JP2003199596A - 硫酸化フカンオリゴ糖 - Google Patents
硫酸化フカンオリゴ糖Info
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Abstract
assifolia)などのコンブ目海藻由来である新
規な硫酸化多糖を分解する硫酸化フカン分解酵素を、硫
酸化フカンに作用させて得られる、構造が均一な低分子
化物及びその製造方法を提供すること。 【解決手段】 硫酸化フカン分解酵素を用いて、コンブ
目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解し、糖鎖工学用試
薬として利用できる、構造の均一な硫酸化フカンオリゴ
糖、該硫酸化フカンオリゴ糖を製造する方法。
Description
いて有用な硫酸化フカンオリゴ糖、及びその製造方法に
関する。
れている。これらの多糖はフコイダンあるいはフコイジ
ンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海
藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコン
ブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれか
ら抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ(例えば、
非特許文献1参照。)。そのため、硫酸化多糖を酵素的
に分解してそのオリゴ糖を得たりその構造を決定したり
するにはそれぞれを分解する酵素を取得する必要があ
る。
ン(例えば、特許文献1参照。)、硫酸化フコグルクロ
ノマンナン(例えば、特許文献2参照。)、硫酸化フコ
ガラクタン(例えば、特許文献3参照。)等、またそれ
らの他にも何種類もの分子種(例えば、特許文献4参
照。)が報告されている。硫酸化フカン画分には強い抗
凝血活性(例えば、特許文献1参照。)、硫酸化フコグ
ルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス
誘導活性(例えば、特許文献5参照。)が報告されてい
るなど、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つこ
とが多い。
その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を
分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利
である。しかしながら褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵
素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海
藻の種によって異なることが多いため、1種類の硫酸化
多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解
する分解酵素が必要となる。コンブ目海藻由来の硫酸化
多糖の構造が研究されているが、多くの分子種のうち数
種類の構造が判明しているに過ぎない(例えば、特許文
献6、7、非特許文献2、3、4参照。)。
ット
ット
ット
ット
ット
とインダストリー」、2002年6月、第60巻、第6
号、p.377−380
1998年8月、第26巻、第8号、p.1211−1
215
学」、1996年2月、第43巻、第2号、p.143
−148
外8名、「グリココンジュゲート・ジャーナル(Gly
coconjugate Journal)」、第16
巻、p.19−26
ブ目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する酵素、すな
わち硫酸化フカンを特異的に分解する酵素を使用して酵
素的に製造した構造が均一な硫酸化フカンオリゴ糖が求
められていた。すなわち、本発明の目的は、コンブ目海
藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する硫酸化フカン分解
酵素を硫酸化フカンに作用させて得られる低分子化物及
びその製造方法を提供することにある。
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フ
カン又はその塩に関する。 (1)構成糖:フコースを含有し、(2)下記一般式
(I)で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする:
1つはSO3Hであり、nは1以上の整数である)、
(3)Alteromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分
解酵素により低分子化され、下記一般式(II)、(I
II)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XV
I)で表される化合物より選択される1種類以上の化合
物が生成する:
1つはSO3Hである。)
中、nが1〜5であることを特徴とする硫酸化フカンオ
リゴ糖に関する。
つはSO3Hである。)
は第2の発明の硫酸化フカンにAlteromonas sp. SN-10
09由来の硫酸化フカン分解酵素を作用させてその分解物
を採取することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の調
製方法に関する。本発明の第3の発明において、上記硫
酸化フカンはガゴメ(Kjellmaniella crassifolia)、
マコンブ(Laminaria japonica)、あるいはレッソニア
ニグレッセンス(Lessonia nigrescens)由来であっ
てもよい。
明の方法で調製される硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
I)、(III)、(XIII)、(XIV)、(X
V)、(XVI)から選択される化学構造を有する硫酸
化フカンオリゴ糖またはその塩に関する。
1つはSO3Hである。)
硫酸化フカン分解酵素を用いて、コンブ目海藻由来の新
規な硫酸化多糖を分解し、糖鎖工学用試薬として利用で
きる、構造の均一な硫酸化フカンオリゴ糖を製造する方
法を見出し、また、それらのオリゴ糖の構造を決定し本
発明を完成させた。
する。
えば、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンを使用すること
ができる。該多糖は硫酸基とフコースを主要構成成分と
する。また、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンの主鎖は
一般の糖よりも酸に対して弱いL−フコースからなるた
め、加熱や酸処理により容易に低分子化することができ
る。
化フカンを使用することができる。その由来は特に限定
されるものではないが、例えば、ガゴメ(Kjellmaniell
a crassifolia)、マコンブ(Laminaria japonica)、
あるいはレッソニア ニグレッセンス(Lessonia nigre
scens)等コンブ目の海藻は硫酸化フカンの含有量が多
く原料として好適である。
化フカン及び硫酸化フカンオリゴ糖などに作用してフコ
ースとフコースの間のα−L−フコシル結合をエンド的
に加水分解し、還元性末端にL−フコースを持つオリゴ
糖を生成させる。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖とは、
硫酸化フカンに本発明の硫酸化フカン分解酵素を作用さ
せて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がL−フコ
ースである。
際にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、pHは4〜
9、温度は100℃以下が好ましい。また、上記抽出液
中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過により効率
良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も
有効である。
得ることができる。該画分を硫酸化フカン画分として例
えば本発明の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用可
能である。該画分を陰イオン交換カラムにより分離すれ
ばより純度の高い硫酸化フカンを得ることもできる。上
記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫
酸化フカンもともに本発明の硫酸化フカンオリゴ糖製造
