JP2004501630A - GP286 nucleic acids and polypeptides - Google Patents

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Abstract

ＧＰ２８６と名付けられた新規な免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ＧＰ２８６は、予想される単一膜スパニングドメイン、および１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを、タンパク質の細胞外部分に有する。ＧＰ２８６のタンパク質構造および組織分布は、ＧＰ２８６が、免疫系の細胞−細胞認識、結合、シグナル伝達、および接着事象において役割を果たすことを示す。単離されたＧＰ２８６に関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ベクターおよびこれらのいずれかを含む宿主細胞、ＧＰ２８６を指向する抗体、このような抗体を産生する細胞、および関連する診断方法および治療方法が、本発明によって提供される。Provided is an isolated polynucleotide encoding a member of the novel immunoglobulin superfamily, designated GP286. GP286 has a predicted single membrane spanning domain and one immunoglobulin (Ig) domain in the extracellular portion of the protein. The protein structure and tissue distribution of GP286 indicates that GP286 plays a role in cell-cell recognition, binding, signaling, and adhesion events of the immune system. Isolated polynucleotides and polypeptides related to GP286, vectors and host cells containing any of these, antibodies directed to GP286, cells producing such antibodies, and related diagnostic and therapeutic methods are described in US Pat. Provided by the present invention.

Description

【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年４月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／２８３，８１３号、および２０００年６月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／２１３，６３０号、から優先権を主張し、これらの仮特許出願の開示の各々は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーに関する。
【０００３】
（発明の背景）
生物体の細胞が互いに連絡し、これらの環境からの情報および刺激を得る機構は、この細胞表面上に発現される細胞膜レセプター分子を含む。細胞表面レセプターは細胞外シグナルを、細胞の生理学的応答に転換する第１必須連結である。多数のこのようなレセプターは、同定され、特徴付けられ、そして時折、保存構造モチーフ、およびシグナル伝達特性のような生物学的機能に基づいて、主要なレセプタースーパーファミリーに分類されてきた。
【０００４】
スーパーファミリーは、特定の程度の配列相同性（通常、少なくとも１５％）を共有するタンパク質のグループとして広く定義される。スーパーファミリーのメンバーによって共有される保存配列は、ドメインと称される緻密な三次構造の形成にしばしば寄与し、そしてしばしば特定のスーパーファミリーを特徴付けるドメインの全配列が単一のエキソンによってコードされる（例えば、Ａｂｂａｓら、ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．１９９７を参照のこと）。スーパーファミリーのメンバーは、分岐進化によって共通の前駆遺伝子に由来するようであり、マルチドメインタンパク質は、１つのより多いスーパーファミリーに属し得る。タンパク質スーパーファミリーの例としては、以下が挙げられる：リガンド依存性イオンチャネルレセプタースーパーファミリー、電位依存性イオンチャネルレセプタースーパーファミリー、レセプターチロシンキナーゼスーパーファミリー、レセプタータンパク質チロシンホスファターゼスーパーファミリー、Ｇタンパク質共役レセプタースーパーファミリー、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー。
【０００５】
免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、多種多様な機能を有する多数の構造的関連タンパク質を包含する。Ｉｇスーパーファミリー分子は、免疫系における認識、接着、および結合（例えば、Ａｂｂａｓら、前出、を参照のこと）、ならびに免疫系以外の他の機能を媒介する。免疫グロブリン重鎖および軽鎖にもともと由来する、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーは、部分的なアミノ酸配列の相同性および構造的特徴をＩｇ（例えば、いわゆる「Ｉｇドメイン」）と共有する。Ｉｇドメインは、約７０〜１１０個のアミノ酸残基および内部にＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を有する三次元的な球形構造である。これらのドメインは、２層のβプリーツシートを含み、各層は、５〜１０個のアミノ酸残基の３〜５の逆平行鎖から構成される。Ｉｇドメインは、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインのいずれかに対する最も近隣な相同性に基づいてＶ様またはＣ様として分類される。一般的な見解として、例えば、Ａｂｂａｓら、前出を参照のこと。
【０００６】
Ｉｇスーパーファミリーの最も同定されたメンバーは、細胞外部分、広く分岐する細胞質末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｔａｉｌ）において１つ以上のＩｇドメインを有する内在性原形質膜タンパク質（通常、内因性酵素活性を持たない）である。これらの総括に例外は存在する。Ｉｇスーパーファミリーメンバーの１つの反復特性は、（同じかまたは異なるアミノ酸配列の）異なるポリペプチド鎖におけるＩｇドメイン間の相互作用が、この分子の生物学的活性に必須であるということである。ヘテロフィリックな相互作用はまた、異なる細胞の表面上に発現される全体的に別個の分子におけるＩｇドメイン間で生じ得る。このような相互作用は、細胞−細胞結合を安定化する接着力を提供する。
【０００７】
Ｉｇスーパーファミリーの多数のメンバーは、脊椎動物の免疫系における細胞認識、接着および結合機能を媒介する細胞表面または可溶性分子である。Ｉｇスーパーファミリー分子を産生する２つの顕著な細胞型は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球である。免疫系において重要な例示的なＩｇスーパーファミリーメンバータンパク質としては、以下が挙げられる：抗体、Ｔ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子および主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２０（Ｂ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩ）、ＣＤ４４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１２１（ＩＬ−１Ｒ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ｐ−ＩｇＲ、ＮＣＡＭ、およびＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲ）（Ａｂｂａｓら、前出）。
【０００８】
Ｂリンパ球は、体液性免疫を担う。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子の遺伝子組換えは、Ｂ細胞の内部で生じる。Ｉｇ重鎖および軽鎖は、別個の遺伝子由来の領域から構成される。重鎖および軽鎖は両方とも、可変（Ｖ）セグメント、定常（Ｃ）セグメント、およびＢ細胞の変異の間に遺伝子組換えによってインフレームで連結される連結（Ｊ）セグメントを有する（Ａｂｂａｓら、１９９７）。さらに、重鎖は、多様性（Ｄ）セグメントと称されるさらなるセグメントを有する（Ａｂｂａｓら、１９９７）。この遺伝的再編成は、Ｉｇまたは抗体と称される機能的分子の発現を可能にする。遺伝子組換えの間、重鎖および軽鎖を作製するために用いられ得る大多数の遺伝子に起因して、抗原の膨大なアレイに特異性を有する過剰の抗体が産生され得る。
【０００９】
Ｂ細胞は、膜結合形態のＩｇおよび分泌形態のＩｇの両方ともを産生する。Ｂ細胞は、抗原がＢ細胞の表面上の膜結合抗体に結合する場合、「補助」Ｂ細胞が分泌形態で抗体を産生するのに必要な可溶性因子が存在する条件下で、免疫学的に活性化される。
【００１０】
Ｔリンパ球は、細胞媒介性免疫を担う。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターならびに多数のコレセプターおよび接着分子を介して抗原提示細胞と相互作用する場合、免疫学的に活性化される。Ｔ細胞レセプターは、不変のＣＤ３γタンパク質、ＣＤ３δ、ＣＤ３εタンパク質、およびＣＤ３ζタンパク質タンパク質と結合する可変性のαβレセプターまたはγδレセプターからなる多タンパク質複合体である。Ｔ細胞レセプターは、抗原提示細胞上のＭＨＣ抗体複合体を特異的に認識する（Ｃａｎｔｒｅｌｌら，１９９５，ｐｐ．１５１−１６３　ｉｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｉ．，Ｍ．Ｊ．ＯｗｅｎおよびＥ．Ｓｉｍｐｓｏｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ＭＨＣ認識に寄与する他のＴ細胞表面分子は、ＣＤ４およびＣＤ８を含むが、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＤ５およびＣＤ４４のような分子は、抗原産生細胞の表面上のＭＨＣ以外の分子を認識する。
【００１１】
Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、例えば、神経系における免疫組織および非免疫組織において同定され続けている。これらの保存された構造モチーフに基づいて、これらの新規Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、細胞認識、結合、および接着機能を同様に行うと考えられる。新規Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、免疫疾患、自己免疫疾患および免疫学的疾患の治療のための適切な標的である。なぜなら、Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、免疫系および非免疫系において他のＩｇスーパーファミリーメンバーとともに作用する。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、これまで未知であったＩｇスーパーファミリーメンバー（ＧＰ２８６と称される）をコードする遺伝子の発見に（少なくとも一部）基づく。（他に示さない限り、名前が小文字の場合（ｇｐ２８６）は、本発明の新規核酸をいい、これに対して名前が大文字の場合（ＧＰ２８６）は、本発明の新規ポリペプチドをいう）。（さらに、用語「ｇｐ２８６」および用語「ＧＰ２８６」は両方とも、本発明のスプライス改変体をいう。下記を参照のこと）。
【００１３】
以下に記載されるヒトｇｐ２８６　ｃＤＮＡ（配列番号１）は、１８６個のアミノ酸タンパク質（配列番号２）をコードする５５８塩基対のオープンリーディングフレームを有する。ヒトｇｐ２８６遺伝子は、第１９染色体上に位置し、そして１回膜貫通型ドメインおよびＮ末端中に１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン（そのタンパク質の細胞外部分）を有すると予測されるＧＰ２８６タンパク質をコードする。ｇｐ２８６　ｍＲＮＡは、Ｔリンパ球を富化し、そして種々の免疫系組織（例えば、末梢血リンパ球、リンパ節、胸腺および扁桃腺）において検出可能である。さらに、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡは、いくつかの非免疫組織において低いレベルで検出可能であり、これは、これらの非免疫組織へのＴ細胞の浸潤に起因するようである。ＧＰ２８６のタンパク質構造および組織分布は、免疫応答中の他の細胞または細胞外環境とＴ細胞の相互作用におけるＧＰ２８６についての役割を示す。ＧＰ２８６ａは、ＧＰ２８６のスプライス改変体であるようである。ＧＰ２８６と対照的に、ＧＰ２８６ａは、２７８個のアミノ酸タンパク質（配列番号１５）をコードする８３４個の塩基対のオープンリーディングフレーム（配列番号１４）を有する。ＧＰ２８６のように、ＧＰ２８６ａタンパク質は、１回膜貫通ドメインおよび１つの細胞外Ｉｇドメインを有することが予測される。
【００１４】
特定の細胞型に局在する新規Ｉｇスーパーファミリーメンバー（例えばＧＰ２８６；これは、Ｔ細胞中に高レベルで発現される）は、診断の目的のため、および法医科学において有用な細胞マーカーおよび組織マーカーである。組織特異的Ｉｇスーパーファミリーメンバーはまた、特に、例えば、組織損傷および組織傷害の後の組織発達の間または組織再生の間の、組織における不適切な細胞−細胞接着およびシグナル伝達に関連する異常な状態、障害および／疾患を処置するための適切な治療的標的である。例えば、ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａは、Ｔ細胞の細胞外マトリクス分子への細胞接着および他の細胞への細胞接着を媒介するのに有用である。
【００１５】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のＩｇドメインに対して、少なくとも８０％（８５％、９５％または９８％）同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列、または少なくとも１７個の核酸単位（例えば、ヌクレオチド）を有するそのフラグメントを有する。このようなフラグメントの例は、配列番号３、４、５、１６、２０、２２、２６、２８および３２である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のＩｇドメインに対して少なくとも８０％（８５％、９５％または９８％）同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列、または少なくとも１７個の核酸単位（例えば、ヌクレオチド）を有するそのフラグメントを有する。このようなフラグメントの例は、配列番号１８、２４および３０である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列、または少なくとも１７個の核酸単位を有するそのフラグメントを含む。このようなフラグメントの例は、配列番号３、４、５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２である。
【００１８】
本発明は、配列番号２または配列番号１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子改変体をコードするポリヌクレオチドを提供し、ここで、この核酸は、ストリンジェントな条件下で配列番号１、１３または１４のいずれかにハイブリダイズする。
【００１９】
本発明はまた、ＧＰ２８６の選択部分をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書において以下でさらに議論されるように、これらの「核酸フラグメント」を用いて、例えば、ＧＰ２８６の特定の部分（単独または融合タンパク質のエレメントとしてのいずれか）を発現し得る。核酸フラグメントはまた、領域特異的核酸プローブとして用いられ得る。
【００２０】
本発明はまた、配列番号２または配列番号１５のいずれかのアミノ酸配列によってコードされるＩｇドメインに対して少なくとも８０％（８５％、９５％または９８％）同一であるアミノ酸配列を含む単離されたＧＰ２８６タンパク質タンパク質を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１または配列番号１４のいずれかに対して少なくとも約６５％、好ましくは７５％、８５％または９５％同一である配列有するポリヌクレオチドによってコードされる単離されたＧＰ２８６タンパク質、および配列番号１または１４のいずれかの配列を有する核酸に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するポリヌクレオチドをコードする単離されたタンパク質を提供する。
【００２２】
本発明は、Ｉｇスーパーファミリーの他のメンバーをコードする核酸に関連してｇｐ２８６核酸を特異的に検出するｇｐ２８６ポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、核酸構築物（例えば、組換えベクター（例えば、発現ベクター））を提供し、このベクターは、本発明のｇｐ２８６ポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
本発明はまた、以下：（ｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または変異；（ｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子の調節不良（ｍｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）；および（ｉｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質の異常な翻訳後修飾、の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝子の損傷または変異の存在または非存在を同定するための診断アッセイを提供し、ここで、この遺伝子の野生型形態は、ＧＰ２８６の生物学的活性を有するタンパク質をコードする。
【００２４】
このような核酸構築物を含む宿主細胞もまた、提供され、ＧＰ２８６ポリペプチドが産生されるように組換え発現構築物を含む本発明の宿主細胞を、適切な培地中で培養することによって、ＧＰ２８６ポリペプチドを産生するための方法もまた同様に提供される。
【００２５】
単離されたＧＰ２８６タンパク質または組換えＧＰ２８６タンパク質および単離されたＧＰ２８６ポリペプチドまたは組換えＧＰ２８６ポリペプチドは、本発明によって提供される。好ましいＧＰ２８６タンパク質およびＧＰ２８６ポリペプチドは、天然のヒトＧＰ２８６によって保有される以下の（重複する）生物学的活性の少なくとも１つを保有する：（１）ＧＰ２８６タンパク質に自然に結合するリガンド（例えば、タンパク質レセプター、多糖類など）と相互作用する（例えば、結合する）能力；（２）天然のヒトＧＰ２８６に対する自己抗体または天然のヒトＧＰ２８６に対して生じる抗体に結合する能力；（３）Ｔリンパ球媒介機能（例えば、免疫発達におけるシグナル伝達機能）に関与する能力；ならびに（４）細胞−細胞相互作用（例えば、認識、結合および／または接着）を媒介する能力。
【００２６】
ＧＰ２８６タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、非ＧＰ２８６ポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列（例えば、タンパク質の安定性、検出、精製、または標的細胞へのインビボでの送達を促進する配列）に作動可能に連結して、ＧＰ２８６融合タンパク質を形成し得る。
【００２７】
本発明はさらに、以下を含む抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を特徴とする：ヒト化抗体および完全ヒト抗体（これは、ＧＰ２８６タンパク質またはその一部に特異的に結合する）。
【００２８】
上記のｇｐ２８６関連の単離されたポリヌクレオチド、ＧＰ２８６タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分、抗体または融合タンパク質は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に組み込まれ得る。
【００２９】
このような組成物は、異常なＧＰ２８６の細胞局在化、発現および／または活性に関連した被験体における障害、状態および疾患を改善するための治療方法に有用である。従って、本発明は、本発明のｇｐ２８６関連化合物またはｇｐ２８６関連組成物を投与する工程を包含する処置の方法を提供する。このような方法は、例えば、Ｔ細胞に作用する異常な状態、ならびに発生途中または成人の免疫系および／もしくは中枢神経系における細胞の認識、結合、シグナル伝達および接着機能に関連する障害または疾患を処置するために有用である。
【００３０】
本発明は、ＧＰ２８６の活性を調節する方法を提供する。この方法において、標的細胞は、ＧＰ２８６の活性またはＧＰ２８６の発現を調節（例えば、阻害または刺激）する因子と接触することによって、ＧＰ２８６の活性またはＧＰ２８６の発現を変更する。いくつかの実施形態において、この因子は、ＧＰ２８６に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、この因子は、ｇｐ２８６遺伝子の転写、ｇｐ２８６　ＲＮＡのスプライシング、またはｇｐ２８６　ｍＲＮＡの翻訳を調節することによってＧＰ２８６の活性またはＧＰ２８６の発現を調節する。他の実施形態において、この因子は、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡまたはｇｐ２８６遺伝子のコード鎖に対するアンチセンスである配列を有する核酸である。他の実施形態において、この因子は、ＧＰ２８６タンパク質、ＧＰ２８６タンパク質をコードする核酸、あるいはＧＰ２８６タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、ペプチド、擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、もしくは他の低分子）であり得る。
【００３１】
本発明は、生物学的サンプル（例えば、患者由来の流体サンプルもしくは組織サンプル）中のｇｐ２８６ポリヌクレオチド、ＧＰ２８６タンパク質またはその活性の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、このサンプルを、ｇｐ２８６ポリヌクレオチド配列、ＧＰ２８６タンパク質またはその活性の存在の指標を検出し得る因子と接触させることによる。
【００３２】
本発明はまた、ＧＰ２８６タンパク質に結合する化合物を同定するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、ＧＰ２８６タンパク質の生物学的活性を調節する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、試験化合物の存在下および非存在下でこのタンパク質の生物学的活性または発現を測定する工程およびこのタンパク質の活性を変更するこれらの化合物を同定する工程を包含する。コンビナトリアルライブラリーは、これらの方法において候補化合物の供給源として用いられ得る。
【００３３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウマまたはウシのような哺乳動物）に少なくともいくつかの細胞を提供する。このような動物は、その体細胞および／または生殖細胞のいくつかのみがこのポリヌクレオチドを保有するキメラ体であり得る。このような動物は、その体細胞および生殖細胞がこのポリヌクレオチドを保有する場合、代替的にトランスジェニックであり得る。
【００３４】
本発明はまた、ｇｐ２８６遺伝子の内因性オルソログが遺伝子ターゲティングによって破壊される（すなわち「ノックアウト」）非ヒト動物を提供する。ｇｐ２８６ポリヌクレオチド、生物学的サンプル（例えば、組織および流体）ならびにこれらおよび上述の動物由来のＧＰ２８６関連産物を含む細胞はまた、本発明の範囲内である。
【００３５】
本発明は、本発明の核酸配列およびアミノ酸配列をソーティングするコンピュータで読み取り可能な手段を提供する。コンピュータで読み取り可能な手段の記録は、配列の読み取りおよび表示について、ならびに本発明の配列の他の配列との比較、アライメントおよび順序付けについて評価し得る。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および上記の特許請求の範囲から明白である。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、これまで未知であったタンパク質（ＧＰ２８６）をコードする新規ヒト遺伝子の発見に少なくとも一部基づく。この遺伝子（ｇｐ２８６）を、ヒトゲノムの（「探索用の（ｍｉｎｉｎｇ）」）公開されている核酸配列のコンピュータによる分析によって同定した。ｇｐ２８６遺伝子は、代替的にスプライシングされ、そして通常、ヒト第１９染色体上の残基である。１つの転写物（ｇｐ２８６）は、４つのエキソンを含むが、ｇｐ２８６ａは、５つのエキソンを含む。エキソン２およびエキソン３は、ｇｐ２８６転写物およびｇｐ２８６ａ転写物の両方とも同一であり、そしてエキソン１は類似している；しかし、ｇｐ２８６はエキソン４を含むが、ｇｐ２８６ａはエキソン４ａ（これは、エキソン４の一部を含む）およびエキソン５を含む。この遺伝子から転写されたｇｐ２８６　ｍＲＮＡは、およそ９７１塩基長であり（５５８個の塩基対のオープンリーディングフレームを有する）、そして１８６個のアミノ酸残基であると予測されるタンパク質をコードする。この遺伝子から転写されるｇｐ２８６ａ　ｍＲＮＡは、およそ１０６５塩基長であり（８３４個の塩基対のオープンリーディングフレームを有する）、そして２７８個のアミノ酸残基であると予測されるタンパク質をコードする。この新規ＧＰ２８６タンパク質は、免疫系組織において主に発現される。
【００３８】
（定義）
本明細書中で用いられる場合、「核酸」（「ポリヌクレオチド」ともいう）とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。この用語はまた、非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド間結合または両方を含む、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。核酸は、任意のトポロジー構造であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分枝、ヘアピン、環状、またはパドロック構造であり得る。例えば、Ｂａｎｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１１−１５（２００１）；Ｅｓｃｕｄｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１４；９６（１９）：１０６０３−７（１９９９）；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５（５１８１）：２０８５−８　（１９９４）；Ｐｒａｓｅｕｔｈら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８９（１）：１８１−２０６（１９９９）；Ｆｏｘ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｉ．７（１）：１７−３７（２０００）；Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１８９−２０１（２０００）；Ｃｈａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（４）：２６７−８２（１９９７）を参照のこと。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、「単離された核酸」（「単離されたポリヌクレオチド」ともいう）は、その核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸である。特に、単離された、非組換え天然染色体およびその５００ｋｂを超えるフラグメントが排除される。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノム中の核酸に天然で隣接する配列を実質的に含まない。例えば、好ましい単離されたｇｐ２８６核酸は、単離された核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然で隣接する、約１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列に隣接する。
【００４０】
しかし、「単離された」は、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチド自体が天然の環境から物理的に取り出されたことを必ずしも必要としない。例えば、生物のゲノム中の内因性核酸は、異種配列（すなわち、この内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、その内因性核酸配列に隣接して配置され、この内因性核酸配列の発現が変化する場合に、本明細書中では「単離された」とみなされる。例として、非天然プロモーター配列が、（例えば、相同組換えによって）ヒトの細胞のゲノム中でｇｐ２８６遺伝子の天然のプロモーターに代えて置換され得て、その結果、この遺伝子は、変化した発現パターンを有する。この遺伝子は、天然で隣接する配列の少なくともいくつかから分離されているので、今や「単離された」ものになる。
【００４１】
核酸はまた、対応する核酸がゲノム中に天然には生じない任意の改変を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば、内因性のｇｐ２８６コード配列は、例えば、ヒトの介入により、人為的に導入される挿入、欠損または点変異を含む場合、「単離された」とみなされる。
【００４２】
「単離された核酸」はまた、宿主細胞の染色体中に非相同的部位で組みこまれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物、および宿主細胞染色体中に組みこまれた核酸構築物を含む。
【００４３】
さらに、「単離された核酸」は、組換え技術によって産生される場合に、他の細胞物質を実質的に含まないものであり得るか、もしくは培養培地を実質的に含まないものであり得るか、あるいは、化学的に合成される場合に、化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、全長ＧＰ２８６タンパク質をコードし得る場合に、「全長」とみなされる。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合に、句、参照核酸配列の「縮重改変体」とは、標準的な遺伝暗号に従って、翻訳されて、その参照核酸配列から翻訳された配列と同一のアミノ酸配列を提供し得る、核酸配列を含む。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合に、用語「マイクロアレイ」（「核酸マイクロアレイ」ともいう）は、基材に結合した複数の核酸を示し、結合した核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションは、個別に検出可能である。その基材は、固体構成もしくは多孔性構成、平面構成もしくは非平面構成、単一構成もしくは分散構成、または他の任意の構成であり得る。
【００４７】
そう規定される場合に、用語「マイクロアレイ」は、、Ｓｃｈｅｎａ（編）、ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；およびＳｃｈｅｎａ（編）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｂｏｏｋｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７（４）：１６６５−１６７０（２０００）において、このように呼ばれるかまたは同様に呼ばれる、全ての装置を含む。これら参考文献の全ての開示は、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
【００４８】
核酸ハイブリダイゼーションに関して本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」（「核酸プローブ」または「ハイブリダイゼーションプローブ」ともいう）は、検出可能に標識されているかまたは検出可能に標識されるように意図される、単離された既知の配列の核酸をいう。核酸マイクロアレイに関して本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」（等価には、「核酸プローブ」または「ハイブリダイゼーションプローブ」）は、基材に結合されるているかまたは基材に結合されるように意図されている。単離された核酸をいう。このような状況のいずれにおいても、用語「標的」は、配列相補性によって、プローブに結合することが意図される、核酸をいう。
【００４９】
他のように示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」は、（ｉ）配列番号Ｘの配列または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを少なくとも一部が有する核酸をいう。この２つの間の選択は、状況によって、決定される。例えば、核酸がプローブとして用いられる場合、この２つの間の選択は、プローブが所望される標的に相補的であるという必要条件によって決定される。
【００５０】
本明細書中での目的のために、「高ストリンジェンシー条件」は、溶液相でのハイブリダイゼーションについて、６５℃の６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ　ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％　ＳＤＳ中で、８−１２時間水性（すなわち、ホルムアルデヒドを含まない）ハイブリダイゼーションを行いその後の６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳで２０分間洗浄することとして規定される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、下記の多数の要因（ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性パーセントを含む）に依存して異なる速度で生じることが、理解される。
【００５１】
マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションについて、標準的な「高ストリンジェンシー条件」は、４２℃の加湿オーブン中において、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．２μｇ／μｌポリ（ｄＡ）、０．２μｇ／μｌヒトｃｏｔ１　ＤＮＡおよび０．５％　ＳＤＳ中で一晩ハイブリダイゼーションし、その後５５℃の１×ＳＳＣ、０．２％　ＳＤＳ中で５分間、次いで５５℃の０．１×ＳＳＣ、０．２％　ＳＤＳ中で２０分間マイクロアレイを連続洗浄することとして規定される。マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションについて、「中程度のストリンジェンシー条件」とは、構造的および機能的に関連したタンパク質をコードするｍＲＮＡにクロスハイブリダイゼーションするのに適しており、高ストリンジェンシー条件についての条件と同じであるが、ハイブリダイゼーションの温度を下げ、室温（約２５℃）で洗浄する。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、交換可能に使用されて、天然に存在するかまたは合成されたアミノ酸のポリマーを長さに関わりなく示し、ここで、本明細書中のアミノ酸は、ペプチド結合に関与できる、天然に存在するアミノ酸、天然に存在するアミノ酸の構造改変体、および合成された天然に存在しないアナログを含む。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、翻訳後および合成後の修飾（例えば、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸の切断反応およびグリコシル化）を、明示的に許容する。
【００５３】
本明細書中において、用語「オリゴペプチド」は、アミノ酸残基２５以下を有する、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを示す。
【００５４】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドは、単離されたポリヌクレオチドによってコードされる場合；天然には見られない純度で存在する場合（ここで、純度は、他の細胞物質の存在に関して判断され得る）；および／または天然には見出されないアミノ酸アナログもしくはアミノ酸誘導体、または標準的ペプチド結合以外の連結を含む場合に、「単離された」とみなされる。このように規定される場合「単離された」は、そのように記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、天然の環境から物理的に取り出されたことを必ずしも必要としない。
【００５５】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドは、少なくとも６５％（例えば、少なくとも７５％、８５％または９５％）の濃度（組成物中の総タンパク質に関する質量に基づいて測定される）で存在する場合に、本明細書中において「精製された」とみなされる。濃度が少なくとも８５％である場合に、ンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドは、「実質的に精製されたとみなされる。
【００５６】
本明細書中において用いられる場合、「オルソログ」は、異なる生物種における、同じ遺伝子の別個の存在のことである。この別個の存在は、類似したアミノ酸配列または同一のアミノ酸配列を有し、ここで配列の類似性の程度は、その同じ遺伝子を有する共通の祖先からの、種の進化距離に部分的に依存する。
【００５７】
本明細書中で用いられる場合、用語「パラログ」は、１つの生物種における１つの遺伝子の別個の存在のことである。この別個の存在は、類似したアミノ酸配列または同一のアミノ酸配列を有し、ここで配列の類似性の程度は、この存在を生じる遺伝子複製事象からの、これらの別個の存在の進化距離に部分的に依存する。
【００５８】
用語「ホモログ」（「相同体」ともいう）は、「オルソログ」および「パラログ」を含む。
【００５９】
「相同性」アミノ酸配列は、保存性アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、このポリペプチドは、実質的に同じ結合性および／または活性を有する。しかし、相同性アミノ酸配列は、他の既知のＩｇスーパーファミリーメンバーをコードするアミノ酸配列を含まない。相同性（同一性％）は、例えば、デフォルト設定を用いるＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）によって、決定され得る（このＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２−４８９（１９８１）（これは本明細書中において、その全体が参考として援用される））のアルゴリズムを使用する）。
【００６０】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、完全な抗体（２つの重鎖および２つの軽鎖からなる）またはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントとしては、そのフラグメントが抗原に特異的に結合できる限り、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々のプロテアーゼを用いた消化によって生じたフラグメント、化学的切断および／または化学的解離によって生じたフラグメント、ならびに組換え的産生されたフラグメント。これらのフラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。
【００６１】
配列が改変されているが、抗原に特異的に結合でき得る抗体もまた、用語「抗体」の範囲内にある。改変抗体の例は、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合物；ならびにヘテロマー抗体複合体（例えば、ディアボディ（ｄｉａｂｉｄｙ）（二重特異的抗体）、単鎖ディアボディおよびイントラボディ）である（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ（編）、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４１５１３）（この開示は、本明細書中においてその全体が援用される）を参照のこと）。
【００６２】
「特異的結合」は、２つの分子が、環境中の他の分子への結合に優先して互いに結合する、能力をいう。典型的には、「特異的結合」は、反応中の偶然の結合より、少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍、識別する。典型的に、特異的結合反応のアフィニティーまたはアビディティは、少なくとも約１０−７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ）である。
【００６３】
用語「領域」は、生体分子の１次構造の物理的に連続した位置を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した位置によって規定される。
【００６４】
用語「ドメイン」は、生体分子の公知の機能または推測される機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、それらの領域またはそれらの部分と同一の広がりであり得；ドメインはまた、生体分子の異なる非連続的な領域も含み得る。ＧＰ２８６タンパク質ドメインの例としては、細胞外ドメイン（すなわち、Ｎ末端）、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン（すなわち、Ｃ末端）が挙げられるがこれれに限定されない。細胞外ドメインは、例えば、Ｉｇドメインおよびシグナル配列ドメインに、さらに細区画され得る。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」は、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるがこれらに限定されない任意の分子を意味し、このような化合物は、天然または合成であり得る。
【００６６】
他に規定がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例示的な方法および材料が、以下で記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料もまた、本発明の実施において使用され得、そしてそれらは、当業者には明白である。本明細書中で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それら全体が参考として援用される。矛盾している場合、定義を含む本明細書が、支配する。これらの材料、方法および実施例は、例示でのみあり、制限されることを意図しない。
【００６７】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示している標準的な参考資料としては、以下が挙げられる：Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９８および２００１に補遺）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら、編，ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＡＮＤ　ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，編，ＤＩＲＥＣＴＥＤ　ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）。当業者に公知の免疫学の一般的な原理を示している標準的な参考資料としては、以下が挙げられる：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；Ｒｏｉｔｔら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｅｕｒｏｐｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３）。
【００６８】
当業者に公知の医療の生理学および薬理学の一般的な原理を示している標準的な参考資料としては、以下が挙げられる：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＯＦ　ＩＮＴＥＲＮＡＬ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ，第１４版，（Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｓ．Ｆａｕｃｉｅｔら、編），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９８。
【００６９】
（ＧＰ２８６関連核酸）
第１の一連の核酸の実施形態において、本発明は、ＧＰ２８６タンパク質全体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。上記のように、本発明の「全長」ポリヌクレオチドは、特に、全長ＧＰ２８６タンパク質を発現するために使用され得る。全長ポリヌクレオチドはまた、プローブとして（核酸プローブとして）使用され得、これらの実施形態の単離されたポリヌクレオチドは、ｇｐ２８６にハイブリダイズする。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号１、１３または１４のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１、１３または１４のヌクレオチド配列の縮重改変体、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体。配列番号１および配列番号１４は、それぞれ、５’非翻訳（ＵＴ）領域および３’ＵＴ領域を含む、ｇｐ２８６およびｇｐ２８６ａの全体のｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１３は、５’非転写領域および３’非転写領域を含む、ｇｐ２８６のゲノムＤＮＡ配列を示す。
【００７１】
他の実施形態において、本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号３、４、５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０または３２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列の縮重改変体、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体。
【００７２】
配列番号３は、ＣＲ２−０３７（配列番号７）プライマーおよびＣＲ２−０３８（配列番号８）プライマーを用いて、ヒト胸腺ｍＲＮＡから増幅されたｇｐ２８６のＲＴ−ＰＣＲフラグメントを示し；配列番号４は、ＣＲ２−１４６プライマー（配列番号９）およびＡＰ−１プライマー（配列番号１１）を使用して、ヒト胸腺ｃＤＮＡの増幅から生じた５’ＲＡＣＥ産物を示し；配列番号５は、ＣＲ２−１４８プライマー（配列番号１０）およびＡＰ−１プライマーを用いて、ヒト胸腺ｃＤＮＡの増幅から生じた３’ＲＡＣＥ産物を示し；配列番号１６は、ＧＰ２８６の細胞外部分をコードする核酸配列を示し；配列番号１８は、ＧＰ２８６ａの細胞外部分をコードする核酸配列を示し；配列番号２０は、ＧＰ２８６のＩｇ様ドメインをコードする核酸配列を示し；配列番号２２は、ＧＰ２８６の細胞内ドメインをコードする核酸配列を示し；配列番号２４は、ＧＰ２８６ａの細胞内ドメインをコードする核酸配列を示し；配列番号２６は、Ｉｇ様ドメインのＮ末端のアミノ酸を含まないＧＰ２８６の細胞外ドメインをコードする核酸配列を示し；配列番号２８は、Ｉｇ様ドメインのＮ末端のアミノ酸をコードする部分を含まないＧＰ２８６をコードする核酸配列を示し；配列番号３０は、Ｉｇ様ドメインのＮ末端のアミノ酸をコードする部分を含まないＧＰ２８６ａをコードする核酸配列を示し；そして、配列番号３２は、ＧＰ２８６の膜貫通ドメインをコードする核酸配列を示す。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号２または配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号２または配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体。配列番号２は、配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるＧＰ２８６のアミノ酸配列を提供する。配列番号１５は、配列番号１４のｃＤＮＡによってコードされるＧＰ２８６ａのアミノ酸配列を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号２または配列番号１５の配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、（ｉｉ）保存的なアミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号１５の配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体である、ヌクレオチド配列。
【００７５】
（ＧＰ２８６の一部をコードする核酸）
第２の一連の核酸の実施形態において、本発明は、ｇｐ２８６の選択部分をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書中以下でさらに議論されるように、これらの核酸分子は、特に、ＧＰ２８６の特定の部分を発現するために使用され得る。これらの核酸分子はまた、特に、領域特異的核酸プローブとしても使用され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、またはそれらの相補体は、ＧＰ２８６のＮ末端細胞外部分に特徴的なＩｇドメインを少なくとも１コピー有するポリペプチドをコードする。詳細には、細胞外Ｉｇドメイン（配列番号２１）は、配列番号１のｇｐ２８６　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１１９〜３５４（図１参照）、および配列番号１４のヌクレオチド１１８〜３５３（図２参照）によってコードされる。
【００７７】
好ましくは、単離されたポリヌクレオチド（または、それらの相補体）はまた、膜を通るそのコードされたポリペプチドの輸送を媒介する、シグナル分泌配列をコードする。ｇｐ２８６シグナル分泌配列は、配列番号１のｇｐ２８６　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２６〜７６（配列番号２のアミノ酸１〜１７；図１参照）、および配列番号１４のｇｐ２８６ａ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１０〜７５（配列番号１５のアミノ酸１〜２２；図２参照）によってコードされる。より好ましくは、本発明の単離されたポリヌクレオチドのシグナル分泌配列は、ｇｐ２８６由来である。
【００７８】
上記の好ましい、単離されたポリヌクレオチドは、そのコードされたポリペプチドの膜への挿入がかなり望まれる場合に、必要に応じて、膜貫通ドメインをコードし得る。膜貫通ドメインは、ｇｐ２８６もしくはｇｐ２８６ａによってコードされ得るか（以下を参照）、または異種膜関連タンパク質の膜貫通ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。
【００７９】
所望な場合、上記の好ましい、単離されたポリヌクレオチドは、ＧＰ２８６結合相互作用応答する特定のシグナル伝達反応が望まれる場合、細胞内Ｃ末端ドメインをさらに含み得る。細胞内ドメインは、ｇｐ２８６もしくはｇｐ２８６ａによってコードされ得るか（以下を参照）、または異種膜関連タンパク質の細胞内ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドの他の好ましい実施形態は、ＧＰ２８６の膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補体である。詳細には、ＧＰ２８６膜貫通ドメインは、配列番号１のｇｐ２８６　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド４４３〜５０５（図１参照）、および配列番号１４のｇｐ２８６ａ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド４４２〜５０４（図２参照）によってコードされる。配列番号３３は、配列番号３２によってコードされるＧＰ２８６の膜貫通ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００８１】
上記核酸のさらに他の好ましい実施形態は、ＧＰ２８６の（Ｃ末端）細胞内ドメインを有するポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの相補体である。詳細には、ＧＰ２８６の細胞内ドメインは、配列番号１のｇｐ２８６　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５０６〜５８３（図１参照）によってコードされる。ＧＰ２８６ａの細胞内ドメインは、配列番号１４のｇｐ２８６ａ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５０５〜８４３（図２参照）によってコードされる。配列番号２３は、配列番号２２によってコードされるＧＰ２８６の細胞内ドメインのアミノ酸配列を示し、一方、配列番号２５は、配列番号２４によってコードされるＧＰ２８６ａの細胞内ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００８２】
ＧＰ２８６とＧＰ２８６ａとの間の最も有意な差異は、タンパク質のＣ末端細胞質部分である。ＧＰ２８６が約２６アミノ酸の細胞質テイルを有するのに対して、ＧＰ２８６ａは、約１１３アミノ酸の細胞質テイルを有する。さらに、ＧＰ２８６ａは、タンパク質リン酸化の潜在的部位である、細胞質テイル中の３つのチロシン残基を有する。この知見は、ＧＰ２８６ａがリン酸化され得、それによって、ＧＰ２８６ａがＴ細胞中のシグナル伝達において重要な役割を果たすようであることを強く示唆する。ＧＰ２８６はまた、レセプターのようであるが、リン酸化されないようである。いかなる特定の理論に束縛されないが、例えば、Ｉｇドメインを含む、タンパク質の細胞外部分は、細胞外分子からシグナルを受け取り得、そして、このシグナルは、細胞質ドメインを通って伝達されて、Ｔ細胞中で応答（例えば、増殖応答または分化応答）を誘発する。
【００８３】
本発明の好ましい単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３により表される。配列番号３は、エキソン２、３の一部にまたがり、これらのエキソンは、ｇｐ２８６およびｇｐ２８６ａの両方に同一である。実施例３を参照のこと。
【００８４】
本発明の他の好ましい単離されたポリヌクレオチドとして、ｇｐ２８６とｇｐ２８６ａとを区別するポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書の教示に従い、当業者は、スプライス改変体特異的ポリヌクレオチドが、１つのスプライス改変体由来の配列のみを含み、他の改変体由来の配列を含まないポリヌクレオチドであり得ることを認識する。他のスプライス改変体特異的ポリヌクレオチドとして、例えば、異なるスプライス改変体間の大きさの差を利用するために用いられ得るポリヌクレオチドが挙げられる。スプライス改変体特異的ポリヌクレオチドの例として、配列番号２２（ｇｐ２８６）の３’の２５ヌクレオチドおよび配列番号２４（ｇｐ２８６ａ）の３’の２８６ヌクレオチドにより表されるポリヌクレオチドが挙げられるが、他の例もまた本明細書中に開示される。
【００８５】
（クロスハイブリダイゼーション核酸）
核酸の実施形態の別のシリーズにおいて、本発明は、本発明の種々のｇｐ２８６核酸にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらの「クロスハイブリダイゼーション核酸」は、特に、本発明のｇｐ２８６に関連するタンパク質（さらに、アイソフォーム、ホモログ、パラログ、またはオルトログについても同様）に対するプローブとして、およびこのタンパク質の発現を駆動するために、使用され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号３、配列番号３の相補体、またはそれらの少なくとも１７核酸ユニットを有するそれらのフラグメントを含むヌクレオチド配列を有するプローブにハイブリダイズする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００８７】
（好ましい核酸）
免疫系の組織において発現される核酸（または、その相補鎖が発現される核酸）は、上記の核酸の中で特に好ましい。上述のような、ｇｐ２８６の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸（または、その相補鎖がこの活性を有するペプチドをコードする核酸）もまた、上記の核酸の中で特に好ましい。
【００８８】
（核酸フラグメント）
核酸の実施形態の別のシリーズにおいて、本発明は、特に、単独でかまたは融合タンパク質のエレメントとしてＧＰ２８６の特定の一部を発現させ、そしてエピトープタンパク質フラグメントまたは免疫原性タンパク質フラグメントの発現または合成を指示するために、領域特異的核酸プローブとして、増幅プライマーとして有用性を示す、本発明の種々の単離されたポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１または１４から選択される連続する核酸配列の少なくとも１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、この単離されたポリヌクレオチドは、約１００ｋｂ長以下、代表的には約７５ｋｂ長以下、より代表的には約５０ｋｂ長以下である。しばしば、これらの実施形態の単離されたポリヌクレオチドは、約２５ｋｂ長以下であり、しばしば約１５ｋｂ長以下であり、そして頻繁に約１０ｋｂ長以下である。さらにより好ましくは、この単離されたポリヌクレオチドは、５０００塩基対以下であり、しばしば１０００塩基対以下、５００塩基対、１００塩基対、または５０塩基対である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号２または１５のいずれかの少なくとも８連続するアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または１５のいずれかの少なくとも８連続するアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｉ）または（ｉｉ）の相補鎖であるヌクレオチド配列、を含む単離された核酸を提供する。ここで、この単離された核酸は、約１００ｋｂ長以下であり、代表的には約７５ｋｂ長以下であり、より代表的には約５０ｋｂ長以下である。しばしば、これらの実施形態の単離された核酸は、約２５ｋｂ長以下であり、しばしば約１５ｋｂ長以下であり、そして頻繁に約１０ｋｂ長以下である。さらにより好ましくは、これらの単離されたポリヌクレオチドは、５０００塩基対以下であり、しばしば１０００塩基対以下、５００塩基対以下、１００塩基対以下、または５０塩基対以下である。
【００９１】
（単一エキソンプローブ）
本発明はさらに、ｇｐ２８６遺伝子の１つのみのエキソンの一部を有する、ノム由来の単一エキソンプローブを提供する。単一エキソンプローブは、スプライス改変体の同定および特徴付けにおいて特定の有用性を有する。特に、このような単一エキソンプローブは、ｇｐ２８６の異なるアイソフォームの発現を同定および識別するために有用である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１、１３、もしくは１４；または配列番号１、１３、もしくは１４の相補鎖の、以下のエキソン特異的部分の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。ここで、この部分は、配列番号１、１３、もしくは１４、またはそれらの相補鎖の部分のいずれか１つの少なくとも１７連続ヌクレオチド、１８連続ヌクレオチド、２０連続ヌクレオチド、２４連続ヌクレオチド、２５連続ヌクレオチド、または５０連続ヌクレオチドを含む。
【００９３】
【表１】

Figure 2004501630
（転写制御核酸）
別の局面において、本発明は、ｇｐ２８６遺伝子の転写を制御する核酸配列エレメントを含む、ゲノム由来の単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらの核酸は、特に、組み換え構築物中の異種コード領域の発現を駆動するために使用され得、従って、このような異種コード領域に、ネイティブｇｐ２８６遺伝子の発現パターンを与える。これらの核酸はまた、逆に、ｇｐ２８６のゲノム遺伝子座に異種転写制御エレメントを標的化するために使用され得、ｇｐ２８６遺伝子自体の発現パターンを変化させる。
【００９４】
このような実施形態の第１のシリーズにおいて、本発明は、配列番号１３のヌクレオチド１〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１〜１５９；配列番号１３のヌクレオチド１〜１７０；配列番号１３のヌクレオチド１５９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１７０〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド４２０９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７７３８〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７８７４〜１０５００もしくは配列番号１３のヌクレオチド９６６９〜１０５００；またはこのような配列の相補鎖を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、この単離された核酸は、約１００ｋｂ長以下であり、代表的には約７５ｋｂ長以下であり、より代表的には約５０ｋｂ長以下である。しばしば、これらの実施形態の単離された核酸は、約２５ｋｂ長以下であり、しばしば約１５ｋｂ長以下であり、そして頻繁に約１０ｋｂ長以下である。さらにより好ましくは、これらの単離されたポリヌクレオチドは、５０００塩基対以下であり、しばしば１０００塩基対以下、５００塩基対以下、１００塩基対以下、または５０塩基対以下である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１３のヌクレオチド１〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１〜１５９；配列番号１３のヌクレオチド１〜１７０；配列番号１３のヌクレオチド１５９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１７０〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド４２０９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７７３８〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７８７４〜１０５００もしくは配列番号１３のヌクレオチド９６６９〜１０５００；またはこのような配列の相補鎖の、少なくとも１７、１８、２０、２４、または２５ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、この単離された核酸は、約１００ｋｂ長以下であり、代表的には約７５ｋｂ長以下であり、より代表的には約５０ｋｂ長以下である。しばしば、これらの実施形態の単離された核酸は、２５ｋｂ長以下であり、しばしば約１５ｋｂ長以下であり、そして頻繁に約１０ｋｂ長以下である。さらにより好ましくは、これらの単離されたポリヌクレオチドは、５０００塩基対以下であり、しばしば１０００塩基対以下、５００塩基対以下、１００塩基対以下、または５０塩基対以下である。
【００９６】
配列番号１３のヌクレオチド１〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１〜１５９；配列番号１３のヌクレオチド１〜１７０；配列番号１３のヌクレオチド１５９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド１７０〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド４２０９〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７７３８〜１０５００；配列番号１３のヌクレオチド７８７４〜１０５００もしくは配列番号１３のヌクレオチド９６６９〜１０５００を含む単離されたポリヌクレオチドの各々は、ｇｐ２８６遺伝子の発達特異的および組織特異的な発現および調節を媒介する転写制御配列を含む。このような転写制御配列は、それらに作動可能に連結された異種核酸配列に、このような発達特異的および組織特異的な発現パターンを与えるために有用である。
【００９７】
（ｇｐ２８６核酸分子に関する他の規定された特徴）
本明細書中に詳細に示される全ての核酸配列は、デオキシリボヌクレオチドの配列として示される。しかし、示される配列は、ポリヌクレオチド組成物に適するように解釈されることが意図される：例えば、単離された核酸がＲＮＡで構成される場合、示される配列は、リボヌクレオチドを意図し、チミジンがウリジンで置換される。
【００９８】
多型（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））は、真核生物ゲノムにおいて頻繁に発生する。１，４００，０００より多いＳＮＰが、ヒトゲノムにおいてすでに同定されており（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ　４０９：８６０−９２１（２００１））、そして１つの種の１つの個体から決定された配列は、その集団に存在する他の対立遺伝子形態と異なり得る。あるいは、単一ヌクレオチド多型ではなく小さな欠失および挿入は、全体的な集団においてまれではなく、しばしばそのタンパク質の機能を変更しない。
【００９９】
従って、本発明は、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１および１４）に配列において同一な単離されたポリヌクレオチドを提供するだけでなく、それらの詳細に記載される核酸配列の対立遺伝子改変体である単離されたポリヌクレオチドもまた提供することが特に強調される。さらに、本発明は、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約６５％同一であり、代表的には、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であり、有用に、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％同一であり、より有用に本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、そして最も保存的には、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一である、ｇｐ２８６のホモログ（例えば、パラログおよびオルトログ）を提供する。これらの配列改変体は天然に存在し得るか、または無作為変異誘発または特異的変異誘発によるようなヒトの介入により生じ得る。
【０１００】
本明細書における目的のために、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｔａｔｉａｎａら、「Ｂｌａｓｔ　２　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ　ｎｅｗ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順を用いて決定される。この手順は：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにてオンラインで利用可能なコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２　ＳＥＱＵＥＮＣＥＳにより達成される。核酸配列のパーセント同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴ２　ＳＥＱＵＥＮＣＥＳのＢＬＡＳＴＮモジュールが、以下のデフォルト値で使用され、そして両方の配列は、それらの全体において入力される：（ｉ）リワード　フォー　ア　マッチ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ａ　ｍａｔｃｈ）：１；（ｉｉ）ペナルティー　フォー　ア　ミスマッチ（ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ａ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）：−２；（ｉｉｉ）オープンギャップ５およびエクステンションギャップ２ペナルティー；（ｉｖ）ギャップＸ＿ドロップオフ５０エクスペクト１０ワードサイズ１１フィルター。
【０１０１】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントの発現に有用であり、従って、本発明は、ＧＰ２８６タンパク質およびその一部をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する（本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において同一なポリヌクレオチドだけでなく、それらの縮重改変体も同様に提供する）。周知のように、遺伝暗号は縮重し、そして最適な発現のためのコドンの選択は種間で変化する。また、周知のように、アミノ酸置換は、天然の対立遺伝子改変体の間で頻繁に生じ、しばしば保存的置換は、タンパク質機能において最小の変化しか生じない。
【０１０２】
従って、本発明は、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において同一のポリヌクレオチドだけでなく、保存的アミノ酸置換または中程度の保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ２８６およびその一部分をコードするポリヌクレオチドもまた提供する。
【０１０３】
保存的アミノ酸置換と呼ぶために種々の基準が存在するが（主に、進化的に関連するタンパク質間で観察される変化か、または予想される化学的類似性かのいずれかに基づく）、本明細書における目的のためには、保存的置換は、本明細書の以下に複写したＰＡＭ２５０対数尤度行列（Ｌｏｇ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ　ｍａｔｒｉｘ）におけるポジティブ値を有する任意の変化である（Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６（５０６２）：１４４３−５（１９９２）を参照のこと）。
【０１０４】
【表２】
Figure 2004501630
本明細書における目的のために、「中程度の保存的」置換は、本明細書の上に複写したＰＡＭ２５０対数尤度行列においてマイナスではない値を有する任意の変化である。
【０１０５】
生物学的活性の重度の減少または除去を回避するために、種々の種のＧＰ２８６タンパク質間またはＩｇファミリーメンバー間で保存されるアミノ酸残基は、遺伝子操作時に変更されない（保存的置換を除く）。例えば、ＧＰ２８６のＩｇドメインを維持するために、システイン残基は保存されるべきである。
【０１０６】
ポリヌクレオチドの関係はまた、機能的試験を用いて、規定のハイブリダイゼーションストリンジェンシーにおいて２つのポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力が特徴付けられ得る。従って、本発明は、本明細書中で詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において同一であるだけでなく、本発明の種々の単離されたｇｐ２８６ポリヌクレオチド（「参照核酸」）の全てまたは一部分に高ストリンジェンシー条件（本明細書で規定されるような）下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド（「クロスハイブリダイゼーションする核酸」）を提供するための、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１０７】
このようなクロスハイブリダイゼーションする核酸は、特に、本発明のタンパク質に関連するタンパク質（例えば、選択的スプライス改変体およびホモログ（例えば、オルトログおよびパラログ））のためのプローブ、およびこのようなタンパク質の発現を駆動するために有用である。特に有用なオルトログは、他の霊長類種（例えば、チンパンジー、アカゲザル、ヒヒ、オラウータン、およびゴリラ）由来；げっ歯類由来（例えば、ラット、マウス、モルモット）；ウサギ目由来（例えば、ウサギ）、および家畜由来（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ）のオルトログである。
【０１０８】
参照核酸のハイブリダイズする部分は、代表的に、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、しばしば少なくとも１７、２０、２５、３０、３５、４０、または５０ヌクレオチド（ｎｔ）長である。参照核酸のより大きな部分（例えば、少なくとも５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔ以上であり、参照核酸の全長以下の部分）にハイブリダイズするクロスハイブリダイゼーションする核酸もまた、有用である。
【０１０９】
クロスハイブリダイゼーションする核酸のハイブリダイズする部分は、参照核酸の少なくとも一部分と配列において少なくとも７５％同一である。代表的に、クロスハイブリダイゼーションする核酸のハイブリダイズする部分は、参照核酸の少なくとも一部分と配列において、少なくとも８０％、しばしば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または少なくとも９０％さえも同一である。しばしば、クロスハイブリダイゼーションする核酸のハイブリダイズする部分は、参照核酸配列の少なくとも一部分と配列において、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。時々、クロスハイブリダイゼーションする核酸のハイブリダイズする部分は、参照核酸の少なくとも一部分と配列において、少なくとも９９．５％同一である。
【０１１０】
本発明はまた、本発明の種々の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸のフラグメントを提供する。参照核酸の「フラグメント」により、本明細書ではこの参照核酸配列の一部分に対するヌクレオチド配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドまたは核酸（どのくらい獲得されていても）が意図される。この一部分は、少なくとも１７ヌクレオチドであり、そして参照核酸全体より短い。
【０１１１】
理論上、１７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、３０億塩基のヒトゲノムに１つ未満の頻度で無作為に生じるのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり、従って、哺乳動物ゲノム複雑度を有する核酸混合物中の参照配列を特異的に同定し得る核酸プローブを提供するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドである。さらなる特異性は、部分ゲノムの複雑度の核酸サンプルをプローブすることにより、および／または１７ヌクレオチドと同じくらい短い長さの複数のフラグメントを集合的に用いて、核酸の増幅をプライムすることにより（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により）獲得され得る。
【０１１２】
本発明の核酸プローブは、ホモログまたは同一なタンパク質をコードするＲＮＡ転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。このプローブは、それらに結合された標識基（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子）を含み得る。このようなプローブは、（ｉ）ＧＰ２８６タンパク質を誤発現する（例えば、異常なスプライシング、異常なｍＲＮＡレベル）か、または（ｉｉ）ｇｐ２８６遺伝子中に変異（例えば、欠失、挿入、または点変異）を有する細胞または組織を同定するための診断キットの一部として使用され得る。このような診断キットは、好ましくは、標識試薬およびそれらの使用のための説明書を含む。
【０１１３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、ＰＣＲ、プライマー伸長などにおいてプライマーとして用いられ得る。プライマーとして有用であるために、このポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも６ヌクレオチド長（例えば、少なくとも７、８、９、または１０ヌクレオチド長）であり得る。このプライマーは、例えば、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの増幅のために、ｇｐ２８６遺伝子のエキソン配列にハイブリダイズし得る。あるいは、このプライマーは、ｇｐ２８６遺伝子のゲノム構造の非転写部分（例えば、調節部分）を利用するために、ｇｐ２８６遺伝子のイントロン配列または上流もしくは下流調節配列にハイブリダイズし得る。
【０１１４】
本発明の核酸プライマーはまた、例えば、ＳＮＰ検出のための一塩基伸長（ＳＢＥ）をプライムするために使用され得る（例えば、本明細書中で、開示がその全体において参考として援用される、米国特許第６，００４，７４４号を参照のこと）。等温増幅アプローチ（例えば、ローリングサークル増幅）もまた、現在十分に記載されている。例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：２１−７（２００１）；米国特許第５，８５４，０３３号および同第５，７１４，３２０号、ならびに国際特許公開ＷＯ　９７／１９１９３およびＷＯ　００／１５７７９を参照のこと（これらの開示は、本明細書中でその全体において参考として援用される）。ローリングサークル増幅は、ＳＮＰ検出を容易にする他の技術と組み合わせられ得る。例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．１９（３）：２２５−３２（１９９８）を参照のこと。
【０１１５】
以下に記載されるように、少なくとも６連続アミノ酸をコードする核酸フラグメント（すなわち、１８ヌクレオチド以上のフラグメント）は、参照核酸によりコードされるタンパク質のエピトープをマッピングする際に有用性を有するペプチドの発現または合成を指示する上で有用である。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２（１９８４）；ならびに米国特許第４，７０８，８７１号および同第５，５９５，９１５号を参照のこと。
【０１１６】
そして、以下に記載されるように、少なくとも８続アミノ酸をコードする核酸フラグメント（すなわち、２４ヌクレオチド以上のフラグメント）は、免疫原として有用性を有するペプチドの発現または合成を指示する上で有用である。例えば、Ｌｅｒｎｅｒ、「Ｔａｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ　２９９：５９２−５９６（１９８２）；Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：４２５−４６（１９８３）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６（１９８３）を参照のこと。
【０１１７】
従って、本発明の核酸フラグメントは、少なくとも１７ヌクレオチド長、代表的には少なくとも１８ヌクレオチド長、そしてしばしば少なくとも２４、２５、３０、３５、４０、または４５ヌクレオチド（ｎｔ）長である。当然、少なくとも５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔまたはそれ以上を有するより大きなフラグメントもまた有用であり、そして当業者に認識されるように、時には好ましい。
【０１１８】
発現されるメッセージの調査に基づくというよりもゲノム配列の採掘（ｍｉｎｉｎｇ）に基づき、本発明はさらに、ｇｐ２８６遺伝子の部分を含む単離されたゲノム由来のポリヌクレオチドまたは核酸を提供する。本発明は特に、ゲノム由来の単一エキソンプローブを提供する。このプローブは、エキソン（「参照エキソン」）の少なくとも一部分を含み、そして高ストリンジェンシー条件下で、参照エキソンを含む転写物由来の核酸に検出可能にハイブリダイズし得る。しかし、この単一エキソンプローブは、高ストリンジェンシー条件下で、参照エキソンを欠くがゲノムにおいて参照エキソンに隣接して見いだされる１つ以上のエキソンを含む核酸に検出可能にハイブリダイズしない。
【０１１９】
本発明はまた、ｇｐ２８６遺伝子の転写を制御する核酸配列エレメントを含む単離されたゲノム由来のポリヌクレオチドまたは核酸を提供する。転写制御配列として、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター、サイレンサーなどが挙げられる。
【０１２０】
転写または翻訳のアンチセンス阻害における使用が所望される場合、あるいは酵素的核酸分子（例えば、リボザイム）のアンチセンス媒介標的化が所望される場合、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび核酸は、有用に、１つ以上の改変塩基（以下を参照のこと）および／または１つ以上の改変もしくは変更されたヌクレオシド間結合を含み得、これらは、しばしば、ヌクレアーゼ耐性を提供する。Ｈａｒｔｍａｎｎら（編），　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ），　Ｋｌｕｗｅｒ　Ｌａｗ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　（１９９９）（ＩＳＢＮ：　０７９２３８５３９Ｘ）；Ｓｔｅｉｎら（編），Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（ｃｏｖｅｒ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０４７１１７２７９０）；Ｃｈａｄｗｉｃｋら（編），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｇｅｎｔｓ−Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｎｏ．２０９，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ　Ｌｔｄ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４７１９７２７９７）を参照のこと。このような改変された塩基およびヌクレオシド間結合は、Ｇａｍｐｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２８（２１）：４３３２−９（２０００）（この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、本発明の単離された核酸が標的遺伝子修正のために使用される場合にもまた、しばしば所望される。
【０１２１】
本発明のアンチセンス核酸分子（およびアンチセンスによって標的化された酵素的核酸）は、治療設定において使用され得る。これらの分子は、作動可能に連結された転写調節配列を含む発現ベクターから発現され得、その活性が、このベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節に議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＥＶＩＥＷＳ−−ＴＲＥＮＤＳ　ＩＮ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ，１巻（１）（１９８６）を参照のこと。
【０１２２】
本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムであり得る。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得、この一本鎖核酸に対して、リボザイムは、相補性領域を有する。従って、リボザイムは、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために使用されて、それによりｇｐ２８６　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ｇｐ２８６コード核酸に対する特異性を有するリボザイムが、本明細書中に開示されるｇｐ２８６　ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、１３または１４）に基づいて、設計され得る。
【０１２３】
ｇｐ２８６のオリゴヌクレオチド模倣物（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））が、治療適用および診断適用において使用され得る。例えば、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：５−２３を参照のこと。ＰＮＡ化合物において、核酸のホスホジエステル骨格が、特にアミド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットを反復させることによって、アミド含有骨格で置換される。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘導することによる、あるいは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的改変のためのアンチセンス薬剤または抗遺伝子薬剤として使用され得る。ｇｐ２８６のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ＰＮＡ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＰＣＲ　ｃｌａｍｐｉｎｇ）により遺伝子における一塩基対変異の分析において用いられ得る；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて用いられる場合の人工制限酵素として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ．，前出；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，前出）。ｇｐ２８６のＰＮＡは、親油性基または他の補助基（ｈｅｌｐｅｒ　ｇｒｏｕｐ）をＰＮＡに結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームの使用もしくは当該分野で公知の薬物送達の他の技術（下記を参照のこと）によって、例えば、それらの安定性もしくは細胞取り込みを増強するために改変され得る。
【０１２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜もしくは血液脳関門を横切る輸送を容易にする薬剤のような他の付属基（ａｐｐｅｎｄｅｄ　ｇｒｏｕｐ）を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ａｇｅｎｔ）または***剤で改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）、輸送薬剤（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ａｇｅｎｔ）、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など（下記を参照のこと））に結合体化され得る。
【０１２５】
天然に見出される核酸組成物との差異（例えば、ネイティブでない塩基、改変されたヌクレオシド間結合、合成後修飾）は、ｇｐ２８６ポリヌクレオチドの長さ全体を通して存在され得るか、または有用に、その一部とは分離した部分に位置されうる。後者の例として、別々のＤＮＡドメインおよびＲＮＡドメインを有するキメラ核酸が合成され得、さらに、米国特許第５，７６０，０１２号および同第５，７３１，１８１号に記載されるように（これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）、標的化された遺伝子修復のための利用性を示され得る。ＤＮＡおよびＰＮＡ両方を含むキメラ核酸は、改変ＰＣＲ反応において有用性を有することが示されている。Ｍｉｓｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１９１７−１９２５（１９９８）を参照のこと；Ｆｉｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３３５７−３３６３（１９９６）もまた参照のこと（本明細書中に参考として援用される）。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸はまた、有用に、基材に結合され得る。この基材は、多孔性または固体、平板または非平板、一体のまたは分割された基板であり得；結合は、共有結合または非共有結合であり得る。基材に対して結合した本発明の核酸は、それらが標識されていない状態でプローブとして用いられ得る。例えば、本発明の核酸は、有用に、多孔性基材（通常は、膜（代表的には、ニトロセルロース、ナイロン、または正に荷電した誘導体化ナイロンを含む））に結合され得る；このように結合された本発明の核酸は、標識された核酸サンプル内（ゲノム核酸のサンプルまたは転写物に由来する核酸のサンプルのいずれか）に存在するｇｐ２８６核酸を、例えば、逆ドットブロット（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）により検出するために用いられ得る。
【０１２７】
本発明の核酸はまた、有用に、固体基材（例えば、ガラス）に結合され得るが、他の固体基材（例えば、非晶質ケイ素、結晶性ケイ素、またはプラスチック）もまた用いられ得る。本発明の核酸は、固体支持体の表面に共有結合され得るか、または変性を容易にするカオトロピック剤中での誘導体化表面、および推定される非共有結合的相互作用による接着、またはそれらのある組み合わせに適用され得る。
【０１２８】
本発明の核酸は、基材に結合され得、この基材に対して、複数の他の核酸が同時に結合され、この複数の結合した核酸の各々に対するハイブリダイゼーションは、別個に検出可能である。低密度では（例えば、多孔性膜上で）、これらの基材に結合した収集物は、代表的には、マイクロアレイとよばれる；高密度では（代表的には、ガラスのような固体支持体上）、これらの基材に結合した複数の核酸の収集物は、通称、マイクロアレイと呼ばれる。本明細書中で用いられる場合、用語マイクロアレイは、全ての密度のアレイを含む。従って、本発明は、本発明の核酸を含むマイクロアレイを提供する。
【０１２９】
