細胞膜を保護するのであろう。この化
合物のコレステロール低下作用も調べられ、この物がコレステロール低下剤のよ
うに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の量を下げないことが分かっている（Lee,
K.N., Kritchevsky, D., Pariza, M.W., Conjugated linoleic acid and ather
osclerosis in rabbits, Atherosclerosis, 1994, 108: 19-25)。ＣＬＡは、脂
肪組織を分割することがわかっているので、減量剤にも好適であり得る（Park e
t al., Changes in Body Composition in Mice during Feeding and Withdrawal
of Conjugated Linoleic Acid, Lipids, 1999, 34: 243-248)。
【０００４】
他方、非複合リノール酸は、有害作用、例えば、乳癌に対する促進作用を有す
ることが報告されている。非複合リノール酸の抗微生物作用も一般に知られてい
る。
ることが報告されている。非複合リノール酸の抗微生物作用も一般に知られてい
る。
【０００５】
ＣＬＡを化学的または酵素的異性化によりつくることができる。天然のＣＬＡ
は、例えば反芻動物の第一胃においてポリ不飽和脂肪酸から細菌 Butyrivibrio
fibrisolvens の生物活性の結果として形成され、それから乳汁および肉に分泌
される。乳汁および肉はＣＬＡの最上の供給原である。
は、例えば反芻動物の第一胃においてポリ不飽和脂肪酸から細菌 Butyrivibrio
fibrisolvens の生物活性の結果として形成され、それから乳汁および肉に分泌
される。乳汁および肉はＣＬＡの最上の供給原である。
【０００６】
食物から摂取されるＣＬＡの量が過去十年間でかなり減少していることがわか
っている。食物分析からの計算によると１９７０年代で平均的食事は１日につき
約０.４５ｇのＣＬＡを含有していた。ミルクおよび乳製品の使用の減少により
、平均のＣＬＡ１日摂取量が現在では０.２５ｇとなった。食物中の天然ＣＬＡ
を増加せしめることが健康上の観点から非常に重要である。研究者によると、Ｃ
ＬＡ摂取を倍にすると癌の危険性を減じることができよう。
っている。食物分析からの計算によると１９７０年代で平均的食事は１日につき
約０.４５ｇのＣＬＡを含有していた。ミルクおよび乳製品の使用の減少により
、平均のＣＬＡ１日摂取量が現在では０.２５ｇとなった。食物中の天然ＣＬＡ
を増加せしめることが健康上の観点から非常に重要である。研究者によると、Ｃ
ＬＡ摂取を倍にすると癌の危険性を減じることができよう。
【０００７】
ＣＬＡ源としてのすべての食物、特に、ミルクの重要性について、いくつかの
研究が発表されている。例えば、フインランドの疫学的調査（Knekt et al.、口
頭発表）によると、ミルクの使用が乳癌の危険性を減少した。現在、乳脂肪中の
ＣＬＡ濃度は餌の質にかなり依存して季節的に変動する（２.４〜２８.１ｍｇ／
ｇ脂肪)。
研究が発表されている。例えば、フインランドの疫学的調査（Knekt et al.、口
頭発表）によると、ミルクの使用が乳癌の危険性を減少した。現在、乳脂肪中の
ＣＬＡ濃度は餌の質にかなり依存して季節的に変動する（２.４〜２８.１ｍｇ／
ｇ脂肪)。
【０００８】
腸管中の有益な微生物がＣＬＡをつくることがわかっている。特に第一胃にお
いて生じる細菌 Butyrivibrio fibrisolvens およびそのイソメラーゼ酵素につ
いて研究されている。しかし、この細菌は嫌気性であるので、工業的規模でＣＬ
Ａをつくり得ない。この株が必要とする完全な嫌気性状態を得るのは困難であり
、経済的でないからである（米国特許５,８５６,１４９、Pariza et al.)。
いて生じる細菌 Butyrivibrio fibrisolvens およびそのイソメラーゼ酵素につ
いて研究されている。しかし、この細菌は嫌気性であるので、工業的規模でＣＬ
Ａをつくり得ない。この株が必要とする完全な嫌気性状態を得るのは困難であり
、経済的でないからである（米国特許５,８５６,１４９、Pariza et al.)。
【０００９】
Propionibacterium acnes もＣＬＡをつくることが知られている。しかし、こ
の病原性株は、つくられたＣＬＡをさらに他の脂肪酸に還元するレダクターゼ酵
素をも産生する（Verhulst et al., System. Appln. Microbiol., 9: 12-15 (19
87))。
の病原性株は、つくられたＣＬＡをさらに他の脂肪酸に還元するレダクターゼ酵
素をも産生する（Verhulst et al., System. Appln. Microbiol., 9: 12-15 (19
87))。
【００１０】
いくつかのプロピオン酸バクテリウムがリノール酸を複合シス−９、トランス
−１１の形態に転換し得ることも一般に知られている。
−１１の形態に転換し得ることも一般に知られている。
【００１１】
さらに、遊離リノール酸のＣＬＡへの転換はトリグリセリド形態における脂肪
酸の転換よりも効率的であることが一般に知られている。しかし、遊離のリノー
ル酸はプロピオン酸バクテリウムの生長に対する阻害作用を比較的低濃度で有し
、この作用が複合リノール酸、特にそのシス−９、トランス−１１形態の大規模
での産生を妨げる。
酸の転換よりも効率的であることが一般に知られている。しかし、遊離のリノー
ル酸はプロピオン酸バクテリウムの生長に対する阻害作用を比較的低濃度で有し
、この作用が複合リノール酸、特にそのシス−９、トランス−１１形態の大規模
での産生を妨げる。
【００１２】
米国特許５,８５６,１４９（Pariza および Yang) は、非複合で不飽和（９お
よび１２位での二重結合）脂肪酸の Lactobacillus reuterii 特に L. reuterii
PYR8 株による転換によりシス−９、トランス−１１脂肪酸をつくる方法を開示
している。この開示では、ＣＬＡ産生株の単離について記載され、４５の単離株
のうち僅か４が所望のリノール酸イソメラーゼ活性を有し、リノール酸からＣＬ
Ａをつくり得る。この研究者は、つくられたＣＬＡ量が細胞の量に直接比例する
ことを観察し、リノール酸イソメラーゼが細胞生長における機能的な意味をもた
ない蓄積酵素であると推定した。この開示は、リノール酸の細菌生長に対する阻
害作用について言及しておらず、したがって、この問題を解消する解決法を提起
していない。
よび１２位での二重結合）脂肪酸の Lactobacillus reuterii 特に L. reuterii
PYR8 株による転換によりシス−９、トランス−１１脂肪酸をつくる方法を開示
している。この開示では、ＣＬＡ産生株の単離について記載され、４５の単離株
のうち僅か４が所望のリノール酸イソメラーゼ活性を有し、リノール酸からＣＬ
Ａをつくり得る。この研究者は、つくられたＣＬＡ量が細胞の量に直接比例する
ことを観察し、リノール酸イソメラーゼが細胞生長における機能的な意味をもた
ない蓄積酵素であると推定した。この開示は、リノール酸の細菌生長に対する阻
害作用について言及しておらず、したがって、この問題を解消する解決法を提起
していない。
【００１３】
文献（J., Jiang, L. Bjoerck, R. Fonden: Production of conjugated linol
eic acid by dairy starter cultures, J. Appl. Nicrobiol., 85 (1998), pp.
