FI108730B

FI108730B - Menetelmä konjugoidun linolihapon valmistamiseksi

Info

Publication number: FI108730B
Application number: FI992477A
Authority: FI
Inventors: Tarja Suomalainen; Simo Laakso; Marjatta Vahvaselkae; Marja Maeyrae-Maekinen; Soile Sisko Tynkkynen; Auli Marjo Raunio
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2002-03-15
Also published as: HRP20020427B1; WO2001036653A1; NO20022361L; HUP0204173A3; JP2003514535A; HUP0204173A2; AU770113B2; NO20022361D0; PL355658A1; KR20020065523A; ZA200203539B; HU224704B1; EE200200253A; FI19992477A; US6960456B1; CN1391613A; RU2002116367A; CA2390572A1; AU1709301A; EP1240348A1

Description

I 108730 I 1

Menetelmä konjugoidun linolihapon valmistamiseksi

Tekniikan ala I Keksintö koskee menetelmää konjugoidun linolihapon valmista- 5 miseksi. Erityisesti kuvataan menetelmää konjugoidun linolihapon ja varsinkin sen cis-9,trans-11 -isomeerin valmistamiseksi linolihaposta fermentoimalla.

Keksinnön tausta CLA on yleisnimi konjugoituneen linolihapon eri isomeereille, joista ainoastaan kahden isomeerin (cis-9 .trans-11 -isomeeri eli boviinihappo ja 10 trans-10,cis-12 -isomeeri) on todettu olevan biologisesti aktiivisia. Synteettisesti valmistetut, kaupalliset CLA-valmisteet sisältävät yleensä kaikkia CLA:n eri isomeerejä ja vain 40 % c9,t11 -isomeeriä, maito taas sisältää 80 % c9, t11-18:2 -isomeeriä.

Useissa tutkimuksissa on osoitettu, että eläinrasvat sisältävät 15 rasvahappoa, joka mm. estää koe-eläimissä syöpää, vaikuttaa kasvutekijöihin ja i saattaa säädellä rasvakudoksen määrää elimistössä. Michael Pariza havaitsi i I tutkiessaan hampurilaispihvejä niiden sisältävän rasvahappoa, joka analysoitiin konjugoituneeksi linolihapoksi (CLA). Koe-eläimillä suoritetuissa tutkimuksissa havaittiin CLA:ta sisältänyttä ravintoa syöneiden ryhmässä rintarauhas-, maha-20 ja paksusuolisyöpätapausten alentuneen vertailuryhmään verrattuna (Pariza, M.W., Loretz, L.J., Storkson, J.M. and Holland, N.C. 1983. Mutagens and modulator of mutagenesis in fried ground beef. Cancer Res. (Suppl.) 43: 2444s-2446s, ja Pariza, M.W, and Hargraves, W.A. 1985. A beef-derived mutagenesis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumors by :.‘-i 25 7,12-dimethylbenzanthracene. Carcinogenesis 6:591-593). Myös ihmissolujen • j": kudosviljelmissä on CLA.Ila pystytty estämään syöpäsolujen kehittyminen.

Vaikutusmekanismi on edelleen tuntematon, mutta CLA:n on havaittu vaikuttavan syövän eri kehitysvaiheisiin, moniin kasvutekijöihin ja mahdollisesti myös syöpää aiheuttavien aineiden aineenvaihduntaan maksassa. On myös 30 ehdotettu, että CLA toimisi antioksidanttina (Ip, C., Chin, S.F., Scimeca, J.A., and Pariza, M.W. 1991. Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid. Cancer Res. 51:6118-6124), jolloin yhdiste suojaisi solukalvoja vapaiden radikaalien haitallisilta vaikutuksilta. Lisäksi yhdisteen kolesterolitasoa laskevaa vaikutusta on selvitetty ja todettu, että yhdiste ei laske . 35 hyvän HDL:n määrää, niinkuin kolesterolia laskevat lääkkeet tekevät (Lee, K.N.,

Kritchevsky, D, and Pariza, M.W. 1994. Conjugated linoleic acid and I 108730 2 atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis 108:19-25). CLA saattaa auttaa myös laihduttajia, sillä yhdisteen on havaittu pilkkovan rasvakudosta (Park et ai. 1999. Changes in Body Composition in Mice During Feeding and Withdrawal of Conjugated Linoleic Acid. Lipids 34, 243 - 248).

5 Konjugoimattomalla linolihapolla on puolestaan todettu olevan haitallisia vaikutuksia, kuten esimerkiksi rintasyöpää stimuloiva vaikutus. Myös konjugoimattoman linolihapon antimikrobinen vaikutus on yleisesti tunnettua.

CLA:ta voidaan valmistaa kemiallisesti tai entsymaattisesti isomeroimalla. Luonnollista CLA:ta muodostuu mm. märehtijöiden pötsissä 10 Butyrivibrio fibrisolvens -bakteerin toiminnan seurauksena monityydytty-mättömistä rasvahapoista ja erittyy sieltä sekä maitoon että lihaan, joiden onkin ! todettu olevan parhaita CLA:n lähteitä.

Ravinnosta saatavan CLA:n määrän on todettu laskeneen viimeisen vuosikymmenen aikana huomattavasti. Ravintokoostumusanalyyseissä on 15 laskettu, että 1970-luvulla keskimääräinen dieetti sisälsi noin 0,45 g CLA:ta/päivä. Maidon ja maitotuotteiden käytön laskiessa keskimääräinen saanti on nykyisin 0,25 g CLA:ta/päivä. Ravinnon sisältämän luontaisen CLA:n kohottaminen on erittäin oleellista kansanterveyden kannalta, sillä CLA:n saannin kaksinkertaistaminen alentaisi tutkimusten mukaan mm. syöpäriskiä.

20 Elintarvikkeista erityisesti maidon merkitys CLA:n saannin lähteenä | on tuotu esille useissa tutkimuksissa. Mm. suomalaisen väestötutkimuksen " (Knekt ym., suullinen tiedonanto) mukaan maidon käyttö alensi rintasyöpäriskiä.

