JP2004208583A - New immunosuppressive receptor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、新規免疫抑制性受容体及びその部分ペプチド、該蛋白質をコードするＤＮＡ及びその断片、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法、該蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は他の細胞とコミュニケーションすることによって、細胞の機能や増殖、分化を制御している。細胞接着分子（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の中でも、生体内のあらゆる免疫反応に深く関与する免疫担当細胞の細胞接着分子は免疫機能そのものを調節する重要なものである。
【０００３】
イムノグロブリンドメインは、免疫系および神経系で非常に多くの蛋白質に見出されており、さらには細胞間認識機構に関与する他の多くの蛋白質においても見出されている。これらの分子を総称してイムノグロブリンスーパーファミリーという。イムノグロブリンドメイン構造を持つ細胞接着分子は数多く知られているが、例えばＩＬ−１受容体、ｇｐ１３０、ＰＤＧＦ受容体などが挙げられる。
【０００４】
ＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ）は免疫抑制性受容体に共通して認められるモチーフであり、このモチーフ内に含まれるチロシン残基がリン酸化されるとＳＨＰ１（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１）やＳＨＰ２と呼ばれるフォスファターゼやＳＨ２ドメインをもつ脂質フォスファターゼＳＨＩＰ（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が結合することが知られている。このフォスファターゼがｓｙｋなどチロシンキナーゼまたはＩＰ４やＰＩＰ３のような脂質を脱リン酸化する。この結果、ＣａストアからのＣａイオン流出、細胞外からのＣａイオン流入が抑制されることによって負のシグナルを引き起こすと考えられる。
【０００５】
イムノグロブリンスーパーファミリーに属する免疫抑制性受容体は、ＣＴＬＡ−４、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ）、ＣＤ２２などが知られているが、生体内の複雑な免疫反応、炎症反応の解明のためには、これらに関与する新たな免疫抑制性受容体の単離同定が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な免疫抑制性受容体とその遺伝子を同定することにより、免疫疾患の予防並びに治療に有用な医薬及び方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、新規な遺伝子（ｍｃｄ０５５とする）、当該遺伝子にコードされる新規免疫抑制性受容体（ＭＣＤ０５５）に関する。また、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質の活性調節物質の検索方法、該蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【０００８】
（核酸）
本発明は、ＭＣＤ０５５（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｍｃｄ０５５を提供する。遺伝子ｍｃｄ０５５とは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる免疫抑制性受容体をコードするＤＮＡのことである。具体例としては配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されるものではなく、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。該遺伝子はヒト脾臓から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
【０００９】
また、ｍｃｄ０５５の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００１０】
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
【００１１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が免疫抑制性受容体であれば、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫抑制性受容体をコードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００１２】
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
【００１３】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
【００１４】
本発明のＤＮＡは、ＭＣＤ０５５を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患、特に自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等の診断を行うことも可能である。
【００１５】
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
【００１６】
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等の発症を予防または治療するための遺伝子治療にも使用することが出来る。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換え蛋白質ＭＣＤ０５５の生産方法、あるいはＭＣＤ０５５の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
【００１８】
本発明における形質転換細胞は当業者が公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｍｃｄ０５５をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｍｃｄ０５５の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いたＭＣＤ０５５の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｍｃｄ０５５の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
【００１９】
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｍｃｄ０５５の一部または全部を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｍｃｄ０５５の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。遺伝子ｍｃｄ０５５の一部の例としてはｍｃｄ０５５遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２０】
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を作製することが出来る。さらに、本発明の遺伝子ｍｃｄ０５５を利用すれば、ヒト以外の動物からｍｃｄ０５５に相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さらに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトｍｃｄ０５５を導入することにより、ヒトｍｃｄ０５５のみを有するモデル動物を作製することも可能となる。このモデル動物は、該導入されたヒトｍｃｄ０５５をターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。
【００２１】
（蛋白質ＭＣＤ０５５）
ＭＣＤ０５５にコードされる蛋白質ＭＣＤ０５５は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる免疫抑制性受容体である。特にそのアミノ酸配列に見られる構造的特徴から、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する新規の免疫抑制性受容体であると判断される。
【００２２】
ＭＣＤ０５５は４１３アミノ酸からなる分子であり、膜貫通領域を有するＩ型膜貫通蛋白質である。配列番号２に示すアミノ酸配列の３９残基から９２残基、１３２残基から１８９残基、２２８残基から２８５残基の領域にかけ計３個のイムノグロブリンドメイン、２から２４残基、及び３１７から３３９残基の領域に膜貫通領域、３７５から３８１残基の領域にＩＴＩＭと機能的に同等と推測されるモチーフＧＶＶＹＳＶＶが存在する。これら領域の範囲はドメインの定義の仕方により多少の異同を生じ得るが、本質的に同じドメインを意味する限り同義であることは言うまでもない。
【００２３】
本発明の蛋白質ＭＣＤ０５５は、細胞外ドメインにイムノグロブリンドメインを有し、細胞内ドメインにＩＴＩＭを有すること、および脾臓、白血球など免疫に直接関与している臓器、細胞で発現していることから、免疫抑制性受容体であると判断される。ここで言う免疫抑制性受容体とは、免疫担当細胞の細胞膜上に発現し、リガンドや抗体などが細胞外ドメインに結合することにより、細胞内活性化シグナル蛋白質のリン酸化抑制を介して、その免疫担当細胞のサイトカイン産生、細胞増殖などの活性を抑制する分子を指す。本発明の蛋白質の細胞外ドメインに対する抗体を作製し、その抗体を用いてフローサイトメーターにより免疫担当細胞における発現を確認することが出来る。また、本発明の蛋白質を発現させたＴリンパ球細胞株を樹立し、その細胞に対してサイトカイン産生刺激を与え産生サイトカインを測定する系により、サイトカイン産生抑制作用を指標に本発明蛋白質に対するアゴニスティック抗体、またはペプチドなどを探索することが出来る。
【００２４】
サイトカイン産生刺激として抗ＣＤ３刺激を用いたＩＬ−２産生試験系が具体例として挙げられる。細胞内活性化シグナル蛋白質とは例えばＥＲＫ−１やＥＲＫ−２が挙げられるが、ＭＣＤ０５５を介してリン酸化が調節されている蛋白質であればこれらに限定されるものではない。本発明の蛋白質に対するリガンドやアゴニスティック抗体による刺激が細胞内に抑制シグナルをもたらすことは、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ−１（ＥＲＫ−１）のリン酸化抑制により確認できる（Ｃａｒｒｅｎｏら Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６５ １３５２−１３５６ （２０００））。
【００２５】
この様に、ＭＣＤ０５５はイムノグロブリンドメインを有する、ＩＴＩＭを有する等免疫抑制性受容体に認められる特徴を高度に保持している一方、図１に示すように肺、肝臓、心臓、活性化白血球、白血球、脾臓および気管に発現するというＭＣＤ０５５固有の発現プロファイルを示すなどの特徴を有する。このことから、ＭＣＤ０５５は、免疫機能の調節において、他の免疫抑制性受容体にはない特徴的な役割を果たしていることが強く推認される。従って、ＭＣＤ０５５を標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備えた医薬となり得るものと期待される。
【００２６】
なお、免疫抑制性受容体である限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
【００２７】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
【００２８】
従って、配列番号２に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、それが免疫抑制性受容体であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。免疫抑制性受容体であるとは、換言すれば本発明のＭＣＤ０５５蛋白質と同等の機能を有することである。同等の機能を有するとは、細胞内活性化シグナル蛋白質のリン酸化抑制活性、サイトカイン産生抑制活性、細胞増殖抑制活性から選ばれる少なくとも一つの活性を保持していることを言う。
【００２９】
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が免疫抑制性受容体である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
【００３０】
また本発明では、ＭＣＤ０５５を上述のような全てのドメイン構造を有する分子全体として理解できるほか、特徴的なドメイン、特にリガンドとの結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして理解することもできる。膜貫通型蛋白質の中には、リガンド結合部位を含む部分断片が、特徴的な立体構造を保持したまま他のドメインから切り離されるなどして、遊離の（あるいは可溶化、可溶型とも言われる）部分ペプチドとして存在し得るものがあることが、以前より報告されている。この様な部分ペプチドは、依然として特異的なリガンドとの結合能を保持していることから、これを用いて該蛋白質への結合能を有する化合物の探索が可能となる。ＭＣＤ０５５における部分ペプチドも、かかる意味においてそのリガンド結合能を有する限り、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。また、可溶型ＭＣＤ０５５はＭＣＤ０５５（細胞膜上にある膜貫通型）との競合により免疫反応を調節したり、可溶型ＭＣＤ０５５自体がリガンドとして機能し、何らかの受容体に結合し、免疫反応を調節する活性を発揮する可能性も考えられる。このような活性を有する部分ペプチドも本発明の範囲内のものである。可溶型ＭＣＤ０５５の免疫反応を調節する活性は例えば実施例９に示す混合リンパ球反応により検出することが可能である。免疫反応を調節する活性とは、具体的にはサイトカイン産生調節活性および／または細胞増殖調節活性のことである。
【００３１】
部分ペプチドの好ましい態様としては、例えば細胞外ドメイン（配列番号２の２５〜３１６ａ．ａ．）、または細胞内ドメイン（配列番号２の３４０〜４１３ａ．ａ．）のいずれかを含むペプチドが挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列の３１７番目から３３９番目のアミノ酸残基付近に膜貫通領域の存在が予測されている（膜貫通予測プログラムＳＯＳＵＩを用いた場合）。ドメインをどこまでのアミノ酸残基で区切るかは、使用するドメインの予測方法により多少前後することがあるが、そのような差異は許容されるべきものである。リガンド結合能または免疫反応を調節する活性を有するという観点では、少なくともイムノグロブリンドメインを含むことが好ましい。また、シグナル伝達機能を有するという観点では、少なくとも細胞内ドメインのＩＴＩＭを含むことが好ましい。少なくとも一つの機能ドメインを含む限り、他のドメインの全部または一部が連結していても良いし、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質となっていても良い。
【００３２】
機能ドメインとは、リガンド結合能、免疫反応を調節する活性またはシグナル伝達機能を保持した部分ペプチドのことである。融合蛋白質がＭＣＤ０５５または可溶型ＭＣＤ０５５としてのリガンド結合能、免疫反応を調節する活性またはシグナル伝達機能から選ばれる少なくとも一つの活性を有する限りにおいて、ＭＣＤ０５５部分ペプチドに連結される他のポリペプチドには特に制限はない。このような融合蛋白質の好ましい一例は、イムノグロブリンのＦｃフラグメントとの融合蛋白質やヒスチジンタグとの融合蛋白質であるがこれらに限定されるものではない。Ｆｃ断片はＩｇＧの場合、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる。Ｆｃ断片の部分（例えばヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域もしくはＣＨ４領域の各領域の単独または任意の組合せ）も使用可能である。この場合のイムノグロブリンは、由来する種は何れでもよいが、ヒト由来のものが好ましい。また、クラス及びサブクラスに関しても必ずしも限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ等の何れもが使用可能であるが、例えば、ＩｇＧが好ましい例である。
【００３３】
またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合もある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれた成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。ＭＣＤ０５５の場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２番目から２４番目のアミノ酸残基付近にシグナル配列の存在が予測されている（膜貫通予測プログラムＳＯＳＵＩを用いた場合）。シグナルペプチド領域の範囲は予測プログラムにより多少の異同を生じ得るし、実験的に作製した蛋白質においてもシグナルペプチドの除かれ方に多様性が生じることがあるが、ＭＣＤ０５５蛋白質として機能的に同等である限り、本発明と同等の物質であると理解されるべきである。
【００３４】
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
【００３５】
（抗体）
本発明はさらにＭＣＤ０５５に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＭＣＤ０５５全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。またＭＣＤ０５５あるいはその部分ペプチドを特異的に認識するのみでなく、ＭＣＤ０５５の活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＭＣＤ０５５の活性を調節する機能を有する抗体とは、例えばＭＣＤ０５５とリガンドの結合を阻害する中和抗体が挙げられる。これらの抗体は、ＭＣＤ０５５の研究的あるいは臨床的な検出等に有用である。
【００３６】
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＭＣＤ０５５生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＭＣＤ０５５をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｍｃｄ０５５の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補性を有する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列に相当あるいは相補性を有する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補性を有するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
【００３７】
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＭＣＤ０５５の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
【００３８】
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
【００３９】
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
【００４０】
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
【００４１】
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるＭＣＤ０５５の発現を抑制することができるので、ＭＣＤ０５５が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
【００４２】
【発明の実施の形態】
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製するのに適した細胞を選び、公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
【００４３】
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
【００４４】
