JP2003509031A - ドナー細胞又は分化細胞からの核を使用する豚のクローニング並びに多能性豚の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脱核された子ブタ卵母細胞内へのドナーの分化したブタ細胞核の移入を含む核移入の改善法を提供する。結果として生じた核移入ユニットは胎児および産子の作出による遺伝子型および形質転換した遺伝子型の増殖のために有用である。ドナー核の分化した細胞源を遺伝的に一時変異させまたクローニングによって増殖させることが可能なことにより、本手法は遺伝工学的に作られたもしくは形質転換された子ブタ胚、胎児および産子の作出を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） この出願は1997年1月10日に出願された米国特許出願番号08/781,752の一部継
続出願である1997年7月3日に出願された米国特許出願番号08/888,057の一部継続
出願であり、その内容はこの明細書の中の参考として取り込む。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は分化した子ブタ細胞由来の細胞核を脱核されたブタ卵母細胞もしくは
割球内に移入するクローニングの工程に関連する。胎児および産子を作出するた
めに、その後レシピエントの雌に移入できる、もしくは多能性の培養内部細胞塊
細胞(CICM)を作出するために用いることができるクローン胚の発育を方向づける
為に核を再プログラムする。クローン胚はまたキメラ胚、胎児および/もしくは
子孫を作出するために受精胚と結合することができる。

【０００３】 （発明の背景） 核移植のための有蹄類内部細胞塊(ICM)細胞の利用法がまた報告された。例え
ば、Collasら.,Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)の中で脱核された成熟卵母細
胞中に溶解されたドナー細胞を微量注射することによるウシICMの核移植につい
て発表されている。ウシレシピエントに移入する際、結果として４例の妊娠と２
例の出産を生じた15例の胚盤胞を作出するための７日間のin vitroにおける胚の
培養についてCollasらによって発表された。またKeeferら.,Biol.Reprod.，50:9
35-939(1994)の中でウシレシピエントへの移植の際、結果として数例の生存して
いる産子を生じた胚盤胞を作出するための核移入工程においてドナー核としての
ウシICM細胞の利用について発表された。さらに、Simsら.,Proc,Natl.Acad,Sci.
,USA, 90:6143-6147(1993)の中で脱核された成熟卵母細胞の中に短期間in vitro
で培養されたウシICM由来の核を移入することによる出産の作出について発表さ
れた。

【０００４】 培養された胚盤細胞の核移入の後生存している子ヒツジの作出についてもまた
報告された(Campbellら.,Nature,380:64-68(1996))。またさらに、核移入及びキ
メラ胎児の作出におけるウシ多能性胚細胞の利用について報告された(Sticeら.,
Biol. Reprod, 54 : 100-110 (1996) ； Collasら,. Mol. Reprod. Dev., 38 :
64-267 (1994))。Collasらによって顆粒膜細胞(成熟細胞)を胚作出のためにウ
シクローニング工程の中で利用することができた。しかしながら、終了した初期
の胚期(胚盤胞期)の発生については示されていない。また、顆粒膜細胞は容易に
培養されず雌から得られるだけである。Collasらによって培養液の中で顆粒膜細
胞を増殖されることも、これらの細胞を遺伝的に一時変異させることも試みられ
なかった。Wilmutら(Nature, 365:810-813(1997))によって胎児の線維芽細胞由
来の核移入した複数例のヒツジの産子および成熟したヒツジ由来の細胞からの１
例の産子が作出された。

【０００５】 クローン化された子ブタ細胞を他の種の細胞と比較することはさらに困難であ
る。この事象を次の表に示した：

【表１】

【０００６】 形質転換した子ブタを作出する領域にはまた問題が存在している。この方法に
よって、非相同DNAを胎児のさまざまな細胞型に分化し、結局形質転換した細胞
に実際に発生する初期胚もしくは胚細胞株の中に導入する。しかしながら、多く
の初期胚には一例の形質転換した哺乳動物を作出することが必要であり、またそ
れゆえにこの工程が非常に効果的である。また代理の雌に胚を挿入する時間と費
用を費やす前に、形質転換した胚に対して選択する簡単で効果的な方法はない。
さらに、ジーンターゲティング法を初期の胚形質転換工程によって容易に実施す
ることはできない。

【０００７】 マウスにおける胚幹細胞は研究者が形質転換細胞に対して選択し、ジーンター
ゲティング法を実施することを可能にした。これによって他の形質転換法により
さらなる遺伝子工学が可能になる。しかしながら、胚幹細胞株および他の胚細胞
株を支持細胞層および/もしくは培養液へのサイトカインの追加が必要な未分化
状態で維持しなければならない。たとえこのような対策がなされたとしても、こ
れらの細胞は一時的な分化を受け、現在利用できる方法によって形質転換された
産子を作出する為に利用することはできない。またジーンターゲティング法を促
進しない方法で増殖されなければならない胚細胞株もある。

【０００８】 初期内移植マウスの胚由来のin vitroにおける胚幹(ES)細胞株を誘導する方法
がよく知られている(Evansら.,Nature,29:154-156(1981); Martin, Proc. Natl.
Acad.Sci., USA,78:7634-7638(1981)を参照)。もし線維芽細胞の支持細胞層(Eva
nsら.,Id)もしくは分化を抑制因子(Smithら.,Dev.Biol.,121:1-9(1987))が存在
するならば、ES細胞は未分化状態で培養することが可能である。

【０００９】 ES細胞は多くの適用をもつことがすでに報告されている。例えばES細胞はin v
itroにおける分化のモデルとして、特に初期の発育の制御における遺伝子の研究
のモデルとして利用できる。マウスのES細胞は多能性を示すことにより内移植前
マウスの胚の中に導入された場合生殖細胞株キメラを生み出すことが可能である
(Bradleyら.,Nature, 309:255-256(1984))。

【００１０】 次世代へのゲノムの移入を可能にするために、ES細胞は適切な遺伝子一時変異
をした、もしくはしないES細胞を利用することによって家畜哺乳動物の生殖株操
作に対する潜在的な有用性をもつ。さらに家畜動物の場合、例えば有蹄類の場合
、内移植前の家畜胚様胚由来の核は脱核された卵母細胞の発育を限界まで維持す
る(Smithら.,Biol.Reprod.,40:1027-1035(1989);Keeferら., Biol.Reprod., 50:
935-939(1994))。これは報告によれば移入後８細胞期を超えると脱核された卵母
細胞の発育を維持しないマウスの胚由来の核と対照的である(Cheongら.,Biol.Re
prod.,48:958(1993))。従って、核移入工程のために全形成能をもつドナー核の
潜在的な源を、遺伝的に操作されるかまたは他の方法で提供する可能性があるた
め、家畜動物からのES細胞がきわめて適切である。

【００１１】 報告によれば研究グループによっては多能性胚細胞株の分離を報告している。
例えば、Notarianniら.,J.Reprod,Fert,Suppl.,43:255-260(1991)では、ヒツジ
胚盤胞から免疫外科的に分離された内部細胞塊の初期培養液中の細胞に類似した
形態学的および成長の特徴を示す子ブタおよびヒツジ胚盤胞由来の、報告によれ
ば安定な、多能性細胞株の構築を報告している。また、(Notarianniら.,J.Repro
d. Fert.Suppl., 41:51-56(1990)は子ブタ胚盤胞由来の推定上の多能性胚芽細胞
の培養液中での維持および分化について発表している。Gerfenら.,Anim,Biotech
,6(1):1-14(1995)ではブタ胚盤胞由来の胚細胞株の分離について発表している。
これらの細胞を調整された培養液の利用なしにマウス胚線維芽細胞支持細胞層内
で安定して維持し、また報告によれば培養の際様々な異なる細胞型に分化させた
。

【００１２】 さらに、Saitoら.,Roux’s Arch,Dev.Biol.,201:134-141(1992)では第三継代
で生存していたが第四継代後死滅した培養されたウシ胚幹細胞様細胞株について
報告している。Handysideら.,Roux’s Arch.Dev. Biol.,196:185-190(1987)では
マウスのICM由来のマウスES細胞株の分離が可能な条件下でヒツジ胚の免疫外科
的に分離された内部細胞塊の培養について発表している。Handysideらはそのよ
うな条件下でヒツジICMはES細胞様および内胚葉様の細胞の両領域を付着し、拡
散しまた発育させるが、培養期間の延長後は内胚葉様細胞のみの存在が明らかで
ある。

【００１３】 最近の報告によると、Chernyら.,Theriogenology,41:175(1994)では長期間培
養で維持された多能性ウシ原生殖細胞由来の細胞株について報告された。これら
の細胞は約７日間の培養の後、アルカリフォスファターゼ(AP)に対して陽性に染
色し胚体を形成する能力を示し、同時に少なくとも二つの細胞型に分化するES様
コロニーを作出した。報告によるとこれらの細胞はまた、包括的にES細胞によっ
て発現したと考えられているホメオボックス遺伝子の型である転写因子OCT4、OC
T6およびHESIに対するmRNAを表現した。

【００１４】 また最近、Campbellら.,Nature,380:64-68(1996)ではマウスのES細胞株の分離
を促進する条件下で９日目のウシ胚由来の培養された胚盤(ED)胞の核移入に続い
て生存している子ヒツジの作出が報告された。著者らは核移入によって９日目の
ウシ胚由来のED細胞が核移入によって全能性をもち、その全能性が培養液中で維
持されるという結論に達した。

【００１５】 Van Stekelenburg-Hamersら.,Mol.Reprod.Dev.,40:444-454(1995)ウシ胚盤胞
の内部細胞塊細胞由来の報告による永久細胞株の分離および特徴を報告した。著
者らは支持細胞および培養液がウシICM細胞の付着と生育を維持する為にもっと
も効果的であることを確認するために異なる条件下で８日目もしくは９日目のウ
シ胚盤胞由来のICMを分離し、培養した。彼らは培養されたICM細胞の付着および
生育がSTO(マウス線維芽細胞)支持細胞(ウシ子宮上皮細胞の代わりに)の使用に
よってまた培養液の補足として木炭で引き離し処理した血清(正常な血清よりむ
しろ)の使用によって亢進されるという結論に達した。しかしながら、Van Steke
lenburgらはそれらの細胞株が多能性ICM細胞より上皮細胞に似ているということ
を報告した。

【００１６】 Smithら.,WO 94/24274（1994年10月27日発行）,Evans ら.,WO 90/03432（1990
年4月5日発行）,およびWheelerら.,WO 94/26889（1994年11月24日発行）では形
質転換した哺乳動物を得るために利用することができる哺乳動物の幹細胞の分離
、選択および増殖について報告した。Evansらはまた形質転換した動物の作出に
有用であると断言できるブタおよびウシ由来の報告による多能性胚幹細胞の誘導
体化を報告した。さらにWheelerら.,WO 94/26884（1994年11月24日発行）はキメ
ラおよび形質転換した有蹄類の作出に有用であると断言できる胚幹細胞について
発表した。

【００１７】 このように前述の説明に基づいて、クローン化されたもしくは形質転換された
胚の作出および核移植における潜在的な利用のために多くの研究グループがES細
胞株を作出することを試みたことがあるということが明らかである。

【００１８】 従って、すでに文献の中で報告されたことであるが、ドナー核のような培養さ
れた分化した細胞を使用したブタをクローン化する方法の改良の必要性が存在す
る。

【００１９】 （発明の目的および概要） ドナー細胞もしくは核として抽出された分化した細胞および核を利用した核移
入によってクローンブタを作出する斬新な改良法を提供することが本発明の目的
である。おそらく、このような分化した細胞は、任意に遺伝的に一時変異された
G₁,G₂もしくはM細胞期の活発に***している、すなわち非休止状態の(増殖)細胞
を含むであろう。

【００２０】 分化したブタ細胞もしくはその核を脱核されたブタ卵母細胞あるいは割球に移
植することを含むブタをクローン化する斬新な方法を供給することが本発明のさ
らに個々の目的である。

【００２１】 すでに証明された遺伝子の有意性もしくは他の望ましい特徴を持つ成熟したブ
タを増やす方法を提供することが本発明の他の目的である。

【００２２】 遺伝工学的に処理されたもしくは形質転換したブタ(例えばNTユニット、胎児
、産子）を作出する改良法を供給することが本発明の他の目的である。本発明は
またこのような方法で作られたものを含む遺伝工学的に処理されたもしくは形質
転換した子ブタを提供する。