時の原料として使用できる。
般式(I)に表される。下記一般式において、nは1以
上の整数であり、例えば1〜20,000の範囲、さら
に好ましくは1〜10,000の範囲のものが本発明の
硫酸化フカンに含まれる。また、本発明の硫酸化フカン
には、上記範囲であれば、下記一般式(I)が連続的に
繰り返した構造を持つもの、及び他の構造が介在して、
非連続的に下記一般式(I)が含有される構造を持つも
ののいずれもが含まれる。
つはSO3Hである。)
産する菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディタ
ーミネィティブ バクテリオロジー(Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology)、第9巻(199
4)に記載の基本分類によればアルテロモナス属細菌に
分類される。しかしながらアルテロモナス属細菌は近年
分類の再編成が行われており、細菌学的性質のみで分類
するのは適当ではない。そこで、本菌株の16S rD
NAの塩基配列を決定し、既知の細菌と相同性を比較し
たところ最も相同性が高い細菌はThalassomonas属であ
った。しかしながらその遺伝距離は0.05(change/av
erage nucleotide position)以上であり、同属とは判定
できなかった。そこで、本発明者らは、16S rDN
A配列の相同性から、本菌株は既知の属に属さない新属
の細菌であると断定し、本菌株をフカノバクター リィ
ティカス SN−1009と命名した。本明細書におい
て、アルテロモナス sp.SN−1009(Alteromo
nas sp. SN-1009)は、フカノバクター リィティカス
SN−1009と同じものである。
09として、〒305−8566日本国茨城県つくば市東
1−1−1中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターにFERM BP−5747とし
て、平成8年2月13日(原寄託日)より寄託され、ブ
タベスト条約に基づき平成8年11月15日(移管日)
より国際寄託されている。配列表の配列番号1に本菌株
の16S rDNAの配列を示す。
カノバクター リィティカス SN−1009と同属と
判断される細菌を培養して本発明に使用する硫酸化フカ
ン分解酵素を製造することができる。また、本発明にお
いては、上記Alteromonas sp. SN-1009株の他にAltero
monas sp. SN-1009株の自然的又は人工的変異株、その
他アルテロモナス属、フカノバクター属に属する菌種等
であって、本発明に使用する硫酸化フカン分解酵素生産
能を有する微生物を利用することができる。本発明で用
いる硫酸化フカン分解酵素は、上記微生物より実施例1
記載の方法で取得することができる。
フカン分解酵素を硫酸化フカン含有物に作用させること
によって調製することができる。硫酸化フカン含有物と
しては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、褐藻類由来
の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出
物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
にあたり、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物
の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の
硫酸化フカン、若しくは該硫酸化フカン含有物はその最
高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用
する本発明の硫酸化フカン分解酵素の量を考慮して選定
すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝
液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のpHは
通常中性付近で、酵素反応は通常30℃付近で行う。反
応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の配合比率
や使用量、反応液の組成、反応時間等を調整することに
よって、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整すること
もできる。上記の様にして得られた本発明の硫酸化フカ
ンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムに
より分画することによって、更に均一な分子量あるいは
均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を
調製することができる。分子量分画は通常よく使用され
ている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や
分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に
応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操
作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、
凍結乾燥処理をすることもできる。この方法により、後
述するごとく、NMR分析により構造決定可能な均一な
構造の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を得ることができ
る。
特に限定はされないが例えば、下記一般式(II)、
(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、
(XVI)から選択される化学構造を有する硫酸化フカ
ンオリゴ糖またはその塩が例示される。
1つはSO3Hである。)
を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩
を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩にな
った状態が安定であり、通常ナトリウム及び/又はカリ
ウム及び/又はカルシウム等の塩の形態で提供される。
これらの物質の塩はダウエックス50W等の陽イオン交
換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化フ
カンオリゴ糖に導くことが可能である。また、これら
は、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、
マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウ
ム等の塩が挙げられる。
鎖工学用試薬として使用することができる。例えば、特
公平5−65108号公報記載の方法により2−アミノ
ピリジル化(PA化)を行い、該オリゴ糖のPA−化物
を調製すれば、硫酸化フカンオリゴ糖の蛍光標識標準物
質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有
用な物質を提供することができる。
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。本実施例において硫酸化フカンオリゴ糖の分
子量は、質量分析結果から算出された平均分子量であ
る。
装着させたカッターミル(増幸産業社製)で破砕し、2
0リットルの80%エタノール中に懸濁後25℃で3時
間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを40リット
ルの100mM塩化ナトリウムを含む30mMリン酸緩
衝液(pH6.5)に懸濁し、95℃で2時間処理後、
穴径106μmのステンレス製ふるいでろ過した。得ら
れたろ液に200gの活性炭、4.5リットルのエタノ
ール、12,000Uのアルギン酸リアーゼK(ナガセ
生化学工業社製)を添加し、25℃で20時間攪拌後、
遠心分離した。得られた上清を排除分子量10万のホロ
ファイバーを装着させた限外ろ過機で4リットルに濃縮
後、遠心分離により不溶物を除去し5℃で24時間放置
した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上
清を限外ろ過機により100mM塩化ナトリウムに溶媒
置換した。この溶液を4℃以下に冷却後、塩酸によりp
Hを2.0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のpHを水酸化ナトリウムにより8.
