JP2003509031A - Cloning of pigs using nuclei from donor cells or differentiated cells and production of pluripotent pigs - Google Patents

Cloning of pigs using nuclei from donor cells or differentiated cells and production of pluripotent pigs

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    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

(57)【要約】 脱核された子ブタ卵母細胞内へのドナーの分化したブタ細胞核の移入を含む核移入の改善法を提供する。結果として生じた核移入ユニットは胎児および産子の作出による遺伝子型および形質転換した遺伝子型の増殖のために有用である。ドナー核の分化した細胞源を遺伝的に一時変異させまたクローニングによって増殖させることが可能なことにより、本手法は遺伝工学的に作られたもしくは形質転換された子ブタ胚、胎児および産子の作出を促進する。   (57) [Summary] Methods for improving nuclear transfer, including transfer of donor differentiated pig cell nuclei into enucleated piglet oocytes are provided. The resulting nuclear transfer unit is useful for the propagation of genotypes and transformed genotypes by fetal and litter production. The ability to genetically mutate the source of differentiated cells in the donor nucleus and to propagate it by cloning allows the method to be used to engineer or transform piglet embryos, fetuses and litters. Promote production.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （関連出願の相互参照） この出願は1997年1月10日に出願された米国特許出願番号08/781,752の一部継
続出願である1997年7月3日に出願された米国特許出願番号08/888,057の一部継続
出願であり、その内容はこの明細書の中の参考として取り込む。(Cross-reference of Related Applications) This application is a continuation-in-part application of US patent application No. 08 / 781,752 filed on January 10, 1997. US patent application filed on July 3, 1997 No. 08 / 888,057 is a continuation-in-part application, the contents of which are incorporated by reference in this specification.

【０００２】 （発明の分野） 本発明は分化した子ブタ細胞由来の細胞核を脱核されたブタ卵母細胞もしくは
割球内に移入するクローニングの工程に関連する。胎児および産子を作出するた
めに、その後レシピエントの雌に移入できる、もしくは多能性の培養内部細胞塊
細胞(CICM)を作出するために用いることができるクローン胚の発育を方向づける
為に核を再プログラムする。クローン胚はまたキメラ胚、胎児および/もしくは
子孫を作出するために受精胚と結合することができる。FIELD OF THE INVENTION [0002] The present invention relates to a cloning process that transfers cell nuclei from differentiated piglet cells into enucleated pig oocytes or blastomeres. Nuclei to direct the development of cloned embryos that can be transferred to recipient females and then used to generate pluripotent cultured inner cell mass cells (CICM) to produce fetuses and offspring Reprogram. Cloned embryos can also be combined with fertilized embryos to produce chimeric embryos, fetuses and / or offspring.

【０００３】 （発明の背景） 核移植のための有蹄類内部細胞塊(ICM)細胞の利用法がまた報告された。例え
ば、Collasら.,Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)の中で脱核された成熟卵母細
胞中に溶解されたドナー細胞を微量注射することによるウシICMの核移植につい
て発表されている。ウシレシピエントに移入する際、結果として４例の妊娠と２
例の出産を生じた15例の胚盤胞を作出するための７日間のin vitroにおける胚の
培養についてCollasらによって発表された。またKeeferら.,Biol.Reprod.，50:9
35-939(1994)の中でウシレシピエントへの移植の際、結果として数例の生存して
いる産子を生じた胚盤胞を作出するための核移入工程においてドナー核としての
ウシICM細胞の利用について発表された。さらに、Simsら.,Proc,Natl.Acad,Sci.
,USA, 90:6143-6147(1993)の中で脱核された成熟卵母細胞の中に短期間in vitro
で培養されたウシICM由来の核を移入することによる出産の作出について発表さ
れた。BACKGROUND OF THE INVENTION The use of ungulate inner cell mass (ICM) cells for nuclear transfer has also been reported. Nuclear transfer of bovine ICM by microinjection of lysed donor cells into enucleated mature oocytes in Collas et al., Mol. Reprod. Dev., 38: 264-267 (1994). Has been announced. When transferred to a bovine recipient, the resulting 4 pregnancies and 2
A 7-day in vitro culture of embryos to produce 15 blastocysts giving birth was reported by Collas et al. See also Keefer et al., Biol. Reprod., 50: 9.
Bovine ICM as a donor nucleus in the nuclear transfer process to generate several surviving offspring produced blastocysts upon transplantation into bovine recipients in 35-939 (1994). Announced about cell utilization. In addition, Sims et al., Proc, Natl. Acad, Sci.
, USA, 90: 6143-6147 (1993) in enucleated mature oocytes for a short period in vitro.
Birth production by transferring nuclei derived from bovine ICM cultured in.

【０００４】 培養された胚盤細胞の核移入の後生存している子ヒツジの作出についてもまた
報告された(Campbellら.,Nature,380:64-68(1996))。またさらに、核移入及びキ
メラ胎児の作出におけるウシ多能性胚細胞の利用について報告された(Sticeら.,
Biol. Reprod, 54 : 100-110 (1996) ； Collasら,. Mol. Reprod. Dev., 38 :
64-267 (1994))。Collasらによって顆粒膜細胞(成熟細胞)を胚作出のためにウ
シクローニング工程の中で利用することができた。しかしながら、終了した初期
の胚期(胚盤胞期)の発生については示されていない。また、顆粒膜細胞は容易に
培養されず雌から得られるだけである。Collasらによって培養液の中で顆粒膜細
胞を増殖されることも、これらの細胞を遺伝的に一時変異させることも試みられ
なかった。Wilmutら(Nature, 365:810-813(1997))によって胎児の線維芽細胞由
来の核移入した複数例のヒツジの産子および成熟したヒツジ由来の細胞からの１
例の産子が作出された。The production of lambs that survived nuclear transfer of cultured blastoderm cells was also reported (Campbell et al., Nature, 380: 64-68 (1996)). Furthermore, the use of bovine pluripotent embryonic cells in nuclear transfer and production of chimeric fetuses was reported (Stice et al.,
Biol. Reprod, 54: 100-110 (1996); Collas et al., Mol. Reprod. Dev., 38:
64-267 (1994)). Collas et al. Made granulosa cells (mature cells) available for use in the bovine cloning process for embryogenesis. However, it does not show the development of the terminated early embryonic stage (blastocyst stage). Also, granulosa cells are not easily cultured and are only obtained from females. No attempt was made by Collas et al. To grow granulosa cells in culture or to genetically mutate these cells. Wilmut et al. (Nature, 365: 810-813 (1997)) reported that fetal fibroblast-derived nuclei-transferred cases of litter and mature sheep-derived cells
An example baby was created.

【０００５】 クローン化された子ブタ細胞を他の種の細胞と比較することはさらに困難であ
る。この事象を次の表に示した：It is even more difficult to compare cloned piglet cells with cells of other species. This event is shown in the following table:

【表１】 [Table 1]

【０００６】 形質転換した子ブタを作出する領域にはまた問題が存在している。この方法に
よって、非相同DNAを胎児のさまざまな細胞型に分化し、結局形質転換した細胞
に実際に発生する初期胚もしくは胚細胞株の中に導入する。しかしながら、多く
の初期胚には一例の形質転換した哺乳動物を作出することが必要であり、またそ
れゆえにこの工程が非常に効果的である。また代理の雌に胚を挿入する時間と費
用を費やす前に、形質転換した胚に対して選択する簡単で効果的な方法はない。
さらに、ジーンターゲティング法を初期の胚形質転換工程によって容易に実施す
ることはできない。Problems also exist in the area of producing transformed piglets. By this method, heterologous DNA is differentiated into various fetal cell types and eventually introduced into the early embryo or embryonic cell line that actually develops in transformed cells. However, many early embryos require the production of an example of a transformed mammal, and thus this process is very effective. Also, there is no easy and effective way to select for transformed embryos before spending the time and expense of inserting them into a surrogate female.
Furthermore, the gene targeting method cannot be easily performed by the early embryonic transformation step.

【０００７】 マウスにおける胚幹細胞は研究者が形質転換細胞に対して選択し、ジーンター
ゲティング法を実施することを可能にした。これによって他の形質転換法により
さらなる遺伝子工学が可能になる。しかしながら、胚幹細胞株および他の胚細胞
株を支持細胞層および/もしくは培養液へのサイトカインの追加が必要な未分化
状態で維持しなければならない。たとえこのような対策がなされたとしても、こ
れらの細胞は一時的な分化を受け、現在利用できる方法によって形質転換された
産子を作出する為に利用することはできない。またジーンターゲティング法を促
進しない方法で増殖されなければならない胚細胞株もある。Embryonic stem cells in mice have allowed researchers to select for transformed cells and perform gene targeting procedures. This allows further genetic engineering by other transformation methods. However, embryonic stem cell lines and other embryonic cell lines must be maintained in an undifferentiated state that requires the addition of cytokines to feeder layers and / or cultures. Even if such measures are taken, these cells undergo transient differentiation and cannot be used to produce transformed offspring by currently available methods. Also, some embryonic cell lines must be propagated in a way that does not facilitate the gene targeting method.

【０００８】 初期内移植マウスの胚由来のin vitroにおける胚幹(ES)細胞株を誘導する方法
がよく知られている(Evansら.,Nature,29:154-156(1981); Martin, Proc. Natl.
Acad.Sci., USA,78:7634-7638(1981)を参照)。もし線維芽細胞の支持細胞層(Eva
nsら.,Id)もしくは分化を抑制因子(Smithら.,Dev.Biol.,121:1-9(1987))が存在
するならば、ES細胞は未分化状態で培養することが可能である。[0008] A method for inducing an embryonic stem (ES) cell line derived from the embryo of an early endografted mouse in vitro is well known (Evans et al., Nature, 29: 154-156 (1981); Martin, Proc. . Natl.
Acad. Sci., USA, 78: 7634-7638 (1981)). If the supporting layer of fibroblasts (Eva
ns et al., Id) or differentiation suppressor (Smith et al., Dev. Biol., 121: 1-9 (1987)), ES cells can be cultured in an undifferentiated state. .

【０００９】 ES細胞は多くの適用をもつことがすでに報告されている。例えばES細胞はin v
itroにおける分化のモデルとして、特に初期の発育の制御における遺伝子の研究
のモデルとして利用できる。マウスのES細胞は多能性を示すことにより内移植前
マウスの胚の中に導入された場合生殖細胞株キメラを生み出すことが可能である
(Bradleyら.,Nature, 309:255-256(1984))。ES cells have already been reported to have many applications. For example, ES cells are in v
It can be used as a model for differentiation in itro, especially as a model for studying genes in the control of early development. Mouse ES cells exhibit pluripotency and are capable of producing germline chimeras when introduced into the embryos of preimplantation mice
(Bradley et al., Nature, 309: 255-256 (1984)).

【００１０】 次世代へのゲノムの移入を可能にするために、ES細胞は適切な遺伝子一時変異
をした、もしくはしないES細胞を利用することによって家畜哺乳動物の生殖株操
作に対する潜在的な有用性をもつ。さらに家畜動物の場合、例えば有蹄類の場合
、内移植前の家畜胚様胚由来の核は脱核された卵母細胞の発育を限界まで維持す
る(Smithら.,Biol.Reprod.,40:1027-1035(1989);Keeferら., Biol.Reprod., 50:
935-939(1994))。これは報告によれば移入後８細胞期を超えると脱核された卵母
細胞の発育を維持しないマウスの胚由来の核と対照的である(Cheongら.,Biol.Re
prod.,48:958(1993))。従って、核移入工程のために全形成能をもつドナー核の
潜在的な源を、遺伝的に操作されるかまたは他の方法で提供する可能性があるた
め、家畜動物からのES細胞がきわめて適切である。[0010] To enable the transfer of the genome to the next generation, ES cells have potential utility for reproductive line engineering in livestock mammals by utilizing ES cells with or without appropriate gene transient mutations. With. Furthermore, in the case of domestic animals, for example, in the case of ungulates, the nucleus derived from domestic embryo-like embryos before endotransplantation maintains the development of enucleated oocytes to the limit (Smith et al., Biol.Reprod., 40. : 1027-1035 (1989); Keefer et al., Biol. Reprod., 50:
935-939 (1994)). This is in contrast to mouse embryo-derived nuclei that do not maintain the development of enucleated oocytes beyond the 8-cell stage after transfer (Cheong et al., Biol. Re.
prod., 48: 958 (1993)). Therefore, ES cells from livestock animals are highly prone to genetically engineered or otherwise provide a potential source of fully-forming donor nuclei for the nuclear transfer process. Appropriate.

【００１１】 報告によれば研究グループによっては多能性胚細胞株の分離を報告している。
例えば、Notarianniら.,J.Reprod,Fert,Suppl.,43:255-260(1991)では、ヒツジ
胚盤胞から免疫外科的に分離された内部細胞塊の初期培養液中の細胞に類似した
形態学的および成長の特徴を示す子ブタおよびヒツジ胚盤胞由来の、報告によれ
ば安定な、多能性細胞株の構築を報告している。また、(Notarianniら.,J.Repro
d. Fert.Suppl., 41:51-56(1990)は子ブタ胚盤胞由来の推定上の多能性胚芽細胞
の培養液中での維持および分化について発表している。Gerfenら.,Anim,Biotech
,6(1):1-14(1995)ではブタ胚盤胞由来の胚細胞株の分離について発表している。
これらの細胞を調整された培養液の利用なしにマウス胚線維芽細胞支持細胞層内
で安定して維持し、また報告によれば培養の際様々な異なる細胞型に分化させた
。Reportedly, some research groups have reported the isolation of pluripotent germ cell lines.
For example, Notarianni et al., J. Reprod, Fert, Suppl., 43: 255-260 (1991) resembled cells in initial culture of inner cell mass immunosurgically isolated from sheep blastocysts. We report the construction of a reportedly stable, pluripotent cell line from piglets and sheep blastocysts that exhibit morphological and growth characteristics. Also, (Notarianni et al., J. Repro
d. Fert. Suppl., 41: 51-56 (1990), described the maintenance and differentiation of putative pluripotent germ cells derived from piglet blastocysts in culture. Gerfen et al., Anim, Biotech
, 6 (1): 1-14 (1995) presented the isolation of a germ cell line derived from porcine blastocyst.
These cells were stably maintained in a mouse embryonic fibroblast feeder layer without the use of conditioned medium and were reportedly differentiated into various different cell types during culture.

【００１２】 さらに、Saitoら.,Roux’s Arch,Dev.Biol.,201:134-141(1992)では第三継代
で生存していたが第四継代後死滅した培養されたウシ胚幹細胞様細胞株について
報告している。Handysideら.,Roux’s Arch.Dev. Biol.,196:185-190(1987)では
マウスのICM由来のマウスES細胞株の分離が可能な条件下でヒツジ胚の免疫外科
的に分離された内部細胞塊の培養について発表している。Handysideらはそのよ
うな条件下でヒツジICMはES細胞様および内胚葉様の細胞の両領域を付着し、拡
散しまた発育させるが、培養期間の延長後は内胚葉様細胞のみの存在が明らかで
ある。Furthermore, in Saito et al., Roux's Arch, Dev. Biol., 201: 134-141 (1992), cultured bovine embryonic stem cell-like cells that survived at the third passage but died after the fourth passage. Reports on cell lines. Handyside et al., Roux's Arch. Dev. Biol., 196: 185-190 (1987), immunosurgically isolated inner cells of sheep embryo under conditions that allow isolation of mouse ICM-derived mouse ES cell lines. Presented about lump culture. Handyside et al. Under such conditions, sheep ICM attach, diffuse, and develop both ES cell-like and endoderm-like cell regions, but it is clear that only endoderm-like cells are present after a prolonged culture period. Is.

【００１３】 最近の報告によると、Chernyら.,Theriogenology,41:175(1994)では長期間培
養で維持された多能性ウシ原生殖細胞由来の細胞株について報告された。これら
の細胞は約７日間の培養の後、アルカリフォスファターゼ(AP)に対して陽性に染
色し胚体を形成する能力を示し、同時に少なくとも二つの細胞型に分化するES様
コロニーを作出した。報告によるとこれらの細胞はまた、包括的にES細胞によっ
て発現したと考えられているホメオボックス遺伝子の型である転写因子OCT4、OC
T6およびHESIに対するmRNAを表現した。According to a recent report, Cherny et al., Theriogenology, 41: 175 (1994) reported a cell line derived from a pluripotent bovine germ cell that was maintained in long-term culture. After about 7 days of culture, these cells stained positive for alkaline phosphatase (AP) and showed the ability to form embryo bodies, and at the same time produced ES-like colonies that differentiate into at least two cell types. These cells have also been reported to be transcription factors OCT4, OC, a type of homeobox gene that is believed to be globally expressed by ES cells.
The mRNA for T6 and HESI was expressed.

【００１４】 また最近、Campbellら.,Nature,380:64-68(1996)ではマウスのES細胞株の分離
を促進する条件下で９日目のウシ胚由来の培養された胚盤(ED)胞の核移入に続い
て生存している子ヒツジの作出が報告された。著者らは核移入によって９日目の
ウシ胚由来のED細胞が核移入によって全能性をもち、その全能性が培養液中で維
持されるという結論に達した。Also, recently, Campbell et al., Nature, 380: 64-68 (1996), cultured scutella (ED) derived from bovine embryo on day 9 under conditions that promote the isolation of mouse ES cell lines. The production of surviving lambs was reported following nuclear transfer of vesicles. The authors concluded that by nuclear transfer, ED cells from day 9 bovine embryos were totipotent by nuclear transfer and that totipotency was maintained in culture.

【００１５】 Van Stekelenburg-Hamersら.,Mol.Reprod.Dev.,40:444-454(1995)ウシ胚盤胞
の内部細胞塊細胞由来の報告による永久細胞株の分離および特徴を報告した。著
者らは支持細胞および培養液がウシICM細胞の付着と生育を維持する為にもっと
も効果的であることを確認するために異なる条件下で８日目もしくは９日目のウ
シ胚盤胞由来のICMを分離し、培養した。彼らは培養されたICM細胞の付着および
生育がSTO(マウス線維芽細胞)支持細胞(ウシ子宮上皮細胞の代わりに)の使用に
よってまた培養液の補足として木炭で引き離し処理した血清(正常な血清よりむ
しろ)の使用によって亢進されるという結論に達した。しかしながら、Van Steke
lenburgらはそれらの細胞株が多能性ICM細胞より上皮細胞に似ているということ
を報告した。Van Stekelenburg-Hamers et al., Mol. Reprod. Dev., 40: 444-454 (1995) reported the isolation and characterization of a permanent cell line derived from inner cell mass cells of bovine blastocysts. The authors derived from bovine blastocysts from day 8 or 9 under different conditions to confirm that feeder cells and cultures were most effective in maintaining bovine ICM cell attachment and growth. The ICM was separated and cultured. They found that adherence and growth of cultured ICM cells was dependent on the use of STO (mouse fibroblast) feeder cells (instead of bovine uterine epithelial cells) and as charcoal-separated serum (from normal serum). It has been concluded that it is enhanced by the use of However, Van Steke
Lenburg et al. reported that those cell lines more like epithelial cells than pluripotent ICM cells.

【００１６】 Smithら.,WO 94/24274（1994年10月27日発行）,Evans ら.,WO 90/03432（1990
年4月5日発行）,およびWheelerら.,WO 94/26889（1994年11月24日発行）では形
質転換した哺乳動物を得るために利用することができる哺乳動物の幹細胞の分離
、選択および増殖について報告した。Evansらはまた形質転換した動物の作出に
有用であると断言できるブタおよびウシ由来の報告による多能性胚幹細胞の誘導
体化を報告した。さらにWheelerら.,WO 94/26884（1994年11月24日発行）はキメ
ラおよび形質転換した有蹄類の作出に有用であると断言できる胚幹細胞について
発表した。Smith et al., WO 94/24274 (issued October 27, 1994), Evans et al., WO 90/03432 (1990
, April 5, 2004), and Wheeler et al., WO 94/26889 (published November 24, 1994), isolate, select and select mammalian stem cells that can be used to obtain transformed mammals. Reported proliferation. Evans et al. Also reported derivatization of pluripotent embryonic stem cells with reports from pigs and cows that could be asserted to be useful in the production of transformed animals. Further, Wheeler et al., WO 94/26884 (published November 24, 1994) published embryonic stem cells which can be asserted to be useful in the production of chimeric and transformed ungulates.

【００１７】 このように前述の説明に基づいて、クローン化されたもしくは形質転換された
胚の作出および核移植における潜在的な利用のために多くの研究グループがES細
胞株を作出することを試みたことがあるということが明らかである。Thus, based on the foregoing, many research groups have attempted to generate ES cell lines for the production of cloned or transformed embryos and their potential use in nuclear transfer. It is clear that there is something that has happened.

【００１８】 従って、すでに文献の中で報告されたことであるが、ドナー核のような培養さ
れた分化した細胞を使用したブタをクローン化する方法の改良の必要性が存在す
る。Therefore, as previously reported in the literature, there is a need for improved methods of cloning pigs using cultured differentiated cells such as donor nuclei.

【００１９】 （発明の目的および概要） ドナー細胞もしくは核として抽出された分化した細胞および核を利用した核移
入によってクローンブタを作出する斬新な改良法を提供することが本発明の目的
である。おそらく、このような分化した細胞は、任意に遺伝的に一時変異された
G1,G2もしくはM細胞期の活発に***している、すなわち非休止状態の(増殖)細胞
を含むであろう。OBJECT AND SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a novel and improved method of producing cloned pigs by nuclear transfer utilizing differentiated cells and nuclei extracted as donor cells or nuclei. Perhaps such differentiated cells were optionally genetically transiently mutated
It will include actively dividing, ie non-quiescent (proliferating) cells at the G 1 , G 2 or M cell stage.

【００２０】 分化したブタ細胞もしくはその核を脱核されたブタ卵母細胞あるいは割球に移
植することを含むブタをクローン化する斬新な方法を供給することが本発明のさ
らに個々の目的である。It is a further individual object of the invention to provide a novel method of cloning pigs which comprises transplanting differentiated pig cells or their nuclei into enucleated pig oocytes or blastomeres. .

【００２１】 すでに証明された遺伝子の有意性もしくは他の望ましい特徴を持つ成熟したブ
タを増やす方法を提供することが本発明の他の目的である。[0021] It is another object of the present invention to provide a method of raising mature pigs with previously demonstrated genetic significance or other desirable characteristics.

【００２２】 遺伝工学的に処理されたもしくは形質転換したブタ(例えばNTユニット、胎児
、産子）を作出する改良法を供給することが本発明の他の目的である。本発明は
またこのような方法で作られたものを含む遺伝工学的に処理されたもしくは形質
転換した子ブタを提供する。It is another object of the present invention to provide an improved method of producing genetically engineered or transformed pigs (eg NT units, fetuses, offspring). The invention also provides genetically engineered or transformed piglets, including those produced by such methods.