【００２３】 NTユニットの形成のために分化した子ブタ細胞もしくは細胞核の利用に先だっ
て分化した子ブタ細胞あるいは細胞核に適切なDNA配列を挿入し、除去しもしく
は一時変異させる遺伝工学的に作った、または形質転換した子ブタを作出する方
法を供給することが本発明のさらに個別の目的である。本発明はまたこのような
方法によって作出された遺伝工学的に作られた子ブタあるいは形質転換した子ブ
タを提供する。

【００２４】 脱核した子ブタ卵母細胞もしくは割球内に分化した子ブタ細胞の核あるいはそ
の分化した子ブタ細胞を移植することを含む子ブタCICM細胞を作出し、またその
後多能性CICM細胞を作出するために結果として生じたNTユニットを利用する斬新
な方法を供給することが本発明の他の目的である。本発明はまたこのような方法
によって作出された多能性子ブタCICM細胞および細胞株を提供する。

【００２５】 治療もしくは診断の為にこのような子ブタCICM細胞を利用することが本発明の
他の目的である。

【００２６】 細胞、組織もしくは器官移植が治療的あるいは診断的に有益であるあらゆる疾
患の治療もしくは診断のためにこのような子ブタCICM細胞を利用することが本発
明の個々の目的である。CICM細胞は例えばヒトの治療のためのように同じ種の中
であるいは種を超えて利用される可能性がある。

【００２７】 細胞、組織もしくは器官移植が治療的あるいは診断的に有益であるあらゆる疾
患の治療もしくは診断のために子ブタNTユニット、胎児もしくは産子由来の細胞
もしくは組織を利用することが本発明の他の目的である。このような疾患および
障害はパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、ALS、脊椎損傷、多
発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、火傷、脈
管系疾患、尿路疾患、免疫欠損症の治療のためだけでなく、骨髄移植、癌、他の
疾患と合併しているもの等である。その組織は同じ種の中でもしくは種を超えて
利用される可能性がある。

【００２８】 分化した細胞、組織もしくは器官の作出の為に本発明により作出された子ブタ
NTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブタCICM細胞由来の細胞または組織
を利用することが本発明の他の個々の目的である。

【００２９】 in vitroにおいて、例えば細胞分化の研究および検定の目的のために、例えば
医薬品研究のために本発明により作出された子ブタNTユニット、胎児または産子
、もしくは子ブタCICM細胞由来の細胞あるいは組織を利用することが本発明の他
の個々の目的である。例えば、子ブタCICMはSCIDマウスに導入することが可能で
ある。

【００３０】 移植治療の改良法を供給する為に子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、ある
いはブタCICM細胞由来の組織このような組織から産出された細胞、組織もしくは
器官を利用することが本発明の他の個々の目的である。このような治療には例と
してパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、ALS、脊椎損傷、多発
性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、火傷、脈管
系疾患、尿路疾患、免疫欠損症の治療のためだけでなく、骨髄移植、癌、他の疾
患と合併しているものを含む疾患および障害の治療等がある。

【００３１】 NTユニットの形成のために分化した子ブタ細胞もしくは細胞核の利用に先だっ
て分化した子ブタ細胞あるいは細胞核に適切なDNA配列を挿入、除去または一時
変異させることによって作出されたNTユニット、胎児または産子、もしくは子ブ
タCICM由来の遺伝工学的に作られたあるいは形質転換した組織を提供することが
本発明の他の目的である。

【００３２】 とりわけ上記に確認された疾患と障害の治療および/もしくは予防のために、
遺伝子治療のために本発明によって作出された子ブタNTユニット、胎児または産
子、もしくは子ブタCICM細胞由来の形質転換したあるいは遺伝工学的に作られた
組織を利用することが本発明の他の目的である。

【００３３】 本発明により作出された子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブ
タCICM細胞由来の組織、あるいは核移植の為の核ドナーとして本発明により産出
された子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブタCICM細胞由来の形
質転換したあるいは遺伝工学的に作られた組織を利用することが本発明の他の目
的である。

【００３４】 薬理学的に重要なタンパクを作り出すために本発明により作出された形質転換
したまたは遺伝工学的に作られた子ブタ産子を利用することが本発明の他の目的
である。

【００３５】 従って、一つの側面として、本発明は子ブタをクローン化する（例えば胚、胎
児、産子）方法を提供する。この方法は次のものを含む： (i)核移入（NT）ユニットの形成に適した条件下で任意に脱核された子ブタ卵母
細胞、もしくは割球内に適切な分化した子ブタ細胞あるいは細胞核を挿入するこ
と； (ii)もしレシピエントの子ブタ卵母細胞あるいは割球が前もって脱核されていな
かったならば、前記の子ブタ卵母細胞あるいは割球から内生核を除去すること； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)NTユニットが胎児内に発生するように宿主の子ブタに前記の培養されたNTユ
ニットを移入すること。

【００３６】 任意に、２細胞発生期より以降の段階になるまで活性核移入ユニットを培養す
る。培養液はNT胚発生を促進するよく知られた置換基、例えばホルモン、塩を含
有し、またさらに任意にアポトーシス、例えばカスパーゼ阻害剤を抑制する化合
物の存在下で任意に培養される。しかしながら、このことはNT活性化のあと直ち
に結果として生じた胎児の発生によって移入できる一つの細胞NT胚としては必要
ではない。

【００３７】 さらに、宿主の子ブタはクローン胚の発生を促進するために任意に「ヘルパー
胚」、例えば正常ブタ胚、単為発生の胚、もしくは四倍体胚を含む。ヘルパー胚
数は好ましくは２から約100まで、好ましくは２から50まで、さらに好ましくは
２から10個の胚であろう。

【００３８】 胎児の細胞、組織および/もしくは器官は細胞、組織および/もしくは器官移植
、あるいは適切な遺伝子型の作出の領域で有利に用いられる。

【００３９】 本発明はまた任意に脱核された卵母細胞もしくは割球の中に分化した子ブタ細
胞あるいは細胞核を挿入することに先だってその方法によって適切なDNA配列を
分化したブタ細胞または細胞核に挿入、除去もしくは一時変異する遺伝工学的に
作られたあるいは形質転換した子ブタをクローン化する方法を含む。このような
方法によって作出された遺伝工学的に作られたあるいは形質転換した子ブタは細
胞、組織および/もしくは器官移植、適切な遺伝子型の作出、および薬剤タンパ
クの作出の領域で有利に利用される。

【００４０】 もしクローン化した胎児、胚、もしくは産子が移植のための細胞、組織あるい
は器官を作出するために利用される予定であるならば、拒絶の危険性を抑制する
ために一つ以上の遺伝子一時変異を導入することがまた望ましい。例えば個々の
炭水化物エピトープが拒絶反応、すなわち血管内皮のGa1αl-Galに含まれるとい
うことが知られている。したがって、これらのエピトープをコードし、もしくは
ヒトタンパクに存在する他の炭水化物エピトープ(「競合的グリコシル化」)によ
ってこのようなエピトープを置換する(例えば遮蔽する)遺伝子をノックアウトす
ることが有利である可能性がある。とりわけ、αGal発現の90%を削減するために
、90％のヒトがそれに対して抗体を作らないヒト組織血O(H)抗原に対する遺伝子
の導入が一つの選択肢である。他方、αGalエピトープは、好ましくは強力に制
御できるあるいは構成要素であるプロモーターの制御下で発現したα-ガラクト
シダーゼに対してin vivoでcDNAを導入することによって酵素的に除去される可
能性がある。また他の選択肢は、例えば相同組み換えによるガラクトシル転移酵
素の発現を除去することである。またこのことは新しい炭水化物エピトープを導
入する際ノックアウトによって、あるいは酵素的にこれらのエピトープを除去す
ることが望ましい。

【００４１】 また、主要な組織適合性複合体(MHC)クラスI抗原が免疫反応を引き出すという
ことが知られているため、このような発現、例えばβ₂-マイクログロブリン(構
築及び発現の為に必要なクラスI分子の一部を形成するぺプタイド)、プロテアソ
ームのサブユニットLMP-2及びLMP-7、および/もしくはペプタイド輸送体TAP-1お
よび/もしくはTAP-2(細胞表面への輸送の開始時に小胞体の膜を通ってTAP-1およ
びTAP-2がペプタイド断片を輸送する)に含まれる遺伝子の発現を除去することが
望ましい。

【００４２】 またさらに、IL-4、可溶性CTLA-4、CTLA4-Ig、抗-CD40、抗-CD40-L(CD154)、
レセプターリガンド対の他の阻害剤もしくはFasリガンドのような抑制性サイト
カインのドナー組織における局所的な発現の上記の生理学的ダウンレギュレーシ
ョンが、例えば移植された異種移植片に対して耐性を誘導することによって拒絶
反応を抑制する可能性がある。また内皮細胞活性化に関連した炎症前薬物治療を
中止させるためにまたアプトーシスからドナー細胞、組織および器官を保護する
ために、保護遺伝子の発現を亢進することにより拒絶反応が予防もしくは抑制さ
れる可能性がある。例えば、ストレス反応性遺伝子ヘム(HO-1)の発現は異種移植
の生存数を高めることができる。また、例えば転写活性を阻害する抗アポプトー
シス遺伝子が異種移植の生存数を亢進するために過剰発現する可能性がある。ア
ポプトーシスを抑制する多くの遺伝子をクローン化し配列した。

【００４３】 またさらに、内生ブタレトロウィルスは宿主ゲノム内に挿入しているこのよう
な配列の危険性を予防するために除去される可能性がある。

【００４４】 また、補体活性化が過敏性の拒絶反応の臨界メディエーターであるため、この
経路は遺伝的一時変異によって抑制される可能性がある。特に、補足カスケード
は崩壊促進因子(DAF、CD55)、通常補足カスケードのさまざまな段階で阻害剤と
して働く膜補助因子(MCP、CD46)を含む一群の内皮タンパクによってしっかりと
制御されていることが知られている。これらのタンパクは制限された活性をもつ
。すなわちそれらは相同性（同種)標的分子に働くだけである。したがってブタ
組織の血管内皮のヒト補体抑制タンパク(例えばDAF、MCP）をコードする遺伝子
を導入することが有益であろう。また、最適な結果、すなわち拒絶反応をひきお
こす力が非常に小さい細胞、組織もしくは器官を作出することを得るためにこれ
らの遺伝的方法を組み合わせることが有益であろう。

【００４５】 またさらに、細胞、組織もしくは器官は移植の前に耐性を誘導するためにレシ
ピエントへの移植に先だって、ドナー細胞および他の薬剤、例えばCTLA-4 Ig、
免疫毒素、抗CD40-Lの存在下でin vitroで培養される可能性がある。

【００４６】 もちろん、例としてシクロスポリン、グルココルチコイド、FK-506、ラパマイ
シン、イムラン、およびそれらの誘導体を含む移植後の抗拒絶反応剤を投与する
ことがさらに必要であろう。

【００４７】 前記の方法によって得られたブタ及びそれらのブタの産子が本発明により提供
される。

【００４８】 他の側面として、本発明はブタCICM(多能性)細胞を作出するための方法を提供
する。その方法は次のものから成る： (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で任意に脱核した子ブタ卵母細胞
もしくは割球内に適切な分化した子ブタ細胞もしくは細胞核を挿入すること； (ii)もし前もって脱核されていない場合卵母細胞もしくは割球の内生核を任意に
除去すること； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)子ブタCICM細胞を得るために前記の培養したNTユニットから得られた培養細
胞。

【００４９】 任意に、活性化された核移入ユニットは２細胞発生期より以降の段階になるま
で活性化された核移入ユニットは培養する。結果として生じた子ブタCICM細胞は
細胞、組織および器官移植の領域で有利に利用される。

【００５０】 下記で明らかになるであろう本発明の前述のおよび他の目的、利点および特徴
により、本発明の性質は次の好ましい具体例の詳しい説明および補遺の請求項を
参考にすることによってさらに明らかに理解できるであろう。

【００５１】 （本発明の詳細な説明） 本発明は核移入もしくは核移植によるクローン子ブタに対する改良法を提供す
る。この申請書の中で核移入もしくは核移植あるいはNTは互換性をもって利用さ
れる。

【００５２】 本発明により、分化した子ブタ細胞由来の細胞核を脱核したブタ卵母細胞また
は割球の中に移植する。胎児および産子を作出するためにレシピエントの雌の中
に移入できるクローン胚の発生を方向づけるために核を再プログラムし、もしく
はCICM細胞を作出するために利用する。クローン胚はまたキメラ胚、胎児および
/もしくは産子を作出するために受精胚と結合することができる。

