PL240561B1 - Wektory DNA zdolne do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae zawierające gen kodujący butyrylocholinoesterazę BChE - Google Patents

Description

PL 240 561 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wektory DNA do uzyskiwania butyrylocholinoesterazy BChE zdolne do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae.

Enzymy z grupy ChE: acetylocholinesterazy (AChE) i butyrylocholinesteraza - BChE (E.C. 3.1.1.8) pełniące biologiczną rolę w przekazywaniu sygnału nerwowego (AChE) oraz naturalnej detoksyfikacji organizmu (BChE), charakteryzują się zdolnością rozkładania szerokiego spektrum związków posiadających wiązania estrowe oraz wiązania i unieczynnienia związków fosforoorganicznych - OP. Stąd też znalazły szereg zastosowań cywilnych i militarnych, m.in. w: odtruwaniu po ekspozycji na pestycydy fosfoorganiczne, po ukąszeniach węży, owadów, przedawkowaniu narkotyków, w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych - m.in. demencji, alkoholizmu, narkomanii, chorobie Alzheimera, urazowych uszkodzeń układu nerwowego. Zastosowania militarne i podwójnego użycia obejmują działania w kierunku ochrony ekosystemów i ludzi ogniskujące się na wczesnym ostrzeganiu oraz usuwaniu związków toksycznych. Jednym z największych zagrożeń jest współczesne rozpowszechnienie oraz pozostałości powojenne, m.in. związków OP. Są to jedne z najsilniejszych znanych trucizn, działających na enzymy ChE poprzez fosforylację seryny w centrum aktywnym. OP są stosowane jako pestycydy, a także jako Bojowe Środki Trujące (skrót: „BST”) należące do grupy paralityczno-drgawkowej (m.in. soman, sarin, tabun, VX). W odróżnieniu od zagrożenia pestycydami, które da się oszacować obszarowo i czasowo, wzrastające zagrożenia użycia BST są nieprzewidywalne co do skali oraz momentu zaistnienia. Od strony ochrony zdrowia człowieka, najistotniejszym czynnikiem przy zatruciach jest czas od momentu kontaktu człowieka z tymi związkami do podania związków hamujących działanie OP. Szybka i czuła detekcja BST i pestycydów OP jest kluczowym parametrem pozwalającym zapobiec zatruciom. Sprawdzonym, kluczowym elementem biosensorów wykrywających BST i pestycydy z grupy OP, jest enzym końska BChE. Jest to hydrolaza serynowa obecna w tkankach zwierząt. Enzym ten może pomieścić w swoim centrum aktywnym większe substraty lub inhibitory niż AChE, enzymu odpowiedzialnego za hydrolizę acetylocholiny w ośrodkowym układzie nerwowym i połączeniach nerwowo-mięśniowych. AChE przez to że jest kluczowym enzymem transmisji impulsów nerwowych jest specyficznym celem dla pestycydów OP i BST. Zahamowanie aktywności enzymatycznej AChE prowadzi do cholinergicznych objawów zatrucia takich jak zwężenie źrenic, ślinotok, wymioty, bradykardia i paraliż ośrodka oddechowego. W związku ze specyficzną budową centrum aktywnego BChE i zdolność wiązania szerokiego spektrum związków chemicznych, znajduje ona zastosowanie jako czuła komponenta biosensorów oraz jest również skutecznym antidotum. W 2010 roku amerykańskie FDA (Food and Drug Administration) dopuściło użycie rekombinowanej ludzkiej BChE jako terapeutyka stosowanego w przypadku zatruć i prewencji zatruć BST, pestycydami OP, toksynami oraz do prób terapii chorób neurodegeneracyjnych.

W poniższych publikacjach ujawniono metody produkcji i modyfikacji ChE oraz ich pochodnych. Eddieston i in. Lancet 371:597-607 (2008) ujawnia, że na świecie każdego roku notuje się ok. 200 tysięcy zgonów spowodowanych zatruciami pestycydami OP, są więc one poważnym problemem zdrowia publicznego, szczególnie na wiejskich terenach krajów rozwijających się.

Blong i in. Biochem. J. (1997) 327, 747-757 ujawnia, że domena tetrameryzacyjna ludzkiej BChE, zlokalizowana na C-terminalnym końcu polipeptydu, może być usunięta metodami inżynierii genetycznej, zachowując aktywność enzymatyczną białka o ile nie zostaje usuniętych więcej niż 50 reszt aminokwasowych.

Wierdl i in., Biochem Pharmacol. 59:773-781 (2000) ujawnia, że modyfikacje ludzkiej BChE potencjalnie wpływające na aktywność enzymatyczną polegające na zastosowaniu glikozydazy do usunięcia modyfikacji potranslacyjnych glikozylacji z już uformowanego in vivo białka wykazały, że BChE nie wymaga dalszej glikozylacji do aktywności enzymatycznej. Enzym uzyskany w wyniku transkrypcjitranslacji in vitro, pozbawiony glikozylacji podczas biosyntezy, również wykazywał aktywność enzymatyczną, jakkolwiek wykazywał zmienione właściwości biochemiczne.

Main i in. Biochem J. 143:733-744 (1974) ujawnia procedurę izolowania do stanu jednorodności elektroforetycznej naturalnej (nierekombinantowej) BChE, uzyskując z 20 L osocza konia 15-18 mg białka. Procedura oparta była na frakcjonowaniu siarczanem amonowym, chromatografii jonowymiennej na DEAE-Sephadexie oraz preparatywnej elektroforezie w warunkach niedenaturujących. Dla zastosowania jako antidotum dla człowieka należałoby użyć osocza kilku koni, co czyni podejście tego rodzaju niepraktyczne z powodu braku dostępności materiału zwierzęcego w tak dużych ilościach, procedura jest nieekonomiczna oraz trudna do zaakceptowania ze względów epidemiologicznych i etycznych.

PL 240 561 B1

Kronman i in. Gene 121:295-304 (1992) ujawniają klonowanie w ssaczych liniach komórkowych, ekspresję pod kontrolą wirusowych promotorów cytomegalowirusa, wirusa Rous sarcoma oraz SV40 oraz sekrecję na zewnątrz komórek rekombinantowej ludzkiej BChE. Uzyskane białko w postaci mieszaniny dimerów, tetramerów, oraz wariantów modyfikacji potranslacyjnych wykazywało aktywność enzymatyczną. Jednak, hodowla rekombinantowych komórek ssaczych jest kosztowna, długotrwała i podatna na zakażenia mikrobiologiczne, co czyni ją niepraktyczną do zastosowań przemysłowych.

W opisie wynalazku EP 0388906 B oraz US 5,595,903 została ujawniona sekwencja ludzkiej AChE, określona na podstawie klonowania i sekwencjonowania cDNA. Kodowanie biologicznie aktywnego białka AChE zostało zweryfikowane poprzez sklonowanie cDNA do wektora pGEM, zawierającego promotor SP6, wykonanie transkrypcji in vitro SP6 RNA polimerazą, mikro iniekcję do oocytów Xenopus oraz przeprowadzenie testów enzymatycznych na obecność aktywności AChE. Zastosowana metodologia pozwoliła na wykazanie jedynie na skalę analityczną uzyskanie aktywnie biologicznego klonu cDNA ludzkiej AChE.

Wei i in. Biochem. Pharmacol. 60:121-126 (2000) ujawniają klonowanie genu kodującego ludzką BChE w komórkach larw owadzich - jedwabnika morwowego Bombyxmori, infekowanych modyfikowanymi wirusami baculovirus oraz uzyskanie biologicznie aktywnego enzymu w skali analitycznej. Hodowla komórek owadzich obarczona jest podobnymi ograniczeniami, jak hodowla komórek ssaczych.

Mor i in. Biotechnol. Bioeng. 75:259-266 (2001) ujawniają konstrukcję rośliny transgenicznej, zawierającej klonowany i eksprymowany w ziemniakach gen kodujący aktywną biologicznie izoformę ludzkiej AChE, wykazującą się stabilnością i zachowującą parametry kinetyczne, odpowiadające ludzkiemu enzymowi. Metoda ma szereg zalet w porównaniu do rekombinantowych hodowli tkankowych czy metod izolowania z osocza, m.in. brak ograniczeń epidemiologicznych i wrażliwości na infekcje. Wadą jest natomiast powolne tempo wzrostu rekombinantowych roślin.

Lockridge i in. J. Med. Chem. Biol. Radiol. Def. 3:nihms5095 (2005) ujawnia metodę izolowania naturalnej ludzkiej BChE na skalę preparatywną ze 100 L osocza. Metoda zawiera etapy chromatografii jonowymiennej na Q-Sepharose w niskim pH (4), chromatografii powinowactwa na procainamide-Sepharose, DEAE 8HR- HPLC, pozwalając na uzyskanie wysokooczyszczonego enzymu, o niskim poziomie zawartości endotoksyn, spełniającego kryteria testów ochrony przed OP podczas badań na małpach. Poważną wadą metody są: bardzo ograniczona dostępność ilości osocza ludzkiego, koniecznych do prowadzenia procesu przemysłowego oraz względy epidemiologiczne.

Cerasoli i in. Chem. Biol. Interact. 157-158:363-365 (2005) ujawnili klonowanie i ekspresję BChE w transgenicznych kozach, wydzielających BChE w mleku. Preparat rekombinowanego białka BChE skomercjalizowano pod nazwą Protexia (Nexia Biotechnologies, Que., Canada). Problemem technicznym w procesie przemysłowym jest ograniczona ilość transgenicznych zwierząt i powolne tempo ich rozmnażania.

Saxena i in. J. Mol. Neurosci. 30:145-148 (2006) ujawnia, że BChE wiążąc związki toksyczne obecne w osoczu, hydrolizuje je albo trwale wiąże zapobiegając dotarciu ich do AChE obecnej w obwodowych połączeniach nerwowych i centralnym układzie nerwowym. 1 mol ludzkiej BChE wiąże 1 mol związków OP, a dawka 200 mg tego białka jest w stanie zapobiec efektom zatrucia człowieka o wadze 70 kg somanem w ilości 2x LD50. Doświadczenia na modelach zwierzęcych, u których zaaplikowano wcześniej BChE wykazały pełną ochronę na dawkę 5x LD50 podanego BST. Istotnym aspektem jest ilość białka konieczna do wywołania efektu antidotum - BChE potrzebnego dla jednego człowieka w celu inaktywacji toksyny - 200 mg czystego preparatu BChE jest to ilość bardzo duża, a jej izolacja metodami tradycyjnymi (z osocza konia) jest bardzo kosztowna.

W opisie wynalazku US 6,987,211 B1 zostało ujawnione klonowanie i ekspresja genu kodującego nie-synaptyczny wariant splicingowy ludzkiej AChE do transgenicznych myszy pod kontrolą promotora cytumegalowirusa. Konstrukcja genetyczna prowadziła do ekspresji i sekrecji ludzkiej wersji AChE w mleku mysim. W tym samym zgłoszeniu patentowym ujawnione zostały klonowane i eksprymowane przy użyciu w/w metody: ludzka AChE i BChE w wariancie naturalnego genu oraz na drodze ekspresji syntetycznych genów, posiadających delecje i mutacje punktowe, a także klonowane i eksprymowane ChE pochodzące z owadów. Prezentowana metoda została zaprojektowana jako przeznaczona do analitycznych celów badawczych, nie odpowiadająca wymogom skalowania przemysłowego.

Evron i in. FASEB J. 21:2961-2969 (2007) ujawniają klonowanie ludzkiej AChE w Nicotiana henthamiana, rośliny spokrewnionej z tytoniem. Izolowany rekombinowany enzym miał cechy biochemicznie niewyróżnialne od enzymu otrzymanego z ssaczych kultur komórkowych. Zastosowany w dawkach

PL 240 561 B1 równo molowych, eliminował całkowicie krótkotrwałe symptomy zatruć OP u myszy. Ograniczeniem metody jest powolne tempo wzrostu roślin.

Li i in. Chem. Biol. Interact. 187:101-105 (2010) ujawniają uzyskanie wysokiego poziomu ekspresji klonowanego genu kodującego ludzką BChE w komórkach larwach owadzich, infekowanych modyfikowanymi wirusami baculovirus. Metoda niesie w/w ograniczenia w stosowaniu kultur tkankowych w procesach przemysłowych.

Morel i Massoulie Biochem. J. 328:121-129 (1997) ujawniają klonowanie i ekspresję AChE oraz jej pochodnych delecyjnych szczura i węża w drożdżach Pichia pastoris, uzyskując rekombinantowe formy monomeryczne i dimeryczne, wykazujące aktywność biologiczną. Poziom produkcji rekombinantowych AChE wynosił nie więcej niż 1 mg białka z 1 L hodowli. Uzyskana konstrukcja genetyczna prowadzi do ekspresji AChE na bardzo niskim poziomie, gdyż typowo Pichia pastoris umożliwia produkcję na poziomie nawet powyżej 300 mg z 1 L hodowli, tym samym opisane konstrukty genetyczne nie nadają się do skalowania przemysłowego.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych wektorów DNA, zdolnych do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae.

Do tej pory próby wydajnej ekspresji genów kodujących ChE i biosynteza biologicznie aktywnych enzymów ChE w mikroorganizmach powszechnie używanych do przemysłowej, wydajnej produkcji białek, jak bakteria Escherichia coli czy drożdże nie powiodły się lub powiodły się jedynie częściowo. Wynika to z szeregu trudności: gwałtownej proteolizy ChE w bakteriach i innych mikroorganizmach, obecności wielu mostków dwusiarczkowych w ChE, niemożliwych do właściwego uformowania w mikroorganizmach prokariotycznych, a koniecznych do uzyskaniu aktywnej konformacji przez te enzymy, trudnościach w prawidłowym fałdowaniu białka do konformacji aktywnej enzymatycznie oraz braku wymaganych mechanizmów modyfikacji potranslacyjnych ChE. Strategie ekspresji w układach funkcjonalnie odpowiadających hodowlom mikroorganizmów -zawiesin komórek organizmów eukariotycznych: insektów, infekowanych baculovirusem oraz ssaczych liniach komórkowych są trudne do zastosowań przemysłowych ze względu na wysokie koszty, konieczność zaadoptowania etapów trudnych do zautomatyzowania, długiego okresu inkubacji, podatności na zakażenia bakteryjne.

Istotą wynalazku jest wektor DNA zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae, zawierający gen kodujący skróconą wersję butyrylocholinoesterazy BChE pokazany na Seq. 3 lub Seq. 7 lub Seq. 8, pozbawiony domeny tetrameryzacyjnej, kierujący biosyntezą rekombinantowego białka z zawartej w genie Otwartej Ramie Odczytu, przy czym gen zawierający Otwartą Ramę Odczytu koduje białko o Seq. 1 zawierające sumarycznie 564 reszt aminokwasowych i opatrzone na N-końcu sekwencją sekrecyjną Leishmania o 23 resztach aminokwasowych oraz zawierające dodatkowo 2 reszty aminokwasowe Gly-Ala, a na C-końcu 4 reszty aminokwasowe Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznik 6-ciu reszt His.

Wynalazkiem jest też wektor DNA zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae, do produkcji białka o Seq. 4, zawierającego sumarycznie 614 reszt aminokwasowych, w tym dodatkowe 2 reszty aminokwasowe Met-Ala na N-końcu, a na C- końcu opatrzoną dodatkowymi 4 resztami aminokwasowymi Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznikiem 6-ciu reszt His, przy czym wektor zawiera gen kodujący holoenzym końskiej butyrylocholinoesterazy BChE o sekwencji Seq. 6.