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。一部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡである。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
【００４５】
遺伝子組換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００４６】
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
【００４７】
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、延長因子１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １α）プロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
【００４８】
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
【００４９】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、該蛋白質を発現している細胞や組織から調製することができ、またペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
【００５０】
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
【００５１】
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
【００５２】
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）があるので、それらを参考にして行うことができる。
【００５３】
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５４】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
【００５５】
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
【００５６】
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、免疫抑制性受容体として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
【００５７】
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
【００５８】
本発明のＭＣＤ０５５は、上述のような形質転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、ＭＣＤ０５５の細胞外領域蛋白質フラグメントなどの適当な断片を可溶性蛋白質として製造する場合には、当該細胞外領域あるいは各ドメインをコードするＤＮＡを用いて上述のように形質転換細胞を調製し、外形質転換細胞を培養することにより培養上清中に分泌させることにより製造することができる。
【００５９】
一方、ＭＣＤ０５５が形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から定法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
【００６０】
（ｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物）
本発明は、ｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。ｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。ｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むことにより、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウマ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ましい。
【００６１】
本発明の遺伝子ｍｃｄ０５５を用いれば、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。該トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の受精卵に導入し、この受精卵を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
【００６２】
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスから取得した前核期受精卵にｍｃｄ０５５遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にｍｃｄ０５５遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
【００６３】
該受精卵を仮親となる別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてＭＣＤ０５５遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
【００６４】
また、ｍｃｄ０５５（またはｍｃｄ０５５のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。また、近年さかんに行われているランダムな動物個体の遺伝子破壊方法によっても結果的に本遺伝子の破壊動物が得られる場合もある。本遺伝子の破壊が明らかとなった動物は、その破壊が本遺伝子の明確な目的を持って行われたか否かに関わらずその遺伝子の破壊が判明した時点で本発明の一態様である。
【００６５】
または、最近、中・大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しｍｃｄ０５５（または各動物におけるｍｃｄ０５５の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はｍｃｄ０５５（または各動物におけるｍｃｄ０５５の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にｍｃｄ０５５（または各動物におけるｍｃｄ０５５の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
【００６６】
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
【００６７】
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
【００６８】
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
【００６９】
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００７０】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から公知方法を組み合わせて目的とする抗体を精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３；９９−１２１（１９９１））。
【００７１】
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはＭＣＤ０５５を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
【００７２】
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被験物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被験物質中に、遺伝子ｍｃｄ０５５もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
【００７３】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
【００７４】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
【００７５】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
【００７６】
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、（１）被験物質を用意し、本発明の蛋白質または該蛋白質を発現している形質転換細胞に該被験物質を接触させ、該被験物質が本発明の蛋白質の活性を調節する作用を有するかどうかを評価することからなる方法（２）被験物質を用意し、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞に該被験物質を接触させ、該被験物質がｍｃｄ０５５遺伝子の発現を調節する作用を有するかどうかを評価することからなる方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例７、８または９に示す系において、被験物質存在下／非存在下における本発明の蛋白質の活性を測定し、非存在下に比べて存在下において本発明の蛋白質の活性を増加または減少させる被験物質を選択する方法が挙げられる。（２）の例としては、ｍｃｄ０５５遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した組換えベクターを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｍｃｄ０５５遺伝子組換え非ヒト動物と被験物質を接触させる工程；被験物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＭＣＤ０５５蛋白質の活性を模倣（ミミック）ないし増強する（アゴニスト）、あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ｍｃｄ０５５の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよい。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ｍｃｄ０５５遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ｍｃｄ０５５遺伝子またはＭＣＤ０５５蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、試験したい遺伝子の発現制御領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該発現制御領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。発現制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β―ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
【００７７】
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（被験物質無添加群の測定値−被験物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×１００
【００７８】
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系がサイトカイン産生抑制活性の測定系の場合には、測定値としてはサイトカイン産生量を用いることができ、被験物質添加群のサイトカイン産生量＞被験物質無添加群のサイトカイン産生量となる場合、被験物質にはＭＣＤ０５５蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
【００７９】
本発明である蛋白質は、免疫抑制性受容体であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
【００８０】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
【００８１】
実施例１ 遺伝子ｍｃｄ０５５のクローニング
（１）クローンＣ−ＳＰＬＥＮ２０１０５８８の取得
（１−１）ｃＤＮＡライブラリーの作製と全長性の評価
ヒト組織の脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）より全ＲＮＡとして抽出されたｍＲＮＡを全ＲＮＡの状態で購入した（ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＃６４０３４−１）。購入したＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ． Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓ． Ｓｕｇａｎｏ， Ｇｅｎｅ， １３８： １７１−１７４ （１９９４）］を改良した方法（ＷＯ ０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ ｌｉｎｋｅｒおよびＯｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒを用いて、ＷＯ ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’側と３’側のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩで切断した。次いで、２ｋｂ以上に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ００９８６４， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ ｌｉｎｋｅｒ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ、５’側と３’側のＰＣＲプライマーの配列は、ＷＯ ０１／０４２８６に記載したものを使用した。
【００８２】
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。得られたデータをデータベース化した。
【００８３】
オリゴキャップ法を改良した方法で作製したヒト脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）のｃＤＮＡライブラリーの約３万クローンの５’−末端の全長率を次の方法で求めた。公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡと５’−末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’−末端が伸びている場合、または５’−末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。これをもとに５’−末端の全長率 ［全長クローン数／（全長クローン数＋非全長クローン数）］ を計算した。この結果、５’−末端の全長率は、約９０％であった。この結果より、取得したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’−端配列の全長率が非常に高いことが分かった。
【００８４】
（１−２）全長塩基配列解析クローンの選択および全長配列解析
上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
【００８５】
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて全長ｃＤＮＡの塩基配列を通常の方法により決定した。全長塩基配列は、両鎖とも部分塩基配列が完全にオーバーラップするように確定した。そのなかよりＣ−ＳＰＬＥＮ２０１０５８８を取得した。
【００８６】
クローンＣ−ＳＰＬＥＮ２０１０５８８には、配列番号２で表される４１３個のアミノ酸からなる新規な蛋白質ＭＣＤ０５５をコードする、配列番号１で表される１２３９塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、全長１９９７塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃＤＮＡが含まれていた。このプラスミドＣ−ＳＰＬＥＮ２０１０５８８は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９１６５として寄託されている。
【００８７】
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びアミノ酸配列の解析
（２−１）ＭＣＤ０５５アミノ酸配列をＨＭＭＥＲプログラム（Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｓ． Ｅｄｄｙ， Ａ． Ｋｒｏｇｈ， Ｇ． Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９９８）．）でＰｆａｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／）を検索したところ３９残基から９２残基、１３２残基から１８９残基、２２８残基から２８５残基にかけ計３個のイムノグロブリンドメインが見られた。
【００８８】
（２−２）膜貫通予測プログラム（Ｔａｋａｔｓｕｇｕ Ｈｉｒｏｋａｗａ， Ｓｅａｈ Ｂｏｏｎ−Ｃｈｉｅｎｇ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｋｉ Ｍｉｔａｋｕ， ＳＯＳＵＩ： Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （ｆｏｒｍｅｒｌｙ ＣＡＢＩＯＳ） １９９８ Ｍａｙ；１４（４）：３７８−３７９．）で膜貫通部位予測を行なった結果配列番号２で示されるアミノ酸配列では２から２４残基、及び３１７から３３９残基に膜貫通領域が予測された。このことから配列番号２で示されるアミノ酸配列では、２番目のＬｅｕから２４番目のＴｈｒまでがシグナルペプチド配列と予測された。また、その他の膜貫通領域がＣ末端側の１箇所であることから本蛋白質はＮ末端側を細胞外にＣ末端側を細胞内に向けた形で細胞膜表面に存在することが予測された。
【００８９】
（２−３）［ＩＶ］ｘＹｘｘ［ＬＶ］は一般的にＩＴＩＭモチーフとして知られているが（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ．１５９（５）：２０７５−７（１９９７））、このモチーフと機能的に同等と推測されるモチーフＧＶＶＹＳＶＶが配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７５から３８１残基にかけて認められた。
【００９０】
実施例２ ＰＣＲによる発現プロファイルの確認
ＲＴ−ＰＣＲによるｍｃｄ０５５の組織発現プロファイル解析を行った。解析に用いたヒトＲＮＡは以下の通りである。ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及び、ヒト冠状動脈血管平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）から定法によりｍＲＮＡを調製した。また、ヒト末梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡの存在下あるいは非存在下で２４時間培養した後にｍＲＮＡを定法により調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、脾臓、心臓、副腎、精巣、気管、胎児腎、脳のｍＲＮＡをクローンテック社より、大腸のｍＲＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入した。肝臓、小腸、のｔｏｔａｌ ＲＮＡをクローンテック社より購入し、定法によってｍＲＮＡを調製した。次に、これら各ｍＲＮＡ ０．１２μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮＡｓｅ Ｈ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。また、ＰＣＲに用いたｍｃｄ０５５特異的なプライマーの配列はセンスプライマー ｍｃｄ０５５−Ｆ１（５’−ＧＴＧ ＴＴＧ ＴＣＴ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＧＧ ＴＧＣ− ３’）、アンチセンスプライマーｍｃｄ０５５−Ｒ１（５’− ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＣＴＴ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＣ− ３’）である。解析した結果、ｍｃｄ０５５は肺、肝臓、心臓、活性化白血球、白血球、脾臓及び気管で発現していた（図１）。
【００９１】
