JP2003325185A - New immune function inhibitory molecule having itim motif - Google Patents
New immune function inhibitory molecule having itim motifInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【技術分野】本発明は、活性化白血球に特異的に発現す
る新規免疫機能抑制分子及びその部分ペプチド、該蛋白
質をコードするDNA及びその断片、該DNAを含む組換えベ
クター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細
胞、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法、該
蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗
体、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel immunosuppressive molecule and a partial peptide thereof which are specifically expressed in activated leukocytes, a DNA encoding the protein and a fragment thereof, a recombinant vector containing the DNA, and a recombinant vector thereof. The present invention relates to a transformed cell, a method for searching for a substance having an activity-regulating activity of the protein, an antibody reactive with the protein or a partial peptide thereof, and a transgenic non-human animal.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞は他の細胞とコミュニケーションす
ることによって、細胞の機能や増殖、分化を制御してい
る。細胞接着分子（cellular adhesion molecule）の中
でも、生体内のあらゆる免疫反応に深く関与する免疫担
当細胞の細胞接着分子は免疫機能そのものを調節する重
要なものである。2. Description of the Related Art Cells communicate with other cells to control their functions, proliferation and differentiation. Among the cellular adhesion molecules, the cell adhesion molecules of immunocompetent cells that are deeply involved in all immune reactions in the living body are important ones that regulate the immune function itself.
【０００３】イムノグロブリンドメインは、免疫系およ
び神経系で非常に多くの蛋白質に見出されており、さら
には細胞間認識機構に関与する他の多くの蛋白質におい
ても見出されている。これらの分子を総称してイムノグ
ロブリンスーパーファミリーという。イムノグロブリン
ドメイン構造を持つ細胞接着分子は数多く知られている
が、例えばIL-1受容体、gp130、PDGF受容体などが挙げ
られる。Immunoglobulin domains are found in numerous proteins in the immune and nervous systems, as well as in many other proteins involved in the intercellular recognition machinery. These molecules are collectively called the immunoglobulin superfamily. Many cell adhesion molecules having an immunoglobulin domain structure are known, and examples thereof include IL-1 receptor, gp130, PDGF receptor and the like.
【０００４】ITIM（Immunoreceptor Tyrosine based I
nhibition Motif）は免疫機能抑制分子に共通して認め
られるモチーフであり、このモチーフ内に含まれるチロ
シン残基がリン酸化されるとSHP1（SH2-containing pro
tein tyrosine phosphatase-1）やSHP2と呼ばれるフォ
スファターゼやSH2ドメインをもつ脂質フォスファター
ゼSHIP（SH2-containing inositol polyphosphate 5-ph
osphatase）が結合することが知られている。このフォ
スファターゼがsykなどチロシンキナーゼまたはIP４やP
IP３のような脂質を脱リン酸化する。この結果、Caスト
アからのCaイオン流出、細胞外からのCaイオン流入が抑
制されることによって負のシグナルを引き起こすと考え
られる。ITIM (Immunoreceptor Tyrosine based I
nhibition Motif) is a motif commonly found in immunosuppressive molecules, and when a tyrosine residue contained in this motif is phosphorylated, SHP1 (SH2-containing protif).
tein tyrosine phosphatase-1) and SHP2 phosphatase and SH2 domain lipid phosphatase SHIP (SH2-containing inositol polyphosphate 5-ph)
osphatase) is known to bind. Tyrosine kinase or IP 4 and P such as this phosphatase syk
Lipids, such as IP 3 dephosphorylated. As a result, it is considered that a negative signal is caused by suppressing Ca ion outflow from the Ca store and Ca ion inflow from the extracellular space.
【０００５】イムノグロブリンスーパーファミリーに属
する免疫機能抑制分子は、CTLA-4、FcγRIIB、Killer ce
ll inhibitory receptor(KIR)、CD22などが知られてい
るが、生体内の複雑な免疫反応、炎症反応の解明のため
には、これらに関与する新たな免疫機能抑制分子の単離
同定が望まれている。Immune function suppressing molecules belonging to the immunoglobulin superfamily include CTLA-4, FcγRIIB, and Killer ce.
ll inhibitory receptor (KIR), CD22, etc. are known, but in order to elucidate complex immune reactions and inflammatory reactions in vivo, isolation and identification of new immunosuppressive molecules involved in these are desired. ing.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な免疫
機能抑制分子とその遺伝子を同定することにより、免疫
疾患の予防並びに治療に有用な医薬及び方法を提供する
ものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a drug and a method useful for the prevention and treatment of immune diseases by identifying a novel immune function suppressing molecule and its gene.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、新規な遺伝子
（mcd054とする）、当該遺伝子にコードされる新規免疫
機能抑制分子（MCD054）に関する。また、該DNAを含む
組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形
質転換細胞、該蛋白質の活性調節物質の検索方法、該蛋
白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、
遺伝子組換え非ヒト動物に関する。The present invention relates to a novel gene (designated as mcd054) and a novel immunosuppressive molecule (MCD054) encoded by the gene. Further, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, a method for searching for an activity regulator of the protein, an antibody reactive with the protein or a partial peptide thereof,
Genetically modified non-human animals.
【０００８】（核酸）本発明は、MCD054（後に詳しく述
べる）をコードする遺伝子mcd054を提供する。遺伝子mc
d054とは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列か
らなる免疫機能抑制分子をコードするDNAのことであ
り、配列番号１や配列番号３に示すcDNAのほか該cDNAの
由来するゲノムDNAも含まれる。該遺伝子はヒト気管組
織から単離同定することができるが、本明細書に開示さ
れた配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の
遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダ
イト法などの化学合成的手法により調製されるDNAであ
ってもよい。その形態としてはcDNA、ゲノムDNAの他、
化学合成DNAなどが含まれるが、特に制限はない。本発
明のDNAは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有
するDNAやRNAと結合して２重鎖、３重鎖を形成していて
も良い。また、当該DNAは、ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（HRP）等の酵素や放射性同位体、蛍光物
質、化学発光物質等で標識されていてもよい。(Nucleic Acid) The present invention provides a gene mcd054 encoding MCD054 (described in detail later). Gene mc
Specifically, d054 is a DNA encoding an immune function suppressing molecule consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and not only the cDNA shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 but also the genomic DNA from which the cDNA is derived. included. The gene can be isolated and identified from human tracheal tissue, and based on the sequence disclosed herein, cloning using genetic engineering techniques such as general hybridization and chemistry such as phosphoamidite method It may be a DNA prepared by a synthetic method. As its form, in addition to cDNA, genomic DNA,
It includes, but is not limited to, chemically synthesized DNA. The DNA of the present invention may be single-stranded or may bind to DNA or RNA having a sequence complementary thereto to form a double-stranded chain or triple-stranded chain. The DNA may be labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like.
【０００９】また、mcd054の塩基配列が提供されれば、
これより導かれるRNAの配列や、相補的なDNAおよびRNA
の配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発
明のDNAに対応するRNAあるいは本発明のDNAと相補的な
配列を有するDNAおよびRNAもまた提供するものと理解す
べきである。本明細書中において、「DNA」は「ポリヌ
クレオチド」と同義である。If the nucleotide sequence of mcd054 is provided,
RNA sequences derived from this and complementary DNA and RNA
It should be understood that the present invention also provides RNA corresponding to the DNA of the present invention, or DNA and RNA having a sequence complementary to the DNA of the present invention, since the sequence of . In the present specification, “DNA” is synonymous with “polynucleotide”.
【００１０】さらに、本発明のDNAには、配列番号１に
記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件
でハイブリダイズするDNAをも含むものである。Further, the DNA of the present invention also includes a DNA which hybridizes with the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
【００１１】配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
に対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリ
ダイズし、かつ該DNAにコードされる蛋白質が免疫機能
抑制分子であれば、塩基配列のバリエーションが許容さ
れる。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸
残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的
処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるラン
ダム変異、制限酵素切断によるDNA断片の変異・欠失・
連結等により、部分的にDNA配列が変化したものであっ
ても、これらDNA変異体が配列番号１に記載のDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫機
能抑制分子をコードするDNAであれば、配列番号１に示
したDNA配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のも
のである。DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
On the other hand, if the protein hybridized with this under stringent conditions and the protein encoded by the DNA is an immunosuppressive molecule, variations in the base sequence are allowed. For example, the presence of multiple codons encoding the same amino acid residue due to so-called codon degeneracy, various artificial treatments such as site-directed mutagenesis, random mutation by treatment with a mutagen, mutation / deletion of DNA fragment by restriction enzyme cleavage. Loss
A DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and that encodes an immune function suppressing molecule, even if the DNA sequence is partially changed due to ligation or the like. If it is, it is within the scope of the present invention regardless of the difference from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1.
【００１２】上記のDNA変異の程度は、配列番号１に記
載のDNA配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更
に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば
許容範囲内である。DNA配列の同一性の判断には、BLAST
（J.Mol.Evol.,Vol.36;290-300(1993)、J.Mol.Biol.,Vo
l.215;403-10(1990)）を用いることができる。また、ハ
イブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条
件下、例えばDIG DNA Labeling kit（ロシュ・ダイアグ
ノスティックス社製 Cat No.1175033）でプローブをラ
ベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、よ
り好ましくは４２℃のDIG Easy Hyb溶液（ロシュ・ダイ
アグノスティックス社製 Cat No.1603558）中でハイブ
リダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の0.5
×SSC溶液（0.1%(w/v)SDSを含む）中でメンブレンを洗
浄する条件（1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナト
リウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、
配列番号１に記載の核酸にハイブリダイズする程度であ
ればよい。The degree of the above-mentioned DNA mutation is within an allowable range as long as it has 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more identity with the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1. . BLAST is used to determine the identity of DNA sequences.
(J.Mol.Evol., Vol.36; 290-300 (1993), J.Mol.Biol., Vo
l.215; 403-10 (1990)) can be used. The degree of hybridization is, for example, 32 ° C., preferably 37 ° C. when the probe is labeled under a stringent condition, for example, with a DIG DNA Labeling kit (Cat No. 1175033 manufactured by Roche Diagnostics). More preferably, it is hybridized in a DIG Easy Hyb solution (Cat No. 1603558 manufactured by Roche Diagnostics) at 42 ° C., for example, 0.5 at 50 ° C., preferably 65 ° C.
Southern hybridization under the condition of washing the membrane in SSC solution (containing 0.1% (w / v) SDS) (1 × SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate),
It only needs to hybridize to the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 1.
【００１３】配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
あるいはその部分断片は、自己免疫疾患、免疫不全、ア
レルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等本発明の蛋白質が
関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考え
られる。DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
Alternatively, its partial fragment is considered to be useful as a specific probe for a disease related to the protein of the present invention such as autoimmune disease, immunodeficiency, allergic disease, inflammatory disease and tumor.
【００１４】本発明のDNAは、MCD054を大量に生産する
ために使用することができる。該DNAはまた、酵素等で
標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検
査するために使用することができる。すなわち、該DNA
をプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質
の発現量を、mRNA発現量を指標として確認することによ
り、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件
を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連す
る疾患、特に自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾
患、炎症性疾患、腫瘍等の診断を行うことも可能であ
る。The DNA of the present invention can be used to produce MCD054 in large quantities. The DNA can also be labeled with an enzyme or the like and used to examine the expression status of the protein of the present invention in tissues. That is, the DNA
Using as a probe, the expression level of the protein of the present invention in cells, by confirming the mRNA expression level as an index, it is possible to determine cells suitable for the production of the protein of the present invention and its culture conditions, It is also possible to diagnose diseases related to the protein of the present invention, particularly autoimmune diseases, immunodeficiencies, allergic diseases, inflammatory diseases, tumors and the like.
【００１５】また、本発明のDNAの一部をプライマーと
して使用したPCR-RFLP（Restrictionfragment length p
olymorphism）法、PCR-SSCP（Single strand conformat
ionpolymorphism）法、シークエンシング等の方法によ
り、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断するこ
とができる。Further, PCR-RFLP (Restriction fragment length p) using a part of the DNA of the present invention as a primer
olymorphism) method, PCR-SSCP (Single strand conformat)
Ion polymorphism), sequencing, etc. can be used to test / diagnose abnormalities or polymorphisms in nucleic acid sequences.
【００１６】また、本発明のDNAを生体内の細胞に導入
し、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症
性疾患、腫瘍等の発症を予防または治療するための遺伝
子治療にも使用することが出来る。Further, the DNA of the present invention is introduced into cells in vivo and used for gene therapy for preventing or treating the onset of autoimmune disease, immunodeficiency, allergic disease, inflammatory disease, tumor and the like. You can
【００１７】本発明のDNAは、形質転換細胞の調製、さ
らには該形質転換細胞を用いた組換え蛋白質MCD054の生
産方法、あるいはMCD054の発現を特異的に抑制する化合
物の探索に大いに有用である。The DNA of the present invention is very useful for the preparation of transformed cells, the method for producing the recombinant protein MCD054 using the transformed cells, or the search for compounds that specifically suppress the expression of MCD054. .
【００１８】本発明における形質転換細胞は当業者が公
知の技術を適用して調製することが可能であり、例え
ば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々な
ベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のDNAを
組み入れることが可能である。その際、遺伝子mcd054を
プロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝
子の影響下におくことで、遺伝子mcd054の宿主細胞内で
の発現を任意にコントロールすることが可能である。こ
の手法は、形質転換された宿主細胞を用いたMCD054の生
産において好適に用いられる他、遺伝子mcd054の発現制
御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質
の探索などにも応用することが可能となる。The transformed cell in the present invention can be prepared by a person skilled in the art by applying a known technique. For example, various vectors that are commercially available or generally available to a person skilled in the art can be used to prepare a suitable cell. It is possible to integrate the DNA of the invention into a host cell. At that time, by placing the gene mcd054 under the influence of an expression control gene represented by a promoter or an enhancer, it is possible to arbitrarily control the expression of the gene mcd054 in the host cell. This method is preferably used in the production of MCD054 using transformed host cells, and can also be applied to the study of the expression control mechanism of the gene mcd054 or the search for substances that can regulate the expression of the gene. It will be possible.
【００１９】例えば、任意の被験物質と遺伝子mcd054を
含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で
接触させることで、被験物質の遺伝子mcd054の発現を促
進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるい
は評価を行うことができる。For example, by contacting an arbitrary test substance with a cell transformed with a vector containing the gene mcd054 under appropriate conditions, a substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene mcd054 of the test substance can be obtained. It can be searched or evaluated.
【００２０】また、本発明であるDNAと公知の方法とを
組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基に
トランスジェニック動物を作製することが出来る。さら
に、本発明の遺伝子mcd054を利用すれば、ヒト以外の動
物からヒトmcd054に相当する遺伝子を破壊したいわゆる
ノックアウト動物を作製することも可能である。このモ
デル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的
特徴を分析することにより、本発明に係る遺伝子及び蛋
白質の機能を解明することが可能となる。さらに、その
ようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明の
ヒトmcd054を導入することにより、ヒトmcd054のみを有
するモデル動物を作製することも可能となる。このモデ
ル動物は、該導入されたヒトmcd054をターゲットとした
薬剤の開発、評価に有用である。By combining the DNA of the present invention with a known method, a transgenic animal can be prepared based on a mouse or other suitable animal. Furthermore, by using the gene mcd054 of the present invention, it is possible to produce a so-called knockout animal in which a gene corresponding to human mcd054 is destroyed from an animal other than human. By analyzing the physical, biological, pathological and genetic characteristics of this model animal, it becomes possible to elucidate the functions of the gene and protein according to the present invention. Furthermore, by introducing the human mcd054 of the present invention into the animal in which the endogenous gene has been disrupted as described above, it becomes possible to prepare a model animal having only human mcd054. This model animal is useful for developing and evaluating a drug targeting the introduced human mcd054.
【００２１】（蛋白質MCD054）MCD054にコードされる蛋
白質MCD054は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる
免疫機能抑制分子である。特にそのアミノ酸配列に見ら
れる構造的特徴から、イムノグロブリンスーパーファミ
リーに属する新規の免疫機能抑制分子であると判断され
る。(Protein MCD054) The protein MCD054 encoded by MCD054 is an immune function suppressing molecule consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In particular, the structural features of the amino acid sequence suggest that it is a novel immunosuppressive molecule belonging to the immunoglobulin superfamily.
【００２２】MCD054は２８３アミノ酸からなる分子であ
り、膜貫通領域を有するＩ型膜貫通蛋白質である。配列
番号２に示すアミノ酸配列の51-117a.a.の領域にイムノ
グロブリンドメイン、145-173a.a.の領域に膜貫通領
域、249-254a.aの領域にITIMが存在する。これら領域の
範囲はドメインの定義の仕方により多少の異同を生じ得
るが（例えば、SOSUIによる膜貫通領域予測では、154〜
176a.a.の領域が膜貫通領域と定義される）、本質的に
同じドメインを意味する限り同義であることは言うまで
もない。MCD054 is a molecule consisting of 283 amino acids and is a type I transmembrane protein having a transmembrane region. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an immunoglobulin domain in the region 51-117a.a., A transmembrane region in the region 145-173a.a., And ITIM in the region 249-254a.a. The range of these regions may be slightly different depending on how the domain is defined (for example, in the transmembrane region prediction by SOSUI, 154 ~
The region of 176a.a. is defined as the transmembrane region) and is, of course, synonymous as long as it means essentially the same domain.