> “ Nykyisin maitorasvan CLA-pitoisuus vaihtelee huomattavasti ( 2,4 - 28,1 mg/g ..!: ’ rasvaa) kausittain riippuen ruokinnan laadusta.

·’.*·: 25 Suoliston hyötymikrobien on todettu muodostavan CLA:ta. Erityisesti : T: on tutkittu pötsin Butyrivibrio fibrisolvens -bakteeria ja sen isomeraasi-entsyymiä.

: Tämä bakteeri on kuitenkin niin anaerobinen, ettei CLA:n tuotto sillä ole mahdollista teollisessa mittakaavassa, koska kannan vaatimien täysin anaerobisten olosuhteiden saavuttaminen on vaikea ja epätaloudellista (US , · · ·, 30 5,856,149, Pariza et ai.).

Myös Pmpionibacterium agnes -lajin on todettu tuottavan CLA:ta, '·: mutta tämä patogeeninen kanta tuottaa myös reduktaasi-entsyymiä, joka pelkistää tuotetun CLA:n edelleen muiksi rasvahapoiksi (Verhulst et ai., System. .·[·, Appi. Microbiol. 9 (1987)12 -15).

’ \ 35 Yleisesti on myös tunnettua, että eräät propionihappobakteerit pystyvät muuntamaan linolihappoa sen konjugoiduksi cis-9,trans-11 -muodoksi.

i 3 108730 I Yleisesti tiedetään lisäksi, että vapaan linolihapon konversio CLAksi on tehokkaampaa kuin triglyseridimuodossa olevan rasvahapon. Vapaalla linolihapolla on kuitenkin propionihappobakteerien kasvua estävä vaikutus jo melko pieninä pitoisuuksina, mikä tähän asti on estänyt konjugoidun linolihapon 5 ja varsinkin sen cis-9,trans-11 -muodon tuottamisen suuressa mittakaavassa.

US-patentissa 5,856,149, Pariza ja Yang, kuvataan menetelmää cis-9,trans-11 -rasvahapon tuottamiseksi konjugoimattoman tyydyttymättömän (kaksoissidokset kohdissa 9 ja 12) rasvahapon konversiolla Lactobacillus reuterii -kannan, edullisesti L.reuterii PYR8 -kannan, avulla. Julkaisussa kuvataan 10 CLA:ta tuottavien kantojen eristystä ja todetaan, että 45 eristetystä kannasta ainoastaan neljällä oli haluttua linoleaatti-isomeraasi-aktiivisuutta ja ne pystyivät siis tuottamaan CLAta linolihaposta. Tutkijat havaitsivat CLA:n tuottomäärän olevan suorassa suhteessa solumäärään ja olettavat, että linoleaatti-isomeraasi on akkumuloituva entsyymi, jolla ei ole funktionaalista merkitystä solun I 15 kasvussa. Julkaisussa ei mainita vapaan linolihapon bakteerien kasvua inhiboivaa vaikutusta eikä siten myöskään esitetä ratkaisua tämän ongelman I välttämiseen.

J. Jiang, L. Björck ja R. Fonden esittävät artikkelissa Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures, J. Appi. Microbiol. 85 (1998) s. 20 95 - 102, propionihappobakteerien kyvyn muuttaa linolihappoa CLAksi. Jiang et i . ai. tutkivat 19 eri hapatebakteerin kykyä muuttaa kasvualustaan lisätty linolihappo CLAksi havaittuaan kypsytettyjen juustojen sisältävän muita : maitotuotteita korkeampia määriä ClAta. He tutkivat 7 laktobasilli-kannan, 4 laktokokkikannan, 2 streptokokkikannan ja 6 propionihappobakteerin kykyä ·’.*·: 25 tuottaa CLA:ta MRS-, maito- ja Na-laktaattialustalla linolihaposta. Lisäksi :T: tutkittiin eri linolihappopitoisuuksia lisäämällä linolihappoa MRS-liemeen Tween 80 -detergentin vesiliuoksessa. Tutkituista bakteereista ainoastaan muutamalla propionihappobakteerilla havaittiin biokonversioaktiivisuutta, kuudesta kannasta ,,,,; kolme, eli Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii PFF ja PFF6 sekä

» I

.... 30 P. freudenreichii ssp. shermanii PFS osoittivat aktiivisuutta. PFF6-kannalla saavutettiin maksimituotto 265 pg/ml ClAta alkuperäisestä linolihappo-:: pitoisuudesta 750 pg/ml. Tuotetusta CLAsta biologisesti aktiivista c9,t11 :" '· -isomeeriä oli 70 - 90 %. Yhdenkään laktobasillin, laktokokin tai streptokokin ei todettu tuottavan CLAta.

\ 35 Paras propionihappobakteeri, PFF6-kanta, pystyi siis Jiangin et ai.

kuvaamalla tekniikalla muuntamaan vain 35 % lisätystä linolihaposta CLAksi.

1 4 108730

Tutkijat havaitsivat propionihappobakteerien CLA.n tuoton korreloivan positiivisesti niiden sietokykyyn vapaan linolihapon suhteen. Tässäkin tutkimuksessa todettiin siis yleisesti tunnettu seikka, että linolihapolla on j bakteerien kasvua estävä antimikrobinen vaikutus. Julkaisussa mainitaan, että 5 antimikrobisten rasvahappojen vaikutusta voidaan vähentää käyttämällä pinta-aktiivisia aineita, kuten detergenttiä, esimerkiksi Tween 80, tai proteiinia. Tämän suuntaisia tutkimuksia ei kuitenkaan ole suoritettu eikä julkaisussa esitetä mahdollisia käyttökelpoisia tekniikoita.