実施例３ 可溶型ＭＣＤ０５５蛋白質（ＭＣＤ０５５細胞外ドメイン）の発現
ｍｃｄ０５５遺伝子はＰＣＲにより増幅後、各種発現ベクターに組み込んだ。蛋白質のＮ末端側にヒスチヂンタグを接続して発現させるためには発現ベクターｐＩＶＥＸ２．４ｂＮｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いＣ末端側にヒスチヂンタグを接続して発現させるためには発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３ ｄ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた。ＭＣＤ０５５蛋白質はヒスチヂンタグを接続した形で無細胞系（Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ＲＴＳ）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で発現させた後にニッケルカラムを用いて精製する。なお、ＳＯＳＵＩによる膜貫通部位検索では３１７番目のＰｒｏより３３９番目のＳｅｒまでが膜貫通部位のため、可溶型ＭＣＤ０５５蛋白質としてはそれよりＮ末端側１番目のＭｅｔから３１６番目のＶａｌまでを発現させる。
【００９２】
実施例４ 抗ＭＣＤ０５５抗体の作製
（１）ＭＣＤ０５５の部分ペプチド（ペプチド抗原）の調製 ＭＣＤ０５５部分ペプチドに対する抗体を作製するため、ＭＣＤ０５５の部分ペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合を行う。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（アマシャム ファルマシアバイオテク）で脱塩する。蛋白濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを用い、算出する。
【００９３】
（２）ＭＣＤ０５５抗体の作製
（２−１）ポリクローナル抗体の作製
ＭＣＤ０５５に対するウサギポリクローナル抗体を作製するため、調製したペプチド抗原をそれぞれ各４０μｇずつ混合し、０．５ｍｌとする。その後、等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合し、ウサギの背部皮下に投与を行う。２週間後、同量をフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合したものを投与し、２週間後耳静脈より採血し抗血清を調製する。同様に実施例３で産生および精製した可溶型ＭＣＤ０５５を３０μｇ／ｂｏｄｙで投与し、抗血清を作製する。
【００９４】
（２−２）ペプチド抗体の作製
ＭＣＤ０５５のアミノ酸配列より任意に選んで調製した各ペプチド抗原２０μｇを１００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバントと等量混合を行する。ＢＡＬＢ／ｃマウス５週齢メスの腹腔に投与し、２週間後ペプチド抗原２０μｇを１００μｌの生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等量混合し同様に腹腔に投与する。１週間後眼底より採血を行い、抗体価の上昇をウエスタンブロッティングにより確認する。すなわち組換えＭＣＤ０５５蛋白質を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）にて電気泳動し、ミリポア社の方法にしたがってＰＶＤＦ膜に転写する。転写後５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下Ｔ−ＰＢＳと記載）にてブロッキングを行う。採血した抗血清を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、転写したＰＶＤＦ膜と４℃で一夜反応させる。メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで５００倍に希釈し、メンブレンと室温で１時間反応させる。その後、メンブレンをＴ−ＰＢＳで３回洗浄後、ＥＣＬ（アマシャム ファルマシアバイオテク）で検出する。以上の操作で抗体価の上昇を確認し、抗原の最終投与３日後、脾細胞よりリンパ球を分離し、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１５８１）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後に目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行う。
【００９５】
０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、実施例３で生産及び精製したＭＣＤ０５５細胞外ドメインを１μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μｌ／ウエル添加する。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下ＰＢＳと記載）を各ウエルに１００μｌ添加し、ブロッキングを行う。次に培養上清を各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μｌ添加する。３７℃で１時間反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し、０．０１％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。この結果をもとに、ＭＣＤ０５５細胞外ドメインと反応する細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行う。１０日後、同様にスクリーニングを行い、ＭＣＤ０５５細胞外ドメインと反応する抗体を産生するクローンを取得することができる。選択したハイブリドーマは１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製する。
【００９６】
（２−３）抗ＭＣＤ０５５モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週齢）の腹腔に精製したＭＣＤ０５５細胞外ドメイン蛋白質２０μｇをフロインド完全アジュバントと等量混合して投与する。初回投与２週間後に抗原２０μｇを生理食塩水に溶解し、フロインド不完全アジュバントと等量混合後腹腔に投与する。さらに１週間後、抗体価の上昇を上記（２−２）記載の方法により確認し、最終投与を行う。マウスの腹腔に抗原１００μｇを投与し、３日後、脾臓を摘出する。脾臓よりリンパ球を分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行う。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行う。（２−２）に記載の方法により抗ＭＣＤ０５５抗体産生ウエルのスクリーニングを行い、ＭＣＤ０５５細胞外ドメインと反応したウエルを限界希釈法によりクローニングし、再度スクリーニングを行って抗ＭＣＤ０５５モノクローナル抗体を取得する。
【００９７】
ハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製する。
【００９８】
実施例５ ＭＣＤ０５５発現形質転換株の作製
ＭＣＤ０５５を安定に発現する形質転換株を以下の方法で作製する。即ち、５×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞（ｃｌｏｎｅ Ｅ６．１；ＡＴＣＣ）に２０μｇのＭＣＤ０５５発現プラスミド及び１μｇのＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をエレクトロポレーション法によって導入する。エレクトロポレーションはジーンパルサーＩＩシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて３００Ｖ、９５０μＦ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅにて行う。その後、０．３ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む培地にて選択培養を行い、Ｇ−４１８耐性クローンを得る。次に得られた耐性クローンを実施例６に記すフローサイトメトリー法で解析し、ＭＣＤ０５５を発現しているクローンを得る。
【００９９】
実施例６ ＭＣＤ０５５蛋白質発現確認
脾臓、末梢血などから調製したリンパ球や白血球分画、および、本蛋白質を発現させたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の細胞膜における発現を、フローサイトメーターにより確認する。試験の対象となる１０６個の細胞を０．１ｍｌの０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁させ、１μｇの本発明蛋白質の細胞外ドメインに対する抗体を添加し、室温で３０分反応させる。このサンプルを遠心し、２ｍｌの０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄後、１００μｌの０．１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁させ、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１μｇ加えて室温でさらに３０分反応させる。ふたたび０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍｌの０．１％ＢＳＡ ＰＢＳで再懸濁し、その再懸濁液に含まれるＦＩＴＣ陽性細胞の割合をフローサイトメーターにより検出、および算定する。
【０１００】
実施例７ ＭＣＤ０５５蛋白質抗体のＩＬ−２産生抑制活性測定
本発明蛋白質を恒常的に発現させた２×１０５個のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を９６穴プレートに播種する。１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを添加した培地で１晩培養し、その後、抗ＣＤ３抗体をコートしたビーズ（ビーズ数：Ｊｕｒｋａｔ細胞数＝１：１）、および抗ＣＤ２８抗体 ５μｇ／ｍｌを添加して４８時間培養し、培養上清中に含まれるＩＬ−２をＥＬＩＳＡによって測定する。本発明蛋白質に対する抗体を抗ＣＤ３抗体ビーズ、および抗ＣＤ２８抗体の添加と同時に加え、ＩＬ−２産生に対する影響を検討する。
【０１０１】
実施例８ ＭＣＤ０５５蛋白質抗体によるリン酸化抑制反応
ドキシサイクリン添加によって本発明蛋白質を発現させた１×１０７個のＪｕｒｋａｔ細胞に抗ＣＤ３抗体ビーズ（ビーズ数：Ｊｕｒｋａｔ細胞数＝１：１）、可溶性抗ＣＤ２８抗体 ５μｇ／ｍｌ添加し、１０分後にオルトバナジン酸ナトリウムを含むＰＢＳで一回洗浄した後、５００μｌの溶解用緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム，１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１０μｇ／ｍｌ アプロチニン，２５μｇ／ｍｌ ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノ−ベンゾエート）を添加して３０分氷中で静置する。こうして得られた細胞溶解物に対してＳＤＳ電気泳動を行った後ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、抗活性ＭＡＰＫ抗体を用いてウエスタンブロットを行うことにより、リン酸化ＥＲＫ１／ＥＲＫ２を検出する。本発明に対する抗体を抗ＣＤ３抗体ビーズや抗ＣＤ２８抗体と同時に添加し、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化に対する影響を検討する。
【０１０２】
実施例９ 細胞外ドメインの活性測定
非血縁者２人のドナー（Ａ，Ｂ）の血液から調製した末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を５％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０で１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、９６穴プレートにＡ由来のＰＢＭＣ懸濁液とＢ由来のＰＢＭＣ懸濁液を１００μｌずつ添加して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養する。実施例３で作製したＭＣＤ０５５細胞外ドメインを、リンパ球の添加と同時に１０μｇ／ｍｌ添加する。その後、培地で１００μＭに調製したブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を２０μｌ添加し、２４時間培養する。３００ｇ、１０分遠心して細胞を沈殿させ、上清を除去して２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ（ロシュ）を添加して３０分静置したのち、ＦｉｘＤｅｎａｔを除去し、１００μｌのペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ反応液を加え、室温で９０分静置する。ＰＢＳで３回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ添加して発色させた。発色５−３０分後に２５μｌの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの蛍光度測定を行う。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明のＭＣＤ０５５は、免疫機能の異常による疾患の発症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であり、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、血管炎・肝炎・敗血性ショックなとの炎症性疾患、腫瘍等の予防あるいは治療のための医薬品の開発において、極めて有用である。
【０１０４】
また、遺伝子ｍｃｄ０５５は、アンチセンス医薬品として、また遺伝子治療において利用することができ、蛋白質ＭＣＤ０５５は、それ自体あるいはその可溶性断片（細胞外領域や各ドメイン）を作製することにより可溶性蛋白医薬品として有用である。さらに、ＭＣＤ０５５またはその断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部は、生体内でのＭＣＤ０５５機能を制御する抗体医薬品として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲによるｍｃｄ０５５の組織発現プロファイルを示す図である。[0001]
【Technical field】
The present invention relates to a novel immunosuppressive receptor and a partial peptide thereof, a DNA encoding the protein and a fragment thereof, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, and an activity of the protein. The present invention relates to a method for searching for a substance exhibiting a regulatory action, an antibody reactive with the protein or its partial peptide, and a transgenic non-human animal.
[0002]
[Prior art]
Cells communicate with other cells to control their function, proliferation and differentiation. Among cell adhesion molecules, cell adhesion molecules of immunocompetent cells which are deeply involved in all immune reactions in a living body are important in regulating immune function itself.
[0003]
Immunoglobulin domains are found on numerous proteins in the immune and nervous systems, and also on many other proteins involved in the intercellular recognition mechanism. These molecules are collectively called the immunoglobulin superfamily. Many cell adhesion molecules having an immunoglobulin domain structure are known, and examples thereof include IL-1 receptor, gp130, PDGF receptor and the like.
[0004]
ITIM (Immunoreceptor Tyrosine based Inhibition Motif) is a motif commonly recognized in immunosuppressive receptors, and when a tyrosine residue contained in this motif is phosphorylated, SHP1 (SH2-containing protein tyrosine phosphatase phosphatase). It is known that a phosphatase called SHHP2 or SHP2 or a lipid phosphatase SHIP (SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase) having an SH2 domain binds thereto. This phosphatase is a tyrosine kinase such as syk or IP 4 And PIP 3 Dephosphorylate lipids such as As a result, it is considered that a negative signal is caused by suppressing Ca ion outflow from the Ca store and Ca ion inflow from the outside of the cell.
[0005]
Known immunosuppressive receptors belonging to the immunoglobulin superfamily include CTLA-4, FcγRIIB, Killer cell inhibitory receptor (KIR), CD22, etc., for elucidating complex immune and inflammatory responses in vivo. Therefore, there is a need for the isolation and identification of new immunosuppressive receptors involved in these.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a drug and a method useful for prevention and treatment of an immune disease by identifying a novel immunosuppressive receptor and its gene.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a novel gene (mcd055) and a novel immunosuppressive receptor (MCD055) encoded by the gene. Further, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, a method for searching for an activity-regulating substance of the protein, an antibody reactive with the protein or a partial peptide thereof, For human animals.