【００２３】 NTユニットの形成のために分化した子ブタ細胞もしくは細胞核の利用に先だっ
て分化した子ブタ細胞あるいは細胞核に適切なDNA配列を挿入し、除去しもしく
は一時変異させる遺伝工学的に作った、または形質転換した子ブタを作出する方
法を供給することが本発明のさらに個別の目的である。本発明はまたこのような
方法によって作出された遺伝工学的に作られた子ブタあるいは形質転換した子ブ
タを提供する。Genetically engineered to insert, remove or temporarily mutate the appropriate DNA sequence into the differentiated piglet cell or cell nucleus prior to utilizing the differentiated piglet cell or cell nucleus to form the NT unit, Alternatively, it is a further individual object of the invention to provide a method of producing transformed piglets. The present invention also provides a genetically engineered or transformed piglet produced by such a method.

【００２４】 脱核した子ブタ卵母細胞もしくは割球内に分化した子ブタ細胞の核あるいはそ
の分化した子ブタ細胞を移植することを含む子ブタCICM細胞を作出し、またその
後多能性CICM細胞を作出するために結果として生じたNTユニットを利用する斬新
な方法を供給することが本発明の他の目的である。本発明はまたこのような方法
によって作出された多能性子ブタCICM細胞および細胞株を提供する。A piglet CICM cell comprising transplanting a nucleus of a differentiated piglet cell or a differentiated piglet cell into an enucleated piglet oocyte or a blastomere, and then pluripotent CICM It is another object of the invention to provide a novel method of utilizing the resulting NT unit to create cells. The present invention also provides pluripotent piglet CICM cells and cell lines produced by such methods.

【００２５】 治療もしくは診断の為にこのような子ブタCICM細胞を利用することが本発明の
他の目的である。It is another object of the invention to utilize such piglet CICM cells for treatment or diagnosis.

【００２６】 細胞、組織もしくは器官移植が治療的あるいは診断的に有益であるあらゆる疾
患の治療もしくは診断のためにこのような子ブタCICM細胞を利用することが本発
明の個々の目的である。CICM細胞は例えばヒトの治療のためのように同じ種の中
であるいは種を超えて利用される可能性がある。It is a particular object of this invention to utilize such piglet CICM cells for the treatment or diagnosis of any disease in which cell, tissue or organ transplantation is therapeutically or diagnostically beneficial. CICM cells may be utilized within or across the same species, such as for treatment of humans.

【００２７】 細胞、組織もしくは器官移植が治療的あるいは診断的に有益であるあらゆる疾
患の治療もしくは診断のために子ブタNTユニット、胎児もしくは産子由来の細胞
もしくは組織を利用することが本発明の他の目的である。このような疾患および
障害はパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、ALS、脊椎損傷、多
発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、火傷、脈
管系疾患、尿路疾患、免疫欠損症の治療のためだけでなく、骨髄移植、癌、他の
疾患と合併しているもの等である。その組織は同じ種の中でもしくは種を超えて
利用される可能性がある。The use of piglet NT unit, fetal or litter-derived cells or tissues for the treatment or diagnosis of any disease in which cell, tissue or organ transplantation is therapeutically or diagnostically beneficial is of the present invention. For other purposes. Such diseases and disorders include Parkinson's disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ALS, spinal cord injury, multiple sclerosis, muscular dystrophy, diabetes, liver disease, heart disease, cartilage replacement, burns, vascular disease, urinary tract disease, immunity. Not only for the treatment of deficiencies, but also those associated with bone marrow transplantation, cancer and other diseases. The tissue may be utilized within the same species or across species.

【００２８】 分化した細胞、組織もしくは器官の作出の為に本発明により作出された子ブタ
NTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブタCICM細胞由来の細胞または組織
を利用することが本発明の他の個々の目的である。Piglets produced by the present invention for producing differentiated cells, tissues or organs
It is another individual object of the invention to utilize cells or tissues derived from NT units, fetal or litter, or piglet CICM cells.

【００２９】 in vitroにおいて、例えば細胞分化の研究および検定の目的のために、例えば
医薬品研究のために本発明により作出された子ブタNTユニット、胎児または産子
、もしくは子ブタCICM細胞由来の細胞あるいは組織を利用することが本発明の他
の個々の目的である。例えば、子ブタCICMはSCIDマウスに導入することが可能で
ある。In vitro, cells derived from piglet NT units, fetuses or litters, or piglet CICM cells produced according to the invention, eg for the purpose of cell differentiation studies and assays, eg for pharmaceutical studies. Alternatively, utilizing tissue is another individual object of the invention. For example, piglet CICM can be introduced into SCID mice.

【００３０】 移植治療の改良法を供給する為に子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、ある
いはブタCICM細胞由来の組織このような組織から産出された細胞、組織もしくは
器官を利用することが本発明の他の個々の目的である。このような治療には例と
してパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、ALS、脊椎損傷、多発
性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、火傷、脈管
系疾患、尿路疾患、免疫欠損症の治療のためだけでなく、骨髄移植、癌、他の疾
患と合併しているものを含む疾患および障害の治療等がある。Tissues derived from piglet NT units, fetuses or litters, or porcine CICM cells to provide improved methods of transplantation therapy. The use of cells, tissues or organs produced from such tissues is a subject of the present invention. Is the other individual purpose. Examples of such treatment include Parkinson's disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ALS, spinal cord injury, multiple sclerosis, muscular dystrophy, diabetes, liver disease, heart disease, cartilage replacement, burns, vascular disease, urinary tract disease, Not only for the treatment of immunodeficiency, but also for the treatment of diseases and disorders including bone marrow transplantation, cancer and those associated with other diseases.

【００３１】 NTユニットの形成のために分化した子ブタ細胞もしくは細胞核の利用に先だっ
て分化した子ブタ細胞あるいは細胞核に適切なDNA配列を挿入、除去または一時
変異させることによって作出されたNTユニット、胎児または産子、もしくは子ブ
タCICM由来の遺伝工学的に作られたあるいは形質転換した組織を提供することが
本発明の他の目的である。NT unit, fetus produced by inserting, removing or temporarily mutating an appropriate DNA sequence into the differentiated piglet cell or cell nucleus prior to utilizing the differentiated piglet cell or cell nucleus to form the NT unit Alternatively, it is another object of the invention to provide genetically engineered or transformed tissue from offspring, or piglet CICM.

【００３２】 とりわけ上記に確認された疾患と障害の治療および/もしくは予防のために、
遺伝子治療のために本発明によって作出された子ブタNTユニット、胎児または産
子、もしくは子ブタCICM細胞由来の形質転換したあるいは遺伝工学的に作られた
組織を利用することが本発明の他の目的である。Especially for the treatment and / or prevention of the diseases and disorders identified above,
Utilizing transformed or genetically engineered tissue derived from piglet NT units, fetuses or litters, or piglet CICM cells produced by the present invention for gene therapy is another aspect of the present invention. Is the purpose.

【００３３】 本発明により作出された子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブ
タCICM細胞由来の組織、あるいは核移植の為の核ドナーとして本発明により産出
された子ブタNTユニット、胎児もしくは産子、あるいは子ブタCICM細胞由来の形
質転換したあるいは遺伝工学的に作られた組織を利用することが本発明の他の目
的である。Piglet NT unit produced by the present invention, fetus or litter, tissue derived from piglet CICM cells, or piglet NT unit produced by the present invention as a nuclear donor for nuclear transfer, fetus or It is another object of the invention to utilize transformed or genetically engineered tissue derived from litter or piglet CICM cells.

【００３４】 薬理学的に重要なタンパクを作り出すために本発明により作出された形質転換
したまたは遺伝工学的に作られた子ブタ産子を利用することが本発明の他の目的
である。It is another object of the invention to utilize the transformed or genetically engineered piglet pups produced by the present invention to produce pharmacologically important proteins.

【００３５】 従って、一つの側面として、本発明は子ブタをクローン化する（例えば胚、胎
児、産子）方法を提供する。この方法は次のものを含む： (i)核移入（NT）ユニットの形成に適した条件下で任意に脱核された子ブタ卵母
細胞、もしくは割球内に適切な分化した子ブタ細胞あるいは細胞核を挿入するこ
と； (ii)もしレシピエントの子ブタ卵母細胞あるいは割球が前もって脱核されていな
かったならば、前記の子ブタ卵母細胞あるいは割球から内生核を除去すること； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)NTユニットが胎児内に発生するように宿主の子ブタに前記の培養されたNTユ
ニットを移入すること。Accordingly, in one aspect, the invention provides methods for cloning (eg, embryo, fetus, litter) piglets. The method includes: (i) Piglet oocytes optionally enucleated under conditions suitable for the formation of nuclear transfer (NT) units, or appropriately differentiated piglet cells within blastomeres. Or inserting a cell nucleus; (ii) if the recipient piglet oocyte or blastomere has not previously been enucleated, remove the endonuclear nucleus from said piglet oocyte or blastomere (Iii) activating the resulting nuclear transfection unit; and (iv) transfecting the cultured NT unit into a host piglet so that the NT unit develops in the fetus.

【００３６】 任意に、２細胞発生期より以降の段階になるまで活性核移入ユニットを培養す
る。培養液はNT胚発生を促進するよく知られた置換基、例えばホルモン、塩を含
有し、またさらに任意にアポトーシス、例えばカスパーゼ阻害剤を抑制する化合
物の存在下で任意に培養される。しかしながら、このことはNT活性化のあと直ち
に結果として生じた胎児の発生によって移入できる一つの細胞NT胚としては必要
ではない。Optionally, the active nuclear transfer unit is cultured until the stage after the 2-cell development stage. The culture broth contains well-known substituents that promote NT embryogenesis, such as hormones and salts, and is optionally cultured in the presence of compounds that suppress apoptosis, eg, caspase inhibitors. However, this is not necessary for a single cell NT embryo that can be transferred immediately after NT activation by the resulting fetal development.

【００３７】 さらに、宿主の子ブタはクローン胚の発生を促進するために任意に「ヘルパー
胚」、例えば正常ブタ胚、単為発生の胚、もしくは四倍体胚を含む。ヘルパー胚
数は好ましくは２から約100まで、好ましくは２から50まで、さらに好ましくは
２から10個の胚であろう。In addition, the host piglet optionally contains “helper embryos”, such as normal pig embryos, parthenogenic embryos, or tetraploid embryos, to promote the development of cloned embryos. The number of helper embryos will preferably be from 2 to about 100, preferably from 2 to 50, more preferably from 2 to 10 embryos.

【００３８】 胎児の細胞、組織および/もしくは器官は細胞、組織および/もしくは器官移植
、あるいは適切な遺伝子型の作出の領域で有利に用いられる。Fetal cells, tissues and / or organs are advantageously used in the area of cell, tissue and / or organ transplantation, or generation of suitable genotypes.

【００３９】 本発明はまた任意に脱核された卵母細胞もしくは割球の中に分化した子ブタ細
胞あるいは細胞核を挿入することに先だってその方法によって適切なDNA配列を
分化したブタ細胞または細胞核に挿入、除去もしくは一時変異する遺伝工学的に
作られたあるいは形質転換した子ブタをクローン化する方法を含む。このような
方法によって作出された遺伝工学的に作られたあるいは形質転換した子ブタは細
胞、組織および/もしくは器官移植、適切な遺伝子型の作出、および薬剤タンパ
クの作出の領域で有利に利用される。The present invention also provides that by inserting the differentiated piglet cells or cell nuclei into an optionally enucleated oocyte or blastomere, by the method, a suitable DNA sequence is introduced into the differentiated pig cells or cell nuclei. Methods of cloning genetically engineered or transformed piglets that insert, remove or transiently mutate are included. Genetically engineered or transformed piglets produced by such methods are advantageously utilized in the areas of cell, tissue and / or organ transplantation, production of appropriate genotypes, and production of drug proteins. It

【００４０】 もしクローン化した胎児、胚、もしくは産子が移植のための細胞、組織あるい
は器官を作出するために利用される予定であるならば、拒絶の危険性を抑制する
ために一つ以上の遺伝子一時変異を導入することがまた望ましい。例えば個々の
炭水化物エピトープが拒絶反応、すなわち血管内皮のGa1αl-Galに含まれるとい
うことが知られている。したがって、これらのエピトープをコードし、もしくは
ヒトタンパクに存在する他の炭水化物エピトープ(「競合的グリコシル化」)によ
ってこのようなエピトープを置換する(例えば遮蔽する)遺伝子をノックアウトす
ることが有利である可能性がある。とりわけ、αGal発現の90%を削減するために
、90％のヒトがそれに対して抗体を作らないヒト組織血O(H)抗原に対する遺伝子
の導入が一つの選択肢である。他方、αGalエピトープは、好ましくは強力に制
御できるあるいは構成要素であるプロモーターの制御下で発現したα-ガラクト
シダーゼに対してin vivoでcDNAを導入することによって酵素的に除去される可
能性がある。また他の選択肢は、例えば相同組み換えによるガラクトシル転移酵
素の発現を除去することである。またこのことは新しい炭水化物エピトープを導
入する際ノックアウトによって、あるいは酵素的にこれらのエピトープを除去す
ることが望ましい。If the cloned fetus, embryo, or offspring is to be used to create cells, tissues or organs for transplantation, one or more to reduce the risk of rejection. It is also desirable to introduce the gene transient mutation of For example, it is known that individual carbohydrate epitopes are included in the rejection response, namely Ga1αl-Gal of vascular endothelium. Thus, it may be advantageous to knock out genes that encode these epitopes or that replace (e.g. mask) such epitopes by other carbohydrate epitopes present on human proteins ("competitive glycosylation"). There is a nature. In particular, in order to reduce 90% of αGal expression, the introduction of a gene for human tissue blood O (H) antigen, against which 90% of humans do not make an antibody, is one option. On the other hand, the αGal epitope may be enzymatically removed by introducing the cDNA in vivo against α-galactosidase, which is preferably expressed under the control of a strongly controllable or constituent promoter. Yet another option is to eliminate the expression of galactosyltransferases, eg by homologous recombination. It is also desirable to remove these epitopes by knocking out when introducing new carbohydrate epitopes or enzymatically.

【００４１】 また、主要な組織適合性複合体(MHC)クラスI抗原が免疫反応を引き出すという
ことが知られているため、このような発現、例えばβ2-マイクログロブリン(構
築及び発現の為に必要なクラスI分子の一部を形成するぺプタイド)、プロテアソ
ームのサブユニットLMP-2及びLMP-7、および/もしくはペプタイド輸送体TAP-1お
よび/もしくはTAP-2(細胞表面への輸送の開始時に小胞体の膜を通ってTAP-1およ
びTAP-2がペプタイド断片を輸送する)に含まれる遺伝子の発現を除去することが
望ましい。It is also known that major histocompatibility complex (MHC) class I antigens elicit an immune response, so such expression, eg β 2 -microglobulin (for construction and expression, Peptides that form part of the required class I molecule), the proteasome subunits LMP-2 and LMP-7, and / or the peptide transporters TAP-1 and / or TAP-2 (initiation of cell surface transport). Sometimes it is desirable to eliminate the expression of genes involved in TAP-1 and TAP-2 transporting peptide fragments across the membrane of the endoplasmic reticulum.

【００４２】 またさらに、IL-4、可溶性CTLA-4、CTLA4-Ig、抗-CD40、抗-CD40-L(CD154)、
レセプターリガンド対の他の阻害剤もしくはFasリガンドのような抑制性サイト
カインのドナー組織における局所的な発現の上記の生理学的ダウンレギュレーシ
ョンが、例えば移植された異種移植片に対して耐性を誘導することによって拒絶
反応を抑制する可能性がある。また内皮細胞活性化に関連した炎症前薬物治療を
中止させるためにまたアプトーシスからドナー細胞、組織および器官を保護する
ために、保護遺伝子の発現を亢進することにより拒絶反応が予防もしくは抑制さ
れる可能性がある。例えば、ストレス反応性遺伝子ヘム(HO-1)の発現は異種移植
の生存数を高めることができる。また、例えば転写活性を阻害する抗アポプトー
シス遺伝子が異種移植の生存数を亢進するために過剰発現する可能性がある。ア
ポプトーシスを抑制する多くの遺伝子をクローン化し配列した。Furthermore, IL-4, soluble CTLA-4, CTLA4-Ig, anti-CD40, anti-CD40-L (CD154),
By the above physiological downregulation of local expression in donor tissues of inhibitory cytokines such as other inhibitors of the receptor-ligand pair or Fas ligand, eg by inducing resistance to transplanted xenografts. May suppress rejection. In addition, rejection can be prevented or suppressed by enhancing the expression of protective genes in order to discontinue pre-inflammatory drug treatment related to endothelial cell activation and to protect donor cells, tissues and organs from apoptosis. There is a nature. For example, expression of the stress responsive gene heme (HO-1) can increase survival in xenografts. Further, for example, an anti-apoptosis gene that inhibits transcriptional activity may be overexpressed in order to enhance the survival number of xenotransplantation. Many genes that suppress apoptosis have been cloned and sequenced.

【００４３】 またさらに、内生ブタレトロウィルスは宿主ゲノム内に挿入しているこのよう
な配列の危険性を予防するために除去される可能性がある。Still further, the endogenous porcine retrovirus may be removed to prevent the risk of such sequences inserting into the host genome.

【００４４】 また、補体活性化が過敏性の拒絶反応の臨界メディエーターであるため、この
経路は遺伝的一時変異によって抑制される可能性がある。特に、補足カスケード
は崩壊促進因子(DAF、CD55)、通常補足カスケードのさまざまな段階で阻害剤と
して働く膜補助因子(MCP、CD46)を含む一群の内皮タンパクによってしっかりと
制御されていることが知られている。これらのタンパクは制限された活性をもつ
。すなわちそれらは相同性（同種)標的分子に働くだけである。したがってブタ
組織の血管内皮のヒト補体抑制タンパク(例えばDAF、MCP）をコードする遺伝子
を導入することが有益であろう。また、最適な結果、すなわち拒絶反応をひきお
こす力が非常に小さい細胞、組織もしくは器官を作出することを得るためにこれ
らの遺伝的方法を組み合わせることが有益であろう。Also, since complement activation is a critical mediator of hypersensitivity rejection, this pathway may be suppressed by genetic transient mutations. In particular, the complement cascade is known to be tightly regulated by a group of endothelial proteins including decay-promoting factors (DAF, CD55), membrane cofactors (MCP, CD46) that normally act as inhibitors at various stages of the complement cascade. Has been. These proteins have limited activity. They only work on homologous (homologous) target molecules. Therefore, it would be beneficial to introduce genes encoding human complement inhibitory proteins (eg, DAF, MCP) on vascular endothelial tissue of pig tissue. It would also be beneficial to combine these genetic methods in order to obtain optimal results, ie cells, tissues or organs with very little power to cause rejection.

【００４５】 またさらに、細胞、組織もしくは器官は移植の前に耐性を誘導するためにレシ
ピエントへの移植に先だって、ドナー細胞および他の薬剤、例えばCTLA-4 Ig、
免疫毒素、抗CD40-Lの存在下でin vitroで培養される可能性がある。Still further, the cells, tissues or organs may be donor cells and other agents, such as CTLA-4 Ig, prior to transplantation into a recipient to induce tolerance prior to transplantation.
It may be cultured in vitro in the presence of the immunotoxin, anti-CD40-L.

【００４６】 もちろん、例としてシクロスポリン、グルココルチコイド、FK-506、ラパマイ
シン、イムラン、およびそれらの誘導体を含む移植後の抗拒絶反応剤を投与する
ことがさらに必要であろう。Of course, it may be further necessary to administer post-transplantation anti-rejection agents including, by way of example, cyclosporine, glucocorticoids, FK-506, rapamycin, immunolan, and their derivatives.

【００４７】 前記の方法によって得られたブタ及びそれらのブタの産子が本発明により提供
される。Pigs obtained by the above method and their offspring are provided by the present invention.

【００４８】 他の側面として、本発明はブタCICM(多能性)細胞を作出するための方法を提供
する。その方法は次のものから成る： (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で任意に脱核した子ブタ卵母細胞
もしくは割球内に適切な分化した子ブタ細胞もしくは細胞核を挿入すること； (ii)もし前もって脱核されていない場合卵母細胞もしくは割球の内生核を任意に
除去すること； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)子ブタCICM細胞を得るために前記の培養したNTユニットから得られた培養細
胞。In another aspect, the invention provides a method for generating porcine CICM (pluripotent) cells. The method consists of: (i) Appropriately differentiated piglet cells or cell nuclei within piglet oocytes or blastomeres optionally enucleated under conditions suitable for the formation of nuclear transfer (NT) units. (Ii) optionally removing the endonuclear nucleus of the oocyte or blastomere if not previously enucleated; (iii) activating the resulting nuclear import unit; and (iv) Cultured cells obtained from the above cultured NT units to obtain piglet CICM cells.

【００４９】 任意に、活性化された核移入ユニットは２細胞発生期より以降の段階になるま
で活性化された核移入ユニットは培養する。結果として生じた子ブタCICM細胞は
細胞、組織および器官移植の領域で有利に利用される。Optionally, the activated nuclear transfection unit is cultured until the 2-cell development stage and later stages. The resulting piglet CICM cells are advantageously utilized in the area of cell, tissue and organ transplantation.

【００５０】 下記で明らかになるであろう本発明の前述のおよび他の目的、利点および特徴
により、本発明の性質は次の好ましい具体例の詳しい説明および補遺の請求項を
参考にすることによってさらに明らかに理解できるであろう。With the foregoing and other objects, advantages and features of the invention which will become apparent below, the nature of the invention will be explained by reference to the following detailed description of the preferred embodiments and the appended claims. You can understand it more clearly.

【００５１】 （本発明の詳細な説明） 本発明は核移入もしくは核移植によるクローン子ブタに対する改良法を提供す
る。この申請書の中で核移入もしくは核移植あるいはNTは互換性をもって利用さ
れる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides an improved method for cloning piglets by nuclear transfer or nuclear transfer. In this application, nuclear transfer or nuclear transfer or NT will be used interchangeably.

【００５２】 本発明により、分化した子ブタ細胞由来の細胞核を脱核したブタ卵母細胞また
は割球の中に移植する。胎児および産子を作出するためにレシピエントの雌の中
に移入できるクローン胚の発生を方向づけるために核を再プログラムし、もしく
はCICM細胞を作出するために利用する。クローン胚はまたキメラ胚、胎児および
/もしくは産子を作出するために受精胚と結合することができる。According to the present invention, cell nuclei derived from differentiated piglet cells are transplanted into enucleated pig oocytes or blastomeres. Used to reprogram the nucleus to direct the development of cloned embryos that can be transferred into recipient females to generate fetuses and offspring, or to generate CICM cells. Cloned embryos also include chimeric embryos, fetuses and
/ Or can be combined with fertilized embryos to produce offspring.