WO 99/29886, J. Jiang, L. Björck ja R. Fonden, perustuu osittain 10 edellä mainitussa artikkelissa kuvattuihin tutkimustuloksiin. Hakemus koskee tiettyjen elintarvikesovelluksiin käyttökelpoisten bakteerien käyttöä CLA:n tuottoon in vitro. Sopivina bakteereina mainitaan Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichiin ja P. freudenreichii ssp. shermaniin lisäksi myös Bifidobacterium breve. Julkaisun mukaan fermentointi voidaan suorittaa 15 emulaattorin läsnäollessa, esimerkkeinä mainitaan Tween 80 ja lesitiini. Tämänkään julkaisun esimerkeissä ei kuitenkaan kuvata emulaattorin käyttöä, ja parhaana tuloksena ilmoitetaan sama kuin edellä mainitussa artikkelissa; biologisesti aktiivista c9,t11 -isomeeriä saatiin 246,4 pg/ml alkuperäisestä linolihappopitoisuudesta 750 pg/ml käyttäen kantaa PFF6. Saanto jää siis alle 20 33 %.

Siten on edelleenkin selkeä tarve aikaansaada uusia menetelmiä ” konjugoidun linolihapon tuottamiseksi parannetuin saannoin. Haluttaessa hyödyntää mahdollisimman suuria määriä vapaata linolihappoa CLA:n lähtöaineena oleellista on se, miten vapaan linolihapon antimikrobiseen :: 25 vaikutukseen liittyvät ongelmat voidaan minimoida tai välttää.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on siten aikaansaada uusi menetelmä konjugoidun linolihapon tuottamiseksi hyvällä saannolla.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös aikaansaada uusia ( 30 tuotteita, jotka valmistetaan keksinnön mukaista menetelmää hyödyntäen ja jotka sisältävät suuren määrän CLA:ta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä oleva keksintö perustuu siihen, että vapaan linolihapon bakteerien kasvua inhiboivaa vaikutusta vähennetään lisäämällä linolihappoa \ 35 kasvatusalustaan sellaisessa muodossa, jossa se ei estä merkittävästi bakteerien kasvua, mutta on kuitenkin niiden käytössä kasvatuksen ajan.

108730

O

Keksinnön mukaisesti on havaittu, että kun linolihappo lisätään reaktioliemeen miselliseoksena, sillä on huomattavasti pienempi bakteerien kasvua inhiboiva vaikutus kuin jossakin muussa muodossa olevalla linolihapolla. Sopivan suuruisen detergenttilisäyksen avulla linolihappo pidetään kasvatus-5 olosuhteissa misellaarisena. Myös tämä vähentää osaltaan linolihapon bakteerien kasvua inhiboivaa vaikutusta. Misellaarisen linolihapon käytöllä ja misellien stabiloimisella kasvatuksen aikana saadaan myös CLA:n saanto paranemaan merkittävästi.

Käyttämällä fermentoinnin lähtöaineena misellöityä linolihappoa ja 10 valitsemalla fermentoinnissa oikea linolihappo/detergenttisuhde voidaan saavuttaa yli 90-prosenttinen linolihapon konversio CLA.ksi, ja yli 97 % muodostuneesta CLAista erittyy kasvualustaan. Esillä olevan keksinnön mukaisesti on siten kehitetty menetelmä suurten linolihappomäärien preparoimiseksi sellaiseen muotoon, että bakteerit pystyvät muuntamaan 15 linolihapon tehokkaasti CLA:ksi, ja erityisesti CLA:n c9, t11 - isomeeriksi, reaktion kärsimättä linolihapon kasvua inhiboivasta vaikutuksesta.

Keksintö koskee siten menetelmää CLA:n valmistamiseksi linolihaposta mikro-organismeilla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että lähtöaineena käytettävä linolihappo lisätään reaktioliemeen misellien muodossa.

20 Misellit sisältävät vapaata linolihappoa ja pinta-aktiivista ainetta oikeassa määräsuhteessa.

· '* Keksintö koskee edelleen keksinnön mukaisella menetelmällä

t I

; " valmistettuja tuotteita ja niiden käyttöä sellaisenaan tai terveysvaikutteisten ..! i' aineiden valmistuksessa.

25 Misellöinti voidaan suorittaa hyvin yksinkertaisella toimenpiteellä :T: sekoittamalla linolihappoa ja misellejä muodostavaa detergenttiä oikeassa määräsuhteessa keskenään aikalisissä olosuhteissa. Valmistus ei vaadi erikoisolosuhteita eikä erikoislaitteita, se on yksinkertainen, halpa ja helppo ,,,.; suorittaa myös suuressa mittakaavassa.

I I

30 Pinta-aktiivisen aineen valinta ei ole keksinnön kannalta kriittinen l’* parametri, esimerkiksi mikrobiologian alalla paljon käytetyt polyoksiety- \' · j leenisorbitaaniesterit (Tween-valmisteet) (useita valmistajia mm. Fluka ja Sigma) ·: ·: ja PEG 20 -sorbitaanioleaatti Kotilen-0/1 VL (Dr. W. Kolb AG) sopivat hyvin tähän tarkoitukseen. Myös useat muut pinta-aktiiviset aineet voivat tulla ’ \ 35 kyseeseen.

, 108730

Edellä kuvatulla tavalla valmistetun misellöidyn linolihapon konversio CLAiksi voidaan tehokkaasti suorittaa fermentoimalla. Fermentaatiossa voidaan käyttää mitä tahansa bakteeria, jolla on kyky muuttaa linolihappo CLAiksi, kuten esimerkiksi edellä tekniikan tason kuvauksessa mainittuja bakteereja. Edullisesti 5 fermentaatio suoritetaan kuitenkin elintarvikekäyttöön soveltuvien bakteerien, erityisesti propionihappobakteerien avulla. Sopivina pidetään esimerkiksi lajiin i Propionibacterium freudenreichii kuuluvat kannat, ja erityisesti alalajeihin P.

freudenneichii ssp. freudenreichii ja P. freudenreichii ssp. shermanii kuuluvat kannat.