Wynalazkiem jest też wektor DNA, zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae do produkcji białka o Seq. 4 zawierającego sumarycznie 614 reszt aminokwasowych, w tym dodatkowe 2 reszty aminokwasowe Met-Ala na N-końcu, a na C- końcu opatrzone dodatkowymi 4 resztami aminokwasowymi Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznikiem 6-ciu reszt His, przy czym wektor zawiera gen syntetyczny kodujący holoenzym końskiej butyrylocholinoesterazy BChE o Seq. 3.

Korzystnie jest to wektor wahadłowy klonowania i ekspresji białek, zawierającym dodatkowo minimum dwa origin replikacji, korzystnie dla Escherichia coli i/lub Leishmania tarentolae. Korzystnie, wektor DNA koduje sygnał sekrecyjny, korzystnie pochodzący z Leishmania, geny oporności na antybiotyki, korzystnie bleomycynę i/lub ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie bakteriofaga T7, gen represora transkrypcji, korzystnie regulowany przez tetracyklinę, gen operatora, korzystnie regulowany przez represor tetracyklinowy, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji, korzystnie sekwencję kodującą 6-ciu reszt histydyny.

Wektory DNA zawierają sekwencję wskazane i przedmiot wynalazku zobrazowano na rysunku.

Opisano dodatkowo sposób klonowania molekularnego, ekspresji i produkcji rekombinantowych BChE i ChE - jako porównanie wynalazku, w oparciu o syntetyczne lub naturalne geny, polegający na:

- otrzymaniu syntetycznego genu kodującego,

PL 240 561 B1

- powieleniu metodą PCR syntetycznego lub naturalnego genu BChE,

- wklonowaniu do wektora ekspresyjnego Leishmania tarentolae, pLEXY I-blecherry3, który koduje gen fuzyjny,

- izolowaniu powielonego produktu PCR i poddaniu trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi, korzystnie Sall i MspCl,

- poddaniu wektora również trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi, Sall i MspCl,

- poddaniu uzyskanych produktów trawienia rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu agarozowym

- oczyszczeniu fragmentów DNA,

- poddaniu ligacji z zastosowaniem ligazy DNA, bakteriofaga T4, oczyszczony liniowy wektor, pLEXY 1-blecherry3 oraz trawiony produkt PCR - usunięciu naturalnej N-terminalnej aminokwasowej sekwencji sygnałowej do sekrecji zewnątrzkomórkowej i wstawienie w jej miejsce sekrecyjnej sekwencji sygnałowej Leishmania tarentolae,

- usunięciu C-terminalnej domeny tetrameryzacyjnej,

- skonstruowaniu fuzyjnej Otwartej Ramy Odczytu,

- eksprymowaniu biologicznie aktywnego białka skróconej wersji BChE oraz białka holoenzymu BChE w Leishmania tarentolae

- izolowaniu rekombinowanych białek.

Zastosowano następujące startery:

a) dla syntetycznego genu

5’-ATAGTCGACGCTGGCGCCGAAGAAGACATCATCATCACCACC-3’ oraz 5’-ATTCTTAAGAACTTTCGGGAAGAACAGGGTCCAGAAACGG-3’.

b) dla genu na bazie cDNA

5'-TAGCCATGGCCATGCAGAGCTGGGGTACAATC-3' i

5’-ACTCTTAAGAAAATCTGAACAGCTTTCTTTCTTGCTAGTG-3’.

Opis sekwencji:

Natywny gen kodujący butyrylocholinesterazę BChE pokazany jest Seq. 6 i jest znany i opisany poniżej jako przykład do porównania z wynalazkiem. Przedmiotem wynalazku są opisane konstrukty wektory DNA - które zawierają pewne znane części - sekwencji lub części ale każda wymieniona sekwencja i modyfikacja w jednym konstrukcie jest nowa i stanowi przedmiot wynalazku. W szczególności wektor DNA do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae, według wynalazku zawiera gen pokazany Seq. 3 lub Seq. 6 lub Seq. 7 lub Seq. 8 kodujące wersje końskiego BChE z modyfikacjami opisaną zgodnie z innymi sekwencjami opisanymi niżej.

Seq. 1 - sekwencja aminokwasowa, tworząca białko SP-BChE-His. SP - oznacza sekwencję sekrecyjną Leishmania, BChE - fragment syntetycznego genu, His - oznacza znacznik 6-ciu reszt His.

Seq. 2 - sekwencja aminokwasowa, kodująca białko GA-BChE-His. GA - oznacza 2 reszty Gly-Ala, wynikające z konstrukcji wektora pLEXSY-blecherry3 oraz początek sekwencji fragmentu syntetycznego genu po odcięciu SP, His - oznacza znacznik 6-ciu reszt His.

Seq. 3 - sekwencja nukleotydowa Otwartej Ramy Odczytu fragmentu BChE, pozbawiona odcinak DNA kodującego N-terminalną końską sekwencję sekrecyjną oraz C-terminalną 45-cio aminokwasową domenę tetrameryzacyjną o długości 1587 par zasad, w formie jednoniciowej.

Seq. 4 - sekwencja aminokwasowa, tworząca białka SP-BChE-HorseHis oraz SP-BChE- syntHis. SP- oznacza końską sekwencję sekrecyjną, BChE-Horse - pełnej długości naturalny gen, BChE-synt - pełnej długości syntetyczny gen, His - oznacza znacznik 6-ciu reszt His.

Seq. 5 - sekwencja aminokwasowa, tworząca dojrzałe białka BChE-HorseHis oraz BChE-syntHis, wskazane w Seq. 4 po odcięciu końskiej sekwencji sygnałowej.

Seq. 6 - sekwencja nukleotydowa produktu PCR, w formie jednoniciowej, kodującego białko SP-BChE-HorseHis (bez elementów sekwencji pochodzących z wektora pLEXSY I-blecherry3).

Seq. 7 - sekwencja nukleotydowa produktu PCR, w formie jednoniciowej, kodującego białko SP-BChE-syntHis (bez elementów sekwencji pochodzących z wektora pLEXSY I-blecherry3).

PL 240 561 B1

Seq. 8- powstający produkt PCR o długości 1614 par zasad przedstawiony w formie jednoniciowej.

Seq. 9 - sekwencja nukleotydowa plazmidu pLEX-BCHE-ST w formie jednoniciowej o długości 8807 par zasad. pLEX-BCHE-ST oznacza wektor pLEXSY I-blecherry3 zawierający wklonowany skrócony syntetyczny gen BChE, opatrzony sekwencją sekrecyjną Leishmania.

Seq. 10 - sekwencja nukleotydowa plazmidu pLEXSY-BChEHor o długości 8957 par zasad, w formie jednoniciowej. pLEX-BChEHor oznacza wektor pLEXSY I-blecherry3 zawierający wklonowany pełnej długości naturalny koński gen BChE, opatrzony końską sekwencją sekrecyjną.

Seq. 11 - sekwencja nukleotydowa plazmidu pLEXSY-BChEEco o długości 8957 par zasad, w formie jednoniciowej. pLEX-BChEHor oznacza wektor pLEXSY I-blecherry3 zawierający wklonowany pełnej długości syntetyczny gen BChE, opatrzony końską sekwencją sekrecyjną.

Opisany w stanie techniki problem z uzyskaniem biologicznie aktywnych cholinoesteraz został rozwiązany poprzez niniejszy wynalazek.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1. Schemat realizacji sposobu według wynalazku.

Schemat sposobu według wynalazku omówiony na przekładzie klonowania molekularnego, ekspresji i produkcji skróconej wersji rekombinantowej BChE końskiej oraz holoenzymu pełnej długości BChE końskiej w mikroorganizmie Leishmania tarantolae, w oparciu o syntetyczny gen, którego sekwencja została zaprojektowana w oparciu o naturalne sekwencje cDNA, dostępne w publicznych bazach danych. Zaprezentowano również przykład klonowania naturalnego genu, uzyskanego z cDNA konia. Przedstawiony schemat sposobu wynalazku jest uniwersalny w zastosowaniu do klonowania molekularnego, ekspresji i produkcji rekombinantowego białka BChE lub ChE o pełnej długości oraz wariantów delecyjnych i/lub mutagenizowanych BChE lub ChE, pochodzących z organizmów innych niż koń w mikroorganizmie Leishmania tarantolae.

Protozoan Leishmania tarentolae, pierwotnie izolowany z jelita gekona Tarentola mauritanica jest niechorobotwórczy dla człowieka (Biosafety level 1), pozwalając na bezpieczną hodowlę w warunkach laboratoryjnych. Na bazie modyfikowanego genetycznie protozoana Leishmania tarentolae został opracowany komercyjny zestaw do klonowania i ekspresji białek - LEXSY, firmy Jena Bioscience GmbH (Niemcy) i został on zastosowany w przedmiotowym wynalazku. Istotna z punktu widzenia zastosowania do klonowania i ekspresji eukariotycznych białek jest właściwość posiadania zbliżonych do istniejących w komórkach ssaczych, skomplikowanych mechanizmów zwijania i modyfikacji potranslacyjnej białek. Poziom glikozylacji i sposób rozgałęzienia łańcuchów wielocukrowych różni się od bakteryjnego (zasadniczo brak), drożdżowego (częsta hyperglikozylacja) czy systemy baculowirusowego (często niepełna glikozylacja), natomiast zbliżony jest do typu ssaczego. Obecność glikozylacji i jej odpowiedni sposób są niezbędne do prawidłowego fałdowania białek i ich aktywności enzymatycznych. Jakkolwiek Leishmania tarentolae charakteryzuje się znacznie dłuższym okresem cyklu doświadczalnego niż eksperymenty klonowania i ekspresji białek w bakteriach i drożdżach, z powodu znacznie dłuższego od bakterii czasu trwania jednej generacji - ok. 4 godzin, niedogodność ta jest rekompensowana wysokim poziomem ekspresji białka, wg danych literaturowych przekraczającym 300 g/L hodowli, łatwością jego sekrecji do pożywki, a tym samym znakomicie udogodnioną procedurą izolowania rekombinantowego białka oraz jego właściwym sfałdowaniem do formy aktywnej biologicznie i wysoką rozpuszczalnością. W wynalazku użyto indukowalny wariant systemu LEXSinduce3, szczep Leishmania tarentolae (LEXSY host T7-TR), który cechuje indukowalny system nadprodukcji klonowanego białka oparty na hybrydowym promotorze bakteriofaga T7 i sprzężonym z nim operatorze, pochodzącym z rejonu regulatorowego genu kodującego represor, kontrolujący oporność na tetracyklinę. Poziom biosyntezy rekombinantowego białka sklonowanego w w/w układzie jest ściśle kontrolowany poprzez dobranie odpowiedniego stężenia tetracykliny. Tak precyzyjna możliwość dobrania poziomu nadprodukcji białek jest szczególnie istotna w przypadku ekspresji białek toksycznych dla rekombinantowego gospodarza. Leishmania tarentolae T7-TR posiada modyfikację chromosomu, polegającą na zintegrowaniu genów kodujących T7 RNA polimerazę, specyficzną wobec promotora T7 oraz gen kodujący tetracyklinowy represor transkrypcji w rejonie genu ssu, kodującego mniejszą podjednostkę rybosomalnego RNA. W tej lokalizacji chromosomalnej zachodzi konstytutywna ekspresja obu genów, za pośrednictwem RNA polime

PL 240 561 B1 razy I Leishmania tarentolae. Stabilność modyfikacji genetycznej jest utrzymywana poprzez wbudowanie kasety oporności na antybiotyki higromycynę i nourseotricinę w zbliżonej lokalizacji chromosomalnej Leishmania tarentolae T7-TR. Poza wyspecjalizowanym gospodarzem, do klonowania i ekspresji zastosowano wektor wahadłowy pLEXSY-blecherry3, będący częścią w/w zestawu, zdolny do namnażania w bakterii Escherichia coli, oferujący tym samym możliwość wygodnego przygotowywania konstruktu genetycznego oraz zdolny do integracji chromosomalnej do Leishmania tarentolae T7-TR. Do wektora tego klonowany został fragment DNA, kodujący BChE w taki sposób, że znajdował się on w odpowiedniej orientacji i ramie odczytu w stosunku do promotora T7 i sygnałów startu translacji. Za sklonowanym genem kodującym BChE znajdował się odpowiedniej orientacji i opatrzony sygnałami startu translacji gen, pochodzący z użytego wektora i kodujący białko reporterowe blecherry, którego ekspresję można precyzyjnie monitorować spektrofotometrycznie. Poziom biosyntezy białka blecherry w tym układzie jest skorelowany z poziomem biosyntezy klonowanego i eksprymowanego genu białka BChE w Leishmania tarentolae T7-TR. Wykonanie ekspresyjnego konstruktu genetycznego wykonano w Escherichia coli. W kolejnym etapie wektor zlinearyzowano podwójnym cięciem enzymem restrykcyjnym Swal, a następnie wprowadzono do komórek Leishmania tarentolae T7-TR, gdzie podlegał on integracji chromosomalnej w rejonie bliskim genu ssu. Integracja chromosomalna jest stabilna, dodatkowo podlega selekcji poprzez gen kodujący oporność na antybiotyk bleomycynę, zlokalizowany w zintegrowanym wektorze.

P r z y k ł a d 2. Projekt syntetycznego genu, kodującego skróconą wersję końskiej BChE, pozbawioną domeny tetrameryzacyjnej.

W oparciu o sekwencje cDNA, dostępne w publicznych bazach danych (Equus caballus BChE, cDNA, NCBI Reference Sequence: NM_001081850.1), zaprojektowano całkowicie syntetyczny gen, kodujący pełnej długości holoenzym BChE. Sekwencja nukleotydowa na poziomie DNA różniła się istotnie od naturalnej sekwencji nukleotydowej genu końskiej BChE, gdyż nie zawierała intronów, zawierała optymalizacje trzeciorzędowych struktur mRNA, odmienna też była kompozycja kodonów, jednak kodowany był polipeptyd o identycznej sekwencji aminokwasowej jak naturalny enzym - końska BChE, której metoda ekspresji w aktywnej enzymatycznie formie jest głównym aspektem wynalazku. Przedstawiony powyżej uniwersalny schemat został zastosowany do klonowania molekularnego i ekspresji genetycznej wariantów genu kodującego BChE: wersji rekombinantowego białka BChE końskiej o pełnej długości oraz wariantu skróconego, w których usunięto części sekwencji, nie istotne dla aktywności enzymatycznej. Korzystnie, jest to wersja, w której celem poprawienia poziomu biosyntezy, sekrecji i rozpuszczalności białka rekombinantowego. W tym celu usunięto N-terminalną aminokwasową sekwencję sygnałową do sekrecji zewnątrzkomórkowej, która jest mniej wydajna w kierowaniu sekrecji zewnątrzkomórkowej w Leishmania tarentolae oraz C-terminalną domenę tetrameryzacyjną, istotną dla funkcji in vivo u konia, natomiast nieistotną dla aktywności enzymatycznej białka na potrzeby zastosowań w biotechnologii. W przykładzie realizacji zaprezentowanej na Fig. 1 przedstawiono mapę pełnej długości syntetycznego genu o długości 1806 par zasad, kodującego rekombinantową końską BChE o sekwencji aminokwasowej zawierającej 602 reszty aminokwasowe, tworzące białko o masie cząsteczkowej 68,83 kDa odpowiadające sekwencji, kodowanej przez końskie cDNA, z zaznaczonymi elementami funkcjonalnymi: końska sekwencja sygnałowa (signal peptide, niebieska strzałka), punkty glikozylacji (Glic 1-8, pomarańczowe trójkąty), rejon mostków dwusiarczkowych (Disulfide 1-3, pomarańczowe nawiasy), reszty aminokwasowe centrum aktywnego (Active site 1-3, pomarańczowe pionowe prostokąty), domenę tetrameryzacyjną (Tetramerization domain, pomarańczowy poziomy prostokąt). W przykładzie realizacji zaprezentowanej na Fig. 2, przedstawiono sekwencję aminokwasową rekombinantowego bioaktywnego fragmentu genu BChE, gdzie końską sekwencję sygnału sekrecji zastąpiono sekwencją aminokwasową sygnału sekrecyjnego (SP) Leishmania (23 reszty aminokwasowe, kodowane przez 69 pary zasad, niebieska czcionka), dodatkowe 2 reszty aminokwasowe Gly-Ala, kodowane przez 6 par zasad, których dodanie wynika z konstrukcji wektora pLEXSY-blecherry 3 (pomarańczowa czcionka), sekwencja aminokwasowa kodowana przez Otwartą Ramę Odczytu fragmentu BChE, pozbawionego C-terminalnej 45-cio aminokwasowej domeny tetrameryzacyjnej (529 reszt aminokwasowych, kodowanych przez 1587 par zasad, czarna czcionka), dodatkowe 4 reszty aminokwasowe Leu-Lys-Gly-Thr, kodowane przez 12 par zasad, których dodanie wynika z konstrukcji wektora pLEXSY-blecherry 3 (czerwona czcionka), znacznik 6-ciu reszt His do izolowania rekombinantowego białka metodą chromatografii metalopowinowactwa, kodowany przez 18 para zasad (czerwona czcionka). Sumarycznie, skonstruowana fuzyjna Otwarta Rama Odczytu koduje 564 reszt aminokwasowych, tworzących białko fuzyjne SP-BChE-His o masie cząsteczkowej 63,66 kDa. W trakcie procesu dojrzewania i sekrecji białka do

PL 240 561 B1 pożywki odcięta zostaje sygnałowa sekwencja aminokwasowa do sekrecji zewnątrzkomórkowej, w wyniku czego powstaje skrócone białko fuzyjne GA-BChE-His o długości 541 reszt aminokwasowych i masie cząsteczkowej 61,39 kDa. Sekwencję aminokwasową, tworzącą białko SP-BChE-His przedstawia SEKWENCJA 1; sekwencję aminokwasową, kodującą białko GA-BChE-His przedstawia SEKWENCJA 2. Sekwencję nukleotydową Otwartej Ramy Odczytu fragmentu BChE, pozbawionej odcinak DNA kodującego N-terminalną końską sekwencję sekrecyjną oraz C-terminalną 45-cio aminokwasową domenę tetrameryzacyjną o długości 1587 par zasad, w formie jednoniciowej, przedstawia SEKWENCJA 3.