本発明の単離された核酸をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ゲノム核酸サンプルおよび転写物由来の核酸サンプルの両方においてｇｐ２８６核酸を検出し、特徴づけ、そして定量し、そしてこれらのサンプルからｇｐ２８６核酸を単離し得る。溶液中で遊離している場合、このようなプローブは、代表的には（しかし、常にではない）、検出可能に標識されるか、マイクロアレイとして基材に結合され、このようなプローブは、代表的には（しかし、常にではない）、標識されない。
【０１３０】
例えば、本発明の単離された核酸をプローブとして用いて、染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｓｐｒｅａｄ）に対する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を通じて、ｇｐ２８６ゲノム遺伝子座における全改変（例えば、ｇｐ２８６ゲノム遺伝子座の欠失、挿入、転座、および重複）を検出および特徴づけし得る。例えば、Ａｎｄｒｅｅｆｆ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０４７１０１３４５５）を参照のこと（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。本発明の単離された核酸は、例えば、制限フラグメント長多型のサザンブロット検出を用いて、より小さなゲノム改変を評価するためにプローブとして用いられ得る。本発明の単離された核酸は、本発明の核酸を含むゲノムクローンを単離するためにプローブとして用いられ得る。このゲノムクローンは、その後、制限マッピングされ得、そして配列レベルで欠失、挿入、転座、および置換（一ヌクレオチド多型、すなわちＳＮＰ）を同定するために配列決定され得る。
【０１３１】
本発明の単離された核酸はまた、転写物由来の核酸サンプル中のｇｐ２８６核酸を検出し、特徴づけ、そして定量し、そしてこのサンプルからｇｐ２８６核酸を単離するためにプローブとして用いられ得る。例えば、本発明の単離された核酸は、総ＲＮＡサンプルもしくはポリＡ＋で選択されたＲＮＡサンプルのノーザンブロットによりｇｐ２８６　ｍＲＮＡを検出し、長さにより特徴づけし、そして定量するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。本発明の単離された核酸はまた、組織切片に対するインサイチュハイブリダイゼーションによりｇｐ２８６メッセージを検出し、位置により特徴づけ、そして定量するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｈｚａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（２０００）（ＩＳＢＮ：　０３８７９１５９６６）（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１３２】
さらに、本発明の単離された核酸は、ｃＤＮＡライブラリーにおいてｇｐ２８６クローンの提示を測定するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。例えば、本発明の単離された核酸は、ｃＤＮＡライブラリーからｇｐ２８６核酸を単離するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。このことにより、ｇｐ２８６　ＲＮＡメッセージの配列レベルでの特徴づけ（欠失、挿入、短縮化の同定（選択的スプライシング形態におけるエクソンの欠失、挿入、および短縮化を含む）および一塩基多型を含む）が可能になる。本明細書中以下の実施例において記載されるように、本発明の核酸を用いて、ｇｐ２８６遺伝子の発現を測定するためにもまた、転写物由来のサンプル中のｇｐ２８６核酸を検出および定量し得る。ｇｐ２８６発現の測定は、異常なｇｐ２８６発現と関連した状態、障害および疾患（特に、通常ｇｐ２８６が発現されているＴ細胞において、および本明細書中以下の実施例においてさらに記載されるように、誤って発現され得る組織において）についての診断アッセイにおいて特定の有用性を有する。
【０１３３】
従って、当業者に容易に明らかであるように、ｇｐ２８６核酸プローブ各々は、標識されていようと、基材に結合されていようと、その両方であろうと、免疫組織および他の組織（これらの組織では、発現が既に確認されている）におけるｇｐ２８６発現のレベルを測定するためのツールとして使用するために現在利用可能である。
【０１３４】
本発明のｇｐ２８６核酸プローブはまた、組織へのＴ細胞浸潤のレベルを決定するために有用である。これは、組織が浸潤されているか否かを決定することにおいて特に有用であり得る。この場合、Ｔ細胞は、組織を浸潤するか、または他の疾患状態においては、Ｔ細胞浸潤が生じる。当業者は、正常組織中のｇｐ２８６　ｍＲＮＡのレベルと、浸潤または罹患したと疑われるサンプル組織のｇｐ２８６　ｍＲＮＡレベルとを比較し得る。ここで、このサンプル組織中でｇｐ２８６　ｍＲＮＡのレベルがより高いという決定は、Ｔ細胞浸潤を示し、従って、炎症または他の疾患状態を示す。
上記のように、本発明の核酸プローブは、マイクロアレイを構築することにおいて有用であり；続いてこのマイクロアレイは、例えば、薬物発見および標的確認プログラムにおいて遺伝子発現を測定し、そして調査するために有用な物品である。マイクロアレイ上に含まれる場合、ｇｐ２８６核酸プローブ各々により、ｇｐ２８６遺伝子の一部分がこのプローブ内に含まれることを検出し、従って、シグナルを検出する能力をマイクロアレイデバイスに与えるために、このマイクロアレイが特に有用となる。ここで、このようなプローブがない場合、このマイクロアレイデバイスは、シグナルがないことを報告する。
【０１３５】
ｇｐ２８６発現のレベルの変化は、有用性を有するための発現の測定に観察される必要はない。遺伝子発現分析が、細胞に対する化学的薬剤の毒性を評価するために用いられる場合、例えば、薬剤が遺伝子発現レベルを変化させることができないことは、この薬物が、その遺伝子の発現されたタンパク質が一部である経路に影響を与えないようであるという証拠である。同様に、遺伝子発現分析が、薬理学的薬剤の副作用を評価するために用いられる場合−主役（ｌｅａｄ）化合物の発見におけるか、または主役化合物の誘導体の引き続くスクリーニングにおけるかのいずれかにもかかわらず−薬剤が、遺伝子の発現レベルを改変できないことは、この薬物が遺伝子の発現されたタンパク質が一部分である経路に影響を与えないという証拠である。その全体が本明細書に参考として援用されるＷＯ９９／５８７２０は、その発現が計算で用いられる遺伝子の同一性または機能を問わずに、第１および第２の遺伝子発現プロフィールの関連性を定量する方法、および複数の遺伝子発現プロフィールの関連性を順序付ける方法を提供する。
【０１３６】
本発明のゲノム由来単一エキソンプローブおよびゲノム由来単一エキソンプローブマイクロアレイは、本発明の核酸のスプライシング改変体の高出力検出を可能にするさらなる有用性を有している。
【０１３７】
プロモーターをともなうポリヌクレオチド挿入物に隣接するベクターのような核酸構築物中に挿入された本発明のポリヌクレオチドは、本発明の核酸のいずれかの鎖に相補的なＲＮＡのインビトロ発現を駆動するために用いられ得る。このＲＮＡは、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡサブトラクションにおいてか、またはインビトロ翻訳のために一本鎖プローブとして用いられ得る。ＧＰ２８６タンパク質またはその一部をコードするようなポリヌクレオチドは、さらに、単独であるか、または融合タンパク質の一部分のいずれかとして、ＧＰ２８６タンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するために用いられ得る。発現は、ゲノムから、または本発明の転写物由来のポリヌクレオチドからであり得る。
【０１３８】
タンパク質発現がゲノムＤＮＡから行われる場合、代表的には、発現は、最初のＲＮＡ転写物からイントロンをスプライシングし得る、真核生物細胞、代表的には哺乳動物細胞で行われる。発現は、エピソーム性ベクターからであるか、または宿主細胞染色体中に組み込まれたゲノムＤＮＡから駆動され得る。以下に記載されるように、発現が、本発明の転写物由来（またはそうでなければイントロンのない）ポリヌクレオチドからである場合、発現は、広範な種類の原核生物細胞またはは真核生物細胞中で行われ得る。
【０１３９】
インビトロで発現されて、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはタンパク質融合体は、その後単離されて、本発明のタンパク質またはタンパク質イソ形態に特異的なイムノアッセイにおける標準として用いられ得；治療薬剤として用いられ得、例えば、本発明のタンパク質が欠損している個体における受動置換療法として投与され得；ワクチンとして投与され得；特異的抗体のインビトロ生産のために用いられ得、その後、この抗体は、例えば、本発明のタンパク質の検出および定量のための分析薬剤として、または免疫療法薬剤として用いられ得る。
【０１４０】
本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび核酸はまた、本発明のタンパク質のインビボ発現を駆動するために用いられ得る。インビボ発現は、遺伝子療法を目的にするベクター−代表的にはウイルスベクター、しばしば、複製不能レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にしたベクター−から駆動され得る。インビボ発現は、この核酸に対して内因性であるか、または（例えばベクターからの）外因性の発現制御シグナルから駆動され得る。
【０１４１】
本発明の単離されたｇｐ２８６ポリヌクレオチドの種々の形態（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）は、雄または雌の前核中にマイクロインジェクションされ得るか、または胚性幹（ＥＳ）細胞中に組み込まれて、本発明のタンパク質を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物を作成し得る。
【０１４２】
本発明のゲノム核酸はまた、被験体中のｇｐ２８６遺伝子座への相同的組み換えを標的にするために用いられ得る。例えば、米国特許第６，１８７，３０５号；６，２０４，０６１号；５，６３１，１５３号；５，６２７，０５９号；５，４８７，９９２号；５，４６４，７６４号；５，６１４，３９６号；５，５２７，６９５号および６，０６３，６３０号；ならびにＫｍｉｅｃら（編）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１３３巻、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３３６００）；Ｊｏｙｎｅｒ（編）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７９３８）；Ｓｅｄｉｖｙら、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０７１６７７０１３Ｘ）；Ｔｙｍｍｓら（編）、Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３５７２７）；Ｍａｋら（編）、Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、第２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：０１２４６６０４４４）；Ｔｏｒｒｅｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９７７）（ＩＳＢＮ：０１９９６３６７７Ｘ）；Ｖｅｇａ（編）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、ＬＬＣ（１９９４）（ＩＳＢＮ：０８４９３８９５０Ｘ）を参照のこと。これらの開示はその全体が参考として本明細書に援用される。
【０１４３】
ゲノム領域が、転写調節エレメントを含む場合、相同的組み換えを用いて、ヒト細胞からのＧＰ２８６タンパク質のインビトロ産生の目的、および遺伝子療法の目的のための両方に、ＧＰ２８６の発現を改変し得る。例えば、それらの開示の全体が参考として本明細書に援用される、米国特許第５，９８１，２１４号、６，０４８，５２４号；５，２７２，０７１号を参照のこと。相同的組み換えに代表的に用いられるようなものより小さな本発明のポリヌクレオチドのフラグメントもまた、おそらく、相同的組み換えの間に関与する機構とは異なる細胞の機構によって、標的化された遺伝子矯正または改変のために用いられ得る。例えば、米国特許第５，９４５，３３９号、５，８８８，９８３号、５，８７１，９８４号、５，７９５，９７２号、５，７８０，２９６号、５，７６０，０１２号、５，７５６，３２５号、５，７３１，１８１号；およびＣｕｌｖｅｒら、「Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１０）：９８９−９３（１９９９）；Ｇａｍｐｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２８（２１）：４３３２−９（２０００）を参照のこと。これらの開示は、本明細書に参考として援用される。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的な技法により、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、およびｍＲＮＡサンプルのような核酸サンプルをプローブするために、本発明の標識プローブを用いることによって得られ得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、以下の実施例１にさらに示されるように、本発明の核酸プライマーを用いる増幅によっても得られ得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、特に、約１００ヌクレオチドより少ない場合、代表的には、市販の自動化合成機を用いる固相合成により、化学的に合成され得る。
【０１４５】
（ベクターおよび宿主細胞）
Ａ．核酸構築物
本発明は、１つ以上の単離された本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクターのような核酸構築物、およびこのようなベクターが導入された宿主細胞を提供する。
【０１４６】
このようなベクターは、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを増やすため（クローニングベクター）、異なる生物由来の宿主細胞間で本発明のポリヌクレオチドをシャトルするため（シャトルベクター）、宿主細胞染色体中に本発明のポリヌクレオチドを挿入するため（挿入ベクター）、インビトロまたは宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドのセンスＲＮＡ転写物またはアンチセンスＲＮＡ転写物を発現するため、および単独または異種ポリペプチドへの融合として、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリヌクレオチドを発現するために（発現ベクター）用いられ得る。本発明のベクターは、しばしば、このような使用のいくつかに好適である。
【０１４７】
ベクター類は、今や、当該分野で周知であり、そして、特に、Ｊｏｎｅｓら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ　Ｌｔｄ　１９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６６Ｘ）；Ｊｏｎｅｓら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ　Ｌｔｄ　１９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６７８）；Ｇａｃｅｓａら、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｄａｔａ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５（ＩＳＢＮ：０４７１９４８４１１）；Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ（編）、Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅａｔｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．、２０００（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３５Ｘ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、２００１（ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９（ＩＳＢＮ：０４７１３２９３８Ｘ）に記載されている。これらの開示はそれらの全体が本明細書中に参考として援用される。広範な種類のベクターが市販されている。現存するベクターの使用および改変は当該分野の技術内に十分ある。
【０１４８】
代表的には、ベクターは、ウイルス、プラスミド、原核生物または真核生物の染色体エレメント、またはそれらのいくつかの組み合わせ由来であり、そして、いくつかの組み込みベクターは、染色体が改変される宿主中で機能的である起点を欠き、そしていくつかのベクターは、選択マーカーを欠いているが、少なくとも１つの複製起点、少なくとも１つの異種核酸の挿入のための部位（代表的には、複数の緊密にクラスターとなった単一の切断制限部位を備えたポリリンカーの形態である）、および少なくとも１つの選択マーカーを含む。本発明のベクターは、さらに、少なくとも１つの位置でベクター中に挿入された少なくとも１つの単離された本発明のポリヌクレオチド核酸を含む。存在する場合、複製起点および選択マーカーは、所望の宿主細胞（単数または複数）を基にして選択され；次に、宿主細胞は、所望の適用を基にして選択される。
【０１４９】
例えば、原核生物細胞、代表的にはＥ．ｃｏｌｉは、代表的にはクローニング、すなわち、宿主細胞中のポリヌクレオチド配列の増幅のために選択される。このような場合、ベクター複製は、（λファージ、Ｍ１３、Ｔ７、Ｔ３およびＰ１のような）大腸菌に感染するファージの複製戦略、または自律複製エピソーム、著名には、ｐＢＲ３２２プラスミドおよびｐＵＣシリーズプラスミドを含む、ＣｏｌＥ１プラスミドおよびその後の誘導体の複製起点を基にすることを意味する。Ｅ．ｃｏｌｉが宿主として用いられる場合、選択マーカーは、同様に、グラム陰性細菌中の選択性のために選択される：例えば、代表的なマーカーは、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゼオシンのような抗生物質に対する耐性を付与する；栄養要求性マーカーもまた用いられ得る。
【０１５０】
別の例として、代表的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである酵母細胞が、真核生物遺伝子研究のため、例えば、ツーハイブリッドシステムによる相互作用タンパク質成分の同定のため、およびタンパク質発現のために特に選択される。酵母における使用のための本発明のベクターは、代表的には、いつもではないが、酵母における使用のために適切な複製起点、および酵母において機能的である選択マーカーを含む。適切な酵母ベクターの例は、組み込みＹＩｐベクター、セントロメア配列ＣＥＮを含む複製エピソームのＹＥｐベクター、および自律複製配列ＡＲＳを含む。ＹＡＣは、インビボでテロメア（ＴＥＬ）として機能する同種または異種のＤＮＡ配列を含み、かつ酵母ＡＲＳ（複製起点）セグメントおよびＣＥＮ（セントロメア）セグメントを含む、ＹＬｐと称される酵母線状プラスミドを基礎にしている。
【０１５１】
酵母ベクターにおける選択可能マーカーとしては、特異的な栄養要求性変異（例えば、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−Ｄ１、ｌｅｕ２−Ｄ１、ｔｒｐｌ−Ｄｌおよびｌｙｓ２−２０１）を補完する種々の栄養要求性マーカー（これらの（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける）最も一般的なものは、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２である）が挙げられる。このＵＲＡ３酵母遺伝子およびＬＹＳ２酵母遺伝子は、原栄養体株の増殖を阻害するが、それぞれ、ｕｒａ３変異体およびｌｙｓ２変異体の増殖を許容する特異的なインヒビターである、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）およびα−アミノアジピン酸（αＡＡ）に、それぞれ基づくネガティブ選択をさらに可能にする。他の選択可能マーカーは、例えば、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する耐性を与える。
【０１５２】
昆虫細胞は、高い効率のタンパク質発現について、しばしば選択される。宿主細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａｅ（例えば、Ｓｆ９細胞株およびＳｆ２１細胞株、ならびにｅｘｐｒｅｓＳＦＴＭ細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ））に由来する場合、ベクター複製ストラテジーは、代表的には、バキュロウイルス生活環に基づく。代表的には、バキュロウイルス移入ベクターを使用して、野生型ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子を目的の異種遺伝子で置き換える。野生型ゲノムにおいてこのポリへドリン遺伝子に隣接する配列は、この移入ベクター上の発現カセットの５’および３’に位置する。ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡを用いる同時トランスフェクション後、相同組換え現象がこれらの配列の間で起こり、この目的の遺伝子、このポリへドリンプロモーターまたはｐ１０プロモーターを保有する組換えウイルスを生じる。選択は、ｌａｃＺ融合活性についてのビジュアルスクリーニングに基づき得る。
【０１５３】
哺乳動物細胞は、薬学的因子として意図されるタンパク質の発現についてしばしば選択されるか、またはタンパク質または生理学的経路の潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングのための宿主細胞としても選択される。哺乳動物細胞における自律的染色体外複製について意図されるベクターとしては、代表的には、ウイルス起源（例えば、（大Ｔ抗原を発現する細胞系（例えば、ＣＯＳ１細胞およびＣＯＳ７細胞）における複製のための）ＳＶ４０起源、乳頭腫ウイルス起源または長期間のエピソーム複製のためのＥＢＶ起源（例えば、ＥＢＶ　ＥＢＮＡ−１遺伝子産物およびアデノウイルスＥ１Ａを構成的に発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞））が挙げられる。哺乳動物染色体の部分として統合、およびそれに従った複製を意図するベクターは、哺乳動物細胞内で機能する（例えば、ＳＶ４０起源の）複製起点を含み得るが、必ずしもこれらを含むに及ばない。ウイルスに基づくベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および様々な哺乳動物レトロウイルス）は、代表的には、ウイルス複製ストラテジーに従って複製する。
【０１５４】
哺乳動物細胞での用途のための選択可能マーカーは、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ブラスチシジン、ハイグロマイシンに対する耐性およびゼオシンに対する耐性、ならびにＨＡＴ培地を使用するプリンサルベージ経路に基づく選択に対する耐性を含む。
【０１５５】
植物細胞はまた、代表的には、植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））由来のベクターレプリコン、および植物における適切性について選択される選択可能マーカーを用いる、発現のために使用され得る。
【０１５６】
プライスミドまたはウイルス由来のベクターにおいて容易に適応され得るようなポリヌクレオチドより大きな、本発明のポリヌクレオチドの増殖のために、本発明は、ｇｐ２８６核酸、しばしばゲノム核酸を含む、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ、およびＨＡＣ）をさらに提供する。例えば、Ｓｈｉｚｕｙａら，Ｋｅｉｏ　Ｊ．Ｍｅｄ．５０（１）：２６−３０（２００１）；Ｓｈｉｚｕｙａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９（１８）：８７９４−７（１９９２）；Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１０）：１０８６−９０（２０００）；Ｈｅｎｎｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６（２）：５９２−７（１９９９）；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．１５（４）：３４５−５５（１９９７）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１５７】
挿入された異種核酸からポリペプチドの発現を駆動する本発明の発現ベクターは、しばしば、タンパク質コード異種核酸挿入物に作動可能に連結される種々の他の遺伝的エレメント（代表的には、転写を駆動し、そして調節する遺伝的エレメント（例えば、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメント）、ＲＮＡプロセシングを容易にする遺伝的エレメント（例えば、転写終止、スプライシングシグナルおよび／またはポリアデニル化シグナル）、ならびに翻訳を容易にする遺伝的エレメント（例えば、リボソームコンセンサス配列）を含む。他の転写制御配列としては、例えば、オペレーター、サイレンサーなどが挙げられる。このような発現制御エレメント（誘導性発現、および発生発現または組織調節発現を与える発現制御エレメントを含む）の使用は、当該分野で周知である。
【０１５８】
免疫系においてＧＰ２８６を発現することが可能な組織特異的調節エレメントは、特に有用であり得、そして当該分野で公知である（例えば、ネイティブ免疫グロブリンプロモーターおよびネイティブＴ細胞レセプタープロモーター）。発生的に調節されるプロモーターはまた選択され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。膨大な種々の誘導性プロモーターが、公知であり、そして具体的な適用に基づいて選択され得る。
【０１５９】
発現ベクターは、精製および／または視覚化を容易にする小タンパク質タグに発現されたポリペプチド融合するように設計され得る。多くのこのようなタグが公知であり、そして利用可能である。発現ベクターはまた、精製タグおよび／または同定タグより大きなポリペプチドに、異種核酸挿入物によってコードされるタンパク質を融合するように設計され得る。有用なタンパク質融合としては、ファージまたは細胞の表面上にコードされるタンパク質の提示を可能にするタンパク質融合、元来の蛍光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼまたは緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様発色団を有するタンパク質）への融合、ＩｇＧ　Ｆｃ領域または他の免疫グロブリン型の定常ドメインへの融合、およびツーハイブリット選択系における使用のための融合が挙げられる。
【０１６０】
発現されるタンパク質の分泌のために、広範な種々のベクターが利用可能であり、これらは、リーダーペプチドのような分泌シグナルをコードする適切な配列を含む。ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、および哺乳動物ディスプレイのために設計されるベクターは、例えば、Ｎ末端細胞表面標的化シグナルおよびＣ末端膜貫通アンカー化ドメインを使用して、組換えタンパク質を標的化する。
【０１６１】
異種核酸にコードされる融合タンパク質を、基質非依存性の、元来蛍光発光性のＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）ならびにその多くのカラーシフト改変体および／または安定化改変体の発色団に融合する、広範な種々のベクターが現在存在する。
【０１６２】
ＦｃＲｎレセプター（これはまた、ＦｃＲｐレセプターおよびＢｒａｍｂｅｌｌレセプター、ＦｃＲｂと呼称される）との相互作用を通してタンパク質薬学的製品の血清半減期を増大するために、ＩｇＧ　Ｆｃ領域に対する異種配列の融合を可能にするベクターはまた、広範に利用可能である。
【０１６３】
本発明のタンパク質、タンパク質融合物およびタンパク質フラグメントの長期間の高収量組換え産生のために、安定発現が好ましい。安定発現は、（好ましくは、選択可能マーカーを有する）ベクターの、宿主細胞ゲノムへの組み込み、その後の組み込み体の選択によって、容易に達成される。
【０１６４】
本発明のベクターはまた、しばしば、挿入された異種核酸のＲＮＡのインビトロ転写を可能にするエレメントを含む。このようなベクターは、代表的には、ファージプロモーター（例えば、この核酸挿入物に隣接する、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６由来のファージプロモーター）を含む。しばしば、２つの異なるこのようなプロモーターは、挿入された核酸に隣接し、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の別個のインビトロ産生を可能にする。
【０１６５】
（Ｂ．宿主細胞）
本発明は、細胞内でエピソーム的に存在するか、または宿主細胞染色体に全体的もしくは部分的に取り込まれるかのいずれかにある、本発明のベクターのような核酸構築物を含む、宿主細胞（原核生物（細菌）細胞または真核生物細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞）のいずれか）をさらに含む。
【０１６６】
他の考慮（その考慮のいくつかは、上記である）の中で、宿主細胞株は、発現タンパク質を所望の様式でプロセスする能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような翻訳後修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアセチル化が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれは、このような翻訳後修飾を有するＧＰ２８６タンパク質を提供するための本発明の局面である。
【０１６７】
適切な宿主細胞の代表的な、非限定的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）；昆虫細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｉｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞（例えば、Ｓｆ９細胞株およびＳｆ２１細胞株、ならびにｅｘｐｒｅｓＳＦＴＭ細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ））、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）；ならびに哺乳動物細胞が挙げられる。代表的な哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ１細胞およびＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、マウスＥＳ細胞株（例えば、１２９／ＳＶ株、Ｃ５７／ＢＬ６株、ＤＢＡ−１株、１２９／ＳＶＪ株由来）、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ならびにＢＷ５１４７が挙げられる。特に好ましいのは、Ｔ細胞株、好ましくは、ヒトＴ細胞株（例えば、ＭＯＬＴ−４）である。他の有用な哺乳動物細胞系が、周知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）およびＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＩＧＭＳ）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。
【０１６８】
本発明のベクターおよび核酸を、宿主細胞に導入する方法は、当該分野で周知であり；技術の選択は、導入される特異的なベクターおよび選択される宿主細胞に主に依存する。
【０１６９】
（ＧＰ２８６タンパク質、ＧＰ２８６ポリペプチドおよびＧＰ２８６フラグメント）
本発明は、抗原としての使用（例えば、エピトープマッピング）、免疫原としての使用（例えば、抗体を惹起するため、またはワクチンとして）、および治療組成物における使用のために適切なＧＰ２８６タンパク質およびこれらの種々のフラグメントを提供する。異種ポリペプチドに対するＧＰ２８６ポリペプチドおよびフラグメントの融合物、ならびに本発明のこのタンパク質、フラグメントおよび融合物の他の部分に対する（例えば、キャリアタンパク質に対する、発色団対する）結合体がまた、提供される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、全長ｇｐ２８６　ｃＤＮＡ（配列番号１および配列番号１４）、または変性改変体にコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドを提供する。本発明はまた、必要に応じ１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、全長ｇｐ２８６　ｃＤＮＡ（配列番号１および配列番号１４）にコードされるアミノ酸を有する。単離されたＧＰ２８６ポリペプチドを提供する。
【０１７１】
本発明また、ｇｐ２８６　ｃＤＮＡ（配列番号１および配列番号１４）のヌクレオチド配列の一部分または全部を有するプローブに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドを提供する。好ましくは、ストリンジェントに交差ハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたＧＰ２８６ポリペプチドは、少なくとも１つのＧＰ２８６の生物学的活性を有する。
【０１７２】
別の一連の実施形態において、本発明は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号１５のいずれかのＧＰ２８６アミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドを提供する。１つ以上の保存的アミノ酸置換を必要に応じて有する、配列番号２または配列番号１５のいずれかの全長ＧＰ２８６ポリペプチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドがまた、提供される。
【０１７３】
本発明は、上記の単離されたポリペプチドの各々のフラグメントをさらに提供し、特に、配列番号２または配列番号１５のいずれかによって与えられる配列の、少なくとも６個のアミノ酸、８個のアミノ酸、１５個のアミノ酸のから配列全体までを有するフラグメントを提供する。
【０１７４】
本発明はまた、ＧＰ２８６のＮ末端の細胞外ドメインの全てまたは一部分を含む単離されたＧＰ２８６ポリペプチドを提供する（ＧＰ２８６ドメインおよびＧＰ２８６配列について、図１および図２ならびに配列番号２および配列番号１５を参照のこと）。好ましいポリペプチドは、配列番号２１（これは、ＧＰ２８６のＩｇ様ドメインである）および配列番号２７（これは、Ｉｇ様ドメインのＮ末端のアミノ酸がないＧＰ２８６の細胞外ドメインである）のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１７５】
好ましい実施形態において、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドは、ＧＰ２８６の細胞外ドメインの全体を含み、そして機能的ＧＰ２８６膜貫通ドメインを欠く。好ましいポリペプチドは、それぞれ、ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａの細胞外部分である、配列番号１７および配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。他の好ましい実施形態において、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドは、異種タンパク質ドメインに融合されるＧＰ２８６細胞外ドメインの全部または一部分からなる。
【０１７６】
ＧＰ２８６の膜貫通ドメインおよびＧＰ２８６のＣ末端細胞質領域からなる群より選択されるＧＰ２８６フラグメントを含む、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドもまた好ましい。好ましいポリペプチドは、配列番号３３（これは、ＧＰ２８６の膜貫通ドメインである）；配列番号２３（これは、ＧＰ２８６の細胞内ドメインである）；および配列番号２５（これは、ＧＰ２８６ａの細胞内ドメインである）のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。他の好ましい実施形態において、単離されたＧＰ２８６ポリペプチドは、異種タンパク質ドメインに融合される、ＧＰ２８６細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインの一部分または全体からなる。
【０１７７】
本発明のＧＰ２８６フラグメントは、ネイティブＧＰ２８６タンパク質の連続した部分であり得る。しかし、本明細書中で提供されるようなＧＰ２８６遺伝子およびタンパク質配列の知見が、ネイティブＧＰ２８６タンパク質において連続的でない種々のドメインの再結合を可能にすることが理解される。
【０１７８】
本発明はまた、ＧＰ２８６および関連するタンパク質の選択部分を含むポリペプチドを提供する。本明細書中の以下で議論されるように、特に異種タンパク質フラグメントに結合される場合、これらのタンパク質フラグメントは、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を介して特定の細胞型に因子を標的化するため；Ｉｇドメイン含有タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害するため；競合的結合アッセイのため；およびフラグメント特異的ＧＰ２８６抗体を惹起するために使用され得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、このタンパク質フラグメントは、少なくとも１つのコピーにおいて、ＧＰ２８６のＮ末端細胞外部分に特徴的なＩｇドメインを含む。具体的には、この細胞外Ｉｇドメインは、配列番号２のＧＰ２８６アミノ酸配列のアミノ酸３２−１１０（図１参照のこと）および配列番号１５のＧＰ２８６ａアミノ酸配列のアミノ酸３７−１１５（図２参照のこと）にコードされる。
【０１８０】
好ましくは、このタンパク質フラグメントは、膜を介するこのポリペプチド輸送を媒介するＮ末端シグナル分泌配列を含む。このＧＰ２８６シグナル分泌配列は、配列番号２のＧＰ２８６アミノ酸配列のアミノ酸１〜１７（図１を参照のこと）および配列番号１５のＧＰ２８６ａアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２（図２を参照のこと）によってコードされる。このシグナル配列は、異種タンパク質由来であり得るが、好ましくは、このタンパク質フラグメントのこのシグナル分泌配列は、ＧＰ２８６由来である。
【０１８１】
上記の好ましいタンパク質フラグメントは、このポリペプチドの膜への挿入が非常に所望される場合、必要に応じて膜貫通ドメインを含み得る。この膜貫通ドメインは、ＧＰ２８６ドメイン（以下を参照のこと）であり得るか、または異種膜結合タンパク質の膜貫通ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。
【０１８２】
非常に所望される場合、上記の好ましいタンパク質フラグメントは、特定のシグナル伝達反応が、ＧＰ２８６結合相互作用に応答して所望されるときに、細胞内Ｃ末端ドメインをさらに含み得る。この細胞内ドメインは、ＧＰ２８６またはＧＰ２８６ａに由来し得る（以下を参照のこと）か、またこのドメインは、異種膜結合タンパク質の細胞内ドメインをコードする異種遺伝子にコードされ得る。
【０１８３】
本発明のタンパク質フラグメントの他の好ましい実施形態は、ＧＰ２８６の膜貫通ドメインを含むフラグメントである。具体的には、このＧＰ２８６膜貫通ドメインは、配列番号２のＧＰ２８６アミノ酸配列のアミノ酸１４０−１６０（図１を参照のこと）および配列番号１５のＧＰ２８６ａアミノ酸配列のアミノ酸１４５−１６５（図２を参照のこと）にコードされる。
【０１８４】
上記のタンパク質フラグメントのさらに他の好ましい実施形態は、ＧＰ２８６の（Ｃ末端）細胞内ドメインを有する。具体的には、ＧＰ２８６の１つの細胞内ドメインは、配列番号２のＧＰ２８６アミノ酸配列のアミノ酸１６１−１８６（図１参照のこと）および配列番号１５のＧＰ２８６ａアミノ酸配列のアミノ酸１６６−２７８（図２を参照のこと）にコードされる。これらの異なった細胞内ドメイン形態は、選択的スプライシングによって生成されると考えられている。
【０１８５】
上述のように、本発明は、好ましくは、ＧＰ２８６活性を実質的に保持する配列を有する、挿入もしくは欠失の様式だけ、保存的置換または中程度に保存的置換の様式だけ、ハイブリダイゼーション関連タンパク質として、または交差ハイブリダイズ化タンパク質として、特に、上で参照される配列識別子（配列番号）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｓ：）における特徴を有する記載されたタンパク質と、配列において異なるタンパク質をさらに提供する。上述されたように、本発明は、異種ポリペプチドに対する、本明細書中に記載されるポリペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントの融合をさらに提供する。
【０１８６】
免疫原性として使用される場合、本発明の様々なタンパク質の実施形態は、特に、ＧＰ２８６タンパク質の種々のエピトープに結合する抗体を惹起するために使用され得る。
【０１８７】
（ＧＰ２８６タンパク質の特徴の他の定義付け）
図１および図２は、ｇｐ２８６　ｃＤＮＡクローン（配列番号２）およびｇｐ２８６ａ　ｃＤＮＡクローン（配列番号１４）によってコードされる推定アミノ酸配列を示す。別段指摘されない限り、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、核酸配列からの推定翻訳として決定された。従って、本発明で示される任意のアミノ酸配列は、上記で詳細に記載したようなこの核酸配列における誤差に起因する誤差を含み得る。さらに、一塩基多型（ＳＮＰ）は、真核生物ゲノムにおいて頻繁に生じ（ヒトゲノムにおいて１４００万を超えるＳＮＰが既に同定されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ　４０９：８６０−９２１（２００１）））、そして、１つの種の１個体から決定された配列は、集団の中に存在する、他の対立遺伝子形態とは異なり得る。タンパク質の機能を変更しない少量の欠失および挿入は、頻繁に見出され得る。
【０１８８】
従って、本発明は、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において同一なＧＰ２８６ポリペプチドのみでなく、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において少なくとも約８０％同一な単離されたタンパク質、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において代表的には少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％同一な単離されたタンパク質、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において通常は少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％同一な単離されたタンパク質、および最も保存的には、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において少なくとも約９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％および９９．９％同一な単離されたタンパク質が提供される。これらの配列改変体は、天然に存在し得るか、または無作為突然変異誘発または指向された突然変異誘発によって人の介入により生じ得る。
【０１８９】
本明細書中の目的のために、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、Ｔａｔｉａｎａらの「Ｂｌａｓｔ　２　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａ　ｎｅｗ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ」，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順を使用して決定される。この手順は、コンピュータプログラムＢｌａｓｔ　２　ＳＥＱＵＥＮＣＥＳによって達成され、以下：ｈｔｔｐ　：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ，からオンラインで利用可能である。アミノ酸配列のパーセント同一性を評価するために、Ｂｌａｓｔ　２　ＳＥＱＵＥＮＣＥＳのＢｌａｓｔＰモジュールが、以下のデフォルト値を用いて使用される：（ｉ）ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９（２２）：１０９１５−９（１９９２））；（ｉｉ）オープンギャップ（ｏｐｅｎ　ｇａｐ）１１ペナルティおよびエクステンション１ギャップペナルティ；ならびに（ｉｉｉ）ｇａｐ　ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ５０　期待値（ｅｘｐｅｃｔ）１０ワードサイズ３フィルター、そして両方の配列は全体が入力された。
【０１９０】
周知のように、アミノ酸置換は、天然の対立遺伝子改変体において頻繁に生じ、保存的置換がしばしば、タンパク質機能における最小の変化のみを引き起こす。従って、本発明は、本明細書中の特徴を持つ記載されるタンパク質に配列において同一なタンパク質のみではなく、保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ２８６タンパク質の配列またはそれらの一部分を有する単離されたタンパク質、を提供する。中程度に保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ２８６タンパク質の配列およびその一部分を有する単離されたタンパク質もまた、提供される。これらの保存的置換された改変体または中程度に保存的に置換された改変体は、天然に存在し得るか、または人の介入によって生じ得る。
【０１９１】
当該分野で周知のように、タンパク質の関連性はまた、機能試験、所定のハイブリダイゼーションストリンジェンシーにおいて互いに塩基対を形成するコード核酸の能力を使用して、特徴付けられる。従って、本明細書中の特徴を有する記載されたタンパク質に配列において同一である単離されたタンパク質を提供するのみではなく、様々な本発明の単離されたポリヌクレオチドの改変体（「参照核酸」）の全てまたは一部分に（本明細書中の上記で定義されるような）高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる単離されたタンパク質（「ハイブリダイゼーション関連タンパク質」）を提供することは、本発明の別の局面である。
【０１９２】
ハイブリダイゼーション関連タンパク質は、本発明のＧＰ２８６タンパク質の代替的なアイソフォーム、ホモログ、パラログ、およびオルソログであり得る。特に有用なオルソログは、チンパンジー、アカゲマカクザル、ヒヒ、オランウータン、およびゴリラのような他の霊長類由来；ラット、マウス、モルモットのようなげっ歯類由来；ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）のようなウサギ目の動物（ｌａｇｏｇｍｏｒｐｈ）由来；およびウシ、ブタ、ウマ、ヤギのような家畜由来のオルソログである。
【０１９３】
タンパク質の関連性はまた、第２の機能的試験（第２のタンパク質が抗体に結合するのを競合的に阻害する第１のタンパク質の能力）を使用して特徴付けられ得る。従って、本発明の別の局面は、本明細書中に詳細に記載されるタンパク質と配列が同一な単離されたタンパク質を提供するだけでなく、本発明の種々の単離されたＧＰ２８６タンパク質（「参照タンパク質」）の全てまたは一部分への抗体の結合を競合的に阻害する単離されたタンパク質（「交差反応性タンパク質」）もまた提供することである。このような競合的阻害は、当業者に周知の免疫アッセイを使用して容易に決定され得る。
【０１９４】
１０％までの非同一性を生じる欠失および挿入を有するタンパク質、保存的または中程度に保存的な置換を有するタンパク質、ハイブリダイゼーション関連タンパク質、および交差反応性タンパク質を含む、本明細書中に詳細に記載されるタンパク質とアミノ酸配列が異なる本発明のタンパク質の中で、１つ以上のＧＰ２８６活性を実質的に保持するタンパク質が好ましい（前出を参照のこと）。
【０１９５】
変化に寛容であるが機能を保持する残基は、アラニン走査変異誘発、Ｇｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４（４９０８）：１０８１−５（１９８９）；トランスポゾンリンカー走査変異誘発、Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｅ　２６３（１−２）：３９−４８（２００１）；ホモログ走査変異誘発およびアラニン走査変異誘発の組み合わせ、Ｊｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６（３）：８５１−６５（１９９２）；機能的アッセイが後に続くコンビナトリアルアラニン走査、Ｗｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９７（１６）：８９５０−４（２０００）のような当該分野で公知の方法を使用して、既知の残基においてタンパク質を変更することよって同定され得る。トランスポゾンリンカー走査キットは、市販されている（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｅ７−１０２Ｓ；ＥＺ：：ＴＮＴＭ　Ｉｎ−Ｆｒａｍｅ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，カタログ番号ＥＺＩ０４ＫＮ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。
【０１９６】
以下にさらに記載されるように、本発明の単離されたタンパク質は、ＧＰ２８６タンパク質、これらのアイソフォーム、ホモログ、パラログ、および／またはオルソログを特異的に認識する抗体を惹起する特異的な免疫原として容易に使用され得る。順に、抗体は、とりわけ、ＧＰ２８６タンパク質の特異的な抗体の媒介性の単離および／または精製のために（例えば、免疫沈降による）、およびＧＰ２８６作用の特異的なアゴニストまたはアンタゴニストとしての使用のために、特に、本発明のＧＰ２８６タンパク質についてアッセイ（例えば、タンパク質流体サンプル（例えば、血清）の検出のためにＥＬＩＳＡによるか、組織サンプル中のタンパク質の検出のために免疫組織化学またはレーザー走査サイトメトリーによるか、または細胞懸濁液中の細胞内タンパク質の検出のためにフローサイトメトリーによる）するために使用され得る。さらに、抗体は、医学適用および法医科学において有用であるヒトＴ細胞を同定するために使用され得る。抗体はまた、ヒトＴ細胞を単離する（例えば、ＦＡＣＳによる）ために使用され得、これは、インビトロでＴ細胞を処置するため、および患者への引き続く再注入に有用である。抗体は、毒素に結合体化され得るか、または毒素を含む融合タンパク質を形成するように操作され得、これは、患者中の異常なＴ細胞を標識づけ、そして殺傷するために使用され得る。
【０１９７】
本発明の単離されたタンパク質はまた、本発明のＧＰ２８６タンパク質の濃度および／または量を特異的に決定するために使用されるアッセイにおける特異的な標準としての使用のために直ちに利用可能である。周知であるように、タンパク質分析物の検出および定量のためのＥＬＩＳＡキットは、代表的に、測定標準としての使用のための既知の濃度の単離されたかつ精製されたタンパク質を含む（例えば、ヒトインターフェロンγ　ＯｐｔＥＩＡキット、カタログ番号５５５１４２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ　ＵＳＡは、バキュロウイルス生成のヒト組換えγインターフェロンを含む）。本発明の単離されたタンパク質はまた、タンパク質−タンパク質相互作用の表面強化レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）検出のための特異的な生体分子捕捉プローブとしての使用のために直ちに利用可能である（ＷＯ９８／５９３６２；ＷＯ９８／５９３６０；ＷＯ９８／５９３６１；およびＭｅｒｃｈａｎｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２１（６）：１１６４−７７（２０００）（この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））。同様に、本発明の単離されたタンパク質はまた、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴プローブ上の特異的な生体分子捕捉プローブとしての使用のために直ちに利用可能である。Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ　１（４）：３９５−４１６（２０００）；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７（２）３３５−４０（１９９９）を参照のこと。
【０１９８】
本発明のポリペプチドは、毒素と結合体化され得るか、または毒素を有する融合タンパク質を形成するように操作され得る。ＧＰ２８６毒素は、ＧＰ２８６結合細胞に結合しそしてこれを殺傷するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、検出可能な標識に結合体化され得るか、または検出可能な標識を有する融合タンパク質を形成するように操作され得る。ＧＰ２８６標識は、ＧＰ２８６結合細胞に結合しそしてこれを検出するために使用され得る。
【０１９９】
本発明の単離されたタンパク質はまた、ＧＰ２８６の生成または活性において特定の欠乏を有すると診断された患者における治療補助として有用である。あるいは、別の細胞または細胞外マトリクスタンパク質への結合の際に活性である細胞外ドメインまたはその一部分が、他の細胞または細胞外マトリクスタンパク質への細胞表面ＧＰ２８６の結合について競合するように、患者に投与され得る。好ましくは、細胞外ドメインまたはその一部分は、血清半減期を増加する融合タンパク質の一部（例えば、ＩｇＧ重鎖の全部または一部分）である（以下を参照のこと）。
【０２００】
本発明はまた、本発明の種々のタンパク質のフラグメントを提供する。タンパク質フラグメントは、ＧＰ２８６の抗原性フラグメントおよび免疫原性フラグメントとして有用である。タンパク質の「フラグメント」とは、本明細書中では、どのように入手されようが、参照アミノ酸配列の一部分と同一であるアミノ酸配列を有する（この一部分は、少なくとも６アミノ酸であり、かつ参照核酸の全体よりも少ない）単離されたタンパク質（同様に、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド）が意図される。このように定義されるように、「フラグメント」は、参照タンパク質の物理的フラグメント化によって得られる必要はない。しかし、それによりこのような起源は除外されない。
【０２０１】
少なくとも６連続するアミノ酸のフラグメントは、参照タンパク質のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープをマッピングする際に有用である。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、「Ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｔｏ　ｐｒｏｂｅ　ｖｉｒａｌ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｆｏｒ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｔｏ　ａ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２（１９８４）ならびに米国特許第４，７０８，８７１号および同第５，５９５，９１５号（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。フラグメントは、このようなエピトープマッピングにおいて有用であるために、それ自体が免疫優性エピトープの免疫原性の一部分である必要はなく、またネイティブな抗体によって認識すらされる必要はないので、本発明のタンパク質の少なくとも６アミノ酸の全てのフラグメントは、このような研究において有用性を有する。
【０２０２】
少なくとも８連続するアミノ酸のフラグメント（しばしば、少なくとも１５連続するアミノ酸）は、本発明のタンパク質を認識する抗体を惹起するための免疫原としての有用性を有する。例えば、Ｌｅｒｎｅｒ「Ｔａｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ　２９９：５９２−５９６（１９８２）；Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ　ａｓ　ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：４２５−４６（１９８３）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｉｔｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６（１９８３）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。上記の参考文献にさらに記載されるように、キャリア（例えば、タンパク質）に結合体化された実質上全ての８マーが、免疫原性であると判明する（すなわち、結合体化ペプチドについての抗体を惹起し得ると判明する）；従って、本発明のタンパク質の少なくとも８アミノ酸の全てのフラグメントは、免疫原性としての有用性を有する。
【０２０３】
少なくとも８、９、１０、または１２連続するアミノ酸のフラグメントはまた、タンパク質全体もしくはその一部分の、抗体（エピトープマッピングにおけるような）、および天然の結合パートナー（例えば、多量体の複合体におけるサブユニット、または係るタンパク質のレセプターまたはリガンド）への結合の競合的インヒビターとして有用である；この競合的な阻害は、目的のタンパク質に特異的に結合する分子の同定および分離を可能にする（米国特許第５，５３９，０８４号および同第５，７８３，６７４号（これらは、その全体が参考として本明細書中に参考として援用される））。
【０２０４】
従って、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントは、少なくとも６アミノ酸長、代表的には少なくとも８、９、１０、または１２アミノ酸長、そしてしばしば少なくとも１５アミノ酸長である。しばしば、本発明のタンパク質またはそのフラグメントは、少なくとも２０、２５、３０、３５、または５０アミノ酸長以上である。少なくとも７５、１００、１５０以上のアミノ酸を有するより大きいフラグメントもまた有用であり、時々好まれる。
【０２０５】
本発明はさらに、本発明のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントの各々の異種ポリペプチドへの融合物を提供する。融合とは、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントが、アミノ酸またはアミノ酸アナログのペプチド結合ポリマーにおいて、異種ポリペプチドに直鎖状に連続していることが、本明細書中で意図される；「異種ポリペプチド」とは、天然には、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントと連続して存在しないポリペプチドが、本明細書中で意図される。そのように定義されるように、融合物は、変更された配置にて、ＧＰ２８６タンパク質の複数のフラグメントから全体的になり得る；このような場合において、ＧＰ２８６フラグメントのいずれかは、融合タンパク質において、他のＧＰ２８６フラグメントと異種であると考えられ得る。しかし、より代表的には、異種ポリペプチドは、ＧＰ２８６タンパク質自体から引き出されない。
【０２０６】
本発明の融合タンパク質は、本発明のタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含み、このフラグメントは、少なくとも６、代表的に少なくとも８、しばしば少なくとも１５、および有用には少なくとも１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。融合物において含まれる本発明のタンパク質のフラグメントは、有用には、少なくとも２５、５０、７５、１００、または１５０アミノ酸長であり得る。本発明のタンパク質全体を含む融合物は、特定の有用性を有する。
【０２０７】
本発明の融合タンパク質内で含まれる異種ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、そして好ましくは少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長である。より大きいポリペプチド（例えば、ＩｇＧ　Ｆｃ領域）、およびまさにタンパク質全体（例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ発色団含有タンパク質）を含む融合物は、特定の有用性を有する。
【０２０８】
本発明のベクターおよび発現ベクターの記載において上述したように、本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、有用には、組換え的に発現されるタンパク質の精製および／または可視化を容易にするように設計されたポリペプチドを含む。精製タグはまた、化学的に合成される融合物に組み込まれ得るが、化学合成は、代表的に、ＨＰＬＣによるさらなる精製で十分である十分な純度を提供する；しかし、上記のような可視化タグは、タンパク質が化学合成によって生成される場合でさえそれらの有用性を保持し、そしてそのように含まれる場合、本発明の融合タンパク質は、ＧＰ２８６存在の直接的な検出可能なマーカーとして有用になる。
【０２０９】
また上に議論されるように、本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、有用には、分泌シグナルおよび／またはリーダー配列の組み込みを介して、原核生物宿主については細胞膜周辺腔または細胞外環境、真核生物については培養培地中に、組換え的に発現されるタンパク質の分泌を容易にするポリペプチドを含み得る。
【０２１０】
本発明の他の有用なタンパク質融合物は、酵母ツーハイブリッドシステム中の餌として本発明のタンパク質の使用を可能にする融合物を含む。Ｂａｒｔｅｌら（編）、Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０１９５１０９３８４）；Ｚｈｕら、Ｙｅａｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅａｔｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（２０００）（ＩＳＢＮ　１−８８１２９９−１５−５）；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．１０（８）：２８６−９２（１９９４）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（５）：４８２−６（１９９４）；Ｌｕｂａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）：５９−６４（１９９５）；Ａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０（１２）：５１１−６（１９９５）；Ｄｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（１）：６４−７０（１９９９）；Ｔｏｐｃｕら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７（９）：１０４９−５５（２０００）；Ｆａｓｈｅｎａら、Ｇｅｎｅ　２５０（１−２）：１−１４（２０００）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。代表的に、このような融合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＬｅｘＡまたは酵母ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインのいずれかに対する。核局在シグナルに融合された餌を発現する関連した餌プラスミドは、利用可能である。
【０２１１】
他の有用なタンパク質融合物としては、上記のような、ファージまたは細胞の表面上にコードされたタンパク質の表示を可能にする融合物、内因的に検出可能なタンパク質（例えば、蛍光タンパク質または光放射タンパク質）への融合物、および安定なタンパク質ドメイン（例えば、ＩｇＧ　Ｆｃ領域のような免疫グロブリン重鎖）への融合物が挙げられる。
【０２１２】
本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントはまた、本発明のタンパク質に結合するかまたはこれを組み込む細胞の特異的切除を行なうために、タンパク質毒素（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、Ｓｈｉｇａ毒素Ａ、炭素菌毒素致死因子、リシン、または他の生物学的に有害な部分）に有用に融合され得る。
【０２１３】
本発明の単離されたタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物は、ネイティブなペプチド結合によって結合される天然のアミノ酸から構成され得るか、またはタンパク質の長さ全体にわたってかもしくはその１つ以上の部分に局在するかのいずれかで、非天然のアミノ酸アナログ、非ネイティブな結合、および合成後（翻訳後）改変の全てもしくはいずれかを含み得る。
【０２１４】
当該分野で周知のように、単離されたタンパク質が使用される場合（例えば、エピトープマッピングについて）、このような非天然のアナログ、非ネイティブな残基間結合、または合成後改変の範囲は、ペプチドの抗体への結合を可能にする範囲に限定される。非ヒト宿主（例えば、マウス）における抗体の調製のための免疫原として使用される場合、このような非天然のアナログ、非ネイティブな残基間結合、または合成後改変の範囲は、タンパク質の免疫原性に干渉しない範囲に限定される。単離されたタンパク質が治療剤（例えば、ワクチン）としてかまたは補充療法のために使用される場合、このような変化の範囲は、単離されたタンパク質に毒性を与えない範囲に限定される。
【０２１５】
固相化学合成の間にかまたは組換え方法によって非天然のアミノ酸を組み込むための技術は、当該分野において十分に確立されている。手順は、特に、Ｃｈａｎら編、Ｆｍｏｃ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２０００年３月）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７２４５）；Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｎｏ７），Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９２年８月）（ＩＳＢＮ：０１９８５５６６８３）；およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（１９９３年１２月）（ＩＳＢＮ：０３８７５６４３１４）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用されている）において記載されている。
【０２１６】
天然のアミノ酸のＤ−エナンチオマーは、化学的ペプチド合成の間に容易に組み込まれ得る；Ｄ−アミノ酸から構築されるペプチドは、タンパク質分解攻撃により耐性である；Ｄ−エナンチオマーの組み込みはまた、ペプチドに対して特定の三次元コンホメーションを与えるために使用され得る。化学合成の間に一般に付加される他のアミノ酸アナログとしては、オルニチン、ノルロイシン、リン酸化アミノ酸（代表的に、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン）、Ｌ−マロニルチロシン（ホスホチロシンのハイブリダイズ不可能なアナログ）（Ｋｏｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２０９：８１７−８２１（１９９５））および種々のハロゲン化フェニルアラニン誘導体が挙げられる。
【０２１７】
検出可能な標識を有するアミノ酸アナログはまた、標識されたポリペプチドを提供するために、合成の間に有用に組み込まれ得る。例えば、ビオチンは、ビオチノイル−−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＦＭＯＣビオサイチン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して付加され得る。（ビオチンはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢｉｒＡ基質ペプチドの融合タンパク質中への組み込みによって酵素的に付加され得る。）ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）−Ｌ−リジンのＦＭＯＣおよびｔＢＯＣ誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して、合成の間にペプチド配列中の選択された部位にダブシル発色団を組み込み得る。アミノナフタレン誘導体ＥＤＡＮＳ（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムにおけるダブシルクエンチャーと対形成するための最も一般的な発色団）は、ＥＤＡＮＳ−−ＦＭＯＣ−Ｌ−グルタミン酸または対応するｔＢＯＣ誘導体（共にＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用することによって、自動化ペプチド合成の間に導入され得る。テトラメチルローダミン発色団は、（ＦＭＯＣ）−−ＴＭＲ−Ｌ−リジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用するペプチドの自動化ＦＭＯＣ合成の間に組み込まれ得る。
【０２１８】
化学合成の間に組み込まれ得る他の有用なアミノ酸アナログとしては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびアリル側鎖保護を有するチロシンアナログ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる；アリル側鎖は、環状ペプチド分枝鎖ペプチド、スルホン化ペプチド、グリコシル化ペプチド、およびリン酸化ペプチドの合成を可能にする。
【０２１９】
化学合成の間に組み込み可能である、大多数の他のＦＭＯＣ保護された非天然アミノ酸アナログは、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されている。
【０２２０】
非天然の残基はまた、所望の非天然のアミノ酸との化学的アミノアシル化によって、サプレッサーｔＲＮＡ（代表的には、ＵＡＧ停止コドンを認識するｔＲＮＡ）を操作することにより生合成的に付加され得る。従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質遺伝子中の目的の部位に選択された停止コドンＵＡＧを導入するために使用される。アシル化サプレッサーｔＲＮＡおよび変異遺伝子が、インビトロ転写／翻訳系において組み合わせられる場合、非天然のアミノ酸は、特定化された位置にそのアミノ酸を含むタンパク質を与えるように、ＵＡＧコドンに応答して組み込まれる。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６（９）：４７８０−５（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９２（５５１６）；４９８−５００（２００１）。
【０２２１】
本発明の単離されたＧＰ２８６タンパク質、タンパク質フラグメントおよび融合タンパク質はまた、環状形態および分枝形態を生じる結合を含む、非ネイティブの残基間結合を含み得る。本発明の単離されたＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントはまた、タンパク質の長さ全体にわたってかまたは１つ以上のその部分に局在してかのいずれかで、翻訳後改変および合成後改変を含み得る。
【０２２２】
例えば、真核生物細胞における組換え発現によって生成される場合、本発明の単離されたタンパク質、フラグメントおよび融合タンパク質は、代表的に、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化を含み、これらのパターンは、タンパク質配列におけるグリコシル化部位の利用可能性および宿主細胞の同一性の両方を反映する。グリコシル化パターンのさらなる改変は、酵素的に行なわれ得る。別の例としては、本発明の組換えポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスから生じるいくつかの場合、改変された開始メチオニン残基を含み得る。
【０２２３】
本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物が、化学合成によって生成される場合、合成後改変が、樹脂からの脱保護および切断の前か、または脱保護および切断の後に、行なわれ得る。合成タンパク質の脱保護および切断の前の改変は、しばしば、例えば、樹脂結合合成ペプチドのＮ末端への改変部分の標的化を可能にすることによって、より大きい制御を可能にする。有用な合成後（および翻訳後）改変は、発光団のような検出可能な標識への結合体化を含む。一方で、リジン残基のＮ末端アミノ基およびεアミノ基と、そして他方で、システイン残基の遊離チオール基と、非変性条件下で反応する、広範な種々のアミン反応性およびチオール反応性の発色団誘導体が、合成されている。
【０２２４】
種々のアミン反応性またはチオール反応性の発色団へのタンパク質の結合体化を可能にするキットが市販されている；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）は、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４３０、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＥＸ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ　４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ−Ｘへのタンパク質の結合体化のためのキットを提供する。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（モノクローナル抗体標識キット）、ＢＯＤＩＰＹ色素、Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ　Ｙｅｌｌｏｗ、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ　Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ　４８８、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ　５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄを含む、広範な種々の他のアミン反応性およびチオール反応性の発色団が、市販されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）。
【０２２５】
本発明のポリペプチドはまた、二官能性連結試薬を使用して、発色団、他のタンパク質、および他の高分子に結合体化され得る。一般的なホモ二官能性試薬としては、例えば、ＡＰＧ、ＡＥＤＰ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ，ＢＭ［ＰＥＯ］３、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ（Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（全てＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる；一般的なヘテロ二官能性架橋剤としては、ＡＢＨ、ＡＭＡＳ、ＡＮＢ−ＮＯＢ、ＡＰＤＰ、ＡＳＢＡ、ＢＭＰＡ、ＢＭＰＨ、ＢＭＰＳ、ＥＤＣ、ＥＭＣＡ、ＥＭＣＨ、ＥＭＣＳ、ＫＭＵＡ、ＫＭＵＨ、ＧＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、Ｍ２Ｃ２Ｈ、ＭＰＢＨ、ＭＳＡ、ＮＨＳ−ＡＳＡ、ＰＤＰＨ、ＰＭＰＩ、ＳＡＤＰ、ＳＡＥＤ、ＳＡＮＤ、ＳＡＮＰＡＨ、ＳＡＳＤ、ＳＡＴＰ、ＳＢＡＰ、ＳＦＡＤ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＡＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、ＳＶＳＢ、ＴＦＣＳ（全てＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【０２２６】
本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物は、このような架橋剤を使用して、アミン反応性またはチオール反応性ではない発色団に結合体化され得る。本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、および融合タンパク質に有用に結合体化され得る他の標識としては、反応性標識、内視鏡的超音波検査造影剤、およびＭＲＩ造影剤が挙げられる。本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物はまた、抗ＧＰ２８６抗体を惹起するための免疫原性を増加させるために、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ、ウシサイログロブリン、およびまさにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対して架橋剤を使用して有用に結合体化され得る。
【０２２７】
本発明のＧＰ２８６タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質融合体はまた、通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合され得る；ＰＥＧ化は、代償療法のために静脈内に投与されるタンパク質の血清半減期を増大する。Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ．９（３−４）：２４９−３０４（１９９２）；Ｓｃｏｔｔら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．４（６）：４２３−３８（１９９８）；ＤｅＳａｎｔｉｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（４）：３２４−３０（１９９９）（これらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ＰＥＧモノマーは、穏やかな条件下で直接的な結合を可能するトレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド）で活性化されたＰＥＧモノマーを使用するＰＥＧ化で、直接的に、またはリンカーを介してタンパク質に結合され得る。
【０２２８】
本発明の単離したＧＰ２８６タンパク質（その融合体を含む）は、典型的には、上記されるような本発明の発現ベクターを使用して組換え発現によって、または特に約１００アミノ酸よりも少ない場合、必要に応じて化学的合成によって（典型的には、固相合成）および時として、インビトロ翻訳によって産生され得る。
【０２２９】
本発明の単離されたタンパク質の産生の後は、必要に応じて精製を行い得る。組換え的に発現されたタンパク質の精製は、今や当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｔｈｏｒｎｅｒら（編），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ　Ａ：Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第３２６巻），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（２０００），（ＩＳＢＮ：０１２１８２２２７３）；Ｈａｒｂｉｎ（編），Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００１）（ＩＳＢＮ：０１９５１３２９４７）；Ｍａｒｓｈａｋら，Ｓｔｒａｔｅｚｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｇａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（ＩＳＢＮ：０−８７９６９−３８５−１）；およびＲｏｅ（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（２００１）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。従って、ここで詳述される必要はない。
【０２３０】
しかし、簡潔には、精製タグが、このようなタグを付加した発現ベクターの使用を介して融合される場合、精製は、タグに適切である手段（例えば、ポリヒスチジンタグについて固定化金属アフィニティークロマトグラフィーの使用）によって、少なくとも部分的にもたらされ得る。当該分野において通常の他の技術としては、硫酸アンモニウム分画、免疫沈降、タンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および分取ゲル電気泳動が挙げられる。化学的に合成されたペプチドの精製は、例えば、ＨＰＬＣによって容易にもたらされ得る。
従って、本発明の局面は、純粋または実質的に純粋な形態において本発明の単離されたＧＰ２８６タンパク質を提供する。本発明の精製されたタンパク質は、上記のように単離されたタンパク質であり、これは、組成物中の総タンパク質に関して質量基準（ｗ／ｗ）において測定される場合、少なくとも９５％の濃度で存在する。このような精製物は、しばしば、例えば、ＨＰＬＣによるようなさらなる精製なしに化学合成の間に得られ得る。本発明の精製されたタンパク質は、９６％、９７％、９８％およびなお９９％の濃度で存在し得る（組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される）。本発明のタンパク質はなお、ＨＰＬＣによるような精製後に、９９．５％、９９．６％およびなお９９．７％、９９．８％またはなお９９．９％のレベルで存在し得る。
【０２３１】
本発明の単離されたタンパク質は、治療薬として（例えば、ワクチンとしてまたは代償療法のために）使用される場合、高レベルの純度は、好ましいが、本発明の単離されたタンパク質はまた、低純度でも有用である。例えば、本発明の部分的に精製されたタンパク質を、免疫原として使用して、実験動物において抗体を惹起し得る。
【０２３２】
従って、本発明は、実質的に精製された形態において本発明の単離されたタンパク質を提供する。本発明の「実質的に精製されたタンパク質」は、組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される、少なくとも７０％の濃度で存在する、上記のような単離されたタンパク質である。通常、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される、少なくとも７５％、８０％、またはなお少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４．５％またはなお少なくとも９４．９％の濃度で存在する。
【０２３３】
好ましい実施形態において、本発明の精製されたタンパク質および実質的に精製されたタンパク質は、検出可能な両性電解質、アクリルアミドモノマー、ビスアクリルアミドモノマーおよびポリアクリルアミドを欠いた組成物中にある。
【０２３４】
本発明のＧＰ２８６タンパク質、フラグメントおよび融合体は、通常、基質に結合され得る。基質は、多孔性、実質的に非多孔性（例えば、プラスチック）または中実；平面または非平面であり；結合は、共有結合または非共有結合であり得る。多孔性基質（通常は、膜）は、典型的に、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）または陽イオン誘導体化された親水性ＰＶＤＦを含み；このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合体を使用して、本発明の固定化タンパク質に特異的に結合する、例えば、血清中の抗体を検出および定量し得る。本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合体は、プラスチックのような、実質的に非多孔性基質に結合する場合、本発明の固体化タンパク質に特異的に結合する、例えば、血清中の抗体を検出および定量するために使用され得る。
【０２３５】
本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合体はまた、表面増強レーザー脱着イオン化供給源（ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ）としての使用に適切である基質に結合され得る；このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントまたは融合体は、第２のタンパク質を結合し、次いで検出するのに有用であり、このタンパク質は、表面結合タンパク質にそれらの間の生物学的な相互作用を示す十分な親和性またはアビディティで結合する。
【０２３６】
本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合体はまた、表面プラズモン共鳴検出における使用に適切である基質に結合され得る。このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントまたは融合体は、第２のタンパク質を結合し、次いで検出するのに有用であり、このタンパク質は、表面結合タンパク質に２つの間の生物学的な相互作用を示す十分な親和性またはアビディティで結合する。
【０２３７】
（抗体および抗体産生細胞）
本発明は、本発明のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合するか、または本発明の単離されたＧＰ２８６核酸によってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに結合する抗体（フラグメントおよびその誘導体を含む）を提供する。抗体は、ネイティブコンホメーションのタンパク質に存在するか、またはいくつかの場合、例えば、ＳＤＳ中での可溶化によって変性されるタンパク質に存在するかのいずれかのようなタンパク質またはタンパク質フラグメントの直線のエピトープ、接触しないエピトープまたはコンホメーションエピトープに特異的であり得る。
【０２３８】
本発明はまた、抗体の結合が、本発明の１つ以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントによって、または本発明の単離されたｇｐ２８６ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）を提供する。
【０２３９】
第１の一連の抗体の実施形態において、本発明は、配列番号２（すなわち、全長ｇｐ２８６タンパク質）におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）ならびにそのフラグメントおよび誘導体を提供する。
【０２４０】
このような抗体は、種々のインビトロ免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロティングおよびＥＬＩＳＡ）において有用である。このような抗体はまた、免疫沈降、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは磁気ビーズ媒介精製（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によるＧＰ２８６タンパク質（関連する交差反応性タンパク質を含む）を単離および精製するのに有用である。このような方法は、当該分野で周知である。抗ＧＰ２８６抗体はまた、Ｔ細胞を同定するのに、Ｔ細胞をマーキングおよび殺傷するのに、およびＴ細胞を検出可能に標識するのに有用である（上記を参照のこと）。
【０２４１】
第２の一連の抗体の実施形態において、本発明は、抗体の特異的な結合は、本発明の単離されたタンパク質およびポリペプチドによって競合的に阻害され得る抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）ならびにそのフラグメントおよび誘導体を提供する。
【０２４２】
他の実施形態において、本発明はさらに、検出可能に標識された上記の抗体を提供し、そしてなお他の実施形態において、基質に結合される上記の抗体を提供する。
【０２４３】
本明細書中において使用される場合、用語「抗体」は、第１の分子種および特異的な結合が可能なままそのフラグメントまたは誘導体に特異的に結合し得る、少なくとも一部が、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチドをいう。
【０２４４】
「特異的に結合する」および「特異的結合」とは、本明細書中で、抗体が、抗体および第１の分子種が、混合される他の分子種に結合するよりむしろ第１の分子種に結合する能力を意図する。抗体が、第１の分子種に特異的に結合し得る場合、この抗体は特に、この第１の分子種を「認識する」と言われる。
【０２４５】
当該分野で周知であるように、抗体が、混合物中の分子種間を識別し得る程度は、混合物中の種のコンホメーションの関連性に部分的に依存する；典型的に、本発明の抗体は、少なくとも２倍、さらに典型的には少なくとも５倍、典型的には１０倍、２５倍、５０倍、７５倍より多くまでおよびしばしば１００倍より多く、ならびに時として５００倍または１０００倍より多く非ＧＰ２８６タンパク質への偶発的な結合を越えて識別する。本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントを検出するために使用される場合、ヒト膵臓および神経組織由来のサンプルにおける本発明のタンパク質の存在を決定するために使用され得る際、本発明の抗体は、十分に特異的である。
【０２４６】
典型的には、本発明のＧＰ２８６タンパク質またはタンパク質フラグメントに対する本発明の抗体（または、ＩｇＭペンタマーの場合、抗体マルチマー）の親和性あるいはアビディティは、少なくとも約１×１０−６モル（Ｍ）、典型的には少なくとも約５×１０−７Ｍ、通常少なくとも約１×１０−７Ｍであり、少なくとも１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍおよび１×１０−１０Ｍの親和性およびアビディティが、特に有用であることがわかっている。
【０２４７】
本発明の抗体は、任意の哺乳動物種由来の天然に存在する形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ）であり得る。
【０２４８】
ヒト抗体は、まれではあるが、ヒトドナーまたはヒト細胞から直接的に引き出され得る。このような場合、本発明のタンパク質に対する抗体は、典型的に、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントでの、偶発的な免疫化（例えば、自己免疫化）から生じる。このような抗体は、典型的に、不変ではないが、ポリクローナルである。