【００２３】本発明の蛋白質MCD054は、細胞外ドメイン
にイムノグロブリンドメインを有し、細胞内ドメインに
ITIMを有すること、および脾臓、活性化白血球、白血球
に発現が多いことから、免疫機能抑制分子であると判断
される。ここで言う免疫抑制機能分子とは、免疫担当細
胞の細胞膜上に発現し、リガンドや抗体などが細胞外ド
メインに結合することにより、細胞内活性化シグナル蛋
白質のリン酸化抑制を介して、その免疫担当細胞のサイ
トカイン産生、細胞増殖などの活性を抑制する分子を指
す。本発明の蛋白質の細胞外ドメインに対する抗体を作
製し、その抗体を用いてフローサイトメーターにより免
疫担当細胞における発現を確認することが出来る。ま
た、本発明の蛋白質を発現させたTリンパ球細胞株を樹
立し、その細胞に対してサイトカイン産生刺激を与え産
生サイトカインを測定する系により、サイトカイン産生
抑制作用を指標に本発明蛋白質に対するアゴニスティッ
ク抗体、またはペプチドなどを探索することが出来る。The protein MCD054 of the present invention has an immunoglobulin domain in the extracellular domain and an immunoglobulin domain in the intracellular domain.
It is considered to be an immunosuppressive molecule because it has ITIM and is highly expressed in spleen, activated leukocytes, and leukocytes. The immunosuppressive functional molecule referred to here is expressed on the cell membrane of immunocompetent cells, and by binding a ligand or antibody to the extracellular domain, suppresses the phosphorylation of intracellular activation signal protein and This refers to a molecule that suppresses the activities of the responsible cell such as cytokine production and cell proliferation. An antibody against the extracellular domain of the protein of the present invention can be prepared, and the expression in immunocompetent cells can be confirmed by a flow cytometer using the antibody. Further, by establishing a T lymphocyte cell line that expresses the protein of the present invention, and stimulating the production of cytokines to the cells and measuring the produced cytokines, an agonistic effect on the protein of the present invention with the cytokine production inhibitory action as an index Antibodies, peptides, etc. can be searched.
【００２４】サイトカイン産生刺激として抗CD3刺激を
用いたIL-2産生試験系が具体例として挙げられる。細胞
内活性化シグナル蛋白質とは例えばERK-1やERK-2が挙げ
られるが、MCD054を介してリン酸化が調節されている蛋
白質であればこれらに限定されるものではない。本発明
の蛋白質に対するリガンドやアゴニスティック抗体によ
る刺激が細胞内に抑制シグナルをもたらすことは、extr
acellular signal-regulated kinase-1(ERK-1)のリン酸
化抑制により確認できる（Carrenoら The Journal of I
mmunology vol.165 1352-1356 (2000)）。A specific example is an IL-2 production test system that uses anti-CD3 stimulation as a cytokine production stimulation. The intracellular activation signal protein includes, for example, ERK-1 and ERK-2, but is not limited thereto as long as it is a protein whose phosphorylation is regulated via MCD054. The fact that stimulation with a ligand for the protein of the present invention or an agonistic antibody produces an intracellular suppressive signal is extr
It can be confirmed by suppressing phosphorylation of acellular signal-regulated kinase-1 (ERK-1) (Carreno et al. The Journal of I
mmunology vol.165 1352-1356 (2000)).
【００２５】この様に、MCD054はイムノグロブリンドメ
インを有する、ITIMを有する等免疫機能抑制分子に認め
られる特徴を高度に保持している一方、図１に示すよう
に脾臓、白血球、活性化白血球に多く発現するというMC
D054固有の発現プロファイルを示すなどの特徴を有す
る。このことから、MCD054は、免疫機能の調節におい
て、他の免疫機能抑制分子にはない特徴的な役割を果た
していることが強く推認される。従って、MCD054を標的
とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備えた医薬と
なり得るものと期待される。As described above, MCD054 has a high level of the features found in immune function-suppressing molecules such as ITIM having an immunoglobulin domain, but as shown in FIG. 1, spleen, leukocytes, and activated leukocytes are MC that expresses a lot
It has characteristics such as showing an expression profile specific to D054. From this, it is strongly inferred that MCD054 plays a characteristic role in the regulation of immune function that other immune function suppressing molecules do not have. Therefore, it is expected that a pharmaceutical compound targeting MCD054 can be a pharmaceutical having characteristics that were not available in the past.
【００２６】なお、免疫機能抑制分子である限り、配列
番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上の
アミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加したアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明
の範囲内である。As long as it is an immunosuppressive molecule, a polypeptide or protein comprising the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added is also included in the present invention. Within the range of.
【００２７】蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
が、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言
う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つか
の関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換に
ついては、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、Glyと
アラニン（Ala）またはバリン（Val）、ロイシン（Le
u）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグ
ルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギ
ン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、T
hrとセリン（Ser）またはAla、リジン（Lys）とアルギ
ニン（Arg）、等が挙げられる。また、Ala、Val、Leu、
Ile、Pro、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Ph
e）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Gly、Cysは、共に非
極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有す
ると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ser、T
hr、チロシン（Tyr）、Asn、Glnが挙げられる。酸性ア
ミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。塩基性ア
ミノ酸としてはLys、Arg、ヒスチジン（His）が挙げら
れる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、な
おその蛋白質の本質的な機能を失わない変異も当業者に
多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存され
る同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分
散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能
を保持している例も多く認められている。The side chains of amino acid residues, which are the constituent elements of proteins, differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but they do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the whole protein. In the sense, some relationships are known that are highly conservative. For example, for substitution of amino acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Le)
u) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln), aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), T
Examples include hr and serine (Ser) or Ala, lysine (Lys) and arginine (Arg), and the like. Also, Ala, Val, Leu,
Ile, Pro, methionine (Met), phenylalanine (Ph
Since e), tryptophan (Trp), Gly, and Cys are all classified as nonpolar amino acids, they are considered to have similar properties. As uncharged polar amino acids, Ser, T
Examples include hr, tyrosine (Tyr), Asn, and Gln. Acidic amino acids include Asp and Glu. Basic amino acids include Lys, Arg, and histidine (His). In addition, many mutations are known to those skilled in the art, even when the above-mentioned conservativeness is impaired, the essential function of the protein is not lost. Furthermore, there are many cases in which the same type of protein, which is conserved among different organisms, retains its essential function even if some amino acids are concentrated or dispersed and deleted or inserted. .
【００２８】従って、配列番号２に示したアミノ酸配列
上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、
それが免疫機能抑制分子であれば、これらは本発明の範
囲内にあるものと言うことができる。免疫機能抑制分子
であるとは、換言すれば本発明のMCD054蛋白質と同等の
機能を有することである。同等の機能を有するとは、細
胞内活性化シグナル蛋白質のリン酸化抑制活性、サイト
カイン産生抑制活性、細胞増殖抑制活性から選ばれる少
なくとも一つの活性を保持していることを言う。Therefore, even if it is a mutant protein due to substitution, insertion, deletion or the like on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
If it is an immune function suppressing molecule, these can be said to be within the scope of the present invention. In other words, the immunosuppressive molecule has the same function as the MCD054 protein of the present invention. Having an equivalent function means having at least one activity selected from the intracellular activation signal protein phosphorylation inhibitory activity, cytokine production inhibitory activity, and cell growth inhibitory activity.
【００２９】このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型
等によって生ずる変異の様に自然界において認められる
他、当業者に公知の方法、例えばNTGなどの変異誘発剤
を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用い
た部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことがで
きる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が
免疫機能抑制分子である限り特に制限はないが、変異個
数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以
内、より好ましくは１もしくは数個以内である。Such amino acid alterations are recognized in nature as mutations caused by gene polymorphisms, etc., and are known to those skilled in the art, for example, mutagenesis methods using mutagens such as NTG and various methods. Can be performed artificially by utilizing the site-directed mutagenesis method using the recombinant gene method of The mutation site and the number of amino acids are not particularly limited as long as the mutant protein is an immune function suppressing molecule, but the number of mutations is usually within tens of amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 1 or several amino acids.
【００３０】また本発明では、MCD054を上述のような全
てのドメイン構造を有する分子全体として理解できるほ
か、特徴的なドメイン、特にリガンドとの結合能を担う
ドメインを保持した部分ペプチドとして理解することも
できる。膜貫通型蛋白質の中には、リガンド結合部位を
含む部分断片が、特徴的な立体構造を保持したまま他の
ドメインから切り離されるなどして、遊離の（あるいは
可溶化、可溶型とも言われる）部分ペプチドとして存在
し得るものがあることが、以前より報告されている。こ
の様な部分ペプチドは、依然として特異的なリガンドと
の結合能を保持していることから、これを用いて該蛋白
質への結合能を有する化合物の探索が可能となる。MCD0
54における部分ペプチドも、かかる意味においてそのリ
ガンド結合能を有する限り、実質的には本発明と同等の
物質であると理解すべきである。また、可溶型MCD054は
MCD054（細胞膜上にある膜貫通型）との競合により免疫
反応を調節したり、可溶型MCD054自体がリガンドとして
機能し、何らかの受容体に結合し、免疫反応を調節する
活性を発揮する可能性も考えられる。このような活性を
有する部分ペプチドも本発明の範囲内のものである。可
溶型MCD054の活性は例えば実施例９に示す混合リンパ球
反応により検出することが可能である。部分ペプチドの
他の好ましい態様としては、例えばイムノグロブリンド
メイン（配列番号２の51〜117a.a.）、または細胞内ド
メイン（配列番号２の174〜289a.a.）のいずれかを含む
ペプチドが挙げられる。リガンド結合能を有するという
観点では、少なくともイムノグロブリンドメインを含む
ことが好ましい。また、シグナル伝達機能を有するとい
う観点では、少なくとも細胞内ドメインのITIMを含むこ
とが好ましい。少なくとも一つの機能ドメインを含む限
り、他のドメインの全部または一部が連結していても良
いし、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質となってい
ても良い。機能ドメインとは、リガンド結合能またはシ
グナル伝達機能を保持した部分ペプチドのことである。
融合蛋白質がMCD054としてのリガンド結合能、MCD054と
しての細胞内活性化シグナル蛋白質のリン酸化抑制活
性、サイトカイン産生抑制活性、細胞増殖抑制活性から
選ばれる少なくとも一つの活性から選ばれる少なくとも
一つの活性を有する限りにおいて、MCD054部分ペプチド
に連結される他のポリペプチドには特に制限はない。こ
のような融合蛋白質の好ましい一例は、イムノグロブリ
ンのFcフラグメントとの融合蛋白質やヒスチジンタグと
の融合蛋白質であるがこれらに限定されるものではな
い。またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列
が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合も
ある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれ
た成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であ
ると理解すべきである。MCD054の場合、配列番号２に示
されるアミノ酸配列の１番目から２４番目のアミノ酸残
基付近にシグナル配列の存在が予測されている（シグナ
ルペプチド予測プログラムSignalP V2.0 World Wide We
b Serverを用いた場合）。シグナルペプチド領域の範囲
は予測プログラムにより多少の異同を生じ得るし、実験
的に作製した蛋白質においてもシグナルペプチドの除か
れ方に多様性が生じることがあるが、MCD054蛋白質とし
て機能的に同等である限り、本発明と同等の物質である
と理解されるべきである。Further, in the present invention, MCD054 can be understood as a whole molecule having all the above-mentioned domain structures, and also as a partial peptide having a characteristic domain, particularly a domain responsible for binding to a ligand. You can also Among transmembrane proteins, a partial fragment containing the ligand binding site is cleaved from other domains while retaining its characteristic three-dimensional structure, and is thus called free (or solubilized or soluble form). It has been previously reported that some partial peptides may exist. Since such a partial peptide still retains the ability to bind to a specific ligand, it becomes possible to search for a compound having the ability to bind to the protein using this partial peptide. MCD0
It is to be understood that the partial peptide at 54 is also a substance substantially equivalent to the present invention as long as it has the ligand binding ability in this sense. In addition, the soluble MCD054
Possibility to regulate immune response by competition with MCD054 (transmembrane type on cell membrane), or soluble MCD054 itself functions as a ligand, binds to some receptor, and exerts activity to regulate immune response Can also be considered. A partial peptide having such activity is also within the scope of the present invention. The activity of soluble MCD054 can be detected by the mixed lymphocyte reaction shown in Example 9, for example. Another preferred embodiment of the partial peptide is, for example, a peptide containing either an immunoglobulin domain (51 to 117a.a. of SEQ ID NO: 2) or an intracellular domain (174 to 289a.a. of SEQ ID NO: 2). Can be mentioned. From the viewpoint of having ligand binding ability, it preferably contains at least an immunoglobulin domain. Further, from the viewpoint of having a signal transduction function, it is preferable to contain at least the intracellular domain ITIM. As long as it contains at least one functional domain, all or part of other domains may be linked, or may be a fusion protein with another protein or peptide. The functional domain is a partial peptide having a ligand binding ability or a signal transduction function.
The fusion protein has at least one activity selected from at least one activity selected from ligand binding ability as MCD054, phosphorylation inhibitory activity of intracellular activation signal protein as MCD054, cytokine production inhibitory activity, and cell growth inhibitory activity. There is no particular limitation on other polypeptides linked to the MCD054 partial peptide. A preferable example of such a fusion protein is, but not limited to, a fusion protein with an immunoglobulin Fc fragment and a fusion protein with a histidine tag. In addition, a protein having a signal sequence may have a cleaved signal sequence functioning as a mature protein. Therefore, it should be understood that the mature peptide obtained by removing the signal sequence from the protein of the present invention is also a substance substantially equivalent to the present invention. In the case of MCD054, the presence of a signal sequence is predicted near the 1st to 24th amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Signal Peptide Prediction Program SignalP V2.0 World Wide We
When using b Server). The range of the signal peptide region may differ slightly depending on the prediction program, and even in the experimentally produced protein, the way the signal peptide is removed may vary, but it is functionally equivalent as the MCD054 protein. It should be understood as long as it is a substance equivalent to the present invention.
【００３１】本発明の蛋白質またはその部分ペプチド
は、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用するこ
とが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明
の蛋白質が関連する疾患、例えば自己免疫疾患、免疫不
全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等に対する有
効な治療薬または予防薬となることが期待される。The protein of the present invention or its partial peptide can be used for searching for a substance that regulates the activity of the protein. Compounds obtained through the search are expected to be effective therapeutic or prophylactic agents for diseases related to the protein of the present invention, such as autoimmune diseases, immunodeficiency, allergic diseases, inflammatory diseases, tumors, etc. .
【００３２】（抗体）本発明はさらにMCD054に結合する
抗体を提供する。本発明の抗体は、MCD054全体あるいは
その部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体で
あり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル
抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化
学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス
（IgG,IgA,IgM,IgD,IgE）、あるいはＨ鎖のタイプによ
るサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さ
らに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したとき
のF(ab’)２、パパインで分解したときのFabなどのフラ
グメントであっても、またキメラ抗体やヒト化抗体であ
ってもよい。またMCD054あるいはその部分ペプチドを特
異的に認識するのみでなく、MCD054の活性を調節する機
能を有する抗体も本発明に含まれる。MCD054の活性を調
節する機能を有する抗体とは、例えばMCD054とリガンド
の結合を阻害する中和抗体が挙げられる。これらの抗体
は、MCD054の研究的あるいは臨床的な検出等に有用であ
る。(Antibody) The present invention further provides an antibody that binds to MCD054. The antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes the whole MCD054 or a partial peptide thereof as an antigen, and includes a monoclonal antibody and / or a polyclonal antibody. In addition, it belongs to any of the five classes (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) classified as the structure, physicochemical properties and immunological properties of immunoglobulin, or the subclass depending on the type of H chain. Good. Further, it may be a fragment such as F (ab ′) 2 obtained by decomposing immunoglobulin with pepsin, Fab obtained by decomposing immunoglobulin, or chimeric antibody or humanized antibody. The present invention also includes an antibody that not only specifically recognizes MCD054 or its partial peptide but also has a function of regulating the activity of MCD054. The antibody having a function of regulating the activity of MCD054 includes, for example, a neutralizing antibody that inhibits the binding between MCD054 and a ligand. These antibodies are useful for research or clinical detection of MCD054.
【００３３】（アンチセンス核酸）本発明は、生体内に
おいて核酸レベルでのMCD054生合成を抑制することので
きる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるア
ンチセンス核酸は、MCD054をコードするmRNAを作り出す
のに必要なゲノム領域からpre-mRNAへの転写段階、pre-
mRNAから成熟ｍRNAへのプロセッシング段階、核膜通過
段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担
うDNAもしくはRNAに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流
れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味
し、遺伝子mcd054の核酸配列の全体あるいはいずれかの
部分に相補性を有する配列からなるものであってもよ
い。好ましくは、配列番号１または配列番号３に記載の
核酸配列に相当あるいは相補性を有する配列から成る核
酸（DNA、RNAを含む）である。また、ゲノム領域から転
写されるmRNAがイントロン構造あるいは５’末端や３’
末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳
部分の配列に相当あるいは相補性を有するアンチセンス
核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有する
ものとなろう。(Antisense Nucleic Acid) The present invention provides a so-called antisense nucleic acid capable of suppressing MCD054 biosynthesis at the nucleic acid level in vivo. Such an antisense nucleic acid is a pre-mRNA transcriptional step from the genomic region necessary to produce mRNA encoding MCD054, pre-mRNA.