P r z y k ł a d 3. Projekt naturalnego i syntetycznego genu, kodującego holoenzym BChE, zawierający domenę tetrameryzacyjną.

W przykładzie realizacji zaprezentowanej na Fig. 3, przedstawiono sekwencję aminokwasową rekombinantowego bioaktywnego holoenzymu białka BChE, gdzie zachowano końską sekwencję sygnału sekrecji (28 reszty aminokwasowe, kodowane przez 84 pary zasad, niebieska czcionka), poprzedzoną dodatkowymi 2 resztami aminokwasowymi Met-Ala, kodowanymi przez 6 par zasad, których dodanie wynika z konstrukcji wektora pLEXSY-blecherry 3 (pomarańczowa czcionka), sekwencja nukleotydowa tworząca Otwartą Ramę Odczytu, kodującą dojrzały holoenzym BChE (574 reszt aminokwasowych, kodowanych przez 1722 par zasad, czarna czcionka), dodatkowe 4 reszty aminokwasowe Leu-Lys-Gly-Thr, kodowane przez 12 par zasad, których dodanie wynika z konstrukcji wektora pLEXSYblecherry 3 (czerwona czcionka), znacznik 6-ciu reszt His do izolowania rekombinantowego białka metodą chromatografii metalopowinowactwa, kodowany przez 18 par zasad (czerwona czcionka). Sumarycznie, skonstruowane fuzyjne Otwarte Ramy Odczytu składają się z 1842 par zasad, kodujących 614 reszt aminokwasowych, tworzących białka fuzyjne SP-BChE-HorseHis (uzyskane na bazie cDNA) oraz SP-BChE-synt-His (na bazie syntetycznego genu) o masach cząsteczkowych 70,66 kDa. W trakcie procesu dojrzewania i sekrecji białek do pożywki odcięta zostaje sygnałowa sekwencja aminokwasowa, w wyniku czego powstają skrócone białka fuzyjne BChE-HorseHis oraz BChE-synt-His o długościach 584 reszt aminokwasowych i masach cząsteczkowych 67,15 kDa. Sekwencję aminokwasową, tworzącą białka SP-BChE-HorseHis oraz SP-BChE-syntHis, przedstawia SEKWENCJA 4; sekwencję aminokwasową, tworzącą dojrzałe białka BChE-HorseHis oraz BChE-syntHis, przedstawia SEKWENCJA 5; sekwencję nukleotydową produktu PCR, w formie jednoniciowej, kodującego białko SP-BChE-HorseHis (bez elementów sekwencji pochodzących z wektora pLEXSY I-blecherry3), przedstawia SEKWENCJA 6; sekwencję nukleotydową produktu PCR, w formie jednoniciowej, kodującego białko SP-BChE-syntHis (bez elementów sekwencji pochodzących z wektora pLEXSY I-blecherry3), przedstawia SEKWENCJA 7.

P r z y k ł a d 4. Konstrukcja i klonowanie molekularne skróconej wersji rekombinantowego białka BChE końskiej.

W oparciu o sekwencję nukleotydową syntetycznego genu, kodującego dojrzałą (pozbawioną intronów) wersję genu, kodującego końską BChE, wskazanej w przykładowej realizacji w Przykładach 1 i 2, wykonano reakcję powielania DNA za pomocą techniki PCR. Skrócony fragment genu, kodującego BChE, zaprezentowanej na Fig. 1 i Fig. 2, powielono przy zastosowaniu starterów:

5'-ATAGTCGACGCTGGCGCCGAAGAAGACATCATCATCACCACC-3’ oraz 5'-ATTCTTAAGAACTTTCGGGAAGAACAGGGTCCAGAAACGG-3’.

Na 5' końcach starterów wstawiono sekwencje nukleotydowe (podkreślone), przecinane przez endonukleazy restrykcyjne SalI i MspCl. Powstający produkt PCR o długości 1614 par zasad (przedstawiony w formie jednoniciowej jako SEKWENCJA 8) zawiera skrócony gen BChE, który po wklonowaniu do wektora pLEXSY I-blecherry3, koduje gen fuzyjny, opatrzony na końcu 5’ sekwencją nukleotydową, kodującą sygnał sekrecyjny Leishmania - Met-Ala-Ser-Arg-Leu-Val-Arg-Val-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Leu-Val-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Ala oraz dwie dodatkowe reszty aminokwasowe Gly-Ala, a na końcu 3’ opatrzony jest sekwencjami, kodującymi 4 dodatkowe reszty aminokwasowe Lue-Lys-Gly-Thr oraz znacznik 6-ciu reszt His w miejsce sekwencji nukleotydowej, kodującej domenę tetrameryzacyjną BChE. Sumarycznie zaprojektowana Otwarta Rama Odczytu koduje 564 reszty aminokwasowe. Uzyskany produkt powielania PCR izolowano przy użyciu zestawu mini kolumienek krzemionkowych do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych (Roche, Szwajcaria) i poddano trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi SalI i MspCl. Wektor pLEXSY I-blecherry3 również poddano trawieniu SalI i MspCl. Uzyskane produkty trawienia poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w 1% żelu agarozowym, z którego wycięto liniowy fragment wektora pLEXSY I-blecherry3, zawierający kasetę ekspresyjną oraz strawiony produkt PCR. Fragmenty DNA oczyszczano przy użyciu zestawu do izolowania DNA z żelu agarozowego (Roche, Szwajcaria). Po oczyszczeniu, liniowy wektor pLEXSY I-blecherry3 i traPL 240 561 B1 wiony produkt PCR poddano ligacji z zastosowaniem ligazy DNA bakteriofaga T4 (New England Biolabs, USA), zachowując ciągłość Otwartej Ramy Odczytu ze znacznikiem 6-ciu reszt histydyny, wbudowanym na C-końcu polipeptydu. Powstały plazmid pLEX-BCHE-ST o długości 8807 par zasad, ilustruje Fig. 4, oznaczając: promotor bakteriofaga T7, kontrolujący biosyntezę BChE (czerwona, łamana strzałka / T7 promoter), sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez wyselekcjonowane endonukleazy restrykcyjne (SalI, Aflll, Swal), skrócony gen kodujący fragment BChE (BChE z SP (lexsy) -tetra), znacznik 6-ciu reszt His (His tag), gen reporterowi blecherry (blecherry), sekwencje nukleotydowe rejonu genu ssu, kodującego mniejszą podjednostkę rybosomalnego RNA (5’ odc i 3’ odc), gen oporności na ampicylinę (Amp R). Otrzymany w wyniku ligacji wektor poddano analizie restrykcyjnej, a klonowany fragment genu BChE sekwencjonowano w celu potwierdzenia uzyskania zaprojektowanego konstruktu wektora. Sekwencję nukleotydową plazmidu pLEX-BCHE-ST w formie jednoniciowej o długości 8807 par zasad przedstawia SEKWENCJA 9.

P r z y k ł a d 5. Konstrukcja i klonowanie molekularne holoenzymu naturalnego i syntetycznego genu, kodującego holoenzym BChE końską, zawierający domenę tetrameryzacyjną.

W oparciu o sekwencję nukleotydową syntetycznego genu oraz sekwencję nukleotydową naturalnego cDNA, kodujących dojrzałe (pozbawione intronów) wersje genu, kodującego końską BChE, wskazaną w przykładowej realizacji w Przykładzie 1, 2 i 3, wykonano reakcję powielania DNA za pomocą techniki PCR pełnej długości genów - naturalnego oraz syntetycznego, kodujących BChE, zaprezentowanych na Fig. 1, 3 i 5. Gen syntetyczny powielono przy zastosowaniu starterów: 5'-TAGCCATGGCCATGCAGTCCTGGGGTACCATC -3’ i 5'-TATTCTTAAGGAAGTCGGAGCAGGATTC-3’.

Gen uzyskany na bazie cDNA powielono przy zastosowaniu starterów: 5'-TAGCCATGGCCATGCAGAGCTGGGGTACAATC-3’ i 5'-ACTCTTAAGAAAATCTGAACAGCTTTCTTTCTTGCTAGTG-3 ’.

Na 5' końcach starterów wstawiono sekwencje nukleotydowe (podkreślone), przecinane przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i MspCl. Powstające produkty PCR o długości 1826 par zasad (na matrycy cDNA) i 1827 par zasad (na matrycy syntetycznego genu BChE) zawiera kompletną Otwartą Ramę Odczytu pełnej długości genu BChE, który po wklonowaniu do wektora pLEXSY I-blecherry3, koduje gen fuzyjny, opatrzony na końcu 5’ sekwencją nukleotydową, kodującą sygnał sekrecyjny Leishmania Met-Ala-Ser-Arg-Leu-Val-Arg-Val-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Leu-Val-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Ala oraz dwie dodatkowe reszty aminokwasowe Gly-Ala, a na końcu 3’ opatrzony sekwencjami, kodującymi 4 dodatkowe reszty aminokwasowe Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznik 6-ciu reszt His. Uzyskane produkty powielania PCR izolowano przy użyciu zestawu mini kolumienek krzemionkowych do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych (Roche, Szwajcaria) i poddano trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi SalI i MspCl. Wektor pLEXSY I-blecherry3 również poddano trawieniu SalI i MspCl. Uzyskane produkty trawienia poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w 1% żelu agarozowym, z którego wycięto liniowy fragment wektora pLEXSY I-blecherry3, zawierający kasetę ekspresyjną oraz strawiony produkt PCR. Fragmenty DNA oczyszczano przy użyciu zestawu do izolowania DNA z żelu agarozowego (Roche, Szwajcaria). Po oczyszczeniu, liniowy wektor pLEXSY I-blecherry3 i trawiony produkt PCR poddano ligacji z zastosowaniem ligazy DNA bakteriofaga T4 (New England Biolabs USA). Powstały konstrukt, zachowuje ciągłość Otwartej Ramy Odczytu BChE ze znacznikiem 6-ciu reszt His, wbudowanym na C-końcu polipeptydu. Powstałe plazmidy pLEX-BChEHor (otrzymany na bazie cDNA) oraz pLEXBChEEco (na bazie genu syntetycznego), zawierające dwa warianty pełnej długości genów, kodujących holoenzymy BChE ilustruje Fig. 5, gdzie oznaczono: promotor faga T7, kontrolujący holoenzymy BChE (SP-BCHE horseHis lub SP-BCHE-syntHis), znacznik 6-ciu reszt His (His tag), gen reporterowi blecherry (blecherry), sekwencje nukleotydowe rejonu genu ssu, kodującego mniejszą podjednostkę rybosomalnego RNA (5’ odc i 3’ odc), gen oporności na ampicylinę (Amp R). Otrzymany w wyniku ligacji wektor poddano analizie restrykcyjnej, a klonowane geny BChE sekwencjonowano w celu potwierdzenia uzyskania zaprojektowanych konstruktów wektorów. Sekwencję nukleotydową plazmidu pLEXSYBChEHor o długości 8957 par zasad, w formie jednoniciowej, przedstawia SEKWENCJA 10; sekwencję nukleotydową plazmidu pLEXSY-BChEEco o długości 8957 par zasad, w formie jednoniciowej, przedstawia SEKWENCJA 11.

P r z y k ł a d 6. Transformacja Leishmania tarentolae T7-TR skonstruowanymi wektorami, niosącymi konstrukty ekspresyjne, kodujące holoenzymy i skrócony wariant genów BChE.

W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 4 i Fig. 5 skonstruowane wektory, niosące skrócony wariant BChE oraz holoenzymy BChE, wskazane w przykładowej realizacji w Przykładach 1,

PL 240 561 B1

2, 3, 4, 5 poddano transformacji za pomocą metody elektroporacji. W tym celu wskazane wektory DNA przecięto endonukleazą restrykcyjną Swal w celu uzyskania form liniowych. Produkty trawienia poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym, a następnie wyizolowano z żelu fragmenty zawierające moduły ekspresyjne genów BChE oraz sekwencje nukleotydowe rejonu genu ssu. Fragmenty te zostały wprowadzone do komórek Leishmania tarentolae T7-TR pod wpływem impulsu prądu elektrycznego o napięciu 450 V trwającego 5,4 ms przy zastosowanej pojemności kondensatora 450 °F. Transformowane komórki Leishmania tarentolae T7-TR inkubowano przez 20 godzin w temperaturze 26°C w pożywce BHI, a następnie wysiewano na szalki Petriego, zawierające zestalone agarem podłoże BHI, uzupełnione antybiotykiem selekcyjnym - bleomycyną. Inkubację prowadzono przez 8 dni w temperaturze 26°C. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 6 po 8-miu dniach na płytce obserwowano kolonie Leishmania tarentolae T7-TR transformowane wektorami wskazanymi w Przykładach 1,2, 3, 4. W celu zweryfikowania ekspresji klonowanych wariantów BChE monitorowano poziom sprzężonej ekspresji genu reporterowego blecherry. Wykonano odcisk kolonii z szalki Petriego, zawierającej kolonie transformowanego Leishmania tarentolae T7-TR na membranie nitrocelulozowej i membranę umieszczono na szalce Petriego, zawierającej zestalone agarem podłoże BHI, uzupełnione bleomycyną i inducerem transkrypcji hybrydowego promotora T7 - tetracykliną w stężeniu 100 μg/ml. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 7 po 4 dniach na płytce obserwowano kolonie Leishmania tarentolae T7-TR transformowane wektorami wskazanymi w Przykładach 4 i 5, które zabarwiły się na kolor różowy, wskazujący na ekspresję sprzężonego z genami BChE genu reporterowego blecherry. Ze względu na możliwość integracji do chromosomu Leishmania tarentolae T7-TR różnych ilości kopii modułu ekspresyjnego wektorów wskazanych w Przykładach 4 i 5, a tym samym spodziewanego różnego poziomu ekspresji blecherry oraz BChE do dalszej analizy wybrano kolonie wykazujące najciemniejszy różowy odcień, skorelowany z poziomem indukcji transkrypcji z hybrydowego promotora T7 i biosyntezy blecherry.