【００５３】 クローニング工程においては先行技術の方法には胚細胞型が用いられる。これ
はCampbellら(Nature,380:64-68,1996)およびSticeら(Biol.Reprod.,54:100-110
,1996)による研究を含む。これらの両研究において胚細胞株は妊娠10日以前の胚
由来のものであった。両研究において細胞はクローニング工程に利用されるため
にドナー細胞の明白な分化を妨げる支持細胞層上で維持した。本発明には分化し
た細胞を使用する。

【００５４】 報告によればヒツジ由来の成熟細胞および胎児線維芽細胞がヒツジ産子を産出
するために利用された(Wilmutら,1997）。しかしながら複数の研究では子ブタの
クローン化はヒツジのクローン化よりさらに困難であることが示されている。実
際に哺乳類の種の研究ではヒツジのクローン化はもっとも容易であるように見え
、また子ブタのクローン化はもっとも困難であるように見える。従って、本発明
による分化した細胞型、好ましくは活発に***している非休止状態の細胞、すな
わちG₁、G₂、もしくはM細胞期、を用いた子ブタのクローン化の成功は予期しな
い結果である。

【００５５】 したがって、本発明により、子ブタの優位の遺伝子型の増殖が可能である。こ
れによって証明された遺伝的優位もしくは他の望ましい特徴をもった成熟した子
ブタの増殖が可能になるであろう。遺伝的工程が子ブタにおいて促進されるであ
ろう。本発明によって、10億もの胎児もしくは成熟した子ブタ細胞を潜在的にク
ローニング工程のために取り入れ利用することが可能である。このことにより結
果として短期間で多数の同一の産子が生じるであろう。

【００５６】 本発明はまたクローン化によって増殖させることが可能な細胞源との作用によ
る形質転換工程の簡易化を可能にする。これによって未分化状態の細胞を維持す
る必要性がなくなる。従って、無作為な組込みおよびジーンターゲティングの両
方の遺伝的一時変異がさらに簡単に実施される。またin vitroで核移入をこれら
の細胞の一時変異および選択能力と組み合わせることによって、この工程は過去
の形質転換胚法よりさらに有効である。本発明により、さらに形質転換工程を簡
易化しまた促進して、サイトカイン、調整された培養液および/もしくは支持細
胞層なしに、これらの細胞をクローン化によって増殖できる。移入された細胞が
本発明によりクローン化工程において利用される場合、胎児および産子に発生す
ることが可能な形質転換された子ブタの胚が作出される。また、これらの形質転
換したクローン胚はCICM細胞株もしくは他の胚細胞株を作出するために利用でき
る。従って、本発明により遺伝工学技術に貢献する未分化細胞株をin vitroで誘
導および維持する必要性がなくなる。

【００５７】 好ましい具体例として、複合体遺伝子一時変異のために個々に適用できる適切
な分化した細胞は遺伝的に好ましくは組織培養において一時変異されるであろう
。クローン胎児もしくは哺乳動物を作出するために利用されるこれらの遺伝的に
一時変異した細胞、および分化した細胞はその後、追加的な遺伝的一時変異の影
響をうけて、また結果として生じた2回遺伝的に一時変異した細胞はクローニン
グのための細胞および核ドナーとして利用されて、クローン胎児もしくは哺乳類
から誘導される。発明者が「再クローニング」と呼ぶこの工程は相当な時間を必
要とする複合体遺伝的一時変異の作出のために有用である。本質的に、クローニ
ングの前に、別々の段階でこのような遺伝的一時変異を生じることによって、す
べての適切な遺伝的一時変異を生じる前に、潜在的に老化した細胞の問題なしに
適切な遺伝的一時変異を作出することは可能である。理論上、この工程を必要な
だけ何回も繰り返すことが可能である。

【００５８】 本発明により作出された形質転換したCICM細胞はin vitroで無期限に維持する
ことが可能で、それによって適切な分化した細胞型を後に作出するために未分化
多能性細胞を無制限に補給する。好ましい具体例として、これらのCICMは普通に
与えられた米国特許No.5,905,042,の中に開示された方法により未分化状態で維
持されるであろう。これは全体的にこの文書の中に具体的に示されている。

【００５９】 本発明はまた、例えば細胞、組織および器官移植に利用できるクローン子ブタ
の胎児、産子もしくはCICM細胞を作出するために利用できる。子ブタ由来の胎児
もしくは成熟細胞を採取することおよびクローニング工程の中でそれを利用する
ことによって、様々な細胞、組織およびおそらく器官は器官形成により発生する
ためそれらはにクローン胎児から得られる。細胞、組織、および器官は同様にク
ローン産子から分離が可能であるこの工程は細胞および遺伝子治療を含む多くの
医学的および獣医学的治療のための「物質」の源を提供する。もし細胞が誘導さ
れた哺乳動物に細胞を移入しもどすなら、その後の免疫学的拒絶反応は消失する
。また、多数の細胞型をこれらのクローンから分離することが可能であるため、
造血キメラ現象のような他の方法では種間と同様に同じ種の動物の間で免疫拒絶
反応を避けるために利用できる。

【００６０】 このように、一つの側面として、本発明は子ブタのクローニング法を提供する
。一般的に、子ブタは次の段階を含む核移入工程によって作出されるであろう：
(i)ドナー核もしくはドナー細胞源として利用するための適切な分化した子ブタ
細胞を入手すること； (ii)子ブタ卵母細胞もしくは割球； (iii)任意に脱核している前記の卵母細胞あるいは割球； (iv)適切な分化した細胞もしくは細胞核を、例えば点滴あるいは注射によって、
NTユニットを形成するために、任意に脱核した卵母細胞または割球内に移入する
こと； (v)もし前もって脱核していない場合、内生卵母細胞もしくは割球を除去するた
めにＮＴユニットを脱核すること； (vi)結果として生じたNTユニットを活性化すること；および (vii)NTユニットが胎児内に発生するように前記の培養したNTユニットを宿主の
子ブタに移入すること。

【００６１】 任意に、活性化された核移入ユニットは２細胞発生期より以降の段階まで培養
する。また、宿主のブタは、1個以上の「ヘルパー」胚を含有するであろう。そ
れは例えば正常子ブタ胚、四倍体胚、もしくはクローン胚の発生を促進するため
の単為発生胚である。

【００６２】 本発明はまた適切なDNA配列が、任意に脱核された卵母細胞あるいは割球の中
に分化した子ブタ細胞もしくは細胞核を挿入する前に、分化したブタ細胞もしく
は細胞核に挿入、除去もしくは一時変異される遺伝工学的に作られたもしくは形
質転換した子ブタのクローニング法を含む（脱核はドナー細胞もしくは核の挿入
の後起こる）。

【００６３】 また上記の手法によって得られたクローンブタおよびそれらのブタの産子は本
発明によって提供される。すでに形質転換した受精ブタと対照的に、これらのク
ローンは核移入ドナーとして利用されるすでに存在している分化した細胞を含む
であろう。

【００６４】 上述の利用法に加えて、本発明による遺伝工学的に作られたもしくは形質転換
したブタは、薬理学的に重要なタンパクのような適切なタンパクを作出するため
に利用することができる。その上適切なタンパクは形質転換したブタの乳もしく
は他の体液または組織から分離することが可能である。他方、外生のDNA配列に
より、疾患に対する抵抗力、体脂肪の減少、赤身の肉製品の増加、飼料の転換の
改善、もしくは産子の去勢比率のような、形質転換したブタに対する農学的に有
用な特徴がもたらされる可能性がある。また、外生のDNAは例えばヒトのような
非相同性宿主におけるこのような細胞の拒絶反応を抑制する一つ以上のDNAをコ
ードする可能性がある。個々の好ましい具体例として、ブタは一つ以上のヒト遺
伝子、例えば好ましくはブタと同等の動物の助けになるように挿入されたコラー
ゲン、免疫タンパク、ホルモン、酵素、凝固因子のようなコードした構造タンパ
クを発現するであろう。もしブタ同等動物の中にヒト因子VIIIが発現するならば
、例えばブタ因子IIIのような相同性ブタタンパクを除去する必要をなくすよう
な、後のヒトタンパクの回収が上述の特徴によって促進されるであろう。

【００６５】 本発明はさらに細胞、組織および器官移植の領域におけるNT胎児とNTおよびキ
メラ産子の利用法を提供する。

【００６６】 他の側面として、本発明は子ブタCICM細胞を作出するための手法を提供する。
その手法は次のものから成る。 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に脱核したブタ卵母細胞
もしくは割球の中に適切な分化したブタ細胞もしくは細胞核を挿入すること； (ii)もし前もって除去しない場合内生の卵母細胞もしくは割球の核を除去するこ
と； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)子ブタCICM細胞を得るための前記の培養されたNTユニット由来の培養細胞。

【００６７】 上述のように、好ましい培養工程は米国特許No.5,905,042の中で開示されてお
り、全体的にこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。任意に、活性化
された核移入ユニットを2細胞発生期より以降の段階まで培養する。

【００６８】 ブタCICMは細胞、組織および器官移植の領域において、あるいは形質転換した
胎児または産子も含めて、胎児もしくは産子の作出に有益に用いられる。

【００６９】 この文書の中で用いられたように、胎児は子宮のなかで形づくられた後の胎生
哺乳動物の胎内の子である。ブタにおいては、胎児期は受胎の後30日から誕生ま
での間である。哺乳動物では誕生から死亡までの間が成熟期である。

【００７０】 任意に、NTユニットは少なくとも2個から400個の細胞の大きさまで、好ましく
は4個から128個の細胞まで、最も好ましくは少なくとも約50個の細胞まで培養す
る。

【００７１】 核移入法もしくは核移植法は文献のなかでよく知られており、また本発明の背
景の中で引用した多くの参考文献の中に記載されている。個別的には、Campbell
ら, Theriogenology, 43 : 181 (1995); Collasら, Mol. Report Dev., 38 : 26
4-267 (1994); Keeferら, Biol. Reprod., 50 : 935-939 (1994); Simsら, Proc
. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274,
およびWO 90/03432である。これらはこの文書の中の参考文献に具体的に示され
ている。また、米国特許Nos.4,944,384および5,057,420ではウシ核移植の工程に
ついて述べられている。

【００７２】 分化したとは周囲の構造もしくは起源の細胞とは別の特徴または機能をもつ細
胞を表す。分化した子ブタ細胞は初期胚期を過ぎた細胞である。さらに個別には
分化した細胞は少なくとも胚盤期（ウシ胚形成の10日目）を過ぎた時からの細胞
である。分化した細胞は外胚葉、中胚葉あるいは内胚葉由来である可能性がある
。

【００７３】 好ましい具体例として、分化した細胞は活性増殖(非休止状態の)細胞、すなわ
ちG₁、G₂もしくはM細胞期である。このような細胞は直接成熟したあるいは胎児
のブタから得られる可能性があるか、もしくはin vitroで培養組織から分離され
る可能性がある。またさらに、このような分化している細胞は、ブタ以外の動物
、たとえばブタ免疫細胞を移植されたSCIDマウス由来である可能性がある。適当
な分化した細胞は体細胞および 生殖細胞を含むドナー細胞もしくは核、および
それら由来の核と同様に有益である。

【００７４】 子ブタ細胞は周知の方法によって得られる。本発明で 有用な子ブタ細胞は、
例として上皮細胞、積細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン細胞、造血細胞、
メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球(BおよびTリンパ球)、赤血球、樹状細胞、マ
クロファージ、単球、単核細胞、および他の免疫細胞、線維芽細胞、心筋細胞、
および他の筋細胞等を含む。さらに、核移入のために用いられたブタ細胞は異な
る器官、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、
尿道および他の尿路器官等、別々の器官から得られる可能性がある。また、個々
の分化した細胞型に対する幹細胞は有用なドナー細胞、例えば造血管細胞である
可能性がある。これらは適当なドナー細胞のほんの一部の例にすぎない。適当な
ドナー細胞、すなわち本発明で有用な細胞は体のあらゆる細胞あるいは器官から
得られる可能性がある。上記のように、ドナー細胞は体細胞および生殖細胞の両
方を含むことを意味する。