0とし、4リットルに濃縮後、限外ろ過機により20m
M塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液中の不溶物
を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ガゴメ由来フコ
イダンの乾燥物76gを得た。
ナトリウムと10%エタノールを含む20mMイミダゾ
ール塩酸緩衝液(pH8.0)700mlに溶解し、遠
心分離により不溶物を除去した。得られた上清を、同緩
衝液で平衡化したDEAE―セルロファインA−800
カラム(11.4×48cm)にかけ、同緩衝液で洗浄
後、50mMから1.95Mの塩化ナトリウム濃度勾配
により溶出させた。溶出液は250mlずつ分取した。
各フラクションの総糖量をフェノール硫酸法により、ウ
ロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した。溶出順
に、フラクション43−49、50−55、56−67
の画分をまとめ、それぞれを電気透析により脱塩後凍結
乾燥し、フラクション43−49から340mg、50
−55から870mg、56−67から2.64gの乾
燥物を得た。フラクション56−67から得た画分を硫
酸化フカン画分とした。
定方法 12μlの2.5%の硫酸化フカン画分溶液と、60μ
lの50mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.5)
と、9μlの4M塩化ナトリウムと、6μlの1M塩化
カルシウムと、21μlの水と、12μlの本発明の硫
酸化フカン分解酵素溶液とを混合し、30℃で3時間反
応させた後、反応液を100℃で10分間処理し、遠心
分離後100μlをHPLCにより分析し、低分子化の
程度を測定した。対照として、硫酸化フカン分解酵素溶
液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用
いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水
を用いて反応させたものを同様にHPLCで分析した。
反応系において1分間に1μmolの硫酸化フカンのフ
コシル結合を切断する酵素量とした。硫酸化フカン分解
酵素活性は下記式により求めた。 {(12×1000×2.5/100)/MG}×
{(MG/M)−1}×{1/(180×0.01
2)}=U/ml 12×1000×2.5/100:添加した硫酸化フカ
ン画分(μg) MG:基質硫酸化フカンの平均分子量 M:反応生成物の平均分子量 (MG/M)−1:1分子の硫酸化フカンが酵素により
切断された部位の数 180:反応時間(分) 0.012:酵素液量(ml)
m、昭和電工社製) 溶離液:5mMのアジ化ナトリウムを含む50mMの塩
化ナトリウム 検出:視差屈折率検出器(Shodex RI−71、
昭和電工社製) 流速:1ml/分 カラム温度:25℃
市販の分子量既知のプルラン(STANDARD P−
82、昭和電工社製)を上記のHPLC分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線と
した。また、蛋白質の定量は、酵素液の280nmの吸
光度を測定することにより行った。その際1mg/ml
の蛋白質溶液の吸光度を1.0として計算した。
例1の方法で調製したフコイダン0.2%とペプトン
0.3%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー製)
pH8.2からなる培地4mlを120℃、20分間オ
ートクレーブ処理した培地に接種し、25℃で24時間
培養して種培養液とした。グルコース 0.25%、ペ
プトン 1%、酵母エキス 0.05%及び消泡剤(K
M70、信越化学工業製)を含む人工海水pH8.2か
らなる培地600mlを2リットルの三角フラスコに入
れ、120℃、20分間オートクレーブ処理した培地に
上記の種培養物を接種した、25℃で20時間培養した
ものを、ペプトン 1%、酵母エキス 0.02%及び
消泡剤(KM70、信越化学工業製)を含む人工海水p
H8.2からなる培地20リットルを30リットルのジ
ャーファーメンターに入れ、120℃、20分間オート
クレーブ処理した培地に、参考例1の方法で調製したフ
コイダンを100℃、20分間処理したものを混合し、
上記の種培養物を接種した。培養は25℃で28時間行
った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養
上清を得た。
ファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、1
0mM 塩化カルシウム及び150mM 塩化ナトリウ
ムを含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH8.2)に
溶媒置換し、遠心分離して上清を得た。
リットルのDEAE−セルロファインA−800のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、150mMから400
mM塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液
を63mlずつに分画し、活性画分を集めた。
ファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、1
0mM 塩化カルシウム及び100mM 塩化ナトリウ
ムを含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH8.2)に
溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した
200ml DEAE−セルロファインA−800のカ
ラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、100mMから30
0mM塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出
液を19mlずつに分画し、活性画分を集めた。
ろ過膜を装着させた限外ろ過装置により濃縮後、4Mと
なるように塩化ナトリウムを添加し、100mM 塩化
カルシウム及び4M 塩化ナトリウムを含む20mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したフェニル
セファロースCL−4Bのカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、4Mから1M 塩化ナトリウムの濃度勾配によ
り溶出させ、溶出液を9.4mlずつに分画した。こう
して硫酸化フカン分解酵素の精製物を得た。
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 (1)調製 養殖したガゴメ乾燥物200gを10リットルの45m
M 塩化カルシウムと500mM 塩化ナトリウムと9