95-105) によると、プロピオン酸バクテリウムはリノール酸をＣＬＡに転換でき
る。生育培地に加えられたリノール酸をＣＬＡに転換する１９種の異なる出発物
細菌の能力が調べられ、成熟チーズが他の乳製品よりも高いレベルのＣＬＡを含
有することが認められた。７ lactobacillus 株、４ lactococcus 株、２ strep
tococcus 株、６プロピオン酸バクテリウムについてリノール酸からＣＬＡをＭ
ＲＳ、ミルク、乳酸ナトリウム培地においてつくる能力が調べられた。さらに、
異なるリノール酸濃度についてリノール酸をＭＲＳ肉汁に Tween 80 界面活性剤
水溶液中で加えて調べられた。試験された細菌のうち少数のプロピオン酸バクテ
リウムのみが生物的転換活性を有した。６種の株のうち３種、すなわち Propion
ibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii PFF および PFF6、 P. freud
enreichii ssp. shermanii PFS が活性を示した。元のリノール酸濃度７５０μ
ｇ／ｍｌから高収率２６５μｇ／ｍｌのＣＬＡが PFF6 株で得られた。つくられ
たＣＬＡのうち、７０ないし９０％が生物学的に活性のｃ９,ｔ１１異性体であ
った。lactobacillus、lactococcus、streptococcus はいずれもＣＬＡを産生し
なかった。
eic acid by dairy starter cultures, J. Appl. Nicrobiol., 85 (1998), pp.
95-105) によると、プロピオン酸バクテリウムはリノール酸をＣＬＡに転換でき
る。生育培地に加えられたリノール酸をＣＬＡに転換する１９種の異なる出発物
細菌の能力が調べられ、成熟チーズが他の乳製品よりも高いレベルのＣＬＡを含
有することが認められた。７ lactobacillus 株、４ lactococcus 株、２ strep
tococcus 株、６プロピオン酸バクテリウムについてリノール酸からＣＬＡをＭ
ＲＳ、ミルク、乳酸ナトリウム培地においてつくる能力が調べられた。さらに、
異なるリノール酸濃度についてリノール酸をＭＲＳ肉汁に Tween 80 界面活性剤
水溶液中で加えて調べられた。試験された細菌のうち少数のプロピオン酸バクテ
リウムのみが生物的転換活性を有した。６種の株のうち３種、すなわち Propion
ibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii PFF および PFF6、 P. freud
enreichii ssp. shermanii PFS が活性を示した。元のリノール酸濃度７５０μ
ｇ／ｍｌから高収率２６５μｇ／ｍｌのＣＬＡが PFF6 株で得られた。つくられ
たＣＬＡのうち、７０ないし９０％が生物学的に活性のｃ９,ｔ１１異性体であ
った。lactobacillus、lactococcus、streptococcus はいずれもＣＬＡを産生し
なかった。
【００１４】
このように、Jiang et al.に記載の方法では、最良のプロピオン酸バクテリウ
ム、PFF6 株が、加えられたリノール酸のわずか３５％をＣＬＡに転換できる。
この研究者によると、プロピオン酸バクテリウムのＣＬＡ産生はその遊離リノー
ル酸に対する耐性に正相関する。この研究でまた、リノール酸が細菌の生長を阻
害する抗微生物作用を有することが確認された。この開示は、抗微生物性脂肪酸
の作用は洗剤などの界面活性剤、例えば Tween 80 やタンパク質を用いることに
より低下することがあると述べている。しかし、この面での研究はなされておら
ず、この開示は可能性ある有用な技法について述べていない。
ム、PFF6 株が、加えられたリノール酸のわずか３５％をＣＬＡに転換できる。
この研究者によると、プロピオン酸バクテリウムのＣＬＡ産生はその遊離リノー
ル酸に対する耐性に正相関する。この研究でまた、リノール酸が細菌の生長を阻
害する抗微生物作用を有することが確認された。この開示は、抗微生物性脂肪酸
の作用は洗剤などの界面活性剤、例えば Tween 80 やタンパク質を用いることに
より低下することがあると述べている。しかし、この面での研究はなされておら
ず、この開示は可能性ある有用な技法について述べていない。
【００１５】
ＷＯ９９／２９８８６（J. Jiang, L. Bjoerck, R. Fonden) は、上記の文献
の研究結果に部分的に基づいている。その適用は、インビトロでＣＬＡをつくる
ために食材で有用な具体的な細菌を利用することに関している。Propionibacter
ium freudenreichii ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. she
rmanii に加えて、適当な細菌に Bafidobacterium breve がある。この開示によ
ると、発酵を乳化剤の存在で実施できる。例として Tween 80 およびレシチンが
ある。しかし、乳化剤の使用はこの開示の実施例に記載されていない。得られる
最良の結果は上記開示と同じであると報告されている。すなわち、２４６.４μ
ｇ／ｍｌの生物活性ｃ９,ｔ１１異性体が元のリノール酸濃度７５０μｇ／ｍｌ
から、株 PFF6 を用いて得られた。収率は３３％以下である。
の研究結果に部分的に基づいている。その適用は、インビトロでＣＬＡをつくる
ために食材で有用な具体的な細菌を利用することに関している。Propionibacter
ium freudenreichii ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. she
rmanii に加えて、適当な細菌に Bafidobacterium breve がある。この開示によ
ると、発酵を乳化剤の存在で実施できる。例として Tween 80 およびレシチンが
ある。しかし、乳化剤の使用はこの開示の実施例に記載されていない。得られる
最良の結果は上記開示と同じであると報告されている。すなわち、２４６.４μ
ｇ／ｍｌの生物活性ｃ９,ｔ１１異性体が元のリノール酸濃度７５０μｇ／ｍｌ
から、株 PFF6 を用いて得られた。収率は３３％以下である。
【００１６】
したがって、改善された収率でもって複合リノール酸を産生する方法が提供さ
れることは、明らかに必要である。遊離リノール酸の最大可能量をＣＬＡの出発
物質として利用しようとするときに、基本的なことは、遊離リノール酸の抗微生
物作用に関連する問題をいかにして小さくまたは無くし得るかである。
れることは、明らかに必要である。遊離リノール酸の最大可能量をＣＬＡの出発
物質として利用しようとするときに、基本的なことは、遊離リノール酸の抗微生
物作用に関連する問題をいかにして小さくまたは無くし得るかである。
【００１７】
（発明の簡単な記述）
本発明の目的は、複合リノール酸を優れた収率で製造するための新しい方法を
提供することである。 本発明の目的はまた、本発明方法を用いて製造され、多量のＣＬＡを含有する
新規な産物を提供することである。
提供することである。 本発明の目的はまた、本発明方法を用いて製造され、多量のＣＬＡを含有する
新規な産物を提供することである。
【００１８】
（発明の詳細な記述）
本発明は、遊離リノール酸の細菌生長に対する作用が、リノール酸を培地に、
細菌の生長をかなり阻害するのではなく、培養の際に細菌に利用されるような形
態で、添加することにより低下されるとの考えに基づく。
細菌の生長をかなり阻害するのではなく、培養の際に細菌に利用されるような形
態で、添加することにより低下されるとの考えに基づく。
【００１９】
本発明により、リノール酸を反応肉汁にミセル(微胞)混合物として添加すると
きに、いかなる他の形態のリノール酸よりも非常に低い細菌生長に対する阻害作
用を有することが分かった。適当に多量の界面活性剤の添加により、培養状態で
リノール酸はミセルで保持される。これも、それだけでリノール酸の細菌生長に
対する阻害作用を低下する。培養におけるミセル状リノール酸の使用およびその
ミセルの安定化もＣＬＡの収率を非常に改善する。
きに、いかなる他の形態のリノール酸よりも非常に低い細菌生長に対する阻害作
用を有することが分かった。適当に多量の界面活性剤の添加により、培養状態で
リノール酸はミセルで保持される。これも、それだけでリノール酸の細菌生長に
対する阻害作用を低下する。培養におけるミセル状リノール酸の使用およびその
ミセルの安定化もＣＬＡの収率を非常に改善する。
【００２０】
ミセル化リノール酸を発酵の出発物質をして使用すること、および適当なリノ
ール酸対界面活性剤の比率を選択することにより、リノール酸のＣＬＡへの９０
％以上の転換が可能であり、形成されたＣＬＡの９７％以上が培地に分泌される
。本発明により、細菌がリノール酸をＣＬＡ、特にｃ９,ｔ１１異性体に効率的
に転換せしめ得る形態に、その生長に対するリノール酸の阻害作用による反応な
しに、多量のリノール酸を製造することを開発した。
ール酸対界面活性剤の比率を選択することにより、リノール酸のＣＬＡへの９０
％以上の転換が可能であり、形成されたＣＬＡの９７％以上が培地に分泌される
。本発明により、細菌がリノール酸をＣＬＡ、特にｃ９,ｔ１１異性体に効率的
に転換せしめ得る形態に、その生長に対するリノール酸の阻害作用による反応な
しに、多量のリノール酸を製造することを開発した。
【００２１】
このように、本発明は、リノール酸からＣＬＡを微生物で製造する方法に関す
る。この方法は、出発物質として使用されるリノール酸をミセルの形態で反応肉
汁に添加することを特徴とする。
る。この方法は、出発物質として使用されるリノール酸をミセルの形態で反応肉
汁に添加することを特徴とする。
【００２２】
ミセルは遊離リノール酸および界面活性剤を適当な比率で含有する。
本発明はさらに、本発明方法により製造された産物、それ自体の使用、機能性
食品および健康増進物質の製造における使用に関する。
食品および健康増進物質の製造における使用に関する。
【００２３】
ミセル化は、リノール酸とミセル形成界面活性剤とを適当な比率でアルカリ性
の下に混合するという簡単な方法で実施できる。製造には、特別の条件や特別の
施設を必要としない。この方法は簡単であり、費用がかからず、大規模でも実施
が容易である。
の下に混合するという簡単な方法で実施できる。製造には、特別の条件や特別の
施設を必要としない。この方法は簡単であり、費用がかからず、大規模でも実施
が容易である。
【００２４】
遊離リノール酸を本発明のミセル化に使用する。遊離リノール酸は市販されて
いる。あるいは、遊離リノール酸は、植物油、例えば、ベニバラ油、トウモロコ
シ油、ヒマワリ油などから、それ自体公知の方法（参照、例えば、Christie, W.