At the processing stage from mRNA to mature mRNA, at the nuclear membrane passage stage, or at the translation stage into protein, it binds to DNA or RNA that carries genetic information and affects the normal flow of transmission of genetic information It means that it regulates expression, and may be a sequence having complementarity to the whole nucleic acid sequence of gene mcd054 or any part thereof. Nucleic acid (including DNA and RNA) having a sequence corresponding to or complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is preferable. In addition, mRNA transcribed from the genomic region has an intron structure or 5'end or 3 '
When the untranslated region is included at the end, an antisense nucleic acid having a sequence equivalent to or complementary to the sequence of the untranslated region will have the same function as the antisense nucleic acid of the present invention.
【００３４】本発明のアンチセンス核酸は、DNAやRNAの
他、その立体構造や機能がDNAあるいはRNAと類似する各
種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端
もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌ
クレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１
つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しな
いような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リ
ン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が
挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織
選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高めら
れた誘導体として好適である。すなわち、MCD054の活性
発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限
はない。The antisense nucleic acid of the present invention includes not only DNA and RNA but also various derivatives whose three-dimensional structure and function are similar to those of DNA and RNA. For example, at least one of a nucleic acid having another substance bound to the 3'end or 5'end, a base of an oligonucleotide, a sugar, and a phosphate.
Examples of the nucleic acid include a nucleic acid having a substitution or modification in one of them, a base that does not exist in nature, a nucleic acid having a sugar or a phosphate, a nucleic acid having a skeleton (backbone) other than the sugar-phosphate skeleton, and the like. These nucleic acids are suitable as derivatives in which at least one of nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability and avidity is enhanced. That is, the form of the nucleic acid is not limited as long as it has a function of suppressing the active expression of MCD054.
【００３５】また本発明では、一般的には、ステム・ル
ープを形成しているmRNAのループ部分にハイブリダイズ
するような塩基配列、すなわちステム・ループを形成し
ている領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチ
センス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付
近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライ
ス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこ
れらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス
核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ま
しい。In the present invention, in general, a nucleotide sequence that hybridizes to the loop portion of mRNA forming a stem loop, that is, a nucleotide sequence complementary to a region forming a stem loop is complementary. An antisense nucleic acid having a unique base sequence is preferable. Alternatively, antisense nucleic acids that bind to the vicinity of the translation initiation codon, the ribosome binding site, the capping site, and the splice site, that is, antisense nucleic acids having sequences complementary to the sequences of these sites are also generally expected to have high expression-suppressing effects. It is preferable because it is possible.
【００３６】この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り
込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチ
センス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好まし
くは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩
基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなる
ものが好適である。In order to incorporate such an antisense nucleic acid into cells and make it act efficiently, the chain length of the antisense nucleic acid of the present invention is 15 bases or more and 30 bases or less, preferably 15 bases or more and 25 bases or less. , And more preferably those having a base sequence consisting of 18 or more and 22 or less bases.
【００３７】本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果
は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領
域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳
領域の一部等を含むDNAとルシフェラーゼ等のレポータ
ー遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、in vitro
transcription反応（プロメガ社：Ribo max system
等）とin vitro translation反応（プロメガ社：Rabbit
Reticulocyte Lysate System等）を併用する系のよう
な本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験
物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定
することにより評価することができる。The effect of suppressing the expression of the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by a known method, for example, a DNA containing an expression control region of the gene of the present invention, a 5'untranslated region, a region near the translation initiation site or a part of the translated region. And an expression plasmid ligated with a reporter gene such as luciferase and
transcription reaction (Promega: Ribo max system
Etc.) and in vitro translation reaction (Promega: Rabbit
It can be evaluated by adding a test substance to the system under an environment in which the gene of the present invention is transcribed or translated, such as a system using Reticulocyte Lysate System), and measuring the expression level of the reporter gene.
【００３８】本発明のアンチセンス核酸は、生体内にお
けるMCD054の発現を抑制することができるので、MCD054
が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。Since the antisense nucleic acid of the present invention can suppress the expression of MCD054 in vivo, MCD054
It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with.
【００３９】[0039]
【発明の実施の形態】（核酸）本発明のDNAをDNAライブ
ラリーから得る例としては、適当なゲノムDNAライブラ
リーやcDNAライブラリーを、ハイブリダイゼーションに
よるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリー
ニング法等でスクリーニングし、目的のDNAを有するク
ローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出
す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリ
ーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその
一部を有するDNAを３２P等でラベルしてプローブとし、
任意のcDNAライブラリーに対して、公知の方法で（例え
ば、Maniatis T.等，Molecular Cloning,a Laboratory
Manual,Cold Spring harbor Laboratory,New York,1982
年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用い
る抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができ
る。本発明の新規DNAはまた、ゲノムDNAライブラリーも
しくはｃDNAライブラリーを鋳型とするPCR（Polymerase
Chain Reaction）によっても得る事ができる。PCRは、
配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマ
ー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のDNAライ
ブラリーに対し、公知の方法（例えばMichael A.I.等,P
CR Protocols,a Guide to Methodsand Applications,Ac
ademic Press、1990年参照）等を行って、本発明のDNAを
得る事もできる。上記各種方法で使用するDNAライブラ
リーは、本発明のDNAを有するDNAライブラリーを選択し
て使用する。当該DNAライブラリーは、本発明のDNAを有
するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能で
あり、市販のDNAライブラリーを使用したり、本発明のD
NAを有する細胞からcDNAライブラリーを作製するのに適
した細胞を選び、公知の方法（J.Sambrook 等、Molecul
ar Cloning,a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring
Harbor Laboratory,New York,1989年参照）に従って、
cDNAライブラリーを作製し、利用することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION (Nucleic Acid) As an example of obtaining the DNA of the present invention from a DNA library, a suitable genomic DNA library or cDNA library is screened by hybridization or an immunoscreening method using an antibody. Etc., a clone having the target DNA is proliferated, and the clone is excised from the clone using a restriction enzyme or the like. In the screening by the hybridization method, the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof is labeled with 32 P or the like to prepare a probe,
For any cDNA library, known methods (for example, Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory
Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982
Year) can be done. As the antibody used in the immunoscreening method, the antibody of the present invention described later can be used. The novel DNA of the present invention may also be PCR (Polymerase) using a genomic DNA library or a cDNA library as a template.
It can also be obtained by Chain Reaction). PCR
A sense primer and an antisense primer were prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the known method (for example, Michael AI et al., P.
CR Protocols, a Guide to Methodsand Applications, Ac
ademic Press, 1990) and the like to obtain the DNA of the present invention. As the DNA library used in the above various methods, a DNA library containing the DNA of the present invention is selected and used. As the DNA library, any library can be used as long as it has the DNA of the present invention, and a commercially available DNA library can be used, or D of the present invention can be used.
A cell suitable for preparing a cDNA library from cells having NA is selected by a known method (J. Sambrook et al., Molecul).
ar Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, 1989)
A cDNA library can be prepared and used.
【００４０】また、本明細書に開示された配列を基にホ
スホアミダイト法などの化学合成的手法により調製する
ことも可能である。It is also possible to prepare by a chemical synthetic method such as the phosphoramidite method based on the sequence disclosed in the present specification.
【００４１】本発明のDNAを含む組換えベクターは、環
状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かか
る組換えベクターは、本発明のDNAの全部または一部に
加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。一
部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードす
るDNAである。他の塩基配列とは、エンハンサーの配
列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー
数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペ
プチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコー
ドする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配
列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列
等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一
例は、発現ベクターである。The recombinant vector containing the DNA of the present invention may be in any form such as circular or linear form. Such a recombinant vector may have, in addition to all or part of the DNA of the present invention, other base sequences if necessary. A part is, for example, DNA encoding a partial peptide of the protein of the present invention. With other base sequences, enhancer sequence, promoter sequence, ribosome binding sequence, base sequence used for the purpose of amplification of copy number, base sequence encoding signal peptide, base sequence encoding other polypeptide, It is a poly A addition sequence, a splicing sequence, an origin of replication, a base sequence of a gene serving as a selection marker, and the like. A preferred example of the recombinant vector of the present invention is an expression vector.
【００４２】遺伝子組換えに際しては、適当な合成DNA
アダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを
本発明のDNAに付加したり、あるいは塩基配列内に適当
な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させ
ることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の
範囲内であり、本発明のDNAを基に任意かつ容易に加工
することができる。For gene recombination, an appropriate synthetic DNA
It is also possible to add a translation initiation codon or a translation termination codon to the DNA of the present invention using an adaptor, or to newly generate or delete an appropriate restriction enzyme cleavage sequence in the base sequence. These are within the scope of operations normally performed by those skilled in the art, and can be arbitrarily and easily processed based on the DNA of the present invention.
【００４３】また本発明のDNAを保持するベクターは、
使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用す
ればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキ
ュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等
の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限
はない。Further, the vector carrying the DNA of the present invention is
An appropriate vector may be selected and used according to the host to be used, and it is also possible to use various viruses such as bacteriophage, baculovirus, retrovirus, vaccinia virus in addition to the plasmid, and there is no particular limitation. .
【００４４】本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有の
プロモーター配列の制御下に発現させることができる。
かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進
あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。ある
いは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモー
ターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは
置き換えて使用することもできる。この場合に使用する
プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択
すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、T7プ
ロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、λPL
プロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはPHO5プ
ロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が、
宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、
レトロウィルスプロモーター、延長因子1α（Elongatio
n Factor 1α）プロモーター等を例示できるが、当然な
がらこれらには限定されない。The gene of the present invention can be expressed under the control of a promoter sequence specific to the gene.
By using such an expression system, it is possible to more advantageously search for a substance that promotes or suppresses the transcription of the gene of the present invention. Alternatively, another suitable expression promoter can be used upstream of the gene of the present invention by connecting or replacing the promoter sequence specific to the gene. The promoter used in this case may be appropriately selected depending on the host and the purpose of expression. For example, when the host is E. coli, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, λPL
When the host is yeast, PHO5 promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc.
SV40-derived promoter when the host is an animal cell,
Retrovirus promoter, elongation factor 1α (Elongatio
n Factor 1α) promoter and the like can be exemplified, but naturally it is not limited thereto.
【００４５】DNAをベクターに導入する方法は公知であ
る（J.Sambrook等、Molecular Cloning,a Laboratory M
anual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory，ニュ
ーヨーク(New York),1989年、参照）。すなわち、DNAと
ベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られた
それぞれの断片を、DNAリガーゼを用いてライゲーショ
ンさせればよい。Methods for introducing DNA into a vector are known (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory M.
anual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, see). That is, DNA and vector may be digested with appropriate restriction enzymes, and the obtained fragments may be ligated with DNA ligase.
【００４６】（蛋白質）本発明の蛋白質は、該蛋白質を
発現している細胞や組織から調製することができ、また
ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー433A
型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社
製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは
真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え
方法によっても調製することができる。しかしながら、
その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならび
に組換え型蛋白質が好ましい。(Protein) The protein of the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein, and can be synthesized by a peptide synthesizer (eg, peptide synthesizer 433A).
Type, manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) or by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryote or eukaryote. However,
From the aspect of its purity, production by genetic engineering techniques and recombinant proteins are preferable.
【００４７】前項の組換えベクターを用いて形質転換さ
せる宿主細胞には特に制限はなく、E.coli、B.subtilis
あるいはS.cerevisiaeに代表される遺伝子工学手法にお
いて利用可能な下等細胞、昆虫細胞、COS7細胞、CHO細
胞、HeLa細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、
本発明に対しても利用可能である。The host cell transformed with the recombinant vector of the preceding paragraph is not particularly limited, and may be E. coli or B. subtilis.
Alternatively, many cells such as lower cells, insect cells, COS7 cells, CHO cells, animal cells typified by HeLa cells, which can be used in genetic engineering techniques typified by S. cerevisiae,
It can also be used for the present invention.
【００４８】本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞
を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで
得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に
導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プ
ロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈
澱法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション
法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学
臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０
日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用い
ても構わない。The transformed cell of the present invention can be obtained by transforming an appropriate host cell with the recombinant vector of the present invention. As a method for introducing the recombinant vector of the preceding paragraph into a host cell, known methods such as electroporation method, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, method using virus particles, etc. Special Issue on Medicine, Genetic Engineering Handbook March 20, 1991
Issued daily, Yodosha, see), but either method may be used.
【００４９】当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するに
は、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収
し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一
般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養に
ついては各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日
本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）が
あるので、それらを参考にして行うことができる。In order to produce the protein by genetic engineering, the above transformed cells are cultured, the culture mixture is recovered, and the protein is purified. Culture of the transformed cells can be carried out by a general method. Regarding the culture of the transformed cells, there are various publications (eg, "Microbial Experiments" edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., 1992), which can be referred to.
【００５０】培養混合物から本発明の蛋白質を精製する
方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法
の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。
すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾
過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の
各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロ
マトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切
な方法を適宜選択し、必要によりHPLCシステム等を使用
して適当な順序で精製を行えば良い。As a method for purifying the protein of the present invention from the culture mixture, an appropriate method can be appropriately selected from the methods usually used for protein purification.
That is, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, affinity chromatography such as hydrophobic chromatography and antibody chromatography, chromatofocusing method, adsorption method. Appropriate methods may be appropriately selected from commonly used methods such as chromatography and reverse phase chromatography, and if necessary, purification may be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like.
【００５１】また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ
（例、グルタチオンSトランスフェラーゼ、プロテイン
A、ヘキサヒスチジンタグ、FLAGタグその他）との融合
蛋白質として発現させることも可能である。発現させた
融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エン
テロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能で
あり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが
可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な
手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の
形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を
採用することが好ましい。In addition, the protein of the present invention may be used as another protein or tag (eg, glutathione S transferase, protein).
A, a hexahistidine tag, a FLAG tag, etc.) and a fusion protein. The expressed fusion form can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin, enterokinase, etc.), which sometimes allows the protein to be prepared more advantageously. Purification of the protein of the present invention may be carried out by appropriately combining techniques generally used by those skilled in the art, and particularly when expressed in the form of a fusion protein, it is preferable to adopt a purification method characteristic of the form.
【００５２】また、組換えDNA分子を利用して無細胞系
の合成方法（J.Sambrook, et al.:Molecular Cloning 2
nd ed.（1989年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産
する方法の１つである。In addition, a cell-free synthesis method using a recombinant DNA molecule (J. Sambrook, et al .: Molecular Cloning 2
nd ed. (1989)) is also one of the methods for producing by genetic engineering.
【００５３】この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形
態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製する
ことができるが、これらのみに制限されるものではな
く、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させる
ことも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学
修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不
溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手
法による加工が考えられる。また、用いる宿主によって
は糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認めら
れる。かかる場合にあっても、免疫機能抑制分子として
機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあると
いうべきである。As described above, the protein of the present invention can be prepared in the form of a protein alone or in the form of a fusion protein with a protein of another species. However, the protein of the present invention is not limited to these. It can also be converted into various forms. For example, processing by various methods known to those skilled in the art such as various chemical modifications of proteins, binding with polymers such as polyethylene glycol, binding to insoluble carriers, and the like can be considered. Further, depending on the host used, the presence or absence of addition of sugar chains or the degree thereof is different. Even in such a case, it should be still under the concept of the present invention as long as it functions as an immune function suppressing molecule.
【００５４】本発明の蛋白質は、抗体を作製するための
抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や
該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用す
ることができ、有用である。The protein of the present invention is useful because it can be used as an antigen for producing an antibody, or can be used for screening a substance that binds to the protein or a substance that regulates the activity of the protein.
【００５５】本発明のMCD054は、上述のような形質転換
細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表
面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、
MCD054の細胞外領域蛋白質フラグメントなどの適当な断
片を可溶性蛋白質として製造する場合には、当該細胞外
領域あるいは各ドメインをコードするDNAを用いて上述
のように形質転換細胞を調製し、外形質転換細胞を培養
することにより培養上清中に分泌させることにより製造
することができる。The MCD054 of the present invention is capable of highly expressing the target molecule on the cell surface of the above-mentioned transformed cell, particularly by culturing the animal cell. on the other hand,
When a suitable fragment such as the extracellular region protein fragment of MCD054 is produced as a soluble protein, a transformant cell is prepared as described above by using the DNA encoding the extracellular region or each domain, and the external transformation is performed. It can be produced by culturing cells and secreting them into the culture supernatant.