10 Misellaarinen linolihappo stabiloidaan lisäämällä kasvualustaan pinta- aktiivista ainetta eli detergenttiä niin paljon, että kasvualustan vaikutus eliminoituu. Pinta-aktiivisina aineina voidaan käyttää edellä mainittuja aineita, esimerkiksi Tween ja Kotilen. Edullinen pinta-aktiivisen aineen pitoisuus riippuu lisätyn misellaarisen linolihapon määrästä ja on lisäksi kasvualustakohtainen. 15 Yleensä käytetään noin 0,5 - 1,5 % detergenttiä, edullisesti noin 1 %. CLAin lähtöaineeksi fermentointiliemeen lisätään siis misellöityä linolihappoa.

Uudella keksinnön mukaisella tekniikalla voidaan fermentointiliemeen lisätä linolihappoa ainakin 1000 pg/ml alustaa ilman että bakteerien kasvu merkittävästi muuttuu tai konversiotehokkuus laskee. Siten biokonversio tällä > 20 tekniikalla on huomattavasti parempi kuin tunnetuilla tekniikoilla, eli ainakin 80 % I , linolihaposta muuttuu CLAiksi ja siitä CLA-määrästä ainakin 75 % on biologisesti ' * aktiivisinta isomeeriä.

! · Fermentaatio suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla. Kasvualustat ja olosuhteet valitaan käytettävän kannan vaatimusten mukaisesti niin, että 25 saadaan optimaalinen CLAin tuotto. Esillä olevan keksinnön julkaisemisen . · : jälkeen sopivien fermentaatioparametrien valinta on alan ammattimiehen ; ; tietotaitoihin kuuluva asia.

Misellöityä linolihappoa käyttäen CLAita voidaan siis tuottaa bakteerien kasvun yhteydessä eliminoimalla linolihapon kasvua inhiboiva 30 vaikutus. CLAita voidaan tuottaa myös samanaikaisesti muihin tarkoituksiin käytettävän solutuotannon aikana. Keksinnön mukaisen menetelmän eräänä erityispiirteenä mainittakoon, että CLAita voidaan myös tuottaa solujen kasvatuksen jälkeen tai siitä erillään käyttäen lepääviä eli ei-kasvavia soluja, Λ jolloin CLAita voidaan tuottaa sekä ravintoalustassa että puskuriliuoksessa.

35 Puskuriliuoksessa ei tarvita erillistä detergenttilisäystä stabiloimaan linolihappodetergentti-misellejä. Haluttaessa CLAin muodostuminen voidaan 7 108730 myös yhdistää tapahtuvaksi ko. bakteeria hyödyntävässä elintarvikkeen valmistusprosessissa suoraan valmistettavaan tuotteeseen.

Fermentaatiossa muodostunut solujen ulkopuolelle erittyvä CLA voidaan eristää fermentointiliemestä tunnetuilla tekniikoilla ja haluttaessa 5 muokata sinänsä tunnetuin menetelmin hyvinkin puhtaaksi CLA-tuotteeksi. Vaihtoehtoisesti CLA.ta ja bakteerisoluja sisältävä fermentointiliemi voidaan käyttää sellaisenaan, tai CLA voidaan konsentroida esimerkiksi tiivistämällä tai kuivaamalla bakteerisolujen kanssa.

Saatua CLA:ta sisältävää tuotetta voidaan käyttää sellaisenaan 10 terveysvaikutteisena aineena. Tuotetta voidaan myös käyttää terveysvaikutteisten elintarvikkeiden ja vastaavien muiden tuotteiden valmistuksessa.

Käsitteellä elintarvike on tässä julkaisussa laaja merkitys kattaen kaikki nautittavaksi tarkoitetut tuotteet, jotka voivat olla kiinteässä, hyytelöidyssä tai nestemäisessä muodossa, ja kattaen sekä valmiit tuotteet että tuotteet, joihin 15 keksinnön mukainen tuote lisätään nauttimisen yhteydessä, lisäaineeksi tai j osaksi tuotetta. Elintarvikkeet voivat olla esimerkiksi meijeriteollisuuden, ! lihanjalostusteollisuuden, einesteollisuuden, juomateollisuuden, leipomoteolli suuden ja makeisteollisuuden tuotteita. Tyypillisiä ovat maitotuotteet, kuten jogurtti, viili, rahka, piimä, kirnupiimä, muut hapanmaitojuomat, tuorejuustot ja 20 kypsytetyt juustot, välipalasnackien täytteet, jne. Toisen tärkeän ryhmän muodostavat juomat, kuten herajuomat, hedelmäjuomat ja oluet.

| “ Edullisina käyttösovelluksina esitetään lyofilisoidut valmisteet, kuten : ’· CLA:ta sisältävät propionihappobakteerikapselit ja jauheet, sekä hapanmaito- tuotteet, joiden CLA-pitoisuus on nostettu propionihappobakteerin toiminnan :''. i 25 avulla.

* >

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä pidä katsoa sen suojapiiriä mitenkään rajoittaviksi.

Viite-esimerkki 1 tili» ... 30 Misellöinnin vaikutus bakteerien kasvuun ja CLA:n tuottoon I I 0 "S Keksinnön mukaisen menetelmän tehon osoittamiseksi suoritettiin :’*! vertailukoe, jossa tutkittiin propionihappobakteerien kasvua ja CLAn tuottoa ravintoalustassa, joka sisälsi vapaata linolihappoa, vapaata linolihappoa ja Λ, detergenttiä, ja esimerkin 1 mukaisesti misellöityä linolihappoa ja detergenttiä.

* 35 Kontrolleina käytettiin samaa ravintoalustaa ilman lisäystä (positiivinen kasvukontrolli) ja ravintoalustaa, johon oli lisätty ainoastaan detergenttiä.

8 108730

Kokeen suorittamiseksi propionihappobakteerikannat Propionibac-terium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) ja P. freudenreichii ssp. freudenreichii 131 (P131) kasvatettiin ensin MRS-liemissä, joissa 1) ei mitään lisäystä 5 2) 600 pg/ml linolihappoa 3) lisätty 600 pg/ml linolihappoa kantaliuoksesta, jossa linolihappoa 5 mg/ml ja 1 % Tween 80 -valmistetta vesiliuoksessa (lopullinen pitoisuus Tweeniä 0,2 %) 4) lisätty 0,9 % Kotileniä ja 600 pg/ml linolihappoa misellöitynä 10 esimerkin 1 mukaisesti 5) lisätty ainoastaan 0,9 % Kotileniä (ei linolihappoa) | Kanta PJS kasvatettiin lisäksi herapohjaisella alustalla, joka sisälsi 5 % herapermeaattia (Valio Oy), 2 % kaseiinihydrolysaattia (Valio Oy) ja 1 % hiivauutetta (LabM), edellä mainituilla lisäyksillä 1) - 5).