W., Gas Chromatography and Lipids - a Practical Guide, 2 edition, 1989,
The Oily Press, Ary, Scotland）によるけん化を用いて遊離の脂肪酸を加水分
解して製造することもできる。
いる。あるいは、遊離リノール酸は、植物油、例えば、ベニバラ油、トウモロコ
シ油、ヒマワリ油などから、それ自体公知の方法（参照、例えば、Christie, W.
W., Gas Chromatography and Lipids - a Practical Guide, 2 edition, 1989,
The Oily Press, Ary, Scotland）によるけん化を用いて遊離の脂肪酸を加水分
解して製造することもできる。
【００２５】
これは、純粋で遊離リノール酸が非常に高価なことを考慮するとしばしば経済
的な別法となる。さらに、合成されたリノール酸は、化学的残留物からして食品
材料における使用にかならずしも常に適切といえない。
的な別法となる。さらに、合成されたリノール酸は、化学的残留物からして食品
材料における使用にかならずしも常に適切といえない。
【００２６】
ベニバラ油はリノール酸の好適な材料である。この物は７８％以上のリノール
酸を含有し、それから得られる遊離の脂肪酸物は市販の遊離リノール酸よりも百
倍も経済的である。
酸を含有し、それから得られる遊離の脂肪酸物は市販の遊離リノール酸よりも百
倍も経済的である。
【００２７】
本発明の観点からして、界面活性剤の選択は重要なパラメーターではない。例
えば、マイクロ生物学の分野で広く使用されているポリオキシエチレンソルビタ
ンエステル（Tween 製剤)(いくつかの製造業者、例えば、Fluka や Sigma）およ
びＰＥＧ２０ソルビタンオレエート Kotilen-0/1 VL (Dr. W. Kolb AG) が本目
的に適している。いくつかの他の界面活性剤も使用できる。
えば、マイクロ生物学の分野で広く使用されているポリオキシエチレンソルビタ
ンエステル（Tween 製剤)(いくつかの製造業者、例えば、Fluka や Sigma）およ
びＰＥＧ２０ソルビタンオレエート Kotilen-0/1 VL (Dr. W. Kolb AG) が本目
的に適している。いくつかの他の界面活性剤も使用できる。
【００２８】
上記のように、ミセル化リノール酸のＣＬＡへの転換は、発酵により効率的に
実施できる。発酵において、リノール酸をＣＬＡに転換できるいかなる細菌も使
用可能である。そのような細菌は上記の背景技術で述べた。しかし、好都合な発
酵は、食品用の細菌、特にプロピオン酸バクテリウムで行い得る。適当な株には
、例えば、Propionibacterium freudenreichii 種、特に亜種 P. freudenreichi
i ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. shermanii に属する種
がある。
実施できる。発酵において、リノール酸をＣＬＡに転換できるいかなる細菌も使
用可能である。そのような細菌は上記の背景技術で述べた。しかし、好都合な発
酵は、食品用の細菌、特にプロピオン酸バクテリウムで行い得る。適当な株には
、例えば、Propionibacterium freudenreichii 種、特に亜種 P. freudenreichi
i ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. shermanii に属する種
がある。
【００２９】
ミセル性リノール酸は、界面活性剤すなわち洗剤を培地に、培地の作用を消失
せしめるような量で添加することにより安定化する。上記の物質、Tween および
Kotilen などを界面活性剤として使用できる。適切な界面活性剤の濃度は、添
加されるミセル性リノール酸の量および使用される培地に依存する。界面活性剤
は、通常０.５ないし１.５％、好ましくは１％で使用する。ミセル化リノール酸
は、このようにＣＬＡの出発物質として発酵肉汁に添加する。
せしめるような量で添加することにより安定化する。上記の物質、Tween および
Kotilen などを界面活性剤として使用できる。適切な界面活性剤の濃度は、添
加されるミセル性リノール酸の量および使用される培地に依存する。界面活性剤
は、通常０.５ないし１.５％、好ましくは１％で使用する。ミセル化リノール酸
は、このようにＣＬＡの出発物質として発酵肉汁に添加する。
【００３０】
本発明の新規な技術により、リノール酸を少なくとも１,０００μｇ／ｍｌ培
地まで発酵肉汁に、細菌生長のかなりの変化または転換効率の低下なしに、添加
できる。バイオ転換が本発明法では既知の方法よりも非常に優れている。すなわ
ち、少なくとも８０％のリノール酸がＣＬＡに転換し、少なくとも７５％のＣＬ
Ａ量が生物学的に最も活性な異性体である。
地まで発酵肉汁に、細菌生長のかなりの変化または転換効率の低下なしに、添加
できる。バイオ転換が本発明法では既知の方法よりも非常に優れている。すなわ
ち、少なくとも８０％のリノール酸がＣＬＡに転換し、少なくとも７５％のＣＬ
Ａ量が生物学的に最も活性な異性体である。
【００３１】
発酵はそれ自体既知の方法で実施する。培地および条件は、最適量のＣＬＡを
提供するのに使用される株が必要とする要件を満たすように選択する。本発明が
公知になると、適切な発酵パラメーターの選択は当業者に明らかである。
提供するのに使用される株が必要とする要件を満たすように選択する。本発明が
公知になると、適切な発酵パラメーターの選択は当業者に明らかである。
【００３２】
ミセル化リノール酸を用いて、リノール酸の生長阻害作用を消失せしめて、細
菌生長に関連するＣＬＡをつくることができる。ＣＬＡは、他の目的での細胞産
生と同時につくることもできる。本発明方法のひとつの特徴は、ＣＬＡを細胞培
養またはそれからの分離の後に、睡眠中すなわち非生長性の細胞によってつくり
得ることである。これによってＣＬＡを栄養培地中および緩衝液中の両方でつく
り得る。リノール酸界面活性剤ミセルを安定にするために、界面活性剤の分離的
添加を緩衝液において必要としない。所望ならば、関連の細菌を利用する製造過
程においてつくられる（食用）産物中にＣＬＡが直接生じるように、ＣＬＡ形成
を組み合すこともできる。
菌生長に関連するＣＬＡをつくることができる。ＣＬＡは、他の目的での細胞産
生と同時につくることもできる。本発明方法のひとつの特徴は、ＣＬＡを細胞培
養またはそれからの分離の後に、睡眠中すなわち非生長性の細胞によってつくり
得ることである。これによってＣＬＡを栄養培地中および緩衝液中の両方でつく
り得る。リノール酸界面活性剤ミセルを安定にするために、界面活性剤の分離的
添加を緩衝液において必要としない。所望ならば、関連の細菌を利用する製造過
程においてつくられる（食用）産物中にＣＬＡが直接生じるように、ＣＬＡ形成
を組み合すこともできる。
【００３３】
発酵において形成され、細胞外に分泌されたＣＬＡを発酵肉汁から既存の技術
により分離し、そして所望に応じて、それ自体既知の方法で高度に精製されたＣ
ＬＡ産物に改変できる。あるいは、ＣＬＡおよび細菌細胞を含有する発酵肉汁を
そのまま使用するか、またはＣＬＡを細菌細胞とともに濃縮または乾燥すること
ができる。
により分離し、そして所望に応じて、それ自体既知の方法で高度に精製されたＣ