% エタノールを含む18mM イミダゾール塩酸緩衝
液(pH7.0)にひたし、硫酸化フカン分解酵素を3
0U添加し、室温で2日間攪拌後、ろ紙でろ過し排除分
子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を
用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分
1とした。
1を脱塩装置(マイクロアシライザー G3、旭化成工
業製)により脱塩後、ロータリーエバポレーターで濃縮
した。この硫酸化フカンオリゴ糖溶液1に10mMとな
るようにイミダゾールを、300mMとなるように塩化
ナトリウムを添加し、300mM 塩化ナトリウムを含
む10mM イミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)
で平衡化した1リットルのDEAE−セルロファインA
−800のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、3
00mMから1200mMの塩化ナトリウムの濃度勾配
により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総
糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾ
ール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクション
の中には少なくとも4個の明瞭なピークが存在していた
のでそれぞれのピーク部分について質量分析を行った。
また、各ピークの糖組成を調べたところフコースのみ
で、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる各
質量のオリゴ糖は表1に示すような組成のものと考えら
れた。
め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、下記の条
件で精製した。 カラム:YMC Pack PolyamineII
(20×250mm、YMC社製) 流速:8ml/分 カラム温度:30℃ 平衡化溶液:10%のアセトニトリルを含む0.5M
リン酸2水素ナトリウム 溶出溶液:10%のアセトニトリルを含む0.5M リ
ン酸2水素ナトリウムから10%のアセトニトリルを含
む1.5M リン酸2水素ナトリウムの濃度勾配によ
る。但し、ピーク番号1−(4)に関しては、10%の
アセトニトリルを含む787.5mM リン酸2水素ナ
トリウムから10%のアセトニトリルを含む1462.
5mM リン酸2水素ナトリウムの濃度勾配による。 分取:1本あたり4ml 検出:フェノール硫酸法による
取したフラクションについて質量分析を行ったところ、
ピーク番号1−(1)からは質量1914の物質が、ピ
ーク番号1−(2)からは質量2264の物質が、ピー
ク番号1−(3)からは質量2366の物質が、ピーク
番号1−(4)からは質量3460の物質がそれぞれ主
ピークとして得られた。各ピーク部分を集め、10%
エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25
のカラムにかけ、10% エタノールで溶出して脱塩し
た。こうして本発明の硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)
〜(4)を得た。
ゴ糖1−(1)〜(4)について、2−アミノピリジン
を用いた蛍光標識法により還元末端糖及び糖組成の分析
を行ったところ、オリゴ糖1−(1)〜(4)の還元性
末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫酸
含量(塩化バリウムを用いた比濁法による)、ウロン酸
含量(カルバゾール−硫酸法による)を測定した。ま
た、JNMα−500型核磁気共鳴装置(日本電子社
製)を用いてNMR分析を行った。分析試料は定法によ
り重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式
は、1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて
行った。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及
びHOHAHA法を13C−NMRの帰属にはHSQC
法を用いた。
を示す。 (a)オリゴ糖1−(1)の物性 質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、本
発明の硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)の1H−NMR
スペクトルを図1に、13C−NMRスペクトルを図2
に、マススペクトルを図3にそれぞれ示した。図1、図
2において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト
値(ppm)を示す。また、図3において、縦軸は相対
強度を、横軸は、m/z値を示す。 分子量;1914 MS m/z 455.0[M−4Na+]4−、61
4.8[M−3Na+] 3−、933.8[M−2Na
+]2− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表2
及び表3に示す。
の帰属の番号は下記式(IV)の通りである。
発明の硫酸化フカンオリゴ糖1−(2)の1H−NMR
スペクトルを図4に、13C−NMRスペクトルを図5
に、マススペクトルを図6にそれぞれ示した。図4、図
5において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト
値(ppm)を示す。また、図6において、縦軸は相対
強度を、横軸は、m/z値を示す。 分子量;2264 MS m/z 354.2[M−6Na+]6−、42
9.8[M−5Na+] 5−、543.0[M−4Na
+]4−、731.6[M−3Na+]3− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表
4、表5に示す。
の帰属の番号は下記式(V)の通りである。
開第00/62785号パンフレット、実施例1−
(2)記載の方法で、HGF産生誘導活性を調べたとこ
ろ、当該活性が確認できた。
リゴ糖1−(3)の1H−NMRスペクトルを図7に、
13C−NMRスペクトルを図8に、マススペクトルを
図9にそれぞれ示した。図7、図8において縦軸はシグ
ナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。
また、図9において、縦軸は相対強度を、横軸は、m/
z値を示す。 分子量;2366 MS m/z 371.4[M−6Na+]6−、45
0.3[M−5Na+] 5−、568.6[M−4Na
+]4−、765.7[M−3Na+]3− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表6