【００５６】一方、MCD054が形質転換細胞のペリプラズ
ムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸
濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処
理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および
／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方
法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜
画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調
製する。そして、当該粗溶液から定法により目的蛋白質
を単離、精製することができる。On the other hand, when MCD054 is present in the periplasm or cytoplasm of the transformed cells, the cells suspended in an appropriate buffer solution are subjected to, for example, ultrasonic treatment, freeze-thaw treatment or lysozyme treatment. After disrupting the cell wall and / or cell membrane, a membrane fraction containing the protein of the present invention is obtained by a method such as centrifugation or filtration, and the membrane fraction is solubilized with an appropriate surfactant to obtain a crude fraction. Prepare the solution. Then, the target protein can be isolated and purified from the crude solution by a standard method.
【００５７】（mcd054遺伝子組換え非ヒト動物）本発明
は、mcd054遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。mcd054
遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒ
ト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。mcd0
54遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコード
する遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むこと
により、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現
部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物とし
ては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウ
マ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ま
しい。(Mcd054 gene recombinant non-human animal) The present invention provides a mcd054 gene recombinant non-human animal. mcd054
Transgenic non-human animals include transgenic non-human animals and knockout non-human animals. mcd0
54 In the transgenic non-human animal, the expression level, expression time, expression site, etc. of the protein of the present invention is controlled by artificially incorporating the gene encoding the protein of the present invention into the chromosome of the animal. It is characterized by Examples of non-human animals include, but are not limited to, cows, sheep, goats, pigs, mice, horses, chickens and the like. Among the non-human animals, non-human mammals are preferable.
【００５８】本発明の遺伝子mcd054を用いれば、トラン
スジェニック非ヒト動物を作製することができる。該ト
ランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動
物の製造において通常使用されるような定法（例、発生
工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、
勝木元也編、野村達次監修、1987年）に従って作製する
ことができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換え
ベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞
を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が
組み込まれた個体を選別する。Using the gene mcd054 of the present invention, transgenic non-human animals can be produced. The transgenic non-human animal is prepared by a conventional method (eg, developmental engineering experiment manual, published by Kodansha Scientific, etc.) that is usually used in the production of transgenic animals.
Edited by Motoya Katsuki, supervised by Tatsuji Nomura, 1987). That is, the gene or recombinant vector of the present invention is introduced into a totipotent cell of a non-human animal, this cell is allowed to develop into an individual, and an individual having the transgene integrated in the genome of somatic cells is selected.
【００５９】具体的には、例えば、トランスジェニック
マウスの場合には、正常C57Black/6マウスから取得した前
核期受精卵にmcd054遺伝子が発現可能なように構築され
たDNAを直接注入する。より具体的には、適切なプロモ
ーターの下流にmcd054遺伝子を接続して導入したコンス
トラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の
配列を可能な限り除去した直鎖状DNAを得て、これを前
核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入す
る。Specifically, for example, in the case of transgenic mice, DNA constructed so that the mcd054 gene can be expressed is directly injected into pronuclear stage fertilized eggs obtained from normal C57Black / 6 mice. More specifically, a construct introduced by connecting the mcd054 gene downstream of an appropriate promoter is prepared, and if necessary, a linear DNA in which prokaryotic-derived sequences are removed as much as possible is obtained. Are directly injected into the pronucleus of the pronuclear stage fertilized egg using a fine glass needle.
【００６０】該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの
子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にICR雌マウス
を、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製
する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムDNAを抽出し、P
CR法またはサザンブロッティング法にてMCD054遺伝子の
導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。The fertilized egg is transplanted into the uterus of another pseudopregnant mouse as a foster mother. Pseudopregnant mice are generally made by mating ICR female mice with male mice with the vas deferens cut or ligated. Genomic DNA was extracted from the tissue of the embryo derived from the transplanted embryo, and P
Whether or not the MCD054 gene has been introduced is confirmed by the CR method or Southern blotting method to obtain transgenic mice.
【００６１】また、mcd054（またはmcd054のマウス相同
遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウ
トマウス」を作製することができる。本発明における
「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋
白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性
化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用した
ポジティブネガティブセレクション法（米国特許第5,46
4,764号公報、同5,487,992号公報、同5,627,059号公
報、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,8932-8935,1989、N
ature,Vol.342,435-438,1989など）を用いて作製するこ
とができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一
態様である。Further, a so-called "knockout mouse" can be prepared based on the nucleotide sequence of mcd054 (or mouse homologous gene of mcd054). The “knockout mouse” in the present invention is a mouse in which an endogenous gene encoding the mouse-derived protein of the present invention has been knocked out (inactivated), and for example, a positive negative selection method applying homologous recombination (US Patent 5th, 46th
4,764 publication, 5,487,992 publication, 5,627,059 publication, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.86,8932-8935,1989, N
ature, Vol. 342, 435-438, 1989), and such a knockout mouse is also an embodiment of the present invention.
【００６２】または、最近、中・大動物においても核移
植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴
い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウ
ト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち
体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しmcd054（または
各動物におけるmcd054の相同遺伝子）の塩基配列に基づ
いて、ES細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行
い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクロー
ン動物を得ることができる。該動物はmcd054（または各
動物におけるmcd054の相同遺伝子）が失われたノックア
ウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動
物の任意の細胞にmcd054（または各動物におけるmcd054
の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクロー
ン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製す
る事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物
およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わら
ず本発明の一態様である。Alternatively, recently, it has become possible to produce cloned animals by nuclear transfer in medium and large animals. Along with this, the production of transgenic and knockout animals using this technology has also come into practice. That is, based on the nucleotide sequence of mcd054 (or the homologous gene of mcd054 in each animal) to somatic cells or germ line cells, homologous recombination was performed in the same manner as for ES cells, and the obtained cells were A nucleus can be obtained, and the nucleus can be used to obtain a cloned animal. The animal is a knockout animal lacking mcd054 (or the homologous gene of mcd054 in each animal). Alternatively, as in the method described above, mcd054 (or mcd054 in each animal) in any cell of any animal
It is also possible to produce a transgenic animal by introducing the gene of the above homologous gene) and using the nucleus to obtain a cloned animal. Such knockout non-human animals and transgenic non-human animals are one aspect of the present invention regardless of their species.
【００６３】（抗体）本発明の抗体は、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にし
て得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免
疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説
明する。(Antibodies) The antibodies of the present invention can be obtained by referring to known methods for both polyclonal and monoclonal antibodies (see, for example, immunological experimental procedures, edited by the Immunological Society of Japan, published by the Japanese Immunological Society). A brief description will be given below.
【００６４】当該新規抗体を得るには、まず動物に、免
疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイント
の完全アジュバント（FCA）や不完全アジュバント（FI
A）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があ
れば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採
血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋
白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度のもので
あればいかなる方法で得られたものであってもよい。本
発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適
に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチド
が、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミ
ノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキー
ホールリンペットヘモシアニン（KLH）等のキャリアと
結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物は
いかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者
で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等か
ら、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用する
ことが好ましい。In order to obtain the novel antibody, first, the protein of the present invention is used as an immunizing antigen in an animal, if necessary, in Freund's complete adjuvant (FCA) or incomplete adjuvant (FI).
Inoculate with an appropriate adjuvant such as A), and booster immunize at intervals of 2 to 4 weeks if necessary. After the booster immunization, blood is collected to obtain antiserum. The protein of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has a degree of purification that can be used for producing an antibody. A partial polypeptide of the protein of the present invention can also be preferably used as an immunogen. When the polypeptide used as the immunizing antigen is a low-molecular-weight polypeptide, that is, a polypeptide consisting of about 10 to 20 amino acids, it is bound to a carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) to form an antigen. You can use it. The animal to be immunized may be any animal, but is preferably a rat, a mouse, a rabbit, a sheep, a horse, a chicken, a goat, a pig, a bovine, etc., which is usually used in an immunological experiment by those skilled in the art. It is preferable to select and use an animal species capable of producing an antibody.
【００６５】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良
い。The polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum. Purification is salting out,
A known method such as ion exchange chromatography or affinity chromatography may be appropriately combined.
【００６６】モノクローナル抗体を得るには以下のよう
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗
体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択
されたクローンの培養上清を精製することによって得れ
ば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を
適宜組み合わせて用いれば良い。The procedure for obtaining a monoclonal antibody is as follows. That is, antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal and fused with a myeloma cell line or the like by a known method using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse or the like to prepare a hybridoma. Then, it may be obtained by selecting a clone producing an antibody that binds to the protein of the present invention, culturing it, and purifying the culture supernatant of the selected clone. For purification, known methods such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like may be appropriately combined and used.
【００６７】また、遺伝子工学的な方法を用いても当該
新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその
部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あ
るいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから
mRNAを採取し、これをもとにcDNAライブラリーを作製す
る。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスク
リーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物
から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製する
ことができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原
性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫
系をヒトのものと入れ替えたマウス（例Nat. Genet. 1
5;146-156(1997)）を免疫することにより調製すること
が出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用
いて遺伝子工学的に調製することもできる（Method in
Enzymology 203;99-121(1991)）。The novel antibody can also be obtained by using a genetic engineering method. For example, from spleen cells or lymphocytes of an animal immunized with the protein of the present invention or its partial polypeptide, or from hybridoma producing a monoclonal antibody against the protein of the present invention or its partial polypeptide
mRNA is collected and a cDNA library is prepared based on this. Clones producing antibodies that react with the antigen can be screened, the resulting clones can be cultured, and the desired antibody can be purified from the culture mixture by a combination of known methods. When the antibody is used for therapy, a humanized antibody is preferable from the viewpoint of immunogenicity. A humanized antibody is a mouse in which the immune system is replaced with that of a human (eg, Nat. Genet. 1
5; 146-156 (1997)). It can also be prepared by genetic engineering using the hypervariable region of a monoclonal antibody (Method in
Enzymology 203; 99-121 (1991)).
【００６８】（アンチセンス核酸）アンチセンス核酸
は、公知方法で製造することができる（例えば、Stanle
y T.CrookeおよびBernald Lebleu編、in Antisense Res
earch and Applications,CRC出版、フロリダ、1993
年）。天然のDNAやRNAであれば、化学合成機を使用して
合成し、あるいはMCD054を鋳型としてPCR法により本発
明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチ
ルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、
誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオ
システムズ ジャパン株式会社製、Expedite Model 890
9）を使用して合成できるものもある。この場合には、
化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行
い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等を
用いたHPLC法により精製することによっても、アンチセ
ンス核酸を得ることができる。(Antisense Nucleic Acid) The antisense nucleic acid can be produced by a known method (for example, Stanle
Edited by y T. Crooke and Bernald Lebleu, in Antisense Res
earch and Applications, CRC Publishing, Florida, 1993
Year). Natural DNA or RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by the PCR method using MCD054 as a template. Also, such as methylphosphonate type and phosphorothioate type,
Some of the derivatives are chemical synthesizers (for example, Expedite Model 890 manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
Some can be synthesized using 9). In this case,
The antisense nucleic acid can also be obtained by performing the operation according to the manual attached to the chemical synthesizer and purifying the obtained synthetic product by the HPLC method using reverse phase chromatography or the like.
【００６９】本発明のDNAやアンチセンス核酸を診断用
のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方
法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、ある
いは発光物質等で標識する。次に、検体からDNAもしく
はmRNAを公知方法で調製し、これを被験物質として、前
記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応
の前記標識プローブを除去する。被験物質中に、遺伝子
mcd054もしくはRNAが含まれていれば、当該アンチセン
ス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識し
た酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素
等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることが
できる。When the DNA or antisense nucleic acid of the present invention is used as a probe for diagnosis, it is labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like according to a known method. Next, DNA or mRNA is prepared from a sample by a known method, and using this as a test substance, the labeled probe is added and reacted, and then washed to remove the unreacted labeled probe. Gene in the test substance
If mcd054 or RNA is included, the antisense nucleic acid binds to them. The presence or absence of bond formation can be known by using, as an index, luminescence, fluorescence, radioactivity, etc. by a labeled enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, radioisotope or the like.
【００７０】本発明のDNA、アンチセンス核酸または組
換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品と
して使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容
されうる使用方法で使用することが好ましい。When the DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention is used for medicinal purposes, one having a purity suitable for use as a medicine is used in a pharmacologically acceptable use method. It is preferable.
【００７１】本発明のDNA、アンチセンス核酸または組
換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしく
は懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入した
り、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよ
い。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助
成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、ク
リーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして
使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分と
は、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、
緩衝剤等のことである。The DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention may be used by directly dissolving or suspending it in a suitable solvent, or by encapsulating it in a liposome or incorporating it in a suitable vector. You may use it. In addition, if necessary, pharmacologically acceptable auxiliary components may be added to prepare suitable dosage forms such as injections, tablets, capsules, eye drops, creams, suppositories, sprays and poultices. You may. The pharmacologically acceptable auxiliary components include solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients,
It is a buffer or the like.
【００７２】本発明のDNA、アンチセンス核酸または組
換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の
年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方
法、その投与量を設定して使用することができる。すな
わち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、ある
いは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、
直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投
与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよ
い。When the DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention has the above-mentioned dosage form, its administration method and its dose are determined depending on the patient's age, sex, type of disease and degree. Can be set and used. That is, an amount suitable for improving the condition is orally administered, or inhaled, transdermally administered, eye drop, intravaginal, intraarticular,
A suitable method may be selected from rectal administration, intravenous administration, local administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration and the like.
【００７３】（スクリーニング方法）本発明は、本発明
の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発
明のDNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換えベクタ
ーで形質転換された形質転換細胞またはmcd054遺伝子組
換え非ヒト動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白
質の機能または発現を調節する物質をスクリーニングす
る方法に関する。より具体的には、（１）被験物質の存
在下／非存在下における本発明の蛋白質の活性を評価す
る方法、（２）被験物質の存在下／非存在下における本
発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発
明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする
方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例
７、８または９に示す系において、被験物質存在下／非
存在下における本発明の蛋白質の活性を測定すればよ
い。（２）の例としては、mcd054遺伝子の発現制御領
域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳
領域の一部等を含むDNAとルシフェラーゼ等のレポータ
ー遺伝子を連結した組換えベクターを作製し、本発明の
遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺
伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、
被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する
方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本
発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、
本発明のDNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換えベ
クターで形質転換された形質転換細胞またはmcd054遺伝
子組換え非ヒト動物と被験物質を接触させる工程；被験
物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白
質の活性または本発明のDNAの発現レベルに差があるか
どうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発
明の蛋白質の活性調節物質または本発明のDNAの発現調
節物質として選択する工程を含み得る。本発明の蛋白質
の活性を調節する作用を示す物質とは、MCD054蛋白質の
活性を模倣（ミミック）ないし増強する（アゴニス
ト）、あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有す
る物質のいずれでも良い。本発明のDNAの発現調節作用
を示す物質とは、遺伝子mcd054の発現を促進あるいは抑
制する作用を有する物質のいずれでもよい。被験物質が
本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のDNAの発
現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認でき
る系またはDNAの発現を確認できる系に被験物質を添加
した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはDNAの発
現レベルに差があるかどうかを調べればよい。DNAの発
現レベルとは、mcd054遺伝子のmRNAの発現強度、蛋白質
の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、mcd0
54遺伝子またはMCD054蛋白質自体の発現レベルではな
く、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出し
ても良い。レポーターアッセイ系は、試験したい遺伝子
の発現制御領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発
現量を指標として、該発現制御領域に作用する物質をス
クリーニングするアッセイ系をいう。発現制御領域とし
ては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター
領域に見られるCAATボックス、TATAボックス等を例示す
ることができる。またレポーター遺伝子としては、CAT
（chloramphenicol acetyltransferase）遺伝子、ルシ
フェラーゼ（luciferase）遺伝子、β―ガラクトシダー
ゼ（β-galactosidase）遺伝子等を利用することができ
る。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は
公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実
験プロトコール（秀潤社）、1993年）。阻害（または抑
制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）す
る作用を有するとは、蛋白質の活性またはDNAの発現レ
ベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群
との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計
算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促
進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ま
しくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好
ましくは９０％以上であることをいう。(Screening Method) The present invention includes the protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, the DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, and a trait transformed with the recombinant vector. The present invention relates to a method for screening a substance that regulates the function or expression of the protein of the present invention, which comprises using a transformed cell or a mcd054 gene recombinant non-human animal. More specifically, (1) a method for evaluating the activity of the protein of the present invention in the presence / absence of a test substance, (2) the method for evaluating the activity of the protein or gene of the present invention in the presence / absence of a test substance Examples include methods of comparing expression levels and screening for substances that regulate the expression of the protein of the present invention. As an example of (1), the activity of the protein of the present invention in the presence / absence of a test substance may be measured in the system shown in Example 7, 8 or 9. As an example of (2), a recombinant vector in which a DNA containing an expression control region of the mcd054 gene, a 5'untranslated region, a region near the translation initiation site or a part of the translated region, and a reporter gene such as luciferase are ligated is prepared. Then, the expression level of the reporter gene is measured in the presence / absence of a test substance under an environment in which the gene of the present invention is transcribed or translated,
A method for confirming the transcription promoting activity or transcription repressing activity of the test substance can be mentioned. The screening method of the present invention comprises the protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein,
Contacting the test substance with the DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, or a non-human animal mcd054 gene recombinant; test substance addition group and no test substance added A step of detecting whether there is a difference in the activity of the protein of the present invention or the expression level of the DNA of the present invention between the groups; The step of selecting as an expression regulator may be included. The substance having an action of regulating the activity of the protein of the present invention may be any substance having an action of mimicking (mimic) or enhancing (agonist) or inhibiting (antagonist) the activity of MCD054 protein. The substance having a DNA expression regulating action of the present invention may be any substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene mcd054. Whether the test substance exhibits the activity-regulating action of the protein of the present invention or the expression-regulating action of the DNA of the present invention is the same as when the test substance is added to the system in which the activity of the protein can be confirmed or the system in which the expression of DNA can be confirmed. Whether or not there is a difference in protein activity or DNA expression level upon addition may be examined. The expression level of DNA may be detected by either the expression strength of mRNA of mcd054 gene or the expression strength of protein. Also, mcd0
Instead of the expression level of 54 genes or MCD054 protein itself, the expression level of a reporter gene may be detected as an alternative. The reporter assay system is an assay system for screening a substance that acts on the expression control region, using the expression level of the reporter gene located downstream of the expression control region of the gene to be tested as an index. Examples of the expression control region include a promoter, an enhancer, a CAAT box and a TATA box commonly found in promoter regions. As a reporter gene, CAT
(Chloramphenicol acetyltransferase) gene, luciferase gene, β-galactosidase gene, etc. can be used. The expression control region and 5'untranslated region of the gene of the present invention can be obtained by a known method (New Cell Engineering Experimental Protocol (Shujunsha, 1993)). Having an inhibitory (or suppressing) action or an enhancing (or promoting) action means that the measured value of the protein activity or the DNA expression level is between the test substance addition group and the test substance non-addition group. There is a difference in. For example, the inhibition (or suppression) rate or the enhancement (or promotion) rate calculated by the following formula is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, further preferably 70% or more, particularly preferably 90% or more.