【０２４９】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を使用してさらに頻繁に得られる。このトランスジェニック動物は、本発明のＧＰ２８６タンパク質免疫原で肯定的に免疫され得る。ヒト抗体を産生し得るヒトＩｇトランスジェニックマウスおよび特異的な免疫化によってトランスジェニックマウス由来のヒト抗体を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第５，９３９，５９８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第５，８１４，３１８号；同第５，７８９，６５０号；同第５，７７０，４２９号；同第５，６６１，０１６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号および同第５，５９１，６６９号（これらの開示は、それらの全体が、参考として本明細書中に開示される）を参照のこと。このような抗体は、典型的には、モノクローナルであり、そして典型的には、マウス抗体の産生に関して開発された技術を使用して産生される。
【０２５０】
本発明の抗体が、インビボ診断薬または治療薬として人間に投与されるべきである場合、投与された抗体へのレシピエント免疫応答が、しばしば、マウスのような別の種に由来する抗体の投与によって引き起こされるレシピエント免疫応答より実質的に低いので、ヒト抗体は、特に有用であり、そしてしばしば、好ましい。
【０２５１】
本発明のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ抗体はまた、通常、げっ歯類（典型的には、マウス、だけでなくラット、モルモットおよびハムスター）、ウサギ目の動物（典型的には、ウサギ）およびより大きな哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマも）を含む他の哺乳動物種から得られる。このような場合、ヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる場合と同様に、偶発的な免疫化は、必要とされず、そして非ヒト哺乳動物は、典型的に、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントを用いて、標準的な免疫プロトコルに従って、肯定的に免疫される。
【０２５２】
上記されるように、他のところで上記される（これらの考察は、本明細書中に参考として援用される）ような二機能性のリンカーを都合よく使用して、キャリア、典型的には、ウシサイログロブリン、キーホールカサガイヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンのようなタンパク質に結合される場合、本発明のタンパク質の８個以上連続するアミノ酸の実質的に全てのフラグメントは、免疫原として効果的に使用され得る。
【０２５３】
免疫原性はまた、他の部分と本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントの融合体によって与えられ得る。本発明のペプチドは、例えば、分枝したポリリジンコアマトリクスにおける固相合成によって産生され得る；これらの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）は、高い純度、増大したアビディティ、正確な化学的定義およびワクチン開発において改善した安全性を提供する。Ｔａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５４０９−５４１３（１９８８）；Ｐｏｓｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１７１９−１７２５（１９８８）。
【０２５４】
非ヒト哺乳動物を免疫するためのプロトコルは、当該分野において非常に確立されている（Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）；Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）（ＩＳＢＮ：０−４７１−５２２７６−７）；Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ　Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｔｏ　Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（２０００）（ＩＳＢＮ：０３８７９１５９０７）（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される））。
【０２５５】
非ヒト哺乳動物由来の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ここでポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質の免疫組織化学的検出において特定の利点を有し、そしてモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の特定のエピトープを識別および区別する利点を有する。
【０２５６】
以下の免疫化において、本発明の抗体は、任意の当該分野で受け入れられた技術を使用して産生され得る。このような技術は、当該分野で周知である（Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）（ＩＳＢＮ：０−４７１−５２２７６−７）；Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ　Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｔｏ　Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（２０００）（ＩＳＢＮ：０３８７９１５９０７）；Ｈｏｗａｒｄら（編），Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８４９３９４４５７）；Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）；Ｄａｖｉｓ（編），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第４５巻，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）（ＩＳＢＮ：０８９６０３３０８２）；Ｄｅｌｖｅｓ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ　Ｌｔｄ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４７１９７０１０７）；Ｋｅｎｎｅｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４１２１４１９１４）（これらの全体が、本明細書中に参考として援用される））。従って、ここで詳述する必要はない。
【０２５７】
本発明の抗体のフラグメントまたは誘導体が、所望される場合、宿主細胞における組換え発現は、特に有用である。組換え抗体（抗体全体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体）産生のための宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。
【０２５８】
原核生物宿主は、本発明のファージディスプレイされた抗体ファージディスプレイされた抗体の技術（ここで、抗体可変領域フラグメントは、例えば、線維状のファージ（例えば、Ｍ１３）の表面上でのディスプレイに関して遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に融合される）を産生するのに特に有用である。現在までに十分に確立され（Ｓｉｄｈｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（６）：６１０−６（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：１０２−８（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（１）：１−２０（１９９８）；Ｒａｄｅｒら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：５０３−５０８（１９９７）；Ａｕｊａｍｅら，Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　８：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）；ｄｅ　Ｋｒｕｉｆら，１７：４５３−４５５（１９９６）；Ｂａｒｂａｓら，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：２３０−２３４（１９９６）；Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３３−４５５（１９９４））、そしてこのようなライブラリー由来の抗体フラグメントを産生、成長、スクリーニング（パニング（ｐａｎ））および使用に必要とされる技術およびプロトコルは、最近以下に編集されている：Ｂａｒｂａｓら，Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２００１）（ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４６−３）；Ｋａｙら（編），Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）；Ａｂｅｌｓｏｎら（編），Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．２６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６，５月）（これの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される）。典型的には、ファージディスプレイされた抗体フラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントである；所望される場合、全長抗体は、ディスプレイするファージから完全な抗体に可変領域をクローニングし、そしてさらなる原核宿主細胞または真核宿主細胞において全長抗体を発現することによって産生され得る。
【０２５９】
真核細胞はまた、本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体の発現に有用である。例えば、本発明の抗体フラグメントは、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（１０）：２１３８−４４（２０００）；Ｆｒｅｙｒｅら，Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：１５７−６３（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（Ｐｔ２）：１１７−２０（１９９９）；Ｐｅｎｎｅｌｌら，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（６）：５９９−６０３（１９９８）；Ｅｌｄｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１（１）：６７−７５（１９９７）；およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｆｒｅｎｋｅｎら，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（６）：５８９−９９（１９９８）；Ｓｈｕｓｔａら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（８）：７７３−７（１９９８）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）において産生され得る。
【０２６０】
本発明の抗体（抗体フラグメントおよび誘導体を含む）はまた、昆虫細胞において産生され得る。Ｌｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２１（１）：１２１−８（２００１）；Ａｉｌｏｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ　５８（２−３）：１９６−２０３（１９９８）；Ｈｓｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３（１）：９６−１０４（１９９７）；Ｅｄｅｌｍａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９１（１）：１３−９（１９９７）；およびＮｅｓｂｉｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５１（１−２）：２０１−８（１９９２）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）。
【０２６１】
本発明の抗体ならびにそのフラグメントおよび誘導体はまた、植物細胞において産生され得る。Ｇｉｄｄｉｎｇｓら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１１）：１１５１−５（２０００）；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２９（１）：１２８−３８（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ　１４（２）：８３−９２（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（Ｐｔ２）：１１３−６（１９９９）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（７−８）：８２５−３９（１９９９）；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：１１９−３８（１９９９）；およびＭａら，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９（２）：３４１−６（１９９５）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）。
【０２６２】
本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体の組換え発現に有用な哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞および骨髄腫細胞が挙げられる。Ｖｅｒｍａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２１６（１−２）：１６５−８１（１９９８）は、抗体の発現のための細菌、酵母、昆虫および哺乳動物発現系を概説および比較する。
【０２６３】
本発明の抗体はまた、Ｍｅｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）．１２５（２）：３２８−３３（１９９９）およびＲｙａｂｏｖａら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：７９−８４（１９９７）にさらに記載されるように無細胞翻訳によって調製され得、そしてＰｏｌｌｏｃｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２３１（１−２）：１４７−５７（１９９９）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）にさらに記載されるようにトランスジェニック動物の乳汁に調製され得る。
【０２６４】
本発明は、本発明の１つ以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたｇｐ２８６ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体フラグメント、あるいは本発明の１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって結合が競合的に阻害され得る抗体フラグメントをさらに提供する。
【０２６５】
このような有用なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）’２、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。他の有用なフラグメントは、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（４）：３９５−４０２（１９９８）に記載される。従って、本発明は、本発明の１つ以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離された核酸によってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体誘導体、あるいは本発明の１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る抗体誘導体を提供する。
【０２６６】
このような誘導体のうちでも有用な誘導体は、キメラ抗体、霊長類化抗体およびヒト化抗体である；このような誘導体は、人間において免疫原性は低い。従って、非ヒト哺乳動物種由来の改変されていない抗体インビトロ投与にさらに適切である。
【０２６７】
キメラ抗体は、典型的に別の種（典型的にはヒト）の定常領域に融合した、１種（典型的にはマウス）の免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変領域（ＣＤＲとフレームワーク残基の両方を含む）を含む。例えば、米国特許第５，８０７，７１５号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ．８１（２１）：６８５１−５（１９８４）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３０９（５９６６）：３６４−７（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ　３１４（６０１０）：４５２−４（１９８５）（これらの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２６８】
霊長類化抗体およびヒト化抗体は、典型的には、非ヒト霊長類またはヒト抗体Ｖ領域フレームワーク（通常、ヒト定常領域をさらに含む）に移植されたマウス抗体由来の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含む（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３３２（６１６２）：３２３−７（１９８８）；Ｃｏら，Ｎａｔｕｒｅ　３５１（６３２６）：５０１−２（１９９１）；米国特許第６，０５４，２９７号；同第５，８２１，３３７号；同第５，７７０，１９６号；同第５，７６６，８８６号；同第５，８２１，１２３号；同第５，８６９，６１９号；同第６，１８０，３７７号；同第６，０１３，２５６号；同第５，６９３，７６１号；および同第６，１８０，３７０号（これらの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される））。
【０２６９】
本発明の他の有用な抗体誘導体は、ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体（例えば、二抗体（二重特異性抗体）、単鎖二抗体および内抗体）を含む。
【０２７０】
本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）は、有用なことには、標識され得る。従って、本発明の別の局面は、本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する標識された抗体を提供することである。ずなわち、その結合は、本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る。
【０２７１】
標識の選択は、一部、所望される用途に依存する。本発明の抗体が、組織サンプルの免疫組織化学的染色のために使用される場合、標識は、有用なことには、検出可能な生成物の生成および局所的堆積を触媒する酵素であり得る。代表的にその免疫組織化学的可視化を可能にする抗体に結合体化された酵素は、周知であり、そして、これらとしては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびウレアーゼが挙げられる。本発明の抗体はまた、コロイド状金を使用して標識され得る。
【０２７２】
可視的に検出可能な生成物、発光標識および蛍光標識の生成ならびに堆積のための多数の代表的な物質もまた、周知であり、そしてさらに記載される必要はない。例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３：３３１−５３（１９８６）；Ｋｒｉｃｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１７（１）：６７−８３（１９９６）；およびＬｕｎｄｑｖｉｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１０（６）３５３−９（１９９５）（これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。増強された化学発光検出（ＥＣＬ）のためのキットは、市販されている。
【０２７３】
本発明の抗体が、例えば、フローサイトメトリー検出、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、走査型レーザーサイトメトリー検出、または蛍光イムノアッセイのために使用される場合、これらは、有用なことに、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）で標識される。有用なことには、本発明の抗体に結合し得る広範な種々のフルオロフォア標識が存在する。多くは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡから入手可能である。
【０２７４】
標識されたアビジン、ストレプトアビジン、カプタビジン（ｃａｐａｔａｖｉｄｉｎ）またはニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を使用する二次検出のために、本発明の抗体は、有用なことには、ビオチンで標識され得る。
【０２７５】
本発明の抗体が、たとえば、ウェスタンブロット適用のために使用される場合、これらの抗体は、有用なことには、放射性同位体（例えば、３３Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈおよび１２５Ｉ）で標識され得る。別の例としては、本発明の抗体が放射免疫治療のために使用される場合、この標識は、有用なことには、２２８Ｔｈ、２２７Ａｃ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、２０３Ｐｂ、１９４Ｏｓ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１４９Ｔｂ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、９９ｍＴｃ、９７Ｒｕ、９０Ｙ、９０Ｓｒ、８８Ｙ、７２Ｓｅ、６７Ｃｕまたは４７Ｓｃであり得る。放射標識した抗ＧＰ２８６抗体は、これを必要とする患者において、Ｔ細胞を特異的に標的化および殺傷するために使用され得る。別の例として、本発明の抗体が、インビボの診断用途のために使用される場合、これらの抗体は、ＭＲＩ造影剤（例えば、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌａｕｆｆｅｒら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　２０７（２）：５２９−３８（１９９８））への結合体化によって、または放射性同位体標識によって検出可能にされ得る。当業者に理解されるように、上記の任意の標識の使用は、言及された適用に限定されない。
【０２７６】
本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）はまた、本発明のタンパク質を、提示および／または発現する細胞に対して毒素の除去（ａｂｌａｔｉｖｅ）作用を標的化するために、生物学的に有害な部分（例えば、毒素）に結合体化され得る。上記で考察したように、毒素結合体化抗ＧＰ２８６抗体は、これを必要とする患者においてＴ細胞を結合および殺傷するために使用され得る。一般に、このような免疫毒素中の抗体は、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、志賀毒素Ａ、炭疽毒素致死因子、またはリシンに結合体化される。例えば、Ｈａｌｌ（編）、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６６巻）、Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３７７５４）；およびＦｒａｎｋｅｌら（編）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４０９７５）を参照のこと。これらの開示は、再検討のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２７７】
本発明の抗体は、基板への結合のために有用であり得る。従って、本発明は、本発明の１以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに対して特異的に結合する抗体を提供する。すなわち、その結合は、基材に結合した本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る。基材は多孔性または非多孔性、平面または非平面であり得る。
【０２７８】
例えば、本発明の抗体は、有用なことには、免疫親和性クロマトグラフィーの目的のために、濾過媒体（例えば、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合体化され得る。
【０２７９】
本発明の抗体はまた、有用なことには、代表的にはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、常磁性マイクロスフェアに結合体化され得、次いで、このマイクロスフェアは、本発明のタンパク質を発現または提示する細胞の単離のために使用され得る。別の例として、本発明の抗体は、有用なことには、ＥＬＩＳＡのためのマイクロタイタープレートの表面に結合され得る。
【０２８０】
上記のように、本発明の抗体は、原核生物細胞および真核生物細胞において産生され得る。従って、本発明はまた、本発明の抗体を発現する細胞（本発明の抗体を発現するように組換え的に改変されたハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、および宿主細胞を含む）を提供する。
【０２８１】
本発明はまた、本発明の１以上のＧＰ２８６タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに対して特異的に結合するように進化したアプタマーを提供する。すなわち、その結合は、本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る。
【０２８２】
（薬学的組成物および治療方法）
ＧＰ２８６は、Ｔ細胞上で発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの新規のメンバーである。他の組織および器官における発現は、他の組織のＴ細胞浸潤に起因するようである。細胞表面膜貫通タンパク質であるＧＰ２８６は、その細胞外部分に１つの顕著なＩｇドメインを有し、このドメインは、他のファミリーメンバーにおいて細胞間認識および細胞間接着反応を媒介することが公知である。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーとして、ＧＰ２８６は、免疫系、特にＴ細胞における細胞間認識機能、細胞間結合機能および細胞間接着機能を媒介するために重要である可能性がある。
【０２８３】
従って、本発明は、本発明の核酸、タンパク質および抗体ならびにＧＰ２８６活性の模倣物、アゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤を含む薬学的組成物を提供し、これは、ＧＰ２８６の誤った発現（ｍｉｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関連する障害、状態または疾患の処置（すなわち、寛解）のための薬学的薬剤として、またはＧＰ２８６関連分子および細胞認識経路に関与する他の成分の異常な発現もしくは活性を克服するために、投与され得る。ＧＰ２８６発現は、Ｔ細胞において発現されるので、ＧＰ２８６の誤った発現が、免疫障害もしくは免疫疾患、および／または免疫発達もしくは免疫機能における先天的な欠損に関連し得ることが予測される。
【０２８４】
Ｔ細胞媒介性の疾患としては、限定ではなく、移植障害、自己免疫疾患、癌、多発性硬化症、対宿主性移植片病および川崎病が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺炎、グレーヴズ病、肺線維症、閉塞性細気管支炎、溶血性貧血およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。癌の例としては、白血病およびリンパ腫（急性および慢性の骨髄性白血病ならびに多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。他の免疫障害としては、免疫不全（例えば、ＡＩＤＳ）が挙げられる。
【０２８５】
これらの疾患を有するか、またはこれらの疾患を発症する危険性のある個体を処置するための、ＧＰ２８６調節剤（ＧＰ２８６アンチセンス試薬、ＧＰ２８６リガンドおよび抗ＧＰ２８６抗体を含む）の使用は、本発明の１つの局面である。
【０２８６】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、代表的に、約０．１〜９０重量％（例えば、１〜２０％または１〜１０％）の本発明の治療剤を含む。経口投与のための組成物の固体処方物は、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸カルシウム（ｄｉｃａｒｃｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたはアルギン酸）を含み得る。使用され得る崩壊剤としては、限定ではなく、微小結晶セルロース、コーンスターチ、グリコール酸ナトリウムデンプン、およびアルギン酸が挙げられる。使用され得る錠剤結合剤としては、アカシア、メチルセルロール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースが挙げられる。使用され得る潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油およびコロイド状シリカが挙げられる。
【０２８７】
水または他の水性ビヒクル中に調製される経口投与のための組成物の液体処方物は、種々の懸濁剤（例えば、メチルセルロース、アルギン酸塩、トラガカント、ペクチン、ケルギン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリンドンおよびポリビニルアルコール）を含み得る。液体処方物はまた、活性化合物、湿潤剤、甘味剤ならびに着色剤および矯味・矯臭剤を一緒に含む、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシルを含み得る。種々の液体処方物および粉末処方物は、処置されるべき哺乳動物の肺への吸入のために、従来の方法によって調製され得る。
【０２８８】
組成物の注射可能な処方物は、種々のキャリア（例えば、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エステル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）を含み得る。静脈内注射のために、この化合物の水溶性型が点滴法によって投与され得、それによって抗真菌剤および生理学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物が注入される。生理学的に受容可能な賦形剤としては、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩水、リンゲル溶液または他の適切な賦形剤が挙げられ得る。筋内調製物（例えば、化合物の適切な可溶性塩形態の滅菌処方物）は、薬学的賦形剤（例えば、注射用蒸留水、０．９％の生理食塩水、または５％のグルコース溶液）中に溶解され得、そして投与され得る。化合物の適切な不溶性形態は、水性の基剤または薬学的に受容可能な油基剤（例えば、長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル））中の懸濁物として、調製および投与され得る。
【０２８９】
局所的な半固体軟膏処方物は、代表的に、薬学的なクリーム状基剤のようなキャリア中に、約１〜２０％、例えば、５〜１０％の濃度の活性成分を含む。局所的使用のための種々の処方物としては、活性成分ならびに種々の支持体およびビヒクルを含む、ドロップ、チンキ剤、ローション、クリーム、溶液および軟膏が挙げられる。各薬学的処方物中の治療剤の最適な割合は、処方自体ならびに特定の病理および関連の治療レジメンにおいて所望される治療的効果に従って変化する。
【０２９０】
吸入および経皮的処方物もまた、容易に調製され得る。
【０２９１】
薬学的処方は、十分確立された分野であり、そして以下においてさらに記載される：Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｃｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｌｉｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｌｉｋｉｎｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第３版、（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）（これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。医薬分野の当業者に公知の従来の方法は、患者に薬学的処方物を投与するために使用され得る。
【０２９２】
代表的には、この薬学的処方物は、この薬学的処方物を含む経皮的パッチを患者の皮膚に適用し、そしてこのパッチを患者の皮膚に接触させたままにする（一般に、パッチ当たり、１〜５時間）ことによって、患者に投与される。他の経皮的経路の投与（例えば、局所的に適用されるクリーム、軟膏などの使用による）は、従来の技術を適用することによって使用され得る。これらの薬学的処方物はまた、標準的な技術を使用することによって、他の従来の経路（例えば、経腸的な、皮下の、肺内の、粘膜内の、腹腔内の、子宮内の、舌下の、鞘内の、または筋内の経路）を介して投与され得る。さらに、この薬学的処方物は、例えば、１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月の蓄積投与可能な、または生物分解可能な材料および方法を使用することによって、注射可能な蓄積経路の投与を介して患者に投与され得る。
【０２９３】
投与経路にかかわらず、治療的タンパク質または抗体薬剤は、代表的に、患者の体重１ｋｇ当たり、０．０１ｍｇ〜３０ｍｇの毎日の投薬量（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）で投与される。この薬学的処方物は、所望の場合、所望される毎日の総用量を達成するために、１日当たり複数の用量で投与され得る。処置方法の有効性は、障害の既知の徴候または症状について患者をモニタリングすることによって評価され得る。
【０２９４】
本発明の薬学的組成物は、容器、パッケージまたはディスペンサー中に、単独でかまたは投与のためのラベルおよび手引書を有するキットの一部として、含まれ得る。
【０２９５】
（トランスジェニック動物および細胞）
別の局面において、本発明は、ｇｐ２８６核酸を含むトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト生物、ならびにヒトｇｐ２８６遺伝子の内因性オルソログの破壊を標的化されたトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト生物を提供する。これらの細胞は、胚性幹細胞または体細胞であり得る。これらのトランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体であり得る。ｇｐ２８６は、スプライス改変体ｇｐ２８６またはｇｐ２８６ａであり得る。
【０２９６】
本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ｇｐ２８６ヌクレオチド配列が導入されている受精卵または胚性幹細胞である。このような宿主細胞は、そのゲノムに外因性ｇｐ２８６配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得るか、または動物中の関連の内因性ｇｐ２８６配列を変更もしくは置換するために使用され得る。
【０２９７】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、１以上の動物細胞が導入遺伝子を含んでいる、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはウシ、ヤギ、ヒツジまたはげっ歯類（例えば、ラット、マウス）である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、イヌ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。
【０２９８】
本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、そして成熟動物のゲノム中に保持される外因性ＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する。
【０２９９】
本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、内因性ｇｐ２８６遺伝子が、内因性遺伝子と、動物の発生前に動物の細胞（例えば、動物の胚性幹細胞）中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０３００】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ｇｐ２８６の機能および／または活性を研究するため、ならびにｇｐ２８６活性の調節因子を同定および／または評価するために有用である。これらはまた、ＧＰ２８６タンパク質またはポリペプチドフラグメントを生成するための方法（すなわち、ここで、このタンパク質は、非ヒト哺乳動物の乳腺において生成される）において有用である。
【０３０１】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば、微量注入、レトロウイルス感染によって、受精卵の雄性前核中にｇｐ２８６コード核酸を導入し、そして偽妊娠雌性親マウス中で卵細胞を発生させることによって作製され得る。配列番号１、配列番号１３または配列番号１４のヒトｇｐ２８６ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノム中に導入され得る。あるいは、本発明の単離されたポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって単離されるヒトｇｐ２８６遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスｇｐ２８６遺伝子）は、導入遺伝子として使用され得る。異種転写制御配列の配列、イントロン配列、ポリアデニル化シグナルなどもまた、導入遺伝子に作動可能に連結されて、レシピエント宿主動物において、導入遺伝子の有効性を増大させ得るか、またはさもなければ導入遺伝子の発現を調節し得る（例えば、発生または組織特異的な様式で）。
【０３０２】
胚操作および微量注入によって、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、以下において記載される：米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；Ｈｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ならびにＨｏｇａｎ　１９９９、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ、第二版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ。類似の方法は、他のトランシジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始動物は、この動物の組織または細胞においてゲノム中のｇｐ２８６導入遺伝子の存在および／またはｇｐ２８６　ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ｇｐ２８６をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物とさらに交配され得る。
【０３０３】
相同組換え動物を作製するために、ｇｐ２８６遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製され、このｇｐ２８６遺伝子の少なくとも一部分には、欠失、付加または置換が導入されており、それによってｇｐ２８６遺伝子を変更する（例えば、機能的に破壊する）。ｇｐ２８６遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、１３または１４）であり得るが、より好ましくはヒトｇｐ２８６遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、１３または１４のヒトｇｐ２８６遺伝子のマウスホモログを使用して、マウスゲノム中で内因性ｇｐ２８６遺伝子を変更するために適切な相同組換えベクターを構築し得る。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ｇｐ２８６遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計される。あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ｇｐ２８６遺伝子が変異またはそうでなければ変更されているが、なお機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更され得、これによって内因性ＧＰ２８６タンパク質の発現を変更する）ように設計され得る。相同組換えベクターにおいて、ｇｐ２８６遺伝子の変更された部分は、ベクターによって保有される外因性ｇｐ２８６遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ｇｐ２８６遺伝子との間で相同組換えが生じることを可能にするために、ｇｐ２８６遺伝子のさらなる核酸によってその５’末端および３’末端が隣接される。さらなる隣接ｇｐ２８６核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方で）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの例示的な記載については、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。
【０３０５】
このベクターは、（例えば、エレクトロポレーシションによって）胚性幹細胞株導入され、そして導入されたｇｐ２８６遺伝子が内因性ｇｐ２８６遺伝子で相同的に組換えられた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。次いで、選択された細胞は動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入されて、集合キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ　１９８７、ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＯＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３−１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性親動物中に移植し、胚を出産間近にする。生殖細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させ得る。
【０３０６】
相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、以下にさらに記載される：Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；Ｈｏｇａｎ　１９９９、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ、第二版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０３０７】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載の方法に従って作製し得る。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離し得、そして増殖周期を抜け出しＧ０期に入るように誘導し得る。次いで、この静止期の細胞を、例えば、電気パルスの使用によって、静止期の細胞が単離されたのと同種の動物由来の除核した卵細胞に融合させ得る。次いで、再構築された卵細胞を、桑実胚または未分化胚芽細胞に発生するように培養し、次いで、偽妊娠雌性親動物に移す。この雌性親動物の生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０３０８】
インビボの導入遺伝子の調節された発現を、制御可能な組換え系（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系（例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと）およびＦＬＰ組換え系（Ｏ’Ｇｏｒｍｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３１５−１３５５））を使用して達成し得る。ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系を使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。この系の両方のエレメントを含むトランスジェニック動物を、例えば、２匹のトランスジェニックマウス（各々が、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子またはリコンビナーゼをコードする導入遺伝子のいずれかを含む）を交尾させることによって、獲得し得る。
【０３０９】
（アンチセンス試薬および方法）
（Ａ．アンチセンス）
本発明の単離されたポリヌクレオチドの多くは、ｇｐ２８６ポリヌクレオチドを認識し、そのｇｐ２８６ポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。全長およびフラグメントのアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のフラグメントアンチセンス分子は、（ｉ）ｇｐ２８６　ＲＮＡを特異的に認識し、そしてそのｇｐ２８６　ＲＮＡに特異的にハイブリダイズする分子（ＧＰ２８６をコードするＤＮＡと、他の公知の分子をコードするＤＮＡとの配列比較によって決定される）を含む。ＧＰ２８６をコードするポリヌクレオチドに独特な配列の同定は、任意の公に利用可能な配列データベースの使用によって、および／または市販の配列比較プログラムの使用によって推定され得る。所望の配列の同定の後に、制限消化による単離または当該分野において周知の種々のポリメラーゼ連鎖反応技術のいずれかを使用する増幅が実施され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）によってＧＰ２８６の発現を調節することに特に関する。
【０３１０】
ＧＰ２８６をコードするヌクレオチド配列由来の配列番号１、１３、または１４に記載されるヌクレオチド配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはフラグメント、あるいは、それらに相補的であるかまたは相同な配列は、種々の組織における遺伝子発現を探索するための診断ツールとして有用である。例えば、組織は、この酵素のネイティブな発現またはそれに関連する病理学的な状態を調査するために、従来のオートラジオグラフィー技術によって検出可能な基を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いてインサイチュで探索され得る。特定の局面において、少なくとも約１０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、もしくは約５００ヌクレオチド、またはｇｐ２８６コード鎖全体あるいはそれらの一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２または１５のＧＰ２８６タンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、配列番号１、１３、または１４のＧＰ２８６核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供される。
【０３１１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＧＰ２８６をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」または非コード領域に対するアンチセンスであり得る。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、ヒトＧＰ２８６のタンパク質コード領域は、配列番号１または１４のコード領域に対応する）。
【０３１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、１３、または１４のヌクレオチド配列の調節領域、あるいはそれらに対応するｍＲＮＡ（開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などを含むが、これらに限定されない）に関する。アンチセンス核酸分子は、ｇｐ２８６のコード領域全体または非コード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周りの領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５ヌクレオチド長、約１０ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、約３５ヌクレオチド長、約４０ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長または約５０ヌクレオチド長であり得る。
【０３１３】
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学合成または酵素連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドまたは種々の改変されたヌクレオチド（分子の生物学的安定性を増加させるため、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計される（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る））を使用して化学的に合成され得る。
【０３１４】
あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下のサブセクションにおいてさらに記載されるように、目的の標的核酸へのアンチセンス方向である）。
【０３１５】
本発明のアンチセンス核酸分子（好ましくは、１０〜２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド）は、代表的に、ＧＰ２８６タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかまたは結合して、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、被験体に投与されるかまたはインサイチュで作製される。転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかでのｇｐ２８６発現の抑制は、異常なｇｐ２８６発現によって特徴付けられる疾患／状態に対する細胞モデルまたは動物モデルを作製するために有用である。ｇｐ２８６発現の抑制はまた、他の細胞または細胞外マトリクスへの異常なＴ細胞接着を阻害するのに有用である。
【０３１６】
ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によって、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重鎖らせんの主溝における特異的な相互作用によってであり得る。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による治療的使用に特に意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端に、ポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリン、ポリリジン、またはコレステロール部分を付加することによってさらに改変され得る。
【０３１７】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例としては、組織部位への直接注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するために改変され得、次いで、全身的に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択された細胞表面に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が極力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
【０３１８】
他の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、ａ−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、通常のｂ−ユニットとは異なり、鎖が互いに平行に並ぶ（ｒｕｎ　ｐａｒａｌｌｅｌ）相補的なＲＮＡを有する特定の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０３１９】
（Ｂ．リボザイムおよび触媒核酸）
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、ｇｐ２８６特異的リボザイムの一部（または、改変として、「ヌクレオザイム」）である。リボザイムは、相補的な領域を有する、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、グループＩイントロンリボザイムなど）は、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために使用されて、それによってｇｐ２８６　ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ｇｐ２８６コード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるｇｐ２８６ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号１、１３または１４）に基づいて設計され得る。例えば、米国特許第５，１１６，７４２号；同第５，３３４，７１１号；同第５，６５２，０９４号；および同第６，２０４，０２７号（それらの全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【０３２０】
例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＧＰ２８６コードｍＲＮＡに切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が、構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ｇｐ２８６　ｍＲＡＮは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択するために使用され得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０３２１】
ｇｐ２８６遺伝子の発現は、ｇｐ２８６の調節領域（例えば、ｇｐ２８６プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞におけるｇｐ２８６遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ．ら、（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７−１５を参照のこと。
【０３２２】
（Ｃ．ペプチド核酸（ＰＮＡ））
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物（特に、インビボ投与に有用である）において、糖およびヌクレオシド連結の両方は、新規な基で置換され得る（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。例えば、Ｈｙｒｕｐら、（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：５−２３を参照のこと。ＰＮＡ化合物において、核酸のホスホジエステル骨格は、特に、アミド結合によって連結されるＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を繰り返すことによって、アミド含有骨格で置換される。核酸塩基は、代表的には、メチレンカルボニル連結によって、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら、上記；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ　ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１４６７０−６７５（１９９６）に記載されるように、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【０３２３】
ｇｐ２８６のＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳停止または阻害複製を導入することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためにアンチセンスまたは抗原剤として使用され得る。ｇｐ２８６のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向ＰＣＲクランピングによって、例えば遺伝子に単一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）との組み合わせにおいて使用される場合に、人工制限酵素として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションに対するプローブもしくはプライマーとして使用され得る（Ｈｙｒｕｐら、上記；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、上記）。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、ｇｐ２８６のＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞取り込みを増強するために、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに取り付けることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ｇｐ２８６のＰＡＮ−ＤＮＡキメラが作製され得、これは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得る。このようなキメラによって、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用し得、一方、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、核酸塩基間の結合の数、および方向（Ｈｙｒｕｐ、上記）の点で、選択された適切な長さのリンカーを使用して、連結され得る。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ、上記およびＦｉｎｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３３５７−６３（１９９６）に記載されるように実施され得る。
【０３２５】
例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイト結合化学使用して固体支持体上で合成され得、そして改変ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイト）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８（１９８９））。次いで、ＰＮＡモノマーを、逐次様式で結合して、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を作製する（Ｆｉｎｎら、上記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４（１９７５）を参照のこと。
【０３２６】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：６４８−６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）または血液−脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘引（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘引架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘引切断剤など）に結合され得る。
【０３２７】
ＰＮＡ化学および適用は、特に、Ｒａｙら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１４（９）：１０４１−６０（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ．８６（１）：３−７（２０００）；Ｌａｒｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１４８９（１）：１５９−６６（１９９９）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（３）：３５３−７（１９９９）、およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１）：７１−５（１９９９）（これらの開示は、その全体が本明細書中において参考として援用される）において総説がなされる。
【０３２８】
（診断方法）
（Ａ．核酸診断）
上記のように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、正常に発現される組織（例えば、免疫系組織、特に、Ｔ細胞）、および異常組織ミス発現が疑われる場合、有意なレベルで正常に発現されない組織におけるｇｐ２８６　ｍＲＮＡのレベルを評価するための核酸プローブとして使用され得る。
【０３２９】
従って、本発明は、サンプルを、ｇｐ２８６ポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションによって特異的に検出し得る本発明の単離されたポリヌクレオチドと接触させることによって、生物学的サンプル（例えば、細胞抽出物、患者から誘導される流体または組織サンプル）におけるｇｐ２８６ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を提供する。この方法は、例えば、非免疫組織がＴ細胞で浸潤するか否か（これは、炎症および／または疾患を示し得る）を決定するために有用である。
【０３３０】
好ましくは、この方法は、高度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で、サンプルを単離された核酸と接触させる工程、および単離されたポリヌクレオチドのサンプル中の核酸へのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含し、ここで、このハイブリダイゼーションの存在は、サンプル中のｇｐ２８６コード配列の存在を示す。
【０３３１】
本発明はまた、以下の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝損傷または変異の存在または非存在を同定するための診断アッセイを提供する：（ｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子のミス調節；および（ｉｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質の異常な翻訳後修飾。ここで、野生型形態の遺伝子は、ＧＰ２８６生物学的活性を有するタンパク質をコードする。
【０３３２】
本発明は、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログを同定する方法をさらに提供し、この方法は、核酸ライブラリーを、配列番号１、１３または１４を含む核酸プローブ、または少なくとも１７ヌクレオチドを有するその部分と、高度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする工程；およびこの核酸プローブがライブラリーの核酸配列にハイブリダイズするか否かを決定する工程を包含する。ライブラリーの核酸配列がこのような選択された条件下でハイブリダイズする場合、これは、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログである。
【０３３３】
（Ｂ．抗体診断）
本発明の抗体は、正常に発現される組織（例えば、免疫系組織）、および異常組織ミス発現が疑われる場合、正常に発現されない組織において、ＧＰ２８６タンパク質の発現レベルを評価するために使用され得る。
【０３３４】
従って、本発明は、サンプルを、ＧＰ２８６タンパク質の存在またはその活性のインジケーターを検出し得る薬剤と接触させることによって、生物学的サンプル（例えば、患者由来の細胞抽出物、流体または組織サンプル）においてＧＰ２８６タンパク質の存在またはその活性を検出するための方法を提供する。好ましくは、この薬剤は、ＧＰ２８６タンパク質の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体である。より好ましい実施形態において、抗体は、１つ以上の他のスプライス改変体（ＧＰ２８６またはＧＰ２８６ａ）に特異的である。
【０３３５】
従って、本発明は、ＧＰ２８６タンパク質がサンプル中に存在するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、サンプルを、少なくとも１つのＧＰ２８６エピトープを有する抗体と接触させる工程、および抗体の抗原への特異的結合を検出する工程を包含し、これは、サンプル中のＧＰ２８６タンパク質の存在を示す。この方法は、例えば、非免疫組織がＴ細胞によって浸潤されたか否か（これは、炎症または他の疾患状態を示し得る）を決定するために有用である。
【０３３６】
（Ｃ．疾患を診断するための方法）
本発明のｇｐ２８６単離ポリヌクレオチド、タンパク質およびＧＰ２８６特異的抗体は、異常なｇｐ２８６発現と関連する種々の障害および疾患状態を診断するための方法において有用である。
【０３３７】
従って、本発明は、被験体の疾患状態を診断するための方法を提供し、この方法は、被験体由来の組織サンプル中のＧＰ２８６タンパク質の量または活性を、コントロールサンプル（例えば、健康な被験体から誘導される等価なもの）におけるＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性と比較する工程を包含し、ここで、コントロールサンプルにおけるＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性と比較した組織サンプルにおけるＧＰ２８６ポリペプチドの量または存在における有意な違いは、この被験体が疾患状態を有することを示す。
【０３３８】
好ましい実施形態において、組織サンプルにおけるＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性は、本発明のＧＰ２８６ポリペプチドまたはフラグメントを使用する競合結合アッセイによって、または本発明のＧＰ２８６特異的抗体を使用するイムノアッセイによって評価される。好ましくは、この方法は、膵臓または神経系に関連する疾患状態を診断するために使用される。
【０３３９】
異なる組織における相対的なｇｐ２８６　ｍＲＮＡレベルをモニタリングすることによって被験体における疾患状態を診断するための方法も提供される。好ましくは、この方法は、この被験体由来の試験組織サンプルにおけるｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量を、コントロールサンプルにおけるｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量を比較する工程を包含し、ここで、コントロールサンプルにおける量と比較した試験サンプルにおけるｍＲＮＡの量における有意な差は、この被験体が疾患状態を有することを示す。
【０３４０】
好ましい実施形態において、組織サンプルにおけるｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量は、本発明の単離されたｇｐ２８６ポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントを使用してハイブリダイゼーションによって評価される。好ましくは、この方法は、免疫系（特に、Ｔ細胞に関係するもの）に関連する疾患状態を診断するために使用される。
【０３４１】
（コンピュータ読み取り可能な手段）
本発明のさらなる局面は、本発明のｇｐ２８６核酸配列およびアミノ酸配列を保存するためのコンピュータ読み取り可能な手段である。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される配列番号１〜３３を、配列の完全なセットとしてまたは任意の組み合わせで保存するためのコンピュータ読み取り可能な手段を提供する。コンピュータ読み取り可能な手段の記録は、読み取りおよびディスプレイのため、特定の基準に合うデータについての問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）におけるデータの位置付け、配列の比較、特定のセットの基準に合う配列のアライメントまたは順序付けを可能にするプログラムの適用のためのコンピュータシステムとのインターフェースのためなどにアクセスされ得る。
【０３４２】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、検索分析および配列分析アルゴリズムにおいて有用なデータベースの成分として特に有用である。これらの実施形態において使用される場合、用語「本発明の核酸配列」および「本発明のアミノ酸配列」は、コンピュータ読み取り可能な形態に換算（ｒｅｄｕｃｅ）または保存されるか、あるいは換算または保存され得る、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの任意の検出可能な化学的または物理的特徴を意味する。これらとしては、限定しないが、クロマトグラフィー走査データまたはピークデータ、それら由来の写真データまたは走査データ、および質量分析データが挙げられる。
【０３４３】
本発明は、本発明の配列を保存するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。コンピュータ読み取り可能な媒体は、以下の１つ以上を含み得る：本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列；本発明のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；配列の少なくとも１つが本発明の核酸配列の配列を含む、１セットの核酸配列；配列の少なくとも１つが、本発明のアミノ酸配列の配列を含む、１セットのアミノ酸配列；本発明の１つ以上の核酸配列の配列を含む核酸配列を表すデータセット；本発明の１つ以上のアミノ配列の配列を含むアミノ配列をコードする核酸配列を表すデータセット；少なくとも１つの配列が、本発明の核酸配列の配列を含む、１セットの核酸配列；少なくとも１つの配列が、本発明のアミノ酸配列の配列を含む、１セットのアミノ酸配列；本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列を表すデータセット；本発明のアミノ配列の配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を表すデータセット。コンピュータ読み取り可能な媒体は、情報またはデータを保存するために使用される任意の組成の物体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスクを含む）であり得る。
【０３４４】
従って、本発明は、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログを同定するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、核酸データベースを、配列番号１、１３、または１４からなる問い合わせ配列、または３００以上のヌクレオチドを有するその一部を用いてスクリーニングする工程を包含し、ここで、配列番号１、１３、または１４、またはその一部と少なくとも６５％同一であるが１００％未満同一なデータベース内の核酸配列が、存在する場合、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログである。
【０３４５】
特徴配列（特に、本発明の遺伝子配列）の分析のための方法がまた、本発明によって提供される。配列分析の好ましい方法としては、例えば、配列相同性分析（例えば、同一性分析および類似性分析）、ＲＮＡ構造分析、配列アセンブリ、分岐（ｃｌａｄｉｓｔｉｃ）分析、配列モチーフ分析、オープンリーディングフレーム決定、核酸塩基コーリング（ｃａｌｌｉｎｇ）、および配列決定クロマトグラムピーク分析の方法が挙げられる。
【０３４６】
コンピューターベースの方法を、核酸の相同性の同定を実施するために提供する。この方法は、本発明の核酸の配列を含む核酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および相同性を同定するために、この核酸配列を少なくとも一つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較する工程を包含する。
【０３４７】
コンピューターベースの方法をまた、アミノ酸の相同性の同定を実施するために提供し、この方法は、本発明のポリペプチドの配列を含むアミノ酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および相同性を同定するために、このアミノ酸配列を少なくとも一つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較する工程を包含する。
【０３４８】
コンピューターベースの方法を、またさらに、オーバーラップする核酸配列の構築のために、単一の核酸配列に提供し、この方法は、本発明の核酸の配列を含む第１の核酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の少なくとも１つのオーバーラップする領域をスクリーニングする工程を包含する。
【０３４９】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例証することを意味する。記載した条件およびパラメーターの適切な変更および追加は、分子生物学の分野において通常になされ、このことは、本発明の精神および範囲内であることは、当業者に明らかである。
【０３５０】
以下に記載される実施例について、全てのＲＴ−ＰＣＲおよびフラグメントを、クローニングする前にゲル精製した。このフラグメントを、標準的な方法によって、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲルから切り取り、そして製造者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従い、ＱＩＡＥＸ樹脂を使用してゲルから精製した。このゲル精製したフラグメントを、プラスミドベクターにクローニングし、次いで、このプラスミドを用いて、コンピテントＴＯＰ１０　Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換した。この宿主細胞によって産生されたプラスミドを、標準的なアルカリ溶解ミニプレプ手順（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって単離した。配列決定を、標準的なジデオキシ終結法（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって実施した。
【０３５１】
（実施例１．遺伝子予測および配列分析）
遺伝子予測プログラムを、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたハイスループットゲノム配列データにおける新規な遺伝子を同定するために使用した。ＧｅｎＢａｎｋからのハイスループットゲノム配列データを、以下の遺伝子予測プログラムを使用して分析した：ＧＥＮＳＣＡＮ（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：７８−９４（本明細書中でその全体が参考として援用されている））ならびにＧＥＮＥＭＡＲＫＨＭＭ（ＬｕｋａｓｈｉｎおよびＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙ、１９９８、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：１１０７−１１１５（本明細書中でその全体が参考として援用されている））（これらの使用は、当業者によく知られている）。このＧｅｎＢａｎｋデータ全体を、ローカルサーバーにタウンロードし、個々の配列のコンティグを、配列の入力に伴って提供される注釈に従って分離し、そしてＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＭＡＲＫを、遺伝子を予測するために使用した。この使用したＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＭＡＲＫＨＭＭのパラメーターは、そのプログラムとともに含まれるデフォルトパラメーターであった（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７；ＬｕｋａｓｈｉｎおよびＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙ、１９９８）。遺伝子の予測プログラムの両方から同様の結果が得られたこれらの遺伝子を、さらに分析した。具体的には、この遺伝子配列を、タンパク質に翻訳し、そしてこのタンパク質を、ＧｅｎｐｅｐｔおよびＳｗｉｓｓｐｒｏｔのタンパク質配列データベースのＢＬＡＳＴ分析において問い合わせ配列として使用した。
【０３５２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌを表す）は、配列の類似性を決定するのに適切である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０（本明細書中でその全体が参考として援用されている））。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公共利用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列中のＷ長の短い文字を同定することによってハイスコアリング配列ペア（ｈｉｇｈ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐａｉｒ（ＨＳＰ））を最初に同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さの文字でアライメントした場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、このスコアＴを満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接する文字のスコア閾値として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接する文字のヒットは、サーチを開始するためのシードとして作用し、これらに含むＨＳＰを見出す。文字のヒットは、累積的アライメントスコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸展される。各方向での文字のヒットの伸展は、以下の場合に停止される：１）この累積的アライメントスコアが、最大の達成値から問い合わせ配列Ｘに出くわす場合；２）この累積的アライメントスコアが、１以上の負のスコアを与える残基のアライメントの累積に起因して、０以下になる場合；または３）いずれかの配列の末端に達する場合。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、このアライメントの感度および速度を決定する。このＢｌａｓｔプログラムは、１１の文字長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２、８９、１０９１５−１０９１９（これは、本明細書中でその全体が参考として援用されている））アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【０３５３】
ＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、５８７３−５７８７（これは、本明細書中でその全体が参考として援用されている））およびＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性についての統計的な分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性の測定は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間での一致が偶然生じるかの確率の指標を提供する。例えば、テスト核酸をＧＰ２８６核酸と比較して最小の合計確率が、約１未満、好ましくは、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸がＧＰ２８６の遺伝子またはｃＤＮＡと類似しているとみなされる。
【０３５４】
ＧＰ２８６を、ＢＡＣのコンティグ４９をＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００８６１６（これは，１９９９年８月３日に寄託された）で同定した。この遺伝子の遺伝子スキャン予測は、逆方向であり、そして以下のエキソンを含んだ：エキソン１（開始エキソン）、５３３３２〜５３２８７；エキソン２、４９２９２〜４８９３３；エキソン３、４５７６３〜４５７２２；エキソン４、４５６２７〜４５５１４；エキソン５（終結エキソン）、４５３６８〜４５３３４。このＧＥＮＥＭＡＲＫ予測はまた、逆方向であり、そして以下のエキソンを含んだ：エキソン１（開始エキソン）、５３３１７〜５３２８７；エキソン２，４９２９２〜４８９３３；エキソン３、４５７６３〜４５７２２；エキソン４（終結エキソン）、４５６９２〜４５６５２。このエキソン１、２、および３が、２つの遺伝子予測について、部分的または完全のいずれかでオーバーラップすることに注目した。公共利用可能なＥＳＴデータベースに対するこのクローンのＢｌａｓｔ分析は、ＥＳＴが予測された遺伝子と一致しないことを示した。
【０３５５】
（実施例２：ｇｐ２８６の増幅）
全長配列を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）を使用して、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を実施することによって得た。Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡを、ヒトの組織のｍＲＮＡから合成した二重鎖ｃＤＮＡであり、標準的なアダプターのセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）に連結される。全てのＲＡＣＥ反応は、このキットと共に提供されるアダプタープライマーＡＰ−１、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１１）を使用した。ＧＰ２８６についての５’ＲＡＣＥは、ＣＲ２−１４６、５’−ＴＧＴＴＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡ−３’（配列番号９）と共にＡＰ−１を使用した。ＧＰ２８６についての３’ＲＡＣＥは、ＣＲ２−１４８、５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＴＣＧ−３’（配列番号１０）と共にＡＰ−１（配列番号１１）を使用した。Ａｄｖａｎｔａｑ２　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）を、増幅反応のために使用した。「タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）」ＰＣＲ（Ｄｏｎら、１９９１．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４００８（本明細書中でその全体が参考として援用されている））条件を、熱サイクルに使用したことを除いて、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭキットを、製造者の説明書に従って使用した。熱サイクル条件は、以下の通りであった：９４℃で１分間；９４℃で１５秒間、７２℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、７１℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、７０℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、６９℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、および６８℃で３０秒間の３５サイクル；ならびに６８℃で１０分間。
【０３５６】
（実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰ２８６発現の確認）
ＲＴ−ＰＣＲを、この予測された遺伝子が発現されることを確認するため、および（予測された遺伝子構造ではなく）本当の遺伝子構造を決定するクローニングプロセスを開始するために使用した。プライマーＣＲ２−０３７（４９１１０〜４９１３０を整合するＧＥＮＥＳＣＡＮエキソン２）５’−ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号７）、およびＣＲ２−０３８（４５７３０〜４５７５０を整合するＧＥＮＥＳＣＡＮエキソン３）５’−ＣＴＴＧＣＧＡＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣ−３’（配列番号８）を、製造者の説明書に従って、テンプレート複合組織ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）上で増幅プライマーとして使用した。この複合組織は、ＰＣＲのテンプレートとして二重鎖ヒトｃＤＮＡを提供し、そして以下の組織を含んだ：骨髄、末梢血白血球、肝臓、リンパ節、脾臓、胸腺、および扁桃。ＲＴ−ＰＣＲの熱サイクラー条件は、以下であった：９４℃で１分間；続いて、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で１５秒、の３５サイクル；続いて、７２℃で２分間。末梢血白血球、リンパ節、脾臓、胸腺および扁桃を含有する約２２０〜２５０ｂｐのバンドは、ＧＰ２８６がこれらの免疫系組織中で発現されることを示す（図３）。これらのバンドがＲＴ−ＰＣＲのゲノムＤＮＡ混入物由来でなくスプライスされたｃＤＮＡ由来であることは、バンドのサイズによって示され、これらの２種のプライマーで増幅されたゲノムバンドは、観測された２２０〜２５０塩基ではなく約３４００ｂｐ長であった。胸腺由来のＰＣＲフラグメントを、ゲルから切り取られ、クローニングし、そして配列決定（配列番号３）した。
【０３５７】
別の実験の免疫組織および非免疫組織を、上記のように、ＲＴ−ＰＣＲに供した。この実験において、使用したｃＤＮＡは、以下の組織由来であった：脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、リンパ節、扁桃、およびマウスＴ細胞株ＩＩ−２３。温度制御反応およびゲノムＤＮＡテンプレート制御反応をまた、実施しなかった。図４に示されるように、ｇｐ２８６は、多くの非免疫組織中で検出可能であるが、ｇｐ２８６は、非免疫組織中でよりも免疫組織中でかなりより高度に発現した。ｇｐ２８６は、これらの組織または器官中で浸潤するＴ細胞の存在に起因して、非免疫組織中で観測されると考えられる。
【０３５８】
（実施例４：ＲＡＣＥによる全長ｇｐ２８６ｃＤＮＡの同定）
遺伝子予測プログラムＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＭＡＲＫは、予測可能なエラー比率を有し（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７；ＬｕｋａｓｈｉｎおよびＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙ、１９９８）、ＣＲ２−０３７およびＣＲ２−０３８での増幅により産生されるＲＴ−ＰＣＲフラグメントを、ＧＰ２８６に関するｃＤＮＡ配列の残りを得るために、シード配列として使用した。ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を、ＧＰ２８６によってコードされたｃＤＮＡ配列の残りを決定するために使用した。５’ＲＡＣＥ反応に関して、このプライマーは、ＣＲ２−１４６（５’−ＴＧＴＴＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡ−３’）（配列番号９）であり、そしてテンプレートは、ヒトの胸腺組織から合成されたｃＤＮＡであった（実施例３を参照のこと）。３’ＲＡＣＥに関して、このプライマーは、ＣＲ２−１４８（５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＴＣＧ−３’）（配列番号１０）であり、そしてテンプレートは、ヒトの脾臓組織から合成されたｃＤＮＡであった。この５’ＲＡＣＥから、４５０塩基対のフラグメントが得られた。このフラグメントを、ゲル精製し、クローニングし、そして配列決定（配列番号４）した。このフラグメントの配列は、オリジナルのＰＣＲ産物とオーバーラップし、そしてｃＤＮＡ配列の５’末端を開始コドンに、そして５’非翻訳領域（ＵＴＲ）へと伸長した。３’ＲＡＣＥ産物は、５５０ｂｐ長であり、そして終結コドンを通って、３’ＵＴＲへと伸長した。このフラグメントを、ゲル精製し、クローニングし、そして配列決定（配列番号５）した。