ＬＡ産物に改変できる。あるいは、ＣＬＡおよび細菌細胞を含有する発酵肉汁を
そのまま使用するか、またはＣＬＡを細菌細胞とともに濃縮または乾燥すること
ができる。
【００３４】
得られたＣＬＡ含有産物を健康増進物質などとして使用できる。産物を機能性
食品などの製造にも使用できる。
食品などの製造にも使用できる。
【００３５】
本明細書において、用語の食品は、広い意味で使用されるものであって、固体
、ゲル状、液体の形態を取り得るすべての食べられる物、インスタント食品物、
本発明産物が消費に際して添加物として加えられるような物、その構成成分とな
るような物を包含する。例えば、食品は、乳業、食肉加工業、食品加工業、飲料
産業、製パン業、製菓業の産物である。典型的な産物には、乳製品、例えば、ヨ
ーグルト、カード乳、カードチーズ、酸乳、バターミルク、他の発酵乳飲料、未
熟チーズ、熟成チーズ、スナック充填剤などがある。飲料、例えば、ホエー飲料
、果実飲料、ビールも別の重要な群を構成する。
、ゲル状、液体の形態を取り得るすべての食べられる物、インスタント食品物、
本発明産物が消費に際して添加物として加えられるような物、その構成成分とな
るような物を包含する。例えば、食品は、乳業、食肉加工業、食品加工業、飲料
産業、製パン業、製菓業の産物である。典型的な産物には、乳製品、例えば、ヨ
ーグルト、カード乳、カードチーズ、酸乳、バターミルク、他の発酵乳飲料、未
熟チーズ、熟成チーズ、スナック充填剤などがある。飲料、例えば、ホエー飲料
、果実飲料、ビールも別の重要な群を構成する。
【００３６】
凍結乾燥製剤、例えば、ＣＬＡ含有カプセル、プロピオン酸バクテリウム末、
ＣＬＡ含量がプロピオン酸バクテリウム活性により増加した発酵乳産物も好まし
い実施態様である。
ＣＬＡ含量がプロピオン酸バクテリウム活性により増加した発酵乳産物も好まし
い実施態様である。
【００３７】
下記において、本発明を実施例でもって詳細に記載する。これらの実施例は本
発明の説明を意図するだけであり、いかなる場合もその範囲を限定するものでは
ない。
発明の説明を意図するだけであり、いかなる場合もその範囲を限定するものでは
ない。
【００３８】
参考例１
ミセル化の細菌生長に対する作用およびＣＬＡの産生
本発明方法の作用を検定するために、比較試験を実施した。遊離リノール酸、
遊離リノール酸と界面活性剤、実施例１でミセル化されたリノール酸と界面活性
剤を含有する培地におけるプロピオン酸バクテリウムの生長およびＣＬＡ産生を
調べた。対照として、添加のない同じ培地（陽性生長対照）および界面活性剤の
み添加の培地を使用した。
遊離リノール酸と界面活性剤、実施例１でミセル化されたリノール酸と界面活性
剤を含有する培地におけるプロピオン酸バクテリウムの生長およびＣＬＡ産生を
調べた。対照として、添加のない同じ培地（陽性生長対照）および界面活性剤の
み添加の培地を使用した。
【００３９】
試験のために、プロピオン酸バクテリウム株、Propionibacterium freudenrei
chii ssp. shermanii JS (PJS)、DMS 7067、P. freudenreichii ssp. freudenre
ichii 131 (P131) をＭＲＳ肉汁中で下記とともに最初に培養した。 １）添加なし、 ２）６００μｇ／ｍｌのリノール酸、 ３）５ｍｇ／ｍｌのリノール酸を含有する保存液由来の６００μｇ／ｍｌのリ
ノール酸および１％ Tween 80 水溶液（最終濃度、Tween ０.２％）の添加、 ４）０.９％ Kotilen および実施例１によりミセル化された６００μｇ／ｍｌ
リノール酸の添加、 ５）０.９％ Kotilen のみの添加（リノール酸なし）。
chii ssp. shermanii JS (PJS)、DMS 7067、P. freudenreichii ssp. freudenre
ichii 131 (P131) をＭＲＳ肉汁中で下記とともに最初に培養した。 １）添加なし、 ２）６００μｇ／ｍｌのリノール酸、 ３）５ｍｇ／ｍｌのリノール酸を含有する保存液由来の６００μｇ／ｍｌのリ
ノール酸および１％ Tween 80 水溶液（最終濃度、Tween ０.２％）の添加、 ４）０.９％ Kotilen および実施例１によりミセル化された６００μｇ／ｍｌ
リノール酸の添加、 ５）０.９％ Kotilen のみの添加（リノール酸なし）。
【００４０】
ＰＳＪ株を、５％ホエー浸透物（Valio Oy)、２％カゼイン水解物（Valio Oy)
、１％酵母抽出物（LabM) を上記１）ないし５）とともに含有するホエーを基に
する培地中でも培養した。
、１％酵母抽出物（LabM) を上記１）ないし５）とともに含有するホエーを基に
する培地中でも培養した。
【００４１】
各細菌株を培養基中で２回３０℃で７２時間培養し、ついで各試験肉汁を１％
新鮮培養物とともにインキュベートした。試験培養物を３０℃で４日間監視して
、培養物の細胞密度を Klett メーターでの濁度として測定した。培養に終り（
９６時間）に、形成したＣＬＡの量をガスクロマトグラフィーで、ｃ９,ｔ１１
異性体を別個に、および他の異性体とともに測定した。
新鮮培養物とともにインキュベートした。試験培養物を３０℃で４日間監視して
、培養物の細胞密度を Klett メーターでの濁度として測定した。培養に終り（
９６時間）に、形成したＣＬＡの量をガスクロマトグラフィーで、ｃ９,ｔ１１
異性体を別個に、および他の異性体とともに測定した。
【００４２】
脂肪酸の検定を下記文献の方法を少し改変して行った。M. Suutari, K. Liukk
onen, S. Laakso；Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty aci
ds, J. Gen. Microbiol., 136 (1990) 1469-1474。培養物のサンプルを検定用に
取り、細胞を遠心分離した（５,０００ｇ、１５分間）。上清液を０.２μｍフィ
ルターで濾過し、サンプル０.２ないし０.５ｍｌを得た。細胞の塊を水道水で洗
った。上清サンプルおよび水洗細胞を凍結乾燥した。
onen, S. Laakso；Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty aci
ds, J. Gen. Microbiol., 136 (1990) 1469-1474。培養物のサンプルを検定用に
取り、細胞を遠心分離した（５,０００ｇ、１５分間）。上清液を０.２μｍフィ
ルターで濾過し、サンプル０.２ないし０.５ｍｌを得た。細胞の塊を水道水で洗
った。上清サンプルおよび水洗細胞を凍結乾燥した。
【００４３】
凍結乾燥サンプルに、３.７ＭのＮａＯＨの４９％メタノール液であるけん化
試薬１ｍｌを添加した。サンプルを窒素処理し、混合し、閉管中１００℃で水浴
で３０分間、その間１度攪拌してインキュベートした。サンプルを室温に冷やし
、それに３.３ＭのＨＣｌの４８％メタノール液であるメチル化試薬４ｍｌを添
加した。サンプルを窒素処理し、混合し、サンプル管を８０℃で水浴中１０分間
インキュベートし、ついで冷やした。脂肪酸のメチルエステルを、ヘキサン／メ
チルｔブチルエーテル溶液（１：１）１.５ｍｌをサンプルに加え、ついで管腔
を１０分間激しく振ることにより抽出した。下の水層をパスツール・ピペットで
除去した。有機層を、０.３ＭのＮａＯＨ３ｍｌをサンプルに加え、５分間激し