【００７５】 例えば、生殖細胞の場合にこれはとりわけ原生殖細胞を含むであろう。

【００７６】 線維芽細胞は発生分化している胎児および成熟した子ブタから大量に得られる
ため理想的な細胞型である。線維芽細胞はある程度分化しまたそれ故にクローニ
ング工程で用いられる理想的でない細胞型であると以前は考えられていた。重要
なことに、これらの細胞はin vitroで急速な倍加時間で容易に増殖が可能でまた
ジーンターゲティング工程における利用のためにクローニングによって増殖でき
る。再び本発明は分化した細胞型が使用されるため斬新である。本発明はこれら
の細胞が容易に増殖され、in vitroで遺伝的に一時変異し選択されるため有益で
ある。

【００７７】 卵母細胞の分離の手法は専門家の間で良く知られている。本質的に、これは子
ブタの卵巣もしくは生殖器から卵母細胞を分離することを含むであろう。容易に
入手できる子ブタの卵母細胞源は標本源は畜殺場の材料である。

【００７８】 遺伝工学、核移入およびクローニングのような技術をうまく利用するために、
卵母細胞はこれらの細胞が核移入のためのレシピエント細胞として利用される前
にin vitroで成熟させることが可能である。この工程は一般的にブタ卵巣、例え
ば畜殺場で入手した子ブタ卵巣由来の回収した未熟(前記I)卵母細胞を必要とし
、また子ブタ卵巣の場合に一般的に卵母細胞が吸引後約35-45時間で起こる中期I
I期に達するまで、受精もしくは脱核する前に成熟培養液の中で卵母細胞を成熟
させることを必要とする。本発明の目的のために、この期間は「成熟期間」とし
て知られている。期間の計算のためにこの文書の中で用いられたように、「吸引
」は卵胞由来の未熟卵母細胞の吸引を表している。ブタ卵胞の吸引のためのこの
好ましいプロトコールは次の例の中に開示されている。

【００７９】 更に、in vivoで成熟させた中期II期卵母細胞は核移入法の中でうまく利用さ
れている。例えば、成熟した中期II卵母細胞は発情期の始まりの後あるいはヒト
絨毛性ゴナドトロピン(hCG)もしくは類似ホルモンの注射の後35時間から48時間
の雌ウシもしくは若い雌ウシから外科的に回収される。同様の工程が子ブタにお
いても利用できる。適当な工程について次の例の中に述べる。

【００８０】 脱核および核移入された卵母細胞の成熟期がNT法の好結果に対して有意である
と報告された。(例えばPrather ら Differentiation, 48,1-8,1991)。しかしな
がら、未熟卵母細胞はまた分化した細胞もしくは核と融合が可能で、移入胚を作
出するために使用できると期待されている。例えば、卵母細胞はin vitroで融合
の後成熟する可能性がある。しかしながら、一般に哺乳類胚クローニングの実施
の成功例においては、この段階で卵母細胞が受精した***を導入する場合のよう
に導入された核を処理するためにうまく「活性化される」可能性があるかまたは
うまく「活性化された」状態であると考えられているために、レシピエントの卵
母細胞として中期II期卵母細胞を利用する。家畜の場合に、卵母細胞活性化期は
一般に吸引後約16-52時間、好ましくは約35-45時間の範囲である。

【００８１】 例えば、未熟卵母細胞は適当な成熟培養液の中でin vitroで成熟することが可
能である。好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、ブタ卵母細胞はin vit
roで、例えばNCSU 37培養液中で約22時間その卵母細胞を置くことによって、pFF
β-メルカプトエタノール、システリン、EGF(表皮成長因子)、HCG/PMSG及びcAMP
、を補充することによって、in vitroで成熟する。それらはその後HECM/HEPES及
びショ糖で好ましくは3回洗浄し、その後ホルモンが除去される場合を除いて、
同様のNCSU 37培養液の中で約20時間置いた。好ましくはこれは４ウェルNuncプ
レートの中で起こる。

【００８２】 in vitro(例えば上記のように)もしくはin vivoで成熟が起こる可能性のある
成熟卵母細胞はまた好ましくは脱核の前に処理される。これは積細胞を除去する
ために実施する。これは好ましくはヒアルロン酸で維持し渦を作り出すことによ
って実施される可能性がある。

【００８３】 上述のように卵母細胞はin vivoにおいて成熟し、それに続いてin vivoにおけ
る卵母細胞成熟の形成を誘発しまたそのような成熟卵母細胞を回収することによ
って渦が生じる。例えば、雌ブタに代表的には約5日から6日後に、すなわち発情
期の24時間から36時間後にPG600および回収された成熟卵母細胞の注射を行うこ
とができる。これは畜殺場に送られた動物から子宮を除去し、その後卵管を切断
し、好ましくは適当な培養液をかけ、細胞塊を引き離すことによって行なわれる
。このことはin vitroにおける成熟卵母細胞に対する同様の方法、例えばヒアル
ロン酸で処理することによって行なうことができるであろう。

【００８４】 成熟後、もしin vitroで代表的には約30時間から50時間、好ましくは40時間か
かるならば、卵母細胞は好ましくはその後脱核される。しかしながら、脱核がド
ナー細胞もしくは核の移植のいずれかの後もたらされるためこのことは必要では
ない。上述のもしくは他の工程で作出された引き離された卵母細胞は好ましくは
極体を選別し、また選別された極体の存在によって確認された中期II卵母細胞を
好ましくは核移入のために利用する。分化した細胞もしくは核に対するドナーの
導入の前、もしくは後に脱核が起こる可能性がある。脱核は米国特許NO.4,994,3
84に記載したような良く知られた方法によって起こる可能性がある。それはこの
文書の中の参考文献に具体的に示されている。好ましい具体例として卵母細胞は
NCSU 23培養液(0.2567mg/10mlのショ糖)及びHXTに20分以上曝露されるであろう
。脱核はその後好ましくはサイトカラシンBを含有するHECM/HEPES及びショ糖(0.
2567mg/10ml)培養液の中で実施される。脱核の後、卵母細胞は適当な培養液、例
えばショ糖(0.2567mg/10ml)含むNCSU 23の中に置く。他方、中期II卵母細胞は任
意に7.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)及び0.15Mショ糖を含有するHECM中に置く
。任意にこれらの卵母細胞は適当な培養液、例えば39℃で5%CO₂のNCSU 23のよう
な胚培養液(例中の表を参照)の中で維持する可能性があり、またその後好ましく
はせいぜい24時間後に脱核される。

【００８５】 脱核は極体及び隣接した細胞質を除去するためにマイクロピペットを使用して
顕微外科的に実施される可能性がある。卵母細胞をうまく脱核されたものを識別
するために選別する。この選別は適当な染料、例えば1μg/mlの33342 Hoechst d
yeで、20分間適当な培養液、例えばNCSU 23中で卵母細胞を染色し、またその後
脱核が完了したかどうか、例えば紫外線放射下で10秒以下で卵母細胞を観察する
ことによって視覚的に確認し実施する。うまく脱核された卵母細胞はその後適当
な培養液、例えばNCSU 23及びショ糖(0.2567mg/10ml)、HECM及び0.15Mショ糖の
中に置くことが可能である。

【００８６】 本発明において、レシピエント卵母細胞は好ましくは成熟の開始の後約30時間
から50時間の範囲の時間で、更に好ましくは成熟の開始後約38時間から約46時間
、また最も好ましくは成熟の開始後約42時間の範囲の時間で脱核されるであろう
。

【００８７】 個々のブタの分化した細胞、例えば体細胞もしくは生殖細胞、子ブタ細胞もし
くは核、はその後NTユニットを作出する為に用いられる好ましくは脱核された卵
母細胞もしくは割球の卵黄周囲の空間に移入されるであろう。しかしながら、前
述のように脱核はもしそれが非常に望まれるならば融合の後に起こる可能性があ
る。子ブタ細胞および脱核された卵母細胞は専門家の間で良く知られた方法によ
ってNTユニットを作出する為に利用されるであろう。例えば、細胞は電気的融合
によって融合される可能性がある。電気的融合は細胞質膜の一過性の破壊を引き
起こすのに充分な電気的パルスを与えるすることによって行なわれる。細胞質膜
のこの破壊は急速に膜が再形成する為に非常に短い。このことから、もし二つの
隣接した膜が破壊のために導入され脂質の混ざり合った2層を再形成するならば
二つの細胞の間に小さなチャンネルが開くであろう。そのような小さな口の熱力
学的不安定性のために、それは二つの細胞が一つになるまで増大する。参考文献
はこの工程の更なる検討の為にPratherらによる米国特許4,997,384(この文書の
中に全体的に参考文献に具体的に示されている)に対して作られている。様々な
電気的融合培養液は例えばショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびリン酸緩
衝液を含有して用いることが可能である。融合はまた融合誘発剤(Graham, Wiste
r Inot. Symp. Monogr., 9,19, 1969)としてSendaiウィルスを用いて実施するこ
とができる。次の例の中で用いられた好ましい融合培養液はPh 7.0の0.28Mマン
ニトール、10μM CaCl₂、100μM MgSO₄及び10mMヒスチジンを含有する。

【００８８】 場合によっては(例えば小さいドナー核を持つ場合)電気穿孔法融合を用いるよ
りむしろ卵母細胞内に直接核を注射する方がより好ましい可能性がある。そのよ
うな方法はCollas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267(1994)の中に発
表されこの文書の中で全体的に参考文献の中に具体的に示されている。

【００８９】 他方、融合チャンバーの中に導入する前に、NTユニットは融合培養液に対して
HECMを2:1、1:2及び0:1の比率で含む3回のインキュベーションによって融合培養
液に徐々に曝露することが可能である。子ブタ細胞及び卵母細胞は様々な方法、
例えば卵母細胞成熟の開始の後約44時間に90-120V約30μsecの電気的パルスを用
いることによって500μmのチャンバーの中で処理することによって電気融合でき
る。融合の後、結果として融合されたNTユニットは5分間融合培養液の中で維持
しその後10分間HECMの中に置き、またその後活性化までNCSU 23+7.5mg/mlCB中に
置く。代表的には活性化はその後短時間に起こるであろう、代表的には24時間以
内及び好ましくは約1-9時間後、更に最も好ましくは2時間後に生じるであろう。

【００９０】 現在、好ましいプロトコールはプロナーゼで処理した任意に脱核した卵母細胞
を移入することである。好ましくは約400μl/lのウェル、及びその後適当な培養
液例えばHECM/HEPES中で希釈し、その後好ましくは4分間約6kRPMで遠心分離し適
当な培養液例えばHECM/HEPESの中で懸濁した。他方卵母細胞は上記のような同じ
解離条件を用いてTEで処理することが可能である。

【００９１】 好ましい本プロトコールにおいて、ドナー核もしくは細胞の移入が適当な培養
液、例えばHECM/HEPES+ショ糖(0.2567mg/10ml)の中で起こる。移入が完了した後
結果として生じたNT胚をその後適当な培養液、例えばショ糖(0.2567mg/10ml）を
含むNCSU 23に移入する。NT胚をその後融合し好ましくは適当な融合培養液の中
で約30μ秒の間110Vの電流を適用することによって融合する。上述のように好ま
しい本融合培養液は500mlのSigma水、0.28マンニトール(25.51g)、100μM MgSO₄ (0.0123g）、及び100mMヒスチジン(0.776g)を含む。しかしながら、他の良く知
られた融合培養液は他の物に代用できる。好ましくは、融合されたNTユニットを
その後活性化の前に約2時間適当な培養液、例えばHECM/HEPESの中に置きその後N
CSU 23及びサイトカラシンB(3μl/2ml)の中に置く。

【００９２】 任意に一つ以上のカスパーゼ阻害剤が成熟期、処置(積細胞の引き離し)の間お
よび/もしくは胚細胞発生および生存している産子の作出を亢進させるための活
性化の間用いられる可能性がある。その例はキャスパーゼ３、キャスパーゼ８、
およびキャスパーゼ９を含む。

【００９３】 NTユニットは周知の方法によって活性化される可能性がある。活性化はそれ以
前に、同時に、もしくはその後結果として起こる可能性がある。本質的にNTユニ
ットに対して冷たいもしくは実際には涼しい温度刺激を適用することによって、
このような方法には例えば準生理学的温度でNTユニットを培養することが含まれ
る。このことは胚が正常に曝露される生理学的温度条件に完全に関連した室温で
NTユニットを培養することによってもっとも便宜的に実施される可能性がある。