15 Kukin bakteerikanta kasvatettiin ravintoalustassa 2 kertaa 30 °C:ssa I 72 h, jonka jälkeen kukin koeliemi siirrostettiin 1 %:lla tuoretta viljelmää.

Koekasvatuksia seurattiin 30 °C:ssa 4 vrk määrittämällä kasvatuksesta solutiheys sameutena Klett-mittarilla. Kasvatuksen lopussa (96 h) määritettiin muodostuneen CLA:n määrä kaasukromatografisesti, c9,t11 -isomeeri erikseen 20 ja muut isomeerit yhdessä.

Rasvahappojen analysointi suoritettiin eräin muutoksin kuten M. Suutari, K. Liukkonen ja S. Laakso esittävät artikkelissa Temperature adaptation ‘‘ in yeasts: the role of fatty acids, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 1469 - 1474.

| ..:’ Analyysiä varten otetuista kasvatuslieminäytteistä sentrifugoitiin (5000 g, 15 min) :.' · i 25 solut erilleen. Supernatantti suodatettiin 0,2 pm suodattimena ja siitä otettiin 0,2 -: 0,5 ml näytteitä. Solumassa pestiin vesijohtovedellä. Supernatanttinäytteet ja : T: pestyt solut kylmäkuivatuin.

Kylmäkuivattuihin näytteisiin lisättiin 1 ml saippuointireagenssia, joka oli 3,7 M NaOH-liuosta 49-prosenttisessa metanolissa. Näytteet typetettiin, .>··, 30 sekoitettiin ja niitä pidettiin suljetuissa putkissa 100 °C:n vesihauteessa 30 min välillä kerran sekoittaen. Näytteet jäähdytettiin huoneenlämpöisiksi ja niihin lisättiin 4 ml metylointireagenssia, joka oli 3,3 M HCI-liuos 48-prosenttisessa : metanolissa. Näytteet typetettiin, sekoitettiin ja näyteputkia pidettiin 80 °C:n vesihauteessa 10 min, jonka jälkeen ne jäähdytettiin. Rasvahappojen ' 35 metyyliesterit uutettiin lisäämällä näytteisiin 1,5 ml heksaani/metyylitertbutyyli- eetteriliuosta (1:1) ja ravistelemalla putkia voimakkaasti 10 min. Alempi vesifaasi 9 108730 poistettiin Pasteur-pipetillä. Orgaaninen kerros pestiin lisäämällä näytteisiin 3 ml 0,3 M NaOH-liuosta ja ravistelemalla putkia voimakkaasti 5 min. Näytteitä sentrifugoitiin (5000 g, 20 min) ja orgaaninen näytekerros otettiin talteen Pasteur-pipetillä. Näytteet kuivattiin natriumsulfaatilla ja typetettiin.

5 Rasvahappojen metyyliesterit analysoitiin kaasukromatografilla (Hewlett Packard 5890 series II, Pennsylvania, USA), johon oli liitetty liekki-ionisaattoridetektori (FID) ja automaattinen näytteensyöttölaite (Hewlett Packard 7673A). Määrityksissä käytettiin kapillaarikolonnia (HP-FFAP, 25 m x 0,2 m x 0,3 pm). Näytteet injektoitiin split- eli jakoinjektoinnilla (split-suhde 1:20, 10 septumin huuhtelunopeus 1-2 ml/min). Kolonnin sisäänvirtauspaine oli 150 kPa ja kantajakaasun (helium) virtaus kolonniin oli noin 1 ml/min. Make up -kaasun (ilma) virtaus oli 30 ml/min ja vedyn virtaus detektoriin 40 ml/min. Injektointilämpötila ja detektorin lämpötila olivat 250 °C. Uunin lämpötila oli 70 -200 °C. Lämpötila nousi nopeudella 25 Celsius-astetta/min. Tulosten käsittelyjä 15 tulostus tehtiin kaasukromatografiin liitetyllä HP-Chemstation -ohjelmistolla, j Näytteissä olevat rasvahapot tunnistettiin vertaamalla niiden ' retentioaikoja tunnettujen rasvahappostandardien retentioaikoihin. Konjugoidun linolihapon tunnistamiseen käytettiin Sigman valmistetta, joka oli seos CLA:n cis- ja trans-9,11- ja -10,12 -isomeereistä. Rasvahappojen kvantifiointiin 20 käytettiin sisäisenä standardina C19:0-rasvahapon metyyliesteriä (nonadecanoic ! acid methyl ester, Sigma).

Bakteerien kasvutulokset on esitetty taulukossa 1.1.

10 108730

Taulukko 1.1.

PJS- ja P131-kantojen kasvu linolihappoa (LH) sisältävällä MRS- alustalla | _PJS__Oh 24h 48h 72h 96h 1) kontrolli 2 38 180 325 415 2) LH 78 84 96 106 110 3) LH + detergentti 40 49 68 94 120 4) LH (miselli) + detergentti 11 36 125 252 370 5) detergentti__1 35 185 340 430 _P131_____________ ! 1) kontrolli 8 37 122 270 425 2) LH 80 90 97 107 115 3) LH + detergentti 55 60 74 95 114 4) LH (miselli) + detergentti 1 20 71 160 270 5) detergentti_ 0 22 | 104 244 410 5

Tuloksista ilmenee, että linolihappo pitoisuudessa 600 pg/ml sellaisenaan tai lisättynä kantaliuoksen kautta, jossa 1 % Tween-yhdistettä I vesiliuoksessa, esti molempien kantojen kasvua kontrolliin verrattuna.