【０３５９】
全長ＧＰ２８６配列（最初のＰＣＲ産物）を構築するために、５’ＲＡＣＥ産物および３’ＲＡＣＥ産物を、ＧＣＧＴＭコンピューターパッケージ中のＡＳＳＥＭＢＬＥプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して、単一の連続配列中に構築した。構築した配列を、表４および配列番号１に示した。
【０３６０】
（実施例５：ノーザンブロット分析によるＧＰ２８６発現の確認）
ノーザンブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号７７９０−１）（これは、種々の起源のヒト細胞株由来のＲＮＡを含む）から購入し、これは、以下を含む：ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病）；ＨｅＬａ（頸部の腺癌）；Ｋ−５６２（慢性骨髄性白血病）；ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）；Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）；ＳＷ４８０（結腸直腸の腺癌）Ａ５４９（肺癌）；およびＧ−３６１（黒色腫）。
【０３６１】
このブロットを、ｇｐ２８６の２３２ｂｐのフラグメント（配列番号３）で検索した。このプローブを、ランダムプライム化方法によって標識した５０ｎｇのｃＤＮＡから調製した（ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８３、Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ＤＮＡ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｔｏ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：　６−１３）。ハイブリダイゼーションを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号８０１５−１）中において６８℃、１時間で実施し、続いて、室温にて２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳで洗浄し、そして５０℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。
【０３６２】
約１．３５ｂｐのバンドを、Ｔ細胞から誘導した細胞株であるＭＯＬＴ−４において観測した。試験した他の細胞株（Ｂ細胞株Ｒａｊｉ、造血細胞株ＨＬ−６０および造血細胞株Ｋ−５６２、ならびに上皮細胞株ＨｅＬａを含む）のいずれも、ｇｐ２８６の発現を示さなかった（図５）。このことは、ｇｐ２８６が、Ｔ細胞において特異的に発現されることを示す。
【０３６３】
（実施例６：相同性配列に関するＢＬＳＡＴサーチ）
Ｉｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって提供された一連のＥＳＴに対するｇｐ２８６配列のＢＬＡＳＴサーチを、実施した。このサーチにより、１１９５塩基対ＥＳＴアセンブリ（またはテンプレート）をテンプレート識別番号２３０５４３．１と同定した。テンプレート識別番号２３０５４３．１は、５４１塩基対にわたって、ｇｐ２８６配列に対して９９％の同一であった。
【０３６４】
【表３】
Figure 2004501630
Ｉｎｃｙｔｅテンプレート配列は、配列同一性が不確定の塩基対（小文字で示される）を含んでいたので、本発明者らは、Ｉｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓから、このテンプレート由来の成分ＥＳＴの１つについてのクローンを得た。次いで、このクローン（番号３９４２６５３によって同定された）を、その全体において配列決定し、そして配列番号１４に示す。
【０３６５】
クローン３９４２６５３のＤＮＡ配列（配列番号１４）を、コードされたタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号１５）と共に、表４に示す。この配列とｇｐ２８６のｍＲＮＡ配列との比較、およびこの配列と登録番号ＡＣ００８６１６（配列番号１３）を有するＢＡＣのコンティグ４９中のゲノム配列との比較は、ｇｐ２８６およびｇｐ２８６ａが、恐らく、同一の遺伝子の代替のスプライシングの産物であることを明らかにする。２種のスプライス形態によってコードされたｍＲＮＡ間の最も顕著な差異は、３’末端であり、これは、タンパク質のカルボキシ末端の細胞質部分をコードする。ｇｐ２８６が約２６個のアミノ酸の細胞質尾部を有した場合、ｇｐ２８６ａは、約１１３個のアミノ酸の細胞質尾部を有する。さらに、ｇｐ２８６が、タンパク質のリン酸化の潜在部位である細胞質尾部中に３個のチロシン残基を有する。リン酸化は、シグナル伝達の重要なモードであり、そしてｇｐ２８６ａは、レセプターとして作用するようである。例えば、Ｉｇドメインを含むタンパク質の細胞外部分が、細胞外分子からのシグナルを受容し得、そしてこのシグナルは、Ｔ細胞中で、細胞質ドメインを介して伝達されて、増殖応答を惹起する。
【０３６６】
（実施例７：ゲノムライブラリーＰＣＲスクリーニングおよびサブスクリーニング）
ｇｐ２８６ゲノム遺伝子座のサブクローニングを、ゲノムライブラリーから、またはゲノムＤＮＡから直接的に、ＰＣＲによって達成し得る。例えば、２μｌのヒトゲノムライブラリー（約１０８ＰＦＵ／ｍｌ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、６ｍｌのＫ８０２細胞（一晩培養）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加し、次いで、２５０ｍｌのアリコートとして、各々の２４本のマイクロチューブに分配した。このマイクロチューブを、１５分間、３７℃でインキュベートする。７ｍｌのアガロース（０．８％）を、各チューブに添加し、混合し、次いで、ＬＢアガロース＋１０ｍｌのＭｇＳＯ４プレート上に注ぎ、そして３７℃で一晩インキュベートした。５ｍｌのＳＭファージ緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、８．１ｍＭ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン）を各プレート（５ｍｌ）に添加し、そしてアガロースの上部を、顕微鏡用のスライドを用いて取り除き、そして５０ｍｌの遠心管に配置した。一滴のクロロホルムを添加し、そしてこのチューブを、３７℃の振盪器に１５分間配置し、次いで、２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＴ６０００卓上用遠心分離器）し、そしてこの上清を、ストック溶液として４℃で保存した。
【０３６７】
次いで、ＰＣＲを、以下を含む２０ｍｌ中で実施した：８．８ｍｌのＨ２Ｏ、４ｍｌの５×ＲＡＰＩＤ−ＬＯＡＤ　ＢＵＦＦＥＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、２ｍｌの１０×ＰＣＲ　ＢＵＦＦＥＲ　ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、２ｍｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、配列番号１または配列番号１４のｇｐ２８６ポリヌクレオチドの５’末端の配列の少なくとも一部分を含む、０．１２ｍｌのプライマー（１ｍｇ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ２８６ポリヌクレオチドの３’末端に対して相補的である配列の少なくとも一部分を含む、０．１２ｍｌのプライマー（１ｍｇ／ｍｌ）、０．２ｍｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ　ＧＯＬＤポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）および２４本のチューブの各々からの２ｍｌのファージ溶液。このＰＣＲ反応は、以下を含む：８０℃で２０分、９５℃で１０分の１サイクル；次いで、９５℃で３０秒、７２℃で４分（サイクル毎に１℃低下させる）６８℃で２分間の２２サイクル；続いて、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒での３０サイクル。この反応物を、２％のアガロースゲル上に充填する。
【０３６８】
正確なサイズのＰＣＲ産物を与えるチューブから、５μｌを、５個の１：１０の希釈物を設定するために使用し、これを、ＬＢアガロース＋１０ｍｌのＭｇＳＯ４プレート上に配置し、そして一晩インキュベートした。ＢＡ８５ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ）を、１時間、各プレートの上部に配置した。フィルターを取り除き、ペトリ皿の上側にファージを配置し、そしてファージを溶出するために、１５分間、４ｍｌのＳＭ緩衝液で覆った。１ｍｌのＳＭ緩衝液を、各プレートから取り除き、そして上記のようにＰＣＲ反応を設定するために使用した。ＰＣＲ産物を得るために最も希釈したプレートを細分し、フィルターを載せ、そしてＰＣＲ反応を繰り返す。このプレートの一連の希釈および細分を、ポジティブなＰＣＲバンドを与える単一のプラークが単離されるまで、続ける。一旦、単一のプラークが単離されると、１０ｍｌのファージ上清を、１プレート当たり１００ｍｌのＳＭおよび２００ｍｌのＫ８０２に添加し、全部で８個のプレートを設定する。このプレートを一晩３７℃でインキュベートする。８ｍｌのＳＭを、各プレートに添加し、そしてアガロースの上部を、顕微鏡用のスライドで擦り落し、そして遠心管中に収集した。
【０３６９】
３滴のクロロホルムを、遠心管に添加する。続いて、このチューブをボルテックスにかけ、１５分間、３７℃でインキュベートし、そして２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＴ６０００卓上用遠心分離器）し、ファージを回収した。回収したファージを使用して、ＱＩＡＧＥＮ　ＬＡＭＢＤＡ　ＭＩＤＩ　ＫＩＴを使用してゲノムファージＤＮＡを単離する。プライマーに関する配列を、本明細書中で示す配列から誘導し得る。
【０３７０】
ｇｐ２８６遺伝子のコード配列をサブクローニングするために、ＰＣＲを、以下を含む５０μｌの反応物中で実施する：３３μｌのＨ２Ｏ、５μｌの１０×ＴＴ緩衝液（１４０ｍＭの硫化アンモニウム、０．１％のゼラチン、０．６ＭのＴｒｉｓ−トリシン　ｐＨ８．４）、５μｌの１５ｍＭｎＭｇＳＯ４、２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、４μｌのゲノムファージＤＮＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ２８６ポリヌクレオチドの最も５’側のコード配列の少なくとも一部分を含む、０．３μｌのプライマー（１μｌ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ２８６ポリヌクレオチドの最も３’側のコード配列の少なくとも一部分に対して相補的である配列を含む、０．３μｌのプライマー（１μｇ／ｍｌ）、０．４μｌのＨＩＧＨ　ＦＩＤＥＬＩＴＹ　Ｔａｇポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。ＰＣＲ反応を、９４℃で２分間の１サイクルで開始し、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒の１５サイクル、そして６８℃で２分間実施した。
【０３７１】
ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上に充填する。期待されるサイズのＤＮＡバンドを、ゲルから切り取り、ＧＥＮＥＬＵＴＥ　ＡＧＡＲＯＳＥスピンカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に配置し、そして１０分間、最大速度で遠心した。溶出したＤＮＡを、エタノールで沈殿させ、そしてライゲーションのために１２μｌ中で再懸濁させた。これらのＰＣＲプライマー配列を、本明細書中で提供される配列から誘導し得る。
【０３７２】
このライゲーション反応は、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの溶液を使用する。この反応は、室温で５分間かけて、４μｌのＰＣＲ産物および１μｌのｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターを含む溶液中で進める。この反応を、１μｌの６×ＴＯＰＯクローニング停止溶液の添加によって終結させた。次いで、このライゲーション産物を、氷上に配置する。２μｌのライゲーション反応物を、ＯＮＥ−ＳＨＯＴ　ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するために使用する。簡潔には、このライゲーション反応物を、この細胞と共に混合し、そして３０分間、氷上に配置する。次いで、この細胞に、３０秒間、４２℃の熱ショックを与え、そして２分間、氷上に配置する。次いで、２５０μｌのＳＯＣを、細胞に添加し、これを、１時間、３７℃で振盪させながらインキュベートし、次いで、アンピシリンプレート上にプレーティングする。
【０３７３】
このプレートからの単一のコロニーを、５ｍｌのＬＢ培地の培養物を播種するために使用する。プラスミドＤＮＡを、ＣＯＮＣＥＲＴ　ＲＡＰＩＤ　ＰＬＡＳＭＩＤ　ＭＩＮＩＰＲＥＰ　ＳＹＳＴＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、この培養物から精製し、次いで、プラスミドＤＮＡの挿入物を、配列決定する。
【０３７４】
ｇｐ２８６ゲノムファージＤＮＡを、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（これは、高度なキャピラリー電気泳動技術およびＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＢＩＧＤＹＥ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用する）を使用して配列決定した。サイクル−配列決定反応物は、１４ｍｌのＨ２Ｏ、１６ｍｌのＢＥＧＤＹＥ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ混合物、７ｍｌのゲノムファージＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）および３ｍｌのプライマー（２５ｎｇ／ｍｌ）を含む。この反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　９６００熱サイクラー中で、以下により実施する：９５℃で５分間；続いて９５℃で３０秒、５５℃で２０秒の９９サイクル、および６０℃で４分間。この産物を、ＣＥＮＴＲＩＦＬＥＸゲル濾過カートリッジを使用して精製し、減圧下で乾燥し、次いで１６μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（テンプレート抑制剤）（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に溶解する。これらのサンプルを、９５℃で５分間加熱し、次いで、３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ中に配置する。
【０３７５】
ｐＣＲＩＩにサブクローニングしたＤＮＡを、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（前出）を使用して配列決定する。各々のサイクル−配列決定反応物は、６ｍｌのＨ２Ｏ、８ｍｌのＢＩＧＤＹＥ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ混合物、５ｍｌのミニプレップＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、および１ｍｌのプライマー（２５ｎｇ／ｍｌ）を含み、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　９６００熱サイクラー中で、９６℃で１０秒間、５０℃で１０秒間の２５サイクル、および６０℃で４分間により実施する。この産物を、ＣＥＮＴＲＩＦＬＥＸゲル濾過カートリッジを使用して精製し、減圧下で乾燥し、そして次いで１６μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ中に溶解する。これらのサンプルを、９５℃で５分間加熱し、次いで、３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ中に配置する。
【０３７６】
（実施例７：ハイブリダイゼーション分析による、組織におけるＧＰ２８６発現）
哺乳動物（例えば、ラット）におけるｇｐ２８６の発現は、インサイチュのハイブリダイゼーション組織化学によって研究され得る。例えば、胸腺、リンパおよび／または脾臓におけるｇｐ２８６発現を研究するために、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇクリオスタットを使用して、ラット組織凍結（２０μｍ厚）を調製する。さらに、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学のために、全血またはリンパ球、特にＴリンパ球のいずれかの富化された画分を含む血液スミアを調製することによって、血液サンプルを調製し得る。インサイチュハイブリダイゼーションのための血液サンプルを調製する方法は、当該分野で周知である。個々の切片を、シラン処理したヌクレアーゼを含まないスライド（ＣＥＬ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に凍結固定し、そして−８０℃で保存する。切片を、固定後に、４％の冷パラホルムアルデヒド中で始めて処理し、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でリンスし、トリエタノールアミン緩衝液中の無水酢酸を使用してアセチル化し、そして室温における７０％、９５％および１００％のアルコールでの一連のアルコール洗浄によって脱水する。続いて、切片をクロロホルム中で脱脂し、続いて、室温で１００％および９５％のアルコールに連続的に暴露することによって再水和する。処理した凍結切片を含む顕微鏡用スライドを、ハイブリダイゼーションの前に空気乾燥させる。他の組織、特にＴ細胞浸潤を示す疑いのある組織を、同様の様式でアッセイし得る。
【０３７７】
ｇｐ２８６特異的プローブを、ＰＣＲおよび配列番号１、配列番号１３または配列番号１４からの配列情報を使用して作製し得る。ＰＣＲ増幅後、フラグメントを制限酵素で消化し、そして同じ酵素を用いて切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩにクローン化する。ｇｐ２８６のセンス鎖に特異的なプローブの生成のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩにクローン化されたクローン化ｇｐ２８６フラグメントを、適切な制限酵素で直線化し得、これはベクター性Ｔ７プロモーターおよび市販のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標識されたランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物（すなわち、ｃＲＮＡリボプローブ）に対する基質を提供する。ｇｐ２８６のアンチセンス鎖に特異的なプローブをまた、組換えプラスミドを適切な制限酵素で切断し、Ｔ３プロモーターおよび同族ポリメラーゼを使用して、標識されたランオフｃＲＮＡ転写物の生成のための直線化基質を生成することにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のｇｐ２８６を使用して容易に調製し得る。上記のように、スプライス改変体特異的プローブを調製して、異なる細胞および組織型のｇｐ２８６と比較したｇｐ２８６の発現を決定し得る。
【０３７８】
リボプローブは、［３５Ｓ］−ＵＴＰで標識されて、アンチセンスリボプローブについて、約０．４０×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性、およびセンス鎖リボプローブについて、約０．６５×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性を生じ得る。続いて、各リボプローブを変性し、そして５０％　ホルムアミド、１０％　デキストラン、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、および１０ｍＭ　ジチオトレイオールを含むハイブリダイゼーション緩衝液に添加する（２ｐｍｏｌ／ｍｌ）。
【０３７９】
得られたラット組織凍結切片、または血液スミアを含む顕微鏡用スライドを、スライド１つあたり４５μｌのハイブリダイゼーション溶液に単独で暴露し、そしてハイブリダイゼーション溶液に暴露されている部分の上にシラン処理されたカバースリップを置き得る。切片を５２℃で一晩（例えば、１５〜１８時間）インキュベートし、ハイブリダイゼーションを起こす。次いで、等量の凍結切片または血液スミアをセンスまたはアンチセンスのｇｐ２８６特異的ｃＲＮＡリボプローブに暴露する。
【０３８０】
ハイブリダイゼーション期間の後、このカバースリップを１×ＳＳＣ中で洗浄し、続いてこのスライドを、３７℃で４５分間、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液中２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ　Ａに暴露することによって、ＲＡａｓｅ　Ａ処理する。次いで、このサンプルを、それぞれ２０分間の、０．１×ＳＳＣ中、５２℃の３回の高いストリンジェンシーの洗浄に供する。一連の洗浄の後、アルコール中７０％、９５％および１００％の酢酸アンモニウムに連続的に暴露し、続いて空気乾燥し、そしてＫＯＤＡＫ　ＢＩＯＭＡＸ　ＭＲ−１フィルムに暴露することによって、このサンプルを脱水する。暴露の１３日後、このフィルムを現像し、そして任意の有意なハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【０３８１】
これらの結果に基づいて、フィルムのオートラジオグラムにより示されるようにハイブリダイズした組織を含むスライドに、ＫＯＤＡＫ　ＮＴＢ−２核トラックエマルジョンをコーティングし、そしてこのスライドを暗室で３２日間保存する。次いで、このスライドを現像し、そしてヘマトキシリンで対比染色する。エマルジョンでコーティングされた部分を、顕微鏡で分析して、標識の特異性を決定する。オートラジオグラフグレイン（アンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによって生成する）が、クレシルバイオレットで染色された細胞体と明らかに会合している場合、このシグナルを特異的であると決定する。細胞体間に見出されるオートラジオグラフグレインは、プローブの非特異的結合を示す。
【０３８２】
（実施例８：ｇｐ２８６−ＲＮＡのノーザンブロット分析）
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行って、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡの発現を試験し得る。配列番号１、配列番号１４またはそれらの相補体の少なくとも一部を含むクローンを、プローブとして使用し得る。ベクター特異的プライマーを、ＰＣＲに使用して、３２Ｐ標識のためのハイブリダイゼーションプローブフラグメントを生成する。ＰＣＲは、以下のように行う：
（１）以下の試薬を混合する：
１μｌ　ｇｐ２８６含有プラスミド
２μｌ　順方向プライマー
２μｌ　逆方向プライマー
１０μｌ　Ｔａｑポリメラーゼのメーカー（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）により提供される１０×ＰＣＲ緩衝液
１μｌ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１９６９０６４）
０．５μｌ　Ｔａｑポリメラーゼ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２７−０７９９−６２）
８３．５μｌ　水。
【０３８３】
（２）以下のプログラムを使用して、サーモサイクラーでＰＣＲを行う：
９４℃で５分；９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で１分を３０サイクル；および７２℃で１０分。
【０３８４】
ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）を使用して精製し得る。この精製したＰＣＲフラグメントを、「Ｒｅａｄｙ　ｔｏ　ｇｏ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２−９２４０−０１）を使用するランダムプライミングによって、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＡ００５／２５０）で標識する。メーカーのプロトコルに従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ由来のヒト多組織ノーザンブロットについてハイブリダイゼーションを行う。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲスクリーン（カタログ番号ＭＤ１４６−８１４）で一晩露光した後、約１．３５ｋｂのバンドを可視化する。上記のように、ｇｐ２８６　ｍＲＮＡおよびｇｐ２８６ａ　ｍＲＮＡの両方を検出するハイブリダイゼーションプローブを使用し得るか、またはｇｐ２８６　ｍＲＮＡまたはｇｐ２８６ａ　ｍＲＮＡのいずれかに特異的にハイブリダイズする改変体特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用し得る。
【０３８５】
（実施例９：真核生物宿主細胞におけるＧＰ２８６の組換え発現）
（Ａ．哺乳動物細胞におけるｇｐ２８６の発現）
ＧＰ２８６タンパク質を生成するために、ＧＰ２８６コードポリヌクレオチドを、組換え技術を使用して発現する。例えば、配列番号２または１５のＧＰ２８６コード配列を、市販の発現ベクターのｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。得られた発現構築物を、トランスフェクション試薬のＦＵＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトする。他の真核生物細胞株（ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ　２９３）およびＣＯＳ細胞を含む）も同様に適切である。
【０３８６】
ＧＰ２８６を安定に発現する細胞を、１００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下における増殖によって選択する。必要に応じて、ＧＰ２８６を、標準的なクロマトグラフィー技術を使用して、細胞から精製し得る。精製を容易にするために、ＧＰ２８６アミノ酸の部分に対応する１つ以上の合成ペプチド配列に対して抗血清を惹起し、そしてこの抗血清を使用してＧＰ２８６を親和性精製する。このＧＰ２８６タンパク質をまた、タグ配列（例えば、ポリヒスチジン、赤血球凝集素またはＦＬＡＧ）とインフレームで発現して、精製を促進する。さらに、ＧＰ２８６ポリペプチドの多くの用途（例えば、以下に記載されるアッセイ）は、宿主細胞からのＧＰ２８６の精製を必要としないことが理解される。
【０３８７】
（Ｂ．２９３細胞におけるＧＰ２８６の発現）
哺乳動物細胞２９３（形質転換されたヒトまたは霊長類の胚性腎臓細胞）におけるＧＰ２８６の発現のために、関連のｇｐ２８６コード配列を有するプラスミドを、ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製する。ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａは、分泌のためのマウスＩｇＫ鎖リーダー配列、抗ｍｙｃ抗体を用いて組み替えタンパク質を検出するためのｃ−ｍｙｃエピトープ、ニッケルキレートクロマトグラフィーを用いて精製するためのＣ末端ポリヒスチジン、および安定なトランスフェクト体の選択のためのゼオシン耐性遺伝子を含む。このｇｐ２８６　ｃＤＮＡの増幅のための順方向プライマーを、標準的な手順によって決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長部分およびｇｐ２８６配列と一致するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順によって決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、クローニングのためのＸｈｏＩ制限部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長部分およびｇｐ２８６配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度として５５℃である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩにクローニングする。ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを使用して、ＤＮＡを精製し、そしてＤＯＴＡＰトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、２９３細胞にトランスフェクトする。一過性にトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、抗Ｈｉｓおよび抗ＧＰ２８６ペプチド抗体を使用してプローブするウエスタンブロットを使用して、発現について試験する。
【０３８８】
永久的にトランスフェクトされた細胞を、Ｚｅｏｃｉｎを用いて選択肢、そして増殖する。組換えタンパク質の産生を、抗Ｈｉｓ、抗Ｍｙｃまたは抗ｇｐ２８６ペプチド抗体でプローブするウエスタンブロットを使用して、細胞および培地の両方から検出する。
【０３８９】
（Ｃ．ＣＯＳ細胞におけるＧＰ２８６の発現）
ＣＯＳ７細胞におけるＧＰ２８６の発現について、例えば、配列番号１もしくは１４の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２もしくは１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、ベクターｐ３−ＣＩにクローニングし得る。このベクターは、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列から上流に位置するＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーターイントロン、および多クローニング部位を含む、ｐＵＣ１８由来プラスミドである。さらに、プラスミドは、安定な形質転換体の選択のためのメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下における選択を提供するｄｈｒｆ（ジヒドロホレートレダクターゼ）を含む。
【０３９０】
順方向プライマーを、慣用的な手順で決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、クローニングのためのＸｂａＩ制限部位を導入する５’伸長部位、続いて配列番号１または１４のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順で決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、ＳａｌＩクローニング部位を導入するヌクレオチドの５’伸長部分、続いて配列番号１または１４のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。
【０３９１】
このＰＣＲは、９５℃で５分の最初の変性工程；９５℃で３０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸長の３０サイクル；続いて７２℃で５分の伸長を包含する。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターｐ３−ＣＩのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位に連結する。この構築物を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。次いで、ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物からプラスミドＤＮＡを精製し、そしてメーカーの仕様書に従って、ＢＲＬ製のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を使用して、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に、この培地および細胞を、組換えタンパク質の発現について試験する。
【０３９２】
ＣＯＳ細胞培養物から発現したＧＰ２８６を、最初に、細胞増殖培地を約１０ｍｇタンパク質／ｍｌまで濃縮することによって精製し得る。この精製は、例えば、クロマトグラフィーによって達成し得る。
【０３９３】
精製したＧＰ２８６を、ＹＭ−１０膜を備えたＡＭＩＣＯＮ濃縮機で、０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして−８０℃で保存する。
【０３９４】
（Ｄ．昆虫細胞におけるＧＰ２８６の発現）
バキュロウイルス系におおけるＧＰ２８６の発現について、配列番号１もしくは１４の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２もしくは１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲによって増幅する。順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、ＮｄｅＩクローニング部位を付加する５’伸長部分、続いて配列番号１または１４のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順によって決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、ＫｐｎＩクローニング部位を導入する５’伸長部分、続いて入れて配列番号１または１４のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。
【０３９５】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして発現ベクターｐＡｃＨＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，，ＣＡ）の対応する部位にクローニングする。このｐＡｃＨＴＬベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多角プロモーター、および多クローニング部位から上流の６×Ｈｉｓタグを含む。リン酸化のためのタンパク質キナーゼ部位および組換えタンパク質の切除のためのトロンビン部位をコードする核酸配列は、多クローニング部位の前にある。
【０３９６】
もちろん、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ２）を、ｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに使用し得る。ＧＰ２８６ポリペプチドの発現のために適切な他のベクターをまた使用し得るが、ただし、ベクター構築物は、転写、翻訳および輸送のための適切に配置されたシグナル（例えば、インフレームのＡＵＧおよびシグナルペプチド）を必要に応じて含む。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０３９７】
このウイルスを、標準的なバキュロウイルス発現方法（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲ　ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ　ＶＥＣＴＯＲＳ　ＡＮＤ　ＩＮＳＥＣＴ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される方法）を使用して、増殖および単離する。好ましい実施形態において、ｇｐ２８６遺伝子を含むｐＡｃＨＬＴ−Ａを、ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤトランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、バキュロウイルスに導入する。感染の２４時間後に、感染細胞を３５Ｓ−メチオニンで放射標識することによって、個々のウイルス単離体をタンパク質産生について分析する。感染細胞を、感染の４８時間後に収集し、そして標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化する。高い発現レベルを示すウイルスを単離し、そしてスケールアップした発現のために使用する。
【０３９８】
Ｓｆ９細胞におけるＧＰ２８６ポリペプチドの発現について、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを、バキュロウイルス発現について上に記載された方法を使用して、ＰＣＲによって増幅し得る。ｇｐ２８６　ｃＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫細胞における発現のためのベクターＡｃＨＬＴ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングする。（バキュロウイルスにおける発現のための上記の同じプライマーを使用して）内部ＮｄｅＩ部位を除去した後に、この挿入物をＮｄｅＩおよびｋｐｎＩ部位にクローニングする。ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを用いて精製し、そしてＳＦ９細胞において発現させる。ＧＰ２８６特異的抗体を使用して、精製していないプラークの予備的ウエスタンブロット実験を、推定サイズの組換えタンパク質の存在について試験する。さらなる精製およびＨｉＧ５細胞における発現の最適化の後に、この結果を確認する。
【０３９９】
（実施例１０：相互作用捕捉／ツーハイブリッドシステム）
ＧＰ２８６相互作用タンパク質についてアッセイするために、相互作用捕捉／ツーハイブリッドライブラリースクリーニング方法を使用し得る。このアッセイは、最初に、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５（１９８９）において記載された。プロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＳＨＯＲＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９９）およびＡｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．ら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、第４版、Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９９２）に公開される。キットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　３）から市販される。
【０４００】
ＧＰ２８６の全てまたは一部をコードする核酸配列と、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）との融合物を、適切なベクター（すなわち、ｐＧＢＫＴ７）を使用して構築する。好ましくは、融合物を、ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａの両方について精製する。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ａｄ）融合ライブラフィーを、潜在的なＧＰ２８６結合タンパク質のｃＤＮＡ由来の第２のプラスミド（すなわち、ｐＧＡＤＴ７）において構築する。ｃＤＮＡライブラリの作製のプロトコルについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）を参照のこと。
【０４０１】
ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰ２８６融合構築物を、配列決定によって確認し、そして自立性レセプター遺伝子活性化および細胞毒性（この両方は、首尾良いツーハイブリッド分析を可能にする）について試験する。類似のコントロールを、ＡＤ／ライブラリー融合構築物を用いて実施して、宿主細胞における発現および転写活性の欠失を証明する。標準的な手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）に従って、酵母細胞に、ＧＰ２８６およびライブラフィー融合プラスミドの両方を形質転換する（約１０５形質転換体／ｍｇＤＮＡ）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰ２８６とＡＤ／ライブラリータンパク質とのインビボ結合により、特定の酵母プラスミドレポーター遺伝子（すなわち、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）の転写が生じる。酵母細胞を栄養不足培地に入れて、レポーター遺伝子の発現についてスクリーニングする。Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド）を補充した培地中で増殖した後、コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性について二連でアッセイする（β−ガラクトシダーゼ活性のフィルターアッセイは、Ｂｒｅｅｄｅｎら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０：６４３（１９８５）に記載される）。陽性のＡＤ−ライブラリープラスミドを、形質転換体からレスキューし、そしてもとの酵母株および無関係のＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を含む他の株に再導入して、特定のＧＰ２８６／ライブラリータンパク質の相互作用を確認する。挿入ＤＮＡを配列決定して、ＧＡＬ４　ＡＤに融合したオープンリーディングフレームの存在を証明し、そしてＧＰ２８６結合タンパク質の同一性を決定する。
【０４０２】
（実施例１１：ＧＰ２８６ポリペプチドに対する抗体）
ＧＰ２８６に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成し、そしてこれらの有用な抗原結合フラグメントまたはそれらの改変体（「ヒト化」改変体および全ヒト抗体を含む）を生成するために、標準的な技術を用いる。このようなプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２および１９９９（前出）、Ｈａｒｌｏｗら編、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０）、およびＨａｒｌｏｗら編、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９９）に見出され得る。いくつかの実施形態において、組換えＧＰ２８６ポリペプチド（またはこのようなポリペプチドを含む細胞もしくは細胞膜）を、抗体を生成するための抗原として使用する。いくつかの実施形態において得、ＧＰ２８６の免疫原性部分に対応するアミノ酸配列を有する１つ以上のペプチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸）を、抗原として使用する。ＧＰ２８６の細胞外部分、特に、親水性細胞外部分が好ましい。抗原をアジュバントと混合するか、またはハプテンに結合して、抗体産生を増加し得る。好ましい実施形態において、２つのスプライス改変体（ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａ）に対して特異的な抗体を、スプライス改変体特異的アミノ酸配列を使用することによって（例えば、異なるアミノ酸配列を有する細胞内ドメインの部分を使用することによって）、調製する。
【０４０３】
（Ａ．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）
１つの代表的なプロトコルにおいて、組換えＧＰ２８６またはその合成フラグメントを使用して、マウスを免疫してモノクローナル抗体を生成するか、またはポリクローナル抗体については、より大きな哺乳動物（例えば、ウサギ）を免役する。これらの抗体は、「パン（ｐａｎ）特異的」抗体と呼ばれ得、この抗体は、両方のスプライス改変体、ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａを認識するか、またはこれらのスプライス改変体の一方のみを認識する抗体であり得る。抗原性を増大するために、ペプチドを、例えば、Ｐｉｅｒｃｅから市販されるキーホールリンペットヘモシアニンに結合し得る。最初の注射について、この抗原をフロイント完全アジュバントと共に乳化し、そして皮下注射する。２〜３週間の間隔で、ＧＰ２８６抗原のさらなるアリコートを、フロイントの不完全アジュバントと共に乳化し、そして皮下注射する。最後のブースト注射の前に、血清サンプルを、この免疫したマウスから採取し、そしてウエスタンブロットによってアッセイして、ＧＰ２８６と免疫反応性の抗体の存在を確認する。この免疫した動物由来の血清は、ポリクローナル抗血清として使用され得るか、またはＧＰ２８６を認識するポリクローナル抗体を単離するために使用され得る。
【０４０４】
あるいは、マウスを屠殺し、モノクローナル抗体の生成のために、それらの脾臓を取り出す。モノクローナル抗体を生成するために、この脾臓を、１０ｍｌの血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０に入れ、そして２ｍＭ　Ｍ−グルタミン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌ　ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｂｉｂｃｏ，Ｃａｎａｄａ）を補充した血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０中でこの脾臓を粉砕することによって、単一細胞の懸濁液を形成する。この細胞懸濁液を濾過し、そして遠心分離によって洗浄し、そして血清を含まないＲＰＭＩに再懸濁する。ネイティブのＢａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を、類似の様式で調製し、そして支持細胞層として使用する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を含むＲＰＭＩ中で、融合前の３日間対数期に保たれたＮＳ−１骨髄腫細胞を、同様に遠心分離し、そして洗浄する。
【０４０５】
ハイブリドーマ融合物を生成するために、免役したマウス由来の脾臓細胞をＮＳ−１細胞と合わせ、そして遠心分離し、そして上清を吸引する。この細胞ペレットを、チューブを叩くことによって取り出し、そして２ｍｌの３７℃のＰＥＧ　１５００（７５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）中５０％）をこのペレットに加えて撹拌し、続いて血清を含まないＲＰＭＩを添加する。その後、この細胞を遠心分離し、１５％　ＦＢＳ、１００μＭ　ナトリウムハイポキサンチン、０．４μＭ　アミノプテリン、１６μＭ　チミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５７単位／ｍｌ　ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５×１０６胸腺細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩに再懸濁し、そして１０の平底９６ウェル組織培養プレートに入れる。
【０４０６】
融合の２、４および６日後に、１００μｌの培地をこれらの組織培養プレートのウェルから取り出し、そして新鮮な培地と交換する。８日目に、融合物をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＧＰ２８６に結合するマウスＩｇＧの存在について試験する。抗ＧＰ２８６抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで、希釈によって、選択したウェルの細胞を、さらにクローニングする。
【０４０７】
（Ｂ．抗ＧＰ２８６モノクローナル抗体のヒト化）
本明細書中に報告されるＧＰ２８６の発現パターン、および治療的介在のための標的としてのＧＰ２８６の可能性は、ＧＰ２８６インヒビター（アンタゴニスト）に対する治療的指標を示唆する。ＧＰ２８６中和抗体は、ＧＰ２８６アンタゴニストとして有用な治療剤の１つのクラスを含む。以下は、抗ＧＰ２８６モノクローナル抗体を「ヒト化」することによって、抗ＧＰ２８６モノクローナル抗体の、ヒトにおける治療剤としての有用性を改善するためのプロトコルである。ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、改善された血清半減期を有し、そしてヒトにおける免疫原性が低い。抗体のヒト化の原理は、文献に記載されている。例えば、相補体への潜在的結合を最小にするためには、ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであることが好ましい。
【０４０８】
ヒト化の１つのレベルは、目的の非ヒト抗体の可変ドメインおよびヒト抗体の定常ドメインを含むキメラ抗体を作製することによって、達成され得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８９）を参照のこと。抗ＧＰ２８６抗体の可変ドメインを、適切なＢ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡからか、またはこのハイブリドーマ由来のｃＤＮＡからクローニングし得る。Ｖ領域の遺伝子フラグメントは、ヒト抗体定常ドメインをコードするエキソンに連結される。得られる構築物は、適切な哺乳動物宿主細胞（例えば、ミエローマ細胞またはＣＨＯ細胞）中で発現される。
【０４０９】
ヒト化のさらに高いレベルを達成するためには、非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする可変領域の遺伝子フラグメントの部分のみが、ヒト抗体配列にクローニングされる。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−３６（１９８８）；およびＴｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：２６６−７１（１９９１）を参照のこと。必要であれば、ＣＤＲ３領域を囲むヒト抗体のβ−シートフレームワークもまた、もとのモノクローナル抗体の抗原結合部位の三次元構造をより綿密に反映するために、改変（すなわち、「復帰突然変異」）される。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎ．４：７７３−７８３（１９９１）；およびＦｏｏｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９（１９９２）を参照のこと。
【０４１０】
代替のアプローチにおいて、目的の非ヒトモノクローナル抗体の表面が、非ヒト抗体の選択された表面残基を、例えば部位特異的変異誘発によって変更し、一方でこの非ヒト抗体の内部残基および接触残基の全てを維持することによって、ヒト化される。Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８（４／５）：４８９−９８（１９９１）を参照のこと。
【０４１１】
上述のアプローチは、抗ＧＰ２８６モノクローナル抗体およびこれらの抗体を産生するハイブリドーマを使用して、利用される。ヒト化抗ＧＰ２８６抗体は、ＧＰ２８６の発現またはリガンドにより媒介されるＧＰ２８６シグナル伝達が所望でない状態を処置または軽減するための治療剤として、有用である。
【０４１２】
（Ｃ．ファージディスプレイ由来のヒトＧＰ２８６中和抗体）
抗ＧＰ２８６抗体はまた、Ａｕｊａｍｅら，Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　８（４）：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＴＩＢＴＥＣＨ　１５：６２−７０（１９９７）；およびＲａｄｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８（１９９７）に記載されるもののような、ファージディスプレイ技術によって生成され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントまたは連結した短鎖Ｆｖフラグメントの形態での、抗体可変領域は、線維状ファージマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ末端に融合される。この融合タンパク質の発現およびこの融合タンパク質の成熟ファージコートへの組み込みは、その表面に抗体を提示し、そしてこの抗体をコードする遺伝物質を含むファージ粒子を生じる。このような構築物を含むファージライブラリーは、細菌において発現され、そしてこのライブラリーは、抗原プローブとして標識ＧＰ２８６または固定化ＧＰ２８６を使用して、ＧＰ２８６特異的ファージ抗体に関してスクリーニングされる。
【０４１３】
（Ｄ．トランスジェニックマウス由来のヒトＧＰ２８６特異的抗体）
ヒトＧＰ２８６特異的抗体は、本質的にＢｒｕｉｇｇｅｍａｎｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１７（８）：３９１−９７（１９９６）およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８（１９９７）に記載されるように、トランスジェニックマウスにおいて生成される。ヒトＶ遺伝子セグメントを生殖細胞系配置で保有し、そしてこれらの導入遺伝子をそのリンパ様組織において発現するトランスジェニックマウスを、従来の免疫プロトコルを使用して、ＧＰ２８６組成物で免疫する。この免疫されたマウス由来のＢ細胞を使用し、従来のプロトコルを使用して、ハイブリドーマを生成し、そしてスクリーニングして、抗ＧＰ２８６ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを同定する（例えば、上記のように）。
【０４１４】
（実施例１２：ＧＰ２８６活性の調節因子を同定するためのアッセイ）
ＧＰ２８６活性の調節因子（アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するためのいくつかの非限定的なアッセイが、以下に記載される。これらのアッセイは、ＧＰ２８６のスプライス改変体の１つのみに対して実施され得るが、好ましい実施形態においては、これらのアッセイは、ＧＰ２８６の両方のスプライス改変体（ＧＰ２８６およびＧＰ２８６ａ）に対して並行に実施される。これらのアッセイによって同定され得る調節因子のうちでも、レセプターの天然リガンド；天然リガンドの合成アナログおよび誘導体；天然の抗体または抗体様コンビナトリアルライブラリー由来の抗体および／または抗体様化合物；ならびに／あるいはライブラリーの高スループットのスクリーニングによって同定される合成化合物などである。
【０４１５】
ＧＰ２８６を結合する全ての調節因子が、組織サンプルにおいてＧＰ２８６を同定するために有用である（例えば、診断目的または治療目的で）。アゴニスト調節因子およびアンタゴニスト調節因子は、ＧＰ２８６媒介疾患を処置するために、ＧＰ２８６活性を、それぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートするために有用である。これらのアッセイは、単一の推定調節因子を使用して実施され得、そして／または候補アンタゴニストと組み合わせた既知のアゴニスト（またはその逆）を使用して実施され得る。
【０４１６】
（Ａ．ｃＡＭＰアッセイ）
１つの型のアッセイにおいて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）のレベルが、候補調節因子化合物に曝露されたｇｐ２８６トランスフェクト細胞において測定される。ｃＡＭＰアッセイのためのプロトコルは、文献に記載されている。例えば、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　３７：２７９（１９６８）；Ｆｒａｎｄｓｅｎら，Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　１８：５２９−５４１（１９７６）；Ｄｏｏｌｅｙら，Ｊ．ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２８３（２）：７３５−４１（１９９７）；およびＧｅｏｒｇｅら，Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　２（４）：２３５−４０（１９９７）を参照のこと。ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓのアデニルシクラーゼ活性化ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥアッセイを使用する、このようなアッセイのための例示的なプロトコルを、以下に記載する。
【０４１７】
簡単に言えば、ＧＰ２８６コード配列を、ｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ細胞を、得られる発現構築物で、公知の方法（例えば、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を供給する場合には、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍによって提供されるトランスフェクションプロトコル）を使用して一時的にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥアッセイキットの９６ウェルマイクロプレートに播種し、これを、ｃＡＭＰに対する抗血清を結合させた固体シンチレーション剤でコーティングする。コントロールとして、いくつかのウェルに、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を播種する。このプレートにおける他のウェルに、標準曲線を作成する際に使用するための種々の量のｃＡＭＰ標準溶液を与える。１つ以上の試験化合物を各ウェルの細胞に添加し、化合物のない培地または緩衝液をコントロールとして用いる。処理後、室温でちょうど１５分間、ｃＡＭＰを細胞中に蓄積させる。このアッセイを、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰを含む溶解緩衝液の添加によって終了し、そしてプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ　ＴＯＰＣＯＵＮＴ　９６ウェルマイクロプレートシンチレーションカウンターを使用して計数する。溶解細胞または標準に由来する非標識ｃＡＭＰと、固定量の［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰとは、このプレートに結合した抗体に関して競合する。標準曲線を構築し、そして未知のものに対するｃＡＭＰ値を、内挿によって得る。試験化合物への曝露に応答しての、細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、ＧＰ２８６の調節活性の指標である。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプに結合するレセプターのアゴニストとして作用する調節因子は、ｃＡＭＰの産生を刺激し、ｃＡＭＰレベルの顕著な（例えば、３〜１０倍の）上昇を導く。Ｇタンパク質のＧｉ／ｏサブタイプに結合するレセプターのアゴニストは、フォルスコリンにより刺激されるｃＡＭＰ産生を阻害し、ｃＡＭＰレベルの顕著な減少（例えば、５０〜１００％）を導く。インバースアゴニストとして作用する調節因子は、構成的に活性であるかまたは既知のアゴニストによって活性化されるかのいずれかであるレセプターにおいて、これらの効果を逆にする。
【０４１８】
（Ｂ．エクオリンアッセイ）
別のアッセイにおいて、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ｐｇ２８６発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築物で、一時的に同時トランスフェクトされる。補因子セレントラジンの存在下で、アポアクオリンは、測定可能な発光を生じ、この発光は、細胞質の遊離カルシウムの量に比例する。一般的に、Ｃｏｂｂｏｌｄら「Ａｅｑｕｏｒｉｎ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｆｒｅｅ　ｃａｌｃｉｕｍ」：ＭｃＣｏｒｍａｃｋ　Ｊ．Ｇ．およびＣｏｂｂｏｌｄ　Ｐ．Ｈ．編，ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＣＡＬＣＩＵＭ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｓｔａｂｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：１１５−２６（１９９７）；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ　ＰＲＯＢＥＳ　ＡＮＤ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，第６版，Ｅｕｇｅｎｅ　ＯＲ（１９９６）を参照のこと。
【０４１９】
１つの例示的なアッセイにおいて、ｇｐ２８６コード配列を、ｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。ＣＨＯ細胞を、得られる発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）で、トランスフェクション試薬ＦＵＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品の挿入物で提供されるトランスフェクションプロトコルを使用して、一時的に同時トランスフェクトする。
【０４２０】
これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、３７℃で２４時間培養する。次いで、この培養培地を、５μＭセレントラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を含む無血清ＭＥＭと交換する。培養を、３７℃でさらに２時間続ける。引き続いて、ＶＥＲＳＥＮ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用してこれらの細胞をプレートから離し、洗浄し、そして無血清ＭＥＭ中に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させる。
【０４２１】
候補ＧＰ２８６調節因子化合物の希釈物を、無血清ＭＥＭ中で調製し、そして不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェルに、５０μＬ／ウェルで分配する。次いで、このプレートをＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に設置する。この装置は、５０μｌの細胞懸濁物を、１回に１つのウェルで各ウェルに分配し、そして即座に、発光を１５秒間読み取るようプログラムされている。候補調節因子についての用量−応答曲線を、各光シグナルピークについての曲線の下の面積を使用して構築する。データを、１部位リガンドについての式を使用して、ＳＬＩＤＥＷＲＩＴＥを用いて分析し、そしてＥＣ５０値を得る。これらの化合物によって引き起こされる発光の変化を、調節活性の指標とみなす。Ｇタンパク質のＧｑサブタイプに結合するレセプターにおいて、アゴニストとして働く調節因子は、１００倍までの発光の増加を与える。インバースアゴニストとして働く調節因子は、構成的に活性であるかまたは既知のアゴニストによって活性化されるかのいずれかのレセプターにおいて、この効果を逆にする。
【０４２２】
（Ｃ．ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）
発光タンパク質ルシフェラーゼは、ＧＰ２８６調節因子を同定するための別の有用なツールを提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞）を、ｇｐ２８６発現構築物および転写因子結合部位（例えば、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＡＰ−１、またはＮＦ−κＢ）の下流のルシフェラーゼタンパク質に対する遺伝子を含むレポーター構築物で、一時的に同時トランスフェクトする。ルシフェラーゼの発現レベルは、シグナル伝達事象の活性化状態を反映する。一般的には、Ｇｅｏｒｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　２（４）：２３５−２４０（１９９７）；およびＳｔｒａｔｏｗａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５７４−５８１（１９９５）を参照のこと。ルシフェラーゼ活性を、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、定量的に測定し得る。
【０４２３】
１つの例示的なアッセイにおいて、ＣＨＯ細胞を、２４ウェル培養プレートに、トランスフェクションの１日前に１０５細胞／ウェルの密度でプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中３７℃で培養する。細胞を、ｇｐ２８６発現構築物およびルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーター構築物で、一時的に同時トランスフェクトする。レポータープラスミド構築物のＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＡＰ−１−ルシフェラーゼおよびＮＦ−κＢールシフェラーゼを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し得る。トランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、供給元の指示書に従って実施する。レポーター構築物単独でトランスフェクトした細胞を、コントロールとして使用する。
【０４２４】
トランスフェクションの２４時間後、これらの細胞を、３７℃に予熱したＰＢＳで１回洗浄する。次いで、無血清ＭＥＭを、これらの細胞に、単独で（コントロール）かまたは１つ以上の候補調節因子と共にかのいずれかで、添加する。次いで、これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートする。その後、これらの細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、そして１００μｌの溶解緩衝液を、Ｐｒｏｍｅｇａによって供給されるルシフェラーゼアッセイキットのウェルごとに添加することによって、溶解する。室温で１５分間のインキュベーションの後に、１５μｌの溶解物を、不透明白色の９６ウェルプレートで５０μｌの基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、そして発光を、Ｗａｌｌａｃｅモデル１４５０ＭＩＣＲＯＢＥＴＡシンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で即座に読み取る。
【０４２５】
候補調節因子化合物の存在下対非存在下での発光の差異は、調節活性の指標である。構成的に活性であるかまたはアゴニストによって活性化されるかのいずれかであるレセプターは、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞と比較して、代表的に３倍〜２０倍の発光の刺激を与える。インバースアゴニストとして作用する調節因子は、この効果を逆にする。
【０４２６】
（Ｄ．ＦＬＩＰＲを用いる細胞内カルシウムの測定）
細胞内カルシウムレベルの変化は、レセプター活性の別の認識された指標であり、そしてこのようなアッセイを使用して、ＧＰ２８６活性の調節因子についてスクリーニングし得る。例えば、ｇｐ２８６発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、４×１０４細胞／ウェルの密度で、Ｐａｃｋａｒｄ黒壁９６ウェルプレート（このプレート上の種々のウェルから発する蛍光シグナルを区別するよう特別に設計されている）にプレートする。これらの細胞を、３６ｍｇ／Ｌピルベートおよび１ｇ／Ｌグルコースを含み、１％ウシ胎仔血清および４種のカルシウム指示色素（ＦＬＵＯ−３　ＡＭ、ＦＬＵＯ−４　ＡＭ、ＣＡＬＣＩＵＭ　ＧＲＥＥＮ−１　ＡＭ、またはＯＲＥＧＯＮ　ＧＲＥＥＮ　４８８　ＢＡＰＴＡ−１　ＡＭ）のうちの１種を、各々４μＭの濃度で添加した改変ダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＤ）中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳで１回洗浄し、そして３７℃で１０分間インキュベートして、残余の色素を細胞膜から除去する。さらに、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳでの一連の洗浄を実施し、その直後にカルシウム応答を活性化させる。
【０４２７】
カルシウム応答を、１種以上の候補レセプターアゴニスト化合物（カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１０μＭ；陽性コントロール）、またはＡＴＰ（４μＭ；陽性コントロール））を添加することによって、開始する。蛍光を、アルゴンレーザー（４８８ｎｍで励起）を備えるＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＤｅｖｉｃｅのＦＬＩＰＲによって測定する。例えば、Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒら，　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４４（１）：１４−２０（１９９８）を参照のこと。検出器カメラのためのＦストップを２．５に設定し、そして露光の長さは０．４ミリ秒である。細胞の基準蛍光を２０秒間測定し、その後、候補アゴニストのＡＴＰまたはＡ２３１８７を添加する。基準蛍光のレベルを応答シグナルから減算する。カルシウムシグナルを２秒ごとに読み取りながら約２００秒間測定する。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７およびＡＴＰは、代表的に、カルシウムシグナルをベースラインレベルの約２００％上に増加させる。一般に、活性化ＧＰ２８６は、ベースラインシグナルの少なくとも約１０〜１５％上に、カルシウムシグナルを増加させる。
【０４２８】
（Ｅ．有糸***誘発アッセイ）
有糸***誘発アッセイにおいて、候補調節因子がｇｐ２８６媒介細胞***を誘導または阻害する能力を決定する。例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ　Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２６７（３）：１５７３−１５８１（１９９３）を参照のこと。例えば、ＧＰ２８６を安定して発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの密度で播種し、そして１０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ中３７℃で４８時間増殖させ、この時点で、これらの細胞を無血清ＭＥＭで２回リンスする。リンス後、８０μｌの新鮮なＭＥＭ、または既知のマイトジェンを含むＭＥＭを、無血清培地中に希釈した種々の濃度の１種以上の試験化合物を含む２０μｌのＭＥＭと共に添加する。コントロールとして、各プレート上のいくつかのウェルに、無血清培地単独を入れ、そしていくつかには１０％ウシ胎仔血清を含む培地を入れる。トランスフェクトされていない細胞またはベクター単独でトランスフェクトされた細胞もまた、コントロールとして働き得る。
【０４２９】
１６〜１８時間の培養の後に、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をこれらのウェルに添加し、そして細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートする。これらの細胞をトリプシン処理し、そして細胞採取器（ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（Ｔｏｍｔｅｃ）を用いてフィルタマット上に収集する；次いで、このフィルタをＢｅｔａｐｌａｔｅカウンターで計数する。無血清試験ウェルへの［３Ｈ］−チミジンの取込みを、血清で刺激した細胞（陽性コントロール）において達成された結果と比較する。複数の濃度の試験化合物の使用により、非線形の、最小自乗当てはめ式Ａ＝Ｂ×［Ｃ／（Ｄ＋Ｃ）］＋Ｇを使用する、用量応答曲線の作成および分析が可能となる。この式において、Ａは、血清刺激のパーセントであり；Ｂは、最大の効果からベースラインを減算したものであり；Ｃは、ＥＣ５０であり；Ｄは、化合物の濃度であり；そしてＧは、最大の効果である。パラメータＢ、ＣおよびＧは、単体の最適化（Ｓｉｍｐｌｅｘ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）によって決定される。
【０４３０】
レセプターに結合するアゴニストは、細胞への［３Ｈ］−チミジンの取込みを増加させ、血清への８０％までの応答を示すと予測される。レセプターに結合するアンタゴニストは、既知のアゴニストを用いて見られる刺激を、１００％まで阻害する。
【０４３１】
（Ｆ．［３５Ｓ］ＧＴＰｇＳ結合アッセイ）
ＧＰ２８６がＧタンパク質媒介経路を通ってシグナル伝達するか否かを評価することが可能である。Ｇタンパク質結合レセプターは、細胞内Ｇタンパク質（これの活性は、ＧＴＰの結合、および結合ＧＤＰを与える加水分解を含む）を通してシグナル伝達する。従って、候補調節因子の存在下および非存在下での、加水分解不可能なＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰｇＳの結合の測定は、調節因子活性のための別のアッセイを提供する。例えば、Ｋｏｗａｌら，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３７：１７９−１８７（１９９８）を参照のこと。
【０４３２】
１つの例示的なアッセイにおいて、ｇｐ２８６発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を、１０ｃｍの組織培養ディッシュ中でサブコンフルエントまで増殖させ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない５ｍｌの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で１回リンスし、そして５ｍｌの同じ緩衝液中に掻き取った。細胞を、遠心分離（５００×ｇ、５分）によってペレット化し、ＴＥＥ緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ）中に再懸濁させ、そして液体窒素中で凍結させる。解凍後、これらの細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（細胞のプレートあたり１ｍｌ　ＴＥＥ）を使用してホモジナイズし、そして１，０００×ｇで５分間遠心分離して、核および破壊されていない細胞を除去する。
【０４３３】
ホモジネートの上清を２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、膜の画分を単離し、そして膜のペレットをＴＥＥで１回洗浄し、そして結合緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させる。再懸濁させた膜を、液体窒素中で凍結させ得、そして使用まで−７０℃で貯蔵し得る。
【０４３４】
上記のように調製され、そして−７０℃で保存された細胞膜のアリコートを、解凍し、ホモジナイズし、そして２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０μＭ　ＧＤＰ、および０．２ｍＭアスコルビン酸を含む緩衝液中に、１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で希釈する。９０μｌの最終容量で、ホモジネートを種々の濃度の候補調節因子化合物または１００μＭ　ＧＴＰと共に、３０℃で３０分間インキュベートし、次いで氷上に置く。各サンプルに、１０μｌグアノシン５’−Ｏ−（３［３５Ｓ］チオ）三リン酸（ＮＥＮ、１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ）を、１００〜２００ｐＭの最終濃度まで添加した。サンプルを３０℃でさらに３０分間インキュベートし、１ｍｌの１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２（４℃）を添加し、そして濾過によって反応を停止させる。
【０４３５】
サンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂフィルタで濾過し、そしてこのフィルタを２０ｍｌの氷冷１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２で洗浄する。フィルタを、液体シンチレーション分光法によって計数する。［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳの非特異的結合を、１００μＭ　ＧＴＰの存在下で測定し、そして全体から減算する。細胞において［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合の量を調節する化合物を選択し、トランスフェクトされていないコントロール細胞と比較する。アゴニストによるレセプターの活性化は、［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合の５倍までの増加を与える。この応答は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４３６】
（Ｇ．ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ）
ＧＰ２８６を発現する細胞における、ＭＡＰキナーゼ活性の評価は、ＧＰ２８６活性の調節因子を同定するための別のアッセイを提供する。例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２６７（３）：１５７３−１５８１（１９９３）およびＢｏｕｌｔｏｎら，Ｃｅｌｌ　６５：６６３−６７５（１９９１）を参照のこと。いくつかの実施形態において、ｇｐ２８６で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、アッセイの４８時間前に、６ウェルプレートに７×１０４細胞／ウェルの密度で播種する。この４８時間の間に、これらの細胞を１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中３７℃で培養する。これらの細胞を１〜２時間血清飢餓させ、その後、刺激因子を添加する。
【０４３７】
アッセイのために、これらの細胞を、培地単独でかまたは候補アゴニストもしくは２００ｎＭ　Ｐｈｏｒｂｏｌエステル−酢酸ミリストイル（すなわち、ＰＭＡ、陽性コントロール）のいずれかを含む培地で処理し、そしてこれらの細胞を、３７℃で種々の時間にわたってインキュベートする。この反応を停止させるために、これらのプレートを氷上に置き、培地を吸引し、そして細胞を、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１ｍｌの氷冷ＰＢＳでリンスする。その後、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１２．５ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、１２．５ｍＭグリセロホスフェート、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．５ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭジチオトレイトール、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、および１μＭオカダ酸）を、これらの細胞に添加する。これらの細胞をプレートから掻き取り、そして２３　３／４Ｇ針を１０回通過させることによってホモジナイズし、そして細胞質ゾル画分を、２０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、調製する。
【０４３８】
細胞質ゾルのアリコート（１〜５μｇのタンパク質を含む５〜１０μｌ）を、１ｍＭ　ＭＡＰＫ基質ペプチド（ＡＰＲＴＰＧＧＲＲ（配列番号９）、Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）および５０μＭ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と混合し、約２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの最終比活性に、総容量２５μｌに希釈する。これらのサンプルを３０℃で５分間インキュベートし、そして反応を、２ｃｍ２の正方形のＷｈａｔｍａｎ　Ｐ８１ホスホセルロース紙上に２０μｌをスポットすることによって、停止させる。これらの正方形のフィルタを、１％Ｈ３ＰＯ４を４回交換して洗浄し、そしてこれらの正方形を液体シンチレーション分光法に供して、結合した標識を定量する。等価な細胞質抽出物を、ＭＡＰＫ基質ペプチドなしでインキュベートし、そしてこれらのサンプル由来の結合した標識を、基質ペプチドを用いた一致するサンプルから減算する。各ウェルからの細胞質抽出物を、分離点として使用する。タンパク質濃度を、色素結合タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定する。このレセプターのアゴニスト活性化は、ＭＡＰＫ酵素活性の５倍までの増加を生じると予測される。この増加は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４３９】
（Ｈ． ［３Ｈ］アラキドン酸放出）
ＧＰ２８６の活性化はまた、細胞におけるアラキドン酸の放出を増強し得、これはまた、ＧＰ２８６活性の修飾因子についてのさらに別の有用なアッセイを提供する。例えば、Ｋａｎｔｅｒｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３９：３６４〜３６９（１９９１）を参照のこと。例えば、ＧＰ２８６発現ベクターで安定にトランスフェクトされるＣＨＯ細胞を、１．５×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェル中にプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ　グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中、使用前に３７℃で４８時間増殖させる。各ウェルの細胞を、［３Ｈ］アラキドン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ．、２１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で、０．５μＣｉ／ｍｌで、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、および０．５％脂肪酸非含有ウシ胎仔血清アルブミンを補充した１ｍｌ　ＭＥＭ中で２時間３７℃でインキュベーションすることによって標識する。次いで細胞を２回、１ｍｌの同じ緩衝液を用いて洗浄する。候補の化合物を、１ｍｌの同じ緩衝液に、単独で、または１０μＭ　ＡＴＰと共にのいずれかで添加し、そして細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。緩衝液単独と、偽トランスフェクト細胞を、コントロールとして使用する。各ウェルからのサンプル（０．５ｍｌ）を、液体シンチレーション分光法によって計数する。レセプターを活性化するアゴニストは、［３Ｈ］アラキドン酸のＡＴＰ刺激放出の増強を誘導する。この増強は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４４０】
（Ｉ．　細胞外酸性化速度）
さらに別のアッセイにおいて、ＧＰ２８６活性の候補修飾因子の効果を、試験化合物により誘導されるｐＨの細胞外変化をモニタリングすることでアッセイする。例えば、Ｄｕｎｌｏｐら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０（１）：４７〜５５（１９９８）。いくつかの実施形態において、ＧＰ２８６発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１２ｍｍカプセルカップ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．）に、４×１０５細胞／カップで、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中に播種する。この細胞を、この培地中で、５％ＣＯ２中３７℃で、２４時間インキュベートする。
【０４４１】
細胞外酸性化速度を、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ　ＭＩＣＲＯＰＨＹＳＩＯＭＥＴＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．）を使用して測定する。このカプセルカップを、ＭＩＣＲＯＰＨＹＳＩＯＭＥＴＥＲのセンサーチャンバーに取り付け、そしてこのチャンバーを、泳動緩衝液（４ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１０単位／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２６ｍＭ　ＮａＣｌを補充した、ビカルボネート非含有ＭＥＭ）で、１００μｌ／分の流動速度で灌流する。候補のアゴニストまたは他の薬剤を、泳動緩衝液中に希釈し、そして第２の流動経路を通して灌流する。各６０秒のポンプサイクルの間に、このポンプを３８秒間作動し、そして残りの２２秒間消す。センサーチャンバーにおける泳動緩衝液のｐＨを、サイクル中の４３〜５８秒から記録し、そしてこのポンプを６０秒で再スタートさせて、次のサイクルを開始させる。記録時間の間の泳動緩衝液の酸性化速度は、Ｃｙｔｏｓｏｆｔプログラムによって計算される。酸性化の速度の変化は、修飾因子候補の添加後に得られた、最も早い速度測定値から、基底値（修飾因子候補の添加の直前の４回の速度測定の平均値）を減算することによって計算される。この選択された機器は、６１ｍＶ／ｐＨ単位を検出する。レセプターのアゴニストとして作用する修飾因子は、アゴニストの非存在下における速度と比較して、細胞外酸性化の速度において上昇をもたらす。この応答は、レセプターのアンタゴニストとして作用する修飾因子によってブロックされる。
【０４４２】
本明細書中で言及される全ての特許、特許公開、および他の刊行物は、それぞれが個々に、そして具体的に本明細書中に参考として援用されて示されるのかのように、その全体が参考として本明細書中に援用される。本発明の好ましい例示的な実施形態が記載されるが、当業者は、本発明は記載される実施形態以外によっても実施され得、この実施形態は例示の目的のみであり、限定をするものではないことが理解される。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、ＧＰ２８６のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。細胞外部分の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインには、下線を引き、そして膜貫通ドメインは、四角で囲んでいる。ｃＤＮＡは、９７３塩基長である。配列番号１および配列番号２を参照のこと。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ＧＰ２８６ａのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。細胞外部分の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインには、下線を引き、そして膜貫通ドメインは、四角で囲んでいる。エキソン−イントロンの境界は、バックスラッシュ（／）で示す。ｃＤＮＡは、１０６５塩基長である。配列番号１４および配列番号１５を参照のこと。
【図３】図３は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定される場合のヒト免疫系組織におけるＧＰ２８６の発現である。ＲＴ−ＰＣＲを、以下の文字に記載されるように実施した：ＢＭ＝骨髄のレーン、ＰＢＬ＝末梢血リンパ球のレーン、Ｌｉ＝肝臓のレーン、ＬＮ＝リンパ節のレーン、Ｓｐ＝脾臓のレーン、Ｔｈｙ＝胸腺のレーン、−＝テンプレートを含まないコントロールのレーン、Ｇｅｎｏｍｉｃ＝ゲノムＤＮＡコントロールのレーン。
【図４】図４は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定される場合のヒト組織におけるＧＰ２８６のＲＮＡの発現である。Ｂ＝脳のレーン、Ｈ＝心臓のレーン、Ｋ＝腎臓のレーン、Ｌｉ＝肝臓のレーン、Ｌｇ＝肺のレーン、Ｐａｎ＝膵臓のレーン、Ｐｌ＝胎盤のレーン、ＳｋＭ＝骨格筋のレーン、ＮＴＣ＝テンプレートを含まないコントロールのレーン、ＬＮ＝リンパ節のレーン、ＩＩ２３＝マウスＴ細胞株ＩＩ−２３のレーン、Ｇ＝ゲノムＤＮＡコントロールのレーン。
【図５】図５は、ノーザンブロットによるヒト細胞株におけるＧＰ２８６のＲＮＡの発現。レーン１：Ｇ−３６１（黒色腫）；レーン２：Ａ５４９（肺癌）；レーン３：ＳＷ４８０（結腸直腸の腺癌）；レーン４：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）；レーン５：ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）；レーン６：Ｋ−５６２（慢性骨髄白血病）；レーン７：ＨｅＬａ（頸部の腺癌）；およびレーン８：ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病）。
【図６】図６Ａ〜図６Ｈは、ヒトゲノムのｇｐ２８６のヌクレオチド配列であり、ｇｐ２８６のエキソンには下線を引いている。メチオニンコドンには、二重線を引き、そして終止コドンには、太線を引いている。配列番号１３を参照のこと。
【図７】図７Ａ〜図７Ｈは、ヒトゲノムｇｐ２８６のヌクレオチド配列であり、ｇｐ２８６ａのエキソンには、強調表示をし、そして下線を引いている。開始するメチオニンコドンには、二重線を引き、そして終止コドンには、太線を引いている。配列番号１３を参照のこと。
【図８】図８は、ＧＰ２８６（配列番号２、上の配列）とマウスＴ細胞レセプターβ鎖（配列番号６、下の配列）との間の相同性である。垂直な線は、同一性を示し、そして点線はギャップを示す。[0001]
(Related application)
This application is related to US Provisional Patent Application No. 60 / 283,813 filed on April 13, 2001 and US Provisional Patent Application No. 60 / 213,630 filed on June 23, 2000. , And each of the disclosures of these provisional patent applications is incorporated herein by reference.