【００９４】 適当な活性化プロトコールは次のものを含む： １．イオノマイシンおよびDMATによる活性化 １−卵母細胞を４分間２ｍMのDMAPを加えたイオノマイシン(５μM)中に置く ； ２−卵母細胞を４時間２ｍMのDMAPを加えた培養液の中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く ２．イオノマイシンDMAPおよびロスコビチンによる活性化 １−卵母細胞を４分間２ｍMのDMAPを加えたイオノマイシン(５μM）中に置 く； ２−卵母細胞を３時間２ｍMのDMAPおよび200(μM)のロスコビチンを加えた 培養液中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く。 ３．イオノマイシンに対する曝露の後サイトカラシンおよびシクロヘキシミドに
対する曝露による活性化 １−卵母細胞をイオノマイシン(５μM)中に４分間おく； ２−卵母細胞を５時間５μg/mlのサイトカラシンBおよび５μg/mlのシクロ ヘキシミドを含む培養液の中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く ４．電気的パルスによる活性化 １−卵を100μMCaCl₂を含むマンニトール培養液中に置く； ２−20μsecの間、個々のパルスは22分間隔で1.0ｋVcm^-1の３パルスを送る
； ３−卵母細胞を３時間５μg/mlのサイトカラシンBを含有する培養液に移す ５．エタノールに対する曝露のあとサイトカラシンおよびシクロヘキシミドに対
する曝露による活性化 ２−卵母細胞を１分間７％エタノール中に置く； ３−卵母細胞を５時間５μg/mlのサイトカラシンBおよび５μg/mlのシクロ ヘキシミドを含有する培養液に移す； ４−４回すすぎ、培養液中に置く。 ６．アデノフォスチンのマイクロインジェクションによる活性化 １−卵母細胞を10μMのアデノフォスチンを含む10-12ピコリットルの溶液と ともに注射する； ２−卵母細胞を培養液中に置く。 ７．***因子のマイクロインジェクションによる活性化 １−卵母細胞を霊長類、子ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラッ ト、ウサギもしくはハムスターのいずれかから分離され た10-12ピコリットルの***因子を注射する； ２−卵を培養液中に置く。 ８．組み換え***因子のマイクロインジェクションによる活性化。 ９．DMAP/イオノマイシンどちらかのプロトコール

【００９５】 卵母細胞もしくはNTユニットを約１時間代表的には成熟後約22-28時間約２ｍM
の DMAPの中におき、その後約2-12時間、好ましくは８時間、５μg/mlのサイト
カラシンBおよび20μg/mlのシクロヘキシミドの中でインキュベートする。

【００９６】 活性化をもたらすこの好ましい方法は３段階の活性化プロトコールによる１mg
/mlの BSAを含むHECM/HEPES(H/H)培養液の中で実施される。最初の段階では、N
T融合物は約４分間10μｍイオノマイシン(４μl/2ml)を含有する前記のH/H BSA
培養液の中におき、その後前記のH/H培養液のすすぎ、またその後NT融合物を約3
0分間DMAP(１μl/ml)を含有するNCSU 23中に置く。第二の段階では、NT融合物を
再び１mg/ml BSAを含有し、また５μMイオノマイシンを含有するH/H培養液の中
に約４分間置き、その後H/H中ですすぎ、また約30分間NCSU 23とDMAP(１μl/ml)
中にすすいだ卵母細胞を置く。第三の段階ではNT融合物を２時間１mg/ml BSAを
含有し、さらに５μMイオノマイシンおよびDMAP(１μl/ml)を含有するH/Hのなか
に再び置く。このような活性化プロトコールの後、活性化されたNTユニットを好
ましくは適当な培養液、例えばNCSU 23培養液に移入する。この培養液、もしく
は他の適当な培養液は必要に応じて、代表的には約３日目に交換する。５日目に
好ましくは約５％のFBSを加え、またNTユニットを胚盤胞を形成できるように培
養する。しかしながら、上記の検討のようにNT胚は作出のあと完全に直ちに移入
することができる。すなわち１細胞期の間に１日目に移入が成功するであろう。

【００９７】 他方、子ブタNTユニットはpH7.0の0.28Mマンニトール、100μM CaCl₂、100μM
MgSO₄および10ｍMヒスチジンを含有する活性化培養液中で30μsecの間30Vの電
気的パルスの適用によって500μｍチャンバー内で活性化できる。１時間後15Vの
２番目のパルスが30μsecの間適用される。パルスとパルスの間にNTユニットは3
9℃５％CO₂でCBを加えたNCSU 23中で維持する。

【００９８】 さらに他方、活性化は周知の活性化剤の適用によって実施される可能性がある
。例えば、受精もしくは***の細胞に含まれる因子の活性化の間に***による卵
母細胞の透過によってNTユニットを活性化できる。また電気的もしくは化学的シ
ョック、カルシウムイオノホアおよびプロテインキナーゼ阻害剤のような処置は
融合の後NT胚を活性化するために利用される可能性がある。

【００９９】 さらに他方、４分間５μMイオノマイシンを含有するHECM/HEPES中にNTユニッ
トをおくことによって、またその後HECM/HEPESの中で３回洗浄し、その後約４分
間イオノマイシンを加えたHECM/HEPES＋サイトカラシンB中に置き、HECM/HEPES
中で３回洗浄しそのあと約３時間２mMのDMAP(6-ジメチルアミノプリン)を含有す
るNCSU 23中に置くことによって、融合の後約１−２時間化学的活性化が起こる
可能性がある。その後、好ましくは胚移入に先だってNTユニットをHECM/HEPES中
で約３−４回洗浄し、またその後NCSU 23中に置く。

【０１００】 さらに他方、活性化の後、NTユニットをNCSU 23＋CB中で３-4時間培養し、そ
の後、CBなしにNCSU 23中で培養することが可能である。前述のようにNTユニッ
トは活性化のあといつでも雌のレシピエントに移入できる。

【０１０１】 他方、活性化されたNTユニットはその後、CICM細胞および細胞コロニーを作出
するためにin vitroで適当な培養液の中で培養する可能性がある。胚の培養と成
熟に適した培養液は専門家にはよく知られている。よく知られた培養液の例はHa
m’s F-10＋10％胎児子ウシ血清(FCS)、Tiissue Culture Medium-199(TCM-199)
＋10％胎児子ウシ血清、Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate(TALP), Dulvecco’
s Phosphate Buffered Saline(PBS), Eagle’s and Whitten’s media.を含む。
卵母細胞の回収および成熟のために用いられた最も共通の培養液の一つはTCM-19
9および１から20％の胎児子ウシ血清、新生児血清、発情期ウシ血清、子ヒツジ
、ブタ、もしくは去勢雄ウシの血清を含む血清補充液である。好ましい維持培養
液はEarl塩を加えたTCM-199、10％胎児子ウシ血清、0.2ｍM ピルビン酸ナトリウ
ムおよび50μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含む。さらに好ましくは、使用された
培養液はNCSU 23であり、また活性化の後２から５日NTユニットを新鮮なNCSU 23
および５から10％胎児子ウシ血清中で培養する。上記のいずれもまた顆粒膜細胞
、卵管細胞、BRL細胞、子宮の細胞、およびSTO細胞のようなさまざまな細胞型を
もった共生培養組織を含む。

【０１０２】 他の維持培養液はRosenkrans,Jr.らに発行された米国特許5,096,822の中に述
べられており、それはこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。CR1と
名づけられたこの胚培養液は胚を維持するために必要な栄養物質を含む。

【０１０３】 NTユニットが雌のレシピエントに移入され、もしくはCICM細胞または細胞コロ
ニーを作出するために利用される適切な大きさに達するまで、NTユニットをNCSU
23＋５から10％ FCS中で培養することができる。例えば、これらのNTユニット
を少なくとも約２個から400個の細胞、さらに好ましくは約４個から128個の細胞
、またもっとも好ましくは少なくとも約50個の細胞になるまで培養できる。他方
、１細胞であるNT胚はレシピエントの雌、すなわち活性化の最初の日に作出され
た雌に導入できる。培養は適当な条件下、すなわち約38.5℃、５％CO₂で行なわ
れ、また培養液は代表的には約２-５日ごとに、好ましくは約３日ごとに成長を
最適にするために交換することが可能である。

【０１０４】 本発明における胚移入およびレシピエントの哺乳動物の処置の方法は胚移入産
業において利用される標準的工程を用いて実施することが可能である。同時移入
が望ましい、すなわちNT胚の段階はレシピエントの雌の発情サイクルと同時発生
する。この有益性およびレシピエントの維持方法についてWallら(“Development
of porcine ova that were centrifuged to permit visualization of pronucl
ei and nuclei, “ Biol. Reprod., 32:645-651(1985))の中で検討されている。
その内容はこの文書の中の参考文献のなかに具体的に示されている。

【０１０５】 すでに検討されたように、レシピエントの雌はまた「ヘルパー」胚を含むとい
うことは望ましいが必要ではない。このようなヘルパー胚は例えば自然のもしく
は人工的な方法によって作出された正常のブタ胚、単為発生胚(生存している産
子を作らない活性化された非受精胚)、および四倍体胚を含む。このことはクロ
ーンブタの発生と維持を亢進する為に確認された。

【０１０６】 このようなへルパー胚の数は有意に、すなわち約１から２から100くらいまで
で変更できる。これらのヘルパー胚がクローン胚の発生および/もしくは移植を
亢進する物質、例えばホルモン、成長因子を作出する可能性があるという仮説が
立てられている。単為発生へルーパー胚もしくは四倍体ヘルパー胚の有益性は生
存可能な産子の中で発生する産子のみがクローンであるということである。しか
しながら、クローン産子の産出を遺伝解析、例えばPCRもしくはクローンDNA配列
の発現または存在を検出することによって、例えば原位置のハイブリッド形成に
より、もしくはクローンDNAの発現を検出することにより、例えばラベルされた
抗体もしくは他のプローブの利用によって立証することが可能である。

【０１０７】 前述のように、本発明は個々に遺伝工学的に作られたもしくは形質転換したク
ローンブタを産出する為に有用である。本発明は形質転換工程がクローン化によ
って増殖することが可能な分化した細胞源による操作によって簡略化することが
可能である。とりわけ、ドナー核のために用いられた分化した細胞は挿入され、
除去されもしくは一時変異された望ましいDNA配列をもつ。そのような遺伝的に
変更され分化した細胞はその後脱核された卵母細胞と共に核移植の為に用いられ
る。

【０１０８】 哺乳類の細胞の適切なDNA配列を挿入削除もしくは一時変異するいずれの周知
の方法も核ドナーとして利用する為の分化した細胞を変更する為に利用できる。
これらの工程はDNA配列の全てもしくは一部分を除去し、またDNA配列は非相同性
である可能性がある。細胞ゲノムの特定の部位もしくは複数の部位で一つのDNA
配列もしくは複数のDNA配列の挿入、削除もしくは一時変異を可能にする相同性
組み換えの技術が含まれる。好ましい具体例として内生ブタ遺伝子は「ノックア
ウトされた」であり、またヒト同族体、例えばノックインされた免疫学的タンパ
ク、ホルモン、構造タンパク、凝固因子、酵素、受容体、もしくは他のクローン
遺伝子をコードするDNAである。

【０１０９】 本発明はこのようにして適切な遺伝子型をもった成熟した子ブタを提供する為
に利用できる。すでに証明された遺伝的有意性もしくは他の望ましい特徴をもっ
た形質転換したもしくは遺伝工学的に作られた哺乳動物およびキメラ哺乳動物を
含む成熟子ブタ、形質転換したもしくは遺伝工学的に作られた動物およびキメラ
動物を含む、の増殖は個々に有益である。したがって、本発明は単一の性別の産
子の作出、および改良肉製品、生殖に関する特徴および疾患に対する抵抗性をも
つ子ブタの作出を可能にするであろう。さらに、形質転換したおよびもしくはキ
メラ胎児を含むNT胎児由来の細胞由来の細胞および組織はCICM細胞の利用に関連
して下記に述べるような多数の疾患の治療のために細胞、組織および器官移植に
利用できる。このことから、形質転換した子ブタに疾患、細胞および器官の異種
移植、および薬剤タンパクの作出のモデルを含んだ利用法がある。

【０１１０】 上記のように好ましい具体例として内生構造遺伝子、例えばコラーゲンはヒト
コラーゲン遺伝子によって置換されるであろう。他の好ましい具体例として、ブ
タ血清アルブミン遺伝子はHSA遺伝子によって置換されるであろう。