Käyttämällä vastaavaa määrää keksinnön mukaisesti misellöityä linolihappoa j. 10 linolihapon kasvua estävä vaikutus pieneni ja kanta kasvoi lähes kontrollin j '7 tavoin.

S · ·’· Kannoilla PJS ja P131 muodostuneen CLA:n määrä MRS-

’ · ‘i pohjaisissa liemissä on esitetty taulukossa 1.2, ja vastaava tulos kannalla PJS

:,: : herapohjaisella alustalla taulukossa 1.3.

15 „ 108730

Taulukko 1.2 PJS- ja P131-kantojen CLA:n muodostus linolihappoa (LH) sisältävällä MRS-alustalla PJS Kokonais-CLA CLA(c9,t11) CLA-saanto c9,t11-isomeerin μg/ml μθ/ωΙ % osuus kokonais- __viljelmää viljelmää___CLAsta (%) 1) kontrolli 39 9 24 2) LH 195 135 32 69 3) LH + detergentti 0,2 % 279 227 47 81 4) LH (miselleinä) + deter- 680 490 100 73 gentti 0,9 % 5) detergentti 0,9 %__247__64__:__26_ _P131_____ 1) kontrolli 41 11 - 26 j 2) LH 66 16 11 25 ! 3) LH + detergentti 0,2 % 78 26 13 34 4) LH (miselleinä) + deter- 308 134 51 44 gentti 0,9 % j 5) detergentti 0,9 %__232__63__:__27_ I 5

Taulukko 1.3 1 PJS-kannan CLA.n muodostus linolihappoa (LH) sisältävällä herapermeaattialustalla V : 10 _____ v * PJS Kokonais-CLA CLA(c9,t11) CLA-saanto c9,t11 -isomeerin μg/ml viljelmää μg/ml viljelmää % osuus kokonais- ;*·;_____CLA:sta (%) 1) kontrolli 16 2) LH 13 * ; 3) LH + detergentti 0,2 % 53 13 2 25 I * * ! · 4) LH (miselleinä) + deter- : ; : gentti 0,9 %_ 440 | 420 73 _96_ 12 1 08730

Tuloksista ilmenee, että keksinnön mukaisella misellöinnillä saavutetaan lähes 100 % konversio linolihaposta CLAksi, josta edullista c9,t11 CLA -isomeeriä muodostuu jopa yli 75 %. Jos linolihappo lisätään sellaisenaan, ainoastaan 32 % konvertoituu CLA:ksi, ja jos linolihappo lisätään 1 % 5 detergenttiliuoksessa ainoastaan 47 % konvertoituu CLA:ksi. Keksinnön mukaisella misellöinnillä saavutetaan siis merkittävästi parempi tulos sekä linolihapon bakteerien kasvua inhiboivan vaikutuksen minimoinnin että linolihaposta tapahtuvan CLA:n tuoton maksimoinnin osalta.

Esimerkki 1 10 Linolihapon preparointi misellimuotoon

Linolihappoa sisältävän misellikantaliuoksen valmistamiseksi | punnittiin 300 mg linolihappoa (cis-9,cis-12 -octadecadienoic acid, L-1376,

Sigma) koeputkeen, lisättiin 10 ml hapetonta tislattua vettä, joka sisälsi 0,36 ml sorbitaanioleaattidetergenttiä (Kotilen 0/1 tai Tween 80), sekoitettiin varovasti.

15 Seokseen lisättiin 2 N natriumhydroksidiliuosta tipoittain siten, että seos juuri ja | juuri kirkastui (noin 0,5 - 0,6 ml). Liuos siirrettiin 50 ml mittapulloon ja täytettiin ! pullo merkkiin hapettomalla tislatulla vedellä, jolloin saatiin 6 mg/ml linolihappoa sisältävä misellikantaliuos. Liuos jaettiin sopiviin eriin, ilma poistettiin typpikaasun avulla ja erät säilytettiin pakastettuina.

, 20 Misellikantaliuos voidaan valmistaa myös väkevämmäksi tai ! laimeammaksi kuin yllä on esitetty. Oleellista on, että vapaan linolihapon ja sorbitaanioleaattidetergentin määrien suhde pysyy samana kuin yllä.

Esimerkki 2 | Linolihapon ja detergentin vaikutus bakteerien kasvuun ja CLA:n 25 tuottoon : Linolihapon ja detergentin määrän suhteen vaikutusta selvitettiin ’ : : kasvattamalla propionihappobakteereja herapohjaisessa kasvatusliemessä ja MRS-liemessä (LabM) 150 ml:n kasvatuksina. Herapohjainen liemi sisälsi 2 % . : herapermeaattia (Valio Oy), 0,5 % tryptonia (LabM) ja 1 % hiivauutetta (LabM).

. ·. 30 Linolihappo lisättiin alustaan misellimuodossa edellä kuvattuna kantaliuoksena siten, että vapaan linolihapon pitoisuus alustassa oli 600 pg/ml. . ί Sorbitaanioleaattidetergenttiä (Kotilen 0/1 tai Tween 80) lisättiin alustaan erikseen haluttu määrä. Kasvatusliemen pH säädettiin arvoon 6,3. Kasvatuksissa käytettiin propionihappobakteerikantaa P. freudenreichii ssp.

35 shermanii JS 2 %:n (v/v) siirrosteena, joka oli kasvatettu herapohjaisessa liemessä. Kasvatukset tehtiin lämpötilassa 30 °C. Solujen kasvua seurattiin 96 13 1 08730 tunnin ajan mittaamalla kasvatusliemen sameutta Klett-Summerson -kolori-metrillä (filtteri nro 66). CLA ja linolihappo määritettiin kaasukromatografisesti.

Tulokset on esitetty taulukossa 2. Tässä ja esimerkeissä 3-4 esitetyissä CLA-tuloksissa CLA:n tuotolla tarkoitetaan PJS-mikrobisolujen 5 muodostamaa CLA:ta, joka on laskettu vähentämällä kokonais-CLA-pitoisuuksista alustaan detergentistä tulleen CLA:n määrä. CLA-saanto on laskettu seuraavasti: g muodostunut CLA/g LH alkuhetkellä.