【００７４】阻害（または抑制）率あるいは増強（また
は促進）率＝（被験物質無添加群の測定値−被験物質添
加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×100Inhibition (or suppression) rate or enhancement (or promotion) rate = absolute value of (measured value of test substance non-added group-measured value of test substance added group) / measured value of non-added group × 100
【００７５】ここで、阻害または増強のどちらの活性で
あるかについて、および測定値については、蛋白質の活
性を確認できる系またはDNAの発現を確認できる系の種
類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を
確認できる系が実施例７に示すようなサイトカイン産生
抑制活性の測定系の場合には、測定値としてはサイトカ
イン産生量を用いることができ、被験物質添加群の測定
値＞被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質に
はMCD054蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系に
バックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そ
のようなものを差し引いた値を測定値とすることは言う
までもない。Here, whether the activity is inhibition or enhancement and the measured value are appropriately determined depending on the type of system capable of confirming protein activity or DNA expression. For example, in the case where the system capable of confirming the protein activity is the cytokine production inhibitory activity measurement system as shown in Example 7, the cytokine production amount can be used as the measurement value, and the measurement value of the test substance addition group> When the measured value is in the test substance-free group, it can be said that the test substance has an inhibitory effect on MCD054 protein activity. Needless to say, when the measurement system includes background and noise values, the value obtained by subtracting such values is used as the measurement value.
【００７６】本発明である蛋白質は、免疫機能抑制分子
であることから、上述のスクリーニング方法あるいはト
ランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化
合物等は、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾
患、炎症性疾患等に対する有効な治療薬または予防薬と
なることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプ
チド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合
物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質で
も公知物質でもよい。Since the protein of the present invention is an immune function-suppressing molecule, compounds and the like obtained through the screening method or the search using transgenic animals described above include autoimmune diseases, immunodeficiency, allergic diseases and inflammation. It is expected to be an effective therapeutic or prophylactic drug for sexually transmitted diseases. Examples of test substances include proteins, peptides, oligonucleotides, synthetic compounds, naturally occurring compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. But it's okay.
【００７７】[0077]
【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳述する
が、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきも
のではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention should not be limited to these examples.
【００７８】実施例１ 遺伝子mcd054のクローニング
（１）クローンC-TRACH2003605の取得
（１−１）オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの
作製
ヒト組織、気管(Trachea)より全RNAとして抽出されたmR
NAを購入した（CLONTECH #64091-1）。次いで、RNAより
オリゴキャプ法[M. Maruyama and S. Sugano,Gene, 13
8: 171-174 (1994)]を改良した方法(WO 01/04286)によ
りcDNAライブラリーを作製した。オリゴキャップ・リン
カー（5'- agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg -3’）
およびオリゴ dT プライマー（5'- gcggctgaag acggcct
atg tggccttttt tttttttttt tt - 3'）を用いて、WO 01
/04286に記載したようにBAP（Bacterial Alkaline Phos
phatase）処理、TAP（Tobacco Acid Pyrophosphatase）
処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除
去を行った。次いで、5’（5'- agcatcgagt cggccttgtt
g - 3'）と3’（5'- gcggctgaag acggcctatg t -3'）
のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reactio
n)により2本鎖cDNAに変換し、SfiI切断した。次いで、
通常は2kb以上（場合によっては3kb以上）に分画したcD
NA断片をDraIIIで切断したベクターpME18SFL3（GenBank
AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決め
てクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。Example 1 Cloning of gene mcd054 (1) Acquisition of clone C-TRACH2003605 (1-1) Preparation of cDNA library by oligocap method mR extracted as total RNA from human tissue and trachea (Trachea)
I purchased NA (CLONTECH # 64091-1). Next, from RNA, oligo-cap method [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 13
8: 171-174 (1994)], a cDNA library was prepared by a modified method (WO 01/04286). Oligocap linker (5'- agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg -3 ')
And oligo dT primer (5'- gcggctgaag acggcct
atg tggccttttt tttttttttt tt-3 '), using WO 01
BAP (Bacterial Alkaline Phos
phatase) treatment, TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase)
Treatment, RNA ligation, first strand cDNA synthesis and RNA removal were performed. Then 5 '(5'- agcatcgagt cggccttgtt
g-3 ') and 3'(5'- gcggctgaag acggcctatg t -3 ')
PCR (polymerase chain reactio
It was converted to double-stranded cDNA by n) and cleaved with SfiI. Then
CD usually fractionated to 2 kb or more (3 kb or more in some cases)
Vector pME18SFL3 (GenBank
AB009864, Expression vector) was cloned by determining the directionality of the cDNA to prepare a cDNA library.
【００７９】オリゴキャップ法を改良した方法で作製し
た高全長率cDNAライブラリー（既知mRNAの蛋白質コード
領域を指標にして算出した各cDNAライブラリーの5'端の
全長率は90%）は、真核細胞での発現が可能な発現ベク
ターpME18SFL3を用いて作製した。pME18SFL3にはクロー
ニング部位の上流にSRαプロモーターとSV40 small Tイ
ントロンが組み込まれており、またその下流にはSV40ポ
リA 付加シグナル配列が挿入されている。pME18SFL3の
クローン化部位は非対称性のDraIIIサイトとなってお
り、cDNA断片の末端にはこれと相補的なSfiI部位を付加
しているので、クローン化したcDNA断片はSRαプロモー
ターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長
cDNAを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのま
まCOS細胞などに導入することにより、一過的に遺伝子
を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易
に、遺伝子産物である蛋白質として、あるいはそれらの
生物学的活性として実験的に解析することが可能となっ
ている。A high full-length cDNA library prepared by an improved method of the oligo cap method (90% full-length ratio of 5'end of each cDNA library calculated using the protein coding region of known mRNA as an index) is It was prepared using the expression vector pME18SFL3, which enables expression in nuclear cells. In pME18SFL3, the SRα promoter and SV40 small T intron are integrated upstream of the cloning site, and the SV40 poly A addition signal sequence is inserted downstream thereof. The cloning site of pME18SFL3 is an asymmetric DraIII site, and a complementary SfiI site is added to the end of the cDNA fragment, so the cloned cDNA fragment is unidirectional downstream of the SRα promoter. Inserted in. Therefore, the total length
In the clone containing cDNA, the gene can be transiently expressed by introducing the obtained plasmid as it is into COS cells or the like. That is, it is possible to very easily experimentally analyze the protein as a gene product or the biological activity thereof.
【００８０】（１−２）cDNAクローン末端配列解析、全
長塩基配列解析クローンの選択と全長塩基配列解析
各cDNAライブラリーより得たクローンのプラスミドDNA
について、cDNAの5'末端の塩基配列を解析し、得られた
データについてはデータベース化を行った。解析された
cDNAクローンの5'末端配列については、GenBank、UniGe
neのcomplete cdsの表記があるデータを対象にしたBLAS
Tによる相同性検索を行い、ヒトのmRNA配列に同一なも
のは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性90%以
上かつコンセンサス配列が50塩基対以上の場合、同一グ
ループと見なし、グループを形成させた。グループ内
の、より5'-側に長いクローンを選択し、選択されたク
ローンについては必要に応じ3'末端配列を5'末端配列と
同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデー
タを解析し、5'末端と3'末端の配列でコンティグを作る
クローンは除いた。更に再度前記と同様にBLASTによる
相同性検索によりヒトのmRNA配列（特許化または特許出
願された配列を含む）に同一なものは除いた。こうして
選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローン
を得た。(1-2) cDNA clone terminal sequence analysis, full-length nucleotide sequence analysis Selection of clones and full-length nucleotide sequence analysis Plasmid DNA of clones obtained from each cDNA library
For, the nucleotide sequence of the 5'end of the cDNA was analyzed, and the obtained data was put into a database. Parsed
For 5'end sequences of cDNA clones, see GenBank, UniGe.
BLAS for data with ne complete cds notation
A homology search by T was performed, and those identical to the human mRNA sequence were removed. Next, clustering was performed, and when the homology was 90% or more and the consensus sequence was 50 base pairs or more, they were regarded as the same group, and a group was formed. Clones longer than the 5'-side in the group were selected, and the 3'terminal sequence of the selected clones was analyzed and obtained in the same manner as the 5'terminal sequence, if necessary. The data of the obtained terminal sequence was analyzed, and clones forming a contig with the 5'-terminal and 3'-terminal sequences were excluded. Further, again, the same as the human mRNA sequence (including the patented or patent-applied sequences) was removed by the homology search by BLAST as described above. From the clones thus selected, clones for full-length nucleotide sequence analysis were obtained.
【００８１】全長塩基配列解析に選抜したクローンにつ
いて全長cDNAの塩基配列をプライマーウォーキング法に
より行った。次に、決定された全長塩基配列から、蛋白
質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。The nucleotide sequences of full-length cDNAs of the clones selected for full-length nucleotide sequence analysis were analyzed by the primer walking method. Next, from the determined full-length nucleotide sequence, a protein translation region was estimated and the amino acid sequence was determined.
【００８２】クローンC-TRACH2003605には、配列番号２
で表される２８３個のアミノ酸からなる新規な蛋白質MC
D054をコードする、配列番号１で表される８４９塩基の
塩基配列からなるオープンリーディングフレーム（OR
F）を含む、全長３００２塩基対の塩基配列(配列番号
３)からなるcDNAが含まれていた。このプラスミドC-TRA
CH2003605は、国際微生物寄託機関である独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FE
RM P-18820として寄託されている。The clone C-TRACH2003605 contains SEQ ID NO: 2
A novel protein MC consisting of 283 amino acids represented by
An open reading frame (OR consisting of 849 base sequences represented by SEQ ID NO: 1 encoding D054)
F) was included, and the cDNA was composed of a full-length 3002 base pair base sequence (SEQ ID NO: 3). This plasmid C-TRA
CH2003605 has been deposited at the Patent Biological Deposit Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, which is an international microorganism depository, with the deposit number FE.
Deposited as RM P-18820.
【００８３】（１−３）５’非翻訳領域の確認
得られたC-TRACH2003605に含まれるｃDNAは５’非翻訳
領域が短かったため、更なる５’領域の取得を試みた。
C-TRACH2003605の５’末端側400bpの配列を用い、ヒトE
ST配列をblastn検索した。その結果、GenBank Accessio
n Number AI792952のクローンの180塩基より３’末端ま
での領域と一致した。さらにこのEST配列をアミノ酸に
変換し、配列番号２に示したMCD054アミノ酸配列と比較
した結果、配列番号２のファーストメチオニン（開始Me
t）の６残基Ｎ端側にMetが見つかり、さらに５アミノ残
基Ｎ端側にはstopコドンが存在することから、このＭｅ
ｔが翻訳開始Metである可能性が示された。この、配列
番号２より６アミノ酸N端が長いアミノ酸配列を配列番
号４に示す。配列番号４に記載されるアミノ酸配列から
なる蛋白質もMCD054と実質的に同等であり、本発明の範
囲内のものである。AI792952の核酸配列を元に、配列番
号２の開始ＭｅｔをコードするATGの約80bp上流にセン
スプライマー（5’-CAG AAG ACG AAG CAA AGC CT-3’）
を、そしてC-TRACH2003605のstopコドンを含むアンチセ
ンスプライマー（5’-ACA GAC TTA ACTCCT CAC AC-
3’）をそれぞれ設計し、実施例２に示す活性化末梢血
由来白血球のcDNAを鋳型にPCRクローニングを行った。
得られたクローンの塩基配列を確認した結果、AI792952
の配列と一致し、C-TRACH2003605の上流に４８塩基伸長
したcDNA配列をクローニングすることができた（配列番
号５）。配列番号５に記載の塩基配列からなるDNAおよ
び配列番号５のDNAとストリンジェントな条件でハイブ
リダイズし、かつ免疫機能抑制分子をコードするDNAも
本発明の範囲内のものである。尚、配列番号２あるいは
配列番号４で示されるアミノ配列をシグナルペプチド予
測プログラム（SignalP V2.0 World Wide Web Server）
で検索を行うと、配列番号２で示されるアミノ酸配列で
は、１番目のMetから２４番目のＧｌｙまでがシグナル
ペプチド配列と予測され、配列番号４で示されるアミノ
酸配列では、１番目のMetから３０番目のGlyまでがシグ
ナルペプチド配列と予測された。即ち、配列番号２の蛋
白質および配列番号４の蛋白質いずれの場合もシグナル
ペプチド配列は同位置に予測されるので、シグナル配列
が切除された成熟蛋白は同一になるものと考えられた。(1-3) Confirmation of 5'non-translated region Since the cDNA contained in the obtained C-TRACH2003605 had a short 5'untranslated region, an attempt was made to obtain a further 5'region.
Using the sequence of 400 bp at the 5'end of C-TRACH2003605, human E
The ST sequence was blastn searched. As a result, GenBank Accessio
n Number Matched with the region from the 180th base to the 3'end of the clone of AI792952. Furthermore, this EST sequence was converted into an amino acid and compared with the amino acid sequence of MCD054 shown in SEQ ID NO: 2. As a result, the first methionine (start Me
Since Met was found on the N-terminal side of 6 residues of t) and there was a stop codon on the N-terminal side of 5 amino residues, this Met
It was shown that t may be the translation initiation Met. This amino acid sequence having a 6-amino acid N-terminal longer than that of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 4. The protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is also substantially equivalent to MCD054 and is within the scope of the present invention. Based on the nucleic acid sequence of AI792952, a sense primer (5'-CAG AAG ACG AAG CAA AGC CT-3 ') approximately 80 bp upstream of ATG encoding the start Met of SEQ ID NO: 2.
, And an antisense primer containing the stop codon of C-TRACH2003605 (5'-ACA GAC TTA ACTCCT CAC AC-
3 ′) were designed respectively, and PCR cloning was performed using the cDNA of the activated peripheral blood-derived white blood cells shown in Example 2 as a template.
As a result of confirming the nucleotide sequence of the obtained clone, AI792952
It was possible to clone a cDNA sequence which was identical to the sequence of and was extended by 48 bases upstream of C-TRACH2003605 (SEQ ID NO: 5). The DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and the DNA of SEQ ID NO: 5 which hybridizes under stringent conditions and which encodes an immune function suppressing molecule are also within the scope of the present invention. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is used as a signal peptide prediction program (SignalP V2.0 World Wide Web Server).
In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, from the 1st Met to the 24th Gly is predicted to be a signal peptide sequence, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, it is 30 amino acids from the 1st Met. Up to the second Gly was predicted to be a signal peptide sequence. That is, in both the protein of SEQ ID NO: 2 and the protein of SEQ ID NO: 4, the signal peptide sequence was predicted at the same position, so it was considered that the mature protein with the signal sequence excised is the same.
【００８４】（２）cDNAクローン塩基配列及びアミノ酸
配列の解析
（２−１）MCD054アミノ酸配列をHMMERプログラム（R.
Durbin, S. Eddy, A.Krogh, G. Mitchison. Cambridge
University Press, (1998).）でPfamデータベース（htt
p://www.sanger.ac.uk/Pfam/）を検索したところ51残基
から117残基にかけイムノグロブリンドメインが見られ
た。(2) Analysis of cDNA clone base sequence and amino acid sequence (2-1) The MCD054 amino acid sequence was analyzed using the HMMER program (R.
Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison. Cambridge
University Press, (1998).) Pfam database (htt
p: //www.sanger.ac.uk/Pfam/), an immunoglobulin domain was found from residue 51 to residue 117.