P r z y k ł a d 7. Nadprodukcja rekombinantowych BChE w komórkach Leishmania tarentolae.

W przykładowej realizacji zaprezentowanej w Przykładzie 6 w wyniku transformacji uzyskano kilkadziesiąt klonów różniących się poziomem ekspresji genu reporterowego blecherry, jako efekt integracji różnej ilości kopii kasety ekspresyjnej, zawierającej gen, kodujący skróconą wersję BChE do genomu klonów Leishmania tarentolae T7-TR. Wybrany klon o silnej, ocenionej wizualnie ekspresji blecherry użyto do zaszczepienia 10 ml hodowli płynnej w pożywce BHI, uzupełnionej bleomycyną i hodowano wytrząsając (140 obr/min) przez 72 godziny w temperaturze 26°C. Uzyskaną hodowlę użyto do zaszczepienia 2 kultur: 100 ml ekspresyjnej w pożywce BHI, uzupełnionej bleomycyną i tetracykliną (100 μg/ml) oraz 10 ml kultury kontrolnej w pożywce BHI, uzupełnionej bleomycyną, po czym hodowano wytrząsając (140 obr/min) przez 72 godziny w temperaturze 26°C. W odstępach 24 godzinnych pobierano próbki 100 μl każdej hodowli, nanoszono na płytkę 96-dołkową, przeprowadzając w czytniku płytek TECAN Infinity M200Pro pomiar gęstości optycznej OD przy długości fali 600 nm oraz fluorescencji białka blecherry przy długości fali wzbudzenia 590 nm i długości fali emisji 620 nm. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 8, 9 i 10 wzrost poziomu ekspresji blecherry był skorelowany ze wzrostem OD hodowli. Powyżej czasu hodowli 48 godzin poziom OD600 i ekspresji blecherry nie wzrastał znacząco, stąd hodowle zatrzymywano po 72 godzinach i komórki rekombinantowych Leishmania tarentolae T7-TR wirowano przy 4000 g przez 20 min. Eksprymowane BChE jako białka wydzielane na zewnątrz komórki, pozostawały w pożywce. Odwirowane komórki zawierały białko reporterowe blecherry ze względu na jego cytoplazmatyczną lokalizację, tym samym eksprymowane białka blecherry i BChE zostały rozdzielone. Fig. 8 ukazuje zależność OD600 od czasu hodowli po indukcji, Fig. 9 ukazuje zależność fluorescencji blecherry od czasu hodowli po indukcji, Fig. 10 ukazuje odwirowane komórki po 72 godzinach hodowli po indukcji, gdzie hodowla indukowana tetracykliną wykazuje wyraźne różowe zabarwienie (z prawej strony zdjęcia) w porównaniu do hodowli kontrolnej, nieindukowanej (z lewej strony zdjęcia).

P r z y k ł a d 8. Izolowanie rekombinantowych białek BChE.

W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 11, 12 i 13 zaprezentowano wyniki procedury izolowania rekombinantowej wersji skróconej BChE, wskazanej w Przykładach 1, 2, 3, 4, 6, 7. Identyczną procedurę stosowano dla wersji holoenzymu BChE, wskazanej w Przykładach 1, 3, 5, 6, 7. W przykładowej realizacji wykonano preparatykę w skali laboratoryjnej ze 100 ml supernatantu z indukowanej tetracykliną hodowli komórek Leishmania tarentolae T7-TR, transformowanych kasetami ekspresyjnymi BChE. Procedura jest bezpośrednio skalowalna do procesu przemysłowego, po zastosowa

PL 240 561 B1 niu bioreaktorów, wirówek i układów chromatograficznych o odpowiedniej, wymaganej skalowaniem objętości. 100 ml supernatantu odwirowanej hodowli przefiltrowano przez filtr mikrobiologiczny o średnicy porów 0,22 μm, celem usunięcia pozostałości komórek Leishmania tarentolae T7-TR i ich fragmentów. Do przesączu, schłodzonego do 4°C dodano krystalicznego siarczanu amonowego do uzyskania nasyconego roztworu, precypitując białka zawarte w przesączu. Zawiesinę wirowano przy 20000 g przez 30 min w temperaturze 4°C, supernatant odrzucono, a osad sprecypitowanych białek rozpuszczono w 10 ml buforu A do chromatografii metalopowinowactwa: 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCI, 10 mM imidiazol, pH 8.0. Rozpuszczone w buforze białka naniesiono na 4 ml złoże, zawierającego chelatowane jony niklu (II) (Sigma, USA). Kolumnę, umocowaną w systemie chromatograficznym Hitachi-Merck, płukano 20 ml buforu A, następnie płukano 20 ml buforu B do chromatografii metalopowinowactwa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidiazol, pH 8.0.), zawierającym zwiększone stężenie eluenta - imidiazolu, celem elucji słabo związanych białek zanieczyszczających, nie opatrzonych znacznikiem 6-ciu reszt His. Poziom wypłukiwania zanieczyszczeń oraz następnej elucji BChE monitorowano zainstalowanym w systemie chromatograficznym on-line monitorem UV przy długości fali 280 nm. Po osiągnięciu niskiego i stałego poziomu absorbancji przy 280 nm, związane do złoża chromatograficznego rekombinantowe białko BChE eluowano buforem C: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidiazol, pH 8.0. Zbierano frakcje o objętości 1 ml i analizowano za pomocą elekroforezy denaturującej SDS-PAGE w 8% żelu poliakrylamidowym. Żel wybarwiono Commassie Brilliant Blue, obserwując we frakcjach elucji (ścieżki 2-5) zabarwione prążki białkowe odpowiadające wielkością oczekiwanej dla skrócone wersji rekombinantowej BChE, jak wskazano w Przykładach 2, 4, 6 i 7. Na elektroforegramie w Fig. 11 ścieżka M zawiera standardy masy cząsteczkowej białek Perfect Protein Ladder (EURx, Poland), ścieżka 1, wyciek z kolumny podczas płukania buforem B. Na Fig. 11 wskazano analizę frakcji z elucji rekombinantowej BChE z złoża chromatograficznego, zawierającego chelatowane jony niklu (II). Ewidentnie obserwowany jest pojedynczy prążek białkowy, dominujący elektroforegram w ścieżkach 2 i 3, zawierający wysoce oczyszczoną, homogenną, rekombinantową BChE. Analogiczne porównawcze eksperymenty wykonano z użyciem klonów, zawierających pełnej długości geny BChE, zawierające naturalne końskie sygnały sekrecyjne wskazane w Przykładzie 3 i na Fig. 3. Uzyskane poziomy ekspresji pozwalały na wykrycie aktywności enzymatycznej BChE testem funkcjonalnym Ellmana, był jednak kilkudziesięciokrotnie niższe w porównaniu do ekspresji skróconej wersji BChE, opatrzonej sygnałem sekrecyjnym Leishmania, co wskazuje na istotną rolę użycia sygnału sekrecyjnego Leishmania w prezentowanych wynalazku. Fig. 12 obrazuje porównanie czystość uzyskanego preparatu BChE do czystości dostępnych komercyjnie preparatów BChE: w ścieżce M uwidoczniono standardy masy cząsteczkowej białek Perfect Protein Ladder, w ścieżce 1 uwidoczniono preparat BChE firmy Sigma-Aldrich (USA), w ścieżce 2 uwidoczniono preparat BChE firmy Biomed Lublin (Polska). Ewidentna jest bezprecedensowa czystość preparatu rekombinantowej BChE, uzyskanej w przykładowej realizacji w Przykładzie 8. Celem ostatecznej walidacji identyczności otrzymanego preparatu białkowego z zaprojektowaną, zsyntetyzowaną, sklonowaną i eksprymowaną w Przykładach 2, 4, 6 i 7 rekombinantową BChE, przeprowadzono analizę Western Blotting, elektrotransferując białka z 8% żelu SDS-PAGE na membranę PVDF przez 60 min przy natężeniu prądu 100 mA w buforze do transferu: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyna, 10% metanol, 0,1% SDS. Następnie membranę nitrocelulozową płukano w buforze TBS (50 mM Tis pH 7,5, 0,5 M NaCl) i blokowano przez 16 godzin w buforze TBS z dodatkiem 3% odtłuszczonego mleka w temperaturze 4°C. Następnie membranę nitrocelulozową inkubowano z komercyjnymi króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi (Santa Cruz Technology, USA) stosując rozcieńczenie 1:500, przez 1 godzinę i płukano trzykrotnie w buforze TBS. Immunodetekcję związanych pierwszorzędowych przeciwciał wykonano stosując inkubację przez 1 godzinę z II rzędowymi anty-króliczymi przeciwciałami (rozcieńczenie 1:2000) sprzężonymi z alkaliczną fosfatazą, a następnie przeprowadzono reakcję barwną za pomocą roztworu substratów: soli tetrazolowej nitrobłękitu (NBT) oraz 5-bromo 4-chloro 3-indylo fosforanu (BCIP), dającymi ciemnoniebieską barwę w miejscu wiązania sprzężonych przeciwciał. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 13 widoczny jest specyficzny sygnał immunodetekcji w oczekiwanej pozycji migracji prążka rekombinantowego, fuzyjnego białka GA-BChE-His (oznaczonej czarną strzałką) w 8% żelu SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 9. Funkcjonalne testy enzymologiczne rekombinantowych BChE.

Rekombinantowy enzym GA-BChE-His, otrzymany w przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 i wskazanej w Przykładach 2, 4, 6, 7 i 8 poddano funkcjonalnym testom enzymatycznym, ukazano funkcjonalne testy enzymatyczne rekombinantowej BChE wskazanej w Przykładach 1,2, 3, 4, 6, 7, 8. Uzyskany preparat rekombinantowej skróconej wersji BChE o stężeniu

PL 240 561 B1 mg/ml poddano analizie aktywności enzymatycznej metodą Ellmana. Metoda opiera się na pomiarze barwnego produktu reakcji, który powstaje w wyniku hydrolizy jodku S-butyrylotiocholiny przez BChE do tiocholiny, która z kolei reaguje z DTNB (kwas 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoesowy), dając barwny produkt. Maximum absorbancji znajduje się przy długości fali 412 nm. Uwzględniając molowy współczynnik absorbancji barwnego produktu, którego stężenie jest równe stężeniu rozłożonego przez BChE substratu, można ilościowo ustalić aktywność enzymatyczną BChE. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 14, 15, 16 i 17 pomiary aktywności białka BChE prowadzono na płytkach 96-dołkowych w czytniku płytek TECAN Infinity M200Pro, mierząc absorbancję przy 412 nm co 1 min. Wyniki dla preparatu białka GA-BChE-His, a także dla standardu z zestawu firmy Arbor Assay (USA) wskazują na aktywność enzymatyczną oczyszczonego preparatu rekombinantowego białka GA-BChE-His na wysokim poziomie, wynoszącym 270 U/mg. Ponadto, wykonano szczegółową charakterystykę enzymatyczną, wykreślając krzywą Michaelisa-Menten, uwidocznioną na Fig. 15, na podstawie której ustalono stałą Michaelisa (Km) wynoszącą 20 μM dla jodku S-butyrylotiocholiny. Reakcje enzymatyczne przeprowadzano w temperaturze 25°C w 100 mM buforze fosforanowym o pH 7,4. Znakomita większość specyficznych inhibitorów opisanych i używanych w pracach nad charakterystyką aktywności enzymatycznej ChE i BChE jest silnie toksyczna, niektóre z nich są zaliczane do BST, wymagającymi pracy w atestowanych laboratoriach. Zatem celem weryfikacji specyficzności substratowej uzyskanej rekombinantowej BChE zbadano wpływ opisanego w literaturze inhibitora BChE, o relatywnie niskiej toksyczności - błękitu metylenowego. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 16 przeprowadzono pomiary aktywności BChE w obecności różnych stężeń błękitu metylenowego. Reakcja katalizowana przez BChE ulega inhibicji wraz ze wzrostem stężenia błękitu metylenowego. W każdym pomiarze użyto 10 ng oczyszczonego białka oraz błękit metylenowy w stężeniach 25 um, 12,5 mM, 6,25 mM, 2,5 mM, 0 mM. Uzyskane wyniki potwierdziły działanie inhibicyjne błękitu metylenowego, tym samym dodatkowo potwierdzając, że sklonowane i eksprymowane w Leishmania tarentolae T7-TR białko jest faktycznie funkcjonalnym enzymem GA-BChE-His, wykazującym aktywność opisanych w literaturze BChE. Enzymy ChE i BChE klonowane i eksprymowane w mikroorganizmie Leishmania tarantolae mogą znaleźć szereg obecnych i przyszłych zastosowań: jako antidotum przykładowo, ale nie wyłącznie, na ekspozycję na bojowe środki trujące, pestycydy, inne trucizny, jady węży, ryb, innych kręgowców, owadów, innych bezkręgowców, narkotyki, leki; jako leki lub substancje do testowania leków (np. inhibitorów BchE i ChE) przeznaczone do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, przykładowo, ale nie wyłącznie choroby Alzheimera, demencji, alkoholizmu, narkomanii, uszkodzeń pourazowych układu nerwowego; jako komponenty biosensorów wykrywających przykładowo, ale nie wyłącznie, BST, pestycydy, trucizny przemysłowe, narkotyki.