Taulukko 2.

10 Herapermeaattiliemen ja MRS-liemen x) detergenttipitoisuuden vaikutus PJS-kannan kasvuun ja CLA:n tuottoon

Detergenttilisä Δ Klett-an/o CLA-saanto (%) herapermaattiliemeen___ LH (kontrolli) 34 <1 | 0,9 % Kotilen (kontrolli) 365 < 1 LH + 0,2 % Kotilen 77 33 LH + 0,9 % Kotilen 306 65 LH +1,2% Kotilen 309 67

Detergenttilisä i MRS-liemeen LH + 0,1 % Tween 80 56 51 I LH + 0,8 % Tween 80 301 83 x) MRS-liemi sisältää 0,1 % Tween 80, jolloin lisäyksellä 0,1 % v: 15 lopullinen pitoisuus nousee n. 0,2 %:iin.

Linolihappoa pystytään lisäämään misellimuodossa PJS-kannan ·· kasvatusalustaan suuriakin määriä ilman, että se inhiboi kokonaan solujen ·. kasvua. Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista ilmenee, että detergenttilisäyksellä 20 voidaan edelleen vähentää linolihapon inhiboivaa vaikutusta. Kun linolihapon ja ‘· : detergentin määrien suhde kasvatusalustassa on oikea, linolihapon määrää : voidaan nostaa kasvatusalustassa niin, että sen konversio CLA:ksi solujen . kasvun yhteydessä tapahtuu yhtä tehokkaasti kuin pienistä linolihappopitoi- suuksista. Tällöin päästään teollisesti merkittäviin määriin CLA:n haluttua cis-25 9,trans-11 -isomeeriä. Linolihappopitoisuudella 600 pg/ml detergenttipitoisuus 14 1 08730 0,9 - 1 % oli tässä kokeessa optimaalinen, mutta myös suurempia määriä voidaan käyttää.

Esimerkki 3 CLA:n tuotto pH-säädetyssä fermentaatiossa 5 Propionihappobakteerien kasvatus on teollisessa mittakaavassa tehokkainta tehdä fermentorikasvatuksena, jossa voidaan pitää kasvatusalustan pH-arvo solukasvulle optimaalisena. Konjugoidun linolihapon tuottoprosessia kasvavien PJS-solujen avulla selvitettiin fermentorikasvatuksina 2 litran liuostilavuudella. Kasvatusalustana käytettiin esimerkin 2 herapermeaattilientä.

10 Kasvatusliemi sisälsi miselloitua linolihappoa 400, 600 tai 1000 pg/ml ja Kotilen-detergenttiä vastaavasti 0,6, 0,9 tai 1,5 %. Kasvatusalustan pH pidettiin | kasvatuksen ajan arvossa 6,3 ammoniakkiliuoksen automaattisen lisäyksen avulla. Kasvatuslämpötila oli 30 °C ja sekoitusnopeus 100 rpm. Elävien propionihappobakteerisolujen pitoisuus määritettiin puskuroidussa natrium- 15 laktaattiagarissa ja agarmaljoja inkuboitiin 30 °C:ssa anaerobisesti 5-7 vrk.

I Kuvassa 1 nähdään CLA.n muodostuminen linolihaposta, kun kasvatusalustaan oli lisätty linolihappoa 400 pg/ml ja sorbitaaniole-aattidetergenttiä 0,6 %. Linolihapon konversio CLAksi tapahtuu selvästi yhtä aikaa PJS-solujen kasvun kanssa.

20 Taulukossa 3 on verrattu CLA:n tuottoprosessia fermentorissa j kasvatusalustan linolihappopitoisuuksilla 400, 600 ja 1000 pg/ml 94 tunnin kasvatuksen jälkeen.

{ Taulukko 3.

25 CLA;n tuotto PJS-solujen pH-säädetyissä kasvatuksissa » · · : LA400μ9/ηηΙ LA600pg/ml LA1000pg/ml __deterg. 0,6 % deterg. 0,9 % deterg, 1,5 % solupitoisuus (pmy/ml) 1,3 x1010 1,2 x1010 1,4 x1010 , ·. CLA-saanto (%) 84 (94h) 77(94h) 63 (94h) 50 (19h) 50 (19h) 32(23h) ‘: solunulk. CLA:n osuus (%) 98 99 98 ’ ·" · cis-9,trans-11 -osuus (%) 75 83 73 linolihapon kulutus (%)__93__94__92_ » 15 1 08730

Esimerkki 4 CLA.n tuotto solujen kasvuvaiheen jälkeen

Propionihappobakteerien kykyä tuottaa CLAta solujen kasvuvaiheen jälkeen tutkittiin toistamalla esimerkissä 3 kuvattu fermentaatio sillä erolla, että 5 miselliliuoksessa oleva linolihappo ja sorbitaanioleaattidetergentti lisättiin ravinneliemeen vasta PJS-solujen nopean kasvuvaiheen lopussa, 51 tunnin kuluttua kasvatuksen aloituksesta. Linolihapon pitoisuus kasvatusalustassa oli 600 pg/ml ja detergentin 0,9 %. Solupitoisuus lisäyshetkellä oli 1,8 x 1010 pmy/ml. Tämän jälkeen solujen kasvu pysähtyi noin kolmeksi tunniksi ja jatkui 10 sitten hyvin hitaasti.

Solujen aikaansaama konversio linolihaposta CLAksi tapahtui erittäin | nopeasti: kolmessa tunnissa CLA-saanto oli 45 % ja kuudessa tunnissa 58 %.

Etuna tässä menetelmässä on fermentaation lyhyempi kokonaisaika (noin 60 tuntia) verrattuna vastaavaan kasvatukseen, jossa linolihappo ja detergentti 15 olivat kasvatusalustassa alusta asti (noin 100 tuntia).