【００５３】 クローニング工程においては先行技術の方法には胚細胞型が用いられる。これ
はCampbellら(Nature,380:64-68,1996)およびSticeら(Biol.Reprod.,54:100-110
,1996)による研究を含む。これらの両研究において胚細胞株は妊娠10日以前の胚
由来のものであった。両研究において細胞はクローニング工程に利用されるため
にドナー細胞の明白な分化を妨げる支持細胞層上で維持した。本発明には分化し
た細胞を使用する。In the cloning step, germ cell types are used in the prior art methods. This is due to Campbell et al. (Nature, 380: 64-68, 1996) and Stice et al. (Biol. Reprod., 54: 100-110).
, 1996). In both of these studies, germ cell lines were derived from embryos prior to 10 days gestation. In both studies cells were maintained on a feeder layer that prevented the apparent differentiation of donor cells to be utilized in the cloning process. Differentiated cells are used in the present invention.

【００５４】 報告によればヒツジ由来の成熟細胞および胎児線維芽細胞がヒツジ産子を産出
するために利用された(Wilmutら,1997）。しかしながら複数の研究では子ブタの
クローン化はヒツジのクローン化よりさらに困難であることが示されている。実
際に哺乳類の種の研究ではヒツジのクローン化はもっとも容易であるように見え
、また子ブタのクローン化はもっとも困難であるように見える。従って、本発明
による分化した細胞型、好ましくは活発に***している非休止状態の細胞、すな
わちG1、G2、もしくはM細胞期、を用いた子ブタのクローン化の成功は予期しな
い結果である。[0054] Sheep-derived mature cells and fetal fibroblasts were reportedly utilized to produce sheep offspring (Wilmut et al., 1997). However, studies have shown that cloning piglets is more difficult than cloning sheep. Indeed, in studies of mammalian species, cloning of sheep seems to be the easiest and cloning of piglets seems to be the most difficult. Accordingly, the present invention differentiated cell types by, preferably actively dividing to have a non-dormant cells, i.e. G 1, G 2, or M cell stage, successful cloning of piglets with the unexpected result Is.

【００５５】 したがって、本発明により、子ブタの優位の遺伝子型の増殖が可能である。こ
れによって証明された遺伝的優位もしくは他の望ましい特徴をもった成熟した子
ブタの増殖が可能になるであろう。遺伝的工程が子ブタにおいて促進されるであ
ろう。本発明によって、10億もの胎児もしくは成熟した子ブタ細胞を潜在的にク
ローニング工程のために取り入れ利用することが可能である。このことにより結
果として短期間で多数の同一の産子が生じるであろう。Thus, the present invention allows for the growth of dominant genotypes of piglets. This would allow the growth of mature piglets with proven genetic dominance or other desirable characteristics. The genetic process will be accelerated in piglets. The present invention allows potentially up to 1 billion fetal or mature piglet cells to be incorporated and utilized for the cloning process. This will result in a large number of identical offspring in the short term.

【００５６】 本発明はまたクローン化によって増殖させることが可能な細胞源との作用によ
る形質転換工程の簡易化を可能にする。これによって未分化状態の細胞を維持す
る必要性がなくなる。従って、無作為な組込みおよびジーンターゲティングの両
方の遺伝的一時変異がさらに簡単に実施される。またin vitroで核移入をこれら
の細胞の一時変異および選択能力と組み合わせることによって、この工程は過去
の形質転換胚法よりさらに有効である。本発明により、さらに形質転換工程を簡
易化しまた促進して、サイトカイン、調整された培養液および/もしくは支持細
胞層なしに、これらの細胞をクローン化によって増殖できる。移入された細胞が
本発明によりクローン化工程において利用される場合、胎児および産子に発生す
ることが可能な形質転換された子ブタの胚が作出される。また、これらの形質転
換したクローン胚はCICM細胞株もしくは他の胚細胞株を作出するために利用でき
る。従って、本発明により遺伝工学技術に貢献する未分化細胞株をin vitroで誘
導および維持する必要性がなくなる。The present invention also allows for the simplification of the transformation process by acting with a cell source that can be propagated by cloning. This eliminates the need to maintain undifferentiated cells. Therefore, both genetic mutations of random integration and gene targeting are more easily performed. Also, by combining nuclear transfer in vitro with the transient mutagenesis and selection capacity of these cells, this process is even more effective than previous transgenic embryo methods. The present invention further simplifies and facilitates the transformation process so that these cells can be expanded by cloning without cytokines, conditioned medium and / or feeder layers. When the transferred cells are utilized in the cloning process according to the present invention, transformed piglet embryos capable of developing into fetuses and offspring are produced. Also, these transformed cloned embryos can be used to create CICM cell lines or other embryo cell lines. Therefore, the present invention eliminates the need for in vitro induction and maintenance of undifferentiated cell lines that contribute to genetic engineering technology.

【００５７】 好ましい具体例として、複合体遺伝子一時変異のために個々に適用できる適切
な分化した細胞は遺伝的に好ましくは組織培養において一時変異されるであろう
。クローン胎児もしくは哺乳動物を作出するために利用されるこれらの遺伝的に
一時変異した細胞、および分化した細胞はその後、追加的な遺伝的一時変異の影
響をうけて、また結果として生じた2回遺伝的に一時変異した細胞はクローニン
グのための細胞および核ドナーとして利用されて、クローン胎児もしくは哺乳類
から誘導される。発明者が「再クローニング」と呼ぶこの工程は相当な時間を必
要とする複合体遺伝的一時変異の作出のために有用である。本質的に、クローニ
ングの前に、別々の段階でこのような遺伝的一時変異を生じることによって、す
べての適切な遺伝的一時変異を生じる前に、潜在的に老化した細胞の問題なしに
適切な遺伝的一時変異を作出することは可能である。理論上、この工程を必要な
だけ何回も繰り返すことが可能である。In a preferred embodiment, the appropriately differentiated cells that can be individually applied for the complex gene transient mutation will be genetically preferably transiently mutated in tissue culture. These genetically transient and differentiated cells utilized to create cloned fetuses or mammals are then affected by the additional genetic transients and the resulting twice-mutated cells. Genetically transiently mutated cells serve as cells for cloning and nuclear donors and are derived from cloned fetuses or mammals. This process, which the inventor calls "recloning", is useful for the creation of complex genetic transient mutations that require a significant amount of time. In essence, prior to cloning, the generation of such genetic mutations in discrete steps ensures that all suitable genetic mutations occur before proper cloning without the problems of potentially aged cells. It is possible to create a genetic transient mutation. In theory, this process can be repeated as many times as necessary.

【００５８】 本発明により作出された形質転換したCICM細胞はin vitroで無期限に維持する
ことが可能で、それによって適切な分化した細胞型を後に作出するために未分化
多能性細胞を無制限に補給する。好ましい具体例として、これらのCICMは普通に
与えられた米国特許No.5,905,042,の中に開示された方法により未分化状態で維
持されるであろう。これは全体的にこの文書の中に具体的に示されている。The transformed CICM cells produced according to the present invention can be maintained in vitro indefinitely, thereby allowing unlimited differentiation of undifferentiated pluripotent cells to later produce the appropriate differentiated cell type. Supply to. As a preferred embodiment, these CICMs will be maintained undifferentiated by the method disclosed in commonly-assigned US Pat. No. 5,905,042. This is specifically set out in this document.

【００５９】 本発明はまた、例えば細胞、組織および器官移植に利用できるクローン子ブタ
の胎児、産子もしくはCICM細胞を作出するために利用できる。子ブタ由来の胎児
もしくは成熟細胞を採取することおよびクローニング工程の中でそれを利用する
ことによって、様々な細胞、組織およびおそらく器官は器官形成により発生する
ためそれらはにクローン胎児から得られる。細胞、組織、および器官は同様にク
ローン産子から分離が可能であるこの工程は細胞および遺伝子治療を含む多くの
医学的および獣医学的治療のための「物質」の源を提供する。もし細胞が誘導さ
れた哺乳動物に細胞を移入しもどすなら、その後の免疫学的拒絶反応は消失する
。また、多数の細胞型をこれらのクローンから分離することが可能であるため、
造血キメラ現象のような他の方法では種間と同様に同じ種の動物の間で免疫拒絶
反応を避けるために利用できる。The present invention can also be used to generate cloned piglet fetal, litter or CICM cells which can be used, for example, for cell, tissue and organ transplants. By harvesting fetal or mature cells from piglets and utilizing them in the cloning process, they are obtained from cloned fetuses because various cells, tissues and possibly organs develop by organogenesis. Cells, tissues, and organs can also be separated from clonal offspring. This process provides a source of "substance" for many medical and veterinary therapies, including cell and gene therapy. If the cells are transferred back to the mammal from which they were induced, the subsequent immunological rejection will disappear. Also, since it is possible to isolate a large number of cell types from these clones,
Other methods such as hematopoietic chimerism can be used to avoid immune rejection between animals of the same species as well as between species.

【００６０】 このように、一つの側面として、本発明は子ブタのクローニング法を提供する
。一般的に、子ブタは次の段階を含む核移入工程によって作出されるであろう：
(i)ドナー核もしくはドナー細胞源として利用するための適切な分化した子ブタ
細胞を入手すること； (ii)子ブタ卵母細胞もしくは割球； (iii)任意に脱核している前記の卵母細胞あるいは割球； (iv)適切な分化した細胞もしくは細胞核を、例えば点滴あるいは注射によって、
NTユニットを形成するために、任意に脱核した卵母細胞または割球内に移入する
こと； (v)もし前もって脱核していない場合、内生卵母細胞もしくは割球を除去するた
めにＮＴユニットを脱核すること； (vi)結果として生じたNTユニットを活性化すること；および (vii)NTユニットが胎児内に発生するように前記の培養したNTユニットを宿主の
子ブタに移入すること。Thus, in one aspect, the present invention provides a method for cloning piglets. Generally, piglets will be produced by a nuclear transfer process that includes the following steps:
(i) obtaining suitable differentiated piglet cells for use as donor nuclei or source of donor cells; (ii) piglet oocytes or blastomeres; (iii) optionally enucleated as described above. Oocytes or blastomeres; (iv) appropriate differentiated cells or cell nuclei, for example by infusion or injection,
Transfer into an optionally enucleated oocyte or blastomere to form an NT unit; (v) to remove an endogenous oocyte or blastomere, if not previously enucleated Enucleating the NT unit; (vi) activating the resulting NT unit; and (vii) transferring the cultured NT unit into a host piglet so that the NT unit occurs in the fetus. To do.

【００６１】 任意に、活性化された核移入ユニットは２細胞発生期より以降の段階まで培養
する。また、宿主のブタは、1個以上の「ヘルパー」胚を含有するであろう。そ
れは例えば正常子ブタ胚、四倍体胚、もしくはクローン胚の発生を促進するため
の単為発生胚である。Optionally, the activated nuclear transfer unit is cultured from the 2-cell development stage to later stages. Also, the host pig will contain one or more "helper" embryos. It is, for example, a parthenogenetic embryo for promoting the development of a normal piglet embryo, a tetraploid embryo, or a cloned embryo.

【００６２】 本発明はまた適切なDNA配列が、任意に脱核された卵母細胞あるいは割球の中
に分化した子ブタ細胞もしくは細胞核を挿入する前に、分化したブタ細胞もしく
は細胞核に挿入、除去もしくは一時変異される遺伝工学的に作られたもしくは形
質転換した子ブタのクローニング法を含む（脱核はドナー細胞もしくは核の挿入
の後起こる）。The invention also provides that the appropriate DNA sequence is inserted into the differentiated pig cell or cell nucleus prior to the insertion of the differentiated piglet cell or cell nucleus into the optionally enucleated oocyte or blastomere, Includes methods for cloning genetically engineered or transformed piglets that are removed or transiently mutated (enucleation occurs after donor cell or nuclear insertion).

【００６３】 また上記の手法によって得られたクローンブタおよびそれらのブタの産子は本
発明によって提供される。すでに形質転換した受精ブタと対照的に、これらのク
ローンは核移入ドナーとして利用されるすでに存在している分化した細胞を含む
であろう。The cloned pigs obtained by the above-mentioned method and the offspring of those pigs are also provided by the present invention. In contrast to already transformed fertilized pigs, these clones will contain pre-existing differentiated cells utilized as nuclear transfer donors.

【００６４】 上述の利用法に加えて、本発明による遺伝工学的に作られたもしくは形質転換
したブタは、薬理学的に重要なタンパクのような適切なタンパクを作出するため
に利用することができる。その上適切なタンパクは形質転換したブタの乳もしく
は他の体液または組織から分離することが可能である。他方、外生のDNA配列に
より、疾患に対する抵抗力、体脂肪の減少、赤身の肉製品の増加、飼料の転換の
改善、もしくは産子の去勢比率のような、形質転換したブタに対する農学的に有
用な特徴がもたらされる可能性がある。また、外生のDNAは例えばヒトのような
非相同性宿主におけるこのような細胞の拒絶反応を抑制する一つ以上のDNAをコ
ードする可能性がある。個々の好ましい具体例として、ブタは一つ以上のヒト遺
伝子、例えば好ましくはブタと同等の動物の助けになるように挿入されたコラー
ゲン、免疫タンパク、ホルモン、酵素、凝固因子のようなコードした構造タンパ
クを発現するであろう。もしブタ同等動物の中にヒト因子VIIIが発現するならば
、例えばブタ因子IIIのような相同性ブタタンパクを除去する必要をなくすよう
な、後のヒトタンパクの回収が上述の特徴によって促進されるであろう。In addition to the above-described uses, the genetically engineered or transformed pigs according to the present invention may be used to produce suitable proteins, such as pharmacologically important proteins. it can. Moreover, the appropriate protein can be isolated from transformed pig milk or other body fluids or tissues. On the other hand, exogenous DNA sequences can be agronomically applied to transformed pigs, such as disease resistance, decreased body fat, increased lean meat products, improved feed conversion, or castration ratio of offspring. May bring useful characteristics. Also, the exogenous DNA may encode one or more DNAs that inhibit rejection of such cells in a heterologous host such as humans. In a particularly preferred embodiment, the pig is one or more human genes, preferably encoded structures such as collagen, immunoproteins, hormones, enzymes, coagulation factors inserted to aid the animal of the pig equivalent. Will express the protein. If human factor VIII is expressed in porcine equivalents, subsequent recovery of human protein is facilitated by the above features, eliminating the need to remove homologous porcine proteins such as porcine factor III. Will.

【００６５】 本発明はさらに細胞、組織および器官移植の領域におけるNT胎児とNTおよびキ
メラ産子の利用法を提供する。The present invention further provides the use of NT fetuses and NT and chimeric offspring in the area of cell, tissue and organ transplantation.

【００６６】 他の側面として、本発明は子ブタCICM細胞を作出するための手法を提供する。
その手法は次のものから成る。 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に脱核したブタ卵母細胞
もしくは割球の中に適切な分化したブタ細胞もしくは細胞核を挿入すること； (ii)もし前もって除去しない場合内生の卵母細胞もしくは割球の核を除去するこ
と； (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化すること；および (iv)子ブタCICM細胞を得るための前記の培養されたNTユニット由来の培養細胞。In another aspect, the invention provides a method for generating piglet CICM cells.
The method consists of: (i) inserting an appropriately differentiated porcine cell or cell nucleus into an optionally enucleated porcine oocyte or blastomere under conditions suitable for the formation of a nuclear transfer (NT) unit; (ii) if Removing the nucleus of an endogenous oocyte or blastomere, if not previously removed; (iii) activating the resulting nuclear transfer unit; and (iv) the above to obtain piglet CICM cells. Cultured cells derived from cultured NT unit.

【００６７】 上述のように、好ましい培養工程は米国特許No.5,905,042の中で開示されてお
り、全体的にこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。任意に、活性化
された核移入ユニットを2細胞発生期より以降の段階まで培養する。As noted above, the preferred culturing process is disclosed in US Pat. No. 5,905,042 and is specifically set forth in the references within this document. Optionally, the activated nuclear transfer unit is cultured from the 2-cell development stage to later stages.

【００６８】 ブタCICMは細胞、組織および器官移植の領域において、あるいは形質転換した
胎児または産子も含めて、胎児もしくは産子の作出に有益に用いられる。Porcine CICM is beneficially used in the area of cell, tissue and organ transplantation, or for the production of fetuses or offspring, including transformed fetuses or offspring.

【００６９】 この文書の中で用いられたように、胎児は子宮のなかで形づくられた後の胎生
哺乳動物の胎内の子である。ブタにおいては、胎児期は受胎の後30日から誕生ま
での間である。哺乳動物では誕生から死亡までの間が成熟期である。As used in this document, a fetus is an in-fetal offspring of an embryonic mammal after it has been shaped in the uterus. In pigs, the fetal period is between 30 days after conception and birth. In mammals, the period from birth to death is the maturity stage.

【００７０】 任意に、NTユニットは少なくとも2個から400個の細胞の大きさまで、好ましく
は4個から128個の細胞まで、最も好ましくは少なくとも約50個の細胞まで培養す
る。Optionally, the NT units are cultured to a size of at least 2 to 400 cells, preferably 4 to 128 cells, most preferably at least about 50 cells.

【００７１】 核移入法もしくは核移植法は文献のなかでよく知られており、また本発明の背
景の中で引用した多くの参考文献の中に記載されている。個別的には、Campbell
ら, Theriogenology, 43 : 181 (1995); Collasら, Mol. Report Dev., 38 : 26
4-267 (1994); Keeferら, Biol. Reprod., 50 : 935-939 (1994); Simsら, Proc
. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274,
およびWO 90/03432である。これらはこの文書の中の参考文献に具体的に示され
ている。また、米国特許Nos.4,944,384および5,057,420ではウシ核移植の工程に
ついて述べられている。Nuclear transfer or nuclear transfer methods are well known in the literature and are described in many of the references cited in the background of the invention. Individually, Campbell
Et al, Theriogenology, 43: 181 (1995); Collas et al, Mol. Report Dev., 38: 26.
4-267 (1994); Keefer et al., Biol. Reprod., 50: 935-939 (1994); Sims et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274,
And WO 90/03432. These are specifically set forth in the references within this document. Also, US Pat. Nos. 4,944,384 and 5,057,420 describe the process of bovine nuclear transfer.

【００７２】 分化したとは周囲の構造もしくは起源の細胞とは別の特徴または機能をもつ細
胞を表す。分化した子ブタ細胞は初期胚期を過ぎた細胞である。さらに個別には
分化した細胞は少なくとも胚盤期（ウシ胚形成の10日目）を過ぎた時からの細胞
である。分化した細胞は外胚葉、中胚葉あるいは内胚葉由来である可能性がある
。Differentiated refers to cells that have characteristics or functions other than the cells of the surrounding structure or origin. Differentiated piglet cells are cells that have passed the early embryonic stage. Further, the individually differentiated cells are cells at least after the blastodisc stage (the 10th day of bovine embryogenesis). Differentiated cells may be derived from ectoderm, mesoderm or endoderm.

【００７３】 好ましい具体例として、分化した細胞は活性増殖(非休止状態の)細胞、すなわ
ちG1、G2もしくはM細胞期である。このような細胞は直接成熟したあるいは胎児
のブタから得られる可能性があるか、もしくはin vitroで培養組織から分離され
る可能性がある。またさらに、このような分化している細胞は、ブタ以外の動物
、たとえばブタ免疫細胞を移植されたSCIDマウス由来である可能性がある。適当
な分化した細胞は体細胞および 生殖細胞を含むドナー細胞もしくは核、および
それら由来の核と同様に有益である。In a preferred embodiment, the differentiated cells are active proliferating (non-quiescent) cells, ie at the G 1 , G 2 or M cell stage. Such cells may be directly obtained from mature or fetal pigs, or may be isolated from cultured tissue in vitro. Furthermore, such differentiated cells may be derived from animals other than pigs, such as SCID mice transplanted with pig immune cells. Suitable differentiated cells are as useful as donor cells or nuclei, including somatic and germ cells, and nuclei derived therefrom.

【００７４】 子ブタ細胞は周知の方法によって得られる。本発明で 有用な子ブタ細胞は、
例として上皮細胞、積細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン細胞、造血細胞、
メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球(BおよびTリンパ球)、赤血球、樹状細胞、マ
クロファージ、単球、単核細胞、および他の免疫細胞、線維芽細胞、心筋細胞、
および他の筋細胞等を含む。さらに、核移入のために用いられたブタ細胞は異な
る器官、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、
尿道および他の尿路器官等、別々の器官から得られる可能性がある。また、個々
の分化した細胞型に対する幹細胞は有用なドナー細胞、例えば造血管細胞である
可能性がある。これらは適当なドナー細胞のほんの一部の例にすぎない。適当な
ドナー細胞、すなわち本発明で有用な細胞は体のあらゆる細胞あるいは器官から
得られる可能性がある。上記のように、ドナー細胞は体細胞および生殖細胞の両
方を含むことを意味する。Piglet cells are obtained by well known methods. Piglet cells useful in the present invention include
Examples are epithelial cells, product cells, nerve cells, epidermal cells, keratinocytes, hematopoietic cells,
Melanocytes, chondrocytes, lymphocytes (B and T lymphocytes), erythrocytes, dendritic cells, macrophages, monocytes, mononuclear cells, and other immune cells, fibroblasts, cardiomyocytes,
And other muscle cells and the like. In addition, the porcine cells used for nuclear transfer are different organs such as skin, lung, pancreas, liver, stomach, intestine, heart, reproductive organs, bladder, kidney,
It can come from different organs, such as the urethra and other urinary tract organs. Also, stem cells for individual differentiated cell types can be useful donor cells, eg hematopoietic cells. These are just a few examples of suitable donor cells. Suitable donor cells, ie cells useful in the present invention, may be obtained from any cell or organ of the body. As mentioned above, donor cells are meant to include both somatic and germ cells.

【００７５】 例えば、生殖細胞の場合にこれはとりわけ原生殖細胞を含むであろう。[0075]   For example, in the case of germ cells, this would include progenitor cells, among others.

【００７６】 線維芽細胞は発生分化している胎児および成熟した子ブタから大量に得られる
ため理想的な細胞型である。線維芽細胞はある程度分化しまたそれ故にクローニ
ング工程で用いられる理想的でない細胞型であると以前は考えられていた。重要
なことに、これらの細胞はin vitroで急速な倍加時間で容易に増殖が可能でまた
ジーンターゲティング工程における利用のためにクローニングによって増殖でき
る。再び本発明は分化した細胞型が使用されるため斬新である。本発明はこれら
の細胞が容易に増殖され、in vitroで遺伝的に一時変異し選択されるため有益で
ある。Fibroblasts are an ideal cell type because they are obtained in large quantities from developing embryos and mature piglets. Fibroblasts have previously been thought to be some type of differentiation and therefore a non-ideal cell type used in the cloning process. Importantly, these cells can be readily propagated in vitro with rapid doubling times and can be cloned for use in the gene targeting process. Again the present invention is novel because a differentiated cell type is used. The present invention is beneficial because these cells are easily propagated and genetically mutated and selected in vitro.