く振ることにより洗浄した。サンプルを遠心分離し（５,０００ｇ、２０分間）
、有機サンプル層をパスツール・ピペットで回収した。サンプルを硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、窒素処理を行った。
試薬１ｍｌを添加した。サンプルを窒素処理し、混合し、閉管中１００℃で水浴
で３０分間、その間１度攪拌してインキュベートした。サンプルを室温に冷やし
、それに３.３ＭのＨＣｌの４８％メタノール液であるメチル化試薬４ｍｌを添
加した。サンプルを窒素処理し、混合し、サンプル管を８０℃で水浴中１０分間
インキュベートし、ついで冷やした。脂肪酸のメチルエステルを、ヘキサン／メ
チルｔブチルエーテル溶液（１：１）１.５ｍｌをサンプルに加え、ついで管腔
を１０分間激しく振ることにより抽出した。下の水層をパスツール・ピペットで
除去した。有機層を、０.３ＭのＮａＯＨ３ｍｌをサンプルに加え、５分間激し
く振ることにより洗浄した。サンプルを遠心分離し（５,０００ｇ、２０分間）
、有機サンプル層をパスツール・ピペットで回収した。サンプルを硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、窒素処理を行った。
【００４４】
脂肪酸のメチルエステルをガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard 5890
series II, Pennsylvania, USA）で検定した。これにはフレームイオン化検出器
（ＦＩＤ）および自動サンプル化装置（Hewlett Packard 7673A）が結合されて
いる。毛管カラム（HP-FFAP、２５ｘ０.２ｍｘ０.３μｍ）を検定に使用した。
サンプルを分割注入した（分割比１：２０、中隔洗浄速度１ないし２ｍｌ／分）
。カラムの入口圧は１５０ｋＰａであり、担体ガス（ヘリウム）のカラムへの流
入速度は約１ｍｌ／分であった。メーキャップ・ガス（空気）の流入速度は３０
ｍｌ／分であり、水素の検出器への流入速度は４０ｍｌ／分であった。注入温度
および検出器温度は２５０℃であった。オーブン温度は７０ないし２００℃であ
った。温度を毎分２５℃の比率で上げる。結果をガスクロマトグラフィーに接続
の HP Chemstation ソフトウエアーで処理しアウトプットした。
series II, Pennsylvania, USA）で検定した。これにはフレームイオン化検出器
（ＦＩＤ）および自動サンプル化装置（Hewlett Packard 7673A）が結合されて
いる。毛管カラム（HP-FFAP、２５ｘ０.２ｍｘ０.３μｍ）を検定に使用した。
サンプルを分割注入した（分割比１：２０、中隔洗浄速度１ないし２ｍｌ／分）
。カラムの入口圧は１５０ｋＰａであり、担体ガス（ヘリウム）のカラムへの流
入速度は約１ｍｌ／分であった。メーキャップ・ガス（空気）の流入速度は３０
ｍｌ／分であり、水素の検出器への流入速度は４０ｍｌ／分であった。注入温度
および検出器温度は２５０℃であった。オーブン温度は７０ないし２００℃であ
った。温度を毎分２５℃の比率で上げる。結果をガスクロマトグラフィーに接続
の HP Chemstation ソフトウエアーで処理しアウトプットした。
【００４５】
サンプルの脂肪酸を、その停留時間を測定し既知の脂肪酸標準物と比較して、
同定した。Sigma 社の製剤を複合リノール酸の同定に使用した。この製剤はＣＬ
Ａのシス・トランス−９,１１および−１０,１２の異性体の混合物である。脂肪
酸を定量するために、Ｃ１９：０脂肪酸メチルエステル（ノナデカン酸メチルエ
ステル、Sigma) を内部標準物として使用した。
同定した。Sigma 社の製剤を複合リノール酸の同定に使用した。この製剤はＣＬ
Ａのシス・トランス−９,１１および−１０,１２の異性体の混合物である。脂肪
酸を定量するために、Ｃ１９：０脂肪酸メチルエステル（ノナデカン酸メチルエ
ステル、Sigma) を内部標準物として使用した。
【００４６】
細菌の生長結果を表１.１に示す.
【表１】
結果からすると、濃度６００μｇ／ｍｌのリノール酸そのもの、およびそれに
１％ Tween 水溶液を加えたものが、対照に比べて両株の生長を阻害するようで
ある。本発明によりミセル化されたリノール酸の相当量を使用すると、リノール
酸の生長に対する作用が低下し、株の生長が対照とほぼ同じになった。
１％ Tween 水溶液を加えたものが、対照に比べて両株の生長を阻害するようで
ある。本発明によりミセル化されたリノール酸の相当量を使用すると、リノール
酸の生長に対する作用が低下し、株の生長が対照とほぼ同じになった。
【００４７】
ＭＳＲを基にする肉汁におけるＰＳＪおよびＰ１３１により形成されたＣＬＡ
の量を、表１.２に示す。ホエーを基にする培地におけるＰＳＪ株での対応結果
を、表１.３に示す。
の量を、表１.２に示す。ホエーを基にする培地におけるＰＳＪ株での対応結果
を、表１.３に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
結果からして、本発明のミセル化がリノール酸のＣＬＡへのほぼ１００％の転
換を行うようである。そのうち７５％以上が好適なｃ９,ｔ１１ＣＬＡ異性体で
ある。リノール酸をそのまま添加すると、３２％のみがＣＬＡに転換し、リノー
ル酸に１％界面活性剤液を加えると、４７％のみがＣＬＡに転換する。このよう
に、本発明によるミセル化で、リノール酸の細菌生長に対する阻害作用の減少お
よびリノール酸からのＣＬＡ産生の増大という両者について、非常によい結果を
得る。
換を行うようである。そのうち７５％以上が好適なｃ９,ｔ１１ＣＬＡ異性体で
ある。リノール酸をそのまま添加すると、３２％のみがＣＬＡに転換し、リノー
ル酸に１％界面活性剤液を加えると、４７％のみがＣＬＡに転換する。このよう
に、本発明によるミセル化で、リノール酸の細菌生長に対する阻害作用の減少お
よびリノール酸からのＣＬＡ産生の増大という両者について、非常によい結果を
得る。
【００５１】
実施例１
リノール酸のミセルへの製造
ミセル保存液をつくるために、リノール酸（シス−９,トランス−１２オクタ
デカジエン酸、Ｌ−１３７６、Sigma) ３００ｍｇを試験管に秤量し、ソルビタ
ンオレエート界面活性剤（Kotilen 0/1またはTween 80）０.３６ｍｌを含む酸素
非含有蒸留水１０ｍｌを加え緩やかに混合した。混合物に２Ｎ水酸化ナトリウム
液を、混合物がほぼ澄明になるように滴下した（約０.５ないし０.６ｍｌ）。溶
液を５０ｍｌ容量のフラスコに移し、フラスコに酸素を含まない蒸留水を満たし
て、６ｍｇ／ｍｌリノール酸を含有するメセル保存液を得た。溶液を適当なバッ
チに分け、空気を窒素ガスで除き、バッチを凍結保存した。
デカジエン酸、Ｌ−１３７６、Sigma) ３００ｍｇを試験管に秤量し、ソルビタ
ンオレエート界面活性剤（Kotilen 0/1またはTween 80）０.３６ｍｌを含む酸素
非含有蒸留水１０ｍｌを加え緩やかに混合した。混合物に２Ｎ水酸化ナトリウム
液を、混合物がほぼ澄明になるように滴下した（約０.５ないし０.６ｍｌ）。溶
液を５０ｍｌ容量のフラスコに移し、フラスコに酸素を含まない蒸留水を満たし
て、６ｍｇ／ｍｌリノール酸を含有するメセル保存液を得た。溶液を適当なバッ
チに分け、空気を窒素ガスで除き、バッチを凍結保存した。
【００５２】