I Esimerkki 5

Ei-kasvavien bakteerisolujen käyttö CLA:n tuottoon puskuri-liuoksessa PJS-soluja kasvatettiin herapohjaisessa kasvatusliemessä 3 vrk 20 30 °C:ssa, solut sentrifugoitiin ja pestiin 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla (pH 6,0). 2,0 g märkää solumassaa lisättiin 50 ml:aan 0,1 M natriumfosfaatti-puskuria (pH 7,8), jolloin solupitoisuudeksi puskurissa tuli noin 3 x 1010 “ pmy/ml. Lisättiin esimerkin 1 mukaisesti miselloitua linolihappoa siten, että ! .linolihappopitoisuudeksi puskuriliuoksessa tuli 600 μg/ml. Inkuboitiin ‘ ·; 25 lämpötilassa 6 °C tai 30 °C 21 tuntia. CLA:n määritys tehtiin GC-menetelmällä ja : : *: mittaamalla spektrofotometrillä aallonpituudella 235 nm.

Tulokset on esitetty taulukossa 4. CLA:n muodostumista puskuriliuoksessa ei-kasvavien PJS-solujen avulla tapahtui molemmissa tutkituissa lämpötiloissa, tehokkainta se oli lämpötilassa 30 °C. CLAn tuottoon 30 ravinneliuoksessa tarvitaan detergenttilisäystä pitämään linolihappo misellaari-sessa muodossa. Edullinen detergenttipitoisuus riippuu liuoksen lähtöaine-:· i pitoisuudesta. Puskuriliuoksessa sen sijaan ei tarvita erillistä detergenttilisäystä : reaktioliemeen, vaan se voi jopa olla selvästi haitallinen.

‘ \ 35 i 16 1 08730

Taulukko 4.

CLA-saanto (g muodostunut CLA/g LA ei-kasvavilla PJS-soluilla fosfaattipuskurissa, pH 7,8) __CLA-saanto (%)

Reaktioaika (h) 6 °C__30 °C

3 3 20 5 5 29 21 l 20 l 63 5

Esimerkki 6 i Kuivattua CLA:ta sisältävän koostumuksen valmistus

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS kasvatettiin hera-alustalla, joka sisälsi 2% herapermeaattia (Valio Oy), 0,5% 10 kaseiinihydrolysaattia (Valio Oy), 0,5% hiivauutetta (Lab M) ja 0,2 g esimerkin 1 mukaisesti misellöityä linolihappoa. Alusta siirrostettiin 1%:lla tuoretta bakteeriviljelmää, pH pidettiin automaattisella pH:n säätöyksiköllä arvossa pH

6,5 ja lämpötilaa 30 °C:ssa kasvatuksen aikana. 4 vrk:n kasvatuksen jälkeen soluviljelmä kasvualustoineen haihdutettiin pöyröhaihduttajassa 1/4 osaan I 15 alkuperäisestä ja tämä konsentraatti kylmäkuivatuin Heto-kuivurissa.

I Jauhesaanto oli 23 - 25 g /1000 ml. Saatu jauhe sisälsi CLA:ta 8,056 mg/g (193 mg/24 g jauhetta) eli alkuperäisestä linolihaposta oli 96 % muuttunut CLA:ksi. Biologisesti aktiivisinta isomeeriä oli kokonais-CLA:sta 79 %. Tulokset on esitetty I · ·: taulukossa 5.

• * V·: 20 l » ·

Taulukko 5.

CLA:n tuotto PJS:n kasvualustaan

__PJS

•. Kokonaismäärä CLA mg/g jauhetta 8,056 c9,t11-isomeeri, mg/g 6,373 ‘Linolihappo, mg/g_ 0,609 ; V: 25

Claims

17 1 08730 j

1. Menetelmä konjugoidun linolihapon valmistamiseksi linolihaposta mikro-organismien avulla, tunnettu siitä, että linolihappo lisätään reaktio- 5 liemeen linolihappoa ja pinta-aktiivista ainetta käsittävien misellien muodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, j että misellit on muodostettu saattamalla vapaa linolihappo ja pinta-aktiivinen aine reagoimaan keskenään aikalisissä olosuhteissa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että misellit käsittävät linolihapon ja polyoksietyleenisorbitaanimono- oleaatin seoksen.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan pääasiassa konjugoidun linolihapon cis-9, trans-11 -isomeeriä.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että konversio suoritetaan propionihappobakteer(e)illa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että propionihappobakteeri on lajiin Propionibacterium freudenreichii, ja edullisesti sen alalajiin Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii tai Pro- 20 pionibacterium freudenreichii ssp. shermanii kuuluva kanta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että propionihappobakteeri on Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii 131 tai Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS.

;:· 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, t u n - J 25 n e 11 u siitä, että konjugoidun linolihapon valmistus tapahtuu samanaikaisesti . : ·. bakteerien kasvun kanssa.

•, 9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että konversio suoritetaan pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa.

, 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 30 tä, että pinta-aktiivinen aine on polyoksietyleenisorbitaanimono-oleaatti, jota käytetään pitoisuudessa noin 0,5 -1,5 %.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugoidun linolihapon valmistus tapahtuu mikro-, , organismien kasvatuksen jälkeen. 18 1 08 7 30

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konversio suoritetaan kasvualustasta erotetuilla soluilla ilman erillistä ! pinta-aktiivisen aineen lisäystä.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, t u n -5 n e 11 u siitä, että konjugoidun linolihapon valmistus tapahtuu elintarvikkeen valmistuksen yhteydessä.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugoitu linolihappo eristetään reaktioliemestä ja mahdollisesti kuivataan.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -13 mukainen menetelmä, tun ne 11 u siitä, että konjugoitu linolihappo ja mikro-organismisolut konsentroidaan ja mahdollisesti kuivataan.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että linolihappo ja mikro-organismisolut otetaan talteen, konsentroidaan 15 ja lyofilisoidaan. » »» » • ·» » » • · · • I ft ft ft ft * ft ft ft ft ft ! I ft ft I I I t t * ft ft ft ft ft ft · ft It»#· ft I ft > ft ft ft ft f 19 1 08730