[0008]
(Nucleic acid)
The present invention provides the gene mcd055, which encodes MCD055 (described in detail below). The gene mcd055 specifically refers to a DNA encoding an immunosuppressive receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Specific examples include, but are not limited to, the cDNAs shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and the cDNAs shown in SEQ ID NOs: 1 and 3 as well as the genomic DNA from which the cDNAs are derived. The gene can be isolated and identified from the human spleen, but based on the sequences disclosed herein, cloning using genetic engineering techniques such as general hybridization and chemical synthesis such as the phosphoramidite method. It may be DNA prepared by a technical method. Examples of the form include cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA, but are not particularly limited. The DNA of the present invention may be single-stranded or may form a double or triple chain by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto. The DNA may be labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like.
[0009]
In addition, if the base sequence of mcd055 is provided, the sequence of RNA derived therefrom, the sequence of complementary DNA and RNA, and the like are uniquely determined, so that the present invention corresponds to the DNA of the present invention. It should be understood that RNA or DNA and RNA having a sequence complementary to the DNA of the present invention are also provided. In this specification, “DNA” is synonymous with “polynucleotide”.
[0010]
Furthermore, the DNA of the present invention also includes a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0011]
The DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 hybridizes with the DNA under stringent conditions, and if the protein encoded by the DNA is an immunosuppressive receptor, the variation of the nucleotide sequence is Permissible. For example, the presence of a plurality of codons encoding the same amino acid residue due to so-called codon degeneracy, various artificial treatments such as site-directed mutagenesis, random mutation by mutagen treatment, and mutation / deletion of DNA fragments by restriction enzyme cleavage. Even if the DNA sequence is partially changed due to loss, ligation, etc., these DNA variants hybridize with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and bind to the immunosuppressive receptor. The encoding DNA is within the scope of the present invention, regardless of the difference from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0012]
The degree of the above DNA mutation is within an allowable range as long as it has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1. BLAST (J. Mol. Evol., Vol. 36; 290-300 (1993), J. Mol. Biol., Vol. 215; 403-10 (1990)) is used to determine the identity of DNA sequences. be able to. The degree of hybridization is, for example, 32 ° C., preferably 37 ° C. when the probe is labeled under a stringent condition, for example, using a DIG DNA Labeling kit (Cat No. 1175033 manufactured by Roche Diagnostics). And more preferably in a DIG Easy Hyb solution (Cat No. 1603558 manufactured by Roche Diagnostics) at 42 ° C., for example, a 0.5 × SSC solution (0.1 ° C.) at 50 ° C., preferably 65 ° C. % (W / v) SDS) (including 1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate) under conditions for washing the membrane, and the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 is obtained. To the extent that it hybridizes to
[0013]
The DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial fragment thereof is useful as a specific probe for diseases involving the protein of the present invention, such as autoimmune diseases, immunodeficiencies, allergic diseases, inflammatory diseases, and tumors. it is conceivable that.
[0014]
The DNA of the present invention can be used to produce MCD055 in large quantities. The DNA can also be labeled with an enzyme or the like and used for examining the expression status of the protein of the present invention in a tissue. That is, by using the DNA as a probe and confirming the expression level of the protein of the present invention in cells using the mRNA expression level as an index, cells suitable for producing the protein of the present invention and culture conditions thereof are determined. In addition, it is also possible to diagnose diseases associated with the protein of the present invention, in particular, autoimmune diseases, immunodeficiencies, allergic diseases, inflammatory diseases, tumors and the like.
[0015]
In addition, abnormalities or polymorphisms in the nucleic acid sequence can be obtained by a method such as PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) method using a part of the DNA of the present invention as a primer, PCR-SSCP (Single strand conformation polymorphism) method, or sequencing. Can be inspected and diagnosed.
[0016]
In addition, the DNA of the present invention can be introduced into cells in a living body and used for gene therapy for preventing or treating the onset of autoimmune disease, immunodeficiency, allergic disease, inflammatory disease, tumor and the like. .
[0017]
The DNA of the present invention is extremely useful for preparing transformed cells, further, for producing a recombinant protein MCD055 using the transformed cells, or for searching for a compound that specifically suppresses the expression of MCD055.
[0018]
Transformed cells in the present invention can be prepared by those skilled in the art by applying known techniques.For example, various cells that are commercially available or commonly available to those skilled in the art can be used to prepare suitable host cells. It is possible to incorporate the DNA of the present invention. At that time, the expression of the gene mcd055 in the host cell can be arbitrarily controlled by placing the gene mcd055 under the influence of an expression control gene represented by a promoter and an enhancer. This technique can be suitably used in the production of MCD055 using transformed host cells, and can also be applied to studies on the mechanism of controlling the expression of the gene mcd055 or search for substances that can regulate the expression of the gene. It becomes possible.
[0019]
For example, by bringing an arbitrary test substance into contact with cells transformed with a vector containing part or all of the gene mcd055 under appropriate conditions, it has the effect of promoting or suppressing the expression of the gene mcd055 of the test substance. Substances can be searched or evaluated. Examples of a part of the gene mcd055 include a DNA containing an expression control region, a 5 ′ untranslated region, a region near the translation start site, a part of the translation region, and the like of the mcd055 gene.
[0020]
In addition, by combining the DNA of the present invention with a known method, a transgenic animal can be prepared based on a mouse or other suitable animal. Further, by using the gene mcd055 of the present invention, it is possible to produce a so-called knockout animal in which the gene corresponding to mcd055 is disrupted from an animal other than human. By analyzing the physical, biological, pathological and genetic characteristics of this model animal, it becomes possible to elucidate the functions of the genes and proteins according to the present invention. Furthermore, by introducing the human mcd055 of the present invention into the animal in which the endogenous gene has been disrupted in this manner, a model animal having only human mcd055 can be produced. This model animal is useful for the development and evaluation of a drug targeting the introduced human mcd055.
[0021]
(Protein MCD055)
The protein MCD055 encoded by MCD055 is an immunosuppressive receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In particular, it is determined that the receptor is a novel immunosuppressive receptor belonging to the immunoglobulin superfamily based on the structural characteristics found in its amino acid sequence.
[0022]
MCD055 is a molecule consisting of 413 amino acids, and is a type I transmembrane protein having a transmembrane region. A total of three immunoglobulin domains spanning from 39 to 92 residues, 132 to 189 residues, 228 to 285 residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 2 to 24 residues, and 317 The motif GVVYSVV, which is presumed to be functionally equivalent to ITIM, exists in the region from residues 375 to 339 in the region of residues 375 to 339. The extent of these regions can vary somewhat depending on how the domains are defined, but it goes without saying that they are synonymous as long as they essentially refer to the same domain.
[0023]
Since the protein MCD055 of the present invention has an immunoglobulin domain in the extracellular domain and an ITIM in the intracellular domain, and is expressed in organs and cells directly involved in immunity such as spleen and leukocytes, It is determined to be an immunosuppressive receptor. The immunosuppressive receptor referred to here is expressed on the cell membrane of the immunocompetent cell, and ligands and antibodies bind to the extracellular domain, thereby inhibiting the phosphorylation of the intracellular activation signal protein. It refers to a molecule that suppresses the activities of immunocompetent cells such as cytokine production and cell proliferation. An antibody against the extracellular domain of the protein of the present invention is prepared, and expression of the antibody in an immunocompetent cell can be confirmed by a flow cytometer using the antibody. Further, a T lymphocyte cell line expressing the protein of the present invention is established, and a cytokine production stimulus is applied to the cell to measure the produced cytokine. Antibodies or peptides can be searched.
[0024]
A specific example is an IL-2 production test system using anti-CD3 stimulation as a cytokine production stimulus. The intracellular activation signal protein includes, for example, ERK-1 and ERK-2, but is not limited thereto as long as phosphorylation is regulated via MCD055. The stimulation of the protein of the present invention with a ligand or an agonistic antibody to produce an inhibitory signal in cells can be confirmed by suppressing phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase-1 (ERK-1) (Carreno et al., The Journal of Immunology vol.). .165 1352-1356 (2000)).
[0025]
Thus, MCD055 highly retains the features found in immunosuppressive receptors having an immunoglobulin domain, such as having an ITIM, while, as shown in FIG. 1, lung, liver, heart, activated leukocytes, It has features such as showing an expression profile specific to MCD055 that is expressed in leukocytes, spleen and trachea. This strongly suggests that MCD055 plays a characteristic role in the regulation of immune function that other immunosuppressive receptors do not. Therefore, it is expected that a pharmaceutical compound targeting MCD055 can be a pharmaceutical having characteristics which have not existed before.
[0026]
As long as it is an immunosuppressive receptor, a polypeptide or protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 2 is also within the scope of the present invention. Is within.
[0027]
Amino acid residue side chains, which are protein constituents, differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but are conserved in the sense that they do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein. Several highly relevant relationships are known. For example, for substitution of amino acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln) ), Aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala, lysine (Lys) and arginine (Arg), and the like. Ala, Val, Leu, Ile, Pro, methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), Gly, and Cys are all classified as nonpolar amino acids, and are considered to have similar properties. Can be Uncharged polar amino acids include Ser, Thr, Tyrosine (Tyr), Asn, and Gln. Acidic amino acids include Asp and Glu. Basic amino acids include Lys, Arg, and histidine (His). Furthermore, many mutations that do not lose the essential function of the protein even if the above-mentioned conservative property is impaired are well known to those skilled in the art. Furthermore, there are many cases in which the same type of protein conserved between different species retains its essential function even when some amino acids are deleted or inserted in a concentrated or dispersed manner. .
[0028]
Therefore, even if it is a mutant protein due to substitution, insertion, deletion, etc. on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, if it is an immunosuppressive receptor, these are said to be within the scope of the present invention. be able to. To be an immunosuppressive receptor, in other words, to have a function equivalent to that of the MCD055 protein of the present invention. Having the equivalent function means that the protein has at least one activity selected from the activity of inhibiting the phosphorylation of the intracellular activation signal protein, the activity of inhibiting the production of cytokines, and the activity of inhibiting the cell growth.
[0029]
Such amino acid alterations are found in nature, such as mutations caused by genetic polymorphisms, etc., as well as by methods known to those skilled in the art, for example, mutagenesis using a mutagen such as NTG, and various recombination methods. It can be performed artificially using a site-specific mutation method using a genetic technique. The mutation site and number of amino acids are not particularly limited as long as the mutant protein is an immunosuppressive receptor, but the number of mutations is usually within several tens of amino acids, preferably within ten amino acids, and more preferably within one or several amino acids. .
[0030]
In the present invention, MCD055 can be understood as a whole molecule having all the domain structures as described above, and can also be understood as a partial peptide holding a characteristic domain, particularly a domain responsible for binding ability to a ligand. In transmembrane proteins, partial fragments containing ligand-binding sites are released (or solubilized or soluble) as they are cleaved from other domains while retaining their characteristic steric structure. ) It has been previously reported that some may exist as partial peptides. Since such a partial peptide still retains the binding ability to a specific ligand, it becomes possible to search for a compound capable of binding to the protein using the partial peptide. It should be understood that the partial peptide in MCD055 is also substantially equivalent to the present invention as long as it has the ligand binding ability in this sense. In addition, soluble MCD055 regulates the immune response by competing with MCD055 (transmembrane type on the cell membrane), or soluble MCD055 itself functions as a ligand and binds to any receptor to regulate the immune response. It is also conceivable to exhibit the activity of A partial peptide having such an activity is also within the scope of the present invention. The activity of modulating the immune reaction of soluble MCD055 can be detected, for example, by the mixed lymphocyte reaction shown in Example 9. The activity of regulating an immune response specifically refers to a cytokine production regulating activity and / or a cell growth regulating activity.