ミセルの保存溶液を上記以上に濃縮するか、稀釈することもできる。遊離リノ
ール酸とソルビタンオレエート界面活性剤との量の比率を上記のように保持する
ことが基本である。
ール酸とソルビタンオレエート界面活性剤との量の比率を上記のように保持する
ことが基本である。
【００５３】
実施例２
リノール酸と界面活性剤の細菌生長に対する作用およびＣＬＡの産生
リノール酸の界面活性剤との比率の効果を、ホエーを基にした生育肉汁および
ＭＲＳ肉汁（LabM) においてプロピオン酸バクテリウムを培養物１５０ｍｌで培
養して調べた。ホエーを基にした生育肉汁は２％のホエー浸透物（Valio Oy)、
０.５％のトリプトン（LabM)、１％の酵母抽出物（LabM) を含有する。リノール
酸を上記の保存液のような培地に、培地中の遊離リノール酸濃度が６００μｇ／
ｍｌであるミセルの形態で加えた。所望量のソルビタンオレエート界面活性剤（
Kotilen 0/1 または Tween 80) を培地に別個に加えた。培地のｐＨを６.３に調
整し、プロピオン酸バクテリウム株 P. freudenreichii ssp. shermanii JS を
ホエーを基にした生育肉汁中で培養しておいた２％（ｖ／ｖ）接種物として培養
物で使用した。培養を温度３０℃で行った。細菌生長を９６時間監視した。これ
には Klett-Summerson 色素計（filtre No. 66) で培地の懸濁度を測定した。Ｃ
ＬＡおよびリノール酸をガスクロマトグラフィーで検査した。
ＭＲＳ肉汁（LabM) においてプロピオン酸バクテリウムを培養物１５０ｍｌで培
養して調べた。ホエーを基にした生育肉汁は２％のホエー浸透物（Valio Oy)、
０.５％のトリプトン（LabM)、１％の酵母抽出物（LabM) を含有する。リノール
酸を上記の保存液のような培地に、培地中の遊離リノール酸濃度が６００μｇ／
ｍｌであるミセルの形態で加えた。所望量のソルビタンオレエート界面活性剤（
Kotilen 0/1 または Tween 80) を培地に別個に加えた。培地のｐＨを６.３に調
整し、プロピオン酸バクテリウム株 P. freudenreichii ssp. shermanii JS を
ホエーを基にした生育肉汁中で培養しておいた２％（ｖ／ｖ）接種物として培養
物で使用した。培養を温度３０℃で行った。細菌生長を９６時間監視した。これ
には Klett-Summerson 色素計（filtre No. 66) で培地の懸濁度を測定した。Ｃ
ＬＡおよびリノール酸をガスクロマトグラフィーで検査した。
【００５４】
結果を表２に示す。ここでのＣＬＡ産生、およびＰＪＳ微生物細胞により形成
されたＣＬＡについての実施例３および４のＣＬＡ結果は、全ＣＬＡ濃度から界
面活性剤の培地で生じたＣＬＡ量を引いて計算した。ＣＬＡの収率は下記のよう
に計算した：形成したＣＬＡのｇ／最初のＬＡのｇ。
されたＣＬＡについての実施例３および４のＣＬＡ結果は、全ＣＬＡ濃度から界
面活性剤の培地で生じたＣＬＡ量を引いて計算した。ＣＬＡの収率は下記のよう
に計算した：形成したＣＬＡのｇ／最初のＬＡのｇ。
【００５５】
【表４】
【００５６】
リノール酸を大量にミセル形態でＰＳＪ株の生育培地に、細胞の生長を完全に
阻害することなく、加えることができる。表２の結果からすると、界面活性剤の
添加はリノール酸の阻害作用を低下せしめ得るようである。リノール酸の界面活
性剤に対する比率が培地において適切であるとき、リノール酸の量が培地で増加
し、細胞生長に関連するＣＬＡへの転換が少量のリノール酸で効率よく起きる。
このようにして、工業的に有意量の所望シス−９、トランス−１１異性体を得る
。リノール酸濃度６００μｇ／ｍｌで界面活性剤含量０.９ないし１％がこの試
験で最適であった。より多量も使用できる。
阻害することなく、加えることができる。表２の結果からすると、界面活性剤の
添加はリノール酸の阻害作用を低下せしめ得るようである。リノール酸の界面活
性剤に対する比率が培地において適切であるとき、リノール酸の量が培地で増加
し、細胞生長に関連するＣＬＡへの転換が少量のリノール酸で効率よく起きる。
このようにして、工業的に有意量の所望シス−９、トランス−１１異性体を得る
。リノール酸濃度６００μｇ／ｍｌで界面活性剤含量０.９ないし１％がこの試
験で最適であった。より多量も使用できる。
【００５７】
実施例３
ｐＨ調整発酵におけるＣＬＡの産生
プロピオン酸バクテリウムを工業的規模で培養するのに最も効率的な方法は、
培地のｐＨを細菌生長に最適に維持し得る発酵器中で行うことである。ＰＪＳを
生育する手段による複合リノール酸の製造方法を、発酵器培養において溶液量２
リットルで検討した。実施例２のホエー浸透物肉汁を生育培地として使用した。
生育肉汁は、ミセル化リノール酸４００、６００、１０００、１４００μｇ／ｍ
ｌおよび Kotilen 界面活性剤０.６、０.９、１.５％をそれぞれ含有する。培養
中、生育培地のｐＨをリノール酸濃度４００、６００、１０００μｇ／ｍｌでは
６.３に、リノール酸濃度１４００μｇ／ｍｌでは６.５に、アンモニウム液の自
動添加により保持した。培養温度は３０℃であり、混合速度は１００ｒｐｍであ
った。生存プロピオン酸バクテリウムの濃度を緩衝性乳酸ナトリウム寒天におい
て測定した。この寒天を３０℃で嫌気的に５ないし７日間インキュベートした。
培地のｐＨを細菌生長に最適に維持し得る発酵器中で行うことである。ＰＪＳを
生育する手段による複合リノール酸の製造方法を、発酵器培養において溶液量２
リットルで検討した。実施例２のホエー浸透物肉汁を生育培地として使用した。
生育肉汁は、ミセル化リノール酸４００、６００、１０００、１４００μｇ／ｍ
ｌおよび Kotilen 界面活性剤０.６、０.９、１.５％をそれぞれ含有する。培養
中、生育培地のｐＨをリノール酸濃度４００、６００、１０００μｇ／ｍｌでは
６.３に、リノール酸濃度１４００μｇ／ｍｌでは６.５に、アンモニウム液の自
動添加により保持した。培養温度は３０℃であり、混合速度は１００ｒｐｍであ
った。生存プロピオン酸バクテリウムの濃度を緩衝性乳酸ナトリウム寒天におい
て測定した。この寒天を３０℃で嫌気的に５ないし７日間インキュベートした。
【００５８】
図１は、４００μｇ／ｍｇのリノール酸と０.６％のソルビタンオレエート界
面活性剤とを培地に加えたときの、リノール酸からのＣＬＡ形成を示す。リノー
ル酸のＣＬＡへの転換がＰＳＪ細胞の生長と同時的に明らかに起きる。
面活性剤とを培地に加えたときの、リノール酸からのＣＬＡ形成を示す。リノー
ル酸のＣＬＡへの転換がＰＳＪ細胞の生長と同時的に明らかに起きる。
【００５９】
表３は、発酵器中のＣＬＡ産生について、培養９４時間後の４００、６００、
１０００μｇ／ｍｌの培地中のリノール酸含量と培養１０８および１３２時間後
の１４００μｇ／ｍｌの培地中のリノール酸含量を比較する。
１０００μｇ／ｍｌの培地中のリノール酸含量と培養１０８および１３２時間後
の１４００μｇ／ｍｌの培地中のリノール酸含量を比較する。
【００６０】
【表５】
【００６１】
実施例４
細胞生長相後のＣＬＡの産生
細胞生長相後にＣＬＡを産生するプロピオン酸バクテリウムの能力を、実施例
３の発酵を様々に繰り返して検討した。メセル液中のリノール酸およびソルビタ
ンオレエート界面活性剤を肉汁に、ＰＪＳ細胞の迅速生長相の終りのみに、培養
開始の５１時間後に加えた。培地におけるリノール酸濃度は６００μｇ／ｍｌで