【０１１１】 CICM細胞および細胞株の作出のために、適切な大きさのNTユニットが得られた
後で、細胞はその領域から機械的に除去されその後利用される。このことは代表
的に少なくとも約50個の細胞を含有し、そのような細胞を洗浄しまた支持細胞層
、例えば照射された線維芽細胞の上に細胞をおくNTユニットを含有する細胞塊を
取り除くことによって生じる。代表的に幹細胞もしくは細胞コロニーを得る為に
用いられた細胞は好ましくは少なくとも大きさにおいて50個の細胞である培養さ
れたNTユニットの内部の代部分から得られるであろう。しかしながらNTユニット
の他の部分由来の細胞と同様により小さいあるいはより大きいNTユニットがまた
ES細胞および細胞コロニーを得るために用いられる可能性がある。細胞は適当な
成長培養液、例えば10％ FCSおよび0.1ｍM β-メルカプトエタノール(Sigma)お
よびL-グルタミンを補充したアルファMEM の支持細胞層内で維持する。成長培養
液は成長を最適にするために必要に応じて、例えば約２-３日毎に交換する。

【０１１２】 この培養工程は結果としてCICM細胞もしくは細胞株の形成を生じる。専門家で
あれば個々のCICM細胞の成長を最適にするために望まれるように培養の条件を変
更することができる。また遺伝工学的に作られたもしくは形質転換した子ブタCI
CM細胞は本発明により作出される可能性がある。すなわち上記の方法は一つの適
切なDNA配列もしくは複数のDNA配列が導入される、もしくは一つの内生DNA配列
もしくは複数のDNA配列のすべてあるいは一部が除去され一時変異されるNTユニ
ットを産出するために利用できる。これらの遺伝工学的に作られたもしくは形質
転換したNTユニットはその後遺伝工学的に作られたあるいは形質転換したCICM細
胞を作出するために利用が可能である。上述のように、未分化状態で培養液の中
でこのようなCICMを維持する好ましい方法は米国特許No.5,905,042の中で検討さ
れ、この文書の中の参考文献の中に具体的に示されている。

【０１１３】 結果として生じたCICM細胞および細胞株は多くの治療的および診断的用途をも
つ。とりわけ、このようなCICM細胞は細胞移植治療のために利用される可能性が
ある。

【０１１４】 この点において、マウス胚幹(ES)細胞はほとんどあらゆる細胞型、例えば造血
幹細胞に分化できる。従って、本発明によって作出されたブタCICM細胞は類似し
た分化能力をもつはずである。本発明によって得られたCICMは周知の方法によっ
て適切な細胞型を得るために分化を誘導するであろう。たとえば、この子ブタの
CICM細胞は、細胞分化のために提供する分化培養液中でおよび条件下でこのよう
な細胞を培養することによって、造血幹細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、肝
細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経細胞等に分化を誘導する可能性があ
る。結果としてCICM細胞の分化を生じた培養液および手法は適当な培養条件とし
て専門家には知られている。

【０１１５】 例えば、Palaciosら、Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,92:7530-7537(1995)ではレチ
ノイン酸の欠乏した懸濁培養液中でこのような細胞の培養凝集体を最初に含む誘
発工程に対して支配している幹細胞による胚細胞株から造血幹細胞の作出を解説
している。

【０１１６】 さらに、Pedersen,J.Reprod.Fertil.Dev.,6:543-552(1994)では、造血細胞、
筋肉、心筋、神経細胞、それらの合併症を含む様々な分化細胞型を作出するため
に胚幹細胞のin vitroにおける分化の手法について発表している非常に多くの論
文を参考にした概説論文である。

【０１１７】 更に、Bain ら、Dev.Biol.,168:342-357(1995)はニューロンの性質を持つ神経
細胞を作出するために胚幹細胞のin vitroにおける分化について解説している。
これらの参考文献は胚または幹細胞由来の分化した細胞を得る報告された方法の
例として役に立つ。胚幹細胞の分化の方法に関連しているこれらの参考文献とり
わけ開示は全体的にこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。

【０１１８】 このように、周知の方法及び培養液を用いて、適切な分化した細胞型、例えば
神経細胞、筋細胞、造血細胞等を得るために、専門家は遺伝工学的に作られたも
しくは掲出転換したCICM細胞を含むこのCICM細胞を培養する可能性がある。米国
特許5,905,042に開示されている培養法は多能性CICMを生じるということをキメ
ラ哺乳動物（子ブタ及びウシ）の作出の成功例によって示した。

【０１１９】 このCICMはあらゆる適切な分化した細胞型を得るために利用される可能性があ
る。このような分化した細胞の治療的利用法は前例がない。例えば、造血幹細胞
は骨髄移植の必要な医学的治療に利用される可能性がある。このような工程は多
くの疾患、例えばAIDSのような免疫系を含む疾患と同様に、卵巣癌と白血病のよ
うな末期癌を治療するために利用される。造血幹細胞は、それが得られるまで分
化し易い条件下でそのような細胞を増殖し、癌もしくはAIDSの患者の成熟体細胞
、例えば脱核された卵母細胞を持った上皮細胞もしくはリンパ球を例えば融合す
ることによって、得ることが可能である。このような造血細胞は癌及びAIDSを含
む疾患の治療に利用される可能性がある。

【０１２０】 本発明は欠損遺伝子、例えば欠損免疫系遺伝子に置換するために、もしくは成
長因子、リンフォカイン、サイトカイン、凝固因子、受容体、酵素等のような治
療的に有益なタンパクの発現を生じる遺伝子を導入するために用いることが可能
である。

【０１２１】 このCICM細胞に導入される可能性のあるDNA配列は例えとして、表皮成長因子
、基本線維芽細胞成長因子、グリア由来の向神経性成長因子、インシュリン様成
長因子（I及びII）、ニュートロフィン-3、ニュートロフィン-4/5、繊毛性毛様
神経栄養因子、AFT-1、サイトカイン（インターロイキン、インターフェロン、
コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（アルファ及びベータ）等）、治療的酵素等を
コードするDNA配列を含む。

【０１２２】 本発明はヒトの疾患の治療において子ブタの細胞の利用法を含む。従って、子
ブタCICM細胞、NT胎児及びNT及びキメラ産子（形質転換したもしくは形質転換し
ない)が細胞、組織または器官移植が正当化されるヒトの疾患の状態の治療に利
用される可能性がある。一般的に本発明によって得られたCICM細胞、胎児及び産
子は同じ種（自己、同系もしくは同種移植）あるいは種を超えて（異種移植)の
範囲内で利用できる。例えば、子ブタNT胎児由来の脳細胞はパーキンソン病の治
療をするために利用される可能性がある。

【０１２３】 また、このCICM細胞はとりわけ初期発生の制御に含まれる遺伝子の研究のため
に分化のin vitroにおけるモデルとして用いられる可能性がある。また、このCI
CM細胞を用いた分化した細胞組織及び器官は医薬品研究に利用される可能性があ
る。

【０１２４】 更にこのCICM細胞は他のCICM細胞及び細胞コロニーの作出のための核ドナーと
して利用される可能性がある。

【０１２５】 本発明をさらに明白に説明するために次の例を提供する。

【０１２６】 （例 ブタクローニングのための材料および方法）

【表２】 18mohm、RO、脱イオン水使用。 Phは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。

【０１２７】

【表３】 ^** 60%シロップ^* 沈殿を避けるために、最後にゆっくりCaCl₂2H₂Oを加える 18mohm、RO、脱イオン水使用。 pHは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。

【０１２８】

【表４】 18mohm、RO、脱イオン水使用。 pHは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 red Nalgene filtersを用い減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字
をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。 注：BSA型は重要である。好ましくはSigma BSA catalog ＃ A-7906を使用するこ
と。また、Pen G/Streptはオプションである。

【０１２９】 （成熟培養液(MAT)） 18.0ml mNCSU 37 2.0ml ブタ卵胞液(pFF) 7.0μlの希釈されたβ-メルカプトエタノール(10μlβ-メルカプトエタノールを
990μl mNCSU37で希釈する；最終濃度は50μM) 0.002gシステイン(最終濃度は0.6mM) 20μl EGF Stock(10ng/μl EGF stock由来の表皮成長因子)

【０１３０】 （ブタ卵胞の吸引のためのプロトコール） 濾胞を大きさによって視覚的に類別する。3mm×3mmから7mm×7mmの濾胞が吸引
のためにはふさわしいと考えられている。それに反して、もっと大きい濾胞、と
りわけ1cm×１cmより大きい濾胞は吸引にはふさわしくない。

【０１３１】 好ましくは18ゲージ針を備えた10ccシリンジを使用して1mlのへパリン(100 IU
/ml)の濃度を引き上げる。その後そのシリンジを垂直に持ちへパリン溶液がシリ
ンジの内部をおおうように10ccの線まで引き下げる。へパリンはその後シリンジ
から廃棄する。その時一方の手に卵巣を持ち、もう一方にシリンジを持つ。

【０１３２】 濾胞と共に全ての濾胞液が抽出されたために、針はその後下へ傾け、濾胞が崩
壊するまでシリンジの方に軽く引き戻して濾胞の中に押し込む。濾胞の内側の吸
引工程の際軽く前と後ろに小刻みに動かす運動によって濾胞の崩壊及び全ての濾
胞内容物の除去が促進されることが確認された。

【０１３３】 吸引は10ccのマークを認めるまで可能な限り多くの濾胞を得るために続ける。
その後シリンジから針を除去し濾胞液を回収試験管の中で沈殿させる。

【０１３４】 卵母細胞に損傷を与えるのと同様に積細胞が引き離されるのを避けるために試
験管の中に濾胞液を沈殿させる際、針を取り除くのに注意をしなければならない
。また卵巣を廃棄し次の卵巣に移る前に個々の卵巣の適切なサイズの多数の濾胞
を全部吸引することが望ましい。最適な結果として、個々のセットの特徴に応じ
てへパリンでコーティングされたシリンジを交換することが望ましい。

【０１３５】 （ブタ濾胞液調製） 代表的には約3-6mmの濾胞のブタ濾胞液(pFF)が成熟期前の若い雌ブタから回収
される。卵母細胞及び濾胞細胞は例えば約5-10分間待つことによって沈殿が可能
になる。その後pFFを吸引し15mlの三角試験管に除去する。その後これを30分間3
000rpmで4℃のSorvallで遠心分離する。試験管を除去しpFFを上記のペレットか
ら回収し、貯留し、0.8μmのフィルターと続いて0.45μmのフィルター(Sterivex
)を通して濾過する。濾過した物質をその後1.5mlの滅菌マイクロフュージ試験管
に分取し使用まで−20℃で凍結する。

【０１３６】 （表皮成長因子株(EGF)及び調製） 100μg EGF 0.1%BSAを加えた10mlのmNCSU 37 よく混合する。25μlまで分取し−20℃で凍結する。

【０１３７】 （MAT(PMSG/hCG)に対するウマ絨毛膜ゴナドトロピン及びヒト絨毛膜ゴナド
トロピン株及び調製） ECG(PMSG6000; Intervet Inc., Millsboro; DE19966) この材料は3mlのdH₂Oを加えることによって6000IU/mlから2000IU/mlまで希釈す
る。 hCG(Chorulon; Intervet Inc.) hCG材料は5mlのdH₂Oを加えることによって10,000IUから2,000IU/mlまで希釈する
。

【０１３８】 その後、1mlの希釈したPMSG及び1mlの希釈したhCGを1000IU/mlの個々のホルモ
ンを得るために混合する。50μlのアリコートをその後作出し−20℃で凍結する
。残ったPMSG及びhCG株もまた凍結する。

【０１３９】 （db-cAMP 100mM株及び調製） 25mg db-cAMP(-20℃のデシケーター内に貯蔵する。) 0.509ml dH₂O 上記の材料をよく混合し50μlのアリコートを作出しその後-20℃で貯蔵する。

【０１４０】 (活性培養液) 1mg/ml BSAを含有する以外はHECM/HEPESと同じ。

【０１４１】 （抗生物質/抗真菌剤(Ab/Am)） 100U/lのペニシリン、100μg/lのストレプトマイシン及び0.25μg/lのアンフ
ォテリシンB、(Gibco #15240-062)

【０１４２】 上記の物質の10mlのアリコートを生理食塩液1 l毎に加える。10μlのこの混合
液を1ml毎に加える。

【０１４３】 （卵母細胞複合体(OCC)回収） 卵巣を25℃で実験室に移送し直ちに抗生物質/抗真菌剤(10ml/l;Gibco#600-524
0g)を加えた0.9%生理食塩液で洗浄する。3-6mmの間の濾胞を減圧器(GEML bovine
system)に連結した18gの針及び50mlのFalcon試験管を用いて吸引する。試験管
が満たされた後、OCCを5-10分間沈殿させる。もし必要ならば濾胞液(pFF)を吸引
し培養システムで使用するために取っておく（下記のpFF調製プロトコールを参
照)。