【００８５】（２−２）膜貫通予測プログラム（tmap P
ersson B, Argos P J Mol Biol (1994) Mar 25;237
(2):182-92）で膜貫通部位予測を行なった結果4から22
残基、及び145から173残基に膜貫通領域が予測された。(2-2) Transmembrane prediction program (tmap P
ersson B, Argos PJ Mol Biol (1994) Mar 25; 237
(2): 182-92) Predicted transmembrane site 4 to 22
A transmembrane region was predicted at residues 145 to 173.
【００８６】（２−３）[IV]xYxx[LV]は一般的にITIMモ
チーフとして知られているが（J Immunol. Vol．159
(5):2075-7(1997)）、このモチーフが249から254残基に
かけて見られた。(2-3) [IV] xYxx [LV] is generally known as an ITIM motif (J Immunol. Vol. 159).
(5): 2075-7 (1997)), this motif was found from residues 249 to 254.
【００８７】（３）cDNAクローン塩基配列及びアミノ酸
配列の相同性解析
本配列には高い相同性を有する他の配列は知られていな
い。MCD054アミノ酸配列をblastpプログラムでNRデータ
ベースを検索した結果、有為な相同性を示す配列はなか
った。(3) Homology analysis of cDNA clone base sequence and amino acid sequence No other sequence having high homology to this sequence is known. As a result of searching the NR database for the MCD054 amino acid sequence with the blastp program, no sequence showing significant homology was found.
【００８８】実施例２ PCRによる発現プロファイルの
確認
RT-PCRによるmcd054の組織発現プロファイル解析を行っ
た。解析に用いたヒトRNAは以下の通りである。ヒト冠
状動脈血管内皮細胞（HCAEC）及び、ヒト冠状動脈血管
平滑筋細胞（CASMC）から定法によりmRNAを調製した。
また、ヒト末梢血由来白血球を50μg/mlのPHAの存在下
あるいは非存在下で24時間培養した後にmRNAを定法によ
り調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、脾臓、心
臓、副腎、精巣、気管、胎児腎、脳のmRNAをクローンテ
ック社より、大腸のmRNAをSTRATAGENE社より購入した。
肝臓、小腸、胸腺のtotal RNAをクローンテック社より
購入し、定法によってmRNAを調製した。次に、これら各
mRNA 6μgよりオリゴdTプライマーを用いて1本鎖cDNAの
合成を定法に従って行った。逆転写酵素としてはSuperS
criptIIRNAse H- Reverse Transcriptase（Invitrogen
社）を用いた。また、PCRに用いたmcd054特異的なプラ
イマーの配列はセンスプライマー mcd054-F1（5'-CTGAG
GTTGCAGCCACTTAAG - 3'）、アンチセンスプライマーmcd
054-R1（5'- GCACCATTTCTGTTGTCACCC - 3'）である。解
析した結果、mcd054は活性化白血球、白血球、脾臓及び
気管で発現していた（図１）。Example 2 Confirmation of expression profile by PCR Tissue expression profile analysis of mcd054 was performed by RT-PCR. The human RNA used for the analysis is as follows. MRNA was prepared from human coronary vascular endothelial cells (HCAEC) and human coronary vascular smooth muscle cells (CASMC) by a standard method.
In addition, human peripheral blood-derived leukocytes were cultured in the presence or absence of 50 μg / ml PHA for 24 hours, and then mRNA was prepared by a conventional method. Furthermore, human lung, kidney, pancreas, spleen, heart, adrenal gland, testis, trachea, fetal kidney, and brain mRNA were purchased from Clontech, and large intestine mRNA was purchased from STRATAGENE.
Liver, small intestine, and thymus total RNA were purchased from Clontech and mRNA was prepared by a standard method. Then each of these
Single-stranded cDNA was synthesized from 6 μg of mRNA using an oligo dT primer according to a standard method. SuperS as reverse transcriptase
criptIIRNAse H - Reverse Transcriptase (Invitrogen
Company) was used. The sequence of the mcd054-specific primer used for PCR was the sense primer mcd054-F1 (5'-CTGAG
GTTGCAGCCACTTAAG-3 '), antisense primer mcd
054-R1 (5'- GCACCATTTCTGTTGTCACCC-3 '). As a result of analysis, mcd054 was expressed in activated leukocytes, leukocytes, spleen and trachea (Fig. 1).
【００８９】実施例３ 可溶型MCD054蛋白質の発現
可溶型MCD054はMCD054の細胞外ドメインとヒトIgG Fcフ
ラグメントとのキメラ（融合）蛋白質（以下MCD054-Fc
と称する）として生産することができる。哺乳動物細胞
での発現プラスミド構築は以下の通りである。センスプ
ライマーmcd054-F2（5’-CCG GAA TTC CCT GCC ATG CTT
GGA ACT GGG AAA-3’）及びアンチセンスプライマー m
cd054-R2（5’-CGC GGA TCC GCT TGC CAT TTC GTC CTT
GGA GGG-3’）を合成し、C-TRACH2003605を鋳型にPyrob
est DNA Polymerase（TAKARA）を用いて、９８℃で１０
秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回
繰り返し、PCR反応を行う。得られた約0.45kbのPCR産物
をＥｃｏＲＩ及びBamHIにて消化し、アガロースゲル電
気泳動にてDNA断片を回収する。また再公表WO97/42319
に記載のpM1304をEcoRI及びBamHIにて消化し、前述のDN
A断片をライゲーションする。コンピテントセルJM109を
形質転換して定法に従いMCD054-Fc発現プラスミドを調
製する。得られた発現プラスミドは、以下の方法でCOS
細胞に導入を行う。即ち、FuGENE6（ロシュ・ダイアグ
ノスティックス社）50μlと上記各プラスミドDNA 12.5
μgとを添付プロトコールに従い混合し、150cm２フラス
コにセミコンフルエントに増殖したCOS細胞に添加す
る。5% CO２存在下、37℃で３日間培養した後に培養上
清を回収し、ProteinAカラムを用いてMCD054-Fcを精製
する。Example 3 Expression of Soluble MCD054 Protein Soluble MCD054 is a chimeric (fusion) protein of the extracellular domain of MCD054 and a human IgG Fc fragment (hereinafter MCD054-Fc).
Referred to as)). The construction of the expression plasmid in mammalian cells is as follows. Sense primer mcd054-F2 (5'-CCG GAA TTC CCT GCC ATG CTT
GGA ACT GGG AAA-3 ') and antisense primer m
cd054-R2 (5'-CGC GGA TCC GCT TGC CAT TTC GTC CTT
GGA GGG-3 ') and C-TRACH2003605 as a template for Pyrob
Use est DNA Polymerase (TAKARA) at 98 ℃ for 10
The PCR reaction is carried out by repeating a cycle of 30 seconds at 55 ° C for 30 seconds and 1 minute at 72 ° C 30 times. The obtained PCR product of about 0.45 kb is digested with EcoRI and BamHI, and a DNA fragment is recovered by agarose gel electrophoresis. Republished WO97 / 42319
PM1304 described in 1. was digested with EcoRI and BamHI, and the DN
Ligate the A fragment. Competent cell JM109 is transformed and an MCD054-Fc expression plasmid is prepared according to a standard method. The obtained expression plasmid was transformed into COS by the following method.
Introduce into cells. That is, 50 μl of FuGENE6 (Roche Diagnostics) and the above plasmid DNA 12.5
μg is mixed according to the attached protocol, and added to COS cells grown semiconfluently in a 150 cm 2 flask. After culturing at 37 ° C. for 3 days in the presence of 5% CO 2 , the culture supernatant is collected and MCD054-Fc is purified using a Protein A column.
【００９０】実施例４ 抗MCD054抗体の作製
（１）MCD054の部分ペプチドの調製
MCD054に対する抗体を作製するため、MCD054の細胞外ド
メインのN末端及びC末端の配列あるいはChou-Fasman及
びRobsonの２次構造予測プログラムを用いて解析を行
い、親水性が高く構造的にはαヘリックスを含むなどタ
ンパク表面に露出しているであろう配列を選び出し、合
成を行う。ペプチドの合成はModel 433Aペプチドシンセ
サイザー（アプライドバイオシステムズ ジャパン株式
会社）を用いて、キャリア蛋白と結合できるようにする
ため、C端にシステインを付加し合成する。定法により
樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を行い、C18逆相HPL
C（CAPDELL-PAK、資生堂）を用いて精製を行う。Example 4 Preparation of anti-MCD054 antibody (1) Preparation of partial peptide of MCD054 In order to prepare an antibody against MCD054, the sequences of the N-terminal and C-terminal of the extracellular domain of MCD054 or the secondary sequences of Chou-Fasman and Robson. Analysis is performed using a structure prediction program, and a sequence that is highly hydrophilic and structurally contains α-helix and is likely to be exposed on the protein surface is selected and synthesized. The peptide is synthesized by using Model 433A peptide synthesizer (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) with cysteine added to the C-terminus so that it can be bound to the carrier protein. C18 reverse phase HPL
Purification is carried out using C (CAPDELL-PAK, Shiseido).
【００９１】（２）MCD054のペプチド免疫抗原の調製
合成したペプチドを蒸留水で10mg/mlに溶解し、10mg/ml
のマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（PI
ERCE）と等量混合を行う。室温で２時間反応後、NAP-10
カラム（アマシャム ファルマシアバイオテク）で脱塩
する。蛋白濃度は使用したKLH量を液量で割ったものを
用い、算出する。(2) Preparation of MCD054 peptide immunoantigen The synthesized peptide was dissolved in distilled water to 10 mg / ml to obtain 10 mg / ml.
Maleimidated keyhole limpet hemocyanin (PI
ERCE) and mix in equal volume. After reacting for 2 hours at room temperature, NAP-10
Desalt with a column (Amersham Pharmacia Biotech). The protein concentration is calculated using the amount of KLH used divided by the liquid volume.
【００９２】（３）MCD054抗体の作製
（３−１）ポリクローナル抗体の作製
MCD054に対するウサギポリクローナル抗体を作製するた
め、調製した各ペプチド抗原をそれぞれ各40μgずつ混
合し、0.5mlとする。その後、等量のフロインド完全ア
ジュバント（DIFCO）と混合し、ウサギの背部皮下に投
与を行う。２週間後、同量をフロインド不完全アジュバ
ント（DIFCO）と混合したものを投与し、２週間後耳静
脈より採血し抗血清を調製する。同様に実施例３で産生
および精製したMCD054-Fcを30μg/bodyで投与し、抗血
清を作製する。(3) Preparation of MCD054 Antibody (3-1) Preparation of Polyclonal Antibody In order to prepare a rabbit polyclonal antibody against MCD054, 40 μg of each prepared peptide antigen is mixed to make 0.5 ml. After that, it is mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant (DIFCO) and subcutaneously administered to the back of the rabbit. Two weeks later, the same amount mixed with Freund's incomplete adjuvant (DIFCO) is administered, and two weeks later, blood is collected from an ear vein to prepare an antiserum. Similarly, MCD054-Fc produced and purified in Example 3 is administered at 30 μg / body to prepare an antiserum.
【００９３】（３−２）ペプチド抗体の作製
調製した各ペプチドキャリア抗原20μgを100μlの生理
食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバントと等量混
合を行う。BALB/cマウス５週齢メスの腹腔に投与し、２
週間後ペプチドキャリア抗原20μgを100μlの生理食塩
水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等量混合
し同様に腹腔に投与する。１週間後眼底より採血を行
い、抗体価の上昇をウエスタンブロッティングにより確
認する。すなわち組換えMCD054蛋白質を4-20%SDS-ポリ
アクリルアミドゲル（TEFCO）にて電気泳動し、ミリポ
ア社の方法にしたがってPVDF膜に転写する。転写後５％
スキムミルク、0.05%Tween20を含む０．０７６Ｍリン酸
緩衝液（pH6.4）（以下T-PBSと記載）にてブロッキング
を行う。採血した抗血清を0.5%BSAを含むT-PBSで500倍
に希釈し、転写したPVDF膜と４℃で一夜反応させる。メ
ンブレンをT-PBSで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識
抗マウスイムノグロブリン抗体（DAKO）を0.5%BSAを含
むT-PBSで500倍に希釈し、メンブレンと室温で１時間反
応させる。その後、メンブレンをT-PBSで３回洗浄後、E
CL（アマシャム ファルマシアバイオテク）で検出す
る。以上の操作で抗体価の上昇を確認し、抗原の最終投
与３日後、脾細胞よりリンパ球を分離し、Sp2/O-Ag14
（ATCC No. CRL1581）と混合後、ポリエチレングリコー
ルを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験
操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行う。HA
T培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後に目的
の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニング
を行う。(3-2) Preparation of Peptide Antibody 20 μg of each prepared peptide carrier antigen is dissolved in 100 μl of physiological saline and mixed with Freund's complete adjuvant in an equal amount. BALB / c mice were injected into the abdominal cavity of 5-week-old females and 2
After a week, 20 μg of the peptide carrier antigen is dissolved in 100 μl of physiological saline, mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant, and similarly administered intraperitoneally. One week later, blood is collected from the fundus and the increase in antibody titer is confirmed by Western blotting. That is, the recombinant MCD054 protein is electrophoresed on a 4-20% SDS-polyacrylamide gel (TEFCO) and transferred onto a PVDF membrane according to the method of Millipore. 5% after transfer
Blocking is performed with 0.076 M phosphate buffer (pH 6.4) containing skim milk and 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as T-PBS). The collected antiserum is diluted 500 times with T-PBS containing 0.5% BSA, and reacted with the transferred PVDF membrane at 4 ° C. overnight. The membrane is washed 3 times with T-PBS, the peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DAKO) is diluted 500-fold with T-PBS containing 0.5% BSA, and the membrane is allowed to react at room temperature for 1 hour. After that, wash the membrane 3 times with T-PBS, then E
Detect with CL (Amersham Pharmacia Biotech). By the above procedure, the antibody titer was confirmed to increase, and 3 days after the final administration of the antigen, lymphocytes were isolated from the splenocytes, and Sp2 / O-Ag14 was isolated.
After mixing with (ATCC No. CRL1581), cell fusion is performed using polyethylene glycol according to Tamie Ando, Takeshi Chiba / Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Operation (Kodansha). HA
Hybridomas are selected using T medium, and one week later, the hybridomas producing the desired antibody are screened.
【００９４】0.01M炭酸緩衝液（pH9.5）を用い、実施例
３で生産及び精製するMCD054-Fcを1μg/mlに希釈し、イ
ムノプレート（Maxisorb、NUNC）に50μl／ウエル添加す
る。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄
し、0.5%BSAを含む0.076Mリン酸緩衝液（pH6.4）（以下
PBSと記載）を各ウエルに100μl添加し、ブロッキング
を行う。次に培養上清を各ウエルに添加し、37℃で１時
間反応させた後、0.05%Tween20を含む生理食塩水で３回
洗浄する。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブ
リン抗体を10％ウサギ血清を含むPBSで1000倍に希釈し
各ウエルに50μl添加した。37℃で１時間反応後、0.05%
Tween20を含む生理食塩水で５回洗浄し、0.01%過酸化
水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添
加する。室温で10分間反応後、0.5M硫酸溶液で反応を停
止する。プレート分光光度計（NJ-2100、日本インター
メッド）で450nmの吸光度を測定する。この結果をもと
に、MCD054と反応する細胞を選択し、限界希釈法により
クローニングを行う。１０日後、同様にスクリーニング
を行い、MCD054と反応する抗体を産生するクローンを取
得することができる。選択したハイブリドーマは10%FCS
/RPMI1640培地（Invitrogen）で培養後、Hybridoma-SFM
培地（Invitrogen）で培養し抗体を産生させ、Prosep-A
カラム（ミリポア）を用いて抗体を精製する。MCD054-Fc produced and purified in Example 3 was diluted to 1 μg / ml with 0.01 M carbonate buffer (pH 9.5) and added to an immunoplate (Maxisorb, NUNC) at 50 μl / well. After reacting at 37 ℃ for 1 hour, washed with ion-exchanged water 5 times, and 0.076M phosphate buffer (pH 6.4) containing 0.5% BSA (below.
100 μl of PBS) is added to each well to perform blocking. Next, the culture supernatant is added to each well, reacted at 37 ° C for 1 hour, and then washed 3 times with physiological saline containing 0.05% Tween20. Peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody was diluted 1000-fold with PBS containing 10% rabbit serum, and 50 μl was added to each well. After reacting at 37 ℃ for 1 hour, 0.05%
After washing 5 times with a physiological saline solution containing Tween 20, a tetramethylbenzidine solution containing 0.01% hydrogen peroxide is added to each well. After reacting for 10 minutes at room temperature, stop the reaction with 0.5 M sulfuric acid solution. Measure the absorbance at 450 nm with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed). Based on this result, cells that react with MCD054 are selected and cloned by the limiting dilution method. After 10 days, the same screening can be performed to obtain a clone that produces an antibody that reacts with MCD054. Hybridoma selected is 10% FCS
Hybridoma-SFM after culturing in / RPMI1640 medium (Invitrogen)
Prosep-A is produced by culturing in medium (Invitrogen) to produce antibodies.