[0031]
Preferred embodiments of the partial peptide include, for example, a peptide containing either an extracellular domain (25 to 316 aa of SEQ ID NO: 2) or an intracellular domain (340 to 413 aa of SEQ ID NO: 2). . It is predicted that a transmembrane region exists near the 317st to 339th amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (when the transmembrane prediction program SOSUI is used). The number of amino acid residues at which the domain is divided may vary to some extent depending on the prediction method of the domain to be used, but such a difference should be allowed. It is preferable that at least an immunoglobulin domain be included from the viewpoint of having a ligand binding ability or an activity of regulating an immune response. Further, from the viewpoint of having a signal transduction function, it is preferable to include at least an ITIM of an intracellular domain. As long as it contains at least one functional domain, all or part of the other domains may be linked, or may be a fusion protein with another protein or peptide.
[0032]
The functional domain is a partial peptide having a ligand binding ability, an activity for regulating an immune response, or a signal transduction function. Other polypeptides linked to the MCD055 partial peptide include, as long as the fusion protein has at least one activity selected from the group consisting of ligand binding ability as MCD055 or soluble MCD055, activity for regulating an immune response, and signal transduction function. There is no particular limitation. Preferred examples of such a fusion protein include, but are not limited to, a fusion protein with an immunoglobulin Fc fragment and a fusion protein with a histidine tag. In the case of IgG, the Fc fragment consists of a hinge region, a CH2 region and a CH3 region. Portions of the Fc fragment (eg, the hinge region, CH2 region, CH3 region, or CH4 region alone or in any combination) can also be used. The immunoglobulin in this case may be derived from any species, but is preferably derived from humans. Also, the class and subclass are not necessarily limited, and any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgE, IgD and the like can be used. For example, IgG is a preferable example.
[0033]
In some cases, a protein having a signal sequence in which the signal sequence has been cleaved functions as a mature protein. Therefore, it should be understood that the mature peptide obtained by removing the signal sequence from the protein of the present invention is substantially equivalent to the substance of the present invention. In the case of MCD055, the presence of a signal sequence is predicted near the 2nd to 24th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (when the transmembrane prediction program SOSUI is used). The range of the signal peptide region may vary slightly depending on the prediction program, and even if the protein is experimentally prepared, the signal peptide may be removed in a variety of ways. However, it is functionally equivalent to the MCD055 protein. As long as it is a substance equivalent to the present invention, it should be understood.
[0034]
The protein of the present invention or its partial peptide can be used for searching for a substance that regulates the activity of the protein. Compounds and the like obtained through the search are expected to be effective therapeutic or prophylactic agents for diseases associated with the protein of the present invention, for example, autoimmune diseases, immunodeficiencies, allergic diseases, inflammatory diseases, tumors, and the like. .
[0035]
(antibody)
The invention further provides an antibody that binds to MCD055. The antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes the entire MCD055 or a partial peptide thereof as an antigen, and includes a monoclonal antibody and / or a polyclonal antibody. It also belongs to any of the five classes (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) classified as immunoglobulin structure, physicochemical properties and immunological properties, or subclasses depending on the type of H chain. Is also good. Furthermore, F (ab ') when immunoglobulin is decomposed with, for example, pepsin 2 And fragments such as Fab when degraded with papain, or chimeric antibodies or humanized antibodies. Antibodies that not only specifically recognize MCD055 or its partial peptide, but also have the function of regulating the activity of MCD055 are included in the present invention. The antibody having a function of regulating the activity of MCD055 includes, for example, a neutralizing antibody that inhibits the binding between MCD055 and a ligand. These antibodies are useful for MCD055 research or clinical detection.
[0036]
(Antisense nucleic acid)
The present invention provides a so-called antisense nucleic acid capable of suppressing MCD055 biosynthesis at the nucleic acid level in a living body. Such an antisense nucleic acid includes a step of transcription from a genomic region necessary for producing mRNA encoding MCD055 to pre-mRNA, a step of processing pre-mRNA to mature mRNA, a step of transiting to the nuclear membrane, and a step of translation to protein. Any of these means a substance that binds to DNA or RNA that carries the genetic information and affects the normal flow of transmission of the genetic information to regulate the expression of the protein. It may be composed of a sequence having complementarity in a part. Preferably, it is a nucleic acid (including DNA and RNA) consisting of a sequence having a sequence equivalent to or complementary to the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. When the mRNA transcribed from the genomic region has an intron structure or a form containing a non-translated region at the 5′-end or 3′-end, an antisense nucleic acid having a sequence corresponding to or complementary to the sequence of the untranslated portion is also used. It will have the same function as the antisense nucleic acid of the invention.
[0037]
The antisense nucleic acid of the present invention includes not only DNA and RNA but also all derivatives having a three-dimensional structure and function similar to DNA or RNA. For example, a nucleic acid having another substance bound to the 3 ′ end or 5 ′ end, a nucleic acid having a substitution or modification in at least one of a base, a sugar and a phosphate of an oligonucleotide, a base not naturally occurring , A nucleic acid having a sugar or a phosphate, a nucleic acid having a skeleton (backbone) other than the sugar-phosphate skeleton, and the like. These nucleic acids are suitable as derivatives in which at least one of nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and binding strength is enhanced. That is, the form of the nucleic acid is not limited as long as it has a function of suppressing the activity expression of MCD055.
[0038]
Further, in the present invention, generally, a nucleotide sequence that hybridizes to a loop portion of mRNA forming a stem loop, that is, a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence of a region forming a stem loop Are preferred. Alternatively, antisense nucleic acids that bind to the vicinity of the translation initiation codon, ribosome binding site, capping site, or splice site, that is, antisense nucleic acids having a sequence complementary to the sequence of these sites, are generally expected to have a high expression suppression effect. It is preferable because it can be performed.
[0039]
In order to incorporate such an antisense nucleic acid into cells and allow the antisense nucleic acid to act efficiently, the antisense nucleic acid of the present invention has a chain length of 15 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably Preferably has a base sequence consisting of 18 to 22 bases.
[0040]
The effect of suppressing the expression of the antisense nucleic acid of the present invention can be determined by a known method, for example, DNA containing the expression control region, 5 ′ untranslated region, the region near the translation start site or a part of the translated region of the gene of the present invention, luciferase, etc. And an in vitro translation reaction (Promega, Ribo max system, etc.) and an in vitro translation reaction (Promega, Rabbit Reticulocyte Lysate, etc.) It can be evaluated by adding a test substance to the system in an environment where the gene is transcribed or translated, and measuring the expression level of the reporter gene.
[0041]
Since the antisense nucleic acid of the present invention can suppress the expression of MCD055 in a living body, it is useful as an agent for preventing or treating a disease associated with MCD055.
[0042]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(Nucleic acid)
Examples of obtaining the DNA of the present invention from a DNA library include screening an appropriate genomic DNA library or cDNA library by a screening method using hybridization, an immunoscreening method using an antibody, etc. There is a method of growing clones and cutting them out using restriction enzymes and the like. Screening by the hybridization method involves screening a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof. 32 A probe is labeled with P or the like, and an arbitrary cDNA library is subjected to a known method (for example, Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Can be. As the antibody used in the immunoscreening method, the antibody of the present invention described later can be used. The novel DNA of the present invention can also be obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a genomic DNA library or a cDNA library as a template. In the PCR, a sense primer and an antisense primer are prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and an arbitrary DNA library is subjected to a known method (for example, Michael AI et al., PCR Protocols, a The DNA of the present invention can also be obtained by performing Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990) and the like. As the DNA library used in the above various methods, a DNA library having the DNA of the present invention is selected and used. Any DNA library can be used as long as it has the DNA of the present invention. A commercially available DNA library can be used, or a cDNA library can be prepared from cells having the DNA of the present invention. A cell library is prepared according to a known method (see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), and a cDNA library is prepared. Can be.
[0043]
Further, it can be prepared by a chemical synthesis method such as the phosphoramidite method based on the sequence disclosed in the present specification.
[0044]
The recombinant vector containing the DNA of the present invention may be in any form such as circular or linear. Such a recombinant vector may have, in addition to all or a part of the DNA of the present invention, another base sequence if necessary. A part is, for example, a DNA encoding a partial peptide of the protein of the present invention. The other nucleotide sequence is an enhancer sequence, a promoter sequence, a ribosome binding sequence, a nucleotide sequence used for the purpose of copy number amplification, a nucleotide sequence encoding a signal peptide, a nucleotide sequence encoding another polypeptide, It refers to a polyA addition sequence, a splicing sequence, a replication origin, a base sequence of a gene serving as a selection marker, and the like. One preferred example of the recombinant vector of the present invention is an expression vector.
[0045]
At the time of gene recombination, a translation initiation codon and a translation termination codon are added to the DNA of the present invention using an appropriate synthetic DNA adapter, or an appropriate restriction enzyme cleavage sequence is newly generated or eliminated in the nucleotide sequence. It is also possible. These are within the scope of work normally performed by those skilled in the art, and can be arbitrarily and easily processed based on the DNA of the present invention.
[0046]
Further, as the vector holding the DNA of the present invention, an appropriate vector depending on the host to be used may be selected and used. In addition to plasmids, various viruses such as bacteriophage, baculovirus, retrovirus, and vaccinia virus may be used. It is also possible to use, and there is no particular limitation.
[0047]
The gene of the present invention can be expressed under the control of a promoter sequence specific to the gene. If such an expression system is used, a search for a substance that promotes or suppresses transcription of the gene of the present invention can be performed more advantageously. Alternatively, another suitable expression promoter upstream of the gene of the present invention can be used by connecting to or replacing the promoter sequence specific to the gene. The promoter used in this case may be appropriately selected depending on the host and the purpose of expression. For example, when the host is Escherichia coli, the T7 promoter, lac promoter, trp promoter, λPL promoter, etc., and the host is yeast. In some cases, PHO5 promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like can be exemplified. When the host is an animal cell, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, elongation factor 1α (Elongation Factor 1α) promoter and the like can be exemplified. It is not limited to.
[0048]
Methods for introducing DNA into vectors are known (see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). That is, the DNA and the vector may be digested with appropriate restriction enzymes, and the obtained fragments may be ligated using DNA ligase.
[0049]
(protein)
The protein of the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein, and can also be prepared by a chemical synthesis method using a peptide synthesizer (for example, peptide synthesizer 433A, manufactured by Applied Biosystems Japan). Alternatively, it can be prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotes or eukaryotes. However, from the viewpoint of its purity, production by genetic engineering techniques and recombinant proteins are preferred.
[0050]
The host cell transformed with the recombinant vector of the preceding paragraph is not particularly limited. coli, B.E. subtilis or S. Many cells, such as lower cells, insect cells, COS7 cells, CHO cells, and animal cells represented by HeLa cells, which can be used in genetic engineering techniques represented by cerevisiae, can also be used in the present invention.
[0051]
The transformed cell of the present invention can be obtained by transforming a suitable host cell with the recombinant vector of the present invention. Examples of the method for introducing the recombinant vector described in the preceding paragraph into host cells include known methods such as electroporation, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, and method using virus particles (experimental methods). Extraordinary edition of medicine, Genetic Engineering Handbook, published on March 20, 1991, see Yodosha Co., Ltd.), but any method may be used.