[0002]
(Field of the Invention)
The present invention relates generally to the field of molecular biology. More particularly, the invention relates to members of the immunoglobulin superfamily.
[0003]
(Background of the Invention)
The mechanism by which cells of an organism communicate with each other and obtain information and stimuli from these environments involves cell membrane receptor molecules expressed on the cell surface. Cell surface receptors are the first essential link that converts extracellular signals into the physiological response of the cell. A number of such receptors have been identified, characterized, and have sometimes been assigned to the major receptor superfamily based on biological functions such as conserved structural motifs and signaling properties.
[0004]
A superfamily is broadly defined as a group of proteins that share a certain degree of sequence homology (usually at least 15%). Conserved sequences shared by members of a superfamily often contribute to the formation of a compact tertiary structure called a domain, and often the entire sequence of a domain that characterizes a particular superfamily is encoded by a single exon ( See, for example, Abbas et al., CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, WB Saunders Co., Philadelphia, PA. 1997). Superfamily members appear to derive from a common precursor gene by divergent evolution, and multidomain proteins may belong to more than one superfamily. Examples of protein superfamilies include the following: ligand-gated ion channel receptor superfamily, voltage-gated ion channel receptor superfamily, receptor tyrosine kinase superfamily, receptor protein tyrosine phosphatase superfamily, G protein-coupled receptor superfamily And the immunoglobulin (Ig) superfamily.
[0005]
The immunoglobulin (Ig) superfamily encompasses a number of structurally related proteins with a wide variety of functions. Ig superfamily molecules mediate recognition, adhesion, and binding in the immune system (see, eg, Abbas et al., Supra), and other functions besides the immune system. Members of the Ig superfamily, originally derived from immunoglobulin heavy and light chains, share partial amino acid sequence homology and structural features with Ig (eg, the so-called “Ig domain”). An Ig domain is a three-dimensional spherical structure having about 70 to 110 amino acid residues and an internal Cys-Cys disulfide bond. These domains comprise two layers of β-pleated sheets, each layer composed of 3-5 antiparallel chains of 5-10 amino acid residues. Ig domains are classified as V-like or C-like based on the closest homology to either the IgV or IgC domain. For a general view, see, for example, Abbas et al., Supra.
[0006]
The most identified members of the Ig superfamily are endogenous plasma membrane proteins with one or more Ig domains in the extracellular part, the widely branched cytoplasmic tail (usually without endogenous enzyme activity). It is. There are exceptions to these summaries. One repetitive property of Ig superfamily members is that interactions between Ig domains in different polypeptide chains (of the same or different amino acid sequences) are essential for the biological activity of the molecule. Heterophilic interactions can also occur between Ig domains in totally distinct molecules expressed on the surface of different cells. Such an interaction provides an adhesive force that stabilizes cell-cell binding.
[0007]
Many members of the Ig superfamily are cell surface or soluble molecules that mediate cell recognition, adhesion and binding functions in the vertebrate immune system. Two prominent cell types that produce Ig superfamily molecules are B lymphocytes and T lymphocytes. Exemplary Ig superfamily member proteins important in the immune system include: antibodies, T cell receptors, major histocompatibility complex (MHC) class I molecules and major histocompatibility complex class II molecules, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD20 (B1), CD32 (FcgRII), CD44, CD54 (ICAM-1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD90 (Thy-1 ), CD102 (ICAM-2), CD106 (VCAM-1), CD121 (IL-1R), CD152 (CTLA-4), p-IgR, NCAM, and CD140 (PDGFR) (Abbas et al., Supra).
[0008]
B lymphocytes are responsible for humoral immunity. Genetic recombination of the genes encoding the immunoglobulin heavy and light chains occurs within B cells. Ig heavy and light chains are composed of regions from separate genes. Both heavy and light chains have a variable (V) segment, a constant (C) segment, and a joining (J) segment that is joined in frame by genetic recombination between B cell mutations (Abbas et al. 1997). In addition, heavy chains have additional segments termed diversity (D) segments (Abbas et al., 1997). This genetic rearrangement allows for the expression of functional molecules called Igs or antibodies. During genetic recombination, an excess of antibodies with specificity for a vast array of antigens can be produced due to the majority of genes that can be used to make heavy and light chains.
[0009]
B cells produce both membrane-bound and secreted forms of Ig. B cells can be immunologically tested under conditions where soluble factors necessary for "auxiliary" B cells to produce antibodies in secreted form are present when the antigen binds to membrane-bound antibodies on the surface of the B cells. Be activated.
[0010]
T lymphocytes are responsible for cell-mediated immunity. T cells are immunologically activated when they interact with antigen presenting cells via T cell receptors and numerous co-receptors and adhesion molecules. T cell receptors are multiprotein complexes consisting of invariant CD3γ, CD3δ, CD3ε proteins, and variable αβ or γδ receptors that bind to CD3ζ protein. T cell receptors specifically recognize MHC antibody complexes on antigen presenting cells (Cantrell et al., 1995, pp. 151-163 in T Cell Receptors, Bell, JI, MJ Owen and E). Oxford University Press, New York), edited by Simpson. Other T cell surface molecules that contribute to MHC recognition include CD4 and CD8, while molecules such as CD28, CTLA4, CD5 and CD44 recognize non-MHC molecules on the surface of antigen-producing cells.
[0011]
Ig superfamily members continue to be identified, for example, in immune and non-immune tissues in the nervous system. Based on these conserved structural motifs, these novel Ig superfamily members are likely to perform cell recognition, binding, and adhesion functions as well. New Ig superfamily members are suitable targets for the treatment of immune, autoimmune and immunological diseases. Because Ig superfamily members work with other Ig superfamily members in the immune and non-immune systems.
[0012]
(Summary of the Invention)
The present invention is based (at least in part) on the discovery of a gene encoding a previously unknown Ig superfamily member (designated GP286). (Unless otherwise indicated, lowercase names (gp286) refer to novel nucleic acids of the invention, whereas uppercase names (GP286) refer to novel polypeptides of the invention). (Additionally, the terms “gp286” and “GP286” both refer to splice variants of the invention; see below).
[0013]
The human gp286 cDNA described below (SEQ ID NO: 1) has a 558 base pair open reading frame encoding a 186 amino acid protein (SEQ ID NO: 2). The human gp286 gene is located on chromosome 19 and encodes a GP286 protein predicted to have a single transmembrane domain and one immunoglobulin (Ig) domain (the extracellular portion of the protein) in the N-terminus. Code. gp286 mRNA is enriched in T lymphocytes and is detectable in various immune system tissues, such as peripheral blood lymphocytes, lymph nodes, thymus and tonsils. In addition, gp286 mRNA is detectable at low levels in some non-immune tissues, likely due to infiltration of T cells into these non-immune tissues. The protein structure and tissue distribution of GP286 indicates a role for GP286 in the interaction of T cells with other cells or the extracellular milieu during the immune response. GP286a appears to be a splice variant of GP286. In contrast to GP286, GP286a has an 834 base pair open reading frame (SEQ ID NO: 14) encoding a 278 amino acid protein (SEQ ID NO: 15). Like GP286, the GP286a protein is predicted to have one transmembrane domain and one extracellular Ig domain.
[0014]
Novel Ig superfamily members (eg, GP286; which are expressed at high levels in T cells), which are localized to specific cell types, are useful for diagnostic purposes and in forensic science. It is. Tissue-specific Ig superfamily members may also be associated with abnormal cell-cell adhesion and signal transduction in tissues, e.g., during tissue development and tissue regeneration following tissue damage and injury. Suitable therapeutic targets for treating conditions, disorders and / or diseases. For example, GP286 and GP286a are useful in mediating cell adhesion of T cells to extracellular matrix molecules and to other cells.
[0015]
The present invention relates to a polypeptide comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence that is at least 80% (85%, 95% or 98%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the Ig domain of SEQ ID NO: 2. Characterized by nucleotides. In some embodiments, the polynucleotide has the sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof having at least 17 nucleic acid units (eg, nucleotides). Examples of such fragments are SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 16, 20, 22, 26, 28 and 32.
[0016]
In some embodiments, the invention encodes a protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence that is at least 80% (85%, 95% or 98%) identical to the Ig domain of SEQ ID NO: 15. A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of In some embodiments, the polynucleotide has the sequence of SEQ ID NO: 14, or a fragment thereof having at least 17 nucleic acid units (eg, nucleotides). Examples of such fragments are SEQ ID NOs: 18, 24 and 30.
[0017]
In some embodiments, the polynucleotide comprises the sequence of SEQ ID NO: 13, or a fragment thereof having at least 17 nucleic acid units. Examples of such fragments are SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, and 32.
[0018]
The invention provides a polynucleotide encoding a naturally occurring allelic variant of a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, wherein the nucleic acid is a stringent Hybridizes under the conditions to any of SEQ ID NO: 1, 13 or 14.
[0019]
The invention also provides an isolated polynucleotide encoding a selected portion of GP286. As discussed further herein below, these "nucleic acid fragments" can be used, for example, to express a particular portion of GP286, either alone or as an element of a fusion protein. Nucleic acid fragments can also be used as region-specific nucleic acid probes.
[0020]
The present invention also provides an isolated amino acid sequence comprising at least 80% (85%, 95% or 98%) identical to the Ig domain encoded by the amino acid sequence of either SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15. GP286 protein is provided.
[0021]
The present invention also provides an isolated GP286 protein encoded by a polynucleotide having a sequence that is at least about 65%, preferably 75%, 85%, or 95% identical to either SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14. And a polynucleotide having a sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having the sequence of any of SEQ ID NOs: 1 or 14.
[0022]
The invention provides gp286 polynucleotides that specifically detect gp286 nucleic acids in relation to nucleic acids encoding other members of the Ig superfamily. The invention also provides a nucleic acid construct (eg, a recombinant vector (eg, an expression vector)), which comprises a gp286 polynucleotide of the invention.
[0023]
The present invention also provides the following: (i) abnormal modification or mutation of the gene encoding the GP286 protein; (ii) dysregulation of the gene encoding the GP286 protein; and (iii) abnormal mutation of the GP286 protein. A diagnostic assay for identifying the presence or absence of a damage or mutation in a gene characterized by at least one of a post-translational modification, wherein the wild-type form of the gene is a biological activity of GP286. Encodes a protein having
[0024]
A host cell comprising such a nucleic acid construct is also provided, wherein the host cell of the invention comprising the recombinant expression construct is produced in a suitable medium so as to produce a GP286 polypeptide. Methods for producing are also provided.
[0025]
An isolated or recombinant GP286 protein and an isolated GP286 or recombinant GP286 polypeptide are provided by the invention. Preferred GP286 proteins and polypeptides possess at least one of the following (overlapping) biological activities carried by native human GP286: (1) ligands that naturally bind to GP286 protein (eg, proteins) (2) the ability to bind to autoantibodies against native human GP286 or to antibodies raised against native human GP286; (3) T lymphocyte-mediated The ability to participate in functions (eg, signaling functions in immune development); and (4) the ability to mediate cell-cell interactions (eg, recognition, binding and / or adhesion).
[0026]
The GP286 protein or a biologically active portion thereof can be incorporated into a non-GP286 polypeptide (eg, a heterologous amino acid sequence (eg, a sequence that facilitates protein stability, detection, purification, or delivery to a target cell in vivo)). It may be operably linked to form a GP286 fusion protein.
[0027]
The invention further features antibodies (eg, polyclonal or monoclonal antibodies) that include: humanized and fully human antibodies, which specifically bind to GP286 protein or a portion thereof.
[0028]
The gp286-related isolated polynucleotide, GP286 protein or biologically active portion thereof, antibody or fusion protein described above is optionally incorporated into a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier. obtain.
[0029]
Such compositions are useful in therapeutic methods for ameliorating disorders, conditions and diseases in a subject associated with aberrant GP286 cell localization, expression and / or activity. Accordingly, the present invention provides a method of treatment comprising administering a gp286-related compound or a gp286-related composition of the invention. Such methods include, for example, abnormal conditions affecting T cells and disorders or diseases associated with cell recognition, binding, signaling and adhesion functions during development or in the adult immune and / or central nervous systems. Useful for treating.
[0030]
The present invention provides a method for modulating the activity of GP286. In this method, the target cell alters the activity of GP286 or expression of GP286 by contacting an agent that modulates (eg, inhibits or stimulates) the activity of GP286 or expression of GP286. In some embodiments, the agent is an antibody that specifically binds to GP286. In some embodiments, the agent modulates the activity of GP286 or the expression of GP286 by modulating transcription of the gp286 gene, splicing of gp286 RNA, or translation of gp286 mRNA. In other embodiments, the agent is gp286 mRNA or a nucleic acid having a sequence that is antisense to the coding strand of the gp286 gene. In other embodiments, the agent can be a GP286 protein, a nucleic acid encoding a GP286 protein, or an antagonist or agonist of a GP286 protein (eg, a peptide, a peptidomimetic, or other small molecule).
[0031]
The present invention provides a method for detecting the presence of a gp286 polynucleotide, a GP286 protein or an activity thereof in a biological sample (eg, a fluid sample or tissue sample from a patient), the method comprising: , Gp286 polynucleotide sequence, GP286 protein or an indicator of the presence of its activity by contacting the agent with a detectable agent.
[0032]
The invention also provides a method for identifying a compound that binds to GP286 protein. In another aspect, the invention provides a method for identifying a compound that modulates the biological activity of a GP286 protein, the method comprising the steps of: Measuring the activity or expression and identifying those compounds that alter the activity of the protein. Combinatorial libraries can be used as a source of candidate compounds in these methods.
[0033]
The present invention provides at least some cells in a non-human animal (e.g., a mammal such as a mouse, rat, guinea pig, sheep, goat, horse or cow) comprising a polynucleotide of the present invention. Such an animal may be chimeric, in which only some of its somatic and / or germ cells carry the polynucleotide. Such animals may alternatively be transgenic if their somatic and germ cells carry the polynucleotide.
[0034]
The present invention also provides non-human animals in which the endogenous ortholog of the gp286 gene is disrupted by gene targeting (ie, "knockout"). gp286 polynucleotides, biological samples (eg, tissues and fluids) and cells containing these and the GP286-related products from animals described above are also within the scope of the invention.
[0035]
The present invention provides a computer readable means for sorting the nucleic acid and amino acid sequences of the present invention. Records of the computer readable means can be evaluated for reading and displaying the sequences, as well as for comparing, aligning, and ordering the sequences of the present invention with other sequences.
[0036]
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, drawings, and from the claims.
[0037]
(Detailed description of the invention)
The present invention is based, at least in part, on the discovery of a novel human gene encoding a previously unknown protein (GP286). This gene (gp286) was identified by computer analysis of ("mining") published nucleic acid sequences of the human genome. The gp286 gene is alternatively spliced and is usually a residue on human chromosome 19. One transcript (gp286) contains four exons, while gp286a contains five exons. Exon 2 and exon 3 are identical in both the gp286 and gp286a transcripts and exon 1 is similar; however, gp286 contains exon 4 but gp286a has exon 4a (which is exon 4a). And exon 5). The gp286 mRNA transcribed from this gene is approximately 971 bases in length (has an open reading frame of 558 base pairs) and encodes a protein predicted to be 186 amino acid residues. The gp286a mRNA transcribed from this gene is approximately 1065 bases in length (having an open reading frame of 834 base pairs) and encodes a protein predicted to be 278 amino acid residues. This novel GP286 protein is mainly expressed in tissues of the immune system.
[0038]
(Definition)
As used herein, “nucleic acid” (also referred to as “polynucleotide”) includes DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA or synthetic DNA) and RNA molecules (eg, mRNA). The term is also intended to include DNA or RNA analogs, including unnatural nucleotide analogs, unnatural internucleoside linkages, or both. Nucleic acids can be of any topological structure. For example, the nucleic acid can be single-stranded, double-stranded, triple-stranded, quadruple-stranded, partially double-stranded, branched, hairpin, circular, or padlocked. See, for example, Baner et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12: 11-15 (2001); Escude et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14; 96 (19): 10603-7 (1999); Nilsson et al., Science 265 (5181): 2085-8 (1994); Praseeth et al., Biochim. Biophys. Acta. 1489 (1): 181-206 (1999); Fox, Curr. Med. Cheni. 7 (1): 17-37 (2000); Kochetkova et al., Methods Mol. Biol. 130: 189-201 (2000); Chan et al. Mol. Med. 75 (4): 267-82 (1997).
[0039]
As used herein, an "isolated nucleic acid" (also referred to as an "isolated polynucleotide") is a nucleic acid that has been separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid. It is. In particular, the isolated, non-recombinant natural chromosome and its fragments over 500 kb are eliminated. Preferably, an "isolated" nucleic acid is substantially free of sequences that naturally flank the nucleic acid in the genome of the organism from which the nucleic acid was derived. For example, a preferred isolated gp286 nucleic acid has about 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0 kb naturally adjacent to the nucleic acid in the genomic DNA of the cell from which the isolated nucleic acid is derived. Flanking nucleotide sequences of less than .1 kb.
[0040]
However, "isolated" does not necessarily require that the nucleic acid or polynucleotide so described has itself been physically removed from its natural environment. For example, an endogenous nucleic acid in the genome of an organism is such that a heterologous sequence (ie, a sequence that is not naturally adjacent to the endogenous nucleic acid sequence) is positioned adjacent to the endogenous nucleic acid sequence and the expression of the endogenous nucleic acid sequence Are considered "isolated" herein. By way of example, a non-native promoter sequence can be substituted for the native promoter of the gp286 gene in the genome of a human cell (eg, by homologous recombination) so that the gene has an altered expression pattern. Have. The gene is now "isolated" because it has been separated from at least some of the naturally adjacent sequences.
[0041]
A nucleic acid is also considered "isolated" if the corresponding nucleic acid contains any non-naturally occurring alterations in the genome. For example, an endogenous gp286 coding sequence is considered "isolated" if it contains an insertion, deletion or point mutation that is introduced artificially, for example, by human intervention.
[0042]
"Isolated nucleic acid" also includes nucleic acids integrated at heterologous sites in the chromosome of the host cell, nucleic acid constructs present as episomes, and nucleic acid constructs integrated into the chromosome of the host cell.
[0043]
Further, an "isolated nucleic acid" when produced by recombinant technology may be substantially free of other cellular material or may be substantially free of culture medium. Alternatively, when chemically synthesized, it may be substantially free of chemical precursors or other chemicals.
[0044]
A polynucleotide of the present invention is considered "full length" if it can encode the full length GP286 protein.
[0045]
As used herein, the phrase "degenerate variant" of a reference nucleic acid sequence is an amino acid sequence that is translated according to the standard genetic code and is identical to the sequence translated from the reference nucleic acid sequence. Including a nucleic acid sequence.
[0046]
As used herein, the term "microarray" (also referred to as "nucleic acid microarray") refers to a plurality of nucleic acids bound to a substrate, wherein hybridization to each of the bound nucleic acids is individually detectable. It is. The substrate can be in a solid or porous configuration, a planar or non-planar configuration, a single or dispersed configuration, or any other configuration.
[0047]
As defined, the term "microarray" refers to Schena (eds.), DNA Microarrays: A Practical Approach Series, Oxford University Press (1999) (ISBN: 1919768). 21 (1) (Supplement): 1-60 (1999); and Schena (eds.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company / BioTechniques Books, et al., BizNixion. Natl. Acad. Sci. USA 97 (4): 1665-1670 (2000), including all devices so-called or similarly referred to. The disclosures of all of these references are incorporated herein by reference in their entirety.
[0048]
As used herein with respect to nucleic acid hybridization, the term "probe" (also referred to as "nucleic acid probe" or "hybridization probe") is or is intended to be detectably labeled. The isolated nucleic acid of known sequence. As used herein with respect to nucleic acid microarrays, the term "probe" (equivalently, "nucleic acid probe" or "hybridization probe") is bound to or attached to a substrate. Is intended for. Refers to an isolated nucleic acid. In any of these situations, the term "target" refers to a nucleic acid that is intended to bind to a probe by sequence complementarity.
[0049]
Unless otherwise indicated, "nucleic acid comprising SEQ ID NO: X" refers to a nucleic acid having at least a portion of either (i) the sequence of SEQ ID NO: X or (ii) a sequence complementary to SEQ ID NO: X. . The choice between the two is determined by the situation. For example, if a nucleic acid is used as a probe, the choice between the two is determined by the requirement that the probe be complementary to the desired target.
[0050]
For the purposes herein, “high stringency conditions” refers to 6 × SSC at 65 ° C. (where 20 × SSC is 3.0 M NaCl and 0.3 M Aqueous (ie, without formaldehyde) hybridization in 1% SDS for 8-12 hours in 1% SDS, followed by a wash for 20 minutes in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. Stipulated. It is understood that hybridization at 65 ° C. occurs at different rates depending on a number of factors, including the length and percent identity of the hybridizing sequence.
[0051]
For microarray-based hybridizations, standard “high stringency conditions” are 50% formaldehyde, 5 × SSC, 0.2 μg / μl poly (dA), 0.2 μg / μl human in a humidified oven at 42 ° C. Hybridize overnight in cot1 DNA and 0.5% SDS, then 5 min in 1 × SSC, 0.2% SDS at 55 ° C., then 0.1 × SSC, 0.2% SDS at 55 ° C. As continuous washing of the microarray for 20 minutes. For microarray-based hybridization, "moderate stringency conditions" refers to conditions suitable for cross-hybridizing mRNA that encodes structurally and functionally related proteins, and conditions for high stringency conditions. Same, but reduce hybridization temperature and wash at room temperature (about 25 ° C.).
[0052]
As used herein, the terms "protein", "polypeptide" and "peptide" are used interchangeably to indicate a polymer of amino acids, whether natural or synthetic, regardless of length. Here, the amino acids herein include naturally occurring amino acids, structural variants of naturally occurring amino acids, and synthesized non-naturally occurring analogs that can participate in peptide bonds. The terms “protein”, “polypeptide” and “peptide” explicitly allow for post-translational and post-synthetic modifications (eg, N-terminal or C-terminal amino acid cleavage reactions and glycosylation).
[0053]
As used herein, the term "oligopeptide" refers to a protein, polypeptide or peptide having 25 amino acid residues or less.
[0054]
A protein, polypeptide, peptide or oligopeptide is encoded by an isolated polynucleotide; when present in a purity not found in nature, where purity is determined with respect to the presence of other cellular material. Obtained); and / or include an amino acid analog or derivative that is not found in nature, or a linkage other than a standard peptide bond. "Isolated" as defined in this manner does not necessarily require that the protein, polypeptide, peptide or oligopeptide so described has been physically removed from its natural environment.
[0055]
A protein, polypeptide, peptide or oligopeptide is present at a concentration of at least 65% (eg, at least 75%, 85% or 95%) when measured based on mass relative to total protein in the composition. , Is considered "purified" herein. A protein, polypeptide, peptide or oligopeptide is considered "substantially purified" when the concentration is at least 85%.
[0056]
As used herein, "ortholog" refers to the distinct occurrence of the same gene in different species of organism. This distinct entity has a similar or identical amino acid sequence, wherein the degree of sequence similarity depends in part on the species' evolutionary distance from a common ancestor with the same gene .
[0057]
As used herein, the term "paralog" refers to the distinct occurrence of one gene in one species. The distinct entities have a similar or identical amino acid sequence, wherein the degree of sequence similarity is partially related to the evolutionary distance of these distinct entities from the gene replication event that caused the entity. Depends on.
[0058]
The term “homolog” (also called “homolog”) includes “orthologs” and “paralogs”.
[0059]
"Homologous" amino acid sequences include amino acid sequences that contain conservative amino acid substitutions, wherein the polypeptides have substantially the same binding and / or activity. However, homologous amino acid sequences do not include amino acid sequences encoding other known Ig superfamily members. Homology (% identity) can be determined, for example, by using the GAP program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix (R)), Genetics Computer Group, University Research, Canada, using the default settings. The GAP program uses the algorithm of Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 2: 482-489 (1981), which is hereby incorporated by reference in its entirety).
[0060]
As used herein, the term "antibody" refers to a whole antibody (consisting of two heavy chains and two light chains) or a fragment thereof. Such fragments include, but are not limited to, the following, as long as the fragment can specifically bind to the antigen: fragments produced by digestion with various proteases, chemical cleavage and / or chemical cleavage. Fragments generated by dissociation, as well as recombinantly produced fragments. These fragments include Fab fragments, Fab 'fragments, F (ab') 2 There are fragments and single chain Fv (scFv) fragments.
[0061]
Antibodies that have been modified in sequence but are capable of specifically binding an antigen are also within the scope of the term “antibody”. Examples of engineered antibodies are interspecies chimeric and humanized antibodies; antibody fusions; and heteromeric antibody complexes (eg, diabodies (bispecific antibodies), single-chain diabodies and intrabodies). (For example, Marasco (ed.), Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications, Springer-Verlag New York, Inc. (1998) (ISBN: 3540641513), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. See).
[0062]
"Specific binding" refers to the ability of two molecules to bind to each other in preference to binding to other molecules in the environment. Typically, "specific binding" discriminates at least two-fold, more typically at least 10-fold, often at least 100-fold, than accidental binding in a reaction. Typically, the affinity or avidity of the specific binding reaction is at least about 10 -7 M (eg, at least about 10 -8 M or 10 -9 M).
[0063]
The term "region" refers to a physically contiguous location of the primary structure of a biomolecule. In the case of a protein, regions are defined by contiguous positions in the amino acid sequence of the protein.
[0064]
The term “domain” refers to a structure of a biomolecule that contributes to a known or putative function of the biomolecule. Domains may be coextensive with their regions or portions thereof; domains may also include different, non-contiguous regions of a biomolecule. Examples of a GP286 protein domain include, but are not limited to, an extracellular domain (ie, N-terminus), a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain (ie, C-terminus). The extracellular domain can be further subdivided into, for example, an Ig domain and a signal sequence domain.
[0065]
As used herein, the term "compound" refers to any molecule, including but not limited to small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleotides, nucleic acids, lipids, and the like, and such compounds Can be natural or synthetic.
[0066]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although exemplary methods and materials are described below, methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used in the practice of the present invention, and It will be apparent to those skilled in the art. All publications and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. These materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.
[0067]
Standard references that illustrate the general principles of recombinant DNA technology known to those of skill in the art include: Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York (1998 and 2001). Supplement); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, eds., Directed Mutagenesis: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford (1991). Standard references that illustrate the general principles of immunology known to those of skill in the art include: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ. Y. (1990); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ. Y. (1999); Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3rd edition, Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993).
[0068]
Standard references showing the general principles of medical physiology and pharmacology known to those of skill in the art include: Harrison's PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, 14th Edition, (Anthony S. Fauciet Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. , 1998.
[0069]
(GP286-related nucleic acid)
In a first set of nucleic acid embodiments, the invention provides an isolated polynucleotide encoding the entire GP286 protein. As mentioned above, the "full length" polynucleotides of the present invention can be used, inter alia, to express the full length GP286 protein. Full-length polynucleotides can also be used as probes (as nucleic acid probes), and the isolated polynucleotides of these embodiments hybridize to gp286.
[0070]
In some embodiments, the invention provides an isolated polynucleotide comprising: (i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 13 or 14, (ii) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 13 or 14 A degenerate variant of the sequence or the complement of (iii) (i) or (ii). SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14 show the entire cDNA sequences of gp286 and gp286a, including the 5 'untranslated (UT) region and the 3' UT region, respectively. SEQ ID NO: 13 shows the genomic DNA sequence of gp286, including the 5 'and 3' non-transcribed regions.
[0071]
In another embodiment, the present invention provides an isolated polynucleotide comprising: (i) SEQ ID NO: 3, 4, 5, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 or 32 nucleotide sequences, (ii) degenerate variants of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or (iii) the complement of (i) or (ii).
[0072]
SEQ ID NO: 3 shows a gp286 RT-PCR fragment amplified from human thymus mRNA using the CR2-037 (SEQ ID NO: 7) and CR2-038 (SEQ ID NO: 8) primers; SEQ ID NO: 4 shows the CR2 The 5 'RACE product resulting from the amplification of human thymus cDNA is shown using the -146 primer (SEQ ID NO: 9) and the AP-1 primer (SEQ ID NO: 11); SEQ ID NO: 5 is the CR2-148 primer (SEQ ID NO: 11). 10) shows the 3 ′ RACE product resulting from the amplification of human thymus cDNA using the AP-1 primer; SEQ ID NO: 16 shows the nucleic acid sequence encoding the extracellular portion of GP286; SEQ ID NO: 18 shows the GP286a SEQ ID NO: 20 encodes the Ig-like domain of GP286. SEQ ID NO: 22 shows the nucleic acid sequence encoding the intracellular domain of GP286; SEQ ID NO: 24 shows the nucleic acid sequence encoding the intracellular domain of GP286a; SEQ ID NO: 26 shows the Ig-like domain SEQ ID NO: 28 shows a nucleic acid sequence encoding GP286 without the N-terminal amino acid encoding portion of the Ig-like domain; SEQ ID NO: 28 shows a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of GP286 without the N-terminal amino acid of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 30 shows the nucleic acid sequence encoding GP286a without the portion encoding the N-terminal amino acid of the Ig-like domain; and SEQ ID NO: 32 shows the nucleic acid sequence encoding the transmembrane domain of GP286.
[0073]
In some embodiments, the invention provides an isolated polynucleotide comprising: (i) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, or (ii) A) a complement of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 2 provides the amino acid sequence of GP286 encoded by the cDNA of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 15 provides the amino acid sequence for GP286a encoded by the cDNA of SEQ ID NO: 14.
[0074]
In some embodiments, the invention provides an isolated polynucleotide having the following nucleotide sequence: (i) a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, (Ii) a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15 with conservative amino acid substitutions, or (iii) is the complement of (i) or (ii).
[0075]
(Nucleic acid encoding a part of GP286)
In a second set of nucleic acid embodiments, the invention provides an isolated polynucleotide encoding a selected portion of gp286. As discussed further herein below, these nucleic acid molecules can be used, inter alia, to express certain portions of GP286. These nucleic acid molecules can also be used, inter alia, as region-specific nucleic acid probes.
[0076]
In some embodiments, the isolated polynucleotides, or their complements, encode a polypeptide having at least one copy of a characteristic Ig domain in the N-terminal extracellular portion of GP286. In particular, the extracellular Ig domain (SEQ ID NO: 21) is encoded by nucleotides 119-354 of the gp286 cDNA sequence of SEQ ID NO: 1 (see FIG. 1) and nucleotides 118-353 of SEQ ID NO: 14 (see FIG. 2). You.
[0077]
Preferably, the isolated polynucleotides (or their complements) also encode a signal secretion sequence that mediates the transport of the encoded polypeptide across the membrane. The gp286 signal secretion sequence comprises nucleotides 26-76 of the gp286 cDNA sequence of SEQ ID NO: 1 (amino acids 1-17 of SEQ ID NO: 2; see Figure 1) and nucleotides 10-75 of the gp286a cDNA sequence of SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 15). Amino acids 1-22; see FIG. 2). More preferably, the signal secretion sequence of the isolated polynucleotide of the invention is from gp286.
[0078]
The preferred, isolated polynucleotides described above may optionally encode a transmembrane domain if insertion of the encoded polypeptide into the membrane is highly desired. The transmembrane domain may be encoded by gp286 or gp286a (see below), or may be encoded by a heterologous gene encoding the transmembrane domain of a heterologous membrane-associated protein.
[0079]
If desired, the preferred, isolated polynucleotides described above may further include an intracellular C-terminal domain if a particular signaling response to a GP286 binding interaction is desired. The intracellular domain may be encoded by gp286 or gp286a (see below), or may be encoded by a heterologous gene encoding the intracellular domain of a heterologous membrane-associated protein.
[0080]
Another preferred embodiment of the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding a polypeptide having the transmembrane domain of GP286, or a complement thereof. In particular, the GP286 transmembrane domain is encoded by nucleotides 443-505 of the gp286 cDNA sequence of SEQ ID NO: 1 (see FIG. 1) and nucleotides 442-504 of the gp286a cDNA sequence of SEQ ID NO: 14 (see FIG. 2). . SEQ ID NO: 33 shows the amino acid sequence of the transmembrane domain of GP286 encoded by SEQ ID NO: 32.
[0081]
Yet another preferred embodiment of the above nucleic acid is a nucleic acid encoding a polypeptide having the (C-terminal) intracellular domain of GP286, or a complement thereof. In particular, the intracellular domain of GP286 is encoded by nucleotides 506-583 (see FIG. 1) of the gp286 cDNA sequence of SEQ ID NO: 1. The intracellular domain of GP286a is encoded by nucleotides 505 to 843 (see FIG. 2) of the gp286a cDNA sequence of SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 23 shows the amino acid sequence of the intracellular domain of GP286 encoded by SEQ ID NO: 22, while SEQ ID NO: 25 shows the amino acid sequence of the intracellular domain of GP286a encoded by SEQ ID NO: 24.
[0082]
The most significant difference between GP286 and GP286a is the C-terminal cytoplasmic portion of the protein. GP286 has a cytoplasmic tail of about 113 amino acids, whereas GP286 has a cytoplasmic tail of about 26 amino acids. In addition, GP286a has three tyrosine residues in the cytoplasmic tail, a potential site for protein phosphorylation. This finding strongly suggests that GP286a may be phosphorylated, thereby making GP286a seem to play an important role in signaling in T cells. GP286 also appears to be a receptor but does not appear to be phosphorylated. Without being bound by any particular theory, the extracellular portion of the protein, including, for example, the Ig domain, can receive a signal from the extracellular molecule, and this signal is transmitted through the cytoplasmic domain to be expressed in T cells. Elicits a response (eg, a proliferative or differentiation response).
[0083]
A preferred isolated polynucleotide of the present invention is represented by SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 spans a portion of exons 2, 3, which are identical to both gp286 and gp286a. See Example 3.
[0084]
Other preferred isolated polynucleotides of the present invention include polynucleotides that distinguish between gp286 and gp286a. In accordance with the teachings herein, one of skill in the art will recognize that a splice variant-specific polynucleotide may be a polynucleotide that includes only sequences from one splice variant and no sequences from other variants. I do. Other splice variant-specific polynucleotides include, for example, polynucleotides that can be used to take advantage of size differences between different splice variants. Examples of splice variant-specific polynucleotides include polynucleotides represented by the 3 ′ 25 nucleotides of SEQ ID NO: 22 (gp286) and the 3 ′ 286 nucleotides of SEQ ID NO: 24 (gp286a), but other examples Are also disclosed herein.
[0085]
(Cross hybridization nucleic acid)
In another series of nucleic acid embodiments, the invention provides isolated polynucleotides that hybridize to various gp286 nucleic acids of the invention. These "cross-hybridizing nucleic acids" are particularly useful as probes for the gp286-related proteins of the present invention (as well as for isoforms, homologs, paralogs, or orthologs) and to drive expression of the proteins. , Can be used.
[0086]
In some embodiments, the invention hybridizes under high stringency conditions to a probe having a nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 3, the complement of SEQ ID NO: 3, or a fragment thereof having at least 17 nucleic acid units thereof. An isolated polynucleotide comprising a soybean sequence is provided.
[0087]
(Preferred nucleic acid)
Nucleic acids expressed in tissues of the immune system (or nucleic acids whose complements are expressed) are particularly preferred among the nucleic acids described above. Nucleic acids encoding a polypeptide having the biological activity of gp286 (or nucleic acids whose complementary strand encodes a peptide having this activity), as described above, are also particularly preferred among the nucleic acids described above.
[0088]
(Nucleic acid fragment)
In another series of nucleic acid embodiments, the invention specifically expresses a particular portion of GP286, alone or as an element of a fusion protein, and expresses or synthesizes an epitope or immunogenic protein fragment. To indicate, various isolated polynucleotide fragments of the present invention are provided that have utility as amplification primers, as region-specific nucleic acid probes.
[0089]
In some embodiments, the present invention relates to an isolated polynucleotide comprising at least 17, 18, 20, 24, or 25 nucleotides of a contiguous nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 or 14. I will provide a. Here, the isolated polynucleotide is about 100 kb or less, typically about 75 kb or less, more typically about 50 kb or less. Often, the isolated polynucleotides of these embodiments are no more than about 25 kb, often no more than about 15 kb, and frequently no more than about 10 kb. Even more preferably, the isolated polynucleotide is less than 5000 base pairs, often less than 1000 base pairs, 500 base pairs, 100 base pairs, or 50 base pairs.
[0090]
In some embodiments, the invention provides a method comprising: (i) a nucleotide sequence encoding a polypeptide having a sequence of at least 8 contiguous amino acids of any of SEQ ID NOs: 2 or 15; (ii) having conservative amino acid substitutions. An isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having a sequence of at least 8 contiguous amino acids of either SEQ ID NO: 2 or 15, or a nucleotide sequence that is the complement of (i) or (ii). provide. Here, the isolated nucleic acid is about 100 kb or less, typically about 75 kb or less, and more typically about 50 kb or less. Often, the isolated nucleic acids of these embodiments are no more than about 25 kb, often no more than about 15 kb, and frequently no more than about 10 kb. Even more preferably, these isolated polynucleotides are no more than 5000 base pairs, often no more than 1000 base pairs, no more than 500 base pairs, no more than 100 base pairs, or no more than 50 base pairs.
[0091]
(Single exon probe)
The invention further provides a single exon probe from Nome that has a portion of only one exon of the gp286 gene. Single exon probes have particular utility in identifying and characterizing splice variants. In particular, such single exon probes are useful for identifying and distinguishing the expression of different isoforms of gp286.
[0092]
In some embodiments, the present invention provides a nucleotide sequence selected from one of the following exon-specific portions of SEQ ID NO: 1, 13, or 14; or the complement of SEQ ID NO: 1, 13, or 14: An isolated nucleic acid is provided. Wherein the portion is at least 17 contiguous nucleotides, 18 contiguous nucleotides, 20 contiguous nucleotides, 24 contiguous nucleotides, 25 contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 1, 13, or 14, or any one of the portions of the complement thereof. Contains 50 contiguous nucleotides.
[0093]
[Table 1]
Figure 2004501630
(Transcription control nucleic acid)
In another aspect, the invention provides an isolated polynucleotide from the genome comprising a nucleic acid sequence element that controls transcription of the gp286 gene. These nucleic acids can be used, inter alia, to drive the expression of a heterologous coding region in a recombinant construct, thus conferring such heterologous coding region with the expression pattern of the native gp286 gene. These nucleic acids can also be used, conversely, to target heterologous transcription control elements to the genomic locus of gp286, altering the expression pattern of the gp286 gene itself.
[0094]
In a first series of such embodiments, the invention relates to nucleotides 1 to 10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1 to 159 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1 to 170 of SEQ ID NO: 13; 10500; nucleotides 170-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 4209-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 7938-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 7874-10500 of SEQ ID NO: 13 or nucleotides 9669-10500 of SEQ ID NO: 13; The invention provides an isolated polynucleotide comprising a complementary strand of a unique sequence. Here, the isolated nucleic acid is about 100 kb or less, typically about 75 kb or less, and more typically about 50 kb or less. Often, the isolated nucleic acids of these embodiments are no more than about 25 kb, often no more than about 15 kb, and frequently no more than about 10 kb. Even more preferably, these isolated polynucleotides are no more than 5000 base pairs, often no more than 1000 base pairs, no more than 500 base pairs, no more than 100 base pairs, or no more than 50 base pairs.
[0095]
In some embodiments, the present invention relates to nucleotides 1-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1-159 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1-170 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 159-10500 of SEQ ID NO: 13; Nucleotides 4209-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 7938-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 7874-10500 of SEQ ID NO: 13 or nucleotides 9669-10500 of SEQ ID NO: 13; or the complementary strand of such a sequence An isolated polynucleotide comprising at least 17, 18, 20, 24, or 25 nucleotides. Here, the isolated nucleic acid is about 100 kb or less, typically about 75 kb or less, and more typically about 50 kb or less. Often, the isolated nucleic acids of these embodiments are no more than 25 kb, often no more than about 15 kb, and frequently no more than about 10 kb. Even more preferably, these isolated polynucleotides are no more than 5000 base pairs, often no more than 1000 base pairs, no more than 500 base pairs, no more than 100 base pairs, or no more than 50 base pairs.
[0096]
Nucleotides 1 to 10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1 to 159 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 1 to 170 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 159 to 10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 170 to 10500 of SEQ ID NO: 13; 4209-10500; each of the isolated polynucleotides comprising nucleotides 7938-10500 of SEQ ID NO: 13; nucleotides 7874-10500 of SEQ ID NO: 13 or nucleotides 9669-10500 of SEQ ID NO: 13 is specific for the developmental specificity and organization of the gp286 gene. Contains transcriptional control sequences that mediate specific expression and regulation. Such transcription control sequences are useful for imparting such development-specific and tissue-specific expression patterns to heterologous nucleic acid sequences operably linked thereto.
[0097]
(Other defined features for gp286 nucleic acid molecules)
All nucleic acid sequences set forth in detail herein are shown as deoxyribonucleotide sequences. However, the sequences shown are intended to be construed as appropriate for a polynucleotide composition: for example, where the isolated nucleic acid is comprised of RNA, the sequences shown are intended for ribonucleotides; Thymidine is replaced by uridine.
[0098]
Polymorphisms (eg, single nucleotide polymorphisms (SNPs)) occur frequently in eukaryotic genomes. More than 1,400,000 SNPs have already been identified in the human genome (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409: 860-921 (2001)), and the sequence determined from one individual of one species is: It may differ from other allelic forms present in the population. Alternatively, small deletions and insertions rather than single nucleotide polymorphisms are not uncommon in the overall population and often do not alter the function of the protein.
[0099]
Accordingly, the present invention not only provides isolated polynucleotides identical in sequence to the polynucleotides described in detail herein (eg, SEQ ID NOs: 1 and 14), but also describes in those details. It is especially emphasized that isolated polynucleotides that are allelic variants of the nucleic acid sequence provided are also provided. Further, the present invention is at least about 65% identical in sequence to the polynucleotide described in detail herein, and typically is at least in sequence to the polynucleotide described in detail herein. About 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical and, usefully, at least about 91%, 92%, 93%, 94% in sequence to a polynucleotide described in detail herein. Or at least about 96%, 97%, 98%, or 99% identical in sequence to a polynucleotide described in more detail herein, and most conservatively. Is at least about 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, or 99.9% identical in sequence to a polynucleotide described in detail herein. There is provided a homologue of Gp286 (e.g., paralogs and orthologs). These sequence variants can be naturally occurring or can result from human intervention, such as by random or directed mutagenesis.
[0100]
For the purposes herein, the percent identity of two nucleic acid sequences is determined by Tatiana et al., "Blast 2 sequences-a new tool for compar- ing protein and nucleic acid sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999). The procedure is: http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Blast / bl2seq / bl2. Achieved by the computer program BLAST2 SEQUENCES available online at html. To assess the percent identity of nucleic acid sequences, the BLASTN module of BLAST2 SEQUENCES is used with the following default values, and both sequences are entered in their entirety: (i) reward-for-match (ii) penalty for a mismatch: -2; (iii) penalty for open gap 5 and extension gap 2; (iv) gap X_dropoff 50 expect 10 word size 11 filter .
[0101]
The isolated polynucleotides of the present invention are useful for the expression of GP286 proteins and protein fragments, and thus the present invention provides isolated polynucleotides encoding GP286 proteins and portions thereof (as used herein). Not only polynucleotides identical in sequence to the polynucleotides described in detail herein, but also degenerate variants thereof are provided as well). As is well known, the genetic code is degenerate, and the choice of codons for optimal expression varies between species. Also, as is well known, amino acid substitutions frequently occur among natural allelic variants, and often conservative substitutions result in minimal changes in protein function.
[0102]
Thus, the present invention encodes GP286 and portions thereof that have conservative or moderately conservative amino acid substitutions, as well as polynucleotides identical in sequence to the polynucleotides described in detail herein. A polynucleotide is also provided.
[0103]
Although there are various criteria to refer to as conservative amino acid substitutions (primarily based on either the observed changes between evolutionarily related proteins or the expected chemical similarity), For purposes herein, a conservative substitution is any change that has a positive value in the PAM250 Log-likelihood matrix, duplicated herein below (Gonnet et al., Science 256 ( 5062): 1443-5 (1992)).
[0104]
[Table 2]
Figure 2004501630
For purposes herein, a "moderate conservative" permutation is any change that has a non-negative value in the PAM250 log-likelihood matrix copied above.
[0105]
Amino acid residues that are conserved between GP286 proteins of various species or between Ig family members are not altered during genetic engineering (except for conservative substitutions) to avoid a severe reduction or elimination of biological activity. For example, cysteine residues should be conserved to maintain the GP286 Ig domain.
[0106]
Polynucleotide relationships can also be characterized using functional tests to determine the ability of two polynucleotides to base pair with each other at a defined hybridization stringency. Accordingly, the invention not only is identical in sequence to the polynucleotides described in detail herein, but also all or a portion of the various isolated gp286 polynucleotides of the invention ("reference nucleic acids"). Providing an isolated polynucleotide ("cross-hybridizing nucleic acid") that hybridizes under high stringency conditions (as defined herein) to the polynucleotide. I do.
[0107]
Such cross-hybridizing nucleic acids are particularly probes for proteins related to the proteins of the invention (eg, alternative splice variants and homologs (eg, orthologs and paralogs)) and the expression of such proteins. Useful for driving. Particularly useful orthologs are from other primate species (eg, chimpanzees, rhesus monkeys, baboons, orangutans, and gorillas); from rodents (eg, rats, mice, guinea pigs); And orthologs from livestock (eg, cows, pigs, sheep, horses, goats).
[0108]
The hybridizing portion of the reference nucleic acid is typically at least 15 nucleotides in length, often at least 17, 20, 25, 30, 35, 40, or 50 nucleotides (nt) in length. A cross-hybridizing nucleic acid that hybridizes to a larger portion of the reference nucleic acid (eg, at least 50 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt, 350 nt, 400 nt, 450 nt, 500 nt or more, and less than the full length of the reference nucleic acid). Are also useful.
[0109]
The hybridizing portion of the cross-hybridizing nucleic acid is at least 75% identical in sequence to at least a portion of the reference nucleic acid. Typically, the hybridizing portion of the cross-hybridizing nucleic acid is at least 80%, often at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, or at least 90% in sequence with at least a portion of the reference nucleic acid. Even the same. Often, the hybridizing portion of the cross-hybridizing nucleic acid is at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 91% in sequence with at least a portion of the reference nucleic acid sequence. 99% identical. Sometimes, the hybridizing portion of the nucleic acid that cross-hybridizes is at least 99.5% identical in sequence to at least a portion of the reference nucleic acid.
[0110]
The present invention also provides various isolated polynucleotide or nucleic acid fragments of the present invention. By "fragment" of a reference nucleic acid is intended herein an isolated polynucleotide or nucleic acid, no matter how gained, that has nucleotide sequence identity to a portion of the reference nucleic acid sequence. This portion is at least 17 nucleotides and is shorter than the entire reference nucleic acid.
[0111]
In theory, a 17-nucleotide oligonucleotide is an oligonucleotide long enough to occur randomly at a frequency of less than one in the 3 billion base human genome, and therefore in a nucleic acid mixture with mammalian genomic complexity Oligonucleotides of sufficient length to provide a nucleic acid probe that can specifically identify the reference sequence of Additional specificity may be achieved by probing nucleic acid samples of partial genomic complexity and / or by using multiple fragments as short as 17 nucleotides collectively to prime nucleic acid amplification ( For example, it can be obtained (by polymerase chain reaction (PCR)).
[0112]
The nucleic acid probes of the invention can be used to detect RNA transcripts or genomic sequences encoding homologs or identical proteins. The probes may include a label group (eg, a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzyme cofactor) attached to them. Such probes may (i) mis-express the GP286 protein (eg, aberrant splicing, aberrant mRNA levels) or (ii) mutate (eg, delete, insert, or point mutation) in the gp286 gene. Can be used as part of a diagnostic kit for identifying cells or tissues having Such diagnostic kits preferably include labeling reagents and instructions for their use.
[0113]
The isolated polynucleotides of the present invention can also be used as primers in PCR, primer extension, and the like. To be useful as primers, the polynucleotide can be, for example, at least 6 nucleotides in length (eg, at least 7, 8, 9, or 10 nucleotides in length). This primer can hybridize to the exon sequence of the gp286 gene, for example, for amplification of gp286 mRNA or cDNA. Alternatively, the primer may hybridize to an intron sequence or an upstream or downstream regulatory sequence of the gp286 gene to utilize a non-transcribed portion (eg, a regulatory portion) of the genomic structure of the gp286 gene.
[0114]
The nucleic acid primers of the invention can also be used, for example, to prime single base extensions (SBEs) for SNP detection (see, eg, US Pat. See patent 6,004,744). Isothermal amplification approaches (eg, rolling circle amplification) are also now well described. See, for example, Schweitzer et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12 (1): 21-7 (2001); see U.S. Patent Nos. 5,854,033 and 5,714,320, and International Patent Publications WO 97/19193 and WO 00/15779. Is hereby incorporated by reference in its entirety). Rolling circle amplification can be combined with other techniques that facilitate SNP detection. See, eg, Lizardi et al., Nature Genet. 19 (3): 225-32 (1998).
[0115]
As described below, a nucleic acid fragment encoding at least 6 contiguous amino acids (ie, a fragment of 18 nucleotides or more) is useful for expressing a peptide that has utility in mapping an epitope of a protein encoded by a reference nucleic acid. Useful for directing synthesis. See, for example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984); and U.S. Patent Nos. 4,708,871 and 5,595,915.
[0116]
And, as described below, nucleic acid fragments encoding at least 8 contiguous amino acids (ie, fragments of 24 nucleotides or more) are useful in directing the expression or synthesis of peptides having utility as immunogens. . See, e.g., Lerner, "Tapping the immunological repertoire to product antibodies of predetermined specificity", Nature 299: 592-596 (1982); Rev .. Microbiol. 37: 425-46 (1983); Sutcliffe et al., Science 219: 660-6 (1983).
[0117]
Thus, a nucleic acid fragment of the invention is at least 17 nucleotides in length, typically at least 18 nucleotides in length, and often at least 24, 25, 30, 35, 40, or 45 nucleotides (nt) in length. Of course, larger fragments having at least 50 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt, 350 nt, 400 nt, 450 nt, 500 nt or more are also useful and are sometimes preferred, as will be appreciated by those skilled in the art.
[0118]
Based on mining the genomic sequence rather than on examining the expressed message, the present invention further provides an isolated genomic-derived polynucleotide or nucleic acid comprising a portion of the gp286 gene. The invention particularly provides a single exon probe from the genome. The probe comprises at least a portion of an exon ("reference exon") and is capable of detectably hybridizing under high stringency conditions to nucleic acid from a transcript containing the reference exon. However, this single exon probe does not detectably hybridize under high stringency conditions to a nucleic acid that lacks the reference exon but contains one or more exons that are found adjacent to the reference exon in the genome.
[0119]
The invention also provides an isolated genomic-derived polynucleotide or nucleic acid comprising a nucleic acid sequence element that controls transcription of the gp286 gene. Examples of the transcription control sequence include a promoter, an enhancer, an operator, a terminator, a silencer and the like.
[0120]
Where use in antisense inhibition of transcription or translation is desired, or where antisense-mediated targeting of enzymatic nucleic acid molecules (eg, ribozymes) is desired, the isolated polynucleotides and nucleic acids of the invention may be Usefully, it may contain one or more modified bases (see below) and / or one or more modified or altered internucleoside linkages, which often provide nuclease resistance. Hartmann et al. (Eds.), Manual of Antisense Methodology (Perspectives in Antisense Science), Kluwer Law International (1999) (ISBN: 079238539X); Stein et al. (Eds.), Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Wiley-Liss (cover (1998) (ISBN : 0471172790); Chadwick et al. (Eds.), Oligonucleotides as Therapeutic Agents-Symposium No. 209, John Wiley & Son Ltd (1997) (see ISBN: 047197797). Such modified bases and internucleoside linkages are described in Gamper et al., Nucl. Acids Res. 28 (21): 4332-9 (2000), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. As described, it is often also desirable when the isolated nucleic acids of the invention are used for target gene modification.
[0121]
The antisense nucleic acid molecules of the invention (and enzymatic nucleic acids targeted by antisense) can be used in therapeutic settings. These molecules can be expressed from an expression vector containing an operably linked transcriptional regulatory sequence, the activity of which can be determined by the cell type into which the vector is to be introduced. For a discussion of the regulation of gene expression using antisense genes, see Weintraub et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, REVIEWS-TRENDS IN GENETICS, Vol. 1 (1) (1986).
[0122]
The antisense nucleic acid of the present invention can be a ribozyme. Ribozymes are catalytic RNA molecules that have ribonuclease activity, and ribozymes can cleave single-stranded nucleic acids (eg, mRNA) to which ribozymes have regions of complementarity. Thus, ribozymes can be used to catalytically cleave gp286 mRNA transcripts, thereby inhibiting translation of gp286 mRNA. Ribozymes having specificity for a gp286 encoding nucleic acid can be designed based on the nucleotide sequence of a gp286 polynucleotide disclosed herein (ie, SEQ ID NO: 1, 13 or 14).
[0123]
Oligonucleotide mimetics of gp286, such as peptide nucleic acids (PNA), can be used in therapeutic and diagnostic applications. See, for example, Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 5-23. In PNA compounds, the phosphodiester backbone of a nucleic acid is replaced with an amide-containing backbone, particularly by repeating N- (2-aminoethyl) glycine units linked by amide bonds. For example, PNAs can be used as antisense or anti-gene agents for sequence-specific alteration of gene expression, for example, by inducing transcription or translation arrest or by inhibiting replication. The gp286 PNA can also be used in the analysis of single base pair mutations in genes by, for example, PNA directed PCR clamping; when used in combination with other enzymes (eg, S1 nuclease) As an artificial restriction enzyme; or as a probe or primer for hybridization with DNA sequences (Hyrup et al., Supra; and Perry-O'Keefe, supra). The gp286 PNAs can be attached to the lipophilic or other helper group to the PNA, by forming a PNA-DNA chimera, or using liposomes or other techniques for drug delivery known in the art. See below), for example, to enhance their stability or cellular uptake.
[0124]
Oligonucleotides of the invention include peptides (eg, to target host cell receptors in vivo), or other appended groups, such as agents that facilitate transport across cell membranes or the blood-brain barrier. obtain. In addition, the oligonucleotide may be modified with a hybridization triggered cleavage agent or an insert. For this purpose, the oligonucleotide may comprise another molecule (eg, a peptide, a hybridization triggered cross-linking agent, a transport agent, a hybridization-triggered cleavage agent, etc. (see below). )).
[0125]
Differences from nucleic acid compositions found in nature (eg, non-native bases, modified internucleoside linkages, post-synthesis modifications) can be present throughout the length of the gp286 polynucleotide, or are usefully a portion thereof. May be located in a separate part. As an example of the latter, chimeric nucleic acids having separate DNA and RNA domains can be synthesized and further described as described in U.S. Patent Nos. 5,760,012 and 5,731,181 (these being incorporated herein by reference). The disclosure is hereby incorporated by reference in its entirety), and may show utility for targeted gene repair. Chimeric nucleic acids, including both DNA and PNA, have been shown to have utility in modified PCR reactions. Misra et al. , Biochem. 37: 1917-1925 (1998); Finn et al. , Nucl. Acids Res. 24: 3357-3363 (1996), which is incorporated herein by reference.
[0126]
The polynucleotides and nucleic acids of the invention can also be usefully bound to a substrate. The substrate may be a porous or solid, flat or non-flat, integral or split substrate; the bond may be covalent or non-covalent. Nucleic acids of the invention bound to a substrate can be used as probes without their labeling. For example, the nucleic acids of the invention can be usefully attached to a porous substrate, usually a membrane, typically comprising nitrocellulose, nylon, or a positively charged derivatized nylon. The nucleic acid of the present invention bound to a gp286 nucleic acid present in a labeled nucleic acid sample (either a sample of genomic nucleic acid or a sample of nucleic acid derived from a transcript) can be, for example, reverse dot blot (reverse dot blot). ) Can be used for detection.
[0127]
The nucleic acids of the invention can also be usefully bound to a solid substrate (eg, glass), although other solid substrates (eg, amorphous silicon, crystalline silicon, or plastic) can also be used. The nucleic acids of the invention can be covalently attached to the surface of a solid support or derivatized surface in a chaotropic agent to facilitate denaturation, and adhesion by putative non-covalent interactions, or some of them. It can be applied to combinations.
[0128]
The nucleic acids of the invention can be bound to a substrate to which a plurality of other nucleic acids are bound simultaneously, and hybridization to each of the plurality of bound nucleic acids is separately detectable. At low densities (eg, on a porous membrane), the collection bound to these substrates is typically referred to as a microarray; at high densities (typically, a solid support such as glass). Above), a collection of multiple nucleic acids bound to these substrates is commonly referred to as a microarray. As used herein, the term microarray includes all density arrays. Accordingly, the present invention provides a microarray comprising the nucleic acid of the present invention.
[0129]
The isolated nucleic acids of the invention are used as hybridization probes to detect, characterize, and quantify gp286 nucleic acids in both genomic and transcript-derived nucleic acid samples, and to remove gp286 nucleic acids from these samples. Can be isolated. When free in solution, such probes are typically (but not always) detectably labeled or bound to a substrate as a microarray, and such probes are typically Typically (but not always) unlabeled.
[0130]
For example, using the isolated nucleic acid of the invention as a probe, through fluorescence in situ hybridization (FISH) to a chromosome spread, all modifications at the gp286 genomic locus (eg, deletion of the gp286 genomic locus, Insertions, translocations, and duplications) can be detected and characterized. See, for example, Andreeff et al. (Eds.), Introduction to Fluorescence in Situ Hybridization: Principles and Clinical Applications, John Wiley & Sons (1999), which is incorporated herein by reference, which is incorporated herein by reference in its entirety. . The isolated nucleic acids of the invention can be used as probes to assess smaller genomic alterations, for example, using Southern blot detection of restriction fragment length polymorphisms. The isolated nucleic acids of the invention can be used as probes to isolate genomic clones containing the nucleic acids of the invention. This genomic clone can then be restriction mapped and sequenced at the sequence level to identify deletions, insertions, translocations, and substitutions (single nucleotide polymorphisms, or SNPs).
[0131]
The isolated nucleic acids of the present invention can also be used as probes to detect, characterize, and quantify gp286 nucleic acids in nucleic acid samples from transcripts, and to isolate gp286 nucleic acids from this sample. For example, the isolated nucleic acids of the invention can be used to detect, characterize, and quantify gp286 mRNA by Northern blot of total RNA samples or polyA + selected RNA samples. Can be used as The isolated nucleic acids of the invention can also be used as hybridization probes to detect, characterize, and quantify gp286 message by in situ hybridization to tissue sections (see, eg, Schwarchzacher et al., See In Situ Hybridization, Springer-Verlag New York (2000) (ISBN: 0389915966), the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.