The antibody is purified using a column (Millipore).
【００９５】（３−３）抗MCD054モノクローナル抗体の
作製
BALB/cマウス（メス、６週齢）の腹腔に精製したMCD054
-Fc蛋白質20μgをフロインド完全アジュバントと等量混
合して投与する。初回投与２週間後に抗原２０μｇを生
理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等
量混合後腹腔に投与する。さらに１週間後、抗体価の上
昇を上記（３−２）記載の方法により確認し、最終投与
を行う。マウスの腹腔に抗原100μgを投与し、３日後、
脾臓を摘出する。脾臓よりリンパ球を分離し、P3×63-A
g.8.U・1と10：1で混合し、ポリエチレングリコールを用
いて細胞融合を行う。HAT培地によりハイブリドーマを
選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリド
ーマのスクリーニングを行う。（３−２）に記載の方法
により抗MCD054抗体産生ウエルのスクリーニングを行
い、MCD054-Fcと反応したウエルを限界希釈法によりク
ローニングし、再度スクリーニングを行って抗MCD054モ
ノクローナル抗体を取得することができる。(3-3) Preparation of anti-MCD054 monoclonal antibody Purified MCD054 was intraperitoneally administered to BALB / c mice (female, 6 weeks old).
-Administer 20 μg of Fc protein in the same amount as Freund's complete adjuvant. Two weeks after the first administration, 20 μg of the antigen is dissolved in physiological saline, mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant, and then intraperitoneally administered. After another week, an increase in antibody titer is confirmed by the method described in (3-2) above, and the final administration is performed. 100 μg of antigen was administered to the abdominal cavity of mice, and 3 days later
Remove the spleen. Isolate lymphocytes from spleen, P3 x 63-A
Mix with g.8.U-1 at 10: 1 and perform cell fusion using polyethylene glycol. Hybridomas are selected by HAT medium, and one week later, the hybridomas producing the desired antibody are screened. Anti-MCD054 antibody-producing wells can be screened by the method described in (3-2), and wells that have reacted with MCD054-Fc can be cloned by the limiting dilution method and screened again to obtain anti-MCD054 monoclonal antibody. .
【００９６】ハイブリドーマを10％FCS/RPMI1640培地
（Invitrogen）で培養後、Hybridoma-SFM培地（Invitro
gen）で培養し、抗体を産生させ、Prosep-Aカラム（ミ
リポア）を用いて抗体を精製する。After culturing the hybridoma in 10% FCS / RPMI1640 medium (Invitrogen), Hybridoma-SFM medium (Invitrogen
gen) to produce the antibody, and the antibody is purified using a Prosep-A column (Millipore).
【００９７】実施例５ MCD054発現形質転換株の作製
MCD054を安定に発現する形質転換株を以下の方法で作製
することができる。即ち、5×10６個のJurkat細胞（clo
ne E6.1;ATCC）に20μgのC-TRACH2003605及び1μgのNeo
mycin耐性遺伝子発現プラスミド（例えばpcDNA3.1(+)；
Invitrogen社）をエレクトロポレーション法によって導
入する。エレクトロポレーションの条件は300V、950μF
capacitanceにてジーンパルサーIIシステム（BIO-RAD
社）を用いて行う。その後、0.3mg/mlのG-418（Invitro
gen社）を含む培地にて選択培養を行い、G-418耐性クロ
ーンを得る。次に得られた耐性クローンを実施例６に記
すフローサイトメトリー法で解析し、MCD054を発現して
いるクローンを得ることができる。Example 5 Preparation of MCD054 expressing transformant A transformant which stably expresses MCD054 can be prepared by the following method. That is, 5 × 10 6 Jurkat cells (clo
ne E6.1; ATCC) 20 μg C-TRACH2003605 and 1 μg Neo
mycin resistance gene expression plasmid (eg pcDNA3.1 (+);
Invitrogen) is introduced by the electroporation method. Electroporation conditions are 300V, 950μF
Gene Pulser II system with capacitance (BIO-RAD
Company). Then, 0.3 mg / ml G-418 (Invitro
Selective culture is performed in a medium containing gen) to obtain G-418 resistant clones. Next, the obtained resistant clones can be analyzed by the flow cytometry method described in Example 6 to obtain clones expressing MCD054.
【００９８】実施例６ MCD054蛋白質発現確認
脾臓、末梢血などから調製したリンパ球や白血球分画、
および、本蛋白質を発現させたJurkat T細胞の細胞膜に
おける発現を、フローサイトメーターにより確認する。
試験の対象となる10６個の細胞を0.1mlの0.1%BSA含有PB
Sに懸濁させ、１μｇの本発明蛋白質の細胞外ドメイン
に対する抗体を添加し、室温で30分反応する。このサン
プルを遠心し、2mlの0.1%BSA含有PBSで3回洗浄後、100
μlの0.1%BSA含有PBSに懸濁させ、FITC標識抗マウスIgG
抗体を1μｇ加えて室温でさらに３０分反応させる。ふ
たたび0.1%BSA含有PBSで3回洗浄した後、1mlの0.1%BSA
PBSで再懸濁し、その再懸濁液に含まれるFITC陽性細胞
の割合をフローサイトメーターにより検出、および算定
する。Example 6 Confirmation of MCD054 protein expression Lymphocyte and leukocyte fractions prepared from spleen, peripheral blood, etc.,
And, the expression in the cell membrane of Jurkat T cells expressing this protein is confirmed by a flow cytometer.
10 6 cells to be tested were added to 0.1 ml of PB containing 0.1% BSA.
After suspending in S, 1 μg of an antibody against the extracellular domain of the protein of the present invention is added, and the mixture is reacted at room temperature for 30 minutes. This sample was centrifuged, washed 3 times with 2 ml of PBS containing 0.1% BSA, and then washed with 100
FITC-labeled anti-mouse IgG was suspended in μl of PBS containing 0.1% BSA.
Add 1 μg of antibody and incubate at room temperature for another 30 minutes. After washing again with PBS containing 0.1% BSA three times, 1 ml of 0.1% BSA was used.
Resuspend in PBS, and detect and calculate the proportion of FITC-positive cells contained in the resuspension with a flow cytometer.
【００９９】実施例７ MCD054蛋白質抗体のＩＬ−２産
生抑制活性測定
本発明蛋白質を恒常的に発現させた2×10５個のJurkat
T細胞を96穴プレートに播種する。100ng/mlのドキシサ
イクリンを添加した培地で１晩培養し、その後、抗CD3
抗体をコートしたビーズ(ビース数：Jurkat細胞数＝
１：１)、および抗CD28抗体 5μg/mlを添加して４８時
間培養し、培養上清中に含まれるIL-2をELISAによって
測定する。本発明蛋白質に対する抗体を抗CD3抗体ビー
ズ、および抗CD28抗体の添加と同時に加え、ＩＬ−２産
生に対する影響を検討する。Example 7 Measurement of IL-2 production inhibitory activity of MCD054 protein antibody 2 × 10 5 Jurkat in which the protein of the present invention was constitutively expressed
Plate T cells in 96-well plates. Culture overnight in medium supplemented with 100 ng / ml doxycycline, then anti-CD3
Beads coated with antibody (number of beads: number of Jurkat cells =
1: 1) and 5 μg / ml of anti-CD28 antibody are added and the mixture is cultured for 48 hours, and IL-2 contained in the culture supernatant is measured by ELISA. An antibody against the protein of the present invention is added simultaneously with the addition of anti-CD3 antibody beads and anti-CD28 antibody, and the effect on IL-2 production is examined.
【０１００】実施例８ MCD054蛋白質抗体によるリン酸
化抑制反応
ドキシサイクリン添加によって本発明蛋白質を発現させ
た1×10７個のJurkat細胞に抗CD3抗体ビーズ（ビーズ
数：Jurkat細胞数＝1：1）、可溶性抗CD28抗体5μg/ml
添加し、10分後にオルトバナジン酸ナトリウムを含むPB
Sで一回洗浄した後、500μlの溶解用緩衝液（1% Triton
X-100,150mM NaCl,10mM Tris-HCl pH7.6,5mM EDTA,1mM
オルトバナジン酸ナトリウム，10μg/ml ロイペプチ
ン，10μg/ml アプロチニン，25μg/ml ニトロフェニル
-p′-グアニジノ−ベンゾエート）を添加して30分氷中
で静置する。こうして得られた細胞溶解物に対してSDS
電気泳動を行なった後PVDF膜にトランスファーし、抗活
性MAPK抗体を用いてウエスタンブロットを行なうことに
より、リン酸化ERK1/ERK2を検出する。本発明に対する
抗体を抗CD3抗体ビーズや抗CD28抗体と同時に添加し、E
RK1/ERK2のリン酸化に対する影響を検討する。Example 8 Phosphorylation Inhibition Reaction by MCD054 Protein Antibody Anti-CD3 antibody beads (bead number: Jurkat cell number = 1: 1) were added to 1 × 10 7 Jurkat cells expressing the protein of the present invention by addition of doxycycline. Soluble anti-CD28 antibody 5 μg / ml
Add and 10 minutes later PB with sodium orthovanadate
After washing once with S, 500 μl of lysis buffer (1% Triton
X-100,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.6,5mM EDTA, 1mM
Sodium orthovanadate, 10 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml aprotinin, 25 μg / ml nitrophenyl
-p'-guanidino-benzoate) is added and the mixture is allowed to stand in ice for 30 minutes. SDS was applied to the cell lysate thus obtained.
Phosphorylated ERK1 / ERK2 is detected by performing electrophoresis and then transferring to a PVDF membrane and performing Western blotting using an anti-active MAPK antibody. Antibodies against the present invention were added at the same time as anti-CD3 antibody beads and anti-CD28 antibody, and E
To examine the effect of RK1 / ERK2 on phosphorylation.
【０１０１】実施例９ 細胞外ドメイン-Fc融合タンパ
クの活性測定
非血縁者2人のドナー（A，B）の血液から調製した末梢
血リンパ球（PBMC）を５％ウシ胎児血清添加RPMI1640で
1×106 cells/mlに調製し、96穴プレートにA由来のPBMC
懸濁液とB由来のPBMC懸濁液を100μlずつ添加して37
℃、5%CO２インキュベーター内で5日間培養する。実施
例３で作製したMCD054-Fcを、リンパ球の添加と同時に1
0μg/ml添加する。その後、培地で100μＭに調製したブ
ロモデオキシウリジン（BrdU）を20μl添加し、24時間
培養する。300g、10分遠心して細胞を沈殿させ、上清を
除去して200μｌのFixDenat（ロシュ）を添加して30分
静置したのち、FixDenatを除去し、100μlのペルオキシ
ダーゼ標識抗BrdU反応液を加え、室温で90分静置する。P
BSで3回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（TMB）を
100μl添加して発色させる。発色5-30分後に25μlの1M
硫酸を加えて反応を停止させ、OD450nmの蛍光度測定を
行う。Example 9 Activity Measurement of Extracellular Domain-Fc Fusion Protein Peripheral blood lymphocytes (PBMC) prepared from blood of two unrelated donors (A, B) were subjected to RPMI1640 supplemented with 5% fetal bovine serum.
Prepare 1 x 10 6 cells / ml and put the PBMC derived from A into a 96-well plate.
Add 100 μl of suspension and 100 μl of PBMC suspension from B to 37
Incubate for 5 days in a 5% CO 2 incubator at ℃. MCD054-Fc prepared in Example 3 was treated with 1 at the same time as the addition of lymphocytes.
Add 0 μg / ml. Then, 20 μl of bromodeoxyuridine (BrdU) adjusted to 100 μM in the medium is added, and the mixture is cultured for 24 hours. After centrifuging at 300 g for 10 minutes to precipitate the cells, remove the supernatant, add 200 μl of FixDenat (Roche) and let stand for 30 minutes, then remove FixDenat and add 100 μl of peroxidase-labeled anti-BrdU reaction solution, Let stand for 90 minutes at room temperature. P
After washing 3 times with BS, add tetramethylbenzidine (TMB)
Add 100 μl to develop color. Color development 5-30 minutes later 25 μl 1M
Sulfuric acid is added to stop the reaction, and OD450nm fluorescence measurement is performed.
【０１０２】[0102]
【発明の効果】本発明のMCD054は、免疫機能の異常によ
る疾患の発症あるいは進行に対してその原因となり得る
蛋白質であり、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性
疾患、血管炎・肝炎・敗血性ショックなとの炎症性疾
患、腫瘍等の予防あるいは治療のための医薬品の開発に
おいて、極めて有用である。EFFECTS OF THE INVENTION The MCD054 of the present invention is a protein that can cause the onset or progression of diseases caused by abnormal immune function, and is an autoimmune disease, immunodeficiency, allergic disease, vasculitis / hepatitis / septic. It is extremely useful in the development of pharmaceuticals for the prevention or treatment of shockable inflammatory diseases, tumors and the like.
【０１０３】また、遺伝子mcd054は、アンチセンス医薬
品として、また遺伝子治療において利用することがで
き、蛋白質MCD054は、それ自体あるいはその可溶性断片
（細胞外領域や各ドメイン）を作製することにより可溶
性蛋白医薬品として有用である。さらに、MCD054または
その断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部は、
生体内でのMCD054機能を制御する抗体医薬品として有用
である。Further, the gene mcd054 can be used as an antisense drug and in gene therapy. The protein MCD054 can be used as a soluble protein drug by preparing itself or a soluble fragment thereof (extracellular region or each domain). Is useful as Furthermore, an antibody having reactivity with MCD054 or a fragment thereof and a part of the antibody,
It is useful as an antibody drug that controls MCD054 function in vivo.