及び表7に示す。
ルの帰属の番号は下記式(VI)の通りである。
リゴ糖1−(4)の1H−NMRスペクトルを図10
に、13C−NMRスペクトルを図11に、マススペク
トルを図12にそれぞれ示した。図10、図11におい
て縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(pp
m)を示す。また、図12において、縦軸は相対強度
を、横軸は、m/z値を示す。 分子量;3460 MS m/z 409.6[M−8Na+]8−、47
1.4[M−7Na+] 7−、553.8[M−6Na
+]6−、669.3[M−5Na+]5−、842.
3[M−4Na+]4−、1130.8[M−3N
a+]3− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表8
〜表10に示す。
ルの帰属の番号は下記式(VII)の通りである。
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 (1)調製 養殖したガゴメ乾燥物を穴径1mmのスクリーンを装着
させたカッターミル(増幸産業製)を用いてチップとし
た。250gのガゴメチップを5リットルの80%エタ
ノールに懸濁し、室温で2時間攪拌後、ろ過した。この
80% エタノール洗浄を4回繰り返しガゴメチップ洗
浄物を得た。ガゴメチップ洗浄物 250gを5リット
ルの125mM 塩化カルシウムと250mM 塩化ナ
トリウムと10% エタノールを含む17mM イミダ
ゾール塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、室温で24
時間攪拌後、ろ過、遠心分離して、ガゴメフコイダン溶
液を得た。この抽出液1リットルに、硫酸化フカン分解
酵素を10U添加し室温で3日間攪拌後、ろ紙でろ過
し、ろ液を遠心分離して上清を得、排除分子量1万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子
画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分2とした。
2を、100mM 塩化ナトリウムを含む10mM イ
ミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.5)で平衡化した1
リットルのDEAE−セルロファインA−800のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、100mMから1
Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出
させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸
法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定し
た。その結果、溶出フラクションは2個のピークを形成
したのでそれぞれのピーク部分について質量分析を行っ
た。また、各ピークの糖組成を調べたところフコースの
みで、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる
各質量のオリゴ糖は表11に示すような組成のものと考
えられた。
め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、実施例2
−(2)と同じ条件で精製した。YMC パック ポリ
アミンII カラムを用いたクロマトグラフィーにより分
取したフラクションについて質量分析を行ったところ、
ピーク番号2−(1)からは、質量1914及び201
6の物質が、ピーク番号2−(2)からは質量3110
の物質がそれぞれ主要ピークとして得られた。これら、
質量1914、2016、及び3110の物質を含むピ
ーク近辺のフラクションを集め、10%エタノールで平
衡化させたセルロファインGCL−25のカラムにか
け、10%エタノールで溶出して脱塩した。こうして本
発明の硫酸化フカンオリゴ糖2−(1)−1、2−
(1)−2、及び2−(2)を得た。
ゴ糖2−(1)−1、2−(1)−2、及び2−(2)
について、2−アミノピリジンを用いた蛍光標識法によ
り還元性末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、還元
性末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫
酸含量(塩化バリウムを用いた比濁法による)、ウロン
酸含量(カルバゾール−硫酸法による)を測定した。ま
た、JNM α−500型核磁気共鳴装置(日本電子社
製)を用いてNMR分析を行った。構成糖の結合様式
は、1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて
行った。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及
びHOHAHA法を、13C−NMRの帰属にはHSQ
C法を用いた。以下に本発明の硫酸化フカンオリゴ糖2
−(1)−1、2−(1)−2、及び2−(2)の物性
を示す。
1の物性 上記分析の結果、硫酸化フカンオリゴ糖2−(1)−1
は本発明の硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)と同じ物質
であると判明した。
2の物性 質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1
H−NMRスペクトルを図13に、13C−NMRスペ
クトルを図14に、マススペクトルを図15にそれぞれ
示した。図13、図14において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図1
5において、縦軸は相対強度を、横軸は、m/z値を示
す。 分子量;2016 MS m/z 313.1 [M-6Na+]6-, 380.3 [M-5Na+]5-, 4
81.1 [M-4Na+]4-, 649.1[M-3Na+]3-, 985.0 [M-2Na+]2- 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表1
2及び表13に示す。
ルの帰属の番号は下記式(VIII)の通りである。
リゴ糖2−(2)の1H−NMRスペクトルを図16
に、13C−NMRスペクトルを図17に、マススペク
トルを図18にそれぞれ示した。図16、図17におい
て縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(pp
m)を示す。また、図18において、縦軸は相対強度
を、横軸は、m/z値を示す。 分子量;3111 MS m/z 365.8[M−8Na+]8−、42
1.4[M−7Na+] 7−、495.2[M−6Na
+]6−、599.1[M−5Na+]5−、755.