あり、界面活性剤濃度は０.９％であった。添加時の細胞濃度は１.８ｘ１０１０ ｃｆｕ／ｍｌであった。その後に細胞生長を約３時間で停止し、ついで非常に緩
やかに続けた。
３の発酵を様々に繰り返して検討した。メセル液中のリノール酸およびソルビタ
ンオレエート界面活性剤を肉汁に、ＰＪＳ細胞の迅速生長相の終りのみに、培養
開始の５１時間後に加えた。培地におけるリノール酸濃度は６００μｇ／ｍｌで
あり、界面活性剤濃度は０.９％であった。添加時の細胞濃度は１.８ｘ１０１０ ｃｆｕ／ｍｌであった。その後に細胞生長を約３時間で停止し、ついで非常に緩
やかに続けた。
【００６２】
細胞によるリノール酸からＣＬＡへの転換は非常に速く起きた。ＣＬＡの収率
は３時間で４５％、６時間で５８％であった。この方法の利点は、発酵の全期間
が、リノール酸および界面活性剤が生育培地中に最初から存在している対応の培
養（約１００時間）よりも短いことである（約６０時間)。
は３時間で４５％、６時間で５８％であった。この方法の利点は、発酵の全期間
が、リノール酸および界面活性剤が生育培地中に最初から存在している対応の培
養（約１００時間）よりも短いことである（約６０時間)。
【００６３】
実施例５
緩衝液におけるＣＬＡ産生のための非生長性細菌細胞の使用
ＰＪＳ細胞を、ホエーを基にした生育肉汁中で３日間３０℃で培養した。細胞
を遠心分離し、０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）で洗浄した。湿潤
細胞塊２.０を０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.８）５０ｍｌに加える
と、緩衝液中の細胞濃度が約３ｘ１０１０となった。実施例１でミセル化したリ
ノール酸を加えると、緩衝液中のリノール酸濃度が６００μｇ／ｍｌとなった。
溶液を温度６℃または３０℃で２１時間インキュベートした。ＣＬＡの検定を、
ＧＣ法および分光光度計による波長２３５ｎｍでの測定で行った。
を遠心分離し、０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）で洗浄した。湿潤
細胞塊２.０を０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.８）５０ｍｌに加える
と、緩衝液中の細胞濃度が約３ｘ１０１０となった。実施例１でミセル化したリ
ノール酸を加えると、緩衝液中のリノール酸濃度が６００μｇ／ｍｌとなった。
溶液を温度６℃または３０℃で２１時間インキュベートした。ＣＬＡの検定を、
ＧＣ法および分光光度計による波長２３５ｎｍでの測定で行った。
【００６４】
結果を表４に示す。非生長性ＰＪＳ細胞による緩衝液中のＣＬＡ形成がいずれ
の試験温度でも生じた。３０℃が最も効率的であった。栄養液中のＣＬＡ産生は
、ミセル形態にリノール酸を保持するための界面活性剤添加が必要である。適切
な界面活性剤濃度は溶液の出発物質に依存する。一方、緩衝液においては、別個
の緩衝液の反応肉汁への添加を必要としない。これは明らかに有害となることさ
えある。
の試験温度でも生じた。３０℃が最も効率的であった。栄養液中のＣＬＡ産生は
、ミセル形態にリノール酸を保持するための界面活性剤添加が必要である。適切
な界面活性剤濃度は溶液の出発物質に依存する。一方、緩衝液においては、別個
の緩衝液の反応肉汁への添加を必要としない。これは明らかに有害となることさ
えある。
【００６５】
【表６】
【００６６】
実施例６
ベニバラ油からのＣＬＡ産生
ａ）ベニバラ油のけん化
脂肪酸をベニバラ油から、緩和な条件で抗酸化剤とともにけん化して得る。抗
酸化剤でリノール酸の酸化を防止する。けん化のために、水酸化カリウムまたは
ナトリウム、エタノール、水、アスコルビン酸を、例えば下記の比率で使用する
：ベニバラ油１０ｇ、飽和ＫＯＨ水溶液５ｍｌ、エタノール５０ｍｌ、水１０ｍ
ｌ（量を低くもできる）、アスコルビン酸１ｇ。混合物を窒素処理し、蓋をしっ
かりと閉める。混合物を一夜磁気攪拌してけん化する。未けん化部分を溶液から
、例えばヘキサン３０ｍｌで抽出する。乳化を防ぐために、水を混合物に加える
こともできる。その後に溶液を濃塩酸で酸性にする（ｐＨ２〜３）。脂肪酸を溶
液から、例えば２回へキサン４０ｍｌで抽出する。ヘキサンを回転蒸発器で蒸発
し、脂肪を堅いねじ式キャップ付きの瓶に移し、窒素処理を数分間行う。ついで
脂肪混合物ができ、これを冷凍機に保存して酸化されるのを防止する。
酸化剤でリノール酸の酸化を防止する。けん化のために、水酸化カリウムまたは
ナトリウム、エタノール、水、アスコルビン酸を、例えば下記の比率で使用する
：ベニバラ油１０ｇ、飽和ＫＯＨ水溶液５ｍｌ、エタノール５０ｍｌ、水１０ｍ
ｌ（量を低くもできる）、アスコルビン酸１ｇ。混合物を窒素処理し、蓋をしっ
かりと閉める。混合物を一夜磁気攪拌してけん化する。未けん化部分を溶液から
、例えばヘキサン３０ｍｌで抽出する。乳化を防ぐために、水を混合物に加える
こともできる。その後に溶液を濃塩酸で酸性にする（ｐＨ２〜３）。脂肪酸を溶
液から、例えば２回へキサン４０ｍｌで抽出する。ヘキサンを回転蒸発器で蒸発
し、脂肪を堅いねじ式キャップ付きの瓶に移し、窒素処理を数分間行う。ついで
脂肪混合物ができ、これを冷凍機に保存して酸化されるのを防止する。
【００６７】
ｂ）ミセルの形成
脂肪酸ミセルを遊離脂肪酸の混合物から本発明方法でつくる。この混合物はベ
ニバラ油から Kotilen、水、水酸化ナトリウムでもってつくり、例えば、下記の
比率である：ベニバラ油物７００ｍｇ、水３０ｍｌ、Kotilen ０.７５ｍｌ、２
Ｎ水酸化ナトリウム液１.５ｍｌ。混合に先立ち、Kotilen および水を約４０℃
に加熱できる。Kotilen を窒素処理した水と混合する。ベニバラ油物を混合物に
よく混ぜながら加える。最後に、水酸化ナトリウム液を滴下すると、混合物が澄
明になる。 ｃ）ＣＬＡの産生 ＣＬＡは、脂肪溶液から細菌で例えば下記の方法でつくることができる。例え
ば、２％ホエー浸透物、０.５％カゼイン水解物、０.５％酵母抽出物、０.９％
Kotilen を含有する生育培地に、リノール酸および３日間生長した Propionibac
terium freudenreichii ssp. shermanii の２％接種物を含有する溶液を加える
。細菌でもって温度３０℃で産生されたＣＬＡの収率（％）を表５に示す。
ニバラ油から Kotilen、水、水酸化ナトリウムでもってつくり、例えば、下記の
比率である：ベニバラ油物７００ｍｇ、水３０ｍｌ、Kotilen ０.７５ｍｌ、２
Ｎ水酸化ナトリウム液１.５ｍｌ。混合に先立ち、Kotilen および水を約４０℃
に加熱できる。Kotilen を窒素処理した水と混合する。ベニバラ油物を混合物に
よく混ぜながら加える。最後に、水酸化ナトリウム液を滴下すると、混合物が澄
明になる。 ｃ）ＣＬＡの産生 ＣＬＡは、脂肪溶液から細菌で例えば下記の方法でつくることができる。例え
ば、２％ホエー浸透物、０.５％カゼイン水解物、０.５％酵母抽出物、０.９％
Kotilen を含有する生育培地に、リノール酸および３日間生長した Propionibac
terium freudenreichii ssp. shermanii の２％接種物を含有する溶液を加える
。細菌でもって温度３０℃で産生されたＣＬＡの収率（％）を表５に示す。
【００６８】
【表７】
【００６９】