PL 240 561 Β1

Wykaz sekwencji

MASRLVRVLAAAMLVAAAVSVDAGAEEDIIITTKNGKVRGMNLPVLGGTVTAFLGIPY AQPPLGRLRFKKPQSLTKWSNIWNATKYANSCYQNTDQSFPGFLGSEMWNPNTELSED CLYLNVWIPAPKPKNATVMIWIYGGGFQTGTSSLPVYDGKFLARVERVIWSMNYRVG ALGFLALSENPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPRSVTLFGESAGAASVSLH LLSPRSQPLFTRAILQSGSSNAPWAVTSLYEARNRTLTLAKRMGCSRDNETEMTKCLR DKDPQEILLNEVFWPYDTLLSVNFGPTVDGDFLTDMPDTLL·QLGQFKRTQILVGVNK DEGTAFLVYGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPRVSEFGRESILFHYMDWLDDQR AENYREALDDWGDYNIICPALEFTKKFSELGNDAFFYYFEHRSTKLPWPEWMGVMHG YEIEFVFGLPLERRWYTKAEEILSRSIMKRWANFAKYGNPNGTQSNSTRWPVFKSTE QKYLTLNTESPKVYTKLRAQQCRFWTLFFPKVLKGTHHHHHH

Seq.1

GAEEDI11TTKNGKVRGMNLPVLGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQS LTKWSNIW NATKYANSCYQNTDQSFPGFLGSEMWNPNTELSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVMIWIY GGGFQTGTSSLPVYDGKFLARVERVIWSMNYRVGALGFLALSENPEAPGNMGLFDQQ LALQWVQKNIAAFGGNPRSVTLFGESAGAASVSLHLLSPRSQPLFTRAILQSGSSNAP WAVTSLYEARNRTLTLAKRMGCSRDNETEMIKCLRDKDPQEILLNEVFWPYDTLLSV NFGPTVDGDFLTDMPDTLLQLGQFKRTQILVGVNKDEGTAFLVYGAPGFSKDNNSIIT RKEFQEGMKTFFPRVSEFGRESILFHYMDWLDDQRAENYREALDDWGDYNIICPALE FTKKFSELGNDAFFYYFEHRSTKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRVNYTKAEEI LSRSIMKRWANFAKYGNPNGTQSNSTRWPVFKSTEQKYLTLNTESPKVYTKLRAQQCR FWTLFFPKVLKGTHHHHHH

Seq.2

GAAGAAGACATCATCATCACCACCAAAAACGGTAAAGTTCGTGGTATGAACCTGCCGG TTCTGGGTGGTACCGTTACCGCTTTCCTGGGTATCCCGTACGCTCAGCCGCCGCTGGG TCGTCTGCGTTTCAAAAAACCGCAGTCCCTGACCAAATGGTCCAACATCTGGAACGCT ACCAAATACGCTAACTCCTGCTACCAGAACACCGACCAGTCCTTCCCGGGTTTCCTGG GTTCCGAAATGTGGAACCCGAACACCGAACTGTCCGAAGACTGCCTGTACCTGAACGT TTGGATCCCGGCTCCGAAACCGAASAACGCTACCGTTATGATCTGGATCTACGGTGGT GGTTTCCAGACCGGTACCTCCTCCCTGCCGGTTTACGACGGTAAATTCCTGGCTCGTG TTGAACGTGTTATCGTTGTTTCCATGAACTACCGTGTTGGTGCTCTGGGTTTCCTGGC TCTGTCCGAAAACCCGGAAGCTCCGGGTAACATGGGTCTGTTCGACCAGCAGCTGGCT CTGCAGTGGGTTCAGAAAAACATCGCTGCTTTCGGTGGTAACCCGCGTTCCGTTACCC TGTTCGGTGAATCCGCTGGTGCTGCTTCCGTTTCCCTGCACCTGCTGTCCCCGCGTTC CCAGCCGCTGTTCACCCGTGCTATCCTGCAGTCCGGTTCCTCCAACGCTCCGTGGGCT GTTACCTCCCTGTACGAAGCTCGTAACCGTACCCTGACCCTGGCTAAACGTATGGGTT GCTCCCGTGACAACGAAACCGΑΑΆΤGATCAAATGCCTGCGTGACAAAGACCCGCAGGA AATCCTGCTGAACGAAGTTTTCGTTGTTCCGTACGACACCCTGCTGTCCGTTAACTTC GGTCCGACCGTTGACGGTGACTTCCTGACCGACATGCCGGACACCCTGCTGCAGCTGG GTCAGTTCAAACGTACCCAGATCCTGGTTGGTGTTAACAAAGACGAAGGTACCGCTTT CCTGGTTTACGGTGCTCCGGGTTTCTCCAZ\AGACAACAACTCCATCATCACCCGT7\AA GAATTCCAGGAAGGTCTGA2\AATCTTCTTCCCGCGTGTTTCCGAATTCGGTCGTGAAT CCATCCTGTTCCACTACATGGACTGGCTGGACGACCAGCGTGCTGAAAACTACCGTGA AGCTCTGGACGACGTTGTTGGTGACTACAACATCATCTGCCCGGCTCTGGAATTCACC AAAAAATTCTCCGAACTGGGTAACGACGCTTTCTTCTACTACTTCGAACACCGTTCCA

PL 240 561 Β1

CCAAACTGCCGTGGCCGGAATGGATGGGTGTTATGCACGGTTACGAAATCGAATTCGT TTTCGGTCTGCCGCTGGAACGTCGTGTTAACTACACCAAAGCTGAAGAAATCCTGTCC CGTTCCATCATGAAACGTTGGGCTAACTTCGCTAAATACGGTAACCCGAACGGTACCC AGTCCAACTCCACCCGTTGGCCGGTTTTCAAATCCACCGAACAGAAATACCTGACCCT GAACACCGAATCCCCGAAAGTTTACACCAAACTGCGTGCTCAGCAGTGCCGTTTCTGG ACCCTGTTCTTCCCGAAAGTT

Seq,3

MAMQSWGTIICIRILLRFLLLWVLIGNSHTEEDIIITTKNGKVRGMNLPVLGGTVTAF LGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSNIWNATKYANSCYQNTDQSFPGFLGSEMWNPNT ELSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVMIWIYGGGFQTGTSSLPVYDGKFLARVERVIWSM NYRVGALGFLALSENPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPRSVTLFGESAGAA SVSLHLLSPRSQPLFTRAILQSGSSNAPWAVTSLYEARNRTLTLAKRMGCSRDNETEM IKCLRDKDPQEIL·LNEVFWPYDTL·LSWFGPTVDGDFLTDMPDTL·L·QLGQFKRTQIL VGVNKDE GTAFLVYGAPG FS KDNNS11T RKE FQE GLKIFFPRVSE FGRE SIL FHYMDW LDDQRAENYREALDDWGDYNIICPALEFTKKFSELGNDAFFYYFEHRSTKLPWPEWM GVMHGYEIE FVFGL PLE RRVNY TKAEEIL S RSIMKRWANFAKYGNPNG T QSNS T RW PV FKSTEQKYLTLNTESPKVYTKLRAQQCRFWTLFFPKVLELTGNIDEAEREWKAGFHRW NNYMMDWKNQ FN DY T S KKES C S DFL KG T HHHHHH

Seq.4

EEDIIITTKNGKVRGMNLPVLGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSNIWNA TKYANSCYQNTDQSFPGFLGSEMWNPNTELSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVMIWIYGG GFQTGTSSLPVYDGKFIARVERVIWSMJNrrRVGALGFLALSENPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQKNIAAFGGNPRSVTLFGESAGAASVSLHLLSPRSQPLFTRAILQSGSSNAPWA YTSLYEARNRTLTLAKRMGCSRDNETEMIKCLRDKDPęEILLNEYFWPYDTLLSYNF GPTVDGDFLTDMPBTLLQLGQFKRTQILVGVNKDEGTAFLVYGAPGFSKDNNSIITRK EFQEGLKI FFPRVSEFGRESILFHYMDWLDDQRAENYREALDDWGDYNIICPALEFT KKFSELGNDAFFYYFEHRSTKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRVNYTKAEEILS RSIMKRWANFAKYGNPNGTQSNSTRWPVFKSTEQKYLTLNTESPKVYTKLRAQQCRFW T L F FP KVL E L T GNIDEAE RE W KAG FHRWNNYMMDWKNQ FNDYT S KKE Ξ C S D FLKG THH HHHH

Seq.5

TAGC CAT GGC CAT GCAGAGC T GGGGTACAATCATATGCAT T CGAAT T C T C T T GCGAT T TCTTCTGCTCT GGG TGC T TAT CGGGAAC T CACACACT GAAGAAGACATCATAAT TACA ACCAAGAACGGAAAAGTCAGAGGGATGAACTTGCCAGTTCTTGGTGGCACAGTAACAG CCTTTCTTGGGATTCCCTATGCACAGCCGCCTCTTGGTAGACTTCGATTCAAAAAGCC ACAATCCTTGACTAAGTGGTCCAATATTTGGAATGCCACAAAATATGCCAATTCTTGC TATCAGAACACAGATCAAAGTTTCCCAGGCTTCCTTGGATCAGAGATGTGGAACCCAA ACAC T GAAC T TAGT GAAGAC T G TT T ATAT CT GAAT GT GTGGAT TC CAGCACC TAAACC AAAAAATGCTACTGTAATGATATGGATCTATGGTGGTGGTTTTCAAACTGGGACATCA TCTTTGCCTGTTTATGATGGCAAGTTTCTGGCTCGGGTTGAAAGAGTTATTGTAGTTT CAATGAACTATAGAGTGGGTGCCCTAGGATTCTTAGCCTTATCAGAAAATCCTGAGGC ACCAGGGAACATGGGCTΤΆΤTTGATCAACAGTTGGCACTTCAGTGGGTCCAAAAAAAT

PL 240 561 Β1

ATAGCAGCCTTTGGTGGTAATCCTAGAAGTGTAACTCTCTTTGGAGAAAGTGCAGGAG CAGCTTCAGTTAGCCTTCATTTACTTTCTCCTAGAAGCCAGCCTTTGTTTACCAGAGC CATTCTGCAAAGTGGATCCTCTAATGCCCCTTGGGCAGTAACATCTCTGTATGAAGCT AGGAACAGAACATTGACCCTAGCTAAACGTATGGGTTGCTCTAGGGACAATGAGACTG AGAT GAT CAAAT GT CT T C GAGACAAAGAT C C CCAGGAAAT T C T TC T GAAT GAAGTAT T TGTTGTCCCCTATGATACTCTCTTGTCAGTAAACTTTGGTCCAACTGTGGATGGCGAT T T T C T CAC T GAC AT GC CAGAT ACAC T AC T C C AAC T T GGAC AGT TC AAAAGAACC CAG A TCTTGGTGGGTGTTAATAAAGATGAAGGGACAGCATTTTTAGTATATGGGGCTCCTGG T T T CAGCAAAGATAACAACAGTAT CATAACAAGAAAAGAAT T T CAG GAG G G T T TAAAA ATATTTTTTCCAAGAGTGAGTGAGTTTGGAAGAGAATCAATCCTTTTCCATTACATGG ACTGGTTAGATGATCAGAGAGCCGAAAACTACAGAGAGGCCTTGGATGATGTTGTTGG GGATTACAATATCATATGCCCTGCCTTGGAGTTCACCAAAAAGTTCTCAGAATTGGGA AATGATGCCTTTTTCTACTATTTTGAACACCGATCGACCAAACTTCCTTGGCCAGAAT GGATGGGAGTGATGCATGGTTACGAAATCGAATTTGTCTTTGGTTTACCTCTGGAAAG AAGAG T TAAT TACACAAAAGC T GAGGAAAT T T T GAGTAGAT C CAT TAT GAAACGC T GG GCAAATTTTGCAAAATATGGAAATCCAAATGGGACCCAGAGCAATAGCACAAGATGGC C T G T C T T C AAGAGC AC T GAAC AAAAATAT T T AACC T T GAAT AC AG AG T CAC C AAAAG T G T ACACCAAAC TAC GAG C T C AACAAT G T C GAT T C T GGAC AC TATTTTTTCC T AAAG TC TTGGAATTGACAGGAAATATTGATGAAGCAGAACGAGAATGGAAAGCAGGATTCCATC GCT GGAACAAT TACAT GAT GGAC T GGAAAAAT CAAT T T AAC GAT TACAC T AGCAAGAA AGAAAGC T GT TCAGAT T T TCT TAAGAGT

Seq.6

TAGCCATGGCCATGCAGTCCTGGGGTACCATCATCTGCATCCGTATCCTGCTGCGTTT CCTGCTGCTGTGGGTTCTGATCGGTAACTCCCACACCGAAGAAGACATCATCATCACC ACCAAAAACGGTAAAGTTCGTGGTATGAACCTGCCGGTTCTGGGTGGTACCGTTACCG CTTTCCTGGGTATCCCGTACGCTCAGCCGCCGCTGGGTCGTCTGCGTTTCAAAAAACC GCAGTCCCTGACCAAATGGTCCAACATCTGGAACGCTACCAAATACGCTAACTCCTGC TACCAGAACACCGACCAGTCCTTCCCGGGTTTCCTGGGTTCCGAAATGTGGAACCCGA ACACCGAACTGTCCGAAGACTGCCTGTACCTGAACGTTTGGATCCCGGCTCCGAAACC GAAAAACGCTACCGTTATGATCTGGATCTACGGTGGTGGTTTCCAGACCGGTACCTCC TCCCTGCCGGTTTACGACGGTAAATTCCTGGCTCGTGTTGAACGTGTTATCGTTGTTT CCATGAACTACCGTGTTGGTGCTCTGGGTTTCCTGGCTCTGTCCGAAAACCCGGAAGC TCCGGGTAACATGGGTCTGTTCGACCAGCAGCTGGCTCTGCAGTGGGTTCAGAAAAAC ATCGCTGCTTTCGGTGGTAACCCGCGTTCCGTTACCCTGTTCGGTGAATCCGCTGGTG CTGCTTCCGTTTCCCTGCACCTGCTGTCCCCGCGTTCCCAGCCGCTGTTCACCCGTGC TATCCTGCAGTCCGGTTCCTCCAACGCTCCGTGGGCTGTTACCTCCCTGTACGAAGCT CGTAACCGTACCCTGACCCTGGCTAAACGTATGGGTTGCTCCCGTGACAACGAAACCG AAATGATCAAATGCCTGCGTGACAAAGACCCGCAGGAAATCCTGCTGAACGAAGTTTT CGTTGTTCCGTACGACACCCTGCTGTCCGTTAACTTCGGTCCGACCGTTGACGGTGAC TTCCTGACCGACATGCCGGACACCCTGCTGCAGCTGGGTCAGTTCAAACGTACCCAGA TCCTGGTTGGTGTTAACAAAGACGAAGGTACCGCTTTCCTGGTTTACGGTGCTCCGGG TTTCTCCAAAGACAACAACTCCATCATCACCCGTAAAGAATTCCAGGAAGGTCTGAAA ATCTTCTTCCCGCGTGTTTCCGAATTCGGTCGTGAmTCCATCCTGTTCCACTACATGG ACTGGCTGGACGACCAGCGTGCTGAAAACTACCGTGAAGCTCTGGACGACGTTGTTGG TGACTACAACATCATCTGCCCGGCTCTGGAATTCACCAAAAAATTCTCCGAACTGGGT AACGACGCTTTCTTCTACTACTTCGAACACCGTTCCACCAAACTGCCGTGGCCGGAAT GGATGGGTGTTATGCACGGTTACGAAATCGAATTCGTTTTCGGTCTGCCGCTGGAACG T CG T G T T AAC T AC ACC AAAGC T GAAGAAAT C C T G T CC C G T T C C AT CAT GAAACG T T G G

PL 240 561 Β1

GCTAACTTCGCTAAATACGGTAACCCGAACGGTACCCAGTCCAACTCCACCCGTTGGC C GGT T T T CAAATCCACCGAACAGAAATACC T GAC C CT GAACAC C GAATC C CCGAAAGT TTACACCAAACTGCGTGCTCAGCAGTGCCGTTTCTGGACCCTGTTCTTCCCGAAAGTT C T GGAAC T GAC C GG TAACATCGACGAAGC T GAAC G T GAAT GGAAAGC TGGT T T C CACC GT T GGAACAAC TACATGAT G GAC T GGAAAAAC C AG T T CAAC GAC TAC AC C T C C AAAAA AGAATCCTGCTCCGACTTCCTTAAGAATA