【００７７】 卵母細胞の分離の手法は専門家の間で良く知られている。本質的に、これは子
ブタの卵巣もしくは生殖器から卵母細胞を分離することを含むであろう。容易に
入手できる子ブタの卵母細胞源は標本源は畜殺場の材料である。Techniques for oocyte isolation are well known to those skilled in the art. In essence, this would involve separating the oocyte from the ovary or reproductive organs of the piglet. A readily available source of piglet oocytes is a sample source of slaughterhouse material.

【００７８】 遺伝工学、核移入およびクローニングのような技術をうまく利用するために、
卵母細胞はこれらの細胞が核移入のためのレシピエント細胞として利用される前
にin vitroで成熟させることが可能である。この工程は一般的にブタ卵巣、例え
ば畜殺場で入手した子ブタ卵巣由来の回収した未熟(前記I)卵母細胞を必要とし
、また子ブタ卵巣の場合に一般的に卵母細胞が吸引後約35-45時間で起こる中期I
I期に達するまで、受精もしくは脱核する前に成熟培養液の中で卵母細胞を成熟
させることを必要とする。本発明の目的のために、この期間は「成熟期間」とし
て知られている。期間の計算のためにこの文書の中で用いられたように、「吸引
」は卵胞由来の未熟卵母細胞の吸引を表している。ブタ卵胞の吸引のためのこの
好ましいプロトコールは次の例の中に開示されている。To take advantage of techniques such as genetic engineering, nuclear transfer and cloning,
Oocytes can be matured in vitro before these cells are utilized as recipient cells for nuclear transfer. This step generally requires recovered immature (i.e., I) oocytes derived from pig ovary, such as piglet ovary obtained at a slaughterhouse, and in the case of piglet ovary, the oocyte is generally aspirated. Mid-term I that occurs about 35-45 hours later
Until stage I is reached, it is necessary to mature the oocyte in maturation medium before fertilization or enucleation. For the purposes of the present invention, this period is known as the "maturity period". As used in this document for the calculation of duration, "suction" refers to the suction of immature oocytes from follicles. This preferred protocol for aspiration of porcine follicles is disclosed in the following example.

【００７９】 更に、in vivoで成熟させた中期II期卵母細胞は核移入法の中でうまく利用さ
れている。例えば、成熟した中期II卵母細胞は発情期の始まりの後あるいはヒト
絨毛性ゴナドトロピン(hCG)もしくは類似ホルモンの注射の後35時間から48時間
の雌ウシもしくは若い雌ウシから外科的に回収される。同様の工程が子ブタにお
いても利用できる。適当な工程について次の例の中に述べる。Furthermore, in vivo matured mid-stage II oocytes have been successfully utilized in nuclear transfer procedures. For example, mature metaphase II oocytes are surgically recovered from cows or young cows after the onset of estrus or 35 to 48 hours after injection of human chorionic gonadotropin (hCG) or a similar hormone. . Similar steps are available for piglets. A suitable process is described in the following example.

【００８０】 脱核および核移入された卵母細胞の成熟期がNT法の好結果に対して有意である
と報告された。(例えばPrather ら Differentiation, 48,1-8,1991)。しかしな
がら、未熟卵母細胞はまた分化した細胞もしくは核と融合が可能で、移入胚を作
出するために使用できると期待されている。例えば、卵母細胞はin vitroで融合
の後成熟する可能性がある。しかしながら、一般に哺乳類胚クローニングの実施
の成功例においては、この段階で卵母細胞が受精した***を導入する場合のよう
に導入された核を処理するためにうまく「活性化される」可能性があるかまたは
うまく「活性化された」状態であると考えられているために、レシピエントの卵
母細胞として中期II期卵母細胞を利用する。家畜の場合に、卵母細胞活性化期は
一般に吸引後約16-52時間、好ましくは約35-45時間の範囲である。The maturation stage of enucleated and nuclear-transferred oocytes was reported to be significant to the successful outcome of the NT method. (Eg Prather et al. Differentiation, 48, 1-8, 1991). However, immature oocytes are also expected to be capable of fusing with differentiated cells or nuclei and used to generate transferred embryos. For example, oocytes may mature after fusion in vitro. However, in general, in a successful implementation of mammalian embryo cloning, it is possible that at this stage the oocyte may be successfully "activated" to process the introduced nucleus as it would when introducing fertilized sperm. Utilize metaphase II oocytes as recipient oocytes because they are or are believed to be in a well "activated" state. For livestock, the oocyte activation period is generally in the range of about 16-52 hours, preferably about 35-45 hours after aspiration.

【００８１】 例えば、未熟卵母細胞は適当な成熟培養液の中でin vitroで成熟することが可
能である。好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、ブタ卵母細胞はin vit
roで、例えばNCSU 37培養液中で約22時間その卵母細胞を置くことによって、pFF
β-メルカプトエタノール、システリン、EGF(表皮成長因子)、HCG/PMSG及びcAMP
、を補充することによって、in vitroで成熟する。それらはその後HECM/HEPES及
びショ糖で好ましくは3回洗浄し、その後ホルモンが除去される場合を除いて、
同様のNCSU 37培養液の中で約20時間置いた。好ましくはこれは４ウェルNuncプ
レートの中で起こる。For example, immature oocytes can be matured in vitro in a suitable maturation medium. Preferably, but not necessarily, the porcine oocyte is in vit
pFF by placing the oocytes in a ro, eg NCSU 37 culture for about 22 hours.
β-mercaptoethanol, cysteline, EGF (epidermal growth factor), HCG / PMSG and cAMP
, To mature in vitro. They are then preferably washed 3 times with HECM / HEPES and sucrose, unless the hormone is subsequently removed,
It was placed in the same NCSU 37 culture for about 20 hours. Preferably this occurs in a 4-well Nunc plate.

【００８２】 in vitro(例えば上記のように)もしくはin vivoで成熟が起こる可能性のある
成熟卵母細胞はまた好ましくは脱核の前に処理される。これは積細胞を除去する
ために実施する。これは好ましくはヒアルロン酸で維持し渦を作り出すことによ
って実施される可能性がある。Mature oocytes that may undergo maturation in vitro (eg, as described above) or in vivo are also preferably treated prior to enucleation. This is done to remove the cumulating cells. This may be done preferably by maintaining with hyaluronic acid and creating a vortex.

【００８３】 上述のように卵母細胞はin vivoにおいて成熟し、それに続いてin vivoにおけ
る卵母細胞成熟の形成を誘発しまたそのような成熟卵母細胞を回収することによ
って渦が生じる。例えば、雌ブタに代表的には約5日から6日後に、すなわち発情
期の24時間から36時間後にPG600および回収された成熟卵母細胞の注射を行うこ
とができる。これは畜殺場に送られた動物から子宮を除去し、その後卵管を切断
し、好ましくは適当な培養液をかけ、細胞塊を引き離すことによって行なわれる
。このことはin vitroにおける成熟卵母細胞に対する同様の方法、例えばヒアル
ロン酸で処理することによって行なうことができるであろう。As described above, the oocyte matures in vivo and subsequently induces the formation of oocyte maturation in vivo and the recovery of such mature oocytes creates a vortex. For example, sows can typically be injected after about 5 to 6 days, ie 24 to 36 hours after estrus, with PG600 and the recovered mature oocytes. This is done by removing the uterus from the animal sent to the slaughterhouse, then cutting the oviduct, and preferably sprinkling a suitable culture medium to dislodge the cell mass. This could be done in a similar manner on mature oocytes in vitro, eg by treatment with hyaluronic acid.

【００８４】 成熟後、もしin vitroで代表的には約30時間から50時間、好ましくは40時間か
かるならば、卵母細胞は好ましくはその後脱核される。しかしながら、脱核がド
ナー細胞もしくは核の移植のいずれかの後もたらされるためこのことは必要では
ない。上述のもしくは他の工程で作出された引き離された卵母細胞は好ましくは
極体を選別し、また選別された極体の存在によって確認された中期II卵母細胞を
好ましくは核移入のために利用する。分化した細胞もしくは核に対するドナーの
導入の前、もしくは後に脱核が起こる可能性がある。脱核は米国特許NO.4,994,3
84に記載したような良く知られた方法によって起こる可能性がある。それはこの
文書の中の参考文献に具体的に示されている。好ましい具体例として卵母細胞は
NCSU 23培養液(0.2567mg/10mlのショ糖)及びHXTに20分以上曝露されるであろう
。脱核はその後好ましくはサイトカラシンBを含有するHECM/HEPES及びショ糖(0.
2567mg/10ml)培養液の中で実施される。脱核の後、卵母細胞は適当な培養液、例
えばショ糖(0.2567mg/10ml)含むNCSU 23の中に置く。他方、中期II卵母細胞は任
意に7.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)及び0.15Mショ糖を含有するHECM中に置く
。任意にこれらの卵母細胞は適当な培養液、例えば39℃で5%CO2のNCSU 23のよう
な胚培養液(例中の表を参照)の中で維持する可能性があり、またその後好ましく
はせいぜい24時間後に脱核される。After maturation, if it typically takes about 30 to 50 hours, preferably 40 hours in vitro, the oocyte is preferably subsequently enucleated. However, this is not necessary as the enucleation comes after either donor cells or nuclear transfer. The dissociated oocytes produced in the above or other steps preferably screen polar bodies, and metaphase II oocytes confirmed by the presence of the screened polar bodies are preferably for nuclear transfer. To use. Enucleation may occur before or after introduction of the donor to the differentiated cells or nuclei. Enucleation is US Patent No. 4,994,3
It can occur by well known methods such as those described in 84. It is illustrated in the references within this document. As a preferred specific example, the oocyte is
NCSU 23 culture (0.2567 mg / 10 ml sucrose) and HXT will be exposed for more than 20 minutes. Enucleation is then followed by HECM / HEPES and sucrose (0.
2567mg / 10ml) in culture. After enucleation, the oocytes are placed in a suitable culture medium, for example NCSU 23 containing sucrose (0.2567 mg / 10 ml). On the other hand, metaphase II oocytes are optionally placed in HECM containing 7.5 μg / ml cytochalasin B (CB) and 0.15 M sucrose. Optionally, these oocytes may be maintained in a suitable culture medium, such as an embryo culture medium (see table in the example) such as NCSU 23 in 5% CO 2 at 39 ° C, and thereafter. Enucleation is preferably carried out after at most 24 hours.

【００８５】 脱核は極体及び隣接した細胞質を除去するためにマイクロピペットを使用して
顕微外科的に実施される可能性がある。卵母細胞をうまく脱核されたものを識別
するために選別する。この選別は適当な染料、例えば1μg/mlの33342 Hoechst d
yeで、20分間適当な培養液、例えばNCSU 23中で卵母細胞を染色し、またその後
脱核が完了したかどうか、例えば紫外線放射下で10秒以下で卵母細胞を観察する
ことによって視覚的に確認し実施する。うまく脱核された卵母細胞はその後適当
な培養液、例えばNCSU 23及びショ糖(0.2567mg/10ml)、HECM及び0.15Mショ糖の
中に置くことが可能である。Enucleation can be performed microsurgically using a micropipette to remove polar bodies and adjacent cytoplasm. Oocytes are sorted to identify those that have been successfully enucleated. This selection is carried out with a suitable dye, for example 33342 Hoechst d at 1 μg / ml.
ye by observing the oocytes for 20 minutes in a suitable culture medium, such as NCSU 23, and then observing whether the enucleation is complete, for example under UV radiation for less than 10 seconds. Check and implement. The successfully enucleated oocytes can then be placed in a suitable culture medium such as NCSU 23 and sucrose (0.2567 mg / 10 ml), HECM and 0.15 M sucrose.

【００８６】 本発明において、レシピエント卵母細胞は好ましくは成熟の開始の後約30時間
から50時間の範囲の時間で、更に好ましくは成熟の開始後約38時間から約46時間
、また最も好ましくは成熟の開始後約42時間の範囲の時間で脱核されるであろう
。In the present invention, the recipient oocyte is preferably at a time in the range of about 30 hours to 50 hours after initiation of maturation, more preferably about 38 hours to about 46 hours after initiation of maturation, and most preferably Will be enucleated at a time in the range of about 42 hours after initiation of maturation.

【００８７】 個々のブタの分化した細胞、例えば体細胞もしくは生殖細胞、子ブタ細胞もし
くは核、はその後NTユニットを作出する為に用いられる好ましくは脱核された卵
母細胞もしくは割球の卵黄周囲の空間に移入されるであろう。しかしながら、前
述のように脱核はもしそれが非常に望まれるならば融合の後に起こる可能性があ
る。子ブタ細胞および脱核された卵母細胞は専門家の間で良く知られた方法によ
ってNTユニットを作出する為に利用されるであろう。例えば、細胞は電気的融合
によって融合される可能性がある。電気的融合は細胞質膜の一過性の破壊を引き
起こすのに充分な電気的パルスを与えるすることによって行なわれる。細胞質膜
のこの破壊は急速に膜が再形成する為に非常に短い。このことから、もし二つの
隣接した膜が破壊のために導入され脂質の混ざり合った2層を再形成するならば
二つの細胞の間に小さなチャンネルが開くであろう。そのような小さな口の熱力
学的不安定性のために、それは二つの細胞が一つになるまで増大する。参考文献
はこの工程の更なる検討の為にPratherらによる米国特許4,997,384(この文書の
中に全体的に参考文献に具体的に示されている)に対して作られている。様々な
電気的融合培養液は例えばショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびリン酸緩
衝液を含有して用いることが可能である。融合はまた融合誘発剤(Graham, Wiste
r Inot. Symp. Monogr., 9,19, 1969)としてSendaiウィルスを用いて実施するこ
とができる。次の例の中で用いられた好ましい融合培養液はPh 7.0の0.28Mマン
ニトール、10μM CaCl2、100μM MgSO4及び10mMヒスチジンを含有する。The individual porcine differentiated cells, eg somatic or germ cells, piglet cells or nuclei, are preferably enucleated oocytes or perivitelline of blastomeres which are then used to make NT units. Will be imported into the space. However, as mentioned above, enucleation can occur after fusion if it is highly desired. Piglet cells and enucleated oocytes will be utilized to create NT units by methods well known to those skilled in the art. For example, the cells may be fused by electrical fusion. Electrofusion is performed by applying an electrical pulse sufficient to cause the transient destruction of the cytoplasmic membrane. This disruption of the cytoplasmic membrane is very short due to the rapid membrane reformation. From this it follows that if two adjacent membranes are introduced for disruption and reform the two mixed layers of lipids, a small channel will open between the two cells. Due to the thermodynamic instability of such a small mouth, it grows until the two cells come together. References have been made to Prather et al., US Pat. No. 4,997,384 (incorporated generally herein by reference) for further discussion of this process. Various electrofusion media can be used containing, for example, sucrose, mannitol, sorbitol and phosphate buffer. Fusion is also a fusion inducer (Graham, Wiste
r Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969) using the Sendai virus. The preferred fusion medium used in the following examples contains 0.28M mannitol, Ph 7.0, 10 μM CaCl 2 , 100 μM MgSO 4 and 10 mM histidine.

【００８８】 場合によっては(例えば小さいドナー核を持つ場合)電気穿孔法融合を用いるよ
りむしろ卵母細胞内に直接核を注射する方がより好ましい可能性がある。そのよ
うな方法はCollas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267(1994)の中に発
表されこの文書の中で全体的に参考文献の中に具体的に示されている。In some cases (eg, with small donor nuclei) it may be preferable to inject the nuclei directly into the oocyte rather than using electroporation fusion. Such a method was published in Collas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38: 264-267 (1994) and is specifically set forth in references throughout this document.

【００８９】 他方、融合チャンバーの中に導入する前に、NTユニットは融合培養液に対して
HECMを2:1、1:2及び0:1の比率で含む3回のインキュベーションによって融合培養
液に徐々に曝露することが可能である。子ブタ細胞及び卵母細胞は様々な方法、
例えば卵母細胞成熟の開始の後約44時間に90-120V約30μsecの電気的パルスを用
いることによって500μmのチャンバーの中で処理することによって電気融合でき
る。融合の後、結果として融合されたNTユニットは5分間融合培養液の中で維持
しその後10分間HECMの中に置き、またその後活性化までNCSU 23+7.5mg/mlCB中に
置く。代表的には活性化はその後短時間に起こるであろう、代表的には24時間以
内及び好ましくは約1-9時間後、更に最も好ましくは2時間後に生じるであろう。On the other hand, before being introduced into the fusion chamber, the NT unit was
It is possible to gradually expose the fusion medium by three incubations with HECM in ratios of 2: 1, 1: 2 and 0: 1. Piglet cells and oocytes have various methods,
For example, about 44 hours after the initiation of oocyte maturation, electrofusion can be achieved by treatment in a 500 μm chamber by using 90-120 V about 30 μsec electrical pulses. After fusion, the resulting fused NT units are kept in fusion medium for 5 minutes, then in HECM for 10 minutes, and then in NCSU 23 + 7.5 mg / ml CB until activation. Activation will typically occur shortly thereafter, typically within 24 hours and preferably after about 1-9 hours, and most preferably after 2 hours.

【００９０】 現在、好ましいプロトコールはプロナーゼで処理した任意に脱核した卵母細胞
を移入することである。好ましくは約400μl/lのウェル、及びその後適当な培養
液例えばHECM/HEPES中で希釈し、その後好ましくは4分間約6kRPMで遠心分離し適
当な培養液例えばHECM/HEPESの中で懸濁した。他方卵母細胞は上記のような同じ
解離条件を用いてTEで処理することが可能である。Currently, the preferred protocol is to transfer randomly enucleated oocytes treated with pronase. The wells are preferably about 400 μl / l, and then diluted in a suitable culture medium such as HECM / HEPES, then centrifuged for preferably 4 minutes at about 6 kRPM and suspended in a suitable culture medium such as HECM / HEPES. On the other hand, oocytes can be treated with TE using the same dissociation conditions as described above.

【００９１】 好ましい本プロトコールにおいて、ドナー核もしくは細胞の移入が適当な培養
液、例えばHECM/HEPES+ショ糖(0.2567mg/10ml)の中で起こる。移入が完了した後
結果として生じたNT胚をその後適当な培養液、例えばショ糖(0.2567mg/10ml）を
含むNCSU 23に移入する。NT胚をその後融合し好ましくは適当な融合培養液の中
で約30μ秒の間110Vの電流を適用することによって融合する。上述のように好ま
しい本融合培養液は500mlのSigma水、0.28マンニトール(25.51g)、100μM MgSO4 (0.0123g）、及び100mMヒスチジン(0.776g)を含む。しかしながら、他の良く知
られた融合培養液は他の物に代用できる。好ましくは、融合されたNTユニットを
その後活性化の前に約2時間適当な培養液、例えばHECM/HEPESの中に置きその後N
CSU 23及びサイトカラシンB(3μl/2ml)の中に置く。In the preferred protocol, transfer of donor nuclei or cells occurs in a suitable culture medium, eg HECM / HEPES + sucrose (0.2567 mg / 10 ml). After the transfer is complete, the resulting NT embryos are then transferred to a suitable culture medium, eg NCSU 23 containing sucrose (0.2567 mg / 10 ml). The NT embryos are then fused and preferably fused in a suitable fusion medium by applying a current of 110 V for about 30 μsec. A preferred fusion culture as described above contains 500 ml of Sigma water, 0.28 mannitol (25.51 g), 100 μM MgSO 4 (0.0123 g), and 100 mM histidine (0.776 g). However, other well known fusion media can be substituted for the others. Preferably, the fused NT units are then placed in a suitable culture medium, such as HECM / HEPES, for about 2 hours prior to activation and then N 2
Place in CSU 23 and Cytochalasin B (3 μl / 2 ml).

【００９２】 任意に一つ以上のカスパーゼ阻害剤が成熟期、処置(積細胞の引き離し)の間お
よび/もしくは胚細胞発生および生存している産子の作出を亢進させるための活
性化の間用いられる可能性がある。その例はキャスパーゼ３、キャスパーゼ８、
およびキャスパーゼ９を含む。Optionally one or more caspase inhibitors are used during maturation, treatment (detachment of product cells) and / or during activation to enhance germ cell development and production of live offspring. There is a possibility that Examples are Caspase 3, Caspase 8,
And caspase-9.

【００９３】 NTユニットは周知の方法によって活性化される可能性がある。活性化はそれ以
前に、同時に、もしくはその後結果として起こる可能性がある。本質的にNTユニ
ットに対して冷たいもしくは実際には涼しい温度刺激を適用することによって、
このような方法には例えば準生理学的温度でNTユニットを培養することが含まれ
る。このことは胚が正常に曝露される生理学的温度条件に完全に関連した室温で
NTユニットを培養することによってもっとも便宜的に実施される可能性がある。The NT unit can be activated by known methods. Activation may occur before, at the same time, or thereafter. By applying a cold or actually cool temperature stimulus to the NT unit in essence,
Such methods include, for example, culturing the NT unit at subphysiological temperature. This is at room temperature, which is completely related to the physiological temperature conditions to which the embryo is normally exposed.
It may be most conveniently performed by culturing NT units.