[0052]
In order to produce the protein by genetic engineering, the above-mentioned transformed cells are cultured, a culture mixture is recovered, and the protein is purified. Culture of the transformed cells can be performed by a general method. Culture of the transformed cells can be performed by referring to various books (eg, “Microbial Experiment Method” edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Chemical Dojin, 1992).
[0053]
The method of purifying the protein of the present invention from the culture mixture can be carried out by appropriately selecting an appropriate method from methods generally used for protein purification. That is, various affinity chromatography such as salting-out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and antibody chromatography, chromatofocusing method, adsorption An appropriate method may be appropriately selected from commonly used methods such as chromatography and reverse phase chromatography, and if necessary, purification may be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like.
[0054]
Further, the protein of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein or tag (eg, glutathione S-transferase, protein A, hexahistidine tag, FLAG tag, etc.). The expressed fusion form can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin, enterokinase, etc.), and in some cases, the preparation of the protein can be performed more advantageously. The protein of the present invention may be purified by appropriately combining general techniques known to those skilled in the art. In particular, when expression is performed in the form of a fusion protein, it is preferable to employ a purification method characteristic of the form.
[0055]
In addition, a method of obtaining a cell-free system using a recombinant DNA molecule by a cell-free synthesis method (J. Sambrook, et al .: Molecular Cloning 2nd ed. (1989)) is also one of the methods for production by genetic engineering. It is.
[0056]
As described above, the protein of the present invention can be prepared in its own form or in the form of a fusion protein with another kind of protein, but is not limited thereto. It is also possible to convert to For example, processing by various methods known to those skilled in the art, such as various chemical modifications to proteins, binding to a polymer such as polyethylene glycol, binding to an insoluble carrier, and the like can be considered. Further, depending on the host used, a difference is also observed in the presence or absence or degree of addition of a sugar chain. Even in such a case, as long as it functions as an immunosuppressive receptor, it should still be under the concept of the present invention.
[0057]
The protein of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, or can be used for screening a substance that binds to the protein or a substance that regulates the activity of the protein, and is useful.
[0058]
The MCD055 of the present invention is capable of highly expressing a target molecule on the cell surface by culturing the above-mentioned transformed cells, particularly animal cells. On the other hand, when an appropriate fragment such as an extracellular region protein fragment of MCD055 is produced as a soluble protein, a transformed cell is prepared as described above using the DNA encoding the extracellular region or each domain, and It can be produced by culturing the transformed cell and secreting it into the culture supernatant.
[0059]
On the other hand, when MCD055 is present in the periplasm or cytoplasm of the transformed cells, the cells suspended in an appropriate buffer are subjected to, for example, sonication, freeze-thaw treatment, or lysozyme treatment to perform cell wall and / or lysozyme treatment. Alternatively, after disrupting the cell membrane, a membrane fraction containing the protein of the present invention is obtained by a method such as centrifugation or filtration, and the membrane fraction is further solubilized using an appropriate surfactant to prepare a crude solution. I do. Then, the target protein can be isolated and purified from the crude solution by an ordinary method.
[0060]
(Mcd055 transgenic non-human animal)
The present invention provides mcd055 transgenic non-human animals. The mcd055 transgenic non-human animals include transgenic non-human animals and knockout non-human animals. In the mcd055 transgenic non-human animal, the degree of expression, the timing of expression, the expression site, and the like of the protein of the present invention are controlled by artificially integrating the gene encoding the protein of the present invention into the chromosome of the animal. It is characterized by the following. Non-human animals include, but are not limited to, for example, cows, sheep, goats, pigs, mice, horses, chickens, and the like. Among non-human animals, non-human mammals are preferred.
[0061]
By using the gene mcd055 of the present invention, a transgenic non-human animal can be produced. The transgenic non-human animal is prepared according to a standard method usually used in the production of transgenic animals (eg, Developmental Engineering Experiment Manual, published by Kodansha Scientific, edited by Motoya Katsuki, supervised by Tatsuji Nomura, 1987). can do. That is, the gene or the recombinant vector of the present invention is introduced into a fertilized egg of a non-human animal, the fertilized egg is generated into an individual, and an individual having the introduced gene integrated in the genome of somatic cells is selected.
[0062]
Specifically, for example, in the case of a transgenic mouse, a DNA constructed so that the mcd055 gene can be expressed is directly injected into a pronuclear stage fertilized egg obtained from a normal C57Black / 6 mouse. More specifically, a construct was prepared in which the mcd055 gene was connected downstream of an appropriate promoter and introduced, and then, if necessary, a linear DNA from which prokaryotic-derived sequences had been removed as much as possible was obtained. Is injected directly into the pronucleus at the pronuclear stage using a fine glass needle.
[0063]
The fertilized egg is transplanted into the uterus of another pseudopregnant mouse serving as a foster mother. Pseudopregnant mice are generally produced by mating ICR female mice with male mice whose vas deferens have been cut or ligated. Genomic DNA is extracted from the tissues of the pups derived from the transplanted embryo, and the presence or absence of the introduction of the MCD055 gene is confirmed by PCR or Southern blotting to obtain transgenic mice.
[0064]
In addition, a so-called “knockout mouse” can be prepared based on the nucleotide sequence of mcd055 (or a mouse homologous gene of mcd055). The “knockout mouse” in the present invention is a mouse in which an endogenous gene encoding a mouse-derived protein of the present invention has been knocked out (inactivated). For example, a positive negative selection method utilizing homologous recombination (US Pat. Nos. 5,464,764, 5,487,992, 5,627,059, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 8932-8935, 1989, Nature, Vol. 342, 435-438, 1989), and such a knockout mouse is also one embodiment of the present invention. In addition, in some cases, a gene disrupted animal of the present gene can be obtained as a result by a random gene disrupting method for an individual animal which has been widely practiced in recent years. An animal in which the disruption of the present gene has been revealed is an aspect of the present invention when the disruption of the gene is found, regardless of whether the disruption was performed with a specific purpose of the present gene.
[0065]
Alternatively, recently, it has become possible to produce cloned animals by nuclear transfer in medium and large animals. Along with this, the production of transgenic and knockout animals using this technology has also been actually performed. That is, based on the base sequence of mcd055 (or a homologous gene of mcd055 in each animal) to somatic cells or germ-line cells, homologous recombination is performed in the same manner as performed for ES cells, and A nucleus is obtained, and a cloned animal can be obtained using the nucleus. The animal is a knockout animal that has lost mcd055 (or the homologous gene of mcd055 in each animal). Alternatively, as in the above-described method, a transgenic animal can be produced by introducing the mcd055 (or a homologous gene of mcd055 in each animal) gene into any cell of any animal and using the nucleus to obtain a cloned animal. Is also possible. Such knockout and transgenic non-human animals are an aspect of the present invention, regardless of their species.
[0066]
(antibody)
The antibodies of the present invention can be obtained by referring to known methods for both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (for example, see Immunological Experiment Procedures, edited by the Japanese Society of Immunology, published by the Japan Society of Immunology). This will be briefly described below.
[0067]
In order to obtain the novel antibody, an animal is first inoculated with an appropriate antigen such as Freund's complete adjuvant (FCA) or incomplete adjuvant (FIA), if necessary, as an immunizing antigen. Boosters are given every 2 to 4 weeks. After the booster, blood is collected to obtain antiserum. The protein of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has a degree of purification that can be used for preparing an antibody. The partial polypeptide of the protein of the present invention can also be suitably used as an immunizing antigen. When the polypeptide used as the immunizing antigen is a low molecular weight polypeptide, that is, a polypeptide consisting of about 10 to 20 amino acids, it is bound to a carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) to form an antigen. Just use it. The animal to be immunized may be any animal, but is preferably a rat, a mouse, a rabbit, a sheep, a horse, a chicken, a goat, a pig, a cow, etc., which are usually used for immunological experiments by those skilled in the art. It is preferable to select and use an animal species that can produce the antibody.
[0068]
A polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum. Purification may be performed by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
[0069]
A monoclonal antibody is obtained as follows. That is, antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal, and fused with a myeloma cell line or the like by a known method using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse, etc., to produce a hybridoma. Thereafter, a clone producing an antibody that binds to the protein of the present invention may be selected and cultured, and the culture supernatant of the selected clone may be purified to obtain the clone. Purification may be performed by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
[0070]
The novel antibody can also be obtained by using a genetic engineering method. For example, mRNA is collected from spleen cells and lymphocytes of an animal immunized with the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof, or a hybridoma producing a monoclonal antibody against the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof, and a cDNA library is prepared based on the mRNA. Make a rally. A clone producing an antibody that reacts with the antigen is screened, the obtained clone is cultured, and the target antibody can be purified from the culture mixture by a combination of known methods. When antibodies are used for therapy, humanized antibodies are preferred in terms of immunogenicity. A humanized antibody can be prepared by immunizing a mouse in which the immune system has been replaced by a human (eg, Nat. Genet. 15; 146-156 (1997)). It can also be prepared by genetic engineering using the hypervariable region of a monoclonal antibody (Method in Enzymology 203; 99-121 (1991)).
[0071]
(Antisense nucleic acid)
Antisense nucleic acids can be produced by known methods (e.g., edited by Stanley T. Crooke and Bernard Lebleu, in Antisense Research and Applications, CRC Publishing, Florida, 1993). Natural DNA or RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by PCR using MCD055 as a template. Some derivatives such as a methylphosphonate type and a phosphorothioate type can be synthesized using a chemical synthesizer (for example, Expedite Model 8909, manufactured by Applied Biosystems Japan, Inc.). In this case, the antisense nucleic acid can also be obtained by performing an operation according to the manual attached to the chemical synthesizer, and purifying the obtained synthetic product by an HPLC method using reverse phase chromatography or the like. .
[0072]
When the DNA or antisense nucleic acid of the present invention is used as a diagnostic probe, it is labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like according to a known method. Next, DNA or mRNA is prepared from the sample by a known method, and the unreacted labeled probe is removed by using this as a test substance and reacting by adding the labeled probe. If the test substance contains the gene mcd055 or RNA, the antisense nucleic acid binds to them. The presence or absence of bond formation can be determined by using, as an index, light emission, fluorescence, radioactivity, or the like by a labeled enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, or radioisotope.
[0073]
When the DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention is used for pharmaceutical use, it is preferable to use a substance having a purity suitable for use as a pharmaceutical in a pharmacologically acceptable use method. .
[0074]
The DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention may be used by dissolving or suspending them directly in an appropriate solvent, or may be used by encapsulating them in liposomes or by incorporating them into an appropriate vector. May be. If necessary, a pharmacologically acceptable auxiliary component may be added and used in an appropriate dosage form such as an injection, a tablet, a capsule, an eye drop, a cream, a suppository, a spray, a poultice and the like. May be. Pharmaceutically acceptable auxiliary ingredients are solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients, buffers and the like.
[0075]
When the DNA, antisense nucleic acid or recombinant vector of the present invention is in the above-described dosage form, its administration method and dosage are set according to the patient's age, sex, disease type and degree. Can be used. That is, an amount suitable for improving the disease state is orally administered, or inhaled, transdermal, ophthalmic, vaginal, intraarticular, rectal, intravenous, topical, intramuscular, subcutaneous. An appropriate method such as intraperitoneal administration may be selected and administered.