実施例７
乾燥ＣＬＡを含有する組成物の製造
Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS をホエー培地で培養
した。この培地は、２％ホエー浸透物（Valio Oy)、０.５％カゼイン水解物 (Va
lio Oy)、０.５％酵母抽出物 (Lab M)、リノール酸０.２ｇを含有し、実施例１
のようにミセル化されている。培地を１％新鮮細菌培地とともにインキュベート
し、培養中、ｐＨを６.５に自動ｐＨ調節で保持し、温度を３０℃に保持した。
４日間の培養後に、細胞培養物を培地とともに回転蒸発器で蒸発せしめて元の４
分の１にし、得た濃縮物を Heto 乾燥器で凍結乾燥した。粉末の収率は２３ない
し２５ｇ／１０００ｍｌであった。得られた粉末はＣＬＡ８.０５６ｍｇ／ｇ（
１９３ｍｇ／２４ｇ粉末）を含んでいた。すなわち、元のリノール酸の９６％が
ＣＬＡに転換した。全ＣＬＡのうち、７９％が生物学的に最も活性な異性体であ
った。結果を表６に示す。
した。この培地は、２％ホエー浸透物（Valio Oy)、０.５％カゼイン水解物 (Va
lio Oy)、０.５％酵母抽出物 (Lab M)、リノール酸０.２ｇを含有し、実施例１
のようにミセル化されている。培地を１％新鮮細菌培地とともにインキュベート
し、培養中、ｐＨを６.５に自動ｐＨ調節で保持し、温度を３０℃に保持した。
４日間の培養後に、細胞培養物を培地とともに回転蒸発器で蒸発せしめて元の４
分の１にし、得た濃縮物を Heto 乾燥器で凍結乾燥した。粉末の収率は２３ない
し２５ｇ／１０００ｍｌであった。得られた粉末はＣＬＡ８.０５６ｍｇ／ｇ（
１９３ｍｇ／２４ｇ粉末）を含んでいた。すなわち、元のリノール酸の９６％が
ＣＬＡに転換した。全ＣＬＡのうち、７９％が生物学的に最も活性な異性体であ
った。結果を表６に示す。
【００７０】
【表８】
【図１】 細胞濃度および脂肪酸濃度と培養時間との関係を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
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ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
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，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
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ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 マルヤッタ・ヴァハヴァセルケ
フィンランド、エフイーエン−00400ヘル
シンキ、アドルフ・リンドフォルシン・テ
ィエ７番、ベー87
(72)発明者 アンニカ・メユレ−メキネン
フィンランド、エフイーエン−00170ヘル
シンキ、マウリンカトゥ４番、ベー19
(72)発明者 ソイレ・テュンッキュネン
フィンランド、エフイーエン−00270ヘル
シンキ、マンネルヘイミンティエ71番、ア
ー14
(72)発明者 タルヤ・スオマライネン
フィンランド、エフイーエン−00920ヘル
シンキ、ラッルカンティエ１セー番
Ｆターム(参考） 4B064 AD88 CA02 CC04 CC09 CD07
DA10
Claims (18)
- 【請求項１】 微生物手段によってリノール酸から複合リノール酸を製造す
る方法であって、リノール酸を反応肉汁にミセル形態で加えることを特徴とする
方法。 - 【請求項２】 ミセルが界面活性剤も含むことを特徴とする、請求項１の方
法。 - 【請求項３】 ミセル形成を、遊離リノール酸を界面活性剤とアルカリ条件
で反応せしめることにより行うことを特徴とする、請求項１または２の方法。 - 【請求項４】 メセルがリノール酸とポリオキシエチレンソルビタン・モノ
オレエートの混合物を含むことを特徴とする、請求項１−３の方法。 - 【請求項５】 複合リノール酸のシス−９、トランス−１１異性体を主に製
造することを特徴とする、請求項１−４の方法。 - 【請求項６】 転換をプロピオン酸バクテリウム（バクテリア）で行うこと
を特徴とする、請求項１−５の方法。 - 【請求項７】 プロピオン酸バクテリウムが、種 Propionibacterium freud
enreichii、そして好ましくは亜種 Propionibacterium freudenreichii ssp. fr
eudenreichii または Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii に属
する株であることを特徴とする、請求項６の方法。 - 【請求項８】 プロピオン酸バクテリウムが、Propionibacterium freudenr
eichii ssp. freudenreichii 131 または Propionibacterium freudenreichii s
sp. shermanii JS であることを特徴とする、請求項７の方法。 - 【請求項９】 複合リノール酸の製造を細菌生育培地で同時的に行うことを
特徴とする、請求項１−８の方法。 - 【請求項１０】 転換を界面活性剤の存在で行うことを特徴とする、請求項
１−９の方法。 - 【請求項１１】 界面活性剤が、濃度０.５ないし１.５％で使用されるポリ
オキシエチレンソルビタン・モノオレエートであることを特徴とする、請求項１
０の方法。 - 【請求項１２】 複合リノール酸の製造を細菌の培養の後に行うことを特徴
とする、請求項１−８の方法。 - 【請求項１３】 転換を、生育培地から分離された細胞で、界面活性剤の別
個の添加なしに行うことを特徴とする、請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 複合リノール酸の製造を食品の製造と関連して行うことを
特徴とする、請求項１−１３の方法。 - 【請求項１５】 複合リノール酸を反応肉汁から単離し、場合により乾燥す
ることを特徴とする、請求項１−１３の方法。 - 【請求項１６】 複合リノール酸および細菌細胞を濃縮し、場合により乾燥
することを特徴とする、請求項１−１３の方法。 - 【請求項１７】 複合リノール酸および細菌細胞を回収し、濃縮し、凍結乾
燥することを特徴とする、請求項１６の方法。 - 【請求項１８】 請求項１−１７の方法により得ることができる産物。
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|---|---|---|---|
| FI19992477 | 1999-11-19 | ||
| FI992477A FI108730B (fi) | 1999-11-19 | 1999-11-19 | Menetelmä konjugoidun linolihapon valmistamiseksi |
| PCT/FI2000/001004 WO2001036653A1 (en) | 1999-11-19 | 2000-11-16 | Method for preparing conjugated linoleic acid |
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