[0132]
In addition, the isolated nucleic acids of the present invention can be used as hybridization probes to measure the presentation of gp286 clones in a cDNA library. For example, the isolated nucleic acids of the present invention can be used as hybridization probes to isolate gp286 nucleic acids from a cDNA library. This allows for characterization of the gp286 RNA message at the sequence level, including identification of deletions, insertions, truncations (including deletion, insertion, and truncation of exons in alternative splicing forms) and single nucleotide polymorphisms. ) Becomes possible. As described herein below in the Examples, nucleic acids of the invention can also be used to detect and quantify gp286 nucleic acid in transcript-derived samples to measure expression of the gp286 gene. . Measurement of gp286 expression can be measured in conditions, disorders and diseases associated with abnormal gp286 expression, particularly in T cells in which gp286 is normally expressed, and as described further below in the Examples herein. (In tissues that can be expressed and expressed).
[0133]
Thus, as will be readily apparent to one of skill in the art, each of the gp286 nucleic acid probes, whether labeled or bound to a substrate or both, is immune and other tissues (these tissues). Is now available for use as a tool to measure the level of gp286 expression in (where expression has already been confirmed).
[0134]
The gp286 nucleic acid probes of the present invention are also useful for determining the level of T cell infiltration into a tissue. This can be particularly useful in determining whether tissue has been infiltrated. In this case, the T cells infiltrate the tissue or, in other disease states, cause T cell infiltration. One of skill in the art can compare the level of gp286 mRNA in normal tissues to the level of gp286 mRNA in sample tissues suspected of infiltrating or affected. Here, a determination that the level of gp286 mRNA is higher in this sample tissue is indicative of T cell infiltration, and thus is indicative of inflammation or other disease state.
As noted above, the nucleic acid probes of the invention are useful in constructing microarrays; subsequently, the microarrays are useful for measuring and investigating gene expression, for example, in drug discovery and target confirmation programs. Goods. When included on a microarray, the microarray is particularly useful for detecting, by each of the gp286 nucleic acid probes, a portion of the gp286 gene contained within the probe, thus providing the microarray device with the ability to detect signals. Become. Here, in the absence of such a probe, the microarray device reports no signal.
[0135]
Changes in the level of gp286 expression need not be observed in measuring expression to have utility. When gene expression analysis is used to assess the toxicity of a chemical agent to cells, for example, the inability of the agent to alter the level of gene expression indicates that the drug is not Evidence that does not seem to affect the pathway that is part. Similarly, when gene expression analysis is used to assess the side effects of pharmacological agents-either in the discovery of lead compounds or in subsequent screening for derivatives of the lead compounds -The inability of the drug to modify the expression level of the gene is evidence that the drug does not affect the pathway in which the expressed protein of the gene is part. WO 99/58720, incorporated herein by reference in its entirety, quantifies the relevance of first and second gene expression profiles, regardless of the identity or function of the gene whose expression is used in the calculations. Methods and methods for ordering the association of multiple gene expression profiles are provided.
[0136]
The genome-derived single exon probe and the genome-derived single exon probe microarray of the present invention have further utility to enable high-power detection of splicing variants of the nucleic acid of the present invention.
[0137]
A polynucleotide of the invention inserted into a nucleic acid construct, such as a vector, flanked by a polynucleotide insert with a promoter, may be used to drive in vitro expression of RNA complementary to either strand of a nucleic acid of the invention. Can be used. This RNA can be used in cDNA-mRNA subtraction or as a single-stranded probe for in vitro translation. Polynucleotides such as those encoding the GP286 protein or a portion thereof, either alone or as part of a fusion protein, can be used to express the GP286 protein or protein fragment. Expression can be from the genome or from a polynucleotide from a transcript of the invention.
[0138]
Where protein expression is performed from genomic DNA, expression is typically performed in a eukaryotic cell, typically a mammalian cell, capable of splicing introns from the initial RNA transcript. Expression can be driven from episomal vectors or from genomic DNA integrated into the host cell chromosome. As described below, when expression is from a polynucleotide derived from the transcript of the present invention (or otherwise without introns), expression may be from a wide variety of prokaryotic or eukaryotic cells. Can be done in
[0139]
Expressed in vitro, the protein, protein fragment, or protein fusion can then be isolated and used as a standard in an immunoassay specific for the protein or protein isoform of the invention; used as a therapeutic agent; For example, it can be administered as a passive replacement therapy in an individual deficient in a protein of the invention; can be administered as a vaccine; can be used for in vitro production of a specific antibody, which can then Can be used as an analytical agent for the detection and quantification of proteins of or for immunotherapeutic agents.
[0140]
The isolated polynucleotides and nucleic acids of the invention can also be used to drive in vivo expression of a protein of the invention. In vivo expression can be driven from a vector intended for gene therapy-typically a viral vector, often a vector based on a non-replicable lentivirus, retrovirus, adenovirus, or adeno-associated virus (AAV). In vivo expression can be endogenous to the nucleic acid or driven from exogenous expression control signals (eg, from a vector).
[0141]
Various forms of the isolated gp286 polynucleotides (eg, genomic or cDNA) of the present invention can be microinjected into male or female pronuclei or integrated into embryonic stem (ES) cells. A transgenic non-human animal capable of producing the protein of the present invention can be produced.
[0142]
The genomic nucleic acids of the invention can also be used to target homologous recombination to the gp286 locus in a subject. For example, US Pat. Nos. 6,187,305; 6,204,061; 5,631,153; 5,627,059; 5,487,992; 5,464,764; 5,614. Nos., 396; 5,527,695 and 6,063,630; and Kmiec et al. (Eds.), Gene Targeting Protocols. 133, Humana Press (2000) (ISBN: 0896033600); Joyner (ed.), Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press, Inc. (2000) (ISBN: 0196937938); Sedivy et al., Gene Targeting, Oxford University Press (1998) (ISBN: 071677013X); Tymms et al. (Eds.), Gene Knockout Protocols. Humana Press (2000) (ISBN: 0896035727); Mak et al. (Eds.), The Gene Knockout Factors Book, Volume 2, Academic Press, Inc. (1998) (ISBN: 0124660444); Torres et al., Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press (1977) (ISBN: 01996367X); )checking. These disclosures are incorporated herein by reference in their entirety.
[0143]
If the genomic region contains transcriptional regulatory elements, homologous recombination can be used to modify the expression of GP286, both for the purpose of in vitro production of GP286 protein from human cells and for the purpose of gene therapy. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,981,214, 6,048,524; 5,272,071, the entire disclosures of which are incorporated herein by reference. Fragments of the polynucleotides of the present invention that are smaller than those typically used for homologous recombination may also be targeted by targeted cell correctors or by a cellular mechanism different from that involved during homologous recombination. Can be used for modification. For example, U.S. Patent Nos. 5,945,339, 5,888,983, 5,871,984, 5,795,972, 5,780,296, 5,760,012, 5,756. No. 3,325, 5,731,181; and Culver et al., "Correction of chromosomal point mutations in human cells with bifunctional oligonucleotides" NatureBeauty. 17 (10): 989-93 (1999); Gamper et al., Nucl. Acids Res. 28 (21): 4332-9 (2000). These disclosures are incorporated herein by reference.
[0144]
The polynucleotides of the present invention can be obtained by using the labeled probes of the present invention to probe nucleic acid samples, such as genomic libraries, cDNA libraries, and mRNA samples, by standard techniques. A polynucleotide of the invention can also be obtained by amplification using a nucleic acid primer of the invention, as further shown in Example 1 below. Polynucleotides of the invention can also be chemically synthesized, particularly by less than about 100 nucleotides, typically by solid phase synthesis using a commercially available automated synthesizer.
[0145]
(Vector and host cell)
A. Nucleic acid construct
The invention provides nucleic acid constructs, such as vectors, comprising one or more isolated polynucleotides of the invention, and host cells into which such vectors have been introduced.
[0146]
Such vectors are used to enhance the polynucleotide of the present invention in host cells (cloning vectors) and to shuttle the polynucleotide of the present invention between host cells derived from different organisms (shuttle vectors). For inserting a polynucleotide of the invention (insertion vector), for expressing a sense or antisense RNA transcript of a polynucleotide of the invention in vitro or in a host cell, and as a fusion, alone or to a heterologous polypeptide. Can be used to express a polynucleotide encoded by a polynucleotide of the invention (expression vector). The vectors of the present invention are often suitable for some of such uses.
[0147]
Vectors are now well known in the art, and, in particular, Jones et al. (Eds.), Vectors: Cloning Applications: Essential Technologies (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons, Ltd., John Wiley & Sons. ), Vectors: Expression Systems: Essential Technologies (Essential Technologies Series), John Wiley & Son Ltd. 1998 (ISBN: 04719626678); 471948411); Cid-Arregui (ed.), Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Co. Sambrook et al., Molecular Connecting: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 (ISBN: 0789595773); Ausubol, et al. of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (4th edition), John Wiley & Sons, 1999 (ISBN: 04732938X). These disclosures are incorporated herein by reference in their entirety. A wide variety of vectors are commercially available. The use and modification of existing vectors is well within the skill of the art.
[0148]
Typically, the vectors are derived from a virus, plasmid, prokaryotic or eukaryotic chromosomal element, or some combination thereof, and some integrating vectors are used in a host where the chromosome is modified. Some vectors lack an origin that is functional, and some lack a selectable marker, but have at least one origin of replication, at least one site for insertion of a heterologous nucleic acid (typically more than one Clustered in the form of a polylinker with a single cleavage restriction site), and at least one selectable marker. The vector of the invention further comprises at least one isolated polynucleotide nucleic acid of the invention inserted into the vector at at least one position. If present, the origin of replication and selectable marker are selected based on the desired host cell (s); the host cells are then selected based on the desired application.
[0149]
For example, prokaryotic cells, typically E. coli. E. coli is typically selected for cloning, ie, amplification of a polynucleotide sequence in a host cell. In such cases, vector replication involves the replication strategy of phage that infects E. coli (such as phage lambda, M13, T7, T3 and P1) or autonomously replicating episomes, prominently pBR322 and pUC series plasmids. , ColE1 plasmid and subsequent derivatives. E. FIG. When E. coli is used as a host, the selectable marker is also selected for selectivity in Gram-negative bacteria: for example, representative markers include ampicillin, tetracycline, chloramphenicol, kanamycin, streptomycin, It confers resistance to antibiotics such as zeocin; auxotrophic markers can also be used.
[0150]
As another example, typically S.D. Yeast cells that are cerevisiae are particularly selected for eukaryotic genetic studies, for example, for identification of interacting protein components by a two-hybrid system, and for protein expression. Vectors of the invention for use in yeast will typically, but not always, contain an origin of replication suitable for use in yeast, and a selectable marker that is functional in yeast. Examples of suitable yeast vectors include the integrating YIp vector, the replicative episomal YEp vector containing the centromere sequence CEN, and the autonomously replicating sequence ARS. YACs are based on a yeast linear plasmid called YLp, which contains homologous or heterologous DNA sequences that function as telomeres (TEL) in vivo, and contains a yeast ARS (origin of replication) segment and a CEN (centromere) segment. ing.
[0151]
As selectable markers in yeast vectors, various auxotrophic markers (eg, ura3-52, his3-D1, leu2-D1, trpl-D1 and lys2-201) complementing specific auxotrophic mutations (In Saccharomyces cerevisiae) are URA3, HIS3, LEU2, TRP1 and LYS2. The URA3 and LYS2 yeast genes inhibit the growth of prototrophic strains, but are specific inhibitors that allow the growth of ura3 and lys2 mutants, respectively, 5-fluoro-orotic acid (FOA). )) And α-aminoadipic acid (αAA), respectively. Other selectable markers, for example, confer resistance to zeocin.
[0152]
Insect cells are often selected for high efficiency protein expression. If the host cell is Spodoptera frugiperdae (eg, Sf9 and Sf21 cell lines, and expressSF) TM When derived from cells (Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA), vector replication strategies are typically based on the baculovirus life cycle. Typically, a baculovirus transfer vector is used to replace the wild-type AcMNPV polyhedrin gene with a heterologous gene of interest. Sequences flanking the polyhedrin gene in the wild-type genome are located 5 'and 3' of the expression cassette on the transfer vector. After co-transfection with AcMNPV DNA, the phenomenon of homologous recombination occurs between these sequences, resulting in a recombinant virus carrying the gene of interest, the polyhedrin promoter or the p10 promoter. Selection can be based on visual screening for lacZ fusion activity.
[0153]
Mammalian cells are often selected for expression of the protein intended as a pharmaceutical agent, or as host cells for screening for potential agonists and antagonists of the protein or physiological pathway. Vectors contemplated for autonomous extrachromosomal replication in mammalian cells typically include those of viral origin (eg, for replication in cell lines expressing large T antigen (eg, COS1 and COS7 cells). ) SV40 origin, papillomavirus origin or EBV origin for long-term episomal replication (eg, 293-EBNA cells that constitutively express the EBV EBNA-1 gene product and adenovirus E1A). Vectors intended to be integrated and replicated as part of a mammalian chromosome may, but need not, include an origin of replication (eg, of SV40 origin) that functions in mammalian cells. Virus-based vectors (eg, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus, and various mammalian retroviruses) typically replicate according to viral replication strategies.
[0154]
Selectable markers for use in mammalian cells include resistance to neomycin (G418), blasticidin, hygromycin and zeocin, and resistance to selection based on the purine salvage pathway using HAT medium.
[0155]
Plant cells are also typically expressed using a vector replicon from a plant virus (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV); tobacco mosaic virus (TMV)) and a selectable marker that is selected for suitability in the plant. Can be used for
[0156]
Due to the propagation of the polynucleotides of the present invention larger than those which can be easily adapted in a vector derived from a plasmid or virus, the present invention relates to artificial chromosomes (BAC, YAC) containing gp286 nucleic acids, often genomic nucleic acids. , And HAC). See, for example, Shizuya et al., Keio J. et al. Med. 50 (1): 26-30 (2001); Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89 (18): 8794-7 (1992); Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 18 (10): 1086-90 (2000); Henning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 96 (2): 592-7 (1999); Harrington et al., Nature Genet. 15 (4): 345-55 (1997), the disclosures of which are incorporated herein by reference.
[0157]
Expression vectors of the invention that drive the expression of a polypeptide from an inserted heterologous nucleic acid often contain a variety of other genetic elements operably linked to the protein-encoding heterologous nucleic acid insert, typically driving transcription. Genetic elements that drive and regulate (eg, promoter and enhancer elements), genetic elements that facilitate RNA processing (eg, transcription termination, splicing and / or polyadenylation signals), and translation. Other transcription control sequences include, for example, operators, silencers, etc. Genetic elements (eg, ribosomal consensus sequences), etc. Such expression control elements (eg, inducible expression and developmental or tissue regulated expression). Expression control Use of including Remento) are well known in the art.
[0158]
Tissue-specific regulatory elements capable of expressing GP286 in the immune system can be particularly useful and are known in the art (eg, the native immunoglobulin promoter and the native T cell receptor promoter). Developmentally regulated promoters may also be selected, including, but not limited to, the mouse hox promoter (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the α-fetoprotein promoter. (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546). A large variety of inducible promoters are known and can be selected based on the particular application.
[0159]
Expression vectors can be designed to fuse the expressed polypeptide to a small protein tag that facilitates purification and / or visualization. Many such tags are known and available. Expression vectors can also be designed to fuse the protein encoded by the heterologous nucleic acid insert to a polypeptide larger than the purification and / or identification tags. Useful protein fusions include protein fusions that allow the display of encoded proteins on the surface of phage or cells, native fluorescent proteins (eg, proteins with luciferase or green fluorescent protein (GFP) -like chromophores) Fusions to IgG Fc regions or other immunoglobulin-type constant domains, and for use in a two-hybrid selection system.
[0160]
A wide variety of vectors are available for secretion of the expressed protein, which include appropriate sequences encoding a secretion signal, such as a leader peptide. Vectors designed for phage display, yeast display, and mammalian display target recombinant proteins using, for example, an N-terminal cell surface targeting signal and a C-terminal transmembrane anchoring domain.
[0161]
The fusion protein encoded by the heterologous nucleic acid was converted to a substrate-independent, originally fluorescent green fluorescent protein ("GFP") from Aequorea victoria and many of its color shift and / or stabilizing variants. A wide variety of vectors currently exist that fuse to a chromophore.
[0162]
Enables fusion of heterologous sequences to the IgG Fc region to increase the serum half-life of protein pharmaceutical products through interaction with the FcRn receptor, which is also referred to as the FcRp and Brambell receptors, FcRb Vectors are also widely available.
[0163]
For long-term, high-yield recombinant production of the proteins, protein fusions and protein fragments of the present invention, stable expression is preferred. Stable expression is readily achieved by integration of the vector (preferably with a selectable marker) into the genome of the host cell, followed by selection of the integrant.
[0164]
Vectors of the invention also often include elements that allow for the in vitro transcription of the inserted heterologous nucleic acid RNA. Such vectors typically include a phage promoter (eg, a T7, T3, or SP6 derived phage promoter adjacent to the nucleic acid insert). Often, two different such promoters will flank the inserted nucleic acid and allow separate in vitro production of both the sense and antisense strands.
[0165]
(B. Host cell)
The present invention relates to a host cell (prokaryotic) comprising a nucleic acid construct, such as a vector of the present invention, which is either episomally present in the cell or is completely or partially integrated into the host cell chromosome. It further includes either biological (bacterial) cells or eukaryotic cells (eg, yeast cells, insect cells, plant cells, and animal cells).
[0166]
Among other considerations, some of which are described above, the host cell strain may be selected for its ability to process the expressed protein in a desired manner. Such post-translational modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acetylation, and include It is an aspect of the present invention to provide a GP286 protein having a modification.
[0167]
Representative, non-limiting examples of suitable host cells include bacterial cells (eg, E. coli, Caulobacter crescentus, Streptomyces species, and Salmonella typhimurium); , Pichia methanolica); insect cell lines (eg, cells from Spodoptera fiugiperda (eg, Sf9 and Sf21 cell lines, and expressSF) TM Cells (Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA), Drosophila S2 cells, and Trichoplusia ni High Five® cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); and mammalian cells. Representative mammalian cells include COS1 and COS7 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NIH 3T3 cells, 293 cells, HEPG2 cells, HeLa cells, L cells, HeLa, MDCK, HEK293, WI38, mouse ES cells Strains (eg, from the 129 / SV strain, the C57 / BL6 strain, the DBA-1 strain, and the 129 / SVJ strain), K562, Jurkat cells, and BW5147. Particularly preferred is a T cell line, preferably a human T cell line (eg, MOLT-4). Other useful mammalian cell lines are well known and are available from the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Electronics Cell Sciences. , NJ, USA).
[0168]
Methods for introducing the vectors and nucleic acids of the invention into host cells are well known in the art; the choice of technique will depend mainly on the particular vector to be introduced and the host cell chosen.
[0169]
(GP286 protein, GP286 polypeptide and GP286 fragment)
The present invention relates to GP286 proteins and their use suitable for use as antigens (eg, epitope mapping), use as immunogens (eg, to raise antibodies or as vaccines), and for use in therapeutic compositions. Various fragments are provided. Fusions of GP286 polypeptides and fragments to heterologous polypeptides, and conjugates to other portions of the proteins, fragments and fusions of the invention (eg, to a chromophore, to a carrier protein) are also provided.
[0170]
In some embodiments, the invention provides an isolated GP286 polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a full-length gp286 cDNA (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14), or a modified variant. The invention also has the amino acids encoded by the full-length gp286 cDNA (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14), optionally with one or more conservative amino acid substitutions. Provided is an isolated GP286 polypeptide.
[0171]
The invention also includes a single amino acid sequence encoded by a polynucleotide sequence that hybridizes under highly stringent conditions to a probe having part or all of the nucleotide sequence of the gp286 cDNA (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14). An isolated GP286 polypeptide is provided. Preferably, an isolated GP286 polypeptide encoded by a polynucleotide of the invention that cross-hybridizes stringent has at least one GP286 biological activity.
[0172]
In another set of embodiments, the invention relates to an isolated GP286 polyprotein comprising a GP286 amino acid sequence of either SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, optionally having one or more conservative amino acid substitutions. Provide a peptide. An isolated GP286 polypeptide having an amino acid sequence encoded by a full-length GP286 polypeptide sequence of either SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, optionally having one or more conservative amino acid substitutions, Provided.
[0173]
The present invention further provides fragments of each of the above isolated polypeptides, particularly at least 6 amino acids, 8 amino acids, of the sequence provided by either SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15. Fragments having from 15 amino acids to the entire sequence are provided.
[0174]
The present invention also provides an isolated GP286 polypeptide comprising all or a portion of the N-terminal extracellular domain of GP286 (for the GP286 domain and GP286 sequence, FIGS. 1 and 2 and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 15). checking). A preferred polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (which is the Ig-like domain of GP286) and SEQ ID NO: 27 (which is the extracellular domain of GP286 without the N-terminal amino acid of the Ig-like domain) Polypeptide.
[0175]
In a preferred embodiment, the isolated GP286 polypeptide comprises the entire extracellular domain of GP286 and lacks a functional GP286 transmembrane domain. Preferred polypeptides are those having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19, which are the extracellular portions of GP286 and GP286a, respectively. In another preferred embodiment, the isolated GP286 polypeptide consists of all or a portion of the GP286 extracellular domain fused to a heterologous protein domain.
[0176]
Also preferred is an isolated GP286 polypeptide, comprising a GP286 fragment selected from the group consisting of the transmembrane domain of GP286 and the C-terminal cytoplasmic region of GP286. Preferred polypeptides are SEQ ID NO: 33, which is the transmembrane domain of GP286; SEQ ID NO: 23, which is the intracellular domain of GP286; and SEQ ID NO: 25, which is the intracellular domain of GP286a Is a polypeptide having the amino acid sequence of In another preferred embodiment, the isolated GP286 polypeptide consists of part or all of the GP286 cytoplasmic or transmembrane domain, fused to a heterologous protein domain.
[0177]
The GP286 fragment of the present invention may be a contiguous portion of a native GP286 protein. However, it is understood that knowledge of the GP286 gene and protein sequence as provided herein allows for the recombination of various non-contiguous domains in the native GP286 protein.
[0178]
The invention also provides a polypeptide comprising a selected portion of GP286 and related proteins. As discussed herein below, especially when bound to heterologous protein fragments, these protein fragments can be used, for example, to target factors to particular cell types via protein-protein interactions. To inhibit protein-protein interactions between Ig domain-containing proteins; for competitive binding assays; and to raise fragment-specific GP286 antibodies.
[0179]
In some embodiments, the protein fragment comprises, in at least one copy, an Ig domain characteristic of the N-terminal extracellular portion of GP286. Specifically, this extracellular Ig domain comprises amino acids 32-110 of the GP286 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (see FIG. 1) and amino acids 37-115 of the GP286a amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (see FIG. 2). ).
[0180]
Preferably, the protein fragment contains an N-terminal signal secretion sequence that mediates the transport of the polypeptide across the membrane. This GP286 signal secretion sequence is encoded by amino acids 1-17 of the GP286 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (see FIG. 1) and amino acids 1-22 of the GP286a amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (see FIG. 2). Is done. The signal sequence may be from a heterologous protein, but preferably, the signal secretion sequence of the protein fragment is from GP286.
[0181]
The preferred protein fragments described above may optionally include a transmembrane domain if insertion of the polypeptide into a membrane is highly desired. The transmembrane domain may be a GP286 domain (see below) or may be encoded by a heterologous gene encoding a transmembrane domain of a heterologous membrane-associated protein.
[0182]
If highly desired, the preferred protein fragments described above may further comprise an intracellular C-terminal domain when a particular signaling response is desired in response to a GP286 binding interaction. The intracellular domain may be derived from GP286 or GP286a (see below), or the domain may be encoded by a heterologous gene encoding an intracellular domain of a heterologous membrane-associated protein.
[0183]
Another preferred embodiment of the protein fragment of the invention is a fragment comprising the transmembrane domain of GP286. Specifically, this GP286 transmembrane domain comprises amino acids 140-160 of the GP286 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (see FIG. 1) and amino acids 145-165 of the GP286a amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (see FIG. 2). ).
[0184]
Yet another preferred embodiment of the above protein fragment has the (C-terminal) intracellular domain of GP286. Specifically, one intracellular domain of GP286 comprises amino acids 161-186 of the GP286 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (see FIG. 1) and amino acids 166-278 of the GP286a amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (see FIG. 2). See). It is believed that these different intracellular domain forms are generated by alternative splicing.
[0185]
As mentioned above, the present invention preferably relates to hybridization-related proteins having only sequences that substantially retain GP286 activity, in the form of insertions or deletions, only conservative or moderately conservative substitutions. Or as a cross-hybridized protein, in particular, a protein that differs in sequence from the described protein having features in the sequence identifiers (SEQ ID NOs :) referred to above (SEQ ID NOs :). As noted above, the present invention further provides for the fusion of the polypeptides, proteins and protein fragments described herein to a heterologous polypeptide.
[0186]
When used as immunogenic, the various protein embodiments of the present invention can be used to raise antibodies that specifically bind to various epitopes of the GP286 protein.
[0187]
(Other definition of characteristics of GP286 protein)
1 and 2 show the deduced amino acid sequences encoded by the gp286 cDNA clone (SEQ ID NO: 2) and the gp286a cDNA clone (SEQ ID NO: 14). Unless otherwise indicated, the amino acid sequence of the proteins of the invention was determined as a putative translation from the nucleic acid sequence. Thus, any amino acid sequence set forth in the present invention may contain errors due to errors in this nucleic acid sequence as described in detail above. In addition, single nucleotide polymorphisms (SNPs) occur frequently in eukaryotic genomes (over 14 million SNPs have been identified in the human genome (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409: 860-921 (2001)). ), And the sequence determined from one individual of one species can be different from other allelic forms present in the population. Small deletions and insertions that do not alter the function of the protein can often be found.
[0188]
Accordingly, the present invention is directed not only to GP286 polypeptides which are identical in sequence to the described polypeptides having the characteristics herein, but also to the described polypeptides having the characteristics herein having at least about 80 An isolated protein, typically at least about 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% or 95% in sequence to a described polypeptide having features herein. An isolated protein that is at least about 96%, 97%, 98%, or 99% identical in sequence to a described polypeptide having features herein; and Most conservatively, the described polypeptides having features herein have at least about 99.5%, 99.6%, 99.7%, 9% in sequence. .8% and 99.9% identical to the isolated protein. These sequence variants may be naturally occurring or may result from human intervention by random or directed mutagenesis.
[0189]
For purposes herein, the percent identity of two amino acid sequences is determined by Tatiana et al., "Blast 2 sequence-a new tool for compar- ing protein and nucleotide sequence," FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999). This procedure is accomplished by the computer program Blast 2 SEQUENCES, which can be found at: http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Blast / bl2seq / bl2. available online at html. To assess the percent identity of amino acid sequences, the BlastP module of Blast 2 SEQUENCES is used with the following default values: (i) BLOSUM62 matrix (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 ( 22): 10915-9 (1992)); (ii) an open gap 11 penalty and an extension 1 gap penalty; and (iii) a gap x_dropoff50 expected 10 word size 3 filter, and both sequences are The whole has been entered.
[0190]
As is well known, amino acid substitutions frequently occur in natural allelic variants, and conservative substitutions often result in only minimal changes in protein function. Accordingly, the present invention relates to an isolated protein having the sequence of the GP286 protein, or a portion thereof, having conservative amino acid substitutions, as well as proteins identical in sequence to the described proteins with features herein. ,I will provide a. Also provided is an isolated protein having the sequence of the GP286 protein and portions thereof having moderately conservative amino acid substitutions. These conservatively or moderately conservatively substituted variants may be naturally occurring or may result from human intervention.
[0191]
As is well known in the art, protein relatedness is also characterized using functional tests, the ability of encoding nucleic acids to base pair with each other at a given hybridization stringency. Thus, in addition to providing an isolated protein that is identical in sequence to the described protein having the features herein, various variants of the isolated polynucleotides of the invention ("reference nucleic acid" )) To an isolated protein ("hybridization-associated protein") encoded by a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions (as defined herein above) to all or a portion thereof. Providing is another aspect of the present invention.
[0192]
Hybridization-related proteins can be alternative isoforms, homologs, paralogs, and orthologs of the GP286 protein of the invention. Particularly useful orthologs are from other primates, such as chimpanzees, rhesus macaques, baboons, orangutans, and gorillas; from rodents, such as rats, mice, guinea pigs; and lagomorphs, such as rabbits (Logogmorph); and orthologs from livestock such as cows, pigs, horses, and goats.
[0193]
Protein relevance can also be characterized using a second functional test, the ability of the first protein to competitively inhibit the binding of the second protein to the antibody. Thus, another aspect of the present invention not only provides isolated proteins that are identical in sequence to the proteins described in detail herein, but also various isolated GP286 proteins of the present invention ( It is also to provide an isolated protein ("cross-reactive protein") that competitively inhibits the binding of the antibody to all or a portion of the "reference protein"). Such competitive inhibition can be readily determined using immunoassays well known to those skilled in the art.
[0194]
Details herein include proteins with deletions and insertions that result in up to 10% non-identity, proteins with conservative or moderately conservative substitutions, hybridization-related proteins, and cross-reactive proteins. Among the proteins of the present invention that differ in amino acid sequence from the proteins described in (1), those that substantially retain one or more GP286 activities are preferred (see above).
[0195]
Residues that tolerate changes but retain function are alanine scanning mutagenesis, Gunningham et al., Science 244 (4908): 1081-5 (1989); transposon linker scanning mutagenesis, Chen et al., Gene 263 (1-2). ): 39-48 (2001); Combination of homologous and alanine scanning mutagenesis, Jin et al. Mol. Biol. 226 (3): 851-65 (1992); Combinatorial alanine scanning followed by a functional assay, Weiss et al., Proc. Natl. Acad. It can be identified by altering the protein at known residues using methods known in the art, such as Sci USA 97 (16): 8950-4 (2000). Transposon linker scanning kits are commercially available (New England Biolabs, Beverly, MA, USA, catalog number E7-102S; EZ :: TN TM In-Frame Linker Insertion Kit, catalog number EZI04KN, Epicenter Technologies Corporation, Madison, WI, USA).
[0196]
As described further below, the isolated protein of the present invention is a specific immunogen that elicits antibodies that specifically recognize the GP286 protein, their isoforms, homologs, paralogs, and / or orthologs. Can be easily used as In turn, antibodies may be used, inter alia, for specific antibody-mediated isolation and / or purification of GP286 protein (eg, by immunoprecipitation) and for use as specific agonists or antagonists of GP286 action. In particular, assays for the GP286 proteins of the invention, eg, by ELISA for detection of protein fluid samples (eg, serum) or by immunohistochemistry or laser scanning cytometry for detection of proteins in tissue samples. Or by flow cytometry for the detection of intracellular proteins in cell suspensions). In addition, antibodies can be used to identify human T cells that are useful in medical applications and forensic science. Antibodies can also be used to isolate human T cells (eg, by FACS), which is useful for treating T cells in vitro and for subsequent reinfusion into patients. The antibodies can be conjugated to a toxin or engineered to form a fusion protein containing the toxin, which can be used to label and kill abnormal T cells in a patient.
[0197]
The isolated proteins of the invention are also readily available for use as specific standards in assays used to specifically determine the concentration and / or amount of a GP286 protein of the invention. . As is well known, ELISA kits for the detection and quantification of protein analytes typically include known concentrations of isolated and purified protein for use as a measurement standard (eg, Human Interferon γ OptEIA Kit, Catalog No. 555142, Pharmingen, San Diego, CA USA contains baculovirus-produced human recombinant γ interferon). The isolated proteins of the present invention are also readily available for use as specific biomolecule capture probes for surface-enhanced laser desorption ionization (SELDI) detection of protein-protein interactions (WO98). WO98 / 59361; WO98 / 59361; and Merchant et al., Electrophoresis 21 (6): 1164-77 (2000), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Similarly, the isolated proteins of the present invention are also readily available for use as specific biomolecular capture probes on BIACORE surface plasmon resonance probes. Weinberger et al., Pharmacogenomics 1 (4): 395-416 (2000); Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27 (2) 335-40 (1999).
[0198]
The polypeptides of the present invention can be conjugated to a toxin or engineered to form a fusion protein with the toxin. GP286 toxin can be used to bind to and kill GP286 binding cells. The polypeptides of the present invention can also be conjugated to a detectable label or manipulated to form a fusion protein with a detectable label. GP286 labels can be used to bind to and detect GP286 binding cells.
[0199]
The isolated proteins of the present invention are also useful as therapeutic aids in patients diagnosed as having a particular deficiency in the production or activity of GP286. Alternatively, a patient can be treated such that an extracellular domain or portion thereof that is active upon binding to another cell or extracellular matrix protein competes for binding of cell surface GP286 to another cell or extracellular matrix protein. Can be administered. Preferably, the extracellular domain or a portion thereof is part of a fusion protein that increases serum half-life (eg, all or part of an IgG heavy chain) (see below).
[0200]
The present invention also provides fragments of various proteins of the present invention. Protein fragments are useful as antigenic and immunogenic fragments of GP286. A “fragment” of a protein, as obtained herein, has an amino acid sequence that is identical to a portion of a reference amino acid sequence (this portion is at least 6 amino acids and Less than whole) isolated proteins (also polypeptides, peptides, oligopeptides) are contemplated. As thus defined, a "fragment" need not be obtained by physical fragmentation of a reference protein. However, it does not exclude such sources.
[0201]
Fragments of at least six contiguous amino acids are useful in mapping B and T cell epitopes of a reference protein. For example, Geysen et al., "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amine acid", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984) and U.S. Patent Nos. 4,708,871 and 5,595,915, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. That. Because fragments need not be themselves immunogenic of an immunodominant epitope and need not even be recognized by native antibodies to be useful in such epitope mapping, All fragments of at least six amino acids of the protein have utility in such studies.
[0202]
Fragments of at least 8 contiguous amino acids (often at least 15 contiguous amino acids) have utility as immunogens for raising antibodies that recognize the proteins of the present invention. See, for example, Lerner, "Tapping the Immunological Repertoire to Produce Antibodies of Predeterinated Specificity", Nature 299: 592-596 (1982); Shinnick et al. Rev .. Microbiol. 37: 425-46 (1983); Sutcliffe et al., "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science 219: 660-6 (1983), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. See). As further described in the above references, virtually all 8-mers conjugated to a carrier (eg, a protein) are found to be immunogenic (ie, antibodies to conjugated peptides). All fragments of at least 8 amino acids of the protein of the present invention have utility as immunogenicity.
[0203]
Fragments of at least 8, 9, 10, or 12 contiguous amino acids can also include antibodies (as in epitope mapping), and natural binding partners (eg, subunits in multimeric complexes, of whole proteins or portions thereof). Or a competitive inhibitor of the binding of such a protein to a receptor or ligand); this competitive inhibition allows the identification and separation of molecules that specifically bind to the protein of interest (US Pat. Nos., 5,39,084 and 5,783,674, which are incorporated herein by reference in their entirety).
[0204]
Thus, a protein or protein fragment of the invention is at least 6 amino acids in length, typically at least 8, 9, 10, or 12 amino acids in length, and often at least 15 amino acids in length. Frequently, the proteins of the invention or fragments thereof are at least 20, 25, 30, 35, or 50 amino acids or more in length. Larger fragments having at least 75, 100, 150 or more amino acids are also useful and are sometimes preferred.
[0205]
The present invention further provides fusions of each of the GP286 proteins and protein fragments of the present invention to a heterologous polypeptide. Fusion is intended herein to mean that a protein or protein fragment of the invention is linearly contiguous to a heterologous polypeptide in a peptide binding polymer of amino acids or amino acid analogs; By "peptide" is intended herein a polypeptide that is not naturally present contiguously with a protein or protein fragment of the present invention. As so defined, the fusion may consist entirely of multiple fragments of the GP286 protein in an altered configuration; in such cases, any of the GP286 fragments will It can be considered heterologous to other GP286 fragments. However, more typically, the heterologous polypeptide is not derived from the GP286 protein itself.
[0206]
A fusion protein of the invention comprises at least one fragment of a protein of the invention, which fragment is at least 6, typically at least 8, often at least 15, and usefully at least 16, 17, 18, 19, or It is 20 amino acids long. Fragments of the proteins of the invention included in the fusion may be usefully at least 25, 50, 75, 100, or 150 amino acids in length. Fusions containing the entire protein of the invention have particular utility.
[0207]
Heterologous polypeptides contained within the fusion proteins of the invention are at least 6 amino acids in length, often at least 8 amino acids in length, and preferably at least 15, 20, 25 amino acids in length. Fusions that include larger polypeptides (eg, an IgG Fc region), and just whole proteins (eg, luciferase or GFP chromophore-containing proteins) have particular utility.
[0208]
As noted above in the description of the vectors and expression vectors of the present invention, the heterologous polypeptide comprised in the fusion protein of the present invention advantageously facilitates purification and / or visualization of the recombinantly expressed protein. As well as polypeptides designed to Purification tags can also be incorporated into chemically synthesized fusions, but chemical synthesis typically provides sufficient purity that further purification by HPLC is sufficient; however, visualization tags as described above Retain their utility even when the proteins are produced by chemical synthesis, and when so included, the fusion proteins of the invention will be useful as direct detectable markers of the presence of GP286. .
[0209]
As also discussed above, the heterologous polypeptide included in the fusion proteins of the invention can be usefully associated with a periplasmic space or extracellular space for prokaryotic hosts, via incorporation of secretory signals and / or leader sequences. For the environment, eukaryotes, the culture medium may contain polypeptides that facilitate secretion of the recombinantly expressed protein.
[0210]
Other useful protein fusions of the invention include those that allow use of the proteins of the invention as bait in a yeast two-hybrid system. Bartel et al. (Eds.), The Yes Two Two-Hybrid System, Oxford University Press (1997) (ISBN: 0195109384); Zhu et al., Yeast Hybrid Technologies, 2000-95-Nearby Principle. Et al., Trends Genet. 10 (8): 286-92 (1994); Mendelsohn et al., Curr. Opin. Biotechnol. 5 (5): 482-6 (1994); Luban et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6 (1): 59-64 (1995); Allen et al., Trends Biochem. Sci. 20 (12): 511-6 (1995); Dress, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1): 64-70 (1999); Topcu et al., Pharm. Res. 17 (9): 1049-55 (2000); Fasena et al., Gene 250 (1-2): 1-14 (2000), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. See also. Typically, such fusions are described in E. coli. E. coli LexA or the yeast GAL4 DNA binding domain. Related bait plasmids expressing baits fused to a nuclear localization signal are available.
[0211]
Other useful protein fusions include fusions that allow for the display of proteins encoded on the surface of phage or cells, endogenously detectable proteins (eg, fluorescent proteins or light emission, as described above). Fusions to stable protein domains (eg, an immunoglobulin heavy chain such as an IgG Fc region).
[0212]
The proteins and protein fragments of the present invention can also be used to perform specific excision of cells that bind to or incorporate a protein of the present invention, such as Pseudomonas exotoxin A, diphtheria toxin, Shiga toxin A, carbon (A fungal toxin lethal factor, lysine, or other biologically harmful moiety).
[0213]
The isolated proteins, protein fragments, and protein fusions of the present invention can be composed of natural amino acids joined by native peptide bonds, or can span the entire length of the protein or one or more portions thereof And / or non-natural amino acid analogs, non-native linkages, and / or post-synthetic (post-translational) modifications.
[0214]
As is well known in the art, when isolated proteins are used (eg, for epitope mapping), the extent of such non-natural analogs, non-native residue-to-residue linkages, or post-synthetic modifications is It is limited to the range that allows binding of the peptide to the antibody. When used as an immunogen for the preparation of antibodies in a non-human host (eg, a mouse), the scope of such non-natural analogs, non-native residue linkages, or post-synthesis modifications may be It is limited to a range that does not interfere with the originality. When the isolated protein is used as a therapeutic (eg, a vaccine) or for replacement therapy, the extent of such changes is limited to those that do not render the isolated protein toxic.
[0215]
Techniques for incorporating unnatural amino acids during solid phase chemical synthesis or by recombinant methods are well established in the art. The procedure is described in, among others, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach Series (Practical Approach Series), Oxford Univ. Press (March 2000) (ISBN: 0196637245); Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis (Oxford Chemistry Primers, No. 7), Oxford Univ. Press (August 1992) (ISBN: 098556683); and Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis (Springer Laboratory), Springer Verlag (December 1993) (these are incorporated herein by reference in their entirety; Which are incorporated herein by reference).
[0216]
D-enantiomers of natural amino acids can be easily incorporated during chemical peptide synthesis; peptides constructed from D-amino acids are more resistant to proteolytic attacks; incorporation of D-enantiomers also It can be used to give a specific three-dimensional conformation to. Other amino acid analogs commonly added during chemical synthesis include ornithine, norleucine, phosphorylated amino acids (typically phosphoserine, phosphothreonine, phosphotyrosine), L-malonyltyrosine (non-hybridizable analog of phosphotyrosine) (Kole et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 209: 817-821 (1995)) and various halogenated phenylalanine derivatives.
[0219]
Amino acid analogs with a detectable label can also be usefully incorporated during synthesis to provide a labeled polypeptide. For example, biotin can be added using biotinoyl- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -L-lysine (FMOC biocytin) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). (Biotin can also be added enzymatically by incorporation of an E. coli BirA substrate peptide into the fusion protein.) FMOC and tBOC derivatives of dabcyl-L-lysine (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) , USA) can be used to incorporate dabsyl chromophores at selected sites in the peptide sequence during synthesis. The aminonaphthalene derivative EDANS (the most common chromophore for pairing with the dubsilk enzyme in a fluorescence resonance energy transfer (FRET) system) is EDANS-FMOC-L-glutamic acid or the corresponding tBOC derivative (both Molecular Probes) , Inc., Eugene, OR, USA). Tetramethylrhodamine chromophore can be incorporated during automated FMOC synthesis of peptides using (FMOC) -TMR-L-lysine (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA).
[0218]
Other useful amino acid analogs that can be incorporated during chemical synthesis include aspartic acid, glutamic acid, lysine, and tyrosine analogs with allyl side chain protection (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). Allyl side chains allow the synthesis of cyclic, branched, sulfonated, glycosylated, and phosphorylated peptides.
[0219]
The majority of other FMOC protected unnatural amino acid analogs that can be incorporated during chemical synthesis are commercially available from The Peptide Laboratory (Richmond, CA, USA).
[0220]
Unnatural residues can also be added biosynthetically by engineering suppressor tRNAs (typically those that recognize the UAG stop codon) by chemical aminoacylation with the desired unnatural amino acid. . Conventional site-directed mutagenesis is used to introduce a selected stop codon UAG at the site of interest in the protein gene. When the acylated suppressor tRNA and the mutated gene are combined in an in vitro transcription / translation system, the unnatural amino acid is incorporated in response to a UAG codon to give a protein containing the amino acid at the specified position. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (9): 4780-5 (1999); Wang et al., Science 292 (5516); 498-500 (2001).
[0221]
The isolated GP286 proteins, protein fragments and fusion proteins of the invention may also contain non-native inter-residue bonds, including those that result in cyclic and branched forms. The isolated GP286 proteins and protein fragments of the invention may also include post-translational and post-synthetic modifications, either over the entire length of the protein or localized in one or more portions thereof. .
[0222]
For example, when produced by recombinant expression in eukaryotic cells, the isolated proteins, fragments and fusion proteins of the present invention typically comprise N-linked and / or O-linked glycosylation and Reflects both the availability of glycosylation sites in the protein sequence and the identity of the host cell. Further modifications of the glycosylation pattern can be made enzymatically. As another example, the recombinant polypeptides of the present invention may also include an altered starting methionine residue in some cases resulting from a host-mediated process.
[0223]
Where the proteins, protein fragments, and protein fusions of the present invention are produced by chemical synthesis, post-synthesis modifications may be performed before or after deprotection and cleavage from the resin. Modifications prior to deprotection and cleavage of the synthetic protein often allow greater control, for example, by allowing targeting of the modified moiety to the N-terminus of the resin-bound synthetic peptide. Useful post-synthesis (and post-translation) modifications include conjugation to a detectable label, such as a luminophore. A wide variety of amine and thiol reactivity, which react on the one hand with the N-terminal and ε-amino groups of lysine residues and on the other hand with the free thiol groups of cysteine residues under non-denaturing conditions. Chromophore derivatives have been synthesized.
[0224]
Kits are commercially available that allow the conjugation of proteins to various amine- or thiol-reactive chromophores; Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, USA) are, for example, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Fluorescein-EX, Alexa Fluor 488, Oregon Green 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 564, Alexa Fluor 564, Alexa Fluor 546 And a kit for conjugation of the protein to Texas Red-X. Alexa Fluor (R) 350, Alexa Fluor (R) 488, Alexa Fluor (R) 532, Alexa Fluor (R) 546, Alexa Fluor (R) 568, Alexa Fluor (R) 594, Alexa Fluor. (Registered trademark) 647 (monoclonal antibody labeling kit), BODIPY dye, Cascade Blue, Cascade Yellow, Dansyl, Lissamine Rhodamine B, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Min. A wide variety of other amine reactivities including, tetramethylrhodamine, Texas Red And thiol-reactive chromophores are commercially available (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA).
[0225]
Polypeptides of the invention can also be conjugated to chromophores, other proteins, and other macromolecules using bifunctional linking reagents. Common homobifunctional reagents include, for example, APG, AEDP, BASED, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM [PEO] 3 , BM [PEO] 4 , BS3, BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP (romant reagent), DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, Sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, Sulfo-EGS (all Available from Pierce, Rockford, IL, USA); common heterobifunctional crosslinkers include ABH, AMAS, ANB-NOB, APDP, ASBA, BMPA, BMPH, BMPS, EDC, EMCA, EMCH. , EMCS, KMUA, KMUH, GMBS, LC-SMCC, LC-SPDP, MBS, M2C2H, MPBH, MSA, NHS-ASA, PDPH, PMPI, SADP, SAED, SAND, SANPAH, SAS , SATP, SBAP, SFAD, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, SMPT, SPDP, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-HSAB, Sulfo-KMUS, Sulfo-LC-SPDP, Sulfo-MBS, Sulfo-NHS -LC-ASA, Sulfo-SADP, Sulfo-SANPAH, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMCC, Sulfo-SMPB, Sulfo-LC-SMPT, SVSB, TFCS (all available from Pierce, Rockford, IL, USA). .
[0226]
The proteins, protein fragments, and protein fusions of the present invention can be conjugated to chromophores that are not amine- or thiol-reactive using such crosslinkers. Other labels that can be usefully conjugated to the proteins, protein fragments, and fusion proteins of the invention include reactive labels, endoscopic ultrasonographic contrast agents, and MRI contrast agents. The proteins, protein fragments, and protein fusions of the present invention can also be used to increase the immunogenicity to elicit anti-GP286 antibodies, such as carrier proteins (eg, KLH, bovine thyroglobulin, and just bovine serum albumin (BSA)). ) Can be usefully conjugated using a crosslinking agent.
[0227]
The GP286 proteins, protein fragments and protein fusions of the present invention can also usually be conjugated to polyethylene glycol (PEG); PEGylation increases the serum half-life of proteins administered intravenously for replacement therapy. . Delgado et al., Crit. Rev .. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (3-4): 249-304 (1992); Scott et al., Curr. Pharm. Des. 4 (6): 423-38 (1998); DeSantis et al., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (4): 324-30 (1999), which are incorporated herein by reference in their entirety. The PEG monomer is PEGylated using PEG monomer activated with tresyl chloride (2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride), which allows direct attachment under mild conditions, It can be attached to the protein directly or via a linker.
[0228]
The isolated GP286 protein of the invention (including its fusions) is typically obtained by recombinant expression using an expression vector of the invention as described above, or especially when less than about 100 amino acids. , Optionally by chemical synthesis (typically solid phase synthesis) and sometimes by in vitro translation.
[0229]
After production of the isolated protein of the present invention, purification can be performed if necessary. Purification of recombinantly expressed proteins is now within the skill of the art. See, for example, Thorner et al. (Eds.), Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part A: Gene Expression and Protein Purification (eds., Methods in Enzymology, 2000, Vol. 3, 2000). , Cloning Gene Expression and Protein Purification: Experimental Procedures and Process Rationale, Oxford Univ. Press (2001) (ISBN: 0195132947); Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed. Cold Spring Labor. , Protein Purification Applications, Oxford University Press (2001), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. Therefore, it need not be detailed here.
[0230]
However, in brief, if the purification tag is fused via the use of an expression vector with such a tag, the purification can be performed by any means appropriate to the tag (eg, immobilized metal affinity chromatography for polyhistidine tags). The use of lithography). Other techniques common in the art include ammonium sulfate fractionation, immunoprecipitation, protein high performance liquid chromatography (FPLC), high performance liquid chromatography (HPLC), and preparative gel electrophoresis. Purification of chemically synthesized peptides can be readily effected, for example, by HPLC.
Thus, an aspect of the present invention provides an isolated GP286 protein of the present invention in pure or substantially pure form. A purified protein of the present invention is a protein isolated as described above, which is present at a concentration of at least 95% as measured on a mass basis (w / w) with respect to the total protein in the composition. Exists. Such a purified product can often be obtained during chemical synthesis without further purification, for example by HPLC. A purified protein of the invention may be present at a concentration of 96%, 97%, 98% and even 99% (measured on a mass basis with respect to total protein in the composition). The protein of the invention may still be present at a level of 99.5%, 99.6% and still 99.7%, 99.8% or even 99.9% after purification as by HPLC.
[0231]
Although high levels of purity are preferred when the isolated proteins of the invention are used as therapeutics (eg, as vaccines or for replacement therapy), the isolated proteins of the invention also include Useful even at low purity. For example, a partially purified protein of the invention can be used as an immunogen to raise antibodies in laboratory animals.
[0232]
Thus, the present invention provides an isolated protein of the present invention in a substantially purified form. A "substantially purified protein" of the present invention is an isolated protein as described above, which is present at a concentration of at least 70%, measured on a mass basis with respect to the total protein in the composition. Typically, a substantially purified protein will have at least 75%, 80%, or even at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, as measured on a mass basis relative to total protein in the composition. It is present at a concentration of 94%, 94.5% or even at least 94.9%.
[0233]
In a preferred embodiment, the purified and substantially purified proteins of the present invention are in a composition lacking a detectable amphoteric electrolyte, acrylamide monomer, bisacrylamide monomer and polyacrylamide.
[0234]
The GP286 proteins, fragments and fusions of the invention can usually be conjugated to a substrate. The substrate can be porous, substantially non-porous (eg, plastic) or solid; planar or non-planar; the bond can be covalent or non-covalent. The porous substrate (usually a membrane) typically comprises nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) or a cationically derivatized hydrophilic PVDF; The fragments and fusions can be used to detect and quantify antibodies that specifically bind to the immobilized proteins of the invention, eg, in serum. The proteins, fragments and fusions of the invention, when bound to a substantially non-porous substrate, such as plastic, specifically bind to the immobilized protein of the invention, e.g., detect and detect antibodies in serum. Can be used to quantify.
[0235]
The proteins, fragments and fusions of the present invention may also be bound to a substrate that is suitable for use as a surface enhanced laser desorption ionization source; The protein, fragment or fusion is useful for binding and then detecting a second protein, which has sufficient affinity or surface binding protein to show a biological interaction between them. Combine with avidity.
[0236]
The proteins, fragments and fusions of the invention can also be conjugated to a substrate that is suitable for use in surface plasmon resonance detection. When so bound, a protein, fragment or fusion of the invention is useful for binding and then detecting a second protein, which is a biologically active protein that binds a biologically Bind with sufficient affinity or avidity to show good interaction.
[0237]
(Antibodies and antibody-producing cells)
The present invention relates to antibodies (fragments and fragments thereof) that specifically bind to the GP286 proteins and protein fragments of the present invention or to one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated GP286 nucleic acids of the present invention. Including derivatives). The antibody may be present in the protein in its native conformation or, in some cases, for example, in a protein that is denatured by solubilization in SDS. It may be specific for an epitope, a non-contacting epitope or a conformational epitope.
[0238]
The invention also provides that binding of the antibody is competitive with one or more GP286 proteins and protein fragments of the invention, or with one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated gp286 polynucleotides of the invention. (Including fragments and derivatives thereof).
[0239]
In a first series of antibody embodiments, the invention relates to antibodies (both polyclonal and monoclonal) and fragments thereof that specifically bind to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (ie, the full length gp286 protein). And derivatives.
[0240]
Such antibodies are useful in various in vitro immunoassays (eg, Western blotting and ELISA). Such antibodies are also useful for isolating and purifying the GP286 protein (including related cross-reactive proteins) by immunoprecipitation, immunoaffinity chromatography or magnetic bead-mediated purification. . Such methods are well-known in the art. Anti-GP286 antibodies are also useful for identifying T cells, for marking and killing T cells, and for detectably labeling T cells (see above).
[0241]
In a second series of antibody embodiments, the invention relates to antibodies (both polyclonal and monoclonal), wherein the specific binding of the antibody can be competitively inhibited by the isolated proteins and polypeptides of the invention; Fragments and derivatives thereof are provided.
[0242]
In other embodiments, the invention further provides the above-described antibodies detectably labeled, and in yet other embodiments, the above-described antibodies conjugated to a substrate.
[0243]
As used herein, the term "antibody" refers to at least a portion of at least one that is capable of specifically binding to a first molecular species and a fragment or derivative thereof while still allowing specific binding. Refers to a polypeptide encoded by an immunoglobulin gene.
[0244]
"Specific binding" and "specific binding" are used herein to refer to an antibody as the first molecule rather than binding to the other species in which the antibody and the first species are mixed. Intended for the ability to bind to the species. An antibody is specifically said to "recognize" a first species if the antibody is capable of specifically binding to the first species.
[0245]
As is well known in the art, the degree to which an antibody can distinguish between molecular species in a mixture depends, in part, on the relevance of the conformations of the species in the mixture; Antibodies are at least 2-fold, more typically at least 5-fold, typically up to 10, 25, 50, 75-fold and often more than 100-fold, and sometimes more than 500- or 1000-fold. Many discriminate beyond accidental binding to non-GP286 proteins. When used to detect a protein or protein fragment of the present invention, the antibody of the present invention, when used to determine the presence of the protein of the present invention in samples from human pancreas and neural tissue, has sufficient Specific.
[0246]
Typically, the affinity or avidity of an antibody (or antibody multimer, in the case of an IgM pentamer) of the present invention for a GP286 protein or protein fragment of the present invention is at least about 1 × 10 -6 Moles (M), typically at least about 5 x 10 -7 M, usually at least about 1 × 10 -7 M and at least 1 × 10 -8 M, 5 × 10 -9 M and 1 × 10 -10 The affinity and avidity of M have been found to be particularly useful.
[0247]
The antibodies of the invention can be in naturally occurring forms from any mammalian species (eg, IgG, IgM, IgD, IgE and IgA).
[0248]
Although rare, human antibodies can be derived directly from human donors or human cells. In such cases, antibodies to a protein of the invention typically result from accidental immunization (eg, autoimmunization) with a protein or protein fragment of the invention. Such antibodies are typically, but not invariably, polyclonal.
[0249]
Human antibodies are more frequently obtained using transgenic animals that express human immunoglobulin genes. The transgenic animal can be positively immunized with the GP286 protein immunogen of the present invention. Human Ig transgenic mice capable of producing human antibodies and methods of producing human antibodies from transgenic mice by specific immunization are well known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 6,162,963; 6,150,584; 6,114,598; 6,075,181; 5,939,598; 5,877,397; 5,874,299; 5,814,318; 5,789,650; 5,770,429; 5,661,016. Nos. 5,633,425; 5,625,126; 5,569,825; 5,545,807; 5,545,806, and 5th. No. 5,591,669, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Such antibodies are typically monoclonal, and are typically produced using techniques developed for the production of mouse antibodies.
[0250]
If the antibody of the invention is to be administered to a human as an in vivo diagnostic or therapeutic agent, the recipient immune response to the administered antibody often will be due to the administration of the antibody from another species, such as a mouse. Human antibodies are particularly useful, and are often preferred, as they are substantially lower than the recipient immune response caused by.
[0251]
The IgG, IgM, IgD, IgE and IgA antibodies of the present invention are also usually used in rodents (typically mice, but also rats, guinea pigs and hamsters), lagomorphs (typically rabbits). ) And larger mammals (eg, sheep, goats, cows and horses). In such cases, as with transgenic non-human mammals producing human antibodies, accidental immunization is not required and the non-human mammal will typically be a protein of the invention. Alternatively, protein fragments are used to immunize positively according to standard immunization protocols.
[0252]
As noted above, a carrier, typically a bifunctional linker, is conveniently used, as described elsewhere above (these considerations are incorporated herein by reference). When bound to a protein such as bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin or bovine serum albumin, substantially all fragments of eight or more consecutive amino acids of the protein of the invention can be effectively used as immunogens .
[0253]
Immunogenicity may also be conferred by fusion of the proteins and protein fragments of the invention with other moieties. The peptides of the invention can be produced, for example, by solid phase synthesis on a branched polylysine core matrix; these multi-antigen peptides (MAPs) have improved purity, increased avidity, accurate chemical definition and vaccine development Provide safety. Tam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409-5413 (1988); Posnett et al. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988).
[0254]
Protocols for immunizing non-human mammals are very well established in the art (Harlow et al. (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1999) (ISBN: 0879693142). ; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc (2001). (ISBN: 0-471-52276-7); Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives (Basics: From Background to Bench), Springer Verlag (2000) (ISBN: 0387915907), the disclosures of which are incorporated herein by reference.
[0255]
Antibodies from non-human mammals can be polyclonal or monoclonal, wherein polyclonal antibodies have particular advantage in the immunohistochemical detection of a protein of the invention, and monoclonal antibodies It has the advantage of identifying and distinguishing specific epitopes.
[0256]
In the following immunizations, the antibodies of the present invention can be produced using any art-accepted technique. Such techniques are well known in the art (Coligan et al., Eds., Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001) (ISBN: 0-471-52276-7); Zola, Monoclonal Antibodies: and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives (Basics: From Background to Bench), Springer Verlag (2000) (ISBN: 0387915907); Howard et al. (eds.), Basic Methods in Antibody Production and Charac erization, CRC Press (2000) (ISBN: 0849394457); Harlow et al. (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1998) (eds. ISBN: 087993142), davol. , Humana Press (1995) (ISBN: 0896033082); Delves (eds.), Antibody Production: Essential Technologies, John Wiley & Son Ltd (1997) (ISBN: 0471970ntAnt. body Methods Manual, Chapman & Hall (1997) (ISBN: 0412141914) (in their entirety, are incorporated herein by reference)). Therefore, it is not necessary to elaborate here.
[0257]
Recombinant expression in host cells is particularly useful where fragments or derivatives of the antibodies of the invention are desired. Host cells for the production of recombinant antibodies (whole antibodies, antibody fragments or antibody derivatives) can be prokaryotic or eukaryotic.
[0258]
Prokaryotic hosts may use the phage-displayed antibody technology of the present invention in which the phage-displayed antibody technique is used, wherein the antibody variable region fragments are, for example, genes III for display on the surface of filamentous phage (eg, M13). Particularly useful for producing protein (pIII) or gene VIII protein (pVIII). Well established to date (Sidhu, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (6): 610-6 (2000); Griffiths et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1): 102-8 (1998); Hoogenboom. Et al., Immunotechnology, 4 (1): 1-20 (1998); Rader et al., Current Opinion in Biotechnology 8: 503-508 (1997); Aujame et al., Human Antibodies 8: 155-168, 1997; Biotechnol. 15: 62-70 (1997); de Kruif et al., 17: 453-455 (1996); Barbas et al., Trends in. Biotechnol. 14: 230-234 (1996); Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 433-455 (1994)), and the production, growth and screening (panning) of antibody fragments from such libraries. And the techniques and protocols required for use have recently been compiled: Barbas et al., Phase Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (ISBN 0-87969-546-3); Kay et al. (Ed.), Phase Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, Inc. (1996); Abelson et al. (Eds.), Combinatorial Chemistry, Methods in Enzymology vol. 267, Academic Press (May 1996), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Typically, the phage-displayed antibody fragment is a scFv fragment or a Fab fragment; if desired, a full-length antibody clones the variable regions from the displaying phage into a complete antibody, and contains additional prokaryotic host cells or It can be produced by expressing a full-length antibody in a eukaryotic host cell.
[0259]
Eukaryotic cells are also useful for expressing the antibodies, antibody fragments and antibody derivatives of the present invention. For example, the antibody fragments of the present invention can be prepared as described in Pichia pastoris, Takahashi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (10): 2138-44 (2000); Freyre et al. Biotechnol. 76 (2-3): 157-63 (2000); Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30 (Pt2): 117-20 (1999); Pennell et al., Res. Immunol. 149 (6): 599-603 (1998); Eldin et al. Immunol. Methods. 201 (1): 67-75 (1997); and Saccharomyces cerevisiae, Frenken et al., Res. Immunol. 149 (6): 589-99 (1998); Shusta et al., Nature Biotechnol. 16 (8): 773-7 (1998), the disclosures of which are incorporated herein in their entirety.
[0260]
The antibodies of the present invention, including antibody fragments and derivatives, can also be produced in insect cells. Li et al., Protein Expr. Purif. 21 (1): 121-8 (2001); Ailor et al., Biotechnol. Bioeng 58 (2-3): 196-203 (1998); Hsu et al., Biotechnol. Prog. 13 (1): 96-104 (1997); Edelman et al., Immunology 91 (1): 13-9 (1997); and Nesbit et al. Immunol. Methods. 151 (1-2): 201-8 (1992) (these disclosures are incorporated herein in their entirety).