【０１４４】 （in vivoにおける卵母細胞回収のための好ましいプロトコール及び核移入
したブタ胚の移入） 225から275ポンドのLandrance×YorkもしくはLandrance×Hampshireの若い雌
ブタにPG600を注射し5から6日後に(発情期の開始後24時間から36時間後)動物を
畜殺場に送る。子宮を回収し隔離された容器内に置き実験室に持っていく。

【０１４５】 卵管を子宮から切除し緩衝液で洗い流す。その後、上に述べたようにin vitro
において成熟卵母細胞を得るために卵母細胞を積細胞から引き離す。

【０１４６】 活性化の後、卵は5 1/2インチのTom Catカテーテル(Sovereign Cat. #8890-70
3021)の中に入れ同調性レシピエントの若い雌ブタ(同種で200から300ポンド)の
卵管に外科的に移入する。胚の総数の半分を個々の卵管に移入し代表的にはただ
100NTだけが1哺乳動物当たりに移入されるに過ぎない。幾つかの例として、2個
から4個の細胞胚を自然に作出した10個から20個の胚を「ヘルパー」胚としてNT
と共に移入する。カスパーゼ阻害剤は任意に胚の発生及び維持を亢進させるため
に緩衝液に含有される可能性がある。若い雌ブタは250mgのキシラジン、250mgの
ケラミン及び500mgのテラゾール、1ml/50poundの混合液を用いて麻酔する。キシ
ラジン、250mgのケラミン及び500mgのテラゾール。移植の後、好ましくはレシピ
エントの若い雌ブタは新しく隔離された設備に移動させる。

【０１４７】 妊娠チェックは好ましくは外科手術の後30日に、代表的には超音波検査によっ
て実施される。胎児は帝王切開術によってその時に回収することが可能で、また
それらの内のどの一つが核移入によって作出されたか確認するためにPCR及びサ
ザンブロット法によって解析する。他方クローン胎児を出産予定日まで発生分化
させ自然の方法もしくは帝王切開によって出産する。

【０１４８】 OCCを20mlのHepes-PVA中で再懸濁させ沈殿させ、これを2回繰り返す。最後の
洗浄の後、OCCを格子の皿に移動し培養組織を選択する。選択されたOCCはHes-PV
Aの60mmの皿の中で2回洗浄する。全ての吸引及び卵母細胞回収は室温で行なわれ
る(およそ25℃)。

【０１４９】 （in vitroにおける成熟(IVM)） 洗浄したOCC(約50)を約22時間個々に0.5mlの成熟培養液(上記の)を含有する4
ウェルのNuncプレートtje we;;s pfに置く。その後、卵母細胞を約20時間ホルモ
ンを欠乏させる以外は同じ培養液中に置く。

【０１５０】 （ブタ胚及び成熟線維芽細胞の初期培養組織の分離） ブタ線維芽細胞の初期培養組織を受精の後30日から114日、好ましくは35日の
子ブタ胎児から得られる。頭、肝臓、心臓及び消化器を無菌状態で除去し、胎児
を細かく刻み前もって温めたトリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02%EDTA;G
IBCO、グランドアイランド、ニューヨーク州)中で37℃で30分インキュベートす
る。線維芽細胞を組織培養皿に置き10%胎児ウシ血清(FCS)(Hyclone、ロージェン
、ユタ州)を補充したアルファ-MEM培養液(Bio Whittaker、ウォーカースビーレ
、メリーランド州)、ペニシリン(100IU/ml)及びストレプトマイシン(50μl/ml)
を含む線維芽細胞成長培養液(FGM)中で培養する。線維芽細胞を37℃の空気中で5
%CO₂を含んだ湿度の高い環境で成長させ、維持する。

【０１５１】 成熟線維芽細胞をブタの胚および皮膚から分離する。細かく刻んだ胚の組織を
トリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02% EDTA;GIBCO,グランドアイランド、
ニューヨーク州)中で10℃で一晩インキュベートする。次の日にあらかじめあた
ためたトリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02% EDTA; GIBCO、グランドアイ
ランド、ニューヨーク州)中で37℃で１時間、組織およびあらゆる分離した細胞
をインキュベートし、連続的に３回洗浄することによって処理しトリプシンをイ
ンキュベート(１時間)する。線維芽細胞を組織培養皿におき、10%胎児子ウシ血
清(FCS)(Hyclone,ローゲン、ユタ州)、ペニシリン(100IU/ml)およびストレプト
マイシン(50μl/ml)を補充したアルファ-MEM培養液(Bio Whittaker,ウォーカー
スビーレ、メリーランド州)中で培養する。線維芽細胞はおよそ胚盤期の後から
哺乳動物の成熟期間(ブタでは受精の後９日目から10日目から５歳以上まで)の範
囲で、事実上発生期のいつでも分離できる。

【０１５２】 （核移入のための線維芽細胞の調製） ドナー核として利用される可能性のある胎児線維芽細胞の例は次のようである
； １．あらゆる１細胞期もしくは絶食時血清あるいは休止状態における同調しない
増殖している線維芽細胞は核ドナーとして役に立つ。上記の培養組織由来の細胞
をトリプシンEDTAで10分間処理し100%胎児子ウシ血清中で3回洗浄する。単細胞
線維芽細胞にその後HbT培養液(Bavisterら、1983)を顕微操作下で滴下する。こ
れは脱核した子ブタ卵母細胞への線維芽細胞の移入の前10分から30分に実施する
。好ましくは、CMVプロモーターおよび緑色蛍光タンパク遺伝子(第９継代)をも
った増殖している形質転換した線維芽細胞をNTユニットを作出するために利用す
る。

【０１５３】 ２．第二の方法として、線維芽細胞は細胞サイクルのG1もしくはG0に同調する
。線維芽細胞は成長し融合する。その後FGM中の胎児子ウシ血清の濃度を連続４
日以上(０日目=10%、1日目=5%、２日目=2.5%、３日目=1.25%、４日目=0.625%)半
分にする。５日目に細胞をトリプシンEDTAで10分間処理し100%胎児ウシ血清中で
３回洗浄する。その後単細胞線維芽細胞をHbT培養液の顕微操作下で滴下する。
これは脱核した子ブタ卵母細胞に線維芽細胞を移入する前15分以内に実施する。

【０１５４】 他方、ドナー細胞、例えば線維芽細胞は生存している哺乳動物、例えば成熟ブ
タから、例えば組織もしくは体液源から直接得られる。

【０１５５】 （積細胞の除去） 約30時間から50時間、好ましくは約42時間の範囲の成熟期の後、好ましくは卵
母細胞を脱核できる。積細胞の除去は好ましくは0.68mg/mlのヒアルロニダーゼ
を含有するH/H培養液に細胞を接触させ、続いて約３分間渦を作ることによる脱
核の前に実施する。他方、脱核の前に卵母細胞を取り除き、積細胞の除去の前に
1mg/mlのヒアルロニダーゼを含有するHECM(Seshagiri and Bavister,1989)中に
置くことが可能である。これは非常に細い内径のピペットで繰り返しピペッティ
ングすることによってもしくは短い時間(約３分間)渦を作ることによって起こる
可能性がある。引き離された卵母細胞はその後極体を選別し、また極体の存在に
よってした選別された中期II卵母細胞をその後核移入のために使用する。

【０１５６】 （脱核；） この好ましい工程は少なくとも20分間NCSU 23＋ショ糖＋HXTに卵母細胞を曝露
することを含み、その後ショ糖およびサイトカラシンBを含有するH/H培養液の中
で脱核を実施する。脱核の後卵母細胞は好ましくは移入の前にショ糖を含有する
NCSU 23中に置く。

【０１５７】 （移入；） 移入のための細胞は好ましくはプロナーゼもしくはTEで処理する。プロナーゼ
の場合、400μl/lで処理し、インキュベートした後H/H培養液で希釈し、４分間6
kRPMで遠心分離し、その後使用時にH/H培養液中で再懸濁する。

【０１５８】 TEの場合に同じプロトコールが利用される。その後好ましくはショ糖を含むH/
H培養液中で移入が起こりそれが完了した時、細胞を融合のためにショ糖を含むN
CSU 23中に置く。

【０１５９】 （融合培養液；） 処方：500mlのSigma水 0.28マンニトール25.51g 100μM MgSO₄ 0.0123g 10ｍM ヒスチジン 0.776g

【０１６０】 （融合：） 核移入ユニットは好ましくはH/H勾配とマンニトールの勾配1:2,1:1および0:2
を実施し、またその後600μMチャンバー内で融合しマンニトールに浸す。

【０１６１】 細胞を＠100Vに30μsec細胞を置くことによって電気融合する。融合の後、NT
ユニットを好ましくは活性化の前２時間、純粋なH/H中に置きその後NCSU 23＋Cy
to B(３μl/2ml)中に置く。

【０１６２】 （活性化） 代表的には成熟の後約47時間から49時間用いられる可能性のある活性化の手法
の例は本申請書の中ですでに確認された次の工程を含む。上述のように活性化は
融合の前、直前直後、もしくは後に起こる可能性がある。

【０１６３】 （１．１．イオノマイシン/DMAP工程：） NTユニットを４分間１mg/ml BSA＋10μMイオノマイシン(4μl/2ml)を含有する
H/H培養液中に置き、H/Hですすぎその後NCSU 23＋DMAP(1μl/ml)中に30分間置く
。その後BSA(1μl/ml)および５μMイオノマイシンを含有する同じH/H培養液中に
置き、その後30分間処理する。

【０１６４】 その後、１mg/ml BSA+2.5μMイオノマイシンおよびDMAPを含有する同じH/H培
養液中に更に２時間置く。

【０１６５】 その後DMAPを除去するためにNTユニットをすすぎその後、NCSU 23中で培養す
る。培養液は３日目に交換し５日目に５％FBSを加え胚盤胞が形成されるまでNT
ユニットを培養する。

【０１６６】 ２．単一活性化パルス。NTユニットをNCSU 23＋CBから除去し活性化培養液中
で３回洗浄する。平衡の後、NTユニットを融合工程で述べたように活性化培養液
を満たした融合チャンバー(500μm 間隙で)中に置く。30μsec30Vのパルスが適
用される。その後、直ちにNTユニットをHECM HEPES中で３回洗浄し、胚移入、も
しくはin vitroにおける培養(NCSU 23中で39℃, 5%CO₂)までさらに２時間NCSU
23中で培養する(39℃, 5%CO₂)。培養の際NTユニットは培養の２日目に新鮮なNCS
U 23＋５％胎児子ウシ血清中に置く。表１の結果は卵母細胞がこの工程を利用し
て活性化できることおよびそれらが発生能力をもつことを示している。

【０１６７】 ３．二つの活性化パルス。NTユニットをNCSU 23＋CBから除去し活性化培養液
中で３回洗浄する。平衡の後NTユニットを融合工程の中で述べたように活性化培
養液で満たされた融合チャンバー(500μMの間隙)の中に戻す。30μsec30Vのパル
スが適用される。その後直ちにHECM/HEPES中で３回洗浄しNESU 23＋CB中に戻し
、１時間後の次の電気的パルスまでが39℃、５％CO₂の培養液中で培養する。こ
の１時間後に活性化培養液平衡段階を繰り返し30μsecの間15Vのパルスが適用さ
れる。その後直ちにNTユニットをHECM HEPES中で３回洗浄しNCSU 23+CB中に戻し
、また更に２時間から６時間39℃、５％CO₂の培養液中で培養する。上記の１で
述べた同じ工程を用いてNTユニットを培養する。テーブル１の結果は卵母細胞が
この工程を用いて活性化できることおよびそれらが発生能力をもつことを示して
いる。核移入胚についても同じことが言える。４胚盤胞期NTユニットを２パルス
活性化工程によって作出した。