【００９４】 適当な活性化プロトコールは次のものを含む： １．イオノマイシンおよびDMATによる活性化 １−卵母細胞を４分間２ｍMのDMAPを加えたイオノマイシン(５μM)中に置く ； ２−卵母細胞を４時間２ｍMのDMAPを加えた培養液の中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く ２．イオノマイシンDMAPおよびロスコビチンによる活性化 １−卵母細胞を４分間２ｍMのDMAPを加えたイオノマイシン(５μM）中に置 く； ２−卵母細胞を３時間２ｍMのDMAPおよび200(μM)のロスコビチンを加えた 培養液中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く。 ３．イオノマイシンに対する曝露の後サイトカラシンおよびシクロヘキシミドに
対する曝露による活性化 １−卵母細胞をイオノマイシン(５μM)中に４分間おく； ２−卵母細胞を５時間５μg/mlのサイトカラシンBおよび５μg/mlのシクロ ヘキシミドを含む培養液の中へ移す； ３−４回すすぎ、培養液中に置く ４．電気的パルスによる活性化 １−卵を100μMCaCl2を含むマンニトール培養液中に置く； ２−20μsecの間、個々のパルスは22分間隔で1.0ｋVcm-1の３パルスを送る
； ３−卵母細胞を３時間５μg/mlのサイトカラシンBを含有する培養液に移す ５．エタノールに対する曝露のあとサイトカラシンおよびシクロヘキシミドに対
する曝露による活性化 ２−卵母細胞を１分間７％エタノール中に置く； ３−卵母細胞を５時間５μg/mlのサイトカラシンBおよび５μg/mlのシクロ ヘキシミドを含有する培養液に移す； ４−４回すすぎ、培養液中に置く。 ６．アデノフォスチンのマイクロインジェクションによる活性化 １−卵母細胞を10μMのアデノフォスチンを含む10-12ピコリットルの溶液と ともに注射する； ２−卵母細胞を培養液中に置く。 ７．***因子のマイクロインジェクションによる活性化 １−卵母細胞を霊長類、子ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラッ ト、ウサギもしくはハムスターのいずれかから分離され た10-12ピコリットルの***因子を注射する； ２−卵を培養液中に置く。 ８．組み換え***因子のマイクロインジェクションによる活性化。 ９．DMAP/イオノマイシンどちらかのプロトコールSuitable activation protocols include: Activation by ionomycin and DMAT 1-Place oocytes in ionomycin (5 μM) supplemented with 2 mM DMAP for 4 minutes; 2-Transfer oocytes into culture medium supplemented with 2 mM DMAP for 4 hours; 3 -Rinse 4 times and place in culture 2. Activation by ionomycin DMAP and roscovitine 1-Place oocytes in ionomycin (5 μM) with 2 mM DMAP for 4 minutes; 2-Oocytes with 2 mM DMAP and 200 (μM) roscovitine for 3 hours Transfer into culture medium; rinse 3-4 times and place in culture medium. 3. Activation by exposure to ionomycin followed by exposure to cytochalasin and cycloheximide 1-oocytes in ionomycin (5 μM) for 4 minutes; 2-oocytes for 5 hours 5 μg / ml cytochalasin B and 5 μg / ml 3. Transfer into culture medium containing cycloheximide; rinse 3-4 times and place in culture medium 4. Activation by electric pulse 1-Egg is placed in mannitol culture medium containing 100 μM CaCl 2 ; During 2-20 μsec, each pulse sends 3 pulses of 1.0 kV cm −1 at 22 minute intervals; 3-Oocyte 4. Transfer to culture medium containing 5 μg / ml cytochalasin B for 3 hours. Activation by exposure to ethanol followed by exposure to cytochalasin and cycloheximide 2-Place oocytes in 7% ethanol for 1 min; 3-Oocytes for 5 hours 5 μg / ml cytochalasin B and 5 μg / ml cyclo Transfer to medium containing heximide; rinse 4-4 times and place in medium. 6. Activation of adenophostin by microinjection 1-Inject oocytes with 10-12 picoliters of solution containing 10 μM adenophostin; 2-Place oocytes in culture. 7. Activation of sperm factors by microinjection 1- 10-12 picoliters of sperm isolated from primate, piglet, cow, sheep, goat, horse, mouse, rat, rabbit or hamster Inject factor; 2-Place egg in culture. 8. Activation of recombinant sperm factors by microinjection. 9. Either DMAP / ionomycin protocol

【００９５】 卵母細胞もしくはNTユニットを約１時間代表的には成熟後約22-28時間約２ｍM
の DMAPの中におき、その後約2-12時間、好ましくは８時間、５μg/mlのサイト
カラシンBおよび20μg/mlのシクロヘキシミドの中でインキュベートする。Oocyte or NT unit for about 1 hour, typically about 22-28 hours after maturation, about 2 mM
And then incubate in 5 μg / ml cytochalasin B and 20 μg / ml cycloheximide for about 2-12 hours, preferably 8 hours.

【００９６】 活性化をもたらすこの好ましい方法は３段階の活性化プロトコールによる１mg
/mlの BSAを含むHECM/HEPES(H/H)培養液の中で実施される。最初の段階では、N
T融合物は約４分間10μｍイオノマイシン(４μl/2ml)を含有する前記のH/H BSA
培養液の中におき、その後前記のH/H培養液のすすぎ、またその後NT融合物を約3
0分間DMAP(１μl/ml)を含有するNCSU 23中に置く。第二の段階では、NT融合物を
再び１mg/ml BSAを含有し、また５μMイオノマイシンを含有するH/H培養液の中
に約４分間置き、その後H/H中ですすぎ、また約30分間NCSU 23とDMAP(１μl/ml)
中にすすいだ卵母細胞を置く。第三の段階ではNT融合物を２時間１mg/ml BSAを
含有し、さらに５μMイオノマイシンおよびDMAP(１μl/ml)を含有するH/Hのなか
に再び置く。このような活性化プロトコールの後、活性化されたNTユニットを好
ましくは適当な培養液、例えばNCSU 23培養液に移入する。この培養液、もしく
は他の適当な培養液は必要に応じて、代表的には約３日目に交換する。５日目に
好ましくは約５％のFBSを加え、またNTユニットを胚盤胞を形成できるように培
養する。しかしながら、上記の検討のようにNT胚は作出のあと完全に直ちに移入
することができる。すなわち１細胞期の間に１日目に移入が成功するであろう。This preferred method of effecting activation is 1 mg with a 3-step activation protocol.
It is carried out in HECM / HEPES (H / H) culture medium containing / ml of BSA. In the first stage, N
The T-fusion contained the above H / H BSA containing 10 μm ionomycin (4 μl / 2 ml) for about 4 minutes.
Place in culture medium, then rinse with H / H medium as described above, and then add approximately 3 NT fusions.
Place in NCSU 23 containing DMAP (1 μl / ml) for 0 min. In the second step, the NT fusion was again placed in H / H medium containing 1 mg / ml BSA and 5 μM ionomycin for about 4 minutes, then rinsed in H / H for about 30 minutes. NCSU 23 and DMAP (1 μl / ml)
Place the rinsed oocyte inside. In the third step, the NT fusion is repositioned for 2 hours in H / H containing 1 mg / ml BSA and additionally 5 μM ionomycin and DMAP (1 μl / ml). After such activation protocol, the activated NT units are preferably transferred into a suitable culture medium, eg NCSU 23 medium. This medium, or other suitable medium, is changed, if necessary, typically about day 3. On day 5, preferably about 5% FBS is added and the NT units are cultured to allow blastocyst formation. However, as discussed above, NT embryos can be transferred completely immediately after production. That is, the transfer will be successful on day 1 during the 1-cell stage.

【００９７】 他方、子ブタNTユニットはpH7.0の0.28Mマンニトール、100μM CaCl2、100μM
MgSO4および10ｍMヒスチジンを含有する活性化培養液中で30μsecの間30Vの電
気的パルスの適用によって500μｍチャンバー内で活性化できる。１時間後15Vの
２番目のパルスが30μsecの間適用される。パルスとパルスの間にNTユニットは3
9℃５％CO2でCBを加えたNCSU 23中で維持する。On the other hand, the piglet NT unit was 0.28M mannitol, pH 7.0, 100 μM CaCl 2 , 100 μM.
It can be activated in a 500 μm chamber by the application of an electrical pulse of 30 V for 30 μsec in an activated medium containing MgSO 4 and 10 mM histidine. After 1 hour, a second pulse of 15V is applied for 30 μsec. NT unit is 3 between pulses
Maintain in NCSU 23 with CB at 9 ° C 5% CO 2 .

【００９８】 さらに他方、活性化は周知の活性化剤の適用によって実施される可能性がある
。例えば、受精もしくは***の細胞に含まれる因子の活性化の間に***による卵
母細胞の透過によってNTユニットを活性化できる。また電気的もしくは化学的シ
ョック、カルシウムイオノホアおよびプロテインキナーゼ阻害剤のような処置は
融合の後NT胚を活性化するために利用される可能性がある。On the other hand, activation may be carried out by the application of well known activators. For example, the NT unit can be activated by permeation of the oocyte by sperm during fertilization or activation of factors contained in sperm cells. Also, treatments such as electrical or chemical shock, calcium ionophores and protein kinase inhibitors may be used to activate the NT embryo after fusion.

【００９９】 さらに他方、４分間５μMイオノマイシンを含有するHECM/HEPES中にNTユニッ
トをおくことによって、またその後HECM/HEPESの中で３回洗浄し、その後約４分
間イオノマイシンを加えたHECM/HEPES＋サイトカラシンB中に置き、HECM/HEPES
中で３回洗浄しそのあと約３時間２mMのDMAP(6-ジメチルアミノプリン)を含有す
るNCSU 23中に置くことによって、融合の後約１−２時間化学的活性化が起こる
可能性がある。その後、好ましくは胚移入に先だってNTユニットをHECM/HEPES中
で約３−４回洗浄し、またその後NCSU 23中に置く。On the other hand, the HECM / HEPES + site was washed by placing the NT unit in HECM / HEPES containing 5 μM ionomycin for 4 minutes and then 3 times in HECM / HEPES, followed by addition of ionomycin for about 4 minutes. Place in Kalasin B, HECM / HEPES
Washing three times in water, then placing in NCSU 23 containing 2 mM DMAP (6-dimethylaminopurine) for about 3 hours may result in chemical activation for about 1-2 hours after fusion . The NT units are then preferably washed in HECM / HEPES about 3-4 times prior to embryo transfer and then placed in NCSU 23.

【０１００】 さらに他方、活性化の後、NTユニットをNCSU 23＋CB中で３-4時間培養し、そ
の後、CBなしにNCSU 23中で培養することが可能である。前述のようにNTユニッ
トは活性化のあといつでも雌のレシピエントに移入できる。On the other hand, after activation, it is possible to culture the NT units in NCSU 23 + CB for 3-4 hours and then in NCSU 23 without CB. As mentioned above, NT units can be transferred to a female recipient at any time after activation.

【０１０１】 他方、活性化されたNTユニットはその後、CICM細胞および細胞コロニーを作出
するためにin vitroで適当な培養液の中で培養する可能性がある。胚の培養と成
熟に適した培養液は専門家にはよく知られている。よく知られた培養液の例はHa
m’s F-10＋10％胎児子ウシ血清(FCS)、Tiissue Culture Medium-199(TCM-199)
＋10％胎児子ウシ血清、Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate(TALP), Dulvecco’
s Phosphate Buffered Saline(PBS), Eagle’s and Whitten’s media.を含む。
卵母細胞の回収および成熟のために用いられた最も共通の培養液の一つはTCM-19
9および１から20％の胎児子ウシ血清、新生児血清、発情期ウシ血清、子ヒツジ
、ブタ、もしくは去勢雄ウシの血清を含む血清補充液である。好ましい維持培養
液はEarl塩を加えたTCM-199、10％胎児子ウシ血清、0.2ｍM ピルビン酸ナトリウ
ムおよび50μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含む。さらに好ましくは、使用された
培養液はNCSU 23であり、また活性化の後２から５日NTユニットを新鮮なNCSU 23
および５から10％胎児子ウシ血清中で培養する。上記のいずれもまた顆粒膜細胞
、卵管細胞、BRL細胞、子宮の細胞、およびSTO細胞のようなさまざまな細胞型を
もった共生培養組織を含む。On the other hand, the activated NT unit may then be cultured in vitro in a suitable culture medium to generate CICM cells and cell colonies. The culture medium suitable for embryo culture and maturation is well known to the expert. An example of a well-known culture is Ha
m's F-10 + 10% fetal calf serum (FCS), Tiissue Culture Medium-199 (TCM-199)
+ 10% fetal calf serum, Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate (TALP), Dulvecco '
s Phosphate Buffered Saline (PBS), Eagle's and Whitten's media.
One of the most common media used for oocyte recovery and maturation is TCM-19.
A serum supplement containing 9 and 1 to 20% fetal calf serum, newborn serum, estrus calf serum, lamb, pig, or castrated bovine serum. A preferred maintenance medium contains TCM-199 with Earl's salt, 10% fetal calf serum, 0.2 mM sodium pyruvate and 50 μg / ml gentamicin sulfate. More preferably, the culture medium used is NCSU 23, and 2 to 5 days after activation NT units are fresh NCSU 23.
And in 5 to 10% fetal calf serum. Any of the above also includes co-cultured tissue with various cell types such as granulosa cells, oviduct cells, BRL cells, uterine cells, and STO cells.

【０１０２】 他の維持培養液はRosenkrans,Jr.らに発行された米国特許5,096,822の中に述
べられており、それはこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。CR1と
名づけられたこの胚培養液は胚を維持するために必要な栄養物質を含む。Other maintenance media are described in US Pat. No. 5,096,822 issued to Rosenkrans, Jr. et al., Which is specifically set forth in the references within this document. This embryo culture medium, named CR1, contains the nutrients necessary to maintain the embryo.

【０１０３】 NTユニットが雌のレシピエントに移入され、もしくはCICM細胞または細胞コロ
ニーを作出するために利用される適切な大きさに達するまで、NTユニットをNCSU
23＋５から10％ FCS中で培養することができる。例えば、これらのNTユニット
を少なくとも約２個から400個の細胞、さらに好ましくは約４個から128個の細胞
、またもっとも好ましくは少なくとも約50個の細胞になるまで培養できる。他方
、１細胞であるNT胚はレシピエントの雌、すなわち活性化の最初の日に作出され
た雌に導入できる。培養は適当な条件下、すなわち約38.5℃、５％CO2で行なわ
れ、また培養液は代表的には約２-５日ごとに、好ましくは約３日ごとに成長を
最適にするために交換することが可能である。NCSU the NT units until they have been transferred to female recipients or reached the appropriate size to be used to generate CICM cells or cell colonies.
Can be cultured in 23 + 5 to 10% FCS. For example, these NT units can be cultured to at least about 2 to 400 cells, more preferably about 4 to 128 cells, and most preferably at least about 50 cells. On the other hand, one-cell NT embryos can be introduced into recipient females, ie females created on the first day of activation. Culturing is carried out under suitable conditions, ie about 38.5 ° C., 5% CO 2 , and the culture is typically about every 2-5 days, preferably about every 3 days to optimize growth. It is possible to exchange.

【０１０４】 本発明における胚移入およびレシピエントの哺乳動物の処置の方法は胚移入産
業において利用される標準的工程を用いて実施することが可能である。同時移入
が望ましい、すなわちNT胚の段階はレシピエントの雌の発情サイクルと同時発生
する。この有益性およびレシピエントの維持方法についてWallら(“Development
of porcine ova that were centrifuged to permit visualization of pronucl
ei and nuclei, “ Biol. Reprod., 32:645-651(1985))の中で検討されている。
その内容はこの文書の中の参考文献のなかに具体的に示されている。The methods of embryo transfer and treatment of recipient mammals of the invention can be carried out using standard procedures utilized in the embryo transfer industry. Co-transfer is desirable, ie the NT embryonic stage coincides with the estrous cycle of the recipient female. For this benefit and how to maintain recipients, see Wall et al. (“Development
of porcine ova that were centrifugation to permit visualization of pronucl
ei and nuclei, “Biol. Reprod., 32: 645-651 (1985)).
Its contents are specified in the references in this document.

【０１０５】 すでに検討されたように、レシピエントの雌はまた「ヘルパー」胚を含むとい
うことは望ましいが必要ではない。このようなヘルパー胚は例えば自然のもしく
は人工的な方法によって作出された正常のブタ胚、単為発生胚(生存している産
子を作らない活性化された非受精胚)、および四倍体胚を含む。このことはクロ
ーンブタの発生と維持を亢進する為に確認された。As discussed previously, it is desirable, but not necessary, that the recipient female also contains "helper" embryos. Such helper embryos include, for example, normal pig embryos created by natural or artificial methods, parthenogenetic embryos (live non-born activated non-fertilized embryos), and tetraploids. Including embryo. This was confirmed to enhance the development and maintenance of cloned pigs.

【０１０６】 このようなへルパー胚の数は有意に、すなわち約１から２から100くらいまで
で変更できる。これらのヘルパー胚がクローン胚の発生および/もしくは移植を
亢進する物質、例えばホルモン、成長因子を作出する可能性があるという仮説が
立てられている。単為発生へルーパー胚もしくは四倍体ヘルパー胚の有益性は生
存可能な産子の中で発生する産子のみがクローンであるということである。しか
しながら、クローン産子の産出を遺伝解析、例えばPCRもしくはクローンDNA配列
の発現または存在を検出することによって、例えば原位置のハイブリッド形成に
より、もしくはクローンDNAの発現を検出することにより、例えばラベルされた
抗体もしくは他のプローブの利用によって立証することが可能である。The number of such helper embryos can vary significantly, ie from about 1 to about 2 to 100. It has been hypothesized that these helper embryos may produce substances that enhance the development and / or transplantation of cloned embryos, such as hormones and growth factors. The advantage of parthenogenetic looper or tetraploid helper embryos is that only the offspring that develop among the surviving offspring are clones. However, the production of clonal offspring was labeled, for example by genetic analysis, such as by PCR or by detecting the expression or presence of a cloned DNA sequence, for example by in situ hybridization, or by detecting the expression of clonal DNA, It can be demonstrated by the use of antibodies or other probes.

【０１０７】 前述のように、本発明は個々に遺伝工学的に作られたもしくは形質転換したク
ローンブタを産出する為に有用である。本発明は形質転換工程がクローン化によ
って増殖することが可能な分化した細胞源による操作によって簡略化することが
可能である。とりわけ、ドナー核のために用いられた分化した細胞は挿入され、
除去されもしくは一時変異された望ましいDNA配列をもつ。そのような遺伝的に
変更され分化した細胞はその後脱核された卵母細胞と共に核移植の為に用いられ
る。As mentioned above, the present invention is useful for producing individually genetically engineered or transformed cloned pigs. The present invention can be simplified by manipulating the transformation process with a differentiated cell source that can be propagated by cloning. Among other things, the differentiated cells used for the donor nucleus are inserted,
It has the desired DNA sequence that has been removed or temporarily mutated. Such genetically modified and differentiated cells are then used for nuclear transfer with enucleated oocytes.

【０１０８】 哺乳類の細胞の適切なDNA配列を挿入削除もしくは一時変異するいずれの周知
の方法も核ドナーとして利用する為の分化した細胞を変更する為に利用できる。
これらの工程はDNA配列の全てもしくは一部分を除去し、またDNA配列は非相同性
である可能性がある。細胞ゲノムの特定の部位もしくは複数の部位で一つのDNA
配列もしくは複数のDNA配列の挿入、削除もしくは一時変異を可能にする相同性
組み換えの技術が含まれる。好ましい具体例として内生ブタ遺伝子は「ノックア
ウトされた」であり、またヒト同族体、例えばノックインされた免疫学的タンパ
ク、ホルモン、構造タンパク、凝固因子、酵素、受容体、もしくは他のクローン
遺伝子をコードするDNAである。Any of the well known methods of inserting, deleting or transiently mutating the appropriate DNA sequences of mammalian cells can be used to modify the differentiated cells for use as nuclear donors.
These steps remove all or part of the DNA sequence, and the DNA sequence may be heterologous. One DNA at a specific site or multiple sites in the cell genome
Included are techniques of homologous recombination that allow the insertion, deletion or transient mutation of sequences or multiple DNA sequences. In a preferred embodiment, the endogenous porcine gene is "knocked out" and is a human homologue, such as a knocked-in immunological protein, hormone, structural protein, coagulation factor, enzyme, receptor, or other cloned gene. It is the encoding DNA.

【０１０９】 本発明はこのようにして適切な遺伝子型をもった成熟した子ブタを提供する為
に利用できる。すでに証明された遺伝的有意性もしくは他の望ましい特徴をもっ
た形質転換したもしくは遺伝工学的に作られた哺乳動物およびキメラ哺乳動物を
含む成熟子ブタ、形質転換したもしくは遺伝工学的に作られた動物およびキメラ
動物を含む、の増殖は個々に有益である。したがって、本発明は単一の性別の産
子の作出、および改良肉製品、生殖に関する特徴および疾患に対する抵抗性をも
つ子ブタの作出を可能にするであろう。さらに、形質転換したおよびもしくはキ
メラ胎児を含むNT胎児由来の細胞由来の細胞および組織はCICM細胞の利用に関連
して下記に述べるような多数の疾患の治療のために細胞、組織および器官移植に
利用できる。このことから、形質転換した子ブタに疾患、細胞および器官の異種
移植、および薬剤タンパクの作出のモデルを含んだ利用法がある。The present invention can thus be used to provide mature piglets with the appropriate genotype. Mature piglets, including transformed or genetically engineered mammals and chimeric mammals, with previously demonstrated genetic significance or other desirable characteristics, transformed or genetically engineered The growth of, including animals and chimeric animals, is individually beneficial. Thus, the present invention will enable the production of offspring of a single gender and piglets with improved meat products, reproductive characteristics and resistance to disease. In addition, cells and tissues derived from cells derived from NT fetuses, including transformed and / or chimeric fetuses, have been used for cell, tissue and organ transplantation for the treatment of numerous diseases as described below in connection with the utilization of CICM cells. Available. Thus, there are uses that include models of disease, cell and organ xenotransplantation, and drug protein production in transformed piglets.

【０１１０】 上記のように好ましい具体例として内生構造遺伝子、例えばコラーゲンはヒト
コラーゲン遺伝子によって置換されるであろう。他の好ましい具体例として、ブ
タ血清アルブミン遺伝子はHSA遺伝子によって置換されるであろう。As a preferred embodiment as described above, the endogenous structural gene, eg collagen, will be replaced by the human collagen gene. In another preferred embodiment, the porcine serum albumin gene will be replaced by the HSA gene.

【０１１１】 CICM細胞および細胞株の作出のために、適切な大きさのNTユニットが得られた
後で、細胞はその領域から機械的に除去されその後利用される。このことは代表
的に少なくとも約50個の細胞を含有し、そのような細胞を洗浄しまた支持細胞層
、例えば照射された線維芽細胞の上に細胞をおくNTユニットを含有する細胞塊を
取り除くことによって生じる。代表的に幹細胞もしくは細胞コロニーを得る為に
用いられた細胞は好ましくは少なくとも大きさにおいて50個の細胞である培養さ
れたNTユニットの内部の代部分から得られるであろう。しかしながらNTユニット
の他の部分由来の細胞と同様により小さいあるいはより大きいNTユニットがまた
ES細胞および細胞コロニーを得るために用いられる可能性がある。細胞は適当な
成長培養液、例えば10％ FCSおよび0.1ｍM β-メルカプトエタノール(Sigma)お
よびL-グルタミンを補充したアルファMEM の支持細胞層内で維持する。成長培養
液は成長を最適にするために必要に応じて、例えば約２-３日毎に交換する。For the generation of CICM cells and cell lines, after obtaining appropriately sized NT units, the cells are mechanically removed from the area and subsequently utilized. This will typically contain at least about 50 cells, wash such cells and remove cell masses containing NT units that place the cells on a feeder layer, such as irradiated fibroblasts. Caused by The cells typically used to obtain stem cells or cell colonies will be obtained from an internal surrogate portion of the cultured NT unit that is preferably at least 50 cells in size. However, smaller or larger NT units as well as cells from other parts of the NT unit may also
It can be used to obtain ES cells and cell colonies. Cells are maintained in a suitable growth medium, eg, a feeder layer of alpha MEM supplemented with 10% FCS and 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma) and L-glutamine. Growth medium is changed as needed to optimize growth, eg about every 2-3 days.