[0076]
(Screening method)
The present invention relates to a protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, a DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, or mcd055 gene recombination. The present invention relates to a method for screening a substance that regulates the function or expression of the protein of the present invention, which comprises using a non-human animal. More specifically, (1) a test substance is prepared, and the test substance is brought into contact with the protein of the present invention or a transformed cell expressing the protein, whereby the test substance regulates the activity of the protein of the present invention. (2) preparing a test substance, and contacting the test substance with a recombinant vector containing the DNA of the present invention or a transformed cell transformed with the recombinant vector. And evaluating whether the test substance has an effect of regulating the expression of the mcd055 gene. As an example of (1), the activity of the protein of the present invention in the system shown in Example 7, 8 or 9 is measured in the presence / absence of a test substance, and the activity of the protein of the present invention is measured in the presence compared to the absence. And a method of selecting a test substance that increases or decreases the activity of the protein. As an example of (2), a recombinant vector is prepared by linking a reporter gene such as luciferase to DNA containing the expression control region, 5 ′ untranslated region, region near the translation start site or a part of the translated region of the mcd055 gene. However, a method for measuring the expression level of the reporter gene in an environment where the gene of the present invention is transcribed or translated in the presence / absence of a test substance and confirming the transcription promoting activity or the transcription repressing activity of the test substance is known. No. The screening method of the present invention includes the use of the protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, the DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the recombinant vector, or mcd055. A step of contacting the transgenic non-human animal with the test substance; a step of detecting whether there is a difference in the activity of the protein of the present invention or the expression level of the DNA of the present invention between the group to which the test substance is added and the group to which the test substance is not added. Selecting a test substance having a difference as a substance for regulating the activity of the protein of the present invention or a substance for regulating the expression of the DNA of the present invention. The substance having an activity of regulating the activity of the protein of the present invention may be any substance having an action of mimicking (mimic) or enhancing (agonist) or inhibiting (antagonist) the activity of MCD055 protein. The substance of the present invention that exerts the effect of regulating the expression of DNA may be any substance that has the effect of promoting or suppressing the expression of gene mcd055. Whether the test substance has the activity of regulating the activity of the protein of the present invention or the activity of regulating the expression of the DNA of the present invention depends on whether the test substance is added to a system capable of confirming the activity of the protein or a system capable of confirming the expression of the DNA. It is sufficient to check whether there is a difference in the protein activity or DNA expression level in the case of addition. The expression level of the DNA may be detected by any of the expression intensity of the mRNA of the mcd055 gene and the expression intensity of the protein. Further, instead of the expression level of the mcd055 gene or the MCD055 protein itself, the expression level of the reporter gene may be detected as an alternative. The reporter assay system refers to an assay system that uses an expression level of a reporter gene located downstream of an expression control region of a gene to be tested as an index to screen for a substance that acts on the expression control region. Examples of the expression control region include a promoter, an enhancer, a CAAT box, a TATA box and the like usually found in the promoter region. As the reporter gene, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, luciferase gene, β-galactosidase (β-galactosidase) gene and the like can be used. The expression control region and 5 ′ untranslated region of the gene of the present invention can be obtained by a known method (New Cell Engineering Protocol (Shujunsha), 1993). Having an inhibitory (or suppressing) effect or having an enhancing (or promoting) effect means that the measured value of the protein activity or DNA expression level is between the test substance added group and the test substance non-added group. Means that there is a difference. For example, the inhibition (or suppression) rate or the enhancement (or promotion) rate calculated by the following formula is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 70% or more, and particularly preferably. 90% or more.
[0077]
Inhibition (or suppression) rate or enhancement (or promotion) rate = (measured value of group without test substance-measured value of group with added test substance) / measured value of group without added substance x 100
[0078]
Here, whether the activity is inhibition or enhancement and the measured value are appropriately determined depending on the type of the system capable of confirming the activity of the protein or the system capable of confirming the expression of DNA. For example, when the system capable of confirming the activity of the protein is a system for measuring the activity of inhibiting cytokine production, the amount of cytokine production can be used as the measurement value. In the case of the cytokine production amount, it can be said that the test substance has an MCD055 protein activity inhibitory action. If the measurement system includes a background or noise value, it is needless to say that a value obtained by subtracting such a value is used as the measured value.
[0079]
Since the protein of the present invention is an immunosuppressive receptor, the compounds and the like obtained through the above-described screening method or search using transgenic animals may be used as autoimmune diseases, immunodeficiencies, allergic diseases, inflammatory diseases. It is expected that it will be an effective therapeutic or prophylactic agent for such as. Test substances include, but are not limited to, proteins, peptides, oligonucleotides, synthetic compounds, naturally occurring compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. May be.
[0080]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be understood that the present invention is limited to these Examples.
[0081]
Example 1 Cloning of gene mcd055
(1) Obtaining clone C-SPLEN 2010588
(1-1) Preparation of cDNA library and evaluation of full length
MRNA extracted as total RNA from human tissue spleen (Splen) was purchased in the form of total RNA (CLONTECH # 64034-1). Oligocap method [M. Maruyama and S.M. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)], and a cDNA library was prepared by a modified method (WO 01/04286). Using Oligo-cap linker and Oligo dT primer, as described in WO 01/04286, BAP (Bacterial Alkaline Phosphatases) treatment, TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase) treatment, RNA ligation of first-strand RNA and cDNA ligation of RNA Was done. Next, the DNA was converted into double-stranded cDNA by PCR (polymerase chain reaction) using 5 ′ and 3 ′ PCR primers, and cut with SfiI. Next, the cDNA fragment fractionated to 2 kb or more was cloned by determining the direction of the cDNA into a vector pME18SFL3 (GenBank AB009864, Expression vector), which had been cut with DraIII, to prepare a cDNA library. Oligo-cap linker, Oligo dT primer, 5 ′ and 3 ′ PCR primer sequences used were those described in WO 01/04286.
[0082]
With respect to the plasmid DNA of the clone obtained from these, the base sequence at the 5 'end of the cDNA was sequenced using a DNA sequencing reagent (BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, manufactured by PE Biosystems) according to the manual, followed by DNA sequencing. (ABI PRISM 3700, manufactured by PE Biosystems) was used to analyze the DNA base sequence. The data obtained was compiled into a database.
[0083]
The total length of the 5'-end of about 30,000 clones of a human spleen (Splen) cDNA library prepared by a modification of the oligocap method was determined by the following method. For all clones whose 5'-end sequence matches the known human mRNA in the public database, if the 5'-end is longer than the known mRNA sequence in the public database, or if the 5'-end is shorter but the translation initiation codon is Was determined to be "full length", and the case without the translation initiation codon was determined to be "non-full length". Based on this, the total length ratio of the 5'-end [number of full-length clones / (number of full-length clones + number of non-full-length clones)] was calculated. As a result, the total length ratio of the 5′-end was about 90%. From this result, it was found that the full length ratio of the 5′-end sequence of the clone from the obtained cDNA library was very high.
[0084]
(1-2) Selection of full length nucleotide sequence analysis clone and full length sequence analysis
The 5 ′ end sequence of the cDNA clone obtained as described above was subjected to a homology search by BLAST for data having GenBank and UniGene's complete cds, and those homologous to the human mRNA sequence were identified. Removed. Next, clustering was performed. If the homology was 90% or more and the consensus sequence was 50 base pairs or more, the groups were regarded as the same group, and a group was formed. A clone longer in the 5'-side of the group was selected to obtain a clone for which full-length nucleotide sequence analysis was performed.
[0085]
For the clones selected for full-length nucleotide sequence analysis, the nucleotide sequence of full-length cDNA was determined by an ordinary method. The full-length nucleotide sequence was determined so that the partial nucleotide sequences of both chains completely overlapped. C-SPPLE2010588 was obtained from it.
[0086]
Clone C-SPLE2010588 contains an open reading frame (ORF) consisting of a nucleotide sequence of 1239 bases represented by SEQ ID NO: 1, encoding a novel protein MCD055 consisting of 413 amino acids represented by SEQ ID NO: 2. And a cDNA consisting of a full-length 1997 base pair base sequence (SEQ ID NO: 3). This plasmid C-SPLE2010588 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, the International Microorganisms Depositary under the accession number FERM P-19165.
[0087]
(2) Analysis of base sequence and amino acid sequence of cDNA clone
(2-1) The amino acid sequence of MCD055 was analyzed using the HMMER program (R. Durbin, S. Eddy, A. Krog, G. Mitchison. Cambridge University Press, (1998).) In a Pfam database (http: // www. .Uk / Pfam /), a total of three immunoglobulin domains were found from 39 residues to 92 residues, 132 residues to 189 residues, and 228 residues to 285 residues.
[0088]
(2-2) transmembrane prediction program (Takatsugu Hirokawa, Seah Boon-Chieng and Shigeki Mitaku, SOSUI: Classification and Secondary Structure Prediction System for Membrane Proteins, Bioinformatics (formerly CABIOS) 1998 May; 14 (4): 378-379. As a result of transmembrane site prediction in (2), a transmembrane region was predicted at residues 2 to 24 and residues 317 to 339 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. From this, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, from Leu at the 2nd position to Thr at the 24th position was predicted as the signal peptide sequence. In addition, since the other transmembrane region was located at one position on the C-terminal side, it was predicted that the present protein would be present on the cell membrane surface with the N-terminal side facing out of the cell and the C-terminal side facing into the cell.
[0089]
(2-3) [IV] xYxx [LV] is generally known as an ITIM motif (J Immunol. Vol. 159 (5): 2075-7 (1997)), but is functionally equivalent to this motif. The motif GVVYSVV presumed to be from 375 to 381 residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was found.
[0090]
Example 2 Confirmation of Expression Profile by PCR
The tissue expression profile of mcd055 was analyzed by RT-PCR. The human RNA used for the analysis is as follows. MRNA was prepared from human coronary artery vascular endothelial cells (HCAEC) and human coronary artery vascular smooth muscle cells (CASMC) by a standard method. Further, mRNA was prepared by a standard method after culturing leukocytes derived from human peripheral blood in the presence or absence of 50 μg / ml PHA for 24 hours. Furthermore, human lung, kidney, pancreas, spleen, heart, adrenal gland, testis, trachea, fetal kidney, and brain mRNA were purchased from Clonetech, and large intestine mRNA was purchased from STRATAGENE. Total RNA from liver and small intestine was purchased from Clonetech, and mRNA was prepared by a standard method. Next, a single-stranded cDNA was synthesized from 0.12 μg of each mRNA using an oligo dT primer according to a standard method. As reverse transcriptase, SuperScript II RNAse H − Reverse Transcriptase (Invitrogen) was used. The sequences of the primers specific to mcd055 used in the PCR were sense primer mcd055-F1 (5′-GTG TTG TCT ACT CTG TGG TGC-3 ′) and antisense primer mcd055-R1 (5′-AGC ATC TCC CTC CCC). ATT CC-3 '). As a result of analysis, mcd055 was expressed in lung, liver, heart, activated leukocytes, leukocytes, spleen and trachea (FIG. 1).
[0091]
Example 3 Expression of soluble MCD055 protein (MCD055 extracellular domain)
The mcd055 gene was amplified by PCR and then incorporated into various expression vectors. An expression vector pIVEX2.4bNde (Roche Diagnostics Co., Ltd.) is used for expression by connecting a histidine tag to the N-terminal side of the protein, and an expression vector pIVEX2 is used to connect and express the histidine tag to the C-terminal side. .3d (Roche Diagnostics, Inc.) was used. The MCD055 protein is expressed in a cell-free system (Rapid Translation System: RTS) (Roche Diagnostics Co., Ltd.) in the form of a histidine tag, and then purified using a nickel column. In the transmembrane site search by SOSUI, the portion from Pro at position 317 to Ser at position 339 is a transmembrane site, and soluble MCD055 protein expresses from the first Met at the N-terminal side to Val at the 316th position. Let it.