【０１０４】[0104]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. <110> Helix Research Institute, Inc. <120> Novel immunosuppressive molecule having an ITIM motif <130> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 849 <212> DNA <213> human <400> 1 atgcttggaa ctgggaaatt attttgggtc ttcttcttaa tcccatatct ggacatctgg 60 aacatccatg ggaaagaatc atgtgatgta cagctttata taaagagaca atctgaacac 120 tccatcttag caggagatcc ctttgaacta gaatgccctg tgaaatactg tgctaacagg 180 cctcatgtga cttggtgcaa gctcaatgga acaacatgtg taaaacttga agatagacaa 240 acaagttgga aggaagagaa gaacatttca tttttcattc tacatttcga accagtgctt 300 cctaatgaca atgggtcata ccgctgttct gcaaattttc agtctaatct cattgaaagc 360 cactcaacaa ctctttatgt gacagatgta aaaagtgcct cagaacgacc ctccaaggac 420 gaaatggcaa gcagaccctg gctcctgtat agtttacttc ctttgggggg attgcctcta 480 ctcatcacta cctgtttctg cctgttctgc tgcctgagaa ggcaccaagg aaagcaaaat 540 gaactctctg acacagcagg aagggaaatt aacctggttg atgctcacct taagagtgag 600 caaacagaag caagcaccag gcaaaattcc caagtaccgc tatcagaaac tggaatttat 660 gataatgacc ctgacctttg tttcaggatg caggaagggt ctgaagttta ttctaatcca 720 tgcctggaag aaaacaaacc aggcattgtt tatgcttccc tgaaccattc tgtcattgga 780 ctgaactcaa gactggcaag aaatgtaaaa gaagcaccaa cagaatatgc atccatatgt 840 gtgaggagt 849 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val Phe Phe Leu Ile Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu 20 25 30 Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe 35 40 45 Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr 50 55 60 Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln 65 70 75 80 Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe 85 90 95 Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn 100 105 110 Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr 115 120 125 Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser 130 135 140 Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln 165 170 175 Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu 180 185 190 Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln 195 200 205 Asn Ser Gln Val Pro Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro 210 215 220 Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro 225 230 235 240 Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His 245 250 255 Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala 260 265 270 Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser 275 280 <210> 3 <211> 3002 <212> DNA <213> human <400> 3 attgcctgcc atgcttggaa ctgggaaatt attttgggtc ttcttcttaa tcccatatct 60 ggacatctgg aacatccatg ggaaagaatc atgtgatgta cagctttata taaagagaca 120 atctgaacac tccatcttag caggagatcc ctttgaacta gaatgccctg tgaaatactg 180 tgctaacagg cctcatgtga cttggtgcaa gctcaatgga acaacatgtg taaaacttga 240 agatagacaa acaagttgga aggaagagaa gaacatttca tttttcattc tacatttcga 300 accagtgctt cctaatgaca atgggtcata ccgctgttct gcaaattttc agtctaatct 360 cattgaaagc cactcaacaa ctctttatgt gacagatgta aaaagtgcct cagaacgacc 420 ctccaaggac gaaatggcaa gcagaccctg gctcctgtat agtttacttc ctttgggggg 480 attgcctcta ctcatcacta cctgtttctg cctgttctgc tgcctgagaa ggcaccaagg 540 aaagcaaaat gaactctctg acacagcagg aagggaaatt aacctggttg atgctcacct 600 taagagtgag caaacagaag caagcaccag gcaaaattcc caagtaccgc tatcagaaac 660 tggaatttat gataatgacc ctgacctttg tttcaggatg caggaagggt ctgaagttta 720 ttctaatcca tgcctggaag aaaacaaacc aggcattgtt tatgcttccc tgaaccattc 780 tgtcattgga ctgaactcaa gactggcaag aaatgtaaaa gaagcaccaa cagaatatgc 840 atccatatgt gtgaggagtt aagtctgttt ctgactccaa cagggaccac tgaatgatca 900 gcatgttgac atcattgtct gggctcaaca ggatgtcaaa taatatttct caatttgaga 960 atttttactt tagaaatgtt catgttagtg cttgggtctt aagggtccat aggataaatg 1020 attaaaattt ctctcagaaa cttatttggg agctttttat attatagcct tgaataacaa 1080 aatctctcca aaactggttg acatcatgag tagcagaata gtagaacgtt taaacttagc 1140 tacattttac ccaatataca aactcgatct tgcctttgaa gctattggaa agacttgtag 1200 ggaaaagagg tttgtgttac ctgcatcagt tcactacaca ctcttgaaaa caaaatgtcc 1260 caatttgact aaccaaccat aaatacagta atgattgtat atttcaagtc agtcttccaa 1320 aataagaaat ttttgctgtg tcagtctaag aatggtgttt cttaaatgca aaggagaaat 1380 cattttaggc ttgatgtaag aaaatgaaaa taataaatgg tgcaataaaa atatagaata 1440 taccaattgg atatagggta gatgttccac atacctggca aacaaatgct tatatctact 1500 ctgttagatt gataagcaaa tataggtatt aatggagcag tcaacgtata gcacatttat 1560 gaggaaagta gagactcact gggtcacata gactaatgga taggaatgtg acataatgct 1620 gctgaattaa tatacttatg ggcatctgaa tagtttaaaa gttagtcaga ataggtatca 1680 ctgggcaagt gaagatagct taaactgctt catgcttgac ttgatagcaa gttaaagtgc 1740 aattaatgga atggaggaaa acccagaata tttaattggt ctgtaggggt caatttgctt 1800 tcattcacca catctgcatc ttgctgttct tcttactaag gaatcagggc aaatcatctg 1860 tagtgacata ttttagtttg ctaatcattt attttaaaat actgaggttg cagccactta 1920 agagtatagc aaaagatgga ttcagatttt tggactttcc aaagtacttg agttaaacta 1980 tttcaaaaat agcctataat tttattcaac agtttgaggc tattcgaatt ctcaggtgct 2040 gctactgaat aatgtaatag tcttcataca aagtggatag caaaggttaa aatccatttc 2100 aacaaatatg tgagctgagc tgctgcacaa aggaatgtga tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2160 tgtgtgtgtg ttaggtgggg tgggtgacaa cagaaatggt gcacgagaaa ctgatcaaat 2220 tgacattata ttttcagttt gcttatgaag ctcaaaatac tagagtaaat gggtcattaa 2280 agaaaataat atgtgaaatt atggagttta gaatacaagt ggggtatata tacaaaaaga 2340 caaaactgag gttttgtggt ggagagattt tcttaagtaa cactggcatt aagttttagc 2400 tccttagatt tgggggtgca aatattcttt tgagtcactg ttattttgcc aattacacct 2460 agaatttcaa gcaaccaatt cgagataggc tgttttagcc aggctgcatt tgtggacaac 2520 ttatgtaaga aagacatgtt agaatagctg cttgtggtat tcttaaaaat agaaacagga 2580 aatatgggga ggatacattt agctgtcctc ttatcagatg aacacacgaa attgaacagt 2640 tccttcatga ttctctcaaa cttaaaagca aaatatttct gtcttattta aaatatcctt 2700 agtatgtctt atagtaaaga taatgctgat aatgatttca tctctaagat gtattaatat 2760 atttgtactg tttgccaaaa tcacaaatca tttatgtttt tattcctttt caaaatggtg 2820 tcagagacat acatgcattt tcccaaatga ctctacttca ctattattta catggcttat 2880 ttcattaatt tatagagggt ttgagaaaaa gaatatgtag ataatttaat ggtttttcac 2940 aaattttaag cttgtgattg tgctcaatga gaaggtaaag ttattaaaac ttatttgaaa 3000 tc 3002 <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213> human <400> 4 Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val 1 5 10 15 Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu 20 25 30 Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile 35 40 45 Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala 50 55 60 Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser 85 90 95 Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser 100 105 110 Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser 115 120 125 Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser 130 135 140 Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro 145 150 155 160 Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys 165 170 175 Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala 180 185 190 Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr 195 200 205 Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Pro Leu Ser Glu Thr Gly 210 215 220 Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser 225 230 235 240 Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val 245 250 255 Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala 260 265 270 Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg 275 280 285 Ser <210> 5 <211> 916 <212> DNA <213> human <400> 5 tctacttgag cagtttttcc atcactgata tgtgcaggaa atgaagacat tgcctgccat 60 gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc ccatatctgg acatctggaa 120 catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc 180 catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc 240 tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac 300 aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta catttcgaac cagtgcttcc 360 taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca 420 ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga 480 aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct ttggggggat tgcctctact 540 catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg caccaaggaa agcaaaatga 600 actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat gctcacctta agagtgagca 660 aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtaccgcta tcagaaactg gaatttatga 720 taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct gaagtttatt ctaatccatg 780 cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg aaccattctg tcattggact 840 gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca gaatatgcat ccatatgtgt 900 gaggagttaa gtctgt 916[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. <110> Helix Research Institute, Inc. <120> Novel immunosuppressive molecule having an ITIM motif <130> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 849 <212> DNA <213> human <400> 1 atgcttggaa ctgggaaatt attttgggtc ttcttcttaa tcccatatct ggacatctgg 60 aacatccatg ggaaagaatc atgtgatgta cagctttata taaagagaca atctgaacac 120 tccatcttag caggagatcc ctttgaacta gaatgccctg tgaaatactg tgctaacagg 180 cctcatgtga cttggtgcaa gctcaatgga acaacatgtg taaaacttga agatagacaa 240 acaagttgga aggaagagaa gaacatttca tttttcattc tacatttcga accagtgctt 300 cctaatgaca atgggtcata ccgctgttct gcaaattttc agtctaatct cattgaaagc 360 cactcaacaa ctctttatgt gacagatgta aaaagtgcct cagaacgacc ctccaaggac 420 gaaatggcaa gcagaccctg gctcctgtat agtttacttc ctttgggggg attgcctcta 480 ctcatcacta cctgtttctg cctgttctgc tgcctgagaa ggcaccaagg aaagcaaaat 540 gaactctctg acacagcagg aagggaaatt aacctggttg atgctcacct taagagtgag 600 caaacagaag caagcaccag gcaaaattcc caagtaccgc tatcagaaac tggaatttat 660 gataatgacc ctgacctttg tttcaggatg caggaagggt ctgaagttta ttctaatcca 720 tgcctggaag aaaacaaacc aggcattgtt tatgcttccc tgaaccattc tgtcattgga 780 ctgaactcaa gactggcaag aaatgtaaaa gaagcaccaa cagaatatgc atccatatgt 840 gtgaggagt 849 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val Phe Phe Leu Ile Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu 20 25 30 Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe 35 40 45 Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr 50 55 60 Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln 65 70 75 80 Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe 85 90 95 Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn 100 105 110 Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr 115 120 125 Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser 130 135 140 Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln 165 170 175 Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu 180 185 190 Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln 195 200 205 Asn Ser Gln Val Pro Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro 210 215 220 Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro 225 230 235 240 Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His 245 250 255 Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala 260 265 270 Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser 275 280 <210> 3 <211> 3002 <212> DNA <213> human <400> 3 attgcctgcc atgcttggaa ctgggaaatt attttgggtc ttcttcttaa tcccatatct 60 ggacatctgg aacatccatg ggaaagaatc atgtgatgta cagctttata taaagagaca 120 atctgaacac tccatcttag caggagatcc ctttgaacta gaatgccctg tgaaatactg 180 tgctaacagg cctcatgtga cttggtgcaa gctcaatgga acaacatgtg taaaacttga 240 agatagacaa acaagttgga aggaagagaa gaacatttca tttttcattc tacatttcga 300 accagtgctt cctaatgaca atgggtcata ccgctgttct gcaaattttc agtctaatct 360 cattgaaagc cactcaacaa ctctttatgt gacagatgta aaaagtgcct cagaacgacc 420 ctccaaggac gaaatggcaa gcagaccctg gctcctgtat agtttacttc ctttgggggg 480 attgcctcta ctcatcacta cctgtttctg cctgttctgc tgcctgagaa ggcaccaagg 540 aaagcaaaat gaactctctg acacagcagg aagggaaatt aacctggttg atgctcacct 600 taagagtgag caaacagaag caagcaccag gcaaaattcc caagtaccgc tatcagaaac 660 tggaatttat gataatgacc ctgacctttg tttcaggatg caggaagggt ctgaagttta 720 ttctaatcca tgcctggaag aaaacaaacc aggcattgtt tatgcttccc tgaaccattc 780 tgtcattgga ctgaactcaa gactggcaag aaatgtaaaa gaagcaccaa cagaatatgc 840 atccatatgt gtgaggagtt aagtctgttt ctgactccaa cagggaccac tgaatgatca 900 gcatgttgac atcattgtct gggctcaaca ggatgtcaaa taatatttct caatttgaga 960 atttttactt tagaaatgtt catgttagtg cttgggtctt aagggtccat aggataaatg 1020 attaaaattt ctctcagaaa cttatttggg agctttttat attatagcct tgaataacaa 1080 aatctctcca aaactggttg acatcatgag tagcagaata gtagaacgtt taaacttagc 1140 tacattttac ccaatataca aactcgatct tgcctttgaa gctattggaa agacttgtag 1200 ggaaaagagg tttgtgttac ctgcatcagt tcactacaca ctcttgaaaa caaaatgtcc 1260 caatttgact aaccaaccat aaatacagta atgattgtat atttcaagtc agtcttccaa 1320 aataagaaat ttttgctgtg tcagtctaag aatggtgttt cttaaatgca aaggagaaat 1380 cattttaggc ttgatgtaag aaaatgaaaa taataaatgg tgcaataaaa atatagaata 1440 taccaattgg atatagggta gatgttccac atacctggca aacaaatgct tatatctact 1500 ctgttagatt gataagcaaa tataggtatt aatggagcag tcaacgtata gcacatttat 1560 gaggaaagta gagactcact gggtcacata gactaatgga taggaatgtg acataatgct 1620 gctgaattaa tatacttatg ggcatctgaa tagtttaaaa gttagtcaga ataggtatca 1680 ctgggcaagt gaagatagct taaactgctt catgcttgac ttgatagcaa gttaaagtgc 1740 aattaatgga atggaggaaa acccagaata tttaattggt ctgtaggggt caatttgctt 1800 tcattcacca catctgcatc ttgctgttct tcttactaag gaatcagggc aaatcatctg 1860 tagtgacata ttttagtttg ctaatcattt attttaaaat actgaggttg cagccactta 1920 agagtatagc aaaagatgga ttcagatttt tggactttcc aaagtacttg agttaaacta 1980 tttcaaaaat agcctataat tttattcaac agtttgaggc tattcgaatt ctcaggtgct 2040 gctactgaat aatgtaatag tcttcataca aagtggatag caaaggttaa aatccatttc 2100 aacaaatatg tgagctgagc tgctgcacaa aggaatgtga tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2160 tgtgtgtgtg ttaggtgggg tgggtgacaa cagaaatggt gcacgagaaa ctgatcaaat 2220 tgacattata ttttcagttt gcttatgaag ctcaaaatac tagagtaaat gggtcattaa 2280 agaaaataat atgtgaaatt atggagttta gaatacaagt ggggtatata tacaaaaaga 2340 caaaactgag gttttgtggt ggagagattt tcttaagtaa cactggcatt aagttttagc 2400 tccttagatt tgggggtgca aatattcttt tgagtcactg ttattttgcc aattacacct 2460 agaatttcaa gcaaccaatt cgagataggc tgttttagcc aggctgcatt tgtggacaac 2520 ttatgtaaga aagacatgtt agaatagctg cttgtggtat tcttaaaaat agaaacagga 2580 aatatgggga ggatacattt agctgtcctc ttatcagatg aacacacgaa attgaacagt 2640 tccttcatga ttctctcaaa cttaaaagca aaatatttct gtcttattta aaatatcctt 2700 agtatgtctt atagtaaaga taatgctgat aatgatttca tctctaagat gtattaatat 2760 atttgtactg tttgccaaaa tcacaaatca tttatgtttt tattcctttt caaaatggtg 2820 tcagagacat acatgcattt tcccaaatga ctctacttca ctattattta catggcttat 2880 ttcattaatt tatagagggt ttgagaaaaa gaatatgtag ataatttaat ggtttttcac 2940 aaattttaag cttgtgattg tgctcaatga gaaggtaaag ttattaaaac ttatttgaaa 3000 tc 3002 <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213> human <400> 4 Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val 1 5 10 15 Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu 20 25 30 Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile 35 40 45 Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala 50 55 60 Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser 85 90 95 Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser 100 105 110 Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser 115 120 125 Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser 130 135 140 Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro 145 150 155 160 Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys 165 170 175 Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala 180 185 190 Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr 195 200 205 Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Pro Leu Ser Glu Thr Gly 210 215 220 Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser 225 230 235 240 Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val 245 250 255 Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala 260 265 270 Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg 275 280 285 Ser <210> 5 <211> 916 <212> DNA <213> human <400> 5 tctacttgag cagtttttcc atcactgata tgtgcaggaa atgaagacat tgcctgccat 60 gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc ccatatctgg acatctggaa 120 catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc 180 catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc 240 tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac 300 aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta catttcgaac cagtgcttcc 360 taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca 420 ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga 480 aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct ttggggggat tgcctctact 540 catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg caccaaggaa agcaaaatga 600 actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat gctcacctta agagtgagca 660 aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtaccgcta tcagaaactg gaatttatga 720 taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct gaagtttatt ctaatccatg 780 cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg aaccattctg tcattggact 840 gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaagaagcaccaaca gaatatgcat ccatatgtgt 900 gaggagttaa gtctgt 916
【図１】ＲＴ−PCRによるmcd054の組織発現プロファイ
ル。FIG. 1 Tissue expression profile of mcd054 by RT-PCR.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/04 ４Ｃ０８４ 37/04 37/08 ４Ｃ０８７ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA11 BA80 CA04 DA03 EA04 GA14 HA01 HA15 HA17 4B063 QA05 QA18 QQ13 QQ20 QQ53 QQ79 QR59 QR77 QR80 QS34 QS38 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA46 AA93Y AA94X AB05 AC14 BA03 CA24 CA25 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB072 ZB092 ZB112 ZB132 ZB262 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZB07 ZB09 ZB11 ZB13 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 EA50 FA72 FA74─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 37/02 A61P 37/04 4C084 37/04 37/08 4C087 37/08 C07K 14/47 4H045 C07K 14 / 47 16/18 16/18 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12Q 1/02 5/10 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z G01N 33 / 15 C12P 21/08 33/50 C12N 15/00 ZNAA // C12P 21/08 5/00 AF term (reference) 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA11 BA80 CA04 DA03 EA04 GA14 HA01 HA15 HA17 4B063 QA05 QA18 QQ13 QQ20 QQ53 QQ79 QR59 QR77 QR80 QS34 QS38 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA46 AA93Y AA94X AB05 AC14 BA03 CA24 CA25 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB072 A01ZB072 ZB092 ZB092 ZB092 ZB092 ZB092 C83 CA12 NA14 ZB07 ZB09 ZB11 ZB13 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 EA50 FA72 FA74
Claims (10)
イブリダイズし、かつ免疫機能抑制分子をコードするDN
A。1. A DNA of the following (a) or (b); (a) a DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a hybridized with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, And DN that encodes a molecule that suppresses immune function
A.
白質。2. A protein encoded by the DNA according to claim 1.
質； （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫
機能抑制分子。3. A protein of (a) or (b) below; (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a deletion, substitution or addition of an amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Immune function suppressing molecule consisting of a modified amino acid sequence.
ター。4. A recombinant vector containing the DNA according to claim 1.
形質転換された形質転換細胞。5. A transformed cell transformed with the recombinant vector according to claim 4.
の発現を抑制するアンチセンス核酸。6. An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the protein according to claim 2 or 3.
酸の全部または一部に相補する配列である、請求項６に
記載のアンチセンス核酸。7. The antisense nucleic acid according to claim 6, wherein the base sequence is a sequence complementary to all or part of the nucleic acid of the DNA according to claim 1.
もしくはその部分ペプチドに対する抗体。8. An antibody against the protein according to claim 2 or claim 3, or a partial peptide thereof.
あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物
質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質の活性調
節作用を示す物質の検索方法。9. A substance showing an activity-regulating action of the protein, which is characterized in that the test substance is brought into contact with the protein according to claim 2 or a transformed cell expressing the protein. retrieval method.
は請求項５に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触さ
せることを特徴とする、請求項１に記載のDNAの発現調
節作用を示す物質の検索方法。10. A DNA expression-regulating action according to claim 1, which comprises contacting the recombinant vector according to claim 4 or the transformed cell according to claim 5 with a test substance. How to search for substances.
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