【０１１２】 この培養工程は結果としてCICM細胞もしくは細胞株の形成を生じる。専門家で
あれば個々のCICM細胞の成長を最適にするために望まれるように培養の条件を変
更することができる。また遺伝工学的に作られたもしくは形質転換した子ブタCI
CM細胞は本発明により作出される可能性がある。すなわち上記の方法は一つの適
切なDNA配列もしくは複数のDNA配列が導入される、もしくは一つの内生DNA配列
もしくは複数のDNA配列のすべてあるいは一部が除去され一時変異されるNTユニ
ットを産出するために利用できる。これらの遺伝工学的に作られたもしくは形質
転換したNTユニットはその後遺伝工学的に作られたあるいは形質転換したCICM細
胞を作出するために利用が可能である。上述のように、未分化状態で培養液の中
でこのようなCICMを維持する好ましい方法は米国特許No.5,905,042の中で検討さ
れ、この文書の中の参考文献の中に具体的に示されている。This culturing step results in the formation of CICM cells or cell lines. Experts can modify the culture conditions as desired to optimize the growth of individual CICM cells. Also genetically engineered or transformed piglet CI
CM cells may be produced according to the present invention. That is, the above method yields an NT unit into which one appropriate DNA sequence or multiple DNA sequences are introduced, or one or more endogenous DNA sequences or multiple DNA sequences are all or partially removed to be transiently mutated. Available for. These genetically engineered or transformed NT units can then be used to generate genetically engineered or transformed CICM cells. As noted above, preferred methods of maintaining such CICM in culture in an undifferentiated state are discussed in U.S. Patent No. 5,905,042, and are specifically set forth in the references within this document. ing.

【０１１３】 結果として生じたCICM細胞および細胞株は多くの治療的および診断的用途をも
つ。とりわけ、このようなCICM細胞は細胞移植治療のために利用される可能性が
ある。The resulting CICM cells and cell lines have many therapeutic and diagnostic applications. Among other things, such CICM cells may be used for cell transplant therapy.

【０１１４】 この点において、マウス胚幹(ES)細胞はほとんどあらゆる細胞型、例えば造血
幹細胞に分化できる。従って、本発明によって作出されたブタCICM細胞は類似し
た分化能力をもつはずである。本発明によって得られたCICMは周知の方法によっ
て適切な細胞型を得るために分化を誘導するであろう。たとえば、この子ブタの
CICM細胞は、細胞分化のために提供する分化培養液中でおよび条件下でこのよう
な細胞を培養することによって、造血幹細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、肝
細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経細胞等に分化を誘導する可能性があ
る。結果としてCICM細胞の分化を生じた培養液および手法は適当な培養条件とし
て専門家には知られている。In this regard, mouse embryonic stem (ES) cells can differentiate into almost any cell type, eg hematopoietic stem cells. Therefore, the porcine CICM cells produced by the present invention should have similar differentiation potential. The CICM obtained according to the present invention will induce differentiation to obtain the appropriate cell type by well known methods. For example, of this piglet
CICM cells are obtained by culturing such cells in a differentiation medium provided for cell differentiation and under conditions, thereby producing hematopoietic stem cells, nerve cells, muscle cells, cardiomyocytes, hepatocytes, chondrocytes, epithelial cells. , May induce differentiation into urinary tract cells, nerve cells, etc. The culture medium and method resulting in the differentiation of CICM cells are known to the expert as suitable culture conditions.

【０１１５】 例えば、Palaciosら、Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,92:7530-7537(1995)ではレチ
ノイン酸の欠乏した懸濁培養液中でこのような細胞の培養凝集体を最初に含む誘
発工程に対して支配している幹細胞による胚細胞株から造血幹細胞の作出を解説
している。For example, Palacios et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 92: 7530-7537 (1995) first culture aggregates of such cells in suspension cultures deficient in retinoic acid. It describes the generation of hematopoietic stem cells from embryonic cell lines by stem cells that control the induction process including.

【０１１６】 さらに、Pedersen,J.Reprod.Fertil.Dev.,6:543-552(1994)では、造血細胞、
筋肉、心筋、神経細胞、それらの合併症を含む様々な分化細胞型を作出するため
に胚幹細胞のin vitroにおける分化の手法について発表している非常に多くの論
文を参考にした概説論文である。Further, in Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6: 543-552 (1994), hematopoietic cells,
This is a review paper based on a large number of papers that have published a method for in vitro differentiation of embryonic stem cells to generate various differentiated cell types including muscle, cardiac muscle, nerve cells, and their complications. .

【０１１７】 更に、Bain ら、Dev.Biol.,168:342-357(1995)はニューロンの性質を持つ神経
細胞を作出するために胚幹細胞のin vitroにおける分化について解説している。
これらの参考文献は胚または幹細胞由来の分化した細胞を得る報告された方法の
例として役に立つ。胚幹細胞の分化の方法に関連しているこれらの参考文献とり
わけ開示は全体的にこの文書の中の参考文献に具体的に示されている。In addition, Bain et al., Dev. Biol., 168: 342-357 (1995) describe the in vitro differentiation of embryonic stem cells to create neurons with neuronal properties.
These references serve as examples of reported methods of obtaining differentiated cells derived from embryonic or stem cells. These references, especially the disclosures relating to the method of differentiation of embryonic stem cells, are specifically set forth in the references within this document.

【０１１８】 このように、周知の方法及び培養液を用いて、適切な分化した細胞型、例えば
神経細胞、筋細胞、造血細胞等を得るために、専門家は遺伝工学的に作られたも
しくは掲出転換したCICM細胞を含むこのCICM細胞を培養する可能性がある。米国
特許5,905,042に開示されている培養法は多能性CICMを生じるということをキメ
ラ哺乳動物（子ブタ及びウシ）の作出の成功例によって示した。Thus, using well-known methods and cultures, specialists have been genetically engineered to obtain suitable differentiated cell types, such as nerve cells, muscle cells, hematopoietic cells, or the like. It is possible to culture the CICM cells, including the transformed CICM cells. The successful production of chimeric mammals (pigs and cows) has been shown to demonstrate that the culture method disclosed in US Pat. No. 5,905,042 results in pluripotent CICM.

【０１１９】 このCICMはあらゆる適切な分化した細胞型を得るために利用される可能性があ
る。このような分化した細胞の治療的利用法は前例がない。例えば、造血幹細胞
は骨髄移植の必要な医学的治療に利用される可能性がある。このような工程は多
くの疾患、例えばAIDSのような免疫系を含む疾患と同様に、卵巣癌と白血病のよ
うな末期癌を治療するために利用される。造血幹細胞は、それが得られるまで分
化し易い条件下でそのような細胞を増殖し、癌もしくはAIDSの患者の成熟体細胞
、例えば脱核された卵母細胞を持った上皮細胞もしくはリンパ球を例えば融合す
ることによって、得ることが可能である。このような造血細胞は癌及びAIDSを含
む疾患の治療に利用される可能性がある。This CICM may be used to obtain any suitable differentiated cell type. The therapeutic use of such differentiated cells is unprecedented. For example, hematopoietic stem cells may be utilized in medical treatments that require bone marrow transplants. Such a process is utilized to treat many diseases, including diseases involving the immune system, such as AIDS, as well as terminal cancers such as ovarian cancer and leukemia. Hematopoietic stem cells proliferate such cells under the condition that they are easily differentiated until they are obtained, and mature somatic cells of patients with cancer or AIDS, such as epithelial cells or lymphocytes having enucleated oocytes. It can be obtained, for example, by fusing. Such hematopoietic cells may be used to treat cancer and diseases including AIDS.

【０１２０】 本発明は欠損遺伝子、例えば欠損免疫系遺伝子に置換するために、もしくは成
長因子、リンフォカイン、サイトカイン、凝固因子、受容体、酵素等のような治
療的に有益なタンパクの発現を生じる遺伝子を導入するために用いることが可能
である。The present invention relates to defective genes, for example to replace defective immune system genes, or to cause expression of therapeutically beneficial proteins such as growth factors, lymphokines, cytokines, coagulation factors, receptors, enzymes and the like. Can be used to introduce

【０１２１】 このCICM細胞に導入される可能性のあるDNA配列は例えとして、表皮成長因子
、基本線維芽細胞成長因子、グリア由来の向神経性成長因子、インシュリン様成
長因子（I及びII）、ニュートロフィン-3、ニュートロフィン-4/5、繊毛性毛様
神経栄養因子、AFT-1、サイトカイン（インターロイキン、インターフェロン、
コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（アルファ及びベータ）等）、治療的酵素等を
コードするDNA配列を含む。The DNA sequences that may be introduced into this CICM cell are, for example, epidermal growth factor, basal fibroblast growth factor, glial-derived neurotropic growth factor, insulin-like growth factor (I and II), Neutrophin-3, Neutrophin-4 / 5, Ciliary Ciliary Neurotrophic Factor, AFT-1, Cytokine (Interleukin, Interferon,
It includes DNA sequences encoding colony stimulating factors, tumor necrosis factors (alpha and beta), etc., therapeutic enzymes, etc.

【０１２２】 本発明はヒトの疾患の治療において子ブタの細胞の利用法を含む。従って、子
ブタCICM細胞、NT胎児及びNT及びキメラ産子（形質転換したもしくは形質転換し
ない)が細胞、組織または器官移植が正当化されるヒトの疾患の状態の治療に利
用される可能性がある。一般的に本発明によって得られたCICM細胞、胎児及び産
子は同じ種（自己、同系もしくは同種移植）あるいは種を超えて（異種移植)の
範囲内で利用できる。例えば、子ブタNT胎児由来の脳細胞はパーキンソン病の治
療をするために利用される可能性がある。The present invention includes the use of piglet cells in the treatment of human disease. Thus, piglet CICM cells, NT fetuses and NT and chimeric offspring (transformed or untransformed) may be used in the treatment of human disease states for which cell, tissue or organ transplantation is justified. is there. In general, the CICM cells, fetuses and offspring obtained according to the invention can be utilized within the same species (autologous, syngeneic or allogeneic transplant) or across species (xenograft). For example, brain cells derived from piglet NT fetuses may be used to treat Parkinson's disease.

【０１２３】 また、このCICM細胞はとりわけ初期発生の制御に含まれる遺伝子の研究のため
に分化のin vitroにおけるモデルとして用いられる可能性がある。また、このCI
CM細胞を用いた分化した細胞組織及び器官は医薬品研究に利用される可能性があ
る。The CICM cells may also be used as an in vitro model of differentiation, especially for the study of genes involved in the regulation of early development. Also this CI
Differentiated cell tissues and organs using CM cells may be used for drug research.

【０１２４】 更にこのCICM細胞は他のCICM細胞及び細胞コロニーの作出のための核ドナーと
して利用される可能性がある。Furthermore, this CICM cell may be used as a nuclear donor for the production of other CICM cells and cell colonies.

【０１２５】 本発明をさらに明白に説明するために次の例を提供する。[0125]   The following example is provided to more clearly illustrate the present invention.

【０１２６】 （例 ブタクローニングのための材料および方法）[0126]     (Eg materials and methods for pig cloning)

【表２】 18mohm、RO、脱イオン水使用。 Phは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。[Table 2] 18mohm, RO, deionized water used. The Ph should be 7.4 and the osmolality should be checked and recorded. Sterilize by vacuum filtration (0.22 μm), and write the date and initials in the bottle. Store at 4 ℃ and use within 10 days.

【０１２７】[0127]

【表３】 ** 60%シロップ* 沈殿を避けるために、最後にゆっくりCaCl22H2Oを加える 18mohm、RO、脱イオン水使用。 pHは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。[Table 3] ** 60% syrup * 18mohm, RO, deionized water used with slow addition of CaCl 2 2H 2 O at the end to avoid precipitation. The pH should be 7.4 and the osmolality should be checked and recorded. Sterilize by vacuum filtration (0.22 μm), and write the date and initials in the bottle. Store at 4 ℃ and use within 10 days.

【０１２８】[0128]

【表４】 18mohm、RO、脱イオン水使用。 pHは7.4にすべきであり、重量オスモル濃度をチェックし記録すること。 red Nalgene filtersを用い減圧濾過(0.22μm)によって滅菌し、年月日と頭文字
をビンに記す。 ４℃で貯蔵し、10日以内に使用すること。 注：BSA型は重要である。好ましくはSigma BSA catalog ＃ A-7906を使用するこ
と。また、Pen G/Streptはオプションである。[Table 4] 18mohm, RO, deionized water used. The pH should be 7.4 and the osmolality should be checked and recorded. Sterilize by vacuum filtration (0.22 μm) using red Nalgene filters, and write the date and initials in the bottle. Store at 4 ℃ and use within 10 days. Note: BSA type is important. Preferably Sigma BSA catalog # A-7906 is used. Also, Pen G / Strept is optional.

【０１２９】 （成熟培養液(MAT)） 18.0ml mNCSU 37 2.0ml ブタ卵胞液(pFF) 7.0μlの希釈されたβ-メルカプトエタノール(10μlβ-メルカプトエタノールを
990μl mNCSU37で希釈する；最終濃度は50μM) 0.002gシステイン(最終濃度は0.6mM) 20μl EGF Stock(10ng/μl EGF stock由来の表皮成長因子)(Maturation culture medium (MAT)) 18.0 ml mNCSU 37 2.0 ml Porcine follicular fluid (pFF) 7.0 μl of diluted β-mercaptoethanol (10 μl β-mercaptoethanol
Dilute with 990 μl mNCSU37; final concentration 50 μM) 0.002 g cysteine (final concentration 0.6 mM) 20 μl EGF Stock (10 ng / μl EGF stock-derived epidermal growth factor)

【０１３０】 （ブタ卵胞の吸引のためのプロトコール） 濾胞を大きさによって視覚的に類別する。3mm×3mmから7mm×7mmの濾胞が吸引
のためにはふさわしいと考えられている。それに反して、もっと大きい濾胞、と
りわけ1cm×１cmより大きい濾胞は吸引にはふさわしくない。Protocol for Aspiration of Porcine Follicles The follicles are visually graded by size. Follicles of 3 mm x 3 mm to 7 mm x 7 mm are considered suitable for aspiration. On the contrary, larger follicles, especially follicles larger than 1 cm x 1 cm, are not suitable for aspiration.

【０１３１】 好ましくは18ゲージ針を備えた10ccシリンジを使用して1mlのへパリン(100 IU
/ml)の濃度を引き上げる。その後そのシリンジを垂直に持ちへパリン溶液がシリ
ンジの内部をおおうように10ccの線まで引き下げる。へパリンはその後シリンジ
から廃棄する。その時一方の手に卵巣を持ち、もう一方にシリンジを持つ。1 ml of heparin (100 IU) is preferably used using a 10 cc syringe equipped with an 18 gauge needle.
/ ml). After that, hold the syringe vertically and pull down to the line of 10cc so that the heparin solution covers the inside of the syringe. Heparin is then discarded from the syringe. Then hold the ovary in one hand and the syringe in the other.

【０１３２】 濾胞と共に全ての濾胞液が抽出されたために、針はその後下へ傾け、濾胞が崩
壊するまでシリンジの方に軽く引き戻して濾胞の中に押し込む。濾胞の内側の吸
引工程の際軽く前と後ろに小刻みに動かす運動によって濾胞の崩壊及び全ての濾
胞内容物の除去が促進されることが確認された。Since all the follicular fluid was extracted with the follicles, the needle is then tilted down and gently pulled back into the syringe until the follicles collapse, pushing into the follicles. It was confirmed that a light wiggle forward and backward during the aspiration step inside the follicle facilitated the collapse of the follicle and removal of all follicular contents.

【０１３３】 吸引は10ccのマークを認めるまで可能な限り多くの濾胞を得るために続ける。
その後シリンジから針を除去し濾胞液を回収試験管の中で沈殿させる。Suction is continued to obtain as many follicles as possible until the 10 cc mark is seen.
The needle is then removed from the syringe and the follicular fluid is allowed to settle in a collection tube.

【０１３４】 卵母細胞に損傷を与えるのと同様に積細胞が引き離されるのを避けるために試
験管の中に濾胞液を沈殿させる際、針を取り除くのに注意をしなければならない
。また卵巣を廃棄し次の卵巣に移る前に個々の卵巣の適切なサイズの多数の濾胞
を全部吸引することが望ましい。最適な結果として、個々のセットの特徴に応じ
てへパリンでコーティングされたシリンジを交換することが望ましい。Care must be taken to remove the needle when precipitating the follicular fluid into the tube to avoid shedding the product cells as well as damaging the oocyte. It is also desirable to aspirate all of the appropriately sized follicles of an individual ovary before discarding the ovary and moving on to the next. For optimal results, it is desirable to replace the heparin-coated syringe depending on the characteristics of the individual set.

【０１３５】 （ブタ濾胞液調製） 代表的には約3-6mmの濾胞のブタ濾胞液(pFF)が成熟期前の若い雌ブタから回収
される。卵母細胞及び濾胞細胞は例えば約5-10分間待つことによって沈殿が可能
になる。その後pFFを吸引し15mlの三角試験管に除去する。その後これを30分間3
000rpmで4℃のSorvallで遠心分離する。試験管を除去しpFFを上記のペレットか
ら回収し、貯留し、0.8μmのフィルターと続いて0.45μmのフィルター(Sterivex
)を通して濾過する。濾過した物質をその後1.5mlの滅菌マイクロフュージ試験管
に分取し使用まで−20℃で凍結する。Preparation of Porcine Follicular Fluid The porcine follicular fluid (pFF) of about 3-6 mm follicles is typically recovered from premature young sows. Oocytes and follicle cells can be allowed to settle, for example, by waiting about 5-10 minutes. Then pFF is aspirated and removed in a 15 ml triangular test tube. Then do this for 30 minutes 3
Centrifuge at 4 ° C Sorvall at 000 rpm. Remove the test tube and collect pFF from the above pellet, pool and filter with a 0.8 μm filter followed by a 0.45 μm filter (Sterivex
). The filtered material is then aliquoted into 1.5 ml sterile microfuge tubes and frozen at -20 ° C until use.

【０１３６】 （表皮成長因子株(EGF)及び調製） 100μg EGF 0.1%BSAを加えた10mlのmNCSU 37 よく混合する。25μlまで分取し−20℃で凍結する。[0136]     (Epidermal growth factor strain (EGF) and preparation) 100 μg EGF 10 ml mNCSU 37 with 0.1% BSA Mix well. Collect up to 25 μl and freeze at -20 ° C.

【０１３７】 （MAT(PMSG/hCG)に対するウマ絨毛膜ゴナドトロピン及びヒト絨毛膜ゴナド
トロピン株及び調製） ECG(PMSG6000; Intervet Inc., Millsboro; DE19966) この材料は3mlのdH2Oを加えることによって6000IU/mlから2000IU/mlまで希釈す
る。 hCG(Chorulon; Intervet Inc.) hCG材料は5mlのdH2Oを加えることによって10,000IUから2,000IU/mlまで希釈する
。[0137] (MAT (PMSG / hCG) equine chorionic gonadotropin and human chorionic gonadotropin strains and preparation for) ECG (PMSG6000; Intervet Inc., Millsboro; DE19966) 6000IU by this material the addition of dH 2 O for 3 ml / Dilute from ml to 2000 IU / ml. hCG (Chorulon; Intervet Inc.) hCG material is diluted from 10,000 IU to 2,000 IU / ml by adding 5 ml dH 2 O.

【０１３８】 その後、1mlの希釈したPMSG及び1mlの希釈したhCGを1000IU/mlの個々のホルモ
ンを得るために混合する。50μlのアリコートをその後作出し−20℃で凍結する
。残ったPMSG及びhCG株もまた凍結する。Then 1 ml of diluted PMSG and 1 ml of diluted hCG are mixed to obtain 1000 IU / ml of the individual hormones. A 50 μl aliquot is then created and frozen at -20 ° C. The remaining PMSG and hCG strains are also frozen.

【０１３９】 （db-cAMP 100mM株及び調製） 25mg db-cAMP(-20℃のデシケーター内に貯蔵する。) 0.509ml dH2O 上記の材料をよく混合し50μlのアリコートを作出しその後-20℃で貯蔵する。(Db-cAMP 100 mM strain and preparation) 25 mg db-cAMP (stored in a desiccator at −20 ° C.) 0.509 ml dH 2 O The above materials were mixed well to make a 50 μl aliquot and then −20 ° C. Store at.

【０１４０】 (活性培養液) 1mg/ml BSAを含有する以外はHECM/HEPESと同じ。[0140]     (Active culture medium)   Same as HECM / HEPES except containing 1 mg / ml BSA.

【０１４１】 （抗生物質/抗真菌剤(Ab/Am)） 100U/lのペニシリン、100μg/lのストレプトマイシン及び0.25μg/lのアンフ
ォテリシンB、(Gibco #15240-062)Antibiotics / Antifungal Agents (Ab / Am) 100 U / l Penicillin, 100 μg / l Streptomycin and 0.25 μg / l Amphotericin B, (Gibco # 15240-062)

【０１４２】 上記の物質の10mlのアリコートを生理食塩液1 l毎に加える。10μlのこの混合
液を1ml毎に加える。A 10 ml aliquot of the above material is added per 1 liter of saline. Add 10 μl of this mixture every 1 ml.

【０１４３】 （卵母細胞複合体(OCC)回収） 卵巣を25℃で実験室に移送し直ちに抗生物質/抗真菌剤(10ml/l;Gibco#600-524
0g)を加えた0.9%生理食塩液で洗浄する。3-6mmの間の濾胞を減圧器(GEML bovine
system)に連結した18gの針及び50mlのFalcon試験管を用いて吸引する。試験管
が満たされた後、OCCを5-10分間沈殿させる。もし必要ならば濾胞液(pFF)を吸引
し培養システムで使用するために取っておく（下記のpFF調製プロトコールを参
照)。(Oocyte Complex (OCC) Recovery) The ovaries were transferred to the laboratory at 25 ° C. and immediately antibiotic / antimycotic (10 ml / l; Gibco # 600-524 was used.
Wash with 0.9% physiological saline containing 0 g). Reduce the follicles between 3-6 mm to a decompressor (GEML bovine
Aspirate with 18 g needle and 50 ml Falcon test tube connected to system). Allow OCC to settle for 5-10 minutes after the test tube is filled. If necessary, aspirate follicular fluid (pFF) and set aside for use in the culture system (see pFF preparation protocol below).