0[M−4Na+]4−、1013.7[M−3N
a+]3− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表1
4〜表16に示す。
ルの帰属の番号は下記式(IX)の通りである。
マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造
解析 (1)調製 養殖したマコンブの乾燥物を穴径1mmのスクリーンを
装着させたカッターミル(増幸産業製)を用いてチップ
とした。500gのマコンブチップを4.5リットルの
80%エタノールに懸濁し、室温で24時間攪拌後、ろ
過した。この80%エタノール洗浄を3回繰り返し、マ
コンブチップ洗浄物を得た。得られた洗浄物全量を、5
0mM塩化カルシウム、200mMの塩化ナトリウム、
及び10%のエタノールを含む10リットルの50mM
のイミダゾール−塩酸緩衝液pH8.0に懸濁し、そこ
に、硫酸化フカン分解酵素を2U添加し、室温で5日間
攪拌後、ろ紙でろ過し、ろ液を遠心分離して、上清を
得、排除分子量1万のホロファイバーを装着させた限外
ろ過機を用いて、低分子画分を回収しマコンブ硫酸化フ
カンオリゴ糖画分1とした。 (2)精製 上記(1)で得られたマコンブ硫酸化フカンオリゴ糖画
分1に10%エタノールを加えて下記の平衡化用緩衝液
と導電率を同じにし、200mMの塩化ナトリウム及び
10%のエタノールを含む20mMのイミダゾール−塩
酸緩衝液(pH6.5)で平衡化した500mlのDEAE-セ
ルロファインA-800のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄
後、200mMから1.2Mの塩化ナトリウムの濃度勾配
により溶出させた。溶出には4.5リットルの緩衝液を
使用し、分取は1本あたり50mlとした。溶出させた
フラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法
で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。
その結果、溶出フラクションは3個のピークを形成し
た。2つめのピーク近辺のフラクション(44−48)
を集め、エヴァポレーターにより40mlに濃縮後、1
0%エタノールにより平衡化させた4.1×90cmの
セルロファインGCL-25のカラムにかけ、10%エタノー
ルで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総
糖量をフェノール−硫酸法で測定した。糖が検出された
画分を集め、エヴァポレーターにより8.4mlに濃縮
後、下記の条件で精製した。 カラム:YMC Pack Polyamine II (20×250mm、
YMC社製) 流速:8ml/分 カラム温度:30℃ 平衡化溶液:10%のアセトニトリルを含む875mM
のリン酸2水素ナトリウム 溶出:10%のアセトニトリルを含む875mMのリン
酸2水素ナトリウムから10%のアセトニトリルを含む
1.4Mのリン酸2水素ナトリウムの濃度勾配による 分取:1本あたり4ml 検出:フェノール−硫酸法による
取したフラクション(3回分、フラクションナンバー5
0−59近辺)を集め、排除分子量3500の透析チュ
ーブを用いて10%エタノールに対して透析し、エヴァ
ポレーターで約40mlに濃縮後、10%エタノールで
平衡化したセルロファインGCL−25のカラムにか
け、10%エタノールで溶出させた。溶出させたフラク
ションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定し
た。主要ピークの近辺を集め、再度同様にセルロファイ
ンGCL−25により精製した。本溶出画分の主要ピー
クを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、マコ
ンブ硫酸化フカンオリゴ糖1を得た。
ころ、マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖1の構造は、実施
例2に記載の硫酸化フカンオリゴ糖1−(3)と同じで
あることがわかった。
酸化フカンオリゴ糖の調製、精製および構造解析 (1)調製 参考例1に記載の方法により、レッソニア ニグレッセ
ンスの乾燥チップからレッソニア ニグレッセンス由来
フコイダンを調製した。すなわち、10gのレッソニア
ニグレッセンス由来フコイダンを50mM塩化カルシ
ウム、300mMの塩化ナトリウム、及び10%のエタ
ノールを含む2リットルの50mMのイミダゾール−塩
酸緩衝液pH8.0に溶解し、そこに、硫酸化フカン分
解酵素を1U添加し、室温で40時間攪拌後、排除分子
量1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用い
て、低分子画分を回収しレッソニア ニグレッセンス硫
酸化フカンオリゴ糖画分1とした。
化フカンオリゴ糖画分1を200mMの塩化ナトリウム及
び10%のエタノールを含む10mMのイミダゾール−
塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した1000mlのDEA
E-セルロファインA-800のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、200mMから700mMの塩化ナトリウムの濃
度勾配により溶出させた。溶出には5リットルの緩衝液
を使用し、分取は1本あたり56mlとした。溶出させ
たフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法
で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。
その結果、溶出フラクションは7個のピークを形成し
た。それぞれのピーク近辺のフラクションを集め、エヴ
ァポレーターにより40mlに濃縮後、(以下それらを
レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−
(1)から1−(7)とする。)10%エタノールによ
り平衡化させた4.1×90cmのセルロファインGCL-
25のカラムにかけ、10%エタノールで溶出させた。溶
出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−
硫酸法で測定した。糖が検出された画分を集め、エバポ
レーターにより濃縮後、下記の条件で精製した。 カラム:YMC Pack Polyamine II (20×250mm、
YMC社製) 流速:8ml/分 カラム温度:30℃ 平衡化溶液:レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカン
オリゴ糖1−(1)、(2)、(3)の場合は10%の
アセトニトリルを含む90mMのリン酸2水素ナトリウ
ム。レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖
1−(4)、(5)の場合は10%のアセトニトリルを
含む630mMのリン酸2水素ナトリウム。レッソニア
ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(6)の場
合は10%のアセトニトリルを含む720mMのリン酸
2水素ナトリウム。レッソニアニグレッセンス硫酸化フ
カンオリゴ糖1−(7)の場合は10%のアセトニトリ
ルを含む900mMのリン酸2水素ナトリウム
フカンオリゴ糖1−(1)、(2)、(3)の場合は1
0%のアセトニトリルを含む90mMのリン酸2水素ナ
トリウムから10%のアセトニトリルを含む900mM
のリン酸2水素ナトリウムの濃度勾配による。レッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(4)、
(5)の場合は10%のアセトニトリルを含む630m
Mのリン酸2水素ナトリウムから10%のアセトニトリ
ルを含む1260mMのリン酸2水素ナトリウムの濃度
勾配による。レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカン
オリゴ糖1−(6)の場合は10%のアセトニトリルを
含む720mMのリン酸2水素ナトリウムから10%の
アセトニトリルを含む1440mMのリン酸2水素ナト
リウムの濃度勾配による。レッソニア ニグレッセンス
硫酸化フカンオリゴ糖1−(7)の場合は10%のアセ
トニトリルを含む900mMのリン酸2水素ナトリウム
から10%のアセトニトリルを含む1620mMのリン
酸2水素ナトリウムの濃度勾配による。
オリゴ糖1−(1)から1−(7)の上記のカラムクロ
マトグラフィーにより分取したフラクションにおいて、
それぞれの糖溶出画分を集め、エヴァポレーターで約4
0mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化したセルロ
ファインGCL−25のカラムにかけ、10%エタノー
ルで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総
糖量をフェノール−硫酸法で測定した。主要ピークの近
辺を集め、再度同様にセルロファインGCL−25によ
り精製した。但し、レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖1−(7)に関しては、2種の主要ピー
クが認められたので、それぞれのピークをレッソニア
ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(7)−1及
び1−(7)−2とした。それぞれの溶出画分の主要ピ
ークを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、レ
ッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−
(1)から1−(7)−2を得た。
以下に、レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリ
ゴ糖1−(1)から1−(7)−2の物性を示す。
フカンオリゴ糖1−(1)の物性 質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1
H−NMRスペクトルを図19に、13C−NMRスペ
クトルを図20に、マススペクトルを図21にそれぞれ
示した。図19、図20において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図2
1において、縦軸は相対強度を、横軸は、m/z値を示
す。 分子量;718 MS m/z 216.5[M−3Na+]3−,3
36.0[M−2Na+]2−,695.0[M−Na
+]− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表1
7に示す。
ルの帰属の番号は下記式(X)の通りである。
フカンオリゴ糖1−(2)の物性 質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1
H−NMRスペクトルを図22に、13C−NMRスペ
クトルを図23に、マススペクトルを図24にそれぞれ
示した。図22、図23において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図2
4において、縦軸は相対強度を、横軸は、m/z値を示
す。 分子量;966 MS m/z 459.9[M−2Na+]2−,9
42.9[M−Na+] − 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表1
8に示す。
ルの帰属の番号は下記式(XI)の通りである。
フカンオリゴ糖1−(3)の物性 質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1
H−NMRスペクトルを図25に、13C−NMRスペ
クトルを図26に、マススペクトルを図27にそれぞれ
示した。図25、図26において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図2
7において、縦軸は相対強度を、横軸は、m/z値を示
す。 分子量;1068 MS m/z 332.9[M−3Na+]3−,5
11.0[M−2Na+]2−,1045.0[M−N
a+]− 1 H−NMR及び13C−NMRによる分析結果を表1
9に示す。
ルの帰属の番号は下記式(XII)の通りである。
フカンオリゴ糖1−(4)の物性 実施例2に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッ
ソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−
(4)の構造は、実施例2に記載の硫酸化フカンオリゴ
糖1−(2)と同じであることがわかった。
フカンオリゴ糖1−(5)の物性 実施例2に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッ
ソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−
(5)の構造は、実施例2に記載の硫酸化フカンオリゴ
糖1−(3)と同じであることがわかった。
フカンオリゴ糖1−(6)の物性 本発明のレッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリ
ゴ糖1−(6)の質量分析の結果を以下に示す。 分子量;3461 MS m/z 361.5[M−9Na+]9−,40
9.62[M−8Na+]8−,471.42[M−7
Na+]7−,553.81[M−6Na+]6 −,6
69.31[M−5Na+]5−,842.32[M−
4Na+]4−,1130.83[M−3Na+]3− 糖組成 L−フコースのみ(11分子) 硫酸基 18分子 ナトリウム 18分子
フカンオリゴ糖1−(7)−1の物性本発明のレッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(7)−
1の質量分析の結果を以下に示す。 分子量;4659 MS m/z 442.82[M−10Na+]
10−,494.72[M−9Na+]9−,559.