[0261]
The antibodies of the present invention and fragments and derivatives thereof can also be produced in plant cells. Giddings et al., Nature Biotechnol. 18 (11): 1151-5 (2000); Gavilondo et al., Biotechniques 29 (1): 128-38 (2000); Fischer et al., J Biol. Regul. Homeost. Agents 14 (2): 83-92 (2000); Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30 (Pt2): 113-6 (1999); Fischer et al., Biol. Chem. 380 (7-8): 825-39 (1999); Russell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 119-38 (1999); and Ma et al., Plant Physiol. 109 (2): 341-6 (1995) (the disclosures of which are incorporated herein in their entirety).
[0262]
Mammalian cells useful for recombinant expression of the antibodies, antibody fragments and antibody derivatives of the present invention include CHO cells, COS cells, 293 cells and myeloma cells. Verma et al. Immunol. Methods 216 (1-2): 165-81 (1998) reviews and compares bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems for the expression of antibodies.
[0263]
The antibodies of the present invention are also described in Merk et al. Biochem. (Tokyo). 125 (2): 328-33 (1999) and Ryabova et al., Nature Biotechnol. 15 (1): 79-84 (1997), and can be prepared by cell-free translation and described in Pollock et al. Immunol. Methods 231 (1-2): 147-57 (1999), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety, are prepared in the milk of transgenic animals. obtain.
[0264]
The present invention relates to an antibody fragment that specifically binds to one or more GP286 proteins and protein fragments of the invention, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated gp286 polynucleotides of the invention, or Further provided are antibody fragments whose binding can be competitively inhibited by one or more proteins and protein fragments of the invention, or one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention.
[0265]
Such useful fragments include Fab, Fab ', Fv, F (ab)' 2 , And a single chain Fv (scFv) fragment. Other useful fragments are described in Hudson, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (4): 395-402 (1998). Accordingly, the present invention relates to an antibody derivative that specifically binds to one or more GP286 proteins and protein fragments of the invention, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated nucleic acids of the invention, or Provided are antibody derivatives that can be competitively inhibited by one or more proteins and protein fragments of the invention, or one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention.
[0266]
Useful derivatives of such derivatives are chimeric, primatized and humanized antibodies; such derivatives are less immunogenic in humans. Thus, it is further suitable for in vitro administration of unmodified antibodies from non-human mammalian species.
[0267]
Chimeric antibodies typically comprise the heavy and / or light chain variable region (CDR and frame) of one (typically murine) immunoglobulin fused to the constant region of another species (typically human). Work residues). See, for example, US Pat. No. 5,807,715; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 81 (21): 6851-5 (1984); Sharon et al., Nature 309 (5966): 364-7 (1984); Takeda et al., Nature 314 (6010): 452-4 (1985). (Incorporated herein by reference in its entirety).
[0268]
Primatized and humanized antibodies typically comprise a heavy and / or light chain derived from a mouse antibody grafted into a non-human primate or human antibody V region framework (which typically also includes human constant regions). Chain CDRs (Riechmann et al., Nature 332 (6162): 323-7 (1988); Co et al., Nature 351 (6326): 501-2 (1991); U.S. Patent No. 6,054,297; No. 5,770,196; No. 5,766,886; No. 5,821,123; No. 5,869,619; No. 6,180,377. 6,013,256; 5,693,761; and 6,180,370 (the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety). .
[0269]
Other useful antibody derivatives of the present invention include heteromeric antibody conjugates and antibody fusions (eg, bi-antibodies (bispecific antibodies), single-chain bi-antibodies and inner antibodies).
[0270]
The antibodies of the present invention, including fragments and derivatives thereof, may be usefully labeled. Accordingly, another aspect of the present invention is directed to one or more proteins and protein fragments of the present invention, one or more GP286 proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the present invention, which are specifically labeled. To provide antibodies. That is, its binding can be competitively inhibited by one or more proteins and protein fragments of the invention, or one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention.
[0271]
The choice of label will depend, in part, on the desired application. Where the antibodies of the invention are used for immunohistochemical staining of tissue samples, the label may usefully be an enzyme that catalyzes the production and local deposition of a detectable product. Enzymes typically conjugated to antibodies that allow their immunohistochemical visualization are well known and include alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase (HRP) and Urease. The antibodies of the present invention can also be labeled using colloidal gold.
[0272]
Numerous representative materials for the production and deposition of visually detectable products, luminescent and fluorescent labels, are also well known and need not be described further. See, for example, Thorpe et al., Methods Enzymol. 133: 331-53 (1986); Kricka et al. Immunoassay 17 (1): 67-83 (1996); and Lundqvist et al. Biolumin. Chemilumin. 10 (6) 353-9 (1995), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. Kits for enhanced chemiluminescence detection (ECL) are commercially available.
[0273]
When the antibodies of the invention are used, for example, for flow cytometry detection, fluorescence activated cell sorting (FACS), scanning laser cytometry detection, or fluorescence immunoassay, they may usefully comprise a fluorophore. (Fluorophore). Usefully, there is a wide variety of fluorophore labels that can bind to the antibodies of the invention. Many are described, for example, in Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA.
[0274]
For secondary detection using labeled avidin, streptavidin, captavidin or neutravidin, the antibodies of the invention may usefully be labeled with biotin.
[0275]
When the antibodies of the invention are used, for example, for Western blot applications, these antibodies are usefully labeled with radioisotopes (eg, 33 P, 32 P, 35 S, 3 H and 125 I). As another example, when the antibodies of the invention are used for radioimmunotherapy, this label can be usefully 228 Th, 227 Ac, 225 Ac, 223 Ra, 213 Bi, 212 Pb, 212 Bi, 211 At, 203 Pb, 194 Os, 188 Re, 186 Re, 153 Sm, 149 Tb, 131 I, 125 I, 111 In, 105 Rh, 99m Tc, 97 Ru, 90 Y, 90 Sr, 88 Y, 72 Se, 67 Cu or 47 Sc. Radiolabeled anti-GP286 antibody can be used to specifically target and kill T cells in patients in need thereof. As another example, when the antibodies of the present invention are used for in vivo diagnostic applications, these antibodies may be used as MRI contrast agents (eg, gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), Lauffer et al., Radiology 207 (2)). : 529-38 (1998)) or by radioisotope labeling. As will be appreciated by those skilled in the art, the use of any of the above labels is not limited to the mentioned application.
[0276]
Antibodies of the present invention (including fragments and derivatives thereof) may also be used to target proteins that display and / or express the present invention to a biologically detrimental effect by targeting the ablative effect of toxins. Other moieties (eg, toxins). As discussed above, toxin-conjugated anti-GP286 antibodies can be used to bind and kill T cells in patients in need thereof. Generally, the antibodies in such immunotoxins are conjugated to Psedmonas exotoxin A, diphtheria toxin, Shiga toxin A, anthrax toxin lethal factor, or ricin. See, for example, Hall (ed.), Immunotoxin Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 166), Human Press (2000) (ISBN: 0896037754); Frankel et al., (Japan); See Incorporated (1998) (ISBN: 3540640975). These disclosures are hereby incorporated by reference in their entirety for review.
[0277]
The antibodies of the present invention may be useful for binding to a substrate. Accordingly, the invention provides antibodies that specifically bind to one or more GP286 proteins and protein fragments of the invention, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention. . That is, the binding can be competitively inhibited by one or more proteins and protein fragments of the invention bound to the substrate, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention. The substrate can be porous or non-porous, planar or non-planar.
[0278]
For example, the antibodies of the invention can be usefully conjugated to a filtration medium (eg, NHS-activated Sepharose or CNBr-activated Sepharose) for immunoaffinity chromatography purposes.
[0279]
The antibodies of the present invention can also be usefully conjugated to paramagnetic microspheres, typically by biotin-streptavidin interaction, which then expresses or expresses a protein of the present invention. It can be used for isolation of the presenting cells. As another example, the antibodies of the invention can be usefully bound to the surface of a microtiter plate for an ELISA.
[0280]
As described above, the antibodies of the invention can be produced in prokaryotic and eukaryotic cells. Accordingly, the present invention also provides cells expressing the antibodies of the present invention, including hybridoma cells, B cells, plasma cells, and host cells recombinantly modified to express the antibodies of the present invention. .
[0281]
The present invention also provides aptamers that have evolved to specifically bind to one or more GP286 proteins and protein fragments of the present invention, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the present invention. I will provide a. That is, the binding can be competitively inhibited by one or more proteins and protein fragments of the invention, one or more proteins and protein fragments encoded by the isolated polynucleotides of the invention.
[0282]
(Pharmaceutical composition and method of treatment)
GP286 is a novel member of the immunoglobulin (Ig) superfamily expressed on T cells. Expression in other tissues and organs appears to be due to T cell infiltration of other tissues. GP286, a cell surface transmembrane protein, has one prominent Ig domain in its extracellular portion, which domain is known to mediate intercellular recognition and adhesion in other family members. . As a member of the Ig superfamily, GP286 may be important for mediating intercellular recognition, intercellular binding, and intercellular adhesion functions in the immune system, especially T cells.
[0283]
Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid, protein and antibody of the present invention and a mimetic, agonist, antagonist or modulator of GP286 activity, which results in mis-expression of GP286. As a pharmaceutical agent for the treatment (ie, amelioration) of a disorder, condition or disease associated with, or to overcome the aberrant expression or activity of GP286-related molecules and other components involved in the cell recognition pathway. Can be done. Since GP286 expression is expressed in T cells, it is expected that GP286 misexpression may be associated with an immune disorder or disease, and / or an innate defect in immune development or function.
[0284]
T cell mediated diseases include, but are not limited to, transplant disorders, autoimmune diseases, cancer, multiple sclerosis, graft versus host disease, and Kawasaki disease. Examples of autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, Sjogren's syndrome, thyroiditis, Graves' disease, pulmonary fibrosis, bronchiolitis obliterans, hemolytic anemia and Wegener's granulomatosis. Examples of cancers include leukemias and lymphomas, including but not limited to acute and chronic myeloid leukemia and multiple myeloma. Other immune disorders include immunodeficiency (eg, AIDS).
[0285]
The use of GP286 modulators (including GP286 antisense reagents, GP286 ligands and anti-GP286 antibodies) to treat individuals having or at risk for developing these diseases is a subject of the present invention. This is one aspect.
[0286]
The compositions of the present invention typically comprise about 0.1-90% by weight (e.g., 1-20% or 1-10%) of a therapeutic agent of the present invention in a pharmaceutically acceptable carrier. . Solid formulations of the composition for oral administration include a suitable carrier or excipient such as corn starch, gelatin, lactose, acacia, sucrose, microcrystalline cellulose, kaolin, mannitol, dicarcium phosphate, calcium carbonate, Sodium chloride or alginic acid). Disintegrants that may be used include, but are not limited to, microcrystalline cellulose, corn starch, sodium starch glycolate, and alginic acid. Tablet binders that may be used include acacia, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone (Povidone). TM ), Hydroxypropyl methylcellulose, sucrose, starch and ethylcellulose. Lubricants that can be used include magnesium stearate, stearic acid, silicone fluids, talc, waxes, oils and colloidal silica.
[0287]
Liquid formulations of the compositions for oral administration prepared in water or other aqueous vehicles can be prepared using various suspending agents, such as methylcellulose, alginate, tragacanth, pectin, kelgin, carrageenan, acacia, Polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol). Liquid formulations may also include solutions, emulsions, syrups, elixirs, together with the active compound, humectants, sweeteners and coloring and flavoring agents. Various liquid and powder formulations can be prepared by conventional methods for inhalation into the lungs of the mammal to be treated.
[0288]
Injectable formulations of the compositions include various carriers such as vegetable oils, dimethylacetamide, dimethylformamide, lactate, ethyl carbonate, isopropyl myristate, ethanol, polyols (glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like). For intravenous injection, a water-soluble form of the compound can be administered by infusion, whereby a pharmaceutical composition comprising an antifungal agent and a physiologically acceptable excipient is injected. Particularly acceptable excipients may include, for example, 5% dextrose, 0.9% saline, Ringer's solution or other suitable excipients. A suitable soluble salt form of a sterile formulation is a pharmaceutical excipient (eg, distilled water for injection, 0.9% saline). It can be dissolved and administered in water, or a 5% glucose solution) Suitable insoluble forms of the compound are aqueous or pharmaceutically acceptable oil bases such as esters of long chain fatty acids (Eg, ethyl oleate) as a suspension.
[0289]
Topical semi-solid ointment formulations typically contain the active ingredient in a carrier, such as a pharmaceutical cream base, at a concentration of about 1-20%, for example 5-10%. Various formulations for topical use include drops, tinctures, lotions, creams, solutions and ointments containing the active ingredient and various supports and vehicles. The optimal proportion of the therapeutic agent in each pharmaceutical formulation will vary according to the formulation itself and the particular pathology and therapeutic effect desired in the relevant treatment regimen.
[0290]
Inhalational and transdermal formulations may also be readily prepared.
[0291]
Pharmaceutical prescribing is a well-established field and is further described below: Gennaro (eds.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott, Williams & Williams (2000) (330N). ; Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott, Williams & Wlikins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); and Kibbe (eds.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharm Aceuticl Association, Third Edition, (2000) (ISBN: 0917333096X), the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Conventional methods known to those skilled in the pharmaceutical arts can be used to administer a pharmaceutical formulation to a patient.
[0292]
Typically, the pharmaceutical formulation applies a transdermal patch containing the pharmaceutical formulation to the patient's skin and leaves the patch in contact with the patient's skin (generally, , 1 to 5 hours). Other transdermal routes of administration (eg, through the use of topically applied creams, ointments, and the like) can be used by applying conventional techniques. These pharmaceutical formulations can also be prepared by other conventional routes (eg, enteral, subcutaneous, pulmonary, intramucosal, intraperitoneal, intraperitoneal, intrauterine) using standard techniques. , Sublingual, intrathecal, or intramuscular route). In addition, the pharmaceutical formulation can be administered to a patient via administration of an injectable depot, eg, by using one month, three months or six months of depotable or biodegradable materials and methods. Can be administered.
[0293]
Regardless of the route of administration, the therapeutic protein or antibody agent is typically administered at a daily dosage of 0.01 mg to 30 mg per kg of patient weight (eg, 1 mg / kg to 5 mg / kg). The pharmaceutical formulation can be administered in multiple doses per day, if desired, to achieve the desired total daily dose. The effectiveness of the treatment method can be assessed by monitoring the patient for known signs or symptoms of the disorder.
[0294]
The pharmaceutical compositions of the invention may be included in a container, package, or dispenser, alone or as part of a kit having labels and instructions for administration.
[0295]
(Transgenic animals and cells)
In another aspect, the present invention provides transgenic cells and transgenic non-human organisms containing gp286 nucleic acids, as well as transgenic cells and non-human organisms targeted for disruption of the endogenous ortholog of the human gp286 gene. . These cells can be embryonic stem cells or somatic cells. These transgenic non-human organisms can be chimeric, non-chimeric heterozygotes, and non-chimeric homozygotes. gp286 can be a splice variant gp286 or gp286a.
[0296]
The host cells of the invention can be used to produce non-human transgenic animals. For example, in some embodiments, a host cell of the invention is a fertilized egg or embryonic stem cell into which a gp286 nucleotide sequence has been introduced. Such a host cell can be used to create a non-human transgenic animal in which the exogenous gp286 sequence has been introduced into its genome, or to alter or replace the relevant endogenous gp286 sequence in the animal. Can be used for
[0297]
As used herein, a "transgenic animal" is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a cow, goat, sheep or rodent, wherein one or more animal cells contain the transgene. (Eg, rat, mouse). Other examples of transgenic animals include non-human primates, dogs, chickens, amphibians, and the like.
[0298]
As used herein, a "transgene" is exogenous DNA that is integrated into the genome of the cell in which the transgenic animal develops and is retained in the genome of the mature animal, thereby transgenes. Directs the expression of the encoded gene product in one or more cell types or tissues of the transgenic animal.
[0299]
As used herein, a "homologous recombinant animal" refers to an endogenous gp286 gene in which the endogenous gene and the animal are introduced into an animal cell (eg, an animal embryonic stem cell) prior to animal development. A non-human animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, which has been altered by homologous recombination with an exogenous DNA molecule.
[0300]
The non-human transgenic animals of the present invention are useful for studying the function and / or activity of gp286, and for identifying and / or evaluating modulators of gp286 activity. They are also useful in methods for producing a GP286 protein or polypeptide fragment, ie, where the protein is produced in the mammary gland of a non-human mammal.
[0301]
Transgenic animals of the invention can be made by introducing gp286-encoding nucleic acid into the male pronucleus of fertilized eggs, for example, by microinjection, retroviral infection, and generating oocytes in pseudopregnant female parent mice. . A polynucleotide comprising the human gp286 DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 can be introduced as a transgene into the genome of a non-human animal. Alternatively, a non-human homolog of the human gp286 gene (eg, the mouse gp286 gene) isolated by hybridization to the isolated polynucleotide of the invention can be used as a transgene. The sequence of the heterologous transcription control sequence, intron sequences, polyadenylation signals, etc., can also be operably linked to the transgene to increase the effectiveness of the transgene in the recipient host animal, or otherwise, (Eg, in a developmental or tissue-specific manner).
[0302]
Methods for producing transgenic animals, particularly animals such as mice, by embryo manipulation and microinjection have become conventional in the art and are described, for example, in: US Pat. 4,870,009; and 4,873,191; Hogan 1986, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.J. Y. And Hogan 1999, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .; Y. Similar methods are used for the production of other transgenic animals. A transgenic founder can be identified based on the presence of the gp286 transgene in the genome and / or expression of gp286 mRNA in the tissue or cells of the animal. The transgenic founder can then be used to breed additional animals carrying the transgene. In addition, transgenic animals carrying the transgene encoding gp286 can be further crossed with other transgenic animals carrying other transgenes.
[0303]
To produce a homologous recombinant animal, a vector containing at least a portion of the gp286 gene is prepared, wherein at least a portion of the gp286 gene has been deleted, added or substituted, thereby altering the gp286 gene. (Eg, functionally destroy). The gp286 gene can be a human gene (eg, SEQ ID NO: 1, 13 or 14), but is more preferably a non-human homolog of the human gp286 gene. For example, a mouse homolog of the human gp286 gene of SEQ ID NO: 1, 13 or 14 can be used to construct a suitable homologous recombination vector for altering the endogenous gp286 gene in the mouse genome.
[0304]
In some embodiments, the vector is such that upon homologous recombination, the endogenous gp286 gene is functionally disrupted (ie, no longer encodes a functional protein; also referred to as a "knockout" vector). Designed. Alternatively, the vector may have the endogenous gp286 gene mutated or otherwise altered upon homologous recombination, but still encode a functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered; Alters the expression of endogenous GP286 protein). In a homologous recombination vector, the altered portion of the gp286 gene is used to enable homologous recombination to occur between the exogenous gp286 gene carried by the vector and the endogenous gp286 gene in embryonic stem cells. , Flanking its 5 'and 3' ends by additional nucleic acids of the gp286 gene. Additional flanking gp286 nucleic acids are of sufficient length for successful homologous recombination with the endogenous gene. Typically, several kilobases of flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) are included in the vector. See, for example, Thomas et al. (1987) Cell 51: 503 for an exemplary description of homologous recombination vectors.
[0305]
This vector is introduced (eg, by electroporation) into an embryonic stem cell line, and cells in which the introduced gp286 gene has been homologously recombined with the endogenous gp286 gene are selected (eg, Li et al. 1992) Cell 69: 915). The selected cells are then injected into a blastocyst of an animal (eg, a mouse) to form an assembled chimera. See, for example, Bradley 1987, TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTOCAL APPROACH, edited by Robertson, IRL, Oxford, pp. 113-152. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female parent and the embryo is imminent. Progeny having DNA homologously recombined into germ cells can be used to breed animals in which all cells of the animal contain DNA homologously recombined by germline transmission of the transgene.
[0306]
Homologous recombination vectors and methods for constructing homologous recombination animals are further described below: Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; Hogan 1999, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ. Y; PCT International Publication Nos. WO90 / 11354; WO91 / 01140; WO92 / 0968; and WO93 / 04169.
[0307]
Clones of the non-human transgenic animals described herein can also be made according to the methods described, for example, in Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813. Briefly, cells from transgenic animals (eg, somatic cells) can be isolated and induced to exit the growth cycle and enter the G0 phase. The stationary phase cells can then be fused to enucleated egg cells from an animal of the same species from which the stationary phase cells were isolated, for example, by use of an electrical pulse. The reconstructed egg cells are then cultured to develop into morula or undifferentiated germ cells and then transferred to pseudopregnant female parents. The offspring of the female parent animal are clones of the animal from which the cells (eg, somatic cells) have been isolated.
[0308]
Regulated expression of a transgene in vivo can be controlled by a recombinant system (eg, the cre / loxP recombination system (see, eg, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6322-2236). And the FLP recombination system (O'Gormen et al. (1991) Science 251: 1315-1355). If the cre / loxP recombination system is used to regulate transgene expression, animals containing transgenes encoding both Cre recombinase and the selected protein are required. A transgenic animal containing both elements of the system is mated, for example, to two transgenic mice, each containing either a transgene encoding a selected protein or a transgene encoding a recombinase. You can get by.
[0309]
(Antisense reagents and methods)
(A. Antisense)
Many of the isolated polynucleotides of the present invention are antisense polynucleotides that recognize a gp286 polynucleotide and hybridize to the gp286 polynucleotide. Full length and fragment antisense polynucleotides are provided. The fragment antisense molecule of the present invention comprises (i) a molecule that specifically recognizes gp286 RNA and specifically hybridizes to the gp286 RNA (a DNA encoding GP286 and a DNA encoding another known molecule). As determined by sequence comparison with Identification of a sequence that is unique to a polynucleotide that encodes GP286 can be deduced by use of any publicly available sequence database and / or by use of commercially available sequence comparison programs. Following identification of the desired sequence, isolation by restriction digestion or amplification using any of the various polymerase chain reaction techniques well known in the art can be performed. Antisense polynucleotides are of particular interest in regulating the expression of GP286 by cells that express gp286 mRNA (eg, T cells).
[0310]
Antisense oligonucleotides or fragments of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 13, or 14 derived from the nucleotide sequence encoding GP286, or sequences complementary or homologous thereto, may be found in various tissues. It is useful as a diagnostic tool to search for gene expression. For example, tissues can be probed in situ using oligonucleotide probes with groups detectable by conventional autoradiographic techniques to investigate the native expression of the enzyme or its associated pathological condition. . In certain aspects, an antisense comprising a sequence complementary to at least about 10 nucleotides, about 25 nucleotides, about 50 nucleotides, about 100 nucleotides, about 250 nucleotides, or about 500 nucleotides, or the entire gp286 coding strand or only a portion thereof. A sense nucleic acid molecule is provided. Nucleic acid molecules encoding fragments, homologues, derivatives and analogs of the GP286 protein of SEQ ID NO: 2 or 15 and antisense nucleic acids complementary to the GP286 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 13, or 14 are further provided.
[0311]
An antisense nucleic acid molecule of the invention can be antisense to the "coding region" or the non-coding region of the coding strand of a nucleotide sequence encoding GP286. The term “coding region” refers to a region of the nucleotide sequence that includes codons translated into amino acid residues (eg, the protein coding region of human GP286 corresponds to the coding region of SEQ ID NO: 1 or 14).
[0312]
The antisense oligonucleotide preferably relates to a regulatory region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 13, or 14, or an mRNA corresponding thereto, including but not limited to initiation codons, TATA boxes, enhancer sequences and the like. . The antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding or non-coding region of gp286, but is more preferably an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of gp286 mRNA. . For example, the antisense oligonucleotide can be complementary to the region around the translation start site of gp286 mRNA. Antisense oligonucleotides can be, for example, about 5 nucleotides, about 10 nucleotides, about 15 nucleotides, about 20 nucleotides, about 25 nucleotides, about 30 nucleotides, about 35 nucleotides, about 40 nucleotides, about 45 nucleotides. It can be nucleotides long or about 50 nucleotides long.
[0313]
The antisense nucleic acids of the invention can be constructed using chemical synthesis or enzymatic ligation using procedures known in the art. For example, antisense nucleic acids (eg, antisense oligonucleotides) can be naturally-occurring nucleotides or various modified nucleotides (for increasing the biological stability of a molecule or between an antisense nucleic acid and a sense nucleic acid). Designed to increase the physical stability of the resulting duplex (eg, phosphorothioate derivatives and acridine substituted nucleotides can be used).
[0314]
Alternatively, an antisense nucleic acid can be produced biologically using an expression vector in which the nucleic acid has been subcloned in the antisense orientation (ie, RNA transcribed from the inserted nucleic acid is further described in the following subsections). In the antisense direction to the target nucleic acid of interest.
[0315]
The antisense nucleic acid molecules of the invention (preferably oligonucleotides of 10-20 nucleotides in length) typically hybridize or bind to cellular mRNA and / or genomic DNA encoding GP286 protein, Thereby, administered to a subject or made in situ to inhibit expression of the protein, for example, by inhibiting transcription and / or translation. Inhibition of gp286 expression, either at the transcriptional or translational level, is useful for creating a cellular or animal model for a disease / condition characterized by abnormal gp286 expression. Inhibition of gp286 expression is also useful for inhibiting abnormal T cell adhesion to other cells or extracellular matrix.
[0316]
Hybridization can be by conventional nucleotide complementarity to form a stable duplex, or, for example, in the case of an antisense nucleic acid molecule that binds to a DNA duplex, by specific interaction in the major groove of the duplex helix. It can be by action. Phosphorothioate and methylphosphonate antisense oligonucleotides are specifically contemplated for therapeutic use according to the present invention. Antisense oligonucleotides can be further modified by adding a poly-L-lysine, transferrin, polylysine, or cholesterol moiety to the 5 'end.
[0317]
An example of a route of administration of the antisense nucleic acid molecules of the invention includes direct injection into a tissue site. Alternatively, antisense nucleic acid molecules can be modified to target selected cells and then administered systemically. For example, for systemic administration, an antisense molecule is a receptor or antigen expressed on a selected cell surface, for example, by linking an antisense nucleic acid molecule to a peptide or antibody that binds to a cell surface receptor or antigen. Can be modified to specifically bind to Antisense nucleic acid molecules can also be delivered to cells using the vectors described herein. To achieve a sufficient intracellular concentration of the antisense molecule, a vector construct in which the antisense nucleic acid molecule is placed under the control of a potent pol II or pol III promoter is preferred.
[0318]
In another embodiment, an antisense nucleic acid molecule of the invention is an a-anomeric nucleic acid molecule. a-anomeric nucleic acid molecules, unlike normal b-units, form specific double-stranded hybrids with complementary RNAs whose strands run parallel to each other (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). Antisense nucleic acid molecules can also be 2'-O-methyl ribonucleotides (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6131-148) or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327-330). ).
[0319]
(B. Ribozymes and catalytic nucleic acids)
In some embodiments, the antisense nucleic acids of the invention are part (or, as a modification, "nucleozymes") of a gp286-specific ribozyme. Ribozymes are catalytic RNA molecules having ribonuclease activity capable of cleaving single-stranded nucleic acids (eg, mRNA) having complementary regions. Thus, ribozymes (eg, hammerheads, hairpins, group I intron ribozymes, etc.) are used to catalytically cleave gp286 mRNA transcripts, thereby inhibiting translation of gp286 mRNA. Ribozymes having specificity for a gp286 encoding nucleic acid can be designed based on the nucleotide sequence of a gp286 polynucleotide disclosed herein (SEQ ID NO: 1, 13 or 14). For example, U.S. Pat. Nos. 5,116,742; 5,334,711; 5,652,094; and 6,204,027 (the entire contents of which are incorporated herein by reference). ).
[0320]
For example, a derivative of Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed in which the nucleotide sequence of the active site is complementary to the nucleotide sequence cleaved into GP286 encoding mRNA. See, for example, Cech et al., US Pat. No. 4,987,071; and Cech et al., US Pat. No. 5,116,742. Alternatively, gp286 mRAN can be used to select catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules. See, for example, Bartel et al. (1993) Science 261: 1411-1418.
[0321]
Expression of the gp286 gene is inhibited by targeting a nucleotide sequence complementary to a regulatory region of gp286 (eg, the gp286 promoter and / or enhancer) to form a triple helix that prevents transcription of the gp286 gene in target cells. obtain. Generally, Helene. (1991) Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene. Et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; and Maher (1992) Bioassays 14: 807-15.
[0322]
(C. Peptide nucleic acid (PNA))
In other preferred oligonucleotide mimetics, which are particularly useful for in vivo administration, both the sugar and the nucleoside linkage can be replaced with new groups (eg, peptide nucleic acids (PNA)). See, for example, Hyrup et al., (1996) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 5-23. In PNA compounds, the phosphodiester backbone of nucleic acids is replaced with an amide-containing backbone, particularly by repeating N- (2-aminoethyl) glycine units linked by amide bonds. The nucleobase is typically linked directly or indirectly to the aza nitrogen atom of the amide moiety of the backbone by a methylene carbonyl linkage. The synthesis of PNA oligomers is described in Hyrup et al., Supra; and Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675 (1996), and can be performed using standard solid phase peptide synthesis protocols.
[0323]
The gp286 PNA can be used in therapeutic and diagnostic applications. For example, PNAs can be used as antisense or antigenic agents for sequence-specific regulation of gene expression, for example, by introducing transcription or translation termination or inhibitory replication. gp286 PNAs can also be used as artificial restriction enzymes, for example, by PNA-directed PCR clamping, for example, in the analysis of single base pair mutations in genes; when used in combination with other enzymes (eg, S1 nuclease). Or as a probe or primer for hybridization with DNA sequences (Hyrup et al., Supra; and Perry-O'Keefe, supra).
[0324]
In some embodiments, the PNAs of gp286 may be attached to PNAs by attaching a lipophilic or other helper group, for example, to enhance their stability or cellular uptake, or by forming a PNA-DNA chimera, or It can be modified by the use of liposomes or other techniques of drug delivery known in the art. For example, a PAN-DNA chimera of gp286 can be created, which can combine the advantageous properties of PNA and DNA. Such chimeras allow DNA recognition enzymes (eg, RNase H and DNA polymerase) to interact with the DNA portion, while the PNA portion provides high binding affinity and specificity. PNA-DNA chimeras can be joined using linkers of the appropriate length selected in terms of base stacking, number of nucleobase linkages, and orientation (Hyrup, supra). The synthesis of PNA-DNA chimeras is described in Hyrup, supra and Finn et al., Nuc. Acids Res. 24: 3357-63 (1996).
[0325]
For example, DNA strands can be synthesized on a solid support using standard phosphoramidite conjugation chemistry, and modified nucleoside analogs (eg, 5 '-(4-methoxytrityl) amino-5'-deoxy-thymidine phosphoramidite). Dite) can be used between the PNA and the 5 'end of the DNA (Mag et al., Nuc. Acids Res. 17: 5973-88 (1989)). The PNA monomers are then linked in a sequential manner to create a chimeric molecule having a 5 'PNA segment and a 3' DNA segment (Finn et al., Supra). Alternatively, chimeric molecules can be synthesized with a 5 'DNA segment and a 3' PNA segment. Petersen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124 (1975).
[0326]
In other embodiments, the oligonucleotide may be other accessory groups, such as peptides (eg, to target host cell receptors in vivo), or cell membranes (eg, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652 (1987); PCT Publication No. WO88 / 09810) or the blood-brain barrier (eg, PCT). (See Publication No. WO 89/10134). In addition, oligonucleotides can be triggered triggered cleavage agents (see, eg, Kroll et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)) or intercalating agents (eg, Zon, Pharm. Res. 5). : 539-549 (1988)). For this purpose, the oligonucleotide may be conjugated to another molecule, such as a peptide, a hybridization-triggered crosslinker, a transport agent, a hybridization-triggered cleavage agent, and the like.
[0327]
PNA chemistry and applications are described, inter alia, in Ray et al., FASEB J. Am. 14 (9): 1041-60 (2000); Nielsen et al., Pharmacol Toxicol. 86 (1): 3-7 (2000); Larsen et al., Biochim Biophys Acta 1489 (1): 159-66 (1999); Nielsen, Curr. Opin. Struct. Biol. 9 (3): 353-7 (1999), and Nielsen, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1): 71-5 (1999), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[0328]
(Diagnosis method)
(A. Nucleic acid diagnosis)
As noted above, the isolated polynucleotides of the present invention can be expressed in tissues that are normally expressed (eg, immune system tissues, especially T cells), and at a significant level when abnormal tissue misexpression is suspected. Can be used as a nucleic acid probe to assess the level of gp286 mRNA in tissues that are not expressed at
[0329]
Accordingly, the present invention provides a method for contacting a sample with an isolated polynucleotide of the present invention, wherein the isolated gp286 polynucleotide sequence may be specifically detected by hybridization, thereby obtaining a biological sample (eg, a cell extract, a patient). A fluid or tissue sample derived from the same). This method is useful, for example, to determine whether non-immune tissue is infiltrated with T cells, which may indicate inflammation and / or disease.
[0330]
Preferably, the method comprises contacting the sample with the isolated nucleic acid under highly stringent hybridization conditions and detecting hybridization of the isolated polynucleotide to the nucleic acid in the sample. Wherein the presence of this hybridization indicates the presence of the gp286 coding sequence in the sample.
[0331]
The present invention also provides diagnostic assays for identifying the presence or absence of a genetic damage or mutation characterized by at least one of the following: (i) aberrant alterations or mutations in the gene encoding the GP286 protein; (Ii) misregulation of the gene encoding the GP286 protein; and (iii) aberrant post-translational modification of the GP286 protein. Here, the wild-type gene encodes a protein having GP286 biological activity.
[0332]
The invention further provides a method of identifying a homolog of the human gp286 gene, comprising the steps of: combining a nucleic acid library with a nucleic acid probe comprising SEQ ID NO: 1, 13 or 14, or a portion thereof having at least 17 nucleotides. Hybridization under stringent hybridization conditions; and determining whether the nucleic acid probe hybridizes to a nucleic acid sequence in a library. If the nucleic acid sequence of the library hybridizes under such selected conditions, it is a homolog of the human gp286 gene.
[0333]
(B. Antibody diagnosis)
The antibodies of the present invention can be used to assess the expression level of GP286 protein in normally expressed tissues (eg, immune system tissues) and, if abnormal tissue misexpression is suspected, in tissues that are not normally expressed. .
[0334]
Thus, the present invention provides a method for contacting a GP286 in a biological sample (eg, a cell extract, fluid or tissue sample from a patient) by contacting the sample with an agent capable of detecting the presence of the GP286 protein or an indicator of its activity. Methods are provided for detecting the presence of a protein or its activity. Preferably, the agent is an antibody specific for at least one epitope of the GP286 protein. In a more preferred embodiment, the antibody is specific for one or more other splice variants (GP286 or GP286a).
[0335]
Accordingly, the present invention provides a method for determining whether a GP286 protein is present in a sample, the method comprising: contacting a sample with an antibody having at least one GP286 epitope; Detecting the specific binding to the antigen, which indicates the presence of the GP286 protein in the sample. The method is useful, for example, to determine whether non-immune tissue has been infiltrated by T cells, which may indicate inflammation or other disease states.
[0336]
(C. Method for Diagnosing Disease)
The gp286 isolated polynucleotides, proteins and GP286-specific antibodies of the present invention are useful in methods for diagnosing various disorders and disease states associated with abnormal gp286 expression.
[0337]
Accordingly, the present invention provides a method for diagnosing a disease state in a subject, the method comprising determining the amount or activity of GP286 protein in a tissue sample from the subject by a control sample (eg, a healthy subject). Comparing the amount or activity of the GP286 polypeptide in the tissue sample with respect to the amount or activity of the GP286 polypeptide in the control sample. A significant difference in indicates that the subject has a disease state.
[0338]
In a preferred embodiment, the amount or activity of GP286 polypeptide in a tissue sample is assessed by a competitive binding assay using a GP286 polypeptide or fragment of the invention, or by an immunoassay using a GP286-specific antibody of the invention. Preferably, the method is used to diagnose a disease state associated with the pancreas or nervous system.
[0339]
Also provided are methods for diagnosing a disease state in a subject by monitoring relative gp286 mRNA levels in different tissues. Preferably, the method includes comparing the amount of gp286 mRNA in a test tissue sample from the subject to the amount of gp286 mRNA in a control sample, wherein the amount of gp286 mRNA in the control sample is compared to the amount in the control sample. A significant difference in the amount of mRNA indicates that the subject has a disease state.
[0340]
In a preferred embodiment, the amount of gp286 mRNA in a tissue sample is assessed by hybridization using an isolated gp286 polynucleotide or nucleic acid fragment of the invention. Preferably, the method is used to diagnose disease states associated with the immune system, especially those involving T cells.
[0341]
(Computer readable means)
A further aspect of the present invention is a computer readable means for storing the gp286 nucleic acid and amino acid sequences of the present invention. In a preferred embodiment, the present invention provides a computer readable means for storing SEQ ID NOs: 1-33 described herein as a complete set of sequences or in any combination. A record of the computer readable means allows for the positioning of data in a query for data that meets certain criteria, comparison of sequences, alignment or ordering of sequences that meet a particular set of criteria for reading and display. May be accessed, such as for interfacing with a computer system for application of a program.
[0342]
The nucleic acid and amino acid sequences of the present invention are particularly useful as components of databases useful in search and sequence analysis algorithms. As used in these embodiments, the terms “nucleic acid sequence of the present invention” and “amino acid sequence of the present invention” are reduced or stored, or can be reduced or stored, in computer readable form. Means any detectable chemical or physical characteristic of a polynucleotide or polypeptide of the invention. These include, but are not limited to, chromatographic scan or peak data, photographic or scan data therefrom, and mass spectrometry data.
[0343]
The present invention provides a computer readable medium for storing the sequences of the present invention. The computer readable medium may include one or more of the following: a nucleic acid sequence comprising a sequence of a nucleic acid sequence of the invention; an amino acid sequence comprising an amino acid sequence of the invention; at least one of the sequences is a sequence of a nucleic acid sequence of the invention. A set of nucleic acid sequences comprising: a set of amino acid sequences wherein at least one of the sequences comprises a sequence of an amino acid sequence of the invention; a data set representing a nucleic acid sequence comprising the sequence of one or more nucleic acid sequences of the invention A data set representing a nucleic acid sequence encoding an amino sequence comprising one or more amino acid sequences of the present invention; a set of nucleic acid sequences wherein at least one sequence comprises the nucleic acid sequence of the present invention; A set of amino acid sequences, wherein one sequence comprises the sequence of the amino acid sequence of the invention; a data set representing a nucleic acid sequence comprising the sequence of the nucleic acid sequence of the invention; Data set representing a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence comprising the sequence of amino sequences. Computer-readable media is any object of any composition used to store information or data, including, for example, commercially available floppy disks, tapes, hard drives, compact discs, and video discs. possible.
[0344]
Accordingly, the present invention provides a diagnostic assay for identifying homologs of the human gp286 gene, wherein the assay has a nucleic acid database comprising a query sequence consisting of SEQ ID NO: 1, 13, or 14, or 300 or more nucleotides. Screening using a portion thereof, wherein a nucleic acid sequence in the database that is at least 65% identical but less than 100% identical to SEQ ID NO: 1, 13, or 14, or a portion thereof, is present. If so, it is a homolog of the human gp286 gene.
[0345]
Methods for the analysis of characteristic sequences, especially the gene sequences of the present invention, are also provided by the present invention. Preferred methods of sequence analysis include, for example, sequence homology analysis (eg, identity and similarity analysis), RNA structure analysis, sequence assembly, cladistic analysis, sequence motif analysis, open reading frame determination, nucleobases Methods of calling and sequencing chromatogram peak analysis.
[0346]
Computer-based methods are provided for performing nucleic acid homology identification. The method comprises providing a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence of the invention in a computer readable medium; and comparing the nucleic acid sequence to at least one nucleic acid or amino acid sequence to identify homology The step of performing
[0347]
A computer-based method is also provided for performing amino acid homology identification, the method comprising providing an amino acid sequence comprising the sequence of a polypeptide of the invention in a computer-readable medium; and Comparing the amino acid sequence to at least one nucleic acid or amino acid sequence to identify homology.
[0348]
A computer-based method is provided for single nucleic acid sequences, further for the construction of overlapping nucleic acid sequences, wherein the computer reads a first nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence of the invention. Providing in a possible medium; and screening for at least one overlapping region between the first nucleic acid sequence and the second nucleic acid sequence.
[0349]
(Example)
The following examples are meant to illustrate the methods and materials of the present invention. Appropriate changes and additions to the described conditions and parameters are routinely made in the field of molecular biology, and it will be apparent to those skilled in the art that they are within the spirit and scope of the present invention.
[0350]
For the examples described below, all RT-PCR and fragments were gel purified before cloning. The fragments were separated by agarose gel electrophoresis according to standard methods. DNA fragments were excised from an agarose gel and purified from the gel using QIAEX resin according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Valencia, CA). The gel-purified fragment was cloned into a plasmid vector, and the plasmid was then used to competent TOP10 E. coli. E. coli host cells were transformed. Plasmids produced by this host cell were isolated by the standard alkaline lysis miniprep procedure (Qiagen, Valencia, CA). Sequencing was performed by the standard dideoxy termination method (Applied Biosystems, Foster City, CA).
[0351]
(Example 1. Gene prediction and sequence analysis)
A gene prediction program was used to identify new genes in high-throughput genomic sequence data deposited with GenBank. High-throughput genomic sequence data from GenBank was analyzed using the following gene prediction program: GENSCAN (Burge and Karlin, 1997, J. Mol. Biol. 268: 78-94, which is incorporated herein in its entirety). And GENEMARK HMM (Lukashin and Borodovsky, 1998, Nuc. Acids Res. 26: 1107-1115, which is hereby incorporated by reference in its entirety). Well known to those skilled in the art). The entire GenBank data was downloaded to a local server, the contigs of the individual sequences were separated according to the annotation provided with the sequence input, and GENSCAN and GENEMARK were used to predict the gene. The GENSCAN and GENEMARKHMM parameters used were the default parameters included with the program (Burge and Karlin, 1997; Lukashin and Borodovsky, 1998). Those genes that gave similar results from both gene prediction programs were further analyzed. Specifically, the gene sequence was translated into a protein, and the protein was used as a query sequence in BLAST analysis of Genpept and Swissprot protein sequence databases.
[0352]
The BLAST algorithm (representing the Basic Local Alignment Search Tool) is suitable for determining sequence similarity (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410, herein. The whole is incorporated for reference)). Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The algorithm involves first identifying a high scoring sequence pair (HSP) by identifying short W characters in the query sequence, which includes the same length in the database sequence. When the alignment is performed with the letter of the character, either the threshold score T of some positive value is matched or the score T is satisfied. T is referred to as the score threshold for adjacent characters (Altschul et al., Supra). These first adjacent character hits act as seeds to start the search and find the HSPs they contain. Character hits are extended in both directions along each sequence, as long as the cumulative alignment score can be increased. Stretching of character hits in each direction is stopped if: 1) the cumulative alignment score encounters the query sequence X from the highest achieved value; 2) the cumulative alignment score is 1 If less than 0 due to accumulation of alignments of residues that give a negative score above; or 3) reach the end of either sequence. The Blast algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of this alignment. The Blast program has a character length (W) of 11 and a BLOSUM62 score matrix of 50 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919 (which is incorporated herein by Are used as references)) Alignment (B), expected value (E) of 10, M = 5, N = 4, and a comparison of both strands is used as default.
[0353]
BLAST (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787, which is incorporated herein by reference in its entirety) and Gapped BLAST have two sequences. Perform a statistical analysis for the similarity between them. One measure of similarity provided by the BLAST algorithm is the minimum total probability (P (N)), which is the probability that a match between two nucleotide sequences or two amino acid sequences would occur by chance. Provides an indicator of. For example, the lowest total probability of comparing the test nucleic acid to the GP286 nucleic acid is less than about 1, preferably less than about 0.1, more preferably less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001. , The nucleic acid is considered to be similar to the GP286 gene or cDNA.
[0354]
GP286 was identified with BAC contig 49 under GenBank accession number AC008616, which was deposited on August 3, 1999. The gene scan prediction for this gene was in the reverse direction and included the following exons: exon 1 (starting exon), 53332-53287; exon 2, 49292-48933; exon 3, 45763-45722; exon 4, 45627. -45514; exon 5 (termination exon), 45368-45334. This GENEMARK prediction was also in the reverse direction and included the following exons: exon 1 (initiating exon), 53317-53287; exon 2,49292-48933; exon 3, 45763-45722; exon 4 (termination exon). 45692-45652. It was noted that the exons 1, 2, and 3 overlap either partially or completely for the two gene predictions. Blast analysis of this clone against a publicly available EST database indicated that the EST did not match the predicted gene.
[0355]
(Example 2: Amplification of gp286)
Full length sequences were obtained by performing rapid amplification of cDNA ends (RACE) using the Marathon-Ready RACE kit (Clontech, Palo Alto). Marathon-Ready TM The cDNA is a double-stranded cDNA synthesized from human tissue mRNA and ligated to a standard set of adapters (Clontech, Palo Alto). All RACE reactions used the adapter primer AP-1, 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 '(SEQ ID NO: 11) provided with this kit. 5'RACE for GP286 used AP-1 with CR2-146, 5'-TGTTGCCCTCCAGCCTCCTCCAACTCA-3 '(SEQ ID NO: 9). The 3'RACE for GP286 used AP-1 (SEQ ID NO: 11) with CR2-148, 5'-ACCCCACACAGAACAGAAACCGGATCG-3 '(SEQ ID NO: 10). Advantaq2 DNA polymerase (Clontech, Palo Alto) was used for the amplification reaction. Except that the "touchdown" PCR (Don et al., 1991. Nuc. Acids Res. 19: 4008 (hereby incorporated by reference in its entirety)) conditions were used for thermal cycling. Marathon-Ready TM The kit was used according to the manufacturer's instructions. Thermal cycling conditions were as follows: 1 minute at 94 ° C; 15 seconds at 94 ° C, 15 seconds at 72 ° C, 15 seconds at 68 ° C; 15 seconds at 94 ° C, 15 seconds at 71 ° C. 1 cycle at 68 ° C. for 15 seconds; 1 cycle at 94 ° C. for 15 seconds, 70 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 15 seconds; 1 cycle at 94 ° C. for 15 seconds, 69 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 15 seconds. Cycle; 35 cycles of 94 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 30 seconds;
[0356]
(Example 3: Confirmation of GP286 expression by RT-PCR)
RT-PCR was used to confirm that the predicted gene was expressed and to initiate the cloning process to determine the true (rather than predicted) gene structure. Primers CR2-037 (GENESCAN exon 2 matching 49110-49130) 5′-ACATCACCAACGGCAGCCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 7), and CR2-038 (GENESCAN exon 3 matching 45730-45750) 5′-CTTGCGATCCGGTTTCTTGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) was used as an amplification primer on a template composite tissue cDNA panel (Clontech, Palo Alto) according to the manufacturer's instructions. This composite tissue provided double-stranded human cDNA as a template for PCR and included the following tissues: bone marrow, peripheral blood leukocytes, liver, lymph nodes, spleen, thymus, and tonsils. The thermal cycler conditions for RT-PCR were: 1 minute at 94 ° C; followed by 35 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 15 seconds; followed by 72 ° C. For 2 minutes. A band of about 220-250 bp containing peripheral blood leukocytes, lymph nodes, spleen, thymus and tonsils indicates that GP286 is expressed in these immune system tissues (FIG. 3). The fact that these bands were derived from spliced cDNAs rather than from RT-PCR genomic DNA contaminants was indicated by the size of the bands, and the genomic bands amplified with these two primers were observed at 220 nm. It was about 3400 bp long instead of ~ 250 bases. The thymus-derived PCR fragment was excised from the gel, cloned, and sequenced (SEQ ID NO: 3).
[0357]
Immune and non-immune tissues from another experiment were subjected to RT-PCR as described above. In this experiment, the cDNA used was from the following tissues: brain, heart, kidney, liver, lung, pancreas, placenta, skeletal muscle, lymph nodes, tonsils, and mouse T cell line II-23. Temperature control reactions and genomic DNA template control reactions were also not performed. As shown in FIG. 4, gp286 was detectable in many non-immune tissues, but gp286 was expressed much more highly in immune tissues than in non-immune tissues. It is believed that gp286 is observed in non-immune tissues due to the presence of infiltrating T cells in these tissues or organs.
[0358]
(Example 4: Identification of full-length gp286 cDNA by RACE)
The gene prediction programs GENSCAN and GENEMARK have a predictable error rate (Burge and Karlin, 1997; Lukashin and Borodovsky, 1998) and generate RT-PCR fragments produced by amplification with CR2-037 and CR2-038, Used as a seed sequence to obtain the rest of the cDNA sequence for GP286. Rapid amplification of the cDNA ends (RACE) was used to determine the rest of the cDNA sequence encoded by GP286. For the 5'RACE reaction, the primer was CR2-146 (5'-TGTTGCCCTCCAGCCTCCTCCAACTCA-3 ') (SEQ ID NO: 9) and the template was cDNA synthesized from human thymus tissue (Example 3). checking). For 3′RACE, the primer was CR2-148 (5′-ACCCCACACAGAACAGAAACCGGATCG-3 ′) (SEQ ID NO: 10) and the template was cDNA synthesized from human spleen tissue. From this 5 ′ RACE, a 450 base pair fragment was obtained. This fragment was gel purified, cloned and sequenced (SEQ ID NO: 4). The sequence of this fragment overlapped the original PCR product and extended the 5 'end of the cDNA sequence to the start codon and to the 5' untranslated region (UTR). The 3'RACE product was 550 bp long and extended through the termination codon to the 3'UTR. This fragment was gel purified, cloned and sequenced (SEQ ID NO: 5).
[0359]
To construct the full length GP286 sequence (the first PCR product), the 5'RACE and 3'RACE products were TM It was assembled in a single contiguous sequence using the ASSEMBLE program (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) in a computer package. The constructed sequence is shown in Table 4 and SEQ ID NO: 1.
[0360]
(Example 5: Confirmation of GP286 expression by Northern blot analysis)
Northern blots were purchased from Clontech (catalog number 7790-1), which contains RNA from human cell lines of various origins, which include: HL-60 (promyelocytic leukemia). HeLa (cervical adenocarcinoma); K-562 (chronic myeloid leukemia); MOLT-4 (lymphoblastic leukemia); Raji (Burkitt lymphoma); SW480 (colorectal adenocarcinoma) A549 (lung cancer) And G-361 (melanoma).
[0361]
The blot was searched for a 232 bp fragment of gp286 (SEQ ID NO: 3). This probe was prepared from 50 ng of cDNA labeled by the random priming method (Feinberg and Vogelstein, 1983, A method of labeling DNA restriction fragments to high specific activity. Hybridization was performed using ExpressHyb. TM Performed in solution (Clontech, Catalog No. 8015-1) at 68 ° C. for 1 hour, followed by washing with 2 × SSC / 0.05% SDS at room temperature and 0.1 × SSC / 50 ° C. Washed twice with 0.1% SDS.
[0362]
A band of about 1.35 bp was observed in MOLT-4, a cell line derived from T cells. None of the other cell lines tested, including the B cell line Raji, the hematopoietic cell lines HL-60 and K-562, and the epithelial cell line HeLa, did not show gp286 expression (FIG. 5). This indicates that gp286 is specifically expressed in T cells.
[0363]
(Example 6: BLSAT search for homologous sequence)
A BLAST search of the gp286 sequence against a series of ESTs provided by Incyte Genomics (Palo Alto, CA) was performed. This search identified the 1195 base pair EST assembly (or template) as template identification number 230543.1. Template identification number 230543.1 was 99% identical to the gp286 sequence over 541 base pairs.
[0364]
[Table 3]
Figure 2004501630
Since the Incyte template sequence contained base pairs with indeterminate sequence identity (indicated in lower case), we obtained a clone from Incyte Genomics for one of the component ESTs derived from this template. Was. This clone (identified by number 3942653) was then sequenced in its entirety and is shown in SEQ ID NO: 14.
[0365]
The DNA sequence of clone 3942653 (SEQ ID NO: 14) is shown in Table 4, along with the predicted amino acid sequence of the encoded protein (SEQ ID NO: 15). Comparison of this sequence with the mRNA sequence of gp286, and this sequence with the genomic sequence in contig 49 of BAC having accession number AC008616 (SEQ ID NO: 13), indicates that gp286 and gp286a are likely replacements of the same gene. Is the product of splicing. The most striking difference between the mRNAs encoded by the two splice forms is the 3 'end, which encodes the carboxy-terminal cytoplasmic portion of the protein. If gp286 had a cytoplasmic tail of about 26 amino acids, gp286a would have a cytoplasmic tail of about 113 amino acids. In addition, gp286 has three tyrosine residues in the cytoplasmic tail, a potential site of protein phosphorylation. Phosphorylation is an important mode of signal transduction, and gp286a appears to act as a receptor. For example, the extracellular portion of a protein containing an Ig domain may receive a signal from an extracellular molecule, and this signal is transmitted in T cells via the cytoplasmic domain to elicit a proliferative response.
[0366]
(Example 7: Genome library PCR screening and sub-screening)
Subcloning of the gp286 genomic locus can be accomplished by PCR, either from a genomic library or directly from genomic DNA. For example, a 2 μl human genomic library (about 10 8 (PFU / ml) (Clontech) was added to 6 ml of K802 cells (overnight culture) (Clontech) and then distributed into each 24 microtubes as 250 ml aliquots. The microtube is incubated for 15 minutes at 37 ° C. 7 ml of agarose (0.8%) is added to each tube, mixed and then LB agarose + 10 ml of MgSO 4 Poured onto plates and incubated overnight at 37 ° C. 5 ml of SM phage buffer (0.1 M NaCl, 8.1 mM MgSO 4 ・ 7H 2 O, 50 mM Tris.Cl (pH 7.5), 0.01% gelatin) is added to each plate (5 ml) and the top of the agarose is removed using a microscope slide and placed in a 50 ml centrifuge tube. did. A drop of chloroform was added and the tube was placed on a 37 ° C. shaker for 15 minutes, then centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes (Sorvall RT6000 tabletop centrifuge) and the supernatant was added to the stock tube. Stored as a solution at 4 ° C.
[0367]
The PCR was then performed in 20 ml containing: 8.8 ml H 2 O, 4 ml of 5 × RAPID-LOAD BUFFER (Origin), 2 ml of 10 × PCR BUFFER II (Perkin Elmer), 2 ml of 25 mM MgCl 2 0.12 ml of primer (1 mg / ml), comprising at least a portion of the sequence at the 5 'end of the gp286 polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or 14; 0.12 ml of primer (1 mg / ml), 0.2 ml of AMPLITAQ GOLD polymerase (Perkin Elmer) and 2 ml from each of the 24 tubes, containing at least a part of the sequence complementary to the 3 'end of Phage solution. The PCR reaction included the following: one cycle at 80 ° C. for 20 minutes, 95 ° C. for tenths of a second; 22 cycles of min; followed by 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 60 seconds. The reaction is loaded on a 2% agarose gel.
[0368]
From the tube giving the correct size PCR product, 5 μl was used to set up five 1:10 dilutions, which were combined with LB agarose + 10 ml MgSO 4 4 Placed on plate and incubated overnight. A BA85 nitrocellulose filter (Schleicher & Schuell) was placed on top of each plate for 1 hour. The filter was removed, the phage was placed on top of the Petri dish and covered with 4 ml of SM buffer for 15 minutes to elute the phage. One ml of SM buffer was removed from each plate and used to set up the PCR reaction as described above. Subdivide the most diluted plate to obtain the PCR product, mount the filter, and repeat the PCR reaction. A series of dilutions and subdivisions of the plate are continued until a single plaque giving a positive PCR band is isolated. Once a single plaque is isolated, add 10 ml of phage supernatant to 100 ml SM and 200 ml K802 per plate, setting up a total of 8 plates. The plate is incubated overnight at 37 ° C. 8 ml of SM was added to each plate and the top of the agarose was scraped off with a microscope slide and collected in a centrifuge tube.
[0369]
Add 3 drops of chloroform to the centrifuge tube. Subsequently, the tubes were vortexed, incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes (Sorvall RT6000 tabletop centrifuge) to collect the phage. Using the recovered phage, genomic phage DNA is isolated using QIAGEN LAMBDA MIDI KIT. The sequences for the primers can be derived from the sequences set forth herein.
[0370]
To subclone the coding sequence of the gp286 gene, PCR is performed in a 50 μl reaction containing: 33 μl H 2 O, 5 μl of 10 × TT buffer (140 mM ammonium sulfide, 0.1% gelatin, 0.6 M Tris-tricine pH 8.4), 5 μl of 15 mM nMgS0 4 0.3 μl of primer (1 μl / ml) containing 2 μl of 10 mM dNTP, 4 μl of genomic phage DNA (0.1 μg / ml), at least a portion of the 5 ′ most coding sequence of the gp286 polynucleotide of SEQ ID NO: 1 ), 0.3 μl of primer (1 μg / ml), 0.4 μl of HIGH FIDELITY Tag polymerase, comprising a sequence that is complementary to at least a portion of the 3 ′ most coding sequence of the gp286 polynucleotide of SEQ ID NO: 1. (Boehringer Mannheim). The PCR reaction was started with one cycle of 94 ° C for 2 minutes, followed by 15 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 60 seconds, and 68 ° C for 2 minutes.
[0371]
The PCR product is loaded on a 2% agarose gel. The expected size DNA band was excised from the gel, placed on a GENELUTE AGAROSE spin column (Supelco) and centrifuged at maximum speed for 10 minutes. The eluted DNA was precipitated with ethanol and resuspended in 12 μl for ligation. These PCR primer sequences can be derived from the sequences provided herein.
[0372]
This ligation reaction uses a solution from the TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). The reaction proceeds in a solution containing 4 μl of the PCR product and 1 μl of the pCRII-TOPO vector for 5 minutes at room temperature. The reaction was terminated by adding 1 μl of 6 × TOPO cloning stop solution. The ligation product is then placed on ice. 2 μl of the ligation reaction is used to transform ONE-SHOT TOP10 cells (Invitrogen). Briefly, the ligation reaction is mixed with the cells and placed on ice for 30 minutes. The cells are then heat shocked at 42 ° C. for 30 seconds and placed on ice for 2 minutes. Then 250 μl of SOC is added to the cells, which are incubated for 1 hour with shaking at 37 ° C. and then plated on ampicillin plates.
[0373]
A single colony from this plate is used to inoculate a 5 ml culture of LB medium. Plasmid DNA is purified from this culture using the CONCERT RAPID PLASMID MINIPREP SYSTEM (GibcoBRL), and the plasmid DNA insert is then sequenced.
[0374]
The gp286 genomic phage DNA was subjected to ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) (this was determined using advanced capillary electrophoresis technology and ABI PRISM BIGDYE Terminator Cycle Reacinging using a sequencer). The cycle-sequencing reaction contains 14 ml of H 2 O, containing 16 ml of BEGDYE Terminator mixture, 7 ml of genomic phage DNA (0.1 mg / ml) and 3 ml of primer (25 ng / ml). The reaction is performed in a Perkin-Elmer 9600 thermal cycler by: 95 ° C. for 5 minutes; followed by 99 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 60 ° C. for 4 minutes. The product is purified using a CENTTRIFLEX gel filtration cartridge, dried under reduced pressure, and then dissolved in 16 μl of Template Supplement Reagent (Template Inhibitor) (PE Applied Biosystems). The samples are heated at 95 ° C. for 5 minutes and then placed in a 310 Genetic Analyzer.
[0375]
DNA subcloned into pCRII is sequenced using ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (supra). Each cycle-sequencing reaction contains 6 ml of H 2 O, containing 8 ml of BIGDYE Terminator mixture, 5 ml of miniprep DNA (0.1 mg / ml), and 1 ml of primer (25 ng / ml) and 50 minutes at 96 ° C. for 10 seconds in a Perkin-Elmer 9600 thermal cycler. Performed by 25 cycles of 10 seconds at 60 ° C and 4 minutes at 60 ° C. The product is purified using a CENTTRIFLEX gel filtration cartridge, dried under reduced pressure, and then dissolved in 16 μl of Template Supplement Reagent. The samples are heated at 95 ° C. for 5 minutes and then placed in a 310 Genetic Analyzer.
[0376]
(Example 7: GP286 expression in tissues by hybridization analysis)
The expression of gp286 in mammals (eg, rats) can be studied by in situ hybridization histochemistry. For example, to study gp286 expression in the thymus, lymph and / or spleen, rat tissue frozen (20 μm thick) is prepared using a Reichert-Jung cryostat. In addition, a blood sample can be prepared for in situ hybridization histochemistry by preparing a blood smear containing an enriched fraction of either whole blood or lymphocytes, especially T lymphocytes. Methods for preparing blood samples for in situ hybridization are well known in the art. Individual sections are frozen fixed on silanized nuclease free slides (CEL Associates, Inc., Houston, TX) and stored at -80 ° C. Sections were treated, first after fixation, in 4% cold paraformaldehyde, rinsed in cold phosphate buffered saline (PBS), and acetylated using acetic anhydride in triethanolamine buffer. It is then dehydrated by a series of alcohol washes with 70%, 95% and 100% alcohol at room temperature. The sections are subsequently defatted in chloroform and subsequently rehydrated by continuous exposure to 100% and 95% alcohol at room temperature. Microscope slides containing the processed frozen sections are air dried prior to hybridization. Other tissues, especially those suspected of exhibiting T cell infiltration, may be assayed in a similar manner.