【０１４４】 （in vivoにおける卵母細胞回収のための好ましいプロトコール及び核移入
したブタ胚の移入） 225から275ポンドのLandrance×YorkもしくはLandrance×Hampshireの若い雌
ブタにPG600を注射し5から6日後に(発情期の開始後24時間から36時間後)動物を
畜殺場に送る。子宮を回収し隔離された容器内に置き実験室に持っていく。Preferred Protocol for Oocyte Recovery in Vivo and Transfer of Nuclear-Transfected Porcine Embryos 225 to 275 lbs of Landrance × York or Landrance × Hampshire young sows were injected with PG600 for 5-6 days. Later (24 to 36 hours after the start of estrus) the animals are sent to the slaughterhouse. The uterus is collected, placed in an isolated container and taken to the laboratory.

【０１４５】 卵管を子宮から切除し緩衝液で洗い流す。その後、上に述べたようにin vitro
において成熟卵母細胞を得るために卵母細胞を積細胞から引き離す。The fallopian tubes are excised from the uterus and flushed with buffer. Then in vitro as described above.
In, the oocytes are detached from the product cells in order to obtain mature oocytes.

【０１４６】 活性化の後、卵は5 1/2インチのTom Catカテーテル(Sovereign Cat. #8890-70
3021)の中に入れ同調性レシピエントの若い雌ブタ(同種で200から300ポンド)の
卵管に外科的に移入する。胚の総数の半分を個々の卵管に移入し代表的にはただ
100NTだけが1哺乳動物当たりに移入されるに過ぎない。幾つかの例として、2個
から4個の細胞胚を自然に作出した10個から20個の胚を「ヘルパー」胚としてNT
と共に移入する。カスパーゼ阻害剤は任意に胚の発生及び維持を亢進させるため
に緩衝液に含有される可能性がある。若い雌ブタは250mgのキシラジン、250mgの
ケラミン及び500mgのテラゾール、1ml/50poundの混合液を用いて麻酔する。キシ
ラジン、250mgのケラミン及び500mgのテラゾール。移植の後、好ましくはレシピ
エントの若い雌ブタは新しく隔離された設備に移動させる。After activation, the eggs were 5 1/2 inch Tom Cat catheter (Sovereign Cat. # 8890-70).
3021) and surgically transfer to the oviducts of young sows (200 to 300 pounds of the same species) of the synchronous recipient. Transferring half of the total number of embryos into individual fallopian tubes, typically only
Only 100 NT is transferred per mammal. As some examples, 10 to 20 embryos that spontaneously produced 2 to 4 cell embryos were designated as "helper" embryos.
To be transferred with. A caspase inhibitor may optionally be included in the buffer to enhance embryonic development and maintenance. Young sows are anesthetized with a mixture of 250 mg xylazine, 250 mg keramine and 500 mg terazole, 1 ml / 50 pounds. Xylazine, 250 mg keramine and 500 mg terazol. After transplantation, preferably the recipient young sow is moved to a newly isolated facility.

【０１４７】 妊娠チェックは好ましくは外科手術の後30日に、代表的には超音波検査によっ
て実施される。胎児は帝王切開術によってその時に回収することが可能で、また
それらの内のどの一つが核移入によって作出されたか確認するためにPCR及びサ
ザンブロット法によって解析する。他方クローン胎児を出産予定日まで発生分化
させ自然の方法もしくは帝王切開によって出産する。The pregnancy check is preferably performed 30 days after surgery, typically by ultrasonography. Fetuses can then be harvested by cesarean section and analyzed by PCR and Southern blotting to confirm which one of them was produced by nuclear transfer. On the other hand, the cloned fetus is developed and differentiated until the expected date of delivery and delivered by natural method or Caesarean section.

【０１４８】 OCCを20mlのHepes-PVA中で再懸濁させ沈殿させ、これを2回繰り返す。最後の
洗浄の後、OCCを格子の皿に移動し培養組織を選択する。選択されたOCCはHes-PV
Aの60mmの皿の中で2回洗浄する。全ての吸引及び卵母細胞回収は室温で行なわれ
る(およそ25℃)。OCC is resuspended and precipitated in 20 ml Hepes-PVA, which is repeated twice. After the final wash, the OCC is transferred to a grid dish and selected for tissue culture. The selected OCC is Hes-PV
Wash twice in A 60 mm dish. All aspirations and oocyte collections are done at room temperature (approximately 25 ° C).

【０１４９】 （in vitroにおける成熟(IVM)） 洗浄したOCC(約50)を約22時間個々に0.5mlの成熟培養液(上記の)を含有する4
ウェルのNuncプレートtje we;;s pfに置く。その後、卵母細胞を約20時間ホルモ
ンを欠乏させる以外は同じ培養液中に置く。In Vitro Maturation (IVM) Washed OCCs (about 50) containing about 0.5 hours each of 0.5 ml of mature broth (see above).
Place in well Nunc plate tje we ;; s pf. The oocytes are then placed in the same culture medium except for hormone deprivation for about 20 hours.

【０１５０】 （ブタ胚及び成熟線維芽細胞の初期培養組織の分離） ブタ線維芽細胞の初期培養組織を受精の後30日から114日、好ましくは35日の
子ブタ胎児から得られる。頭、肝臓、心臓及び消化器を無菌状態で除去し、胎児
を細かく刻み前もって温めたトリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02%EDTA;G
IBCO、グランドアイランド、ニューヨーク州)中で37℃で30分インキュベートす
る。線維芽細胞を組織培養皿に置き10%胎児ウシ血清(FCS)(Hyclone、ロージェン
、ユタ州)を補充したアルファ-MEM培養液(Bio Whittaker、ウォーカースビーレ
、メリーランド州)、ペニシリン(100IU/ml)及びストレプトマイシン(50μl/ml)
を含む線維芽細胞成長培養液(FGM)中で培養する。線維芽細胞を37℃の空気中で5
%CO2を含んだ湿度の高い環境で成長させ、維持する。(Isolation of Initial Cultured Tissue of Porcine Embryo and Mature Fibroblasts) The initial cultured tissue of porcine fibroblasts is obtained from a fetal piglet 30 to 114 days, preferably 35 days after fertilization. Head, liver, heart and digestive system are removed aseptically and the fetus is finely chopped and pre-warmed with trypsin EDTA solution (0.05% trypsin / 0.02% EDTA; G
Incubate for 30 minutes at 37 ° C in IBCO, Grand Island, NY). Fibroblasts were placed in tissue culture dishes and supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (Hyclone, Rhogen, Utah) in alpha-MEM medium (Bio Whittaker, Walkersville, MD), penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (50 μl / ml)
Culture in a fibroblast growth medium (FGM) containing Fibroblasts in air at 37 ° C 5
Grow and maintain in a humid environment containing% CO 2 .

【０１５１】 成熟線維芽細胞をブタの胚および皮膚から分離する。細かく刻んだ胚の組織を
トリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02% EDTA;GIBCO,グランドアイランド、
ニューヨーク州)中で10℃で一晩インキュベートする。次の日にあらかじめあた
ためたトリプシンEDTA溶液(0.05%トリプシン/0.02% EDTA; GIBCO、グランドアイ
ランド、ニューヨーク州)中で37℃で１時間、組織およびあらゆる分離した細胞
をインキュベートし、連続的に３回洗浄することによって処理しトリプシンをイ
ンキュベート(１時間)する。線維芽細胞を組織培養皿におき、10%胎児子ウシ血
清(FCS)(Hyclone,ローゲン、ユタ州)、ペニシリン(100IU/ml)およびストレプト
マイシン(50μl/ml)を補充したアルファ-MEM培養液(Bio Whittaker,ウォーカー
スビーレ、メリーランド州)中で培養する。線維芽細胞はおよそ胚盤期の後から
哺乳動物の成熟期間(ブタでは受精の後９日目から10日目から５歳以上まで)の範
囲で、事実上発生期のいつでも分離できる。Mature fibroblasts are isolated from porcine embryos and skin. Trypsin EDTA solution (0.05% trypsin / 0.02% EDTA; GIBCO, Grand Island,
Incubate overnight at 10 ° C in New York. Next day preincubate trypsin EDTA solution (0.05% trypsin / 0.02% EDTA; GIBCO, Grand Island, NY) at 37 ° C for 1 hour, incubating the tissue and any detached cells for 3 consecutive times. Treat by washing and incubate trypsin (1 hour). Place fibroblasts in tissue culture dishes and in alpha-MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (Hyclone, Rogen, UT), penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (50 μl / ml). Bio Whittaker, Walkersville, MD). Fibroblasts can be isolated at any time during development, approximately in the post-blastoderm to mammalian maturation period (9-10 days post fertilization in pigs to ages 5+).

【０１５２】 （核移入のための線維芽細胞の調製） ドナー核として利用される可能性のある胎児線維芽細胞の例は次のようである
； １．あらゆる１細胞期もしくは絶食時血清あるいは休止状態における同調しない
増殖している線維芽細胞は核ドナーとして役に立つ。上記の培養組織由来の細胞
をトリプシンEDTAで10分間処理し100%胎児子ウシ血清中で3回洗浄する。単細胞
線維芽細胞にその後HbT培養液(Bavisterら、1983)を顕微操作下で滴下する。こ
れは脱核した子ブタ卵母細胞への線維芽細胞の移入の前10分から30分に実施する
。好ましくは、CMVプロモーターおよび緑色蛍光タンパク遺伝子(第９継代)をも
った増殖している形質転換した線維芽細胞をNTユニットを作出するために利用す
る。(Preparation of Fibroblasts for Nuclear Transfer) Examples of fetal fibroblasts that may be used as donor nuclei are as follows; Any one-cell or fasting serum or unsynchronized proliferating fibroblasts in the resting state serve as nuclear donors. The cells derived from the above-mentioned cultured tissue are treated with trypsin EDTA for 10 minutes and washed 3 times with 100% fetal calf serum. HbT medium (Bavister et al., 1983) is then added dropwise to the single cell fibroblasts under micromanipulation. This is done 10 to 30 minutes before the transfer of fibroblasts to enucleated piglet oocytes. Preferably, growing transformed fibroblasts with the CMV promoter and the green fluorescent protein gene (passage 9) are utilized to generate NT units.

【０１５３】 ２．第二の方法として、線維芽細胞は細胞サイクルのG1もしくはG0に同調する
。線維芽細胞は成長し融合する。その後FGM中の胎児子ウシ血清の濃度を連続４
日以上(０日目=10%、1日目=5%、２日目=2.5%、３日目=1.25%、４日目=0.625%)半
分にする。５日目に細胞をトリプシンEDTAで10分間処理し100%胎児ウシ血清中で
３回洗浄する。その後単細胞線維芽細胞をHbT培養液の顕微操作下で滴下する。
これは脱核した子ブタ卵母細胞に線維芽細胞を移入する前15分以内に実施する。2. As a second method, fibroblasts synchronize with G1 or G0 in the cell cycle. Fibroblasts grow and fuse. After that, the concentration of fetal calf serum in FGM was continuously increased to 4
Reduce to more than half a day (day 0 = 10%, day 1 = 5%, day 2 = 2.5%, day 3 = 1.25%, day 4 = 0.625%). On day 5, cells are treated with trypsin EDTA for 10 minutes and washed 3 times in 100% fetal bovine serum. After that, single cell fibroblasts are added dropwise under the micromanipulation of the HbT culture solution.
This is done within 15 minutes prior to the transfer of fibroblasts to enucleated piglet oocytes.

【０１５４】 他方、ドナー細胞、例えば線維芽細胞は生存している哺乳動物、例えば成熟ブ
タから、例えば組織もしくは体液源から直接得られる。On the other hand, donor cells, eg fibroblasts, are obtained directly from a living mammal, eg a mature pig, eg from a tissue or fluid source.

【０１５５】 （積細胞の除去） 約30時間から50時間、好ましくは約42時間の範囲の成熟期の後、好ましくは卵
母細胞を脱核できる。積細胞の除去は好ましくは0.68mg/mlのヒアルロニダーゼ
を含有するH/H培養液に細胞を接触させ、続いて約３分間渦を作ることによる脱
核の前に実施する。他方、脱核の前に卵母細胞を取り除き、積細胞の除去の前に
1mg/mlのヒアルロニダーゼを含有するHECM(Seshagiri and Bavister,1989)中に
置くことが可能である。これは非常に細い内径のピペットで繰り返しピペッティ
ングすることによってもしくは短い時間(約３分間)渦を作ることによって起こる
可能性がある。引き離された卵母細胞はその後極体を選別し、また極体の存在に
よってした選別された中期II卵母細胞をその後核移入のために使用する。Removal of Product Cells After maturation in the range of about 30 to 50 hours, preferably about 42 hours, oocytes can be preferably enucleated. Cumulus cell removal is preferably carried out prior to enucleation by contacting the cells with H / H medium containing 0.68 mg / ml hyaluronidase, followed by vortexing for about 3 minutes. On the other hand, remove the oocyte before enucleation and remove the product cell before removal.
It is possible to place in HECM (Seshagiri and Bavister, 1989) containing 1 mg / ml hyaluronidase. This can occur by repeated pipetting with a very small inner diameter pipette or by creating a vortex for a short time (about 3 minutes). The dissociated oocytes then sort the polar body, and the sorted metaphase II oocytes, depending on the presence of the polar body, are then used for nuclear transfer.

【０１５６】 （脱核；） この好ましい工程は少なくとも20分間NCSU 23＋ショ糖＋HXTに卵母細胞を曝露
することを含み、その後ショ糖およびサイトカラシンBを含有するH/H培養液の中
で脱核を実施する。脱核の後卵母細胞は好ましくは移入の前にショ糖を含有する
NCSU 23中に置く。Enucleation; This preferred step involves exposing oocytes to NCSU 23 + sucrose + HXT for at least 20 minutes, followed by de-encapsulation in H / H medium containing sucrose and cytochalasin B. Carry out the nuclear. After enucleation, the oocyte preferably contains sucrose before transfer
Place in NCSU 23.

【０１５７】 （移入；） 移入のための細胞は好ましくはプロナーゼもしくはTEで処理する。プロナーゼ
の場合、400μl/lで処理し、インキュベートした後H/H培養液で希釈し、４分間6
kRPMで遠心分離し、その後使用時にH/H培養液中で再懸濁する。(Transfection;) Cells for transfection are preferably treated with pronase or TE. For pronase, treat with 400 μl / l, incubate and then dilute with H / H medium for 6 minutes 6 min.
Centrifuge at kRPM and then resuspend in H / H medium at the time of use.

【０１５８】 TEの場合に同じプロトコールが利用される。その後好ましくはショ糖を含むH/
H培養液中で移入が起こりそれが完了した時、細胞を融合のためにショ糖を含むN
CSU 23中に置く。The same protocol is utilized for TE. Then preferably H / containing sucrose
When transfection takes place and completes in the H medium, the cells are mixed with sucrose for fusion.
Place in CSU 23.

【０１５９】 （融合培養液；） 処方：500mlのSigma水 0.28マンニトール25.51g 100μM MgSO4 0.0123g 10ｍM ヒスチジン 0.776g(Fusion Culture Solution) Formulation: 500 ml Sigma water 0.28 mannitol 25.51 g 100 μM MgSO 4 0.0123 g 10 mM histidine 0.776 g

【０１６０】 （融合：） 核移入ユニットは好ましくはH/H勾配とマンニトールの勾配1:2,1:1および0:2
を実施し、またその後600μMチャンバー内で融合しマンニトールに浸す。Fusion: The nuclear import unit is preferably H / H gradient and mannitol gradient 1: 2, 1: 1 and 0: 2.
And then fuse and soak in mannitol in a 600 μM chamber.

【０１６１】 細胞を＠100Vに30μsec細胞を置くことによって電気融合する。融合の後、NT
ユニットを好ましくは活性化の前２時間、純粋なH/H中に置きその後NCSU 23＋Cy
to B(３μl/2ml)中に置く。The cells are electrofused by placing the cells for 30 μsec at @ 100V. After fusion, NT
The unit is preferably placed in pure H / H for 2 hours before activation and then NCSU 23 + Cy
Place in to B (3 μl / 2 ml).

【０１６２】 （活性化） 代表的には成熟の後約47時間から49時間用いられる可能性のある活性化の手法
の例は本申請書の中ですでに確認された次の工程を含む。上述のように活性化は
融合の前、直前直後、もしくは後に起こる可能性がある。Activation Examples of activation procedures that may typically be used for about 47 to 49 hours after maturation include the following steps already identified in this application. As mentioned above, activation can occur before, immediately after, or after fusion.

【０１６３】 （１．１．イオノマイシン/DMAP工程：） NTユニットを４分間１mg/ml BSA＋10μMイオノマイシン(4μl/2ml)を含有する
H/H培養液中に置き、H/Hですすぎその後NCSU 23＋DMAP(1μl/ml)中に30分間置く
。その後BSA(1μl/ml)および５μMイオノマイシンを含有する同じH/H培養液中に
置き、その後30分間処理する。(1.1. Ionomycin / DMAP step :) NT unit contains 1 mg / ml BSA + 10 μM ionomycin (4 μl / 2 ml) for 4 minutes
Place in H / H medium, rinse with H / H, then place in NCSU 23 + DMAP (1 μl / ml) for 30 minutes. It is then placed in the same H / H medium containing BSA (1 μl / ml) and 5 μM ionomycin and then treated for 30 minutes.

【０１６４】 その後、１mg/ml BSA+2.5μMイオノマイシンおよびDMAPを含有する同じH/H培
養液中に更に２時間置く。Then place in the same H / H medium containing 1 mg / ml BSA + 2.5 μM ionomycin and DMAP for another 2 hours.

【０１６５】 その後DMAPを除去するためにNTユニットをすすぎその後、NCSU 23中で培養す
る。培養液は３日目に交換し５日目に５％FBSを加え胚盤胞が形成されるまでNT
ユニットを培養する。The NT units are then rinsed to remove DMAP and then cultured in NCSU 23. The culture medium was exchanged on the 3rd day and 5% FBS was added on the 5th day until blastocysts were formed.
Incubate the unit.

【０１６６】 ２．単一活性化パルス。NTユニットをNCSU 23＋CBから除去し活性化培養液中
で３回洗浄する。平衡の後、NTユニットを融合工程で述べたように活性化培養液
を満たした融合チャンバー(500μm 間隙で)中に置く。30μsec30Vのパルスが適
用される。その後、直ちにNTユニットをHECM HEPES中で３回洗浄し、胚移入、も
しくはin vitroにおける培養(NCSU 23中で39℃, 5%CO2)までさらに２時間NCSU
23中で培養する(39℃, 5%CO2)。培養の際NTユニットは培養の２日目に新鮮なNCS
U 23＋５％胎児子ウシ血清中に置く。表１の結果は卵母細胞がこの工程を利用し
て活性化できることおよびそれらが発生能力をもつことを示している。2. Single activation pulse. Remove the NT unit from NCSU 23 + CB and wash 3 times in activation medium. After equilibration, the NT unit is placed in a fusion chamber (with 500 μm gap) filled with activated medium as described in the fusion step. 30μsec 30V pulse is applied. Immediately thereafter, the NT unit was washed three times in HECM HEPES and transferred to an embryo or cultured in vitro (39 ° C in NCSU 23, 5% CO 2 ) for another 2 hours NCSU.
Incubate in 23 (39 ° C, 5% CO 2 ). During the culturing, NT unit is fresh NCS on the 2nd day
U23 + 5% in fetal calf serum. The results in Table 1 show that oocytes can be activated utilizing this process and that they are developmental.

【０１６７】 ３．二つの活性化パルス。NTユニットをNCSU 23＋CBから除去し活性化培養液
中で３回洗浄する。平衡の後NTユニットを融合工程の中で述べたように活性化培
養液で満たされた融合チャンバー(500μMの間隙)の中に戻す。30μsec30Vのパル
スが適用される。その後直ちにHECM/HEPES中で３回洗浄しNESU 23＋CB中に戻し
、１時間後の次の電気的パルスまでが39℃、５％CO2の培養液中で培養する。こ
の１時間後に活性化培養液平衡段階を繰り返し30μsecの間15Vのパルスが適用さ
れる。その後直ちにNTユニットをHECM HEPES中で３回洗浄しNCSU 23+CB中に戻し
、また更に２時間から６時間39℃、５％CO2の培養液中で培養する。上記の１で
述べた同じ工程を用いてNTユニットを培養する。テーブル１の結果は卵母細胞が
この工程を用いて活性化できることおよびそれらが発生能力をもつことを示して
いる。核移入胚についても同じことが言える。４胚盤胞期NTユニットを２パルス
活性化工程によって作出した。3. Two activation pulses. Remove the NT unit from NCSU 23 + CB and wash 3 times in activation medium. After equilibration, the NT unit is returned to the fusion chamber (500 μM gap) filled with activated medium as described in the fusion process. 30μsec 30V pulse is applied. Immediately thereafter, the cells are washed 3 times in HECM / HEPES, returned to NESU 23 + CB, and incubated at 39 ° C. in 5% CO 2 until 1 hour after the next electric pulse. After this 1 hour, the activation medium equilibration step is repeated and a 15 V pulse is applied for 30 μsec. Immediately thereafter, the NT unit is washed 3 times in HECM HEPES, returned to NCSU 23 + CB, and further cultured for 2 to 6 hours at 39 ° C. in a 5% CO 2 culture medium. Incubate the NT unit using the same process described in 1 above. The results in Table 1 show that oocytes can be activated using this process and they are developmentally competent. The same applies to nuclear transfer embryos. Four blastocyst NT units were created by a 2-pulse activation process.

【０１６８】 ４．***因子。Stice およびRobl(Mol.Reprod.Dev.,25:272-280)(1990)(その
内容はこの文書の中の参考文献に具体的に示されている)によって哺乳類の***
について最初に述べたように、この因子は卵母細胞の活性化を引き起こす。子ブ
タ***細胞からの***因子分離およびマイクロインジェクションの手法はFissor
eら(Mol.Reprod.Dev.,46:176-189(1997))の中に述べられている。その内容はこ
の文書の中の参考文献の中に具体的に示されている。NTユニットをNCSU 23+CBか
ら取り除き脱核および線維芽細胞移入のために上に述べた顕微操作プレートに置
く。***因子で満たされたマイクロインジェクション針(１μm開口)を用いて卵
母細胞はNTユニットの細胞質内への因子の送達の後活性化を受ける。マイクロイ
ンジェクションの後、NT胚はHECM HEPES中で洗浄し２時間から６時間NCSU 23＋C
B中に置き、その後胚移入までNCSU 23中に置く。4. Sperm factor. Stice and Robl (Mol. Reprod. Dev., 25: 272-280) (1990), the content of which is specifically set forth in the references in this document, as originally described for mammalian sperm. In addition, this factor causes oocyte activation. Fissor is a method for sperm factor isolation and microinjection from piglet sperm cells.
e., et al. (Mol. Reprod. Dev., 46: 176-189 (1997)). Its contents are specified in the references within this document. The NT unit is removed from NCSU 23 + CB and placed on the micromanipulation plate described above for enucleation and fibroblast transfer. Using a microinjection needle (1 μm opening) filled with sperm factors, oocytes undergo activation after delivery of the factors into the cytoplasm of NT units. After microinjection, NT embryos were washed in HECM HEPES for 2-6 hours NCSU 23 + C
Place in B, then in NCSU 23 until embryo transfer.