[0092]
Example 4 Preparation of Anti-MCD055 Antibody
(1) Preparation of MCD055 Partial Peptide (Peptide Antigen) In order to prepare an antibody against the MCD055 partial peptide, the MCD055 partial peptide was dissolved in distilled water at 10 mg / ml, and 10 mg / ml maleimidated keyhole limpet hemocyanin ( PIERCE). After reacting at room temperature for 2 hours, desalting is performed with a NAP-10 column (Amersham Pharmacia Biotech). The protein concentration is calculated by using the KLH amount used divided by the liquid amount.
[0093]
(2) Preparation of MCD055 antibody
(2-1) Preparation of polyclonal antibody
In order to prepare a rabbit polyclonal antibody against MCD055, the prepared peptide antigens are each mixed at 40 μg to make 0.5 ml. Thereafter, it is mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (DIFCO) and administered subcutaneously to the back of the rabbit. Two weeks later, the same amount mixed with Freund's incomplete adjuvant (DIFCO) is administered, and two weeks later, blood is collected from the ear vein to prepare antiserum. Similarly, soluble MCD055 produced and purified in Example 3 is administered at 30 μg / body to prepare an antiserum.
[0094]
(2-2) Preparation of peptide antibody
20 μg of each peptide antigen arbitrarily selected and prepared from the amino acid sequence of MCD055 is dissolved in 100 μl of physiological saline, and mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant. BALB / c mice are intraperitoneally administered to a 5-week-old female, and two weeks later, 20 μg of the peptide antigen is dissolved in 100 μl of physiological saline, mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant, and similarly administered to the abdominal cavity. One week later, blood is collected from the fundus, and the increase in the antibody titer is confirmed by Western blotting. That is, the recombinant MCD055 protein is electrophoresed on a 4-20% SDS-polyacrylamide gel (TEFCO) and transferred to a PVDF membrane according to the method of Millipore. After the transfer, blocking is performed with a 0.076 M phosphate buffer (pH 6.4) containing 5% skim milk and 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as T-PBS). The collected antiserum is diluted 500-fold with T-PBS containing 0.5% BSA, and reacted with the transferred PVDF membrane at 4 ° C. overnight. The membrane is washed three times with T-PBS, and a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DAKO) is diluted 500-fold with T-PBS containing 0.5% BSA, and reacted with the membrane at room temperature for 1 hour. Thereafter, the membrane is washed three times with T-PBS, and then detected by ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Three days after the final administration of the antigen, lymphocytes were separated from splenocytes, mixed with Sp2 / O-Ag14 (ATCC No. CRL1581), mixed with Sp2 / O-Ag14 (ATCC No. CRL1581), and then mixed with polyethylene glycol using polyethylene glycol. Cell fusion is performed according to Mamoru and Takeshi Chiba, "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures" (Kodansha). Hybridomas are selected using HAT medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody are screened.
[0095]
The MCD055 extracellular domain produced and purified in Example 3 is diluted to 1 μg / ml using 0.01 M carbonate buffer (pH 9.5), and added to an immunoplate (Maxisorb, NUNC) at 50 μl / well. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and 100 μl of 0.076 M phosphate buffer (pH 6.4) containing 0.5% BSA (hereinafter referred to as PBS) was added to each well. Perform blocking. Next, the culture supernatant is added to each well, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween 20. A peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody is diluted 1000-fold with PBS containing 10% rabbit serum, and 50 μl is added to each well. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the plate is washed five times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween 20, and a tetramethylbenzidine solution containing 0.01% hydrogen peroxide is added to each well. After the reaction at room temperature for 10 minutes, the reaction is stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution. The absorbance at 450 nm is measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed). Based on this result, cells that react with the MCD055 extracellular domain are selected and cloned by the limiting dilution method. After 10 days, the same screening is performed to obtain a clone that produces an antibody that reacts with the MCD055 extracellular domain. The selected hybridoma is cultured in a 10% FCS / RPMI1640 medium (Invitrogen), and then cultured in a Hybridoma-SFM medium (Invitrogen) to produce an antibody. The antibody is purified using a Prosep-A column (Millipore).
[0096]
(2-3) Preparation of anti-MCD055 monoclonal antibody
BALB / c mouse (female, 6 weeks old) is intraperitoneally administered with 20 μg of purified MCD055 extracellular domain protein mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant. Two weeks after the first administration, 20 μg of the antigen is dissolved in physiological saline, mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant, and administered intraperitoneally. One week later, the increase in the antibody titer is confirmed by the method described in the above (2-2), and the final administration is performed. 100 μg of the antigen is administered to the abdominal cavity of the mouse, and three days later, the spleen is removed. Lymphocytes were separated from the spleen, and P3 × 63-Ag. 8. U.1 is mixed at a ratio of 10: 1, and cell fusion is performed using polyethylene glycol. Hybridomas are selected using the HAT medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody are screened. The anti-MCD055 antibody-producing well is screened by the method described in (2-2), the well that has reacted with the MCD055 extracellular domain is cloned by the limiting dilution method, and the screening is performed again to obtain an anti-MCD055 monoclonal antibody.
[0097]
The hybridoma is cultured in a 10% FCS / RPMI1640 medium (Invitrogen), and then cultured in a Hybridoma-SFM medium (Invitrogen) to produce an antibody. The antibody is purified using a Prosep-A column (Millipore).
[0098]
Example 5 Preparation of MCD055-Expressing Transformant
A transformant that stably expresses MCD055 is prepared by the following method. That is, 5 × 10 6 20 μg of the MCD055 expression plasmid and 1 μg of the Neomycin resistance gene expression plasmid (pcDNA3.1 (+); Invitrogen) are introduced into two Jurkat cells (clone E6.1; ATCC) by electroporation. Electroporation is performed at 300 V, 950 μF capacity using a Gene Pulser II system (BIO-RAD). Thereafter, selective culture is performed in a medium containing 0.3 mg / ml of G-418 (Invitrogen) to obtain a G-418 resistant clone. Next, the obtained resistant clone is analyzed by the flow cytometry method described in Example 6, and a clone expressing MCD055 is obtained.
[0099]
Example 6 Confirmation of MCD055 protein expression
The lymphocyte and leukocyte fractions prepared from spleen, peripheral blood, etc., and the expression of Jurkat T cells expressing the present protein in the cell membrane are confirmed by a flow cytometer. 10 to be tested 6 Each cell is suspended in 0.1 ml of PBS containing 0.1% BSA, 1 μg of an antibody against the extracellular domain of the protein of the present invention is added, and the mixture is reacted at room temperature for 30 minutes. The sample was centrifuged, washed three times with 2 ml of PBS containing 0.1% BSA, suspended in 100 μl of PBS containing 0.1% BSA, and 1 μg of FITC-labeled anti-mouse IgG antibody was added, followed by further 30 minutes at room temperature. Let react. After washing again three times with PBS containing 0.1% BSA, the cells were resuspended in 1 ml of 0.1% BSA PBS, and the proportion of FITC-positive cells contained in the resuspension was detected and calculated using a flow cytometer. I do.
[0100]
Example 7 Measurement of IL-2 production inhibitory activity of MCD055 protein antibody
2 × 10 4 in which the protein of the present invention was constantly expressed 5 Jurkat T cells are seeded in a 96-well plate. Culture overnight in a medium supplemented with 100 ng / ml doxycycline, then add anti-CD3 antibody-coated beads (bead number: Jurkat cell number = 1: 1) and anti-CD28 antibody 5 μg / ml for 48 hours After culturing, IL-2 contained in the culture supernatant is measured by ELISA. An antibody against the protein of the present invention is added simultaneously with the addition of anti-CD3 antibody beads and anti-CD28 antibody, and the effect on IL-2 production is examined.
[0101]
Example 8 Inhibition of phosphorylation by MCD055 protein antibody
1 × 10 5 in which the protein of the present invention was expressed by adding doxycycline 7 Anti-CD3 antibody beads (bead number: Jurkat cell number = 1: 1) and 5 μg / ml of soluble anti-CD28 antibody were added to the Jurkat cells, and after 10 minutes, the cells were washed once with PBS containing sodium orthovanadate and then 500 μl Lysis buffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 5 mM EDTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml aprotinin, 25 μg / ml nitrophenyl-p '-Guanidino-benzoate) and let stand on ice for 30 minutes. After performing SDS electrophoresis on the cell lysate thus obtained, the cell lysate is transferred to a PVDF membrane, and subjected to Western blotting using an anti-active MAPK antibody to detect phosphorylated ERK1 / ERK2. Antibodies to the present invention are added simultaneously with anti-CD3 antibody beads and anti-CD28 antibody, and the effect on ERK1 / ERK2 phosphorylation is examined.
[0102]
Example 9 Measurement of extracellular domain activity
Peripheral blood lymphocytes (PBMC) prepared from the blood of two unrelated donors (A, B) were mixed with RPMI1640 supplemented with 5% fetal bovine serum at 1 × 10 5 6 cells / ml, 100 μl of the PBMC suspension derived from A and the PBMC suspension derived from B were added to a 96-well plate at 37 ° C. and 5% CO 2. 2 Incubate for 5 days in the incubator. The MCD055 extracellular domain prepared in Example 3 is added at 10 μg / ml simultaneously with the addition of lymphocytes. Thereafter, 20 μl of bromodeoxyuridine (BrdU) adjusted to 100 μM in a medium is added, and the cells are cultured for 24 hours. The cells were sedimented by centrifugation at 300 g for 10 minutes, the supernatant was removed, 200 μl of FixDenat (Roche) was added, and the mixture was left to stand for 30 minutes. Let stand at room temperature for 90 minutes. After washing three times with PBS, 100 μl of tetramethylbenzidine (TMB) was added to develop color. After 5 to 30 minutes of color development, 25 μl of 1 M sulfuric acid is added to stop the reaction, and OD450 nm fluorescence measurement is performed.
[0103]
【The invention's effect】
The MCD055 of the present invention is a protein that can be a cause of the onset or progression of a disease due to abnormal immune function, and is used for inflammation such as autoimmune disease, immunodeficiency, allergic disease, vasculitis, hepatitis, and septic shock. It is extremely useful in the development of drugs for preventing or treating sexual diseases, tumors, and the like.
[0104]
The gene mcd055 can be used as an antisense drug and in gene therapy. The protein MCD055 is useful as a soluble protein drug by itself or by preparing a soluble fragment thereof (extracellular region or each domain). is there. Further, an antibody reactive with MCD055 or a fragment thereof and a part of the antibody are useful as an antibody drug that controls MCD055 function in a living body.
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a tissue expression profile of mcd055 by RT-PCR.
Claims (10)
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫抑制性受容体。The following protein (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) an immunosuppressive receptor consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which amino acids are deleted, substituted or added.
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ免疫抑制性受容体をコードするＤＮＡ；
（ｃ）請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡDNA according to any one of the following (a) to (c):
(A) a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes an immunosuppressive receptor;
(C) a DNA encoding the protein of claim 1;
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Legal Events
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| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060307 |