[0377]
A gp286-specific probe may be generated using PCR and sequence information from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14. After PCR amplification, the fragment is digested with restriction enzymes and cloned into pBluescript II cut with the same enzymes. For the generation of a probe specific for the sense strand of gp286, the cloned gp286 fragment cloned into pBluescript II can be linearized with appropriate restriction enzymes, which allows the vector T7 promoter and commercially available T7 RNA polymerase to be used. Used to provide a substrate for a labeled run-off transcript (ie, a cRNA riboprobe). A probe specific for the antisense strand of gp286 is also used to cut the recombinant plasmid with appropriate restriction enzymes and use the T3 promoter and cognate polymerase to generate a linearized substrate for the generation of labeled run-off cRNA transcripts. Can be readily prepared using gp286 in pBluescript. As described above, splice variant-specific probes can be prepared to determine the expression of gp286 compared to gp286 of different cells and tissue types.
[0378]
Riboprobes [ 35 S] -UTP, about 0.40 × 10 5 for antisense riboprobes 6 For a specific activity of cpm / pmol and a sense strand riboprobe, about 0.65 × 10 6 A specific activity of cpm / pmol may result. Subsequently, each riboprobe was denatured and hybridization buffer containing 50% formamide, 10% dextran, 0.3 M NaCl, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 × Denhardt's solution, and 10 mM dithiothreol. Add to the solution (2 pmol / ml).
[0379]
The resulting rat tissue cryosections or microscope slides containing blood smears were exposed alone to 45 μl of hybridization solution per slide and silanized over the portion exposed to hybridization solution. A cover slip may be placed. The sections are incubated at 52 ° C. overnight (eg, 15-18 hours) to allow hybridization. An equal volume of frozen sections or blood smears is then exposed to sense or antisense gp286-specific cRNA riboprobes.
[0380]
After the hybridization period, the coverslips were washed in 1 × SSC, and the slides were then washed for 45 minutes at 37 ° C. with 10 mM Tris.HCl (pH 7.4), 0.5 M EDTA and 0.5 M NaCl. RAase A treatment is performed by exposure to 20 μg / ml RNase A in the buffer solution. The sample is then subjected to three high stringency washes in 0.1 × SSC at 52 ° C. for 20 minutes each. After a series of washes, the samples are dehydrated by continuous exposure to 70%, 95% and 100% ammonium acetate in alcohol, followed by air drying and exposure to KODAK BIOMAX MR-1 film. . Thirteen days after exposure, the film is developed and any significant hybridization signals are detected.
[0381]
Based on these results, slides containing the hybridized tissue are coated with KODAK NTB-2 nuclear track emulsion as indicated by the autoradiogram of the film, and the slides are stored in the dark for 32 days. The slide is then developed and counterstained with hematoxylin. The portion coated with the emulsion is analyzed under a microscope to determine the specificity of the label. This signal is determined to be specific if the autoradiographic grains (generated by hybridization of the antisense probe) are clearly associated with cresyl violet stained cell bodies. Autoradiographic grains found between cell bodies indicate non-specific binding of the probe.
[0382]
(Example 8: Northern blot analysis of gp286-RNA)
Northern blot hybridizations can be performed to test for expression of gp286 mRNA. Clones containing at least a part of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14, or their complement may be used as probes. Vector-specific primers are used for PCR, 32 Generate a hybridization probe fragment for P labeling. The PCR is performed as follows:
(1) Mix the following reagents:
1 μl gp286-containing plasmid
2μl forward primer
2μl reverse primer
10 × PCR buffer provided by the manufacturer of 10 μl Taq polymerase (eg, Amersham Pharmacia Biotech)
1 μl 10 mM dNTP (eg, Boehringer Mannheim cat. No. 1969064)
0.5 μl Taq polymerase (eg, Amersham Pharmacia Biotech Cat No. 27-0799-62)
83.5 μl water.
[0383]
(2) Perform PCR in a thermocycler using the following program:
5 cycles at 94 ° C .; 1 cycle at 94 ° C., 1 minute at 55 ° C. and 1 minute at 72 ° C .;
[0384]
The PCR product can be purified using the QIAQUICK PCR Purification Kit (Qiagen Catalog No. 28104). The purified PCR fragment was random primed using "Ready to go DNA Labeling Beads" (Amersham pharmacia Biotech cat. No. 2-9240-01). 32 Label with P-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Cat # AA005 / 250). Hybridization is performed on human multi-tissue northern blots from Clontech according to the manufacturer's protocol. After overnight exposure on a Molecular Dynamics PHOSPHORIMAGER screen (catalog number MD146-814), a band of approximately 1.35 kb is visualized. As described above, a hybridization probe that detects both gp286 and gp286a mRNA can be used, or a variant-specific hybridization probe that specifically hybridizes to either gp286 or gp286a mRNA. obtain.
[0385]
Example 9: Recombinant expression of GP286 in eukaryotic host cells
(A. Expression of gp286 in mammalian cells)
To produce the GP286 protein, the GP286 encoding polynucleotide is expressed using recombinant techniques. For example, the GP286 coding sequence of SEQ ID NO: 2 or 15 is subcloned into the commercially available expression vector pzeoSV2 (Invitrogen). The resulting expression construct is transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cells using the transfection reagent FUGENE6 (Boehringer-Mannheim) and the transfection protocol provided in the product insert. Other eukaryotic cell lines, including human embryonic kidney (HEK 293) and COS cells, are equally suitable.
[0386]
Cells stably expressing GP286 are selected for by growth in the presence of 100 μg / ml zeocin (Stratagene, LaJolla, CA). If necessary, GP286 can be purified from the cells using standard chromatography techniques. To facilitate purification, antisera is raised against one or more synthetic peptide sequences corresponding to portions of GP286 amino acids, and GP286 is affinity purified using the antisera. The GP286 protein is also expressed in frame with a tag sequence (eg, polyhistidine, hemagglutinin or FLAG) to facilitate purification. Further, it is understood that many uses of GP286 polypeptides (eg, the assays described below) do not require purification of GP286 from host cells.
[0387]
(B. Expression of GP286 in 293 cells)
For expression of GP286 in mammalian cells 293 (transformed human or primate embryonic kidney cells), a plasmid having the relevant gp286 coding sequence is prepared using the vector pSecTag2A (Invitrogen). The vector pSecTag2A contains a mouse IgK chain leader sequence for secretion, a c-myc epitope for detecting the recombinant protein using an anti-myc antibody, a C-terminal polyhistidine for purification using nickel chelate chromatography, and a stable Zeocin resistance gene for selection of suitable transfectants. The forward primer for amplification of the gp286 cDNA was determined by standard procedures, and the forward primer was preferably consistent with the 5 'extension of nucleotides to introduce a HindIII cloning site and the gp286 sequence. Nucleotides. The reverse primer is also determined by conventional procedures, and the reverse primer is preferably a 5 'extension of a nucleotide to introduce an XhoI restriction site for cloning and a reverse complement of the gp286 sequence. Contains the corresponding nucleotide. PCR conditions are 55 ° C. as an annealing temperature. The PCR product is gel purified and cloned into the vector HindIII-XhoI. The DNA is purified using a QIAGEN chromatography column and transfected into 293 cells using DOTAP transfection media (Boehringer Mannheim). Transiently transfected cells are tested for expression 24 hours after transfection using Western blots probed with anti-His and anti-GP286 peptide antibodies.
[0388]
Permanently transfected cells are selected and expanded using Zeocin. Production of the recombinant protein is detected from both cells and medium using Western blots probed with anti-His, anti-Myc or anti-gp286 peptide antibodies.
[0389]
(C. Expression of GP286 in COS cells)
For expression of GP286 in COS7 cells, for example, a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 1 or 14, or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 15, can be cloned into vector p3-CI. This vector is a pUC18-derived plasmid that contains an HCMV (human cytomegalovirus) promoter intron located upstream from the bGH (bovine growth hormone) polyadenylation sequence and a multiple cloning site. In addition, the plasmid contains dhrf (dihydrofolate reductase) which provides for selection in the presence of methotrexate (MTX) for selection of stable transformants.
[0390]
The forward primer is determined by conventional procedures, and preferably corresponds to the 5 'extension site that introduces an XbaI restriction site for cloning, followed by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 14. Nucleotides. The reverse primer is also determined by conventional procedures, and the reverse primer is preferably a 5 'extension of the nucleotide introducing the SalI cloning site, followed by the reverse complement of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 14. Contains nucleotides corresponding to the body.
[0391]
The PCR is an initial denaturation step at 95 ° C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 30 seconds; followed by 5 minutes at 72 ° C. Extension. The PCR product is gel purified and ligated into the XbaI and SalI sites of the vector p3-CI. Using this construct, competent E. Transform E. coli cells. The E. coli was then purified using a QIAGEN chromatography column. Plasmid DNA is purified from the E. coli culture and transfected into COS7 cells using the LIPOFECTAMINE reagent from BRL according to the manufacturer's specifications. At 48 and 72 hours after transfection, the media and cells are tested for expression of the recombinant protein.
[0392]
GP286 expressed from COS cell culture can be purified by first concentrating the cell growth medium to about 10 mg protein / ml. This purification can be achieved, for example, by chromatography.
[0393]
The purified GP286 is concentrated to 0.5 mg / ml on an AMICON concentrator equipped with a YM-10 membrane and stored at -80 <0> C.
[0394]
(D. Expression of GP286 in insect cells)
For expression of GP286 in a baculovirus system, a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 1 or 14, or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 15, is amplified by PCR. The forward primer is determined by conventional procedures, and preferably comprises a 5 ′ extension that adds an NdeI cloning site, followed by nucleotides corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 14. . The reverse primer is also determined by conventional procedures, and the reverse primer is preferably a 5 'extension that introduces a KpnI cloning site, followed by reverse complementation of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 14. Contains nucleotides corresponding to the body.
[0395]
The PCR product is gel purified, digested with NdeI and KpnI, and cloned into the corresponding site of the expression vector pAcHTL-A (Pharmingen, San Diego, Calif.). This pAcHTL vector contains the strong polymorphic promoter of Autographa California nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) and a 6 × His tag upstream from the multiple cloning site. The nucleic acid sequence encoding a protein kinase site for phosphorylation and a thrombin site for excision of the recombinant protein precedes the multiple cloning site.
[0396]
Of course, many other baculovirus vectors (eg, pAC373, pVL941 and pAcIM2) can be used in place of pAcHTL-A. Other vectors suitable for the expression of the GP286 polypeptide may also be used, provided that the vector construct is constructed with appropriately arranged signals for transcription, translation and transport (eg, in-frame AUG and signal peptide). ) Is included as necessary. Such vectors are described, for example, in Luckow et al., Virology 170: 31-39 (1989).
[0397]
This virus is used in standard baculovirus expression methods (eg, Summers et al., A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Aggregation, and a method described in Texas Aggregation, Journal of Pharmaceutical Sciences. And grow and isolate. In a preferred embodiment, pAcHLT-A containing the gp286 gene is introduced into a baculovirus using the BACULOGOLD transfection kit (Pharmingen). 24 hours after infection, the infected cells 35 Individual virus isolates are analyzed for protein production by radiolabeling with S-methionine. Infected cells are harvested 48 hours after infection, and labeled proteins are visualized by SDS-PAGE. Viruses exhibiting high expression levels are isolated and used for scaled-up expression.
[0398]
For expression of a GP286 polypeptide in Sf9 cells, a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 1 can be amplified by PCR using the methods described above for baculovirus expression. The gp286 cDNA is cloned into the vector AcHLT-A (Pharmingen) for expression in Sf9 insect cells. After removing the internal NdeI site (using the same primers described above for expression in baculovirus), the insert is cloned into the NdeI and kpnI sites. DNA is purified using a QIAGEN chromatography column and expressed in SF9 cells. Preliminary Western blot experiments of unpurified plaques are tested for the presence of recombinant proteins of the expected size using GP286 specific antibodies. This result is confirmed after further purification and optimization of expression in HiG5 cells.
[0399]
(Example 10: interaction capture / two-hybrid system)
To assay for GP286 interacting proteins, an interaction capture / two-hybrid library screening method can be used. This assay was first described in Fields et al., Nature 340: 245 (1989). The protocol is described in Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY (1999) and Ausubel. F. M. Et al., Published in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 4th edition, Greene and Wiley-interscience, NY (1992). Kits are commercially available, for example, from Clontech (MATCHMAKER Two-Hybrid System 3).
[0400]
A fusion of the nucleic acid sequence encoding all or a portion of GP286 with the DNA binding domain of the yeast transcription factor GAL4 (DNA-BD) is constructed using an appropriate vector (i.e., pGBKT7). Preferably, the fusion is purified for both GP286 and GP286a. Similarly, a GAL4 active domain (ad) fusion library is constructed on a second plasmid (ie, pGADT7) derived from the cDNA of a potential GP286 binding protein. See, for example, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) for the protocol for preparing a cDNA library.
[0401]
The DNA-BD / GP286 fusion construct is confirmed by sequencing and tested for autonomous receptor gene activation and cytotoxicity, both of which allow a successful two-hybrid assay. Similar controls are performed with the AD / library fusion construct to demonstrate loss of expression and transcriptional activity in host cells. Yeast cells are transformed with both GP286 and the library fusion plasmid (about 105 transformants / mg DNA) according to standard procedures (Ausubel et al., Supra). In vivo binding of DNA-BD / GP286 to AD / library proteins results in transcription of certain yeast plasmid reporter genes (ie, lacZ, HIS3, ADE2, LEU2). Yeast cells are placed in a nutrient-deficient medium and screened for reporter gene expression. After growth in medium supplemented with Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bD-galactoside), colonies are assayed in duplicate for β-galactosidase activity (filter assay for β-galactosidase activity). Is described in Breeden et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 50: 643 (1985)). Positive AD-library plasmids are rescued from the transformants and reintroduced into the original yeast strain and other strains containing an irrelevant DNA-BD fusion protein to reconstitute the specific GP286 / library protein Check the effect. The inserted DNA is sequenced to establish the presence of an open reading frame fused to GAL4 AD and to determine the identity of the GP286 binding protein.
[0402]
(Example 11: Antibody to GP286 polypeptide)
Standard techniques are used to generate polyclonal or monoclonal antibodies to GP286 and to generate these useful antigen-binding fragments or variants thereof, including “humanized” variants and whole human antibodies. . Such protocols are described, for example, in Ausubel et al., 1992 and 1999 (supra); Harlow et al., Eds., ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1990), and D.I. A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1999). In some embodiments, a recombinant GP286 polypeptide (or a cell or cell membrane containing such a polypeptide) is used as an antigen for generating antibodies. In some embodiments, one or more peptides (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15) obtained in some embodiments and having an amino acid sequence corresponding to an immunogenic portion of GP286. , 16, 17, 18, 19, 20 or more amino acids) are used as antigens. The extracellular portion of GP286, particularly the hydrophilic extracellular portion, is preferred. The antigen may be mixed with an adjuvant or bound to a hapten to increase antibody production. In a preferred embodiment, antibodies specific for the two splice variants (GP286 and GP286a) are identified by using splice variant-specific amino acid sequences (eg, by removing portions of the intracellular domain having different amino acid sequences). By use).
[0403]
(A. polyclonal antibody or monoclonal antibody)
In one representative protocol, recombinant GP286 or a synthetic fragment thereof is used to immunize mice to produce monoclonal antibodies or, for polyclonal antibodies, immunize larger mammals (eg, rabbits). . These antibodies may be referred to as "pan-specific" antibodies, which recognize both splice variants, GP286 and GP286a, or recognize only one of these splice variants. Can be To increase antigenicity, the peptide can be conjugated to, for example, keyhole limpet hemocyanin, commercially available from Pierce. For the first injection, the antigen is emulsified with Freund's complete adjuvant and injected subcutaneously. At 2-3 week intervals, additional aliquots of GP286 antigen are emulsified with Freund's incomplete adjuvant and injected subcutaneously. Prior to the last boost injection, serum samples are taken from the immunized mice and assayed by Western blot to confirm the presence of antibodies immunoreactive with GP286. Serum from the immunized animal can be used as a polyclonal antiserum or can be used to isolate a polyclonal antibody that recognizes GP286.
[0404]
Alternatively, the mice are sacrificed and their spleens removed for production of monoclonal antibodies. To produce monoclonal antibodies, the spleen was placed in 10 ml of serum-free RPMI 1640 and 2 mM M-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 units / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin (RPMI) (Bibco A single cell suspension is formed by trituration of the spleen in serum-free RPMI 1640 supplemented with C.A., Canada. The cell suspension is filtered and washed by centrifugation and resuspended in serum-free RPMI. Thymocytes harvested from native Balb / c mice are prepared in a similar manner and used as feeder layers. NS-1 myeloma cells kept in log phase for 3 days prior to fusion in RPMI containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) were similarly centrifuged, And wash.
[0405]
To generate hybridoma fusions, spleen cells from immunized mice are combined with NS-1 cells, centrifuged, and the supernatant is aspirated. The cell pellet is removed by tapping the tube and 2 ml of 37 ° C. PEG 1500 (50% in 75 mM HEPES (pH 8.0)) is added to the pellet and vortexed, followed by the addition of serum-free RPMI I do. The cells were then centrifuged, and 15% FBS, 100 μM sodium hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine (HAT) (Gibco), 257 units / ml IL-6 (Boehringer-Mannheim) and 1.5 × 10 6 Resuspend in RPMI containing thymocytes / ml and place into 10 flat bottom 96 well tissue culture plates.
[0406]
At 2, 4 and 6 days after fusion, 100 μl of medium is removed from the wells of these tissue culture plates and replaced with fresh medium. On day 8, fusions are screened by ELISA and tested for the presence of mouse IgG binding to GP286. The cells in the selected wells are further cloned by dilution until a monoclonal culture producing anti-GP286 antibody is obtained.
[0407]
(B. Humanization of anti-GP286 monoclonal antibody)
The expression pattern of GP286 reported herein, and the potential of GP286 as a target for therapeutic intervention, suggests a therapeutic index for GP286 inhibitors (antagonists). GP286 neutralizing antibodies comprise one class of therapeutic agents useful as GP286 antagonists. The following is a protocol for improving the utility of anti-GP286 monoclonal antibodies as therapeutic agents in humans by "humanizing" the anti-GP286 monoclonal antibodies. Humanized and fully human antibodies have improved serum half-life and are less immunogenic in humans. The principles of humanization of antibodies have been described in the literature. For example, to minimize potential binding to complement, humanized and fully human antibodies should be IgG 4 It is preferably of the subtype.
[0408]
One level of humanization can be achieved by creating a chimeric antibody comprising the variable domains of the non-human antibody of interest and the constant domains of a human antibody. See, eg, Morrison et al., Adv. Immunol. , 44: 65-92 (1989). The variable domains of the anti-GP286 antibody can be cloned from the genomic DNA of a suitable B cell hybridoma or from the cDNA derived from this hybridoma. The V region gene fragment is linked to an exon that encodes a human antibody constant domain. The resulting construct is expressed in a suitable mammalian host cell (eg, a myeloma or CHO cell).
[0409]
To achieve even higher levels of humanization, only the portion of the gene fragment of the variable region encoding the antigen binding complementarity determining region (CDR) of the non-human monoclonal antibody is cloned into the human antibody sequence. For example, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1543-36 (1988); and Tempest et al., Bio / Technology 9: 266-71 (1991). If necessary, the β-sheet framework of the human antibody surrounding the CDR3 region may also be modified (ie, “backmutation”) to more closely reflect the three-dimensional structure of the antigen binding site of the original monoclonal antibody. )). Kettleborough et al., Protein Engin. 4: 773-783 (1991); and Foote et al. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992).
[0410]
In an alternative approach, the surface of the non-human monoclonal antibody of interest alters selected surface residues of the non-human antibody, for example, by site-directed mutagenesis, while retaining the internal residues and contact residues of the non-human antibody. Humanization is achieved by maintaining all of the groups. Padlan, Mol. Immunol. , 28 (4/5): 489-98 (1991).
[0411]
The above approach is utilized using anti-GP286 monoclonal antibodies and hybridomas producing these antibodies. The humanized anti-GP286 antibodies are useful as therapeutic agents for treating or reducing conditions in which GP286 signaling mediated by GP286 expression or ligand is not desired.
[0412]
(C. Human GP286 neutralizing antibody derived from phage display)
Anti-GP286 antibodies are also described by Aujame et al., Human Antibodies 8 (4): 155-168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH 15: 62-70 (1997); and Rader et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 503-508 (1997), such as those described in phage display technology. For example, the antibody variable region, in the form of a Fab fragment or a linked short Fv fragment, is fused to the amino terminus of the filamentous phage minor coat protein pill. Expression of the fusion protein and incorporation of the fusion protein into the mature phage coat results in a phage particle displaying the antibody on its surface and containing the genetic material encoding the antibody. Phage libraries containing such constructs are expressed in bacteria, and the libraries are screened for GP286-specific phage antibodies using labeled GP286 or immobilized GP286 as an antigen probe.
[0413]
(D. Human GP286-specific antibody derived from transgenic mouse)
Human GP286-specific antibodies are described essentially in Bruiggemann et al., Immunol. Today 17 (8): 391-97 (1996) and Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997). Transgenic mice carrying the human V gene segment in a germline configuration and expressing these transgenes in their lymphoid tissues are immunized with the GP286 composition using conventional immunization protocols. Using the B cells from the immunized mouse, hybridomas are generated and screened using conventional protocols to identify those that secrete anti-GP286 human antibodies (eg, as described above). .
[0414]
Example 12: Assay to identify modulators of GP286 activity
Some non-limiting assays for identifying modulators (agonists and antagonists) of GP286 activity are described below. Although these assays can be performed on only one of the splice variants of GP286, in a preferred embodiment, these assays are performed in parallel on both splice variants of GP286 (GP286 and GP286a). Will be implemented. Among the modulators that can be identified by these assays, are natural ligands for receptors; synthetic analogs and derivatives of natural ligands; antibodies and / or antibody-like compounds from natural antibodies or antibody-like combinatorial libraries; and / or libraries And synthetic compounds identified by high-throughput screening.
[0415]
Any modulator that binds GP286 is useful for identifying GP286 in a tissue sample (eg, for diagnostic or therapeutic purposes). Agonist modulators and antagonist modulators are useful for treating GP286-mediated diseases, up-regulating and down-regulating GP286 activity, respectively. These assays can be performed using a single putative modulator and / or using a known agonist in combination with a candidate antagonist (or vice versa).
[0416]
(A. cAMP assay)
In one type of assay, levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) are measured in gp286 transfected cells exposed to a candidate modulator compound. Protocols for cAMP assays are described in the literature. See, for example, Sutherland et al., Circulation 37: 279 (1968); Frandsen et al., Life Sciences 18: 529-541 (1976); of Pharmacol. Exp. Therap. 283 (2): 735-41 (1997); and George et al. of Biomol. Screening 2 (4): 235-40 (1997). An exemplary protocol for such an assay using the NEN Life Science Products adenyl cyclase-activated FLASHHPRATE assay is described below.
[0417]
Briefly, the GP286 coding sequence is subcloned into an expression vector such as pzeoSV2 (Invitrogen). CHO cells are transiently transfected with the resulting expression construct using known methods (eg, the transfection protocol provided by Boehringer-Mannheim when supplying the FUGENE6 transfection reagent). The transfected CHO cells are seeded in a 96-well microplate of the FLASHPLATE assay kit, which is coated with a solid scintillator conjugated with an antiserum against cAMP. As a control, seed some wells with untransfected CHO cells. Other wells in this plate are given various amounts of cAMP standard solution for use in generating a standard curve. One or more test compounds are added to the cells in each well and medium or buffer without compound is used as a control. After treatment, cAMP is allowed to accumulate in the cells at room temperature for just 15 minutes. This assay is called [ 125 Terminate by the addition of lysis buffer containing I] -cAMP, and plate is counted using a Packard TOPCOUNT 96-well microplate scintillation counter. Unlabeled cAMP from lysed cells or standards and a fixed amount of [ 125 I] -cAMP competes for antibodies bound to this plate. A standard curve is constructed and cAMP values for unknowns are obtained by interpolation. A change in the intracellular cAMP level of the cell in response to exposure to the test compound is indicative of a GP286 modulating activity. A modulator that acts as an agonist of a receptor that binds to the Gs subtype of the G protein stimulates cAMP production, leading to a significant (eg, 3- to 10-fold) increase in cAMP levels. Agonists of receptors that bind to the Gi / o subtype of G proteins inhibit forskolin-stimulated cAMP production, leading to a marked decrease in cAMP levels (eg, 50-100%). Modulators that act as inverse agonists reverse these effects at receptors that are either constitutively active or activated by known agonists.
[0418]
(B. Aequorin assay)
In another assay, cells (eg, CHO cells) are transiently co-transfected with a pg286 expression construct and a construct encoding the photoprotein apoaquorin. In the presence of the cofactor serentrazine, apoaquorin produces a measurable luminescence, which is proportional to the amount of free calcium in the cytoplasm. See, generally, Cobbold et al., "Aequorin measurements of cytoplasmic free calcium": McCormac J. et al. G. FIG. And Cobbold P. et al. H. Ed., CELLULLAR CALCIUM: A PRACTICAL APPROACH. Oxford: IRL Press (1991); Stables et al., Anal. Biochem. 252: 115-26 (1997); and Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, 6th edition, Eugene OR (1996).
[0419]
In one exemplary assay, the gp286 coding sequence is subcloned into pzeoSV2 (Invitrogen). CHO cells were transiently transfected with the resulting expression construct and the construct encoding the photoprotein apoaquorin (Molecular Probes) using the transfection reagent FUGENE6 (Boehringer-Mannheim) and the transfection protocol provided with the product insert. Co-transfect.
[0420]
The cells are cultured for 24 hours at 37 ° C. in MEM (Gibco / BRL, Gaithersburg, Md.) Supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 10 U / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin. The culture medium is then replaced with serum-free MEM containing 5 μM coelentrazine (Molecular Probes). The culture is continued at 37 ° C. for a further 2 hours. Subsequently, the cells were detached from the plate using VERSEN (Gibco / BRL), washed and 2x10 in serum-free MEM. 5 Resuspend in cells / ml.
[0421]
Dilutions of the candidate GP286 modulator compound are prepared in serum-free MEM and dispensed at 50 μL / well into the wells of an opaque 96-well assay plate. The plate is then placed on an MLX microtiter plate luminometer (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA). The device is programmed to dispense 50 μl of the cell suspension, one well at a time, into each well and immediately read the luminescence for 15 seconds. A dose-response curve for the candidate modulator is constructed using the area under the curve for each light signal peak. The data is analyzed using SLIDEWRITE, using the formula for the one-site ligand, and EC50 values are obtained. The change in luminescence caused by these compounds is taken as an indicator of regulatory activity. At receptors that bind to the Gq subtype of G proteins, modulators acting as agonists give up to 100-fold increase in luminescence. Modulators that act as inverse agonists reverse this effect at receptors that are either constitutively active or activated by known agonists.
[0422]
(C. Luciferase reporter gene assay)
Photoprotein luciferase provides another useful tool for identifying GP286 modulators. A cell (eg, a CHO or COS7 cell) is transformed into a gp286 expression construct and a reporter construct comprising a gene for a luciferase protein downstream of a transcription factor binding site (eg, a cAMP response element (CRE), AP-1, or NF-κB). Then, transfect temporarily. Luciferase expression levels reflect the activation state of the signaling event. See, generally, George et al. Biomol. Screening 2 (4): 235-240 (1997); and Stratowa et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6: 574-581 (1995). Luciferase activity can be measured quantitatively, for example, using a luciferase assay reagent available from Promega (Madison, WI).
[0423]
In one exemplary assay, CHO cells were plated in 24-well culture plates 10 days prior to transfection. 5 Plate at a density of cells / well and culture at 37 ° C. in MEM (Gibco / BRL) supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 10 U / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin. Cells are transiently co-transfected with a reporter construct containing the gp286 expression construct and the luciferase gene. The reporter plasmid constructs CRE-luciferase, AP-1-luciferase and NF-κB luciferase can be purchased from Stratagene (LaJolla, Calif.). Transfections are performed using the FUGENE6 transfection reagent (Boehringer-Mannheim) according to the supplier's instructions. Cells transfected with the reporter construct alone are used as controls.
[0424]
Twenty-four hours after transfection, the cells are washed once with PBS preheated to 37 ° C. Serum-free MEM is then added to these cells, either alone (control) or with one or more candidate modulators. The cells are then incubated at 37 ° C. for 5 hours. The cells are then washed once with ice-cold PBS and lysed by adding 100 μl of lysis buffer per well of a luciferase assay kit supplied by Promega. After incubation for 15 minutes at room temperature, 15 μl of lysate was mixed with 50 μl of substrate solution (Promega) in an opaque white 96-well plate, and luminescence was measured using a Wallace model 1450 MICROBETA scintillation and luminescence counter (Wallace Instruments, Gaithersburg, Ga.). Read immediately with MD).
[0425]
The difference in luminescence in the presence versus absence of the candidate modulator compound is indicative of a modulatory activity. Receptors, either constitutively active or activated by agonists, typically provide a 3- to 20-fold stimulation of luminescence compared to cells transfected with the reporter gene alone. . Modulators acting as inverse agonists reverse this effect.
[0426]
(D. Measurement of intracellular calcium using FLIPR)
Changes in intracellular calcium levels are another recognized indicator of receptor activity, and such assays can be used to screen for modulators of GP286 activity. For example, CHO cells stably transfected with the gp286 expression vector 4 Plate at a cell / well density in Packard black wall 96-well plates, which are specially designed to distinguish fluorescent signals emanating from various wells on this plate. These cells were grown at 36 mg / L pyruvate and 1 g / L glucose, containing 1% fetal calf serum and four calcium indicator dyes (FLUO-3 AM, FLUO-4 AM, CALCIUM GREEN-1 AM, or OREGON GREEN 488). BAPTA-1 AM) is incubated for 60 minutes at 37 ° C. in modified Dulbecco's PBS (D-PBD), added at a concentration of 4 μM each. Plates are washed once with modified D-PBS without 1% fetal calf serum and incubated at 37 ° C. for 10 minutes to remove residual dye from cell membranes. In addition, a series of washes with modified D-PBS without 1% fetal calf serum are performed, followed immediately by activation of the calcium response.
[0427]
The calcium response is initiated by adding one or more candidate receptor agonist compounds (calcium ionophore A23187 (10 μM; positive control), or ATP (4 μM; positive control)). Fluorescence is measured by a Molecular Device FLIPR equipped with an argon laser (excitation at 488 nm). See, for example, Kuntzweiler et al., Drug Dev. Res. 44 (1): 14-20 (1998). The F-stop for the detector camera is set to 2.5, and the length of the exposure is 0.4 ms. The reference fluorescence of the cells is measured for 20 seconds, after which the candidate agonist ATP or A23187 is added. The level of the reference fluorescence is subtracted from the response signal. The calcium signal is measured for about 200 seconds while reading every 2 seconds. Calcium ionophores A23187 and ATP typically increase calcium signals about 200% above baseline levels. In general, activated GP286 increases the calcium signal by at least about 10-15% above the baseline signal.
[0428]
(E. Mitosis induction assay)
In a mitogenesis assay, the ability of a candidate modulator to induce or inhibit gp286-mediated cell division is determined. See, eg, Lajiness et al. Pharmacol. and Exp. Therap. 267 (3): 1573-1581 (1993). For example, CHO cells stably expressing GP286 are seeded at a density of 5000 cells / well in 96-well plates and grown for 48 hours at 37 ° C. in MEM containing 10% fetal calf serum, at which point The cells are rinsed twice with serum-free MEM. After rinsing, 80 μl of fresh MEM or MEM containing known mitogens are added along with 20 μl of MEM containing various concentrations of one or more test compounds diluted in serum-free medium. As controls, some wells on each plate receive serum-free medium alone, and some receive medium containing 10% fetal calf serum. Non-transfected cells or cells transfected with the vector alone can also serve as controls.
[0429]
After 16-18 hours of culture, 1 μCi of [ 3 [H] -thymidine (2 Ci / mmol) is added to these wells and the cells are incubated at 37 ° C for an additional 2 hours. The cells are trypsinized and collected on a filter mat using a cell harvester (Tomtec); the filters are then counted on a Betaplate counter. Serum-free test wells 3 H] -thymidine incorporation is compared to the results achieved in cells stimulated with serum (positive control). The use of multiple concentrations of the test compound allows for the generation and analysis of a dose response curve using the non-linear, least squares fit equation A = B × [C / (D + C)] + G. In this formula, A is the percent of serum stimulation; B is the maximum effect minus baseline; C is the EC50; D is the concentration of the compound; and G is The biggest effect. The parameters B, C and G are determined by a simple optimization.
[0430]
An agonist that binds to the receptor will bind [ 3 It is expected to increase uptake of [H] -thymidine and show up to 80% response to serum. Antagonists that bind to the receptor inhibit stimuli seen with known agonists by up to 100%.
[0431]
(F. [ 35 S] GTPgS binding assay)
It is possible to assess whether GP286 signals through a G-protein mediated pathway. G protein-coupled receptors signal through intracellular G proteins, the activities of which include binding of GTP and hydrolysis to give bound GDP. Thus, it is a non-hydrolysable GTP analog in the presence and absence of candidate modulators [ 35 Measuring the binding of [S] GTPgS provides another assay for modulator activity. See, for example, Kowal et al., Neuropharmacology 37: 179-187 (1998).
[0432]
In one exemplary assay, cells stably transfected with the gp286 expression vector are grown to subconfluence in a 10 cm tissue culture dish and 2+ / Mg 2+ Rinse once with 5 ml of ice-cold phosphate-buffered saline containing no and scraped into 5 ml of the same buffer. The cells are pelleted by centrifugation (500 × g, 5 minutes), resuspended in TEE buffer (25 mM Tris (pH 7.5), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA) and frozen in liquid nitrogen. After thawing, the cells are homogenized using a Dounce homogenizer (1 ml TEE per plate of cells) and centrifuged at 1,000 xg for 5 minutes to remove nuclei and unbroken cells.
[0433]
The homogenate supernatant was centrifuged at 20,000 xg for 20 minutes to isolate the membrane fraction, and the membrane pellet was washed once with TEE and the binding buffer (20 mM HEPES, pH 7.5) , 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA). The resuspended membrane can be frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C until use.
[0434]
Aliquots of cell membranes prepared as described above and stored at -70 C were thawed, homogenized, and contained 20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 120 mM NaCl, 10 [mu] M GDP, and 0.2 mM ascorbic acid. Dilute in buffer at a concentration of 10-50 μg / ml. In a final volume of 90 μl, the homogenate is incubated with various concentrations of the candidate modulator compound or 100 μM GTP at 30 ° C. for 30 minutes and then placed on ice. Each sample contains 10 μl guanosine 5′-O- (3 [ 35 [S] thio) triphosphate (NEN, 1200 Ci / mmol; [ 35 S] -GTPgS) was added to a final concentration of 100-200 pM. The sample is incubated at 30 ° C. for a further 30 minutes, 1 ml of 10 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl 2 (4 ° C.) is added and the reaction is stopped by filtration.
[0435]
The sample was filtered through a Whatman GF / B filter, and the filter was washed with 20 ml ice-cold 10 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl 2 Wash with. Filters are counted by liquid scintillation spectroscopy. [ 35 Non-specific binding of [S] -GTPgS is measured in the presence of 100 μM GTP and subtracted from the total. In cells 35 Compounds that modulate the amount of [S] -GTPgS binding are selected and compared to untransfected control cells. Activation of the receptor by an agonist is [ 35 Provides up to a 5-fold increase in [S] -GTPgS binding. This response is blocked by the antagonist.
[0436]
(G. MAP kinase activity assay)
Assessing MAP kinase activity in cells that express GP286 provides another assay for identifying modulators of GP286 activity. See, eg, Lajiness et al. Pharmacol. Exp. Therap. 267 (3): 1573-1581 (1993) and Boulton et al., Cell 65: 663-675 (1991). In some embodiments, CHO cells stably transfected with gp286 are transferred to a 6-well plate 7 × 10 4 48 hours prior to the assay. 4 Seed at a density of cells / well. During these 48 hours, the cells are cultured at 37 ° C. in MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 10 U / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin. The cells are serum starved for 1-2 hours, after which the stimulator is added.
[0437]
For the assay, the cells were treated with medium alone or medium containing either the candidate agonist or 200 nM Phorbol ester-myristoyl acetate (ie, PMA, positive control), and the cells were incubated at 37 ° C. For various times. To stop the reaction, place the plates on ice, aspirate the medium, and rinse the cells with 1 ml ice-cold PBS containing 1 mM EDTA. Then, 200 μl of cell lysis buffer (12.5 mM MOPS (pH 7.3), 12.5 mM glycerophosphate, 7.5 mM MgCl 2) 2 , 0.5 mM EGTA, 0.5 mM sodium vanadate, 1 mM benzamidine, 1 mM dithiothreitol, 10 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml aprotinin, 2 μg / ml pepstatin A, and 1 μM okadaic acid) are added to these cells. . The cells are scraped from the plate and homogenized by passing through a 233 / 4G needle 10 times, and the cytosolic fraction is prepared by centrifugation at 20,000 xg for 15 minutes.
[0438]
Aliquots of cytosol (5-10 μl containing 1-5 μg protein) were combined with 1 mM MAPK substrate peptide (APRTPGGRR (SEQ ID NO: 9), Upstate Biotechnology, Inc., NY) and 50 μM [g- 32 P] ATP (NEN, 3000 Ci / mmol) and dilute to a final volume of about 2000 cpm / pmol to a total volume of 25 μl. The samples were incubated at 30 ° C. for 5 minutes and the reaction was 2 Stop by spotting 20 μl on a square Whatman P81 phosphocellulose paper. These square filters are 1% H 3 PO 4 Are washed four times, and the squares are subjected to liquid scintillation spectroscopy to quantify the bound label. Equivalent cytoplasmic extracts are incubated without the MAPK substrate peptide and the bound label from these samples is subtracted from matching samples using the substrate peptide. The cytoplasmic extract from each well is used as a separation point. Protein concentration is determined by a dye binding protein assay (Bio-Rad Laboratories). Agonist activation of this receptor is expected to result in a 5-fold increase in MAPK enzyme activity. This increase is blocked by the antagonist.
[0439]
(H. [ 3 H] Arachidonic acid release)
Activation of GP286 can also enhance the release of arachidonic acid in cells, which also provides yet another useful assay for modulators of GP286 activity. See, for example, Kanterman et al., Molecular Pharmacology 39: 364-369 (1991). For example, CHO cells stably transfected with the GP286 expression vector are transformed into 1.5 x 10 4 Plate in 24 wells at a density of cells / well and grow in MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 10 U / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin for 48 hours at 37 ° C. before use. Replace cells in each well with [ 3 H] Arachidonic acid (Amersham Corp., 210 Ci / mmol) at 0.5 μCi / ml for 2 hours in 1 ml MEM supplemented with 10 mM HEPES, pH 7.5, and fetal bovine serum albumin without 0.5% fatty acid Label by incubating at 37 ° C. The cells are then washed twice with 1 ml of the same buffer. Candidate compounds are added to 1 ml of the same buffer, either alone or with 10 μM ATP, and the cells are incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Buffer alone and mock transfected cells are used as controls. Samples (0.5 ml) from each well are counted by liquid scintillation spectroscopy. Agonists that activate the receptor are [ 3 H] induces enhanced ATP-stimulated release of arachidonic acid. This enhancement is blocked by the antagonist.
[0440]
(I. Extracellular acidification rate)
In yet another assay, the effect of a candidate modulator of GP286 activity is assayed by monitoring the extracellular changes in pH induced by the test compound. See, for example, Dunlop et al. Pharmacol. Toxicol. Meth. 40 (1): 47-55 (1998). In some embodiments, CHO cells transfected with the GP286 expression vector are placed in a 12 mm capsule cup (Molecular Devices Corp.) at 4 × 10 5. 5 Seed cells / cup in MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 U / ml penicillin and 10 μg / ml streptomycin. The cells are grown in this medium with 5% CO2. 2 Incubate at 37 ° C. for 24 hours.
[0441]
The rate of extracellular acidification is measured using a CYTOSENSOR MICROPHYSIOMETER (Molecular Devices Corp.). The capsule cup was attached to the sensor chamber of MICROPHYSIOMETER and the chamber was filled with running buffer (MEM without bicarbonate, supplemented with 4 mM L-glutamine, 10 units / ml penicillin, 10 μg / ml streptomycin, 26 mM NaCl). Perfuse at a flow rate of 100 μl / min. The candidate agonist or other agent is diluted in running buffer and perfused through a second flow path. During each 60 second pump cycle, the pump is turned on for 38 seconds and turned off for the remaining 22 seconds. The pH of the running buffer in the sensor chamber is recorded from 43-58 seconds during the cycle, and the pump is restarted at 60 seconds to start the next cycle. The acidification rate of the running buffer during the recording time is calculated by the Cytosoft program. The change in the rate of acidification is determined by subtracting the basal value (the average of the four rate measurements immediately prior to the addition of the candidate modifier) from the earliest rate measurement obtained after addition of the candidate modifier. Is calculated. The selected instrument detects 61 mV / pH units. Modifiers that act as agonists of the receptor result in an increase in the rate of extracellular acidification as compared to the rate in the absence of the agonist. This response is blocked by modifiers that act as antagonists of the receptor.
[0442]
All patents, patent publications, and other publications mentioned herein are each incorporated by reference in their entirety, individually and specifically as if incorporated by reference herein. Are incorporated herein by reference. Although preferred exemplary embodiments of the invention are described, those skilled in the art will appreciate that the invention may be practiced with embodiments other than those described, which are for purposes of illustration only and not of limitation. It is understood that there is no. The invention is limited only by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
1A-1B are nucleotide and deduced amino acid sequences of GP286. The extracellular portion of the immunoglobulin (Ig) domain is underlined and the transmembrane domain is boxed. The cDNA is 973 bases long. See SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
FIGS. 2A-2B are the nucleotide and deduced amino acid sequences of GP286a. The extracellular portion of the immunoglobulin (Ig) domain is underlined and the transmembrane domain is boxed. Exon-intron boundaries are indicated by backslashes (/). The cDNA is 1065 bases long. See SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15.
FIG. 3 is the expression of GP286 in human immune system tissues as determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). RT-PCR was performed as described in the following letters: BM = bone marrow lane, PBL = peripheral blood lymphocyte lane, Li = liver lane, LN = lymph node lane, Sp = spleen lane. , Thy = thymus lane,-= control lane without template, Genomic = genomic DNA control lane.
FIG. 4 is the expression of GP286 RNA in human tissues as determined by RT-PCR. B = brain lane, H = heart lane, K = kidney lane, Li = liver lane, Lg = lung lane, Pan = pancreas lane, Pl = placenta lane, SkM = skeletal muscle lane, NTC = Control lane without template, LN = Lymph node lane, II23 = Mouse T cell line II-23 lane, G = Genomic DNA control lane.
FIG. 5. Expression of GP286 RNA in human cell lines by Northern blot. Lane 1: G-361 (melanoma); Lane 2: A549 (lung cancer); Lane 3: SW480 (colorectal adenocarcinoma); Lane 4: Raji (Burkit's lymphoma); Lane 5: MOLT-4 (lymphoblast) Lane 6: K-562 (chronic bone marrow leukemia); Lane 7: HeLa (cervical adenocarcinoma); and Lane 8: HL-60 (promyelocytic leukemia).
6A-6H are the nucleotide sequences of gp286 in the human genome, with the exons of gp286 underlined. Methionine codons are double-lined and stop codons are bold. See SEQ ID NO: 13.
7A-7H are nucleotide sequences of the human genome gp286, with exons of gp286a highlighted and underlined. The starting methionine codon is double-lined and the stop codon is bold. See SEQ ID NO: 13.
FIG. 8 is the homology between GP286 (SEQ ID NO: 2, upper sequence) and mouse T cell receptor β chain (SEQ ID NO: 6, lower sequence). Vertical lines indicate identity and dotted lines indicate gaps.

Claims (53)

単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号１、およびその対立遺伝子改変体；
（ｂ）少なくとも１７ヌクレオチドからなる、（ａ）のフラグメント；
（ｃ）配列番号２をコードするヌクレオチド配列、その対立遺伝子改変体または少なくとも６アミノ酸残基から構成されるいずれかのフラグメント；
（ｄ）配列番号１に少なくとも６５％同一である、ヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２に少なくとも８０％相同であるタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｆ）高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかに相補的である配列；
（ｈ）配列番号１４、およびその対立遺伝子改変体；
（ｉ）少なくとも１７ヌクレオチドからなる、（ｈ）のフラグメント；
（ｊ）配列番号１５をコードするヌクレオチド配列、その対立遺伝子改変体または少なくとも６アミノ酸残基から構成されるいずれかのフラグメント；
（ｋ）配列番号１４に少なくとも６５％同一である、ヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号１５に少なくとも８０％相同であるタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｍ）高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１４にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｎ）（ｈ）〜（ｍ）のいずれかに相補的である配列を含む、ポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide, wherein said polynucleotide is a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
(A) SEQ ID NO: 1, and allelic variants thereof;
(B) the fragment of (a), consisting of at least 17 nucleotides;
(C) a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 2, an allelic variant thereof, or any fragment composed of at least 6 amino acid residues;
(D) a nucleotide sequence that is at least 65% identical to SEQ ID NO: 1;
(E) a nucleotide sequence that encodes a protein that is at least 80% homologous to SEQ ID NO: 2;
(F) a nucleotide sequence that hybridizes under high stringency conditions to SEQ ID NO: 1; and (g) a sequence that is complementary to any of (a)-(f);
(H) SEQ ID NO: 14, and allelic variants thereof;
(I) a fragment of (h) consisting of at least 17 nucleotides;
(J) a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 15, an allelic variant thereof or any fragment composed of at least 6 amino acid residues;
(K) a nucleotide sequence that is at least 65% identical to SEQ ID NO: 14;
(L) a nucleotide sequence that encodes a protein that is at least 80% homologous to SEQ ID NO: 15;
(M) a nucleotide sequence that hybridizes to SEQ ID NO: 14 under highly stringent conditions; and (n) a polynucleotide comprising a sequence that is complementary to any of (h)-(m). 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１もしくは配列番号１４から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１もしくは配列番号１４の対立遺伝子改変体を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。2. The polynucleotide of claim 1, wherein the polynucleotide comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, or an allelic variant of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号３、４、５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号３、４、５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２のいずれか１つの対立遺伝子改変体から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, or 32, or SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 16, 18 The polynucleotide of claim 1, comprising a nucleotide sequence selected from allelic variants of any one of, 20, 22, 24, 26, 28, 30, or 32. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号１５から選択されるアミノ酸、または配列番号２または配列番号１５の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 1, wherein the polynucleotide comprises a nucleotide sequence encoding an amino acid selected from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, or an allelic variant of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１もしくは３３から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１もしくは３３の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide is an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 or 33, or SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 or 2. The polynucleotide of claim 1, comprising a nucleotide sequence encoding a 33 allelic variant. （ａ）〜（ｍ）のいずれか１つに作動可能に連結された転写調節配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 1, further comprising a transcriptional regulatory sequence operably linked to any one of (a) to (m). 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。2. The polynucleotide of claim 1, further comprising a nucleotide sequence encoding a heterologous polypeptide. 請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）配列番号１、３、もしくは１４、または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチドからなる、配列番号１、３、もしくは１４のいずれか１つのフラグメント、
のいずれか１つに相補的であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。The polynucleotide according to claim 1, wherein
(I) SEQ ID NO: 1, 3, or 14, or (ii) a fragment of any one of SEQ ID NO: 1, 3, or 14 consisting of at least 17 nucleotides;
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that is complementary to any one of the above. 請求項１のポリヌクレオチドを含む、ベクター。A vector comprising the polynucleotide of claim 1. プラスミドベクターである、請求項９に記載のベクター。The vector according to claim 9, which is a plasmid vector. ウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。The vector according to claim 9, which is a viral vector. バキュロウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。The vector according to claim 11, which is a baculovirus vector. 前記ベクターが、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。12. The vector according to claim 11, wherein said vector is selected from the group consisting of adenovirus, parvovirus, herpes virus, poxvirus, adeno-associated virus, Semliki @ Forest virus, vaccinia virus, lentivirus, and retrovirus. 請求項１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。A host cell comprising the polynucleotide of claim 1. 前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。15. The host cell according to claim 14, wherein said host cell is selected from the group consisting of a bacterial cell, an insect cell, a yeast cell, a plant cell and a mammalian cell. 前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。15. The host cell according to claim 14, wherein said host cell is a human cell. 請求項１のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。An isolated polypeptide encoded by the polynucleotide of claim 1. 請求項１７に記載のポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号１５、または配列番号２もしくは配列番号１５の対立遺伝子改変体、あるいは
（ｉｉ）少なくとも６アミノ酸残基から構成される（ｉ）のフラグメント
を含む、ポリペプチド。The polypeptide according to claim 17, wherein
A polypeptide comprising (i) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, or an allelic variant of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15, or (ii) a fragment of (i) consisting of at least 6 amino acid residues. 配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１もしくは３３、または配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１もしくは３３の対立遺伝子改変体を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。Claims comprising SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 or 33, or an allelic variant of SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 or 33. The polypeptide of claim 17. 異種配列をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。20. The polypeptide of any one of claims 17 to 19, further comprising a heterologous sequence. 請求項１のポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。A composition comprising the polynucleotide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。A composition comprising the polypeptide of any one of claims 17 to 19 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド上のエピトープに結合する、抗体。An antibody that binds to an epitope on the polypeptide according to any one of claims 17 to 19. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体。24. The antibody according to claim 23, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 前記抗体が、ヒト化抗体または完全にヒト抗体である、請求項２４に記載の抗体。25. The antibody of claim 24, wherein said antibody is a humanized or fully human antibody. 前記抗体が、ｇｐ２８６スプライス改変体に特異的である、請求項２３に記載の抗体。24. The antibody of claim 23, wherein said antibody is specific for a gp286 splice variant. 前記抗体が、ｇｐ２８６ａスプライス改変体に特異的である、請求項２３に記載の抗体。24. The antibody of claim 23, wherein said antibody is specific for a gp286a splice variant. 請求項２３〜２７のいずれか１つの抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。28. A composition comprising the antibody of any one of claims 23-27 and a pharmaceutically acceptable carrier. ポリペプチドを産生する方法であって、該方法が、請求項１４に記載の宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で培地中で培養する工程および該細胞からまたは該培養培地から該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。A method for producing a polypeptide, comprising: culturing a host cell according to claim 14 in a medium under conditions in which said polynucleotide is expressed, and from said cell or from said culture medium. Recovering the polypeptide. サンプル中のｇｐ２８６コード配列の存在を決定する方法であって、該方法が、以下の工程：
該サンプルを、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１の単離されたポリヌクレオチドと接触させる工程、および
該単離されたポリヌクレオチドの、該サンプルにおけるポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、該ハイブリダイゼーションの存在が、該サンプル中のｇｐ２８６コード配列の存在を示す工程
を包含する、方法。A method for determining the presence of a gp286 coding sequence in a sample, comprising the steps of:
Contacting the sample with the isolated polynucleotide of claim 1 under highly stringent hybridization conditions, and detecting hybridization of the isolated polynucleotide to a polynucleotide in the sample. Wherein the presence of said hybridization indicates the presence of a gp286 coding sequence in said sample. 前記ポリヌクレオチドが、ｇｐ２８６スプライス改変体に特異的である、請求項３０に記載の方法。31. The method of claim 30, wherein said polynucleotide is specific for a gp286 splice variant. 前記ポリヌクレオチドが、ｇｐ２８６ａスプライス改変体に特異的である、請求項３０に記載の方法。31. The method of claim 30, wherein said polynucleotide is specific for a gp286a splice variant. サンプル中のＧＰ２８６タンパク質の存在を決定する方法であって、該方法が以下の工程：
該サンプルを、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の抗体と接触させる工程；および
抗原に対する該抗体の特異的結合を検出する工程であって、ここで、該特異的結合の存在が、該サンプル中のＧＰ２８６の存在を示す工程
を包含する、方法。A method for determining the presence of a GP286 protein in a sample, the method comprising the following steps:
Contacting said sample with an antibody according to any one of claims 23 to 27; and detecting specific binding of said antibody to an antigen, wherein the presence of said specific binding is determined. Indicating the presence of GP286 in the sample. 前記抗体が、ｇｐ２８６スプライス改変体に特異的である、請求項３３に記載の方法。34. The method of claim 33, wherein said antibody is specific for a gp286 splice variant. 前記抗体が、ｇｐ２８６ａスプライス改変体に特異的である、請求項３３に記載の方法。34. The method of claim 33, wherein said antibody is specific for a gp286a splice variant. ＧＰ２８６タンパク質を結合する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＧＰ２８６タンパク質を、試験化合物と接触させる工程；および
該ＧＰ２８６タンパク質および該試験化合物によって形成された複合体を検出する工程であって、ここで、該複合体の存在が、該試験化合物が該ＧＰ２８６タンパク質に結合すること、を示す工程
を包含する、方法。A method for identifying a compound that binds to a GP286 protein, comprising the steps of:
Contacting the GP286 protein with a test compound; and detecting the complex formed by the GP286 protein and the test compound, wherein the presence of the complex indicates that the test compound is the GP286 protein. Binding to ＧＰ２８６タンパク質の活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＧＰ２８６タンパク質を、試験化合物と接触させる工程；および
該ＧＰ２８６タンパク質の活性に対する試験化合物の効果を検出する工程であって、ここで、接触工程の後の該活性の変化が、該試験化合物が該ＧＰ２８６タンパク質の活性を調節することを示す工程、
を包含する、方法。A method for identifying a compound that modulates the activity of a GP286 protein, comprising the steps of:
Contacting the GP286 protein with a test compound; and detecting the effect of the test compound on the activity of the GP286 protein, wherein the change in the activity after the contacting step is such that the test compound A step showing to regulate the activity of the protein,
A method comprising: ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログを同定する方法であって、該方法が、配列番号１もしくは配列番号１４、または３００以上のヌクレオチドから構成される配列番号１もしくは配列番号１４の一部から構成される照会配列を用いて、ヌクレオチドデータベースをスクリーニングする工程を包含し、
ここで、配列番号１もしくは配列番号１４、または配列番号１もしくは配列番号１４の一部に対して、少なくとも６５％同一であるが１００％未満同一である、該ヌクレオチドデータベースのヌクレオチド配列が、見出される場合、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログである、方法。A method for identifying a homolog of the human gp286 gene, comprising: SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, or a query sequence comprising SEQ ID NO: 1 or a portion of SEQ ID NO: 14 comprising 300 or more nucleotides. Screening a nucleotide database using
Here, a nucleotide sequence is found in the nucleotide database that is at least 65% identical but less than 100% identical to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, or a portion of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14. The method is a homolog of the human gp286 gene. ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログを同定する方法であって、該方法が、以下の工程：
ポリヌクレオチドライブラリーを、配列番号１もしくは配列番号１４、または少なくとも１７ヌクレオチドから構成される配列番号１もしくは配列番号１４の一部を含むポリヌクレオチドプローブで、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程；および
該ポリヌクレオチドプローブが、該ライブラリー中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするか否かを検出する工程
を包含し、
ここで、そのようにハイブリダイズされる該ポリヌクレオチドが、ヒトｇｐ２８６遺伝子のホモログである、方法。A method for identifying a homolog of the human gp286 gene, comprising the following steps:
Hybridizing a polynucleotide library with a polynucleotide probe comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, or a portion of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 consisting of at least 17 nucleotides, under highly stringent conditions And detecting whether the polynucleotide probe hybridizes to a polynucleotide in the library.
Wherein the polynucleotide so hybridized is a homolog of the human gp286 gene. 被験体における疾患の状態を診断する方法であって、該方法が、該被験体からの組織サンプル中のＧＰ２８６タンパク質の量または活性を、コントロールサンプル中のＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロールサンプル中のＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性と比較した該組織サンプル中の該ＧＰ２８６ポリペプチドの量または活性の有意な相違が、該被験体が疾患状態を有することを示す、方法。A method of diagnosing a disease state in a subject, the method comprising comparing the amount or activity of GP286 protein in a tissue sample from the subject to the amount or activity of GP286 polypeptide in a control sample. , And
Wherein the significant difference in the amount or activity of the GP286 polypeptide in the tissue sample relative to the amount or activity of the GP286 polypeptide in the control sample is indicative of the subject having a disease state. . 前記疾患状態が、免疫系に関する、請求項４０に記載の方法。42. The method of claim 40, wherein said disease state is related to the immune system. 前記疾患状態が、Ｔ細胞に関する、請求項４１に記載の方法。42. The method of claim 41, wherein said disease state involves T cells. 被験体における疾患の状態を診断する方法であって、該方法が、該被験体からの組織サンプル中のｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量を、コントロールサンプル中のｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロールサンプル中の該ｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量と比較した該組織サンプル中の該ｇｐ２８６　ｍＲＮＡの量の有意な相違が、該被験体が疾患状態を有することを示す、方法。A method of diagnosing a disease condition in a subject, comprising comparing the amount of gp286 mRNA in a tissue sample from the subject to the amount of gp286 mRNA in a control sample,
Wherein a significant difference in the amount of said gp286 mRNA in said tissue sample relative to the amount of said gp286 mRNA in said control sample indicates that said subject has a disease state. 前記疾患状態が、免疫系に関する、請求項４３に記載の方法。44. The method of claim 43, wherein said disease state is related to the immune system. 前記疾患状態が、Ｔ細胞に関する、請求項４４に記載の方法。45. The method of claim 44, wherein said disease state involves T cells. 試験細胞中の遺伝的な病変または変異の存在または非存在を同定する診断アッセイであって、該遺伝的な病変または変異は、以下：（ｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変もしくは変異；（ｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質をコードする遺伝子の調節不良；および（ｉｉｉ）ＧＰ２８６タンパク質の異常な翻訳後修飾、のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、
該アッセイが、以下の工程：
該試験細胞、および該遺伝的な病変または変異を欠く参照細胞からのポリヌクレオチドを、配列番号１、配列番号１４もしくは少なくとも１７ヌクレオチドから構成されるそれらの一部を含むポリヌクレオチドプローブと、高度にストリンジェントな条件下で別々にハイブリダイズさせる工程；および
該ポリヌクレオチドハイブリッドを、高度にストリンジェントな洗浄条件下で別々に洗浄し、該ハイブリッドを解離させる工程；および
該参照細胞のポリヌクレオチドと比較して、該ポリヌクレオチドプローブが、該試験細胞のポリヌクレオチドからより容易に解離されるか否かを決定する工程、
を包含する、診断アッセイ。A diagnostic assay for identifying the presence or absence of a genetic lesion or mutation in a test cell, wherein the genetic lesion or mutation comprises: (i) an abnormal alteration or mutation of a gene encoding a GP286 protein. (Ii) dysregulation of the gene encoding the GP286 protein; and (iii) aberrant post-translational modification of the GP286 protein;
The assay comprises the following steps:
Polynucleotides from the test cells, and reference cells lacking the genetic lesion or mutation, are combined with a polynucleotide probe comprising SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14, or a portion thereof consisting of at least 17 nucleotides, to a high degree. Separately hybridizing under stringent conditions; and separately washing the polynucleotide hybrids under highly stringent washing conditions to dissociate the hybrids; and comparing to the polynucleotide of the reference cell. Determining whether the polynucleotide probe is more easily dissociated from the polynucleotide of the test cell;
A diagnostic assay. 免疫系に関する疾患状態を処置するための、請求項２１または２２の組成物の使用。23. Use of a composition of claims 21 or 22 for treating a disease state involving the immune system. 請求項４７に記載の使用であって、前記疾患状態が、以下：移植障害、自己免疫疾患、癌、多発性硬化症、対宿主性移植片病、川崎病、免疫欠損障害および炎症障害からなる群から選択される、使用。48. The use according to claim 47, wherein said disease state comprises: transplantation disorder, autoimmune disease, cancer, multiple sclerosis, graft versus host disease, Kawasaki disease, immunodeficiency disorder and inflammatory disorder. Use selected from the group. 請求項４８に記載の使用であって、前記自己免疫疾患が、以下：慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺炎、グレーヴズ病、肺線維症、閉塞性細気管支炎、溶血性貧血およびヴェーゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、使用。49. The use according to claim 48, wherein the autoimmune disease is: rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, Sjogren's syndrome, thyroiditis, Graves' disease, pulmonary fibrosis, bronchiolitis obliterans, hemolytic The use selected from the group consisting of anemia and Wegener's granulomatosis. 前記癌が、白血病またはリンパ腫である、請求項４８に記載の使用。49. The use according to claim 48, wherein said cancer is leukemia or lymphoma. 前記免疫欠損障害が、ＡＩＤＳである、請求項４８に記載の使用。49. The use according to claim 48, wherein said immunodeficiency disorder is AIDS. 前記炎症障害が、以下：喘息、アレルギー、成人呼吸促進症候群ならびに急性膵炎および慢性膵炎からなる群から選択される、請求項４８に記載の使用。49. The use according to claim 48, wherein said inflammatory disorder is selected from the group consisting of: asthma, allergy, adult respiratory distress syndrome and acute and chronic pancreatitis. Ｔ細胞に関連する疾患状態を処置するための、請求項２１または２２に記載の組成物の使用。23. Use of a composition according to claim 21 or 22 for treating a disease state associated with T cells.
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