【０１６９】[0169]

【表５】 [Table 5]

【０１７０】 （胚移入） 子ブタにおける１細胞胚移入の手法がよく知られている(例えば、Pinkertら、
1993、この内容はこの文書の参考文献に具体的に示されている）。代表的に、20
個から30個のNTおよび100個のNTまでのユニットを飼育されたまたは飼育されて
いない若い雌ブタの卵管内に同調移入する。妊娠29日を超えた核移植した胎児(
形質転換したもしくは形質転換しない)はレシピエントの雌ブタから回収できる
。他方、胎児は出産予定日(妊娠114日)に到達しクローンウシの産子が作出され
る。上記のように、このような雌ブタはまた好ましくは「ヘルパー」胚、例えば
正常ブタ胚、単為発生のブタ胚、もしくは四倍体胚を含むであろう。ヘルパー胚
の数は１から約50まで、代表的には２から４まで変化する可能性がある。Embryo Transfer Techniques for single cell embryo transfer in piglets are well known (eg Pinkert et al.
1993, the content of which is set forth in the bibliography of this document). Typically, 20
Units from 1 to 30 NT and 100 NT are synchronously transferred into the oviducts of young and domesticated sows. Fetuses that have undergone nuclear transfer beyond 29 days of gestation (
Transformed or untransformed) can be recovered from the recipient sow. On the other hand, the fetus reaches the expected date of birth (114th day of pregnancy), and the offspring of the cloned cow is produced. As mentioned above, such sows will also preferably include "helper" embryos, such as normal pig embryos, parthenogenic pig embryos, or tetraploid embryos. The number of helper embryos can vary from 1 to about 50, typically 2 to 4.

【０１７１】 （in vitroにおける成熟期のカスパーゼ阻害剤の使用。卵母細胞の引き離し
もしくは活性化） 上で述べたようにカスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ3、8もしくは９の追加
によってNT工程から生じた胚盤胞の数を増加させるということが発見された。こ
の発見を支持するいくらかのデータが下の表に示されている。Use of Caspase Inhibitors during In Vitro Maturation. Oocyte Separation or Activation Produced from the NT step by the addition of a caspase inhibitor, eg caspase 3, 8 or 9 as described above. It was discovered to increase the number of blastocysts. Some data supporting this finding are shown in the table below.

【表６】 [Table 6]

【０１７２】 また、読者の便宜のために、発明者によって用いられているブタ卵母細胞の移
入のためのこの好ましい試験計画は下に総括されている。Also, for the convenience of the reader, this preferred protocol for the transfer of porcine oocytes used by the inventor is summarized below.

【０１７３】 （好ましいクローニング法および材料の要約） （ブタ卵母細胞の核移入のためのプロトコール：） （in vitroにおける成熟：） 引き離しの間にNCSU 37＋PFF＋β-メルカプトエタノール＋システイン＋EGF＋
1000IUのHCG/PMSG＆cAMP中に22時間置き、H/Hで３回すすぐ。 ４ウェルのNuncプレート中にホルモンを追加せずに上の培養液に20時間置く。(Summary of Preferred Cloning Methods and Materials) (Protocol for Nuclear Transfer of Porcine Oocytes :) (Maturation in vitro :) NCSU 37 + PFF + β-mercaptoethanol + Cysteine + EGF + during detachment
Place in 1000 IU of HCG / PMSG & cAMP for 22 hours, rinse with H / H 3 times. Place in the above medium for 20 hours without adding hormones in 4-well Nunc plates.

【０１７４】 （ブタ卵母細胞のプロセッシング：） 0.68mg/mlのHyalで引き離し３分間3回渦を起こす。[0174]     (Pig oocyte processing :)   Separate with Hyal of 0.68 mg / ml and vortex 3 times for 3 minutes.

【０１７５】 （必要な培養液：） HECM/HEPES＋ショ糖(0.2567mg/10ml) NCSU 23＋ショ糖(0.2567ml/10ml) NCSU 23[0175]     (Required culture medium :) HECM / HEPES + sucrose (0.2567mg / 10ml) NCSU 23 + sucrose (0.2567ml / 10ml) NCSU 23

【０１７６】 （融合培養液：） 10μMマンニトール 処方：500mlのSigma水 0.28マンニトール 25.51g 100μM MgSO4 0.0123g 10mMヒスチジン 0.776k(Fusion medium :) 10 μM mannitol Formulation: 500 ml Sigma water 0.28 mannitol 25.51 g 100 μM MgSO 4 0.0123 g 10 mM histidine 0.776k

【０１７７】 （融合：） 核移入ユニットをH/Hとマンニトールの勾配1:2、1:1、および0:2を実施しまた
その後600μmチャンバー内で融合し、マンニトールに浸す。Fusion: The nuclear transfer unit is subjected to H / H and mannitol gradients 1: 2, 1: 1 and 0: 2 and then fused in a 600 μm chamber and immersed in mannitol.

【０１７８】 30μsec100Vを適用することによって融合が起こる。融合物は直ちに純粋なH/H
中に置きその後活性化の前にNCSU 23＋CytoB(3μl/2ml)中に２時間置く。Fusion occurs by applying 30 μsec 100V. The fusion is immediately pure H / H
Place in NCSU 23 + Cyto B (3 μl / 2 ml) for 2 hours before activation.

【０１７９】 （脱核） 卵母細胞を少なくとも20分間NCSU 23＋ショ糖＋HXTに曝露する。 脱核はH/H＋ショ糖＋cyto Ｂ中で実施する。 その後卵母細胞を移入の前にNCSU 23＋ショ糖中に置く。[0179]     (Enucleation) Oocytes are exposed to NCSU 23 + sucrose + HXT for at least 20 minutes. Enucleation is carried out in H / H + sucrose + cyto B. The oocytes are then placed in NCSU 23 + sucrose prior to transfer.

【０１８０】 （移入） プロナーゼもしくはTEのいずれかで調製された細胞 プロナーゼ―400μl/ウェル、固定して置く、H/Hで希釈し4分間６kRPMで遠心分
離、使用時H/Hで懸濁 TE―細胞分離のための同一のプロトコール。(Transfection) Cell Pronase Prepared with either Pronase or TE-400 μl / well, Place Fixed, Dilute with H / H, Centrifuge for 4 min at 6 kRPM, Suspend with H / H at Use -Identical protocol for cell separation.

【０１８１】 移入がH/H＋ショ糖の中で行なわれ、また完了した時融合のためにNCSU 23＋シ
ョ糖の中へもどす。Transfer was carried out in H / H + sucrose and when completed is returned to NCSU 23 + sucrose for fusion.

【０１８２】 （活性化培養液） H/H Z1(H/Hと同様であるが、１mg/mlのBSAを加えて） 30分までに分離した3つの個々の処理。 １．4分間H/H Z1＋10μMイオノマイシン(４μl/２ML)、H/Hですすぎその後３０
分間NCSU 23＋DMAP(１μl/ml)中に置く ２．更に２時間H/H Z1＋５l＋2.5μMイオノマイシンおよびその後DMAPActivation media H / H Z1 (similar to H / H but with 1 mg / ml BSA) 3 individual treatments separated by 30 minutes. 1. H / H Z1 + 10μM ionomycin (4μl / 2ML) for 4 minutes, rinse with H / H for 30 minutes
Place in NCSU 23 + DMAP (1 μl / ml) for 2 minutes 2. H / H Z1 ＋ 5l ＋ 2.5μM ionomycin and then DMAP for 2 hours

【０１８３】 DMAPを除去するために活性NTユニットをすすぎ、その後NCSU 23中で培養する
。The active NT units are rinsed to remove DMAP and then cultured in NCSU 23.

【０１８４】 培養液は1日3回交換し5日目に５％FBSを加え、胚盤胞まで培養する。[0184]   The culture solution is exchanged 3 times a day, and 5% FBS is added on the 5th day to culture the blastocyst.

【０１８５】 本発明はいくらかの個々の具体例に関して述べたが、それらの多くの一時変異
及び変更が発明の精神から離れることなしに専門家によって作り出される可能性
がある。従って、補遺の請求項によって本発明の本当の趣旨及び限界の範囲には
いるすべての一時変異および変更を包含することを意図している。Although the present invention has been described in terms of some specific embodiments, many of those transient mutations and modifications can be made by experts without departing from the spirit of the invention. Therefore, it is intended that the appended claims cover all temporary variations and modifications that fall within the true spirit and scope of the invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 スタイス、スティーブン、エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 アムハースト ロード 468 (72)発明者 シベリ、ホセ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、アム ハースト、 ヴィレッジ パーク 166 (72)発明者 ロブル、ジェイムズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 オールド エンフィール ド 196 (72)発明者 ゴルーク、ポール アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ベル チャータウン、 ダイアン ドライブ ８ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 CA02 DA02 EA02 GA12 GA14 GA18 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG , ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, C H, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE , ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, K P, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, S E, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT , TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Steis, Steven, Elle             Bell, Massachusetts, USA             Chartown, Amherst Road             468 (72) Inventor Siberi, Jose             Am, Massachusetts, United States             Hearst, Village Park 166 (72) Inventor Roble, James             Bell, Massachusetts, USA             Chartown, Old Enfeel             Do 196 (72) Inventor Goruk, Paul             Bell, Massachusetts, USA             Chartown, Diane Drive 8 F-term (reference) 4B024 AA10 CA02 DA02 EA02 GA12                       GA14 GA18                 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01                       CA60

Claims (49)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に脱
核した子ブタ卵母細胞もしくは割球の中に適切に分化した子ブタ細胞もしくは細
胞核を挿入する (ii)もし前もって除去されていない場合前述の卵母細胞もしくは割球から内生の
核を除去する (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化する (iv)前述のNTユニットを任意に培養する (v)NTユニットがブタ胎児もしくは動物に発育するように宿主の哺乳類に前記の
任意に培養されたNTユニットを移入することから成るブタ胎児もしくは生存して
いる産子をクローニングする方法。1. (i) Inserting appropriately differentiated piglet cells or cell nuclei into arbitrarily enucleated piglet oocytes or blastomeres under conditions suitable for the formation of nuclear transfer (NT) units. (Ii) removes the endogenous nucleus from the oocyte or blastomere, if not previously removed (iii) activates the resulting nuclear import unit (iv) optionally the NT unit (V) A method for cloning fetal pigs or live offspring, which comprises transferring (v) the optionally cultured NT units into a host mammal so that the (v) NT units develop into fetal pigs or animals. . 【請求項２】 結果として生存している産子を作出する請求項１記載の方法
。2. The method of claim 1, wherein the resulting live offspring are produced. 【請求項３】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは細胞核内において適切な
DNAが挿入され、除去されあるいは一時変異され、それによって結果として遺伝
的に去勢されたNTユニットを作出する請求項１記載の方法。3. In the differentiated piglet cell or cell nucleus, the
The method of claim 1, wherein the DNA is inserted, removed or mutated, thereby producing a genetically castrated NT unit. 【請求項４】 胎児を産子にまで発生分化することを含む請求項３記載の方
法。4. The method according to claim 3, which comprises developing and differentiating the fetus into an offspring. 【請求項５】 ２細胞発生期より以降の段階になるまで前記の活性核移入ユ
ニットを培養することを含む請求項１記載の方法。5. The method according to claim 1, which comprises culturing the active nuclear transfer unit until the stage after the 2-cell development stage. 【請求項６】 移入されたNTユニットが一つの細胞である請求項１記載の方
法。6. The method according to claim 1, wherein the transferred NT unit is one cell. 【請求項７】 移入が活性化と同日に実施される請求項６記載の方法。7. The method of claim 6, wherein the transfer is performed on the same day as activation. 【請求項８】 前記の分化した細胞もしくは核の導入の後卵母細胞が脱核さ
れる請求項１記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the oocyte is enucleated after the introduction of the differentiated cell or nucleus. 【請求項９】 分化した細胞あるいは核が増殖している(非静止状態の)細胞
の分化した細胞あるいは核である請求項１記載の方法。9. The method according to claim 1, wherein the differentiated cells or nuclei are differentiated cells or nuclei of proliferating (non-quiescent) cells. 【請求項１０】 前記の分化した細胞がG1、G2もしくはＭの中に存在する請
求項９記載の方法。10. The method of claim 9, wherein the differentiated cells are in G 1 , G 2 or M. 【請求項１１】 子ブタ卵母細胞がin vitroで成熟する請求項１記載の方法
。11. The method of claim 1, wherein the piglet oocyte matures in vitro. 【請求項１２】 子ブタ卵母細胞がin vivoで成熟する請求項１記載の方法
。12. The method of claim 1, wherein the piglet oocyte matures in vivo. 【請求項１３】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは核が体細胞から得られ
る請求項１記載の方法。13. The method of claim 1, wherein the differentiated piglet cell or nucleus is obtained from somatic cells. 【請求項１４】 前記の分化した子ブタ細胞もしくは核が胚細胞から得られ
る請求項１記載の方法。14. The method of claim 1, wherein the differentiated piglet cells or nuclei are obtained from embryonic cells. 【請求項１５】 宿主の哺乳動物が一個以上のヘルパー胚から成る請求項１
記載の方法。15. The host mammal comprises one or more helper embryos.
The method described. 【請求項１６】 分化した細胞が前記のクローン胎児もしくは哺乳動物の細
胞、組織、あるいは器官のヒトへの移植に対する拒絶反応を抑制する一つ以上の
遺伝的一時変異から成る請求項１記載の方法。16. The method of claim 1, wherein the differentiated cells comprise one or more genetic transient mutations that inhibit the rejection of said cloned fetal or mammalian cells, tissues, or organs for transplantation into humans. . 【請求項１７】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が中胚葉由来である請
求項１記載の方法。17. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is derived from mesoderm. 【請求項１８】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が外胚葉由来である請
求項１記載の方法。18. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is derived from ectoderm. 【請求項１９】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が内胚葉由来である請
求項１記載の方法。19. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is derived from endoderm. 【請求項２０】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が線維芽細胞もしくは
細胞核である請求項１記載の方法。20. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is a fibroblast or cell nucleus. 【請求項２１】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が成熟分化した細胞も
しくはその細胞由来の核である請求項１記載の方法。21. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is a mature differentiated cell or a nucleus derived from the cell. 【請求項２２】 分化した子ブタ細胞もしくは細胞核が胚のもしくは胎児の
細胞あるいは細胞核である請求項１記載の方法。22. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cell or cell nucleus is an embryonic or fetal cell or cell nucleus. 【請求項２３】 分化した子ブタ細胞あるいは核が子ブタから直接得られた
増殖細胞である請求項１記載の方法。23. The method according to claim 1, wherein the differentiated piglet cells or nuclei are proliferating cells obtained directly from piglets. 【請求項２４】 前記の分化した細胞もしくは核が組織培養液の中で増殖し
た増殖細胞から得られる請求項１記載の方法。24. The method of claim 1, wherein the differentiated cells or nuclei are obtained from proliferating cells grown in tissue culture. 【請求項２５】 前記の分化した細胞もしくは核が核移入に先だって、in v
ivoで増殖する請求項１記載の方法。25. The differentiated cells or nuclei are prior to nuclear transfer, in v
The method of claim 1 which grows in ivo. 【請求項２６】 前記の増殖している子ブタ細胞が、ブタ細胞が注射された
SCIDマウスから得られる請求項25記載の方法。26. The proliferating piglet cells are injected with pig cells.
26. The method of claim 25, obtained from SCID mice. 【請求項２７】 前記の増殖細胞が遺伝的に一時変異した請求項25記載の方
法。27. The method of claim 25, wherein the proliferating cells are genetically transiently mutated. 【請求項２８】 前記の遺伝的一時変異が組換えウイルス、ウイルスベクタ
ー、ネイキッド（naked）DNA、もしくはプラスミドベクターの利用によってもた
らされる請求項27記載の方法。28. The method of claim 27, wherein said genetic transient mutation is brought about by the use of recombinant virus, viral vector, naked DNA, or plasmid vector. 【請求項２９】 脱核された卵母細胞が脱核の前に成熟する請求項1記載の
方法。29. The method of claim 1, wherein the enucleated oocyte matures prior to enucleation. 【請求項３０】 一つ以上の電気的パルスに曝露することによって融合核移
入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。30. The method of claim 1, wherein the fusion nuclear transfer unit is activated by exposure to one or more electrical pulses. 【請求項３１】 イオノマイシンおよびDMAPに曝露することによって融合核
移入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。31. The method of claim 1, wherein the fusion nuclear import unit is activated by exposure to ionomycin and DMAP. 【請求項３２】 ***の細胞由来の少なくとも一つの活性化因子に曝露する
ことによって融合核移入ユニットが活性化される請求項１記載の方法。32. The method of claim 1, wherein the fusion nuclear transfer unit is activated by exposure to at least one activator from sperm cells. 【請求項３３】 マイクロインジェクションが前記の非相同DNAを挿入する
ために用いられる請求項３記載の方法。33. The method of claim 3, wherein microinjection is used to insert the heterologous DNA. 【請求項３４】 電気穿孔法が非相同DNAを挿入するために用いられる請求
項３記載の方法。34. The method of claim 3, wherein electroporation is used to insert the heterologous DNA. 【請求項３５】 前記の胎児もしくは動物が任意に遺伝的に一時変異される
あらかじめ存在している無胚の分化したブタ細胞と同じ遺伝子型をもつ請求項1
記載の方法によって得られたクローン化され任意に形質転換したブタ胎児、もし
くは動物。35. The fetal or animal has the same genotype as a preexisting, non-embryonic, differentiated porcine cell that is optionally genetically transiently mutated.
A cloned, optionally transformed, fetal pig or animal obtained by the method described. 【請求項３６】 キメラ胚を作出する受精胚を持つクローン化されたNTユニ
ットの結合をさらに含む請求項１記載の方法。36. The method of claim 1, further comprising the attachment of a cloned NT unit bearing a fertilized embryo that produces a chimeric embryo. 【請求項３７】 キメラ胚を産子にまで発育させることを含む請求項36記載
の方法。37. The method of claim 36, comprising developing the chimeric embryo to offspring. 【請求項３８】 請求項３６記載の方法によって得られたキメラ胎児。38. A chimeric fetus obtained by the method of claim 36. 【請求項３９】 請求項３７記載の方法によって得られたキメラ産子。39. A chimeric litter obtained by the method according to claim 37. 【請求項４０】 請求項３９によるキメラ産子の後代。40. Progeny of the chimeric offspring according to claim 39. 【請求項４１】 (i)核移入(NT)ユニットの形成に適した条件下で、任意に
脱核した子ブタ卵母細胞もしくは割球の中に適切な分化をした子ブタ細胞もしく
は細胞核を挿入する (ii)もし前もって除去されていない場合前述の卵母細胞もしくは割球から内生の
核を除去する (iii)結果として生じた核移入ユニットを活性化する (iv)多能がありまた組織培養液中で無期限に維持できる子ブタCICM細胞株を得る
ための前記の培養されたNTユニットから得られた培養細胞から成るブタCICM(多
分化能)細胞株の作出の方法。41. (i) Appropriately differentiated piglet cells or cell nuclei into optionally enucleated piglet oocytes or blastomeres under conditions suitable for the formation of nuclear transfer (NT) units. Insert (ii) remove the endogenous nucleus from the oocyte or blastomere, if not previously removed (iii) activate the resulting nuclear import unit (iv) have pluripotency and A method for producing a porcine CICM (multipotent) cell line consisting of cultured cells obtained from the cultured NT units for obtaining a piglet CICM cell line that can be maintained indefinitely in tissue culture medium. 【請求項４２】 識別できる胞胚壁初期の外層および内部細胞塊が得られる
まで前記の活性化された核移入ユニットを培養することを含む請求項41記載の方
法。42. The method of claim 41, comprising culturing the activated nuclear transfer unit until a distinct outer blastocyst wall outer layer and inner cell mass is obtained. 【請求項４３】 前記の細胞株が多能性があり、あらかじめ存在している無
胚の分化した細胞と同じ遺伝子型を含む請求項41記載の方法により得られたCICM
細胞株。43. The CICM obtained by the method of claim 41, wherein said cell line is pluripotent and contains the same genotype as pre-existing embryo-free differentiated cells.
Cell line. 【請求項４４】 適切なDNAが挿入され、除去されもしくは分化した子ブタ
細胞あるいは細胞核に一時変異し、それによって結果として遺伝的に去勢された
NTユニットの作出が起こる請求項41記載の方法。44. Transient mutation into piglet cells or cell nuclei into which the appropriate DNA has been inserted, removed or differentiated, thereby resulting in genetic castration
42. The method of claim 41, wherein the production of NT units occurs. 【請求項４５】 前記の細胞株が遺伝的に一時変異したあらかじめ存在して
いるブタの分化した細胞と同一の遺伝子型を持つ請求項44により得られた形質転
換したCICM細胞株。45. The transformed CICM cell line obtained according to claim 44, wherein said cell line has the same genotype as a pre-existing porcine differentiated cell which is genetically transiently mutated. 【請求項４６】 結果として生じたCICM細胞株が分化のために導入される請
求項41記載の方法。46. The method of claim 41, wherein the resulting CICM cell line is introduced for differentiation. 【請求項４７】 CICM細胞の分化が可能になる請求項44記載の方法。47. The method of claim 44, which allows differentiation of CICM cells. 【請求項４８】 請求項46の方法によって得られた分化した細胞。48. A differentiated cell obtained by the method of claim 46. 【請求項４９】 (i)任意に脱核されるブタ卵母細胞を活性化する (ii)NTユニットを作出するために前記の活性化段階(i)の後でもしくはほとんど
同時に前記のブタ卵母細胞の中に適切な分化した子ブタ細胞もしくは核を転移す
る (iii)もし卵母細胞が前もって脱核されていない場合、内生卵母細胞核を除去す
る (iv)培養段階の後任意に、ブタ胎児もしくは哺乳動物を作出するために雌のブタ
に前記のNTユニットを移入することから成るブタ胎児もしくは生存している産子
をクローニングする方法。49. The pig egg as described above, which is (i) after activation step (i) or at almost the same time as said activation step (ii) to activate the porcine oocyte which is optionally enucleated. Transfer appropriate differentiated piglet cells or nuclei into the mother cell (iii) If the oocyte has not been previously enucleated, remove the endogenous oocyte nucleus (iv) optionally after the culture step , A method for cloning a fetal pig or live offspring, which comprises transferring the NT unit to a female pig to produce a fetal pig or mammal.
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