Seq.7

ATAGTCGACGCTGGCGCCGAAGAAGACATCATCATCACCACCAAAAACGGTAAAGTTC GTGGTATGAACCTGCCGGTTCTGGGTGGTACCGTTACCGCTTTCCTGGGTATCCCGTA CGCTCAGCCGCCGCTGGGTCGTCTGCGTTTCAAAAAACCGCAGTCCCTGACCAAATGG TCCAACATCTGGAACGCTACCAAATACGCTAACTCCTGCTACCAGAACACCGACCAGT CCTTCCCGGGTTTCCTGGGTTCCGAAATGTGGAACCCGAACACCGAACTGTCCGAAGA CTGCCTGTACCTGAACGTTTGGATCCCGGCTCCGAAACCGAAAAACGCTACCGTTATG ATCTGGATCTACGGTGGTGGTTTCCAGACCGGTACCTCCTCCCTGCCGGTTTACGACG GTAAATTCCTGGCTCGTGTTGAACGTGTTATCGTTGTTTCCATGAACTACCGTGTTGG TGCTCTGGGTTTCCTGGCTCTGTCCGAAAACCCGGAAGCTCCGGGTAACATGGGTCTG TTCGACCAGCAGCTGGCTCTGCAGTGGGTTCAGAAAAACATCGCTGCTTTCGGTGGTA ACCCGCGTTCCGTTACCCTGTTCGGTGAATCCGCTGGTGCTGCTTCCGTTTCCCTGCA CCTGCTGTCCCCGCGTTCCCAGCCGCTGTTCACCCGTGCTATCCTGCAGTCCGGTTCC TCCAACGCTCCGTGGGCTGTTACCTCCCTGTACGAAGCTCGTAACCGTACCCTGACCC TGGCTAAACGTATGGGTTGCTCCCGTGACAACGAAACCGAAATGATCAAATGCCTGCG T GACAAAGACC C GCAGGAAAT CC T GC T GAAC GAAG TTTTCGTTGTTCCG TACGACACC CTGCTGTCCGTTAACTTCGGTCCGACCGTTGACGGTGACTTCCTGACCGACATGCCGG ACACCCTGCTGCAGCTGGGTCAGTTCAAACGTACCCAGATCCTGGTTGGTGTTAACAA AGACGAAGGTACCGCTTTCCTGGTTTACGGTGCTCCGGGTTTCTCCAAAGACAACAAC TCCATCATCACCCGTAAAGAATTCCAGGAAGGTCTGAAAATCTTCTTCCCGCGTGTTT CCGAATTCGGTCGTGAATCCATCCTGTTCCACTACATGGACTGGCTGGACGACCAGCG TGGTGAAAACTACCGTGAAGCTCTGGACGACGTTGTTGGTGACTACAACATCATCTGC CCGGCTCTGGAATTCACCAAAAAATTCTCCGAACTGGGTAACGACGCTTTCTTCTACT ACTTCGAACACCGTTCCACCAAACTGCCGTGGCCGGAATGGATGGGTGTTATGCACGG TTACGAAATCGAATTCGTTTTCGGTCTGCCGCTGGAACGTCGTGTTAACTACACCAAA GCTGAAGAAATCCTGTCCCGTTCCATCATGAAACGTTGGGCTAACTTCGCTAAATACG GTAACCCGAACGGTACCCAGTCCAACTCCACCCGTTGGCCGGTTTTCAAATCCACCGA ACAGAAATACCTGACCCTGAACACCGAATCCCCGAAAGTTTACACCAAACTGCGTGCT CAGCAGTGCCGTTTCTGGACCCTGTTCTTCCCGAAAGTTCTTAAGAAT

Seq.8

ATTTAAATGAATACTTACAAGGTACTCCTGCACCCGGCACAAGCGTATGTAATTGCTA GCACGCCGGTGCCGACCCAACCTCCAACTCCCGTGCTCACGCGCGCACACACGCACGC ACAAGCATCATCATCATCATCATCATGGTCATCCCTCCCTTATCTGGCGAAGGAGGCA CTGTGACGCAAGGTTTTCTGTGTCTCTCCTACCCCTCTACTGATTCCTTCTTTCTCTC TTCCTCTTCTCGCACTGCACCCCCCTCCCCCCCCCCACACACACACACTTGCTGTCAT GGCTGTGCGCATTCGCTCACTCTTGTCGTGTCCCGTTTCCCTCATGGCGTCGTCGTCT TCCCCTGCGCAACCACCCACGCTGCACACGCACGCTCCACAGCGCGCTTCGCCTTCTT

PL 240 561 Β1

CGCTCTCTCCCTAGCCTCCTCTCTGTCACCCTCCACTGCCGCCGCGGTTGGCCGCTCT GCATCCTTTTCCCGCAGCCTTTCCTTTTTTTTTTCACTGTCAGTCTGGCTCATACCCG TGGAGCTGTGTCTCCCCGAGCTTCCCATACACCCACCCCCCACGACCTTTCTCAGCTT CCTTTCTCAGTCGCTTGAGCACGCAGTGCATTCACTTCTTCGTCCCTCAGTTCGCCTC GCTCTCGCTCTCTCTCGCGCGCGCTGCCGTACCCGCCCCTCCTCGTACTCCCCTCCTT CCTCATCCCCACCCCCCCCGTGTGCGCCGGCTCCTCTCTGAATTCTAATACGACTCAC TATAGGGAGATCGTCCCTATCAGTGATAGAGATCCAGTCGCAGCCTGACCGCATCACA CATCAAGGCGTTACAGCCTCTCCGTCTTTGCTGCACCCAAGTGTATTCGTGTGACCGC GTTGAGGGATCTAATGGATTCGGAACTTTGGTCGTTTGGTCTCTCATGCTGCCCAATC CCATGCGCTTTTCTCCGTGCCTCTCTGTCTCCCCTTCCGTTCTATTTGGACAACGATG TGTACTGTAATGCGTGCGCCATCTGACAACGAATAGATCAGCAGCATTCGCACACTTG CACATACCCAGTGAAGCTTTTGTGTCTGTCGTATTGACAACACCGACTGCAACAAGGT GTAGATAGAAGTTGGCCTTCTCGCTCGCTCGCACGCTCTTCACGCTCCTGCTTTCCTT GCTGTGCCTTGCCACCAGATCTGCCATGGCCTCGAGGCTCGTCCGTGTGCTGGCCGCC GCCATGCTGGTTGCAGCGGCCGTGTCGGTCGACGCTGGCGCCGAAGAAGACATCATCA TCACCACCAAAAACGGTAAAGTTCGTGGTATGAACCTGCCGGTTCTGGGTGGTACCGT TACCGCTTTCCTGGGTATCCCGTACGCTCAGCCGCCGCTGGGTCGTCTGCGTTTCAAA AAAC C GCAG T CC C T GAC CAAAT GGT C CAACATC T GGAACGC TACCAAATACGCTAAC T CCTGCTACCAGAACACCGACCAGTCCTTCCCGGGTTTCCTGGGTTCCGAAATGTGGAA CCCGAACACCGAACTGTCCGAAGACTGCCTGTACCTGAACGTTTGGATCCCGGCTCCG AAACCGAAAAACGCTACCGTTATGATCTGGATCTACGGTGGTGGTTTCCAGACCGGTA CCTCCTCCCTGCCGGTTTACGACGGTAAATTCCTGGCTCGTGTTGAACGTGTTATCGT TGTTTCCATGAACTACCGTGTTGGTGCTCTGGGTTTCCTGGCTCTGTCCGAAAACCCG GAAGCTCCGGGTAACATGGGTCTGTTCGACCAGCAGCTGGCTCTGCAGTGGGTTCAGA AAAACATCGCTGCTTTCGGTGGTAACCCGCGTTCCGTTACCCTGTTCGGTGAATCCGC TGGTGCTGCTTCCGTTTCCCTGCACCTGCTGTCCCCGCGTTCCCAGCCGCTGTTCACC CGTGCTATCCTGCAGTCCGGTTCCTCCAACGCTCCGTGGGCTGTTACCTCCCTGTACG AAGCTCGTAACCGTACCCTGACCCTGGCTAAACGTATGGGTTGCTCCCGTGACAACGA AACCGAAATGATCAAATGCCTGCGTGACAAAGACCCGCAGGAAATCCTGCTGAACGAA GTTTTCGTTGTTCCGTACGACACCCTGCTGTCCGTTAACTTCGGTCCGACCGTTGACG GTGACTTCCTGACCGACATGCCGGACACCCTGCTGCAGCTGGGTCAGTTCAAACGTAC CCAGATCCTGGTTGGTGTTAACAAAGACGAAGGTACCGCTTTCCTGGTTTACGGTGCT CCGGGTTTCTC CAAAGACAACAAC T C CAT CAT CAC CC G TAAAGAAT T CCAG GAAGG TC TGAAAATCTTCTTCCCGCGTGTTTCCGAATTCGGTCGTGAATCCATCCTGTTCCACTA CATGGACTGGCTGGACGACCAGCGTGCTGAAAACTACCGTGAAGCTCTGGACGACGTT G T T G G T GAC T AC AAC AT C AT C T GC C C G G C T C T G GAAT T C AC C AAAAAAT T C T C C GAAC TGGGTAACGACGCTTTCTTCTACTACTTCGAACACCGTTCCACCAAACTGCCGTGGCC GGAATGGATGGGTGTTATGCACGGTTACGAAATCGAATTCGTTTTCGGTCTGCCGCTG GAACGTCGTGTTAACTACACCAAAGCTGAAGAAATCCTGTCCCGTTCCATCATGAAAC GTTGGGCTAACTTCGCTAAATACGGTAACCCGAACGGTACCCAGTCCAACTCCACCCG TTGGCCGGTTTTCAAATCCACCGAACAGAAATACCTGACCCTGAACACCGAATCCCCG AAAGTTTACACCAAACTGCGTGCTCAGCAGTGCCGTTTCTGGACCCTGTTCTTCCCGA AAGTTCTTAAGGGTACCCACCACCATCACCACCACTAGGCGGCCGCCCTCCTCCTCCT TTCTTGTTCCTTTCACGTCGCCTTCTCGGTTGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTT TTACGTGTACTTCTCTATAGATGATGTATGATCTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGT GTCCGTGTGTTGTGTACGCGTGCGTCTCGCCTCAGCTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGAC TGCCCATGATGCGTGTGTATATCCACGCGCAGGCACGCACACACACACACACACACAC ACACACAG G CACACACAG GCACACAAACG CAT C T CAG GCCGAGCCGCATACGTCTCTC GCAC GGTCTCGTTTATTT GAT CAT G TAG T T GAG TAT TAAAT T G G GAAGACAAAAACAT AATAGCACGAAGAGTCGGGCACGAAAAGCCCGATCTCTCTCTCTCTCTCTCGTGCGCG CAGGGGCGTGTGGGTGCACGACGACGAGGACGGAGGGGGGAAGGGAGGCATAAACGGA

PL 240 561 Β1

TCGATCCCCCATCGCACATGCGGGTACGAGCATTATCTGCTGTGTCTGGTCCTTTATC ATATCGCTACCCGCCCGCCCCCCGCCCCCCTCCCCCCCCCCCCCCCCGCGGCTCCTGT CACTGTCGTTCCTGCGACTCCCCACACACCCGCGCAACGCTCATGTCACGAAGAGAAA AGTAGAAGGCGTGGCGATGCGTTGCGCGGCCCCCTGTCCGCTGGCATGCAGACGTCGA GCCGTGGAACGGATGGTAGCGAGAGACAACGCGGCGATGCAGGAAAGGAGATTTACTG CAGGACGTCTACACACGCGCGCACACCACTGCGAATGGCACCGTGCTGAGGAAAATTG GGGGGGAGGGCGCACGGGGGCGGGGCAGGAAACGGTTGGATCAGCAGCACTCTCAACT TGTGTCCGTATTGCGAAGGAGGGAGAGGAGCCTGCCCGTATTATGGGCGCTGAAACGT CGGAACCACCTATGAATCCCACTTCTGCGTCGCGGAGGCGTACTGCTTCCGACCACCT CCGCAGCTCACGCGCGTCGAGCTCCCTCCCTTTCCCCTTCTTTCCGTTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTCTTGTCACGATGCATGGCCATCTCTCCTCCAACCCTCCACGCCTTC CTCTCCCCCGCCCATCAAACGCGCTACGGCCACAACCATTTCTTCAAGTATCACATCC ACCACCACTCTTACCCACCTACCCTCTTCGACTCTGACACAGCCACTGACGCCCTCTC CGCCTCTCTCGCTCGCTGCACATTGACTCTCCACAGCCCCCCCTCCCTCGCACAGCCA GCCCCACCCACCCACCCACCCACCCACCGCTCTACACACCTCCACAGCAGCCGGATCC ACCGCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGG AGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGAC TTCGCCGGTGTGGTCCGGGACAACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGG TGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGC CGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACC GAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACT GCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACGTCGAGTCCGGAATGGTGAGCAAGGGCGA GGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGC TCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGG GCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGA CATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGAC ATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGA ACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGA GTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATG CAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCG CCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGC TGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAC GTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGT ACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGAC TAGTTCTAGTTCTAGGGGCCGAATTAATTCAGATCCTCGTGTGAGCGTTCGCGGAATC GGTCGCTCGTGTTTATGCCCGTCTTGGTGTTGTGCTCGCAAGGCGGTGCAGCAGGATA CCGTCGCCCTCCTCTCTCCTTGCTTCTCTGTTCTTCAATTCGCGATCTCACAGAGGCC GGCTGTGCACGCCCTTCCTCACCCTCCTTTTCCCACCTCTCGGCCACCGGTCGGCTCC GTTCCGTCTGCCGTCGAGAAGGGACGGGCATGTGCAGCTCCTCCCTTTCTCTCGCGCG CGCATCTTCTCTTGCTTGTGGCACTCACGCTCATGCGTCAAGGCGGCCCCACGCCGAG CCCCTGCGCTCCCTTCCCTCTTGCGCATCCGTAGCGCGGATGCCGTCGATGCGCAAGG CCGGCATGAAGGAGCGCGTGCCCTCAAGAGGGCACACTATCATGCCCTACGTGGGCCA CGCAGCGATGAGGCCGGCTTCGGCGGAGATGCGTCACGCACGTGCCAGATGATGCGCT ACGCCTTCCTTGACTTGCGCCCCCCTCTCTTCCTCCGTCTCTCACTCTCTCTCTCTCA CACACACACACACACACACACACACACAAAGCT C C GG T TC GT C CGGGCC C TGCAGGCA TGCCGACGTTCGGTGACCTGAACCACCTCGTCGCCGCTGTGATGTCTGGCGTGACCTG CTGCCTGCGCTTCCCTGGCCAGCTGAACTCTGACCTGCGCAAGCTTCTCCTGCTCAAC GACGGCGACGGCGCTGACGAGGTGCAGAGTGGCACAGAAGCCGCAGCGGCGTACAGCG ACGAGGAGGGCGGGAAGTCGCCGAGTGGTCCCCTGGCGAACGACTCCCTGTTCATGTC CGCGTGGGACCGCCGTCGCAACCTCACGAGCCGCCCGCTGCGCATCACAACCATATTC GGCCCCACCTGCGATTCGATGGACTGCATTCTGAAGAAGCAGCCCTTCCCGGAGATGA

PL 240 561 Β1

AGCTCGGCGACTGGCTTCTAGTGCCAGACATGGGCAGCTACACCACCGCTGCCGCGGG AGTCTTCAACGGTTTCGCGACACGCCGCCTTGAGTTTGTGAGCTCTGTTGACTTGTCT GCGAGGTCGAGGGCTGTGCATGCGCATGAGGGCAACACTTTTGAGTTCGTGAGCGAGT GAAAACGGGGCTGAGAGGATACAAGGTGCTGTAGGATGAGATCCTCCGCCCACCAGAG CATGGGCTATCTCTTGTGTCTGTTCTGAGCCTGCCTCTCTCTCTCTCTCTTGCCTCCC CCTCCCCCCTCCCCACACACACCCCACACGCACGCTCTGCGTCACCCTCTCCTCCCTC AGTAACGGGAGTAGACATGCAGAAGAAGTATACCACTAATACGTATGCGTTCCTGCAG GCATCCGAGATGGACACCAGAGCAAGCGCGGGTGTGCGCGAGTGGCCAGGAAAGGGGA AGAGAGAGAAAGAGAGAGAGACGAAGGAGCGCGTCCCGTCGTTGTGCGTCTTCTGTGG TGGCGCATTTAAATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAA GGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGC GCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCAC TTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAAT ATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAG TTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGA GTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGG CGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTAT T CT CAGAATGAC T T GGT T GAGT AC T CACCAGT CACAGAAAAGCAT C T TAC GGATGGCA TGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATG GGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAA ACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATT AACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCG gataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctg ATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGGCAGA tggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggat GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGT C AGAC CAAG T T TAC T C AT AT AT AC T T TAG AT T GAT T T AAAAC T T C AT T T T T AAT T T AA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATC _{CTTTTTTTCTGCGCATMTCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGT} GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCAAGGTAACTGGCTTCAGCA GAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCT GCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATA AGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAAC GACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCC GAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCA CGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA AACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTT

Seq.9

ATTTAAATGAATACTTACAAGGTACTCCTGCACCCGGCACAAGCGTATGTAATTGCTA GCACGCCGGTGCCGACCCAACCTCCAACTCCCGTGCTCACGCGCGCACACACGCACGC ACAAGCATCATCATCATCATCATCATGGTCATCCCTCCCTTATCTGGCGAAGGAGGCA CTGTGACGCAAGGTTTTCTGTGTCTCTCCTACCCCTCTACTGATTCCTTCTTTCTCTC

PL 240 561 Β1

TTCCTCTTCTCGCACTGCACCCCCCTCCCCCCCCCCACACACACACACTTGCTGTCAT GGCTGTGCGCATTCGCTCACTCTTGTCGTGTCCCGTTTCCCTCATGGCGTCGTCGTCT TCCCCTGCGCAACCACCCACGCTGCACACGCACGCTCCACAGCGCGCTTCGCCTTCTT CGCTCTCTCCCTAGCCTCCTCTCTGTCACCCTCCACTGCCGCCGCGGTTGGCCGCTCT GCATCCTTTTCCCGCAGCCTTTCCTTTTTTTTTTCACTGTCAGTCTGGCTCATACCCG TGGAGCTGTGTCTCCCCGAGCTTCCCATACACCCACCCCCCACGACCTTTCTCAGCTT CCTTTCTCAGTCGCTTGAGCACGCAGTGCATTCACTTCTTCGTCCCTCAGTTCGCCTC GCTCTCGCTCTCTCTCGCGCGCGCTGCCGTACCCGCCCCTCCTCGTACTCCCCTCCTT CCTCATCCCCACCCCCCCCGTGTGCGCCGGCTCCTCTCTGAATTCTAATACGACTCAC TATAGGGAGATCGTCCCTATCAGTGATAGAGATCCAGTCGCAGCCTGACCGCATCACA CATCAAGGCGTTACAGCCTCTCCGTCTTTGCTGCACCCAAGTGTATTCGTGTGACCGC GTTGAGGGATCTAATGGATTCGGAACTTTGGTCGTTTGGTCTCTCATGCTGCCCAATC CCATGCGCTTTTCTCCGTGCCTCTCTGTCTCCCCTTCCGTTCTATTTGGACAACGATG TGTACTGTAATGCGTGCGCCATCTGACAACGAATAGATCAGCAGCATTCGCACACTTG CACATACCCAGTGAAGCTTTTGTGTCTGTCGTATTGACAACACCGACTGCAACAAGGT GTAGATAGAAGTTGGCCTTCTCGCTCGCTCGCACGCTCTTCACGCTCCTGCTTTCCTT GCTGTGCCTTGCCACCAGATCTGCCATGGCCATGCAGAGCTGGGGTACAATCATATGC ATTCGAATTCTCTTGCGATTTCTTCTGCTCTGGGTGCTTATCGGGAACTCACACACTG AAGAAGACAT CAT AAT TACAACCAAGAACGGAAAAGTCAGAGGGATGAAC T T GC CAGT TCTTGGTGGCACAGTAACAGCCTTTCTTGGGATTCCCTATGCACAGCCGCCTCTTGGT AGAC T TCGAT T CAAAAAGCCACAAT CCT T GAC TAAGT GG TC CAATAT T T GGAAT GC CA CAAAATATGCCAATTCTTGCTATCAGAACACAGATCAAAGTTTCCCAGGCTTCCTTGG ATCAGAGAT GT GGAACCCAAACAC T GAAC T T AG T GAAGACT G T T TAT ATC T GAATGTG TGGATTCCAGCACCTAAACCAAAAAATGCTACTGTAATGATATGGATCTATGGTGGTG GTTTTCAAACTGGGACATCATCTTTGCCTGTTTATGATGGCAAGTTTCTGGCTCGGGT TGAAAGAGTTATTGTAGTTTCAATGAACTATAGAGTGGGTGCCCTAGGATTCTTAGCC T T AT CAGAAAAT CC T GAGGCACCAGGGAACAT G GGCT TAT T T GAT CAACAG T TGGCAC TTCAGTGGGTCCAAAAAAATATAGCAGCCTTTGGTGGTAATCCTAGAAGTGTAACTCT CTTTGGAGAAAGTGCAGGAGCAGCTTCAGTTAGCCTTCATTTACTTTCTCCTAGAAGC CAGCCTTTGTTTACCAGAGCCATTCTGCAAAGTGGATCCTCTAATGCCCCTTGGGCAG T AACATC T C T GTAT GAAGCTAGGAACAGAACAT T GACC C TAGCTAAAC GTAT GGGT TG C TC TAGGGACAATGAGAC TGAGAT GATCAAAT G T C T TCGAGACAAAGATCC C CAGGAA ATTCTTCTGAATGAAGTATTTGTTGTCCCCTATGATACTCTCTTGTCAGTAAACTTTG GTCCAACTGTGGATGGCGATTTTCTCACTGACATGCCAGATACACTACTCCAACTTGG ACAG T TCAAAAGAACCCAGAT CTTGGTGGGTGT TAATAAAGAT GAAGG GACAGCAT T T T TAGT AT AT GGGGC T CCT GGT T TCAGCAAAGAT AACAACAGT ATCAT AACAAGAAAAG AATTTCAGGAGGGTTTAAAAATATTTTTTCCAAGAGTGAGTGAGTTTGGAAGAGAATC AAT CC T T T T C CAT T AGAT GGAC TGG T TAGAT GAT CAGAGAGCCGAAAAC TACAGAGAG GCCTTGGATGATGTTGTTGGGGATTACAATATCATATGCCCTGCCTTGGAGTTCACCA AAAAGTTCTCAGAATTGGGAAATGATGCCTTTTTCTACTATTTTGAACACCGATCGAC CAAACTTCCTTGGCCAGAATGGATGGGAGTGATGCATGGTTACGAAATCGAATTTGTC T T T GGT T TAC CT C T GGAAAGAAGAG T TAAT TACACAAAAGC T GAGGAAAT T T TGAGTA GATCCATTATGAAACGCTGGGCAAATTTTGCAAAATATGGAAATCCAAATGGGACCCA GAGCAAT AGCACAAGAT GGC C T GT C T T CAAGAGCACT GAACAAAAATAT T T AACCT T G AATACAGAGTCACCAAAAGTGTACACCAAACTACGAGCTCAACAATGTCGATTCTGGA CAC TAT T T T T T C C T AAAGT C T T GGAAT T GACAG GAAATAT T GATGAAGCAGAACGAGA ATGGAAAGCAGGAT T CCAT CGC TGGAACAAT TACAT GAT GGAC TGGAAAAAT CAACT T AACGATTACACTAGCAAGAAAGAAAGCTGTTCAGATTTTCTTAAGGGTACCCACCACC ATCACCACCACTAGGCGGCCGCCCTCCTCCTCCTTTCTTGTTCCTTTCACGTCGCCTT CTCGGTTGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTTTTACGTGTACTTCTCTATAGATGA TGTATGATCTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGTGTCCGTGTGTTGTGTACGCGTGCG

PL 240 561 Β1

TCTCGCCTCAGCTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGACTGCCCATGATGCGTGTGTATATCC ACGCGCAGGCACGCACACACACACACACACACACACACACAGGCACACACAGGCACAC AAACGCATCTCAGGCCGAGCCGCATACGTCTCTCGCACGGTCTCGTTTATTTGATCAT G TAG T T GAGTAT T AAAT T GGGAAGACAAAAAC ATAAT AGCAC GAAGAG TCGGGCACGA AAAGCCCGATCTCTCTCTCTCTCTCTCGTGCGCGCAGGGGCGTGTGGGTGCACGACGA CGAGGACGGAGGGGGGAAGGGAGGCATAAACGGATCGATCCCCCATCGCACATGCGGG TACGAGCATTATCTGCTGTGTCTGGTCCTTTATCATATCGCTACCCGCCCGCCCCCCG CCCCCCTCCCCCCCCCCCCCCCCGCGGCTCCTGTCACTGTCGTTCCTGCGACTCCCCA CACACCCGCGCAACGCTCATGTCACGAAGAGAAAAGTAGAAGGCGTGGCGATGCGTTG CGCGGCCCCCTGTCCGCTGGCATGCAGACGTCGAGCCGTGGAACGGATGGTAGCGAGA GACAACG C GGC GAT GCAGGAAAGGAGAT T TAC T GCAGGACG T C TACACAC G C G C G CAC ACCACTGCGAATGGCACCGTGCTGAGGAAAATTGGGGGGGAGGGCGCACGGGGGCGGG GCAGGAAACGGTTGGATCAGCAGCACTCTCAACTTGTGTCCGTATTGCGAAGGAGGGA GAGGAGCCTGCCCGTATTATGGGCGCTGAAACGTCGGAACCACCTATGAATCCCACTT CTGCGTCGCGGAGGCGTACTGCTTCCGACCACCTCCGCAGCTCACGCGCGTCGAGCTC CCTCCCTTTCCCCTTCTTTCCGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTTGTCACGATG CATGGCCATCTCTCCTCCAACCCTCCACGCCTTCCTCTCCCCCGCCCATCAAACGCGC TACGGCCACAACCATTTCTTCAAGTATCACATCCACCACCACTCTTACCCACCTACCC TCTTCGACTCTGACACAGCCACTGACGCCCTCTCCGCCTCTCTCGCTCGCTGCACATT GACTCTCCACAGCCCCCCCTCCCTCGCACAGCCAGCCCCACCCACCCACCCACCCACC CACCGCTCTACACACCTCCACAGCAGCCGGATCCACCGCATGGCCAAGTTGACCAGTG CCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCG GCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACAAC GTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCT GGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCAC GAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGG CGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGC AGGACGTCGAGTCCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAA GGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAG ATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGG TGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTA CGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCC TTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGA CCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCG CGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAG GCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGA GGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGC CAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACC T CCCACAAC GAGGACT ACAC CATC G T GGAACAGTACGAACGC GCC GAGGGC C GC CAC T CCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGACTAGTTCTAGTTCTAGGGGCCGAAT TAATTCAGATCCTCGTGTGAGCGTTCGCGGAATCGGTCGCTCGTGTTTATGCCCGTCT TGGTGTTGTGCTCGCAAGGCGGTGCAGCAGGATACCGTCGCCCTCCTCTCTCCTTGCT TCTCTGTTCTTCAATTCGCGATCTCACAGAGGCCGGCTGTGCACGCCCTTCCTCACCC TCCTTTTCCCACCTCTCGGCCACCGGTCGGCTCCGTTCCGTCTGCCGTCGAGAAGGGA CGGGCATGTGCAGCTCCTCCCTTTCTCTCGCGCGCGCATCTTCTCTTGCTTGTGGCAC TCACGCTCATGCGTCAAGGCGGCCCCACGCCGAGCCCCTGCGCTCCCTTCCCTCTTGC GCATCCGTAGCGCGGATGCCGTCGATGCGCAAGGCCGGCATGAAGGAGCGCGTGCCCT CAAGAGGGCACACTATCATGCCCTACGTGGGCCACGCAGCGATGAGGCCGGCTTCGGC GGAGATGCGTCACGCACGTGCCAGATGATGCGCTACGCCTTCCTTGACTTGCGCCCCC CTCTCTTCCTCCGTCTCTCACTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACACACACACA CACAAAGCTCCGGTTCGTCCGGGCCCTGCAGGCATGCCGACGTTCGGTGACCTGAACC

PL 240 561 Β1

ACCTCGTCGCCGCTGTGATGTCTGGCGTGACCTGCTGCCTGCGCTTCCCTGGCCAGCT GAACTCTGACCTGCGCAAGCTTCTCCTGCTCAACGACGGCGACGGCGCTGACGAGGTG CAGAGTGGCACAGAAGCCGCAGCGGCGTACAGCGACGAGGAGGGCGGGAAGTCGCCGA GTGGTCCCCTGGCGAACGACTCCCTGTTCATGTCCGCGTGGGACCGCCGTCGCAACCT cacgagccgcccgctgcgcatcacaaccatattcggccccacctgcgattcgatggac TGCATTCTGAAGAAGCAGCCCTTCCCGGAGATGAAGCTCGGCGACTGGCTTCTAGTGC cagacatgggcagctacaccaccgctgccgcgggagtcttcaacggtttcgcgacacg CCGCCTTGAGTTTGTGAGCTCTGTTGACTTGTCTGCGAGGTCGAGGGCTGTGCATGCG CATGAGGGCAACACTTTTGAGTTCGTGAGCGAGTGAAAACGGGGCTGAGAGGATACAA GGTGCTGTAGGATGAGATCCTCCGCCCACCAGAGCATGGGCTATCTCTTGTGTCTGTT CTGAGCCTGCCTCTCTCTCTCTCTCTTGCCTCCCCCTCCCCCCTCCCCACACACACCC CACACGCACGCTCTGCGTCACCCTCTCCTCCCTCAGTAACGGGAGTAGACATGCAGAA GAAG TATAC GAC T AATAC GT AT GC G T T CC T GCAGGCAT C CGAGAT GGACACCAGAGCA AGCGCGGGTGTGCGCGAGTGGCCAGGAAAGGGGAAGAGAGAGAAAGAGAGAGAGACGA AGGAGCGCGTCCCGTCGTTGTGCGTCTTCTGTGGTGGCGCATTTAAATTTAGAGCTTG ACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGC GCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC TTAATGCGCCGCTA.CAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAA CCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCC GTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGA AACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATC GAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTC CAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGC CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC T CAC CAG T GACAGAAAAG CAT C T TAC GGAT GGCAT GACAG TAAGAGAATTATGCAGTG CTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGG ACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGAT CGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGC CTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGC T TCC C GGCAACAAT TAATAGAC TGGAT GGAGGCGGATAAAG T T GCAGGAC CAC T T C T G CGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGT T AT C T ACAC GAC G G GGAG T C AG GC AACT AT GGAT GAAC GAAAT AGACAG AT C GC T GAG AT AGG TG C C T CAC T GAT TAAG C AT T GG T AAC T G T C AGAC C AAG T T TAC T C AT AT AT AC T T TAGAT T GAT T TAAAACT T CAT T T T TAAT T TAAAAGGATC TAGGT GAAGAT CC T T T T TGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGGATAATCTGCT GCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCT ACCAACTCTTTTTCCAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTC TTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATA CCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTT ACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAG C G T GAG C TAT GAGAAAGC GC CACGCTTCCC GAAG G GAGAAAGGC GGACAG G TAT CCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACG CCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTA CGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTT

Seq.10

PL 240 561 Β1

ATTTAAATGAATACTTACAAGGTACTCCTGCACCCGGCACAAGCGTATGTAATTGCTA GCACGCCGGTGCCGACCCAACCTCCAACTCCCGTGCTCACGCGCGCACACACGCACGC ACAAGCATCATCATCATCATCATCATGGTCATCCCTCCCTTATCTGGCGAAGGAGGCA CTGTGACGCAAGGTTTTCTGTGTCTCTCCTACCCCTCTACTGATTCCTTCTTTCTCTC TTCCTCTTCTCGCACTGCACCCCCCTCCCCCCCCCCACACACACACACTTGCTGTCAT GGCTGTGCGCATTCGCTCACTCTTGTCGTGTCCCGTTTCCCTCATGGCGTCGTCGTCT TCCCCTGCGCAACCACCCACGCTGCACACGCACGCTCCACAGCGCGCTTCGCCTTCTT CGCTCTCTCCCTAGCCTCCTCTCTGTCACCCTCCACTGCCGCCGCGGTTGGCCGCTCT GCATCCTTTTCCCGCAGCCTTTCCTTTTTTTTTTCACTGTCAGTCTGGCTCATACCCG TGGAGCTGTGTCTCCCCGAGCTTCCCATACACCCACCCCCCACGACCTTTCTCAGCTT CCTTTCTCAGTCGCTTGAGCACGCAGTGCATTCACTTCTTCGTCCCTCAGTTCGCCTC GCTCTCGCTCTCTCTCGCGCGCGCTGCCGTACCCGCCCCTCCTCGTACTCCCCTCCTT CCTCATCCCCACCCCCCCCGTGTGCGCCGGCTCCTCTCTGAATTCTAATACGACTCAC TATAGGGAGAT CGT CC C TAT CAGT GATAGAGAT C CAG T CGCAGCC T GACC GCAT CACA CATCAAGGCGTTACAGCCTCTCCGTCTTTGCTGCACCCAAGTGTATTCGTGTGACCGC GTTGAGGGATCTAATGGATTCGGAACTTTGGTCGTTTGGTCTCTCATGCTGCCCAATC CCATGCGCTTTTCTCCGTGCCTCTCTGTCTCCCCTTCCGTTCTATTTGGACAACGATG TGTACTGTAATGCGTGCGCCATCTGACAACGAATAGATCAGCAGCATTCGCACACTTG CACATACCCAGTGAAGCTTTTGTGTCTGTCGTATTGACAACACCGACTGCAACAAGGT GTAGATAGAAGTTGGCCTTCTCGCTCGCTCGCACGCTCTTCACGCTCCTGCTTTCCTT GCTGTGCCTTGCCACCAGATCTGCCATGGCCATGCAGTCCTGGGGTACCATCATCTGC ATCCGTATCCTGCTGCGTTTCCTGCTGCTGTGGGTTCTGATCGGTAACTCCCACACCG AAGAAGACATCATCATCACCACCAAAAACGGTAAAGTTCGTGGTATGAACCTGCCGGT TCTGGGTGGTACCGTTACCGCTTTCCTGGGTATCCCGTACGCTCAGCCGCCGCTGGGT CGTCTGCGTTTCAAAAAACCGCAGTCCCTGACCAAATGGTCCAACATCTGGAACGCTA CCAAATACGCTAACTCCTGCTACCAGAACACCGACCAGTCCTTCCCGGGTTTCCTGGG TTCCGAAATGTGGAACCCGAACACCGAACTGTCCGAAGACTGCCTGTACCTGAACGTT TGGATCCCGGCTCCGAAACCGAAAAACGCTACCGTTATGATCTGGATCTACGGTGGTG GTTTCCAGACCGGTACCTCCTCCCTGCCGGTTTACGACGGTAAATTCCTGGCTCGTGT TGAACGTGTTATCGTTGTTTCCATGAACTACCGTGTTGGTGCTCTGGGTTTCCTGGCT CTGTCCGAAAACCCGGAAGCTCCGGGTAACATGGGTCTGTTCGACCAGCAGCTGGCTC TGCAGTGGGTTCAGAAAAACATCGCTGCTTTCGGTGGTAACCCGCGTTCCGTTACCCT GTTCGGTGAATCCGCTGGTGCTGCTTCCGTTTCCCTGCACCTGCTGTCCCCGCGTTCC CAGCCGCTGTTCACCCGTGCTATCCTGCAGTCCGGTTCCTCCAACGCTCCGTGGGCTG TTACCTCCCTGTACGAAGCTCGTAACCGTACCCTGACCCTGGCTAAACGTATGGGTTG CTCCCGTGACAACGAAACCGAAATGATCAAATGCCTGCGTGACAAAGACCCGCAGGAA atcctgctgaacgaagttttcgttgttccgtacgacaccctgctgtccgttaacttcg GTCCGACCGTTGACGGTGACTTCCTGACCGACATGCCGGACAGCCTGCTGCAGCTGGG TCAGTTCAAACGTACCCAGATCCTGGTTGGTGTTAACAAAGACGAAGGTACCGCTTTC CTGGTTTACGGTGCTCCGGGTTTCTCCAAAGACAACAACTCCATCATCACCCGTAAAG AATTCCAGGAAGGTCTGAAAATCTTCTTCCCGCGTGTTTCCGAATTCGGTCGTGAATC CATCCTGTTCCACTACATGGACTGGCTGGACGACCAGCGTGCTGAAAACTACCGTGAA GCTCTGGACGACGTTGTTGGTGACTACAACATCATCTGCCCGGCTCTGGAATTCACCA AAAAATTCTCCGAACTGGGTAACGACGCTTTCTTCTACTACTTCGAACACCGTTCCAC CAAACTGCCGTGGCCGGAATGGATGGGTGTTATGCACGGTTACGAAATCGAATTCGTT TTCGGTCTGCCGCTGGAACGTCGTGTTAACTACACCAAAGCTGAAGAAATCCTGTCCC GTTCCATCATGAAACGTTGGGCTAACTTCGCTAAATACGGTAACCCGAACGGTACCCA GTCCAACTCCACCCGTTGGCCGGTTTTCAAATCCACCGAACAGAAATACCTGACCCTG AACACCGAATCCCCGAAAGTTTACACCAAACTGCGTGCTCAGCAGTGCCGTTTCTGGA CCCTGTTCTTCCCGAAAGTTCTGGAACTGACCGGTAACATCGACGAAGCTGAACGTGA

PL 240 561 Β1

AT GGAAAG CTGGTTTC GACO G T T G GAACAAC TACAT GAT GGAC T GGAAAAAC CAG T T C AAC GAC TACAC C T CCAAAAAAGAATCCTGCTCC GAC T T C C T TAAGGG TAC C CAC CACC ATCACCACCACTAGGCGGCCGCCCTCCTCCTCCTTTCTTGTTCCTTTCACGTCGCCTT CTCGGTTGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTTTTACGTGTACTTCTCTATAGATGA TGTATGATCTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGTGTCCGTGTGTTGTGTACGCGTGCG TCTCGCCTCAGCTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGACTGCCCATGATGCGTGTGTATATCC ACGCGCAGGCACGCACACACACACACACACACACACACACAGGCACACACAGGCACAC AAACGCATCTCAGGCCGAGCCGCATACGTCTCTCGCACGGTCTCGTTTATTTGATCAT GTAGTTGAGTAT TAAAT T GG GAAGAC AAAAAC AT AAT AGCAC GAAGAG T C G G G CAC GA AAAGCCCGATCTCTCTCTCTCTCTCTCGTGCGCGCAGGGGCGTGTGGGTGCACGACGA C GAG GAC G GAGG GGGGAAGG GAGG CATAAAC G GAT CGAT CC C C CAT C GCACAT GC GGG TACGAGCATTATCTGCTGTGTCTGGTCCTTTATCATATCGCTACCCGCCCGCCCCCCG CCCCCCTCCCCCCCCCCCCCCCCGCGGCTCCTGTCACTGTCGTTCCTGCGACTCCCCA CACACCCGCGCAACGCTCATGTCACGAAGAGAAAAGTAGAAGGCGTGGCGATGCGTTG CGCGGCCCCCTGTCCGCTGGCATGCAGACGTCGAGCCGTGGAACGGATGGTAGCGAGA GACAACGCGGCGATGCAGGAAAGGAGATTTACTGCAGGACGTCTACACACGCGCGCAC ACCACTGCGAATGGCACCGTGCTGAGGAAAATTGGGGGGGAGGGCGCACGGGGGCGGG GCAGGAAACGGTTGGATCAGCAGCACTCTCAACTTGTGTCCGTATTGCGAAGGAGGGA GAGGAGCCTGCCCGTATTATGGGCGCTGAAACGTCGGAACCACCTATGAATCCCACTT CTGCGTCGCGGAGGCGTACTGCTTCCGACCACCTCCGCAGCTCACGCGCGTCGAGCTC CCTCCCTTTCCCCTTCTTTCCGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTTGTCACGATG CATGGCCATCTCTCCTCCAACCCTCCACGCCTTCCTCTCCCCCGCCCATCAAACGCGC TAC G GCCACAAC CAT T T C T T CAAG TAT CACAT C CACCAC CAC T C T TACC CAC C TAC CC TCTTCGACTCTGACACAGCCACTGACGCCCTCTCCGCCTCTCTCGCTCGCTGCACATT GACTCTCCACAGCCCCCCCTCCCTCGCACAGCCAGCCCCACCCACCCACCCACCCACC CACCGCTCTACACACCTCCACAGCAGCCGGATCCACCGCATGGCCAAGTTGACCAGTG CCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCG GCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACAAC GTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCT GGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCAC GAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGG CGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGC AGGAC GT C GAG T C C GGAAT GGT GAGCAAGGG C GAG GAGGATAACAT G GC CAT CAT CAA GGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAG ATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGG TGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTA CGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCC TTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGA CCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCG CGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAG GCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGA GGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGC CAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACC TCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACT C CAC C GGC GGCAT GGAC GAG C T GTACAAG TAGAC TAG T T CTAG T T C TAGGG GC C GAAT TAATTCAGATCCTCGTGTGAGCGTTCGCGGAATCGGTCGCTCGTGTTTATGCCCGTCT TGGTGTTGTGCTCGCAAGGCGGTGCAGCAGGATACCGTCGCCCTCCTCTCTCCTTGCT TCTCTGTTCTTCAATTCGCGATCTCACAGAGGCCGGCTGTGCACGCCCTTCCTCACCC TCCTTTTCCCACCTCTCGGCCACCGGTCGGCTCCGTTCCGTCTGCCGTCGAGAAGGGA CGGGCATGTGCAGCTCCTCCCTTTCTCTCGCGCGCGCATCTTCTCTTGCTTGTGGCAC TCACGCTCATGCGTCAAGGCGGCCCCACGCCGAGCCCCTGCGCTCCCTTCCCTCTTGC

PL 240 561 Β1

GCATCCGTAGCGCGGATGCCGTCGATGCGCAAGGCCGGCATGAAGGAGCGCGTGCCCT CAAGAGGGCACACTATCATGCCCTACGTGGGCCACGCAGCGATGAGGCCGGCTTCGGC GGAGATGCGTCACGCACGTGCCAGATGATGCGCTACGCCTTCCTTGACTTGCGCCCCC CTCTCTTCCTCCGTCTCTCACTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACACACACACA CACAAAGCTCCGGTTCGTCCGGGCCCTGCAGGCATGCCGACGTTCGGTGACCTGAACC ACCTCGTCGCCGCTGTGATGTCTGGCGTGACCTGCTGCCTGCGCTTCCCTGGCCAGCT GAACTCTGACCTGCGCAAGCTTCTCCTGCTCAACGACGGCGACGGCGCTGACGAGGTG CAGAGTGGCACAGAAGCCGCAGCGGCGTACAGCGACGAGGAGGGCGGGAAGTCGCCGA GTGGTCCCCTGGCGAACGACTCCCTGTTCATGTCCGCGTGGGACCGCCGTCGCAACCT CACGAGCCGCCCGCTGCGCATCACAACCATATTCGGCCCCACCTGCGATTCGATGGAC TGCATTCTGAAGAAGCAGCCCTTCCCGGAGATGAAGCTCGGCGACTGGCTTCTAGTGC CAGACATGGGCAGCTACACCACCGCTGCCGCGGGAGTCTTCAACGGTTTCGCGACACG CCGCCTTGAGTTTGTGAGCTCTGTTGACTTGTCTGCGAGGTCGAGGGCTGTGCATGCG CATGAGGGCAACACTTTTGAGTTCGTGAGCGAGTGAAAACGGGGCTGAGAGGATACAA GGTGCTGTAGGATGAGATCCTCCGCCCACCAGAGCATGGGCTATCTCTTGTGTCTGTT CTGAGCCTGCCTCTCTCTCTCTCTCTTGCCTCCCCCTCCCCCCTCCCCACACACACCC CACACGCACGCTCTGCGTCACCCTCTCCTCCCTCAGTAACGGGAGTAGACATGCAGAA GAAGTATACCACTAATACGTATGCGTTCCTGCAGGCATCCGAGATGGACACCAGAGCA AGCGCGGGTGTGCGCGAGTGGCCAGGAAAGGGGAAGAGAGAGAAAGAGAGAGAGACGA AGGAGCGCGTCCCGTCGTTGTGCGTCTTCTGTGGTGGCGCATTTAAATTTAGAGCTTG ACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGC GCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC TTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC C CC T ATT T G T T TAT T T T T CTAAATAGAT TCAAATATG TATCCGC T CATGAGACAATAA C CC T GAT AAAT G CT T C AAT AAT AT T GAAAAAGGAAGAG TAT GAG TAT TC AAC AT T T C C GTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGA AACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATC GAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTC CAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGC CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC T CACCAGT CACAGAAAAGCAT C T TACGGAT GGCAT GACAGTAAGAGAAT TAT GCAGTG CTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGG ACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGAT CGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGC CTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGC TTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTG CGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGT TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAG ATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC T TTAGAT T GAT T TAAAACT T CAT T T T TAAT T TAAAAGGATC TAGGT GAAGAT CC T T T T TGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCATAATCTGCT GCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCT ACCAACTCTTTTTCCAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTC TTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATA CCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTT ACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTAT CCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACG

CCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTA CGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTT

Seq.11

Claims (5)

PL 240 561 B1 Zastrzeżenia patentowe

1. Wektor DNA zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae, zawierający gen kodujący skróconą wersję butyrylocholinoesterazy BChE pokazany na Seq. 3 lub Seq. 7 lub Seq. 8, pozbawiony domeny tetrameryzacyjnej, kierujący biosyntezą rekombinantowego białka z zawartej w genie Otwartej Ramie Odczytu, przy czym gen zawierający Otwartą Ramę Odczytu koduje białko o Seq. 1 zawierające sumarycznie 564 reszt aminokwasowych i opatrzone na N-końcu sekwencją sekrecyjną Leishmania o 23 resztach aminokwasowych oraz zawierające dodatkowo 2 reszty aminokwasowe Gly-Ala, a na C-końcu 4 reszty aminokwasowe Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznik 6-ciu reszt His.

2. Wektor DNA zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae, do produkcji białka o Seq. 4, zawierającego sumarycznie 614 reszt aminokwasowych, w tym dodatkowe 2 reszty aminokwasowe Met-Ala na N-końcu, a na C-końcu opatrzoną dodatkowymi 4 resztami aminokwasowymi Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznikiem 6-ciu reszt His, przy czym wektor zawiera gen kodujący holoenzym końskiej butyrylocholinoesterazy BChE o sekwencji Seq. 6.

3. Wektor DNA, zdolny do transformacji i integracji z chromosomem Leishmania tarentolae do produkcji białka o Seq. 4 zawierającego sumarycznie 614 reszt aminokwasowych, w tym dodatkowe 2 reszty aminokwasowe Met-Ala na N-końcu, a na C-końcu opatrzone dodatkowymi 4 resztami aminokwasowymi Leu-Lys-Gly-Thr oraz znacznikiem 6-ciu reszt His, przy czym wektor zawiera gen syntetyczny kodujący holoenzym końskiej butyrylocholinoesterazy BChE o Seq. 3.

4. Wektor DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wektorem wahadłowym klonowania i ekspresji białek, zawierającym dodatkowo minimum dwa origin replikacji, korzystnie dla Escherichia coli i/lub Leishmania tarentolae.

5. Wektor DNA według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że koduje sygnał sekrecyjny, korzystnie pochodzący z Leishmania, geny oporności na antybiotyki, korzystnie bleomycynę i/lub ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie bakteriofaga T7, gen represora transkrypcji, korzystnie regulowany przez tetracyklinę, gen operatora, korzystnie regulowany przez represor tetracyklinowy, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji, korzystnie sekwencję kodującą 6-ciu reszt histydyny.