【０１６８】 ４．***因子。Stice およびRobl(Mol.Reprod.Dev.,25:272-280)(1990)(その
内容はこの文書の中の参考文献に具体的に示されている)によって哺乳類の***
について最初に述べたように、この因子は卵母細胞の活性化を引き起こす。子ブ
タ***細胞からの***因子分離およびマイクロインジェクションの手法はFissor
eら(Mol.Reprod.Dev.,46:176-189(1997))の中に述べられている。その内容はこ
の文書の中の参考文献の中に具体的に示されている。NTユニットをNCSU 23+CBか
ら取り除き脱核および線維芽細胞移入のために上に述べた顕微操作プレートに置
く。***因子で満たされたマイクロインジェクション針(１μm開口)を用いて卵
母細胞はNTユニットの細胞質内への因子の送達の後活性化を受ける。マイクロイ
ンジェクションの後、NT胚はHECM HEPES中で洗浄し２時間から６時間NCSU 23＋C
B中に置き、その後胚移入までNCSU 23中に置く。

【０１６９】

【表５】

【０１７０】 （胚移入） 子ブタにおける１細胞胚移入の手法がよく知られている(例えば、Pinkertら、
1993、この内容はこの文書の参考文献に具体的に示されている）。代表的に、20
個から30個のNTおよび100個のNTまでのユニットを飼育されたまたは飼育されて
いない若い雌ブタの卵管内に同調移入する。妊娠29日を超えた核移植した胎児(
形質転換したもしくは形質転換しない)はレシピエントの雌ブタから回収できる
。他方、胎児は出産予定日(妊娠114日)に到達しクローンウシの産子が作出され
る。上記のように、このような雌ブタはまた好ましくは「ヘルパー」胚、例えば
正常ブタ胚、単為発生のブタ胚、もしくは四倍体胚を含むであろう。ヘルパー胚
の数は１から約50まで、代表的には２から４まで変化する可能性がある。

【０１７１】 （in vitroにおける成熟期のカスパーゼ阻害剤の使用。卵母細胞の引き離し
もしくは活性化） 上で述べたようにカスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ3、8もしくは９の追加
によってNT工程から生じた胚盤胞の数を増加させるということが発見された。こ
の発見を支持するいくらかのデータが下の表に示されている。

【表６】

【０１７２】 また、読者の便宜のために、発明者によって用いられているブタ卵母細胞の移
入のためのこの好ましい試験計画は下に総括されている。

【０１７３】 （好ましいクローニング法および材料の要約） （ブタ卵母細胞の核移入のためのプロトコール：） （in vitroにおける成熟：） 引き離しの間にNCSU 37＋PFF＋β-メルカプトエタノール＋システイン＋EGF＋
1000IUのHCG/PMSG＆cAMP中に22時間置き、H/Hで３回すすぐ。 ４ウェルのNuncプレート中にホルモンを追加せずに上の培養液に20時間置く。

【０１７４】 （ブタ卵母細胞のプロセッシング：） 0.68mg/mlのHyalで引き離し３分間3回渦を起こす。

【０１７５】 （必要な培養液：） HECM/HEPES＋ショ糖(0.2567mg/10ml) NCSU 23＋ショ糖(0.2567ml/10ml) NCSU 23

【０１７６】 （融合培養液：） 10μMマンニトール 処方：500mlのSigma水 0.28マンニトール 25.51g 100μM MgSO₄ 0.0123g 10mMヒスチジン 0.776k

【０１７７】 （融合：） 核移入ユニットをH/Hとマンニトールの勾配1:2、1:1、および0:2を実施しまた
その後600μmチャンバー内で融合し、マンニトールに浸す。

【０１７８】 30μsec100Vを適用することによって融合が起こる。融合物は直ちに純粋なH/H
中に置きその後活性化の前にNCSU 23＋CytoB(3μl/2ml)中に２時間置く。

【０１７９】 （脱核） 卵母細胞を少なくとも20分間NCSU 23＋ショ糖＋HXTに曝露する。 脱核はH/H＋ショ糖＋cyto Ｂ中で実施する。 その後卵母細胞を移入の前にNCSU 23＋ショ糖中に置く。

【０１８０】 （移入） プロナーゼもしくはTEのいずれかで調製された細胞 プロナーゼ―400μl/ウェル、固定して置く、H/Hで希釈し4分間６kRPMで遠心分
離、使用時H/Hで懸濁 TE―細胞分離のための同一のプロトコール。

【０１８１】 移入がH/H＋ショ糖の中で行なわれ、また完了した時融合のためにNCSU 23＋シ
ョ糖の中へもどす。

【０１８２】 （活性化培養液） H/H Z1(H/Hと同様であるが、１mg/mlのBSAを加えて） 30分までに分離した3つの個々の処理。 １．4分間H/H Z1＋10μMイオノマイシン(４μl/２ML)、H/Hですすぎその後３０
分間NCSU 23＋DMAP(１μl/ml)中に置く ２．更に２時間H/H Z1＋５l＋2.5μMイオノマイシンおよびその後DMAP

【０１８３】 DMAPを除去するために活性NTユニットをすすぎ、その後NCSU 23中で培養する
。

【０１８４】 培養液は1日3回交換し5日目に５％FBSを加え、胚盤胞まで培養する。

【０１８５】 本発明はいくらかの個々の具体例に関して述べたが、それらの多くの一時変異
及び変更が発明の精神から離れることなしに専門家によって作り出される可能性
がある。従って、補遺の請求項によって本発明の本当の趣旨及び限界の範囲には
いるすべての一時変異および変更を包含することを意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 スタイス、スティーブン、エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 アムハースト ロード 468 (72)発明者 シベリ、ホセ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、アム ハースト、 ヴィレッジ パーク 166 (72)発明者 ロブル、ジェイムズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 オールド エンフィール ド 196 (72)発明者 ゴルーク、ポール アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 ダイアン ドライブ ８ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 CA02 DA02 EA02 GA12 GA14 GA18 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に脱
   核した子ブタ卵母細胞もしくは割球の中に適切に分化した子ブタ細胞もしくは細
   胞核を挿入する (ii)もし前もって除去されていない場合前述の卵母細胞もしくは割球から内生の
   核を除去する (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化する (iv)前述のNTユニットを任意に培養する (v)NTユニットがブタ胎児もしくは動物に発育するように宿主の哺乳類に前記の
   任意に培養されたNTユニットを移入することから成るブタ胎児もしくは生存して
   いる産子をクローニングする方法。
2. 【請求項２】 結果として生存している産子を作出する請求項１記載の方法
   。
3. 【請求項３】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは細胞核内において適切な
   DNAが挿入され、除去されあるいは一時変異され、それによって結果として遺伝
   的に去勢されたNTユニットを作出する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 胎児を産子にまで発生分化することを含む請求項３記載の方
   法。
5. 【請求項５】 ２細胞発生期より以降の段階になるまで前記の活性核移入ユ
   ニットを培養することを含む請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 移入されたNTユニットが一つの細胞である請求項１記載の方
   法。
7. 【請求項７】 移入が活性化と同日に実施される請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記の分化した細胞もしくは核の導入の後卵母細胞が脱核さ
   れる請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 分化した細胞あるいは核が増殖している(非静止状態の)細胞
   の分化した細胞あるいは核である請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記の分化した細胞がG₁、G₂もしくはＭの中に存在する請
    求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 子ブタ卵母細胞がin vitroで成熟する請求項１記載の方法
    。
12. 【請求項１２】 子ブタ卵母細胞がin vivoで成熟する請求項１記載の方法
    。
13. 【請求項１３】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは核が体細胞から得られ
    る請求項１記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは核が胚細胞から得られ
    る請求項１記載の方法。
15. 【請求項１５】 宿主の哺乳動物が一個以上のヘルパー胚から成る請求項１
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 分化した細胞が前記のクローン胎児もしくは哺乳動物の細
    胞、組織、あるいは器官のヒトへの移植に対する拒絶反応を抑制する一つ以上の
    遺伝的一時変異から成る請求項１記載の方法。
17. 【請求項１７】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が中胚葉由来である請
    求項１記載の方法。
18. 【請求項１８】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が外胚葉由来である請
    求項１記載の方法。
19. 【請求項１９】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が内胚葉由来である請
    求項１記載の方法。
20. 【請求項２０】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が線維芽細胞もしくは
    細胞核である請求項１記載の方法。
21. 【請求項２１】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が成熟分化した細胞も
    しくはその細胞由来の核である請求項１記載の方法。
22. 【請求項２２】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が胚のもしくは胎児の
    細胞あるいは細胞核である請求項１記載の方法。
23. 【請求項２３】 分化した子ブタ細胞あるいは核が子ブタから直接得られた
    増殖細胞である請求項１記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記の分化した細胞もしくは核が組織培養液の中で増殖し
    た増殖細胞から得られる請求項１記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記の分化した細胞もしくは核が核移入に先だって、in v
    ivoで増殖する請求項１記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記の増殖している子ブタ細胞が、ブタ細胞が注射された
    SCIDマウスから得られる請求項25記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記の増殖細胞が遺伝的に一時変異した請求項25記載の方
    法。
28. 【請求項２８】 前記の遺伝的一時変異が組換えウイルス、ウイルスベクタ
    ー、ネイキッド（naked）DNA、もしくはプラスミドベクターの利用によってもた
    らされる請求項27記載の方法。
29. 【請求項２９】 脱核された卵母細胞が脱核の前に成熟する請求項1記載の
    方法。
30. 【請求項３０】 一つ以上の電気的パルスに曝露することによって融合核移
    入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。
31. 【請求項３１】 イオノマイシンおよびDMAPに曝露することによって融合核
    移入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。
32. 【請求項３２】 ***の細胞由来の少なくとも一つの活性化因子に曝露する
    ことによって融合核移入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。
33. 【請求項３３】 マイクロインジェクションが前記の非相同DNAを挿入する
    ために用いられる請求項３記載の方法。
34. 【請求項３４】 電気穿孔法が非相同DNAを挿入するために用いられる請求
    項３記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記の胎児もしくは動物が任意に遺伝的に一時変異される
    あらかじめ存在している無胚の分化したブタ細胞と同じ遺伝子型をもつ請求項1
    記載の方法によって得られたクローン化され任意に形質転換したブタ胎児、もし
    くは動物。
36. 【請求項３６】 キメラ胚を作出する受精胚を持つクローン化されたNTユニ
    ットの結合をさらに含む請求項１記載の方法。
37. 【請求項３７】 キメラ胚を産子にまで発育させることを含む請求項36記載
    の方法。
38. 【請求項３８】 請求項３６記載の方法によって得られたキメラ胎児。
39. 【請求項３９】 請求項３７記載の方法によって得られたキメラ産子。
40. 【請求項４０】 請求項３９によるキメラ産子の後代。
41. 【請求項４１】 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に
    脱核した子ブタ卵母細胞もしくは割球の中に適切な分化をした子ブタ細胞もしく
    は細胞核を挿入する (ii)もし前もって除去されていない場合前述の卵母細胞もしくは割球から内生の
    核を除去する (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化する (iv)多能がありまた組織培養液中で無期限に維持できる子ブタCICM細胞株を得る
    ための前記の培養されたNTユニットから得られた培養細胞から成るブタCICM(多
    分化能)細胞株の作出の方法。
42. 【請求項４２】 識別できる胞胚壁初期の外層および内部細胞塊が得られる
    まで前記の活性化された核移入ユニットを培養することを含む請求項41記載の方
    法。
43. 【請求項４３】 前記の細胞株が多能性があり、あらかじめ存在している無
    胚の分化した細胞と同じ遺伝子型を含む請求項41記載の方法により得られたCICM
    細胞株。
44. 【請求項４４】 適切なDNAが挿入され、除去されもしくは分化した子ブタ
    細胞あるいは細胞核に一時変異し、それによって結果として遺伝的に去勢された
    NTユニットの作出が起こる請求項41記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記の細胞株が遺伝的に一時変異したあらかじめ存在して
    いるブタの分化した細胞と同一の遺伝子型を持つ請求項44により得られた形質転
    換したCICM細胞株。
46. 【請求項４６】 結果として生じたCICM細胞株が分化のために導入される請
    求項41記載の方法。
47. 【請求項４７】 CICM細胞の分化が可能になる請求項44記載の方法。
48. 【請求項４８】 請求項46の方法によって得られた分化した細胞。
49. 【請求項４９】 (i)任意に脱核されるブタ卵母細胞を活性化する (ii)NTユニットを作出するために前記の活性化段階(i)の後でもしくはほとんど
    同時に前記のブタ卵母細胞の中に適切な分化した子ブタ細胞もしくは核を転移す
    る (iii)もし卵母細胞が前もって脱核されていない場合、内生卵母細胞核を除去す
    る (iv)培養段階の後任意に、ブタ胎児もしくは哺乳動物を作出するために雌のブタ
    に前記のNTユニットを移入することから成るブタ胎児もしくは生存している産子
    をクローニングする方法。