32[M−8Na+]8−,642.62[M−7Na
+]7−,753.52[M−6Na+]6−,90
8.82[M−5Na+]5−,1141.43[M−
4Na+]4− 糖組成 L−フコースのみ(15分子) 硫酸基 24分子 ナトリウム 24分子
フカンオリゴ糖1−(7)−2の物性本発明のレッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(7)−
2の質量分析の結果を以下に示す。 分子量;3564 MS m/z 373.12[M−9Na+]9−,
422.52[M−8Na+]8−,486.32[M
−7Na+]7−,571.01[M−6N
a+]6−,689.61[M−5Na+]5−,86
8.02[M−4Na+]4 −,1164.93[M−
3Na+]3− 糖組成 L−フコースのみ(11分子) 硫酸基 19分子 ナトリウム 19分子
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 (1)調製 参考例1記載の養殖したガゴメ由来フコイダン10gを
4.8リットルの125mM 塩化カルシウムと250
mM 塩化ナトリウムと10% エタノールを含む17
mM イミダゾール塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解
後、硫酸化フカン分解酵素を10U添加し、室温で72
時間攪拌して、ガゴメフコイダンオリゴ糖溶液を得た。
排除分子量1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過
機を用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖
画分3とした。
00mM 塩化ナトリウムを含む10mM イミダゾー
ル−塩酸緩衝液(pH6.5)で平衡化した1リットル
のDEAE−セルロファインA−800のカラムにか
け、同じ緩衝液で充分洗浄後、100mMから1Mの塩
化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させた
フラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、
総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その
結果、溶出フラクションは2個のピークを形成したので
それぞれのピーク部分について質量分析を行った。ま
た、その糖組成を調べたところフコースのみで、ウロン
酸を含まなかった。糖組成から考えられる各質量のオリ
ゴ糖は表20に示すような組成のものと考えられた。
すような種々の硫酸化フカンオリゴ糖が入っていること
が判明した。
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、構造解析及び生理
活性 (1)実施例2−(2)で得られたDEAE−セルロフ
ァインの4個の明瞭なピークの他に、それらよりも高い
塩濃度で溶出される幅広いピークも認められたのでオリ
ゴ糖4として採取し、実施例2と同様の方法でNMR分
析を行った。その結果、硫酸化フカンオリゴ糖1−
(2)とほぼ同じスペクトルが得られた。この結果か
ら、オリゴ糖4はオリゴ糖1−(2)が数分子結合した
構造を持つことが強く示唆された。そこで、オリゴ糖4
を実施例1記載の硫酸化フカン分解酵素により分解し、
分解物をHPLCにより分析したところ、反応生成物の
多くが硫酸化フカンオリゴ糖1−(2)と同じ位置に溶
出されてきた。プルランを標準物質としたゲル濾過法に
より、上記オリゴ糖4の分子量を測定したところ、オリ
ゴ糖4の分子量はオリゴ糖1−(2)の3倍程度である
ことが判明した。
オリゴ糖4の1H−NMRスペクトルを詳細に検討する
ことにより、式(IV)中のF6のフコースの3位にα
−(1→3)結合でつながっていることが明らかとなっ
た。
物中より、(I)で表される硫酸化糖の1〜5量体、す
なわち下記一般式(I)においてn=1〜5で表される
硫酸化糖を得た。
つはSO3Hである。)
類から得られた硫酸化フカン含有多糖を、硫酸化フカン
分解酵素で処理することにより低分子化され、上記一般
式で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化
多糖が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖
の分子量をゲル濾過法を用いて、測定したところ、抽出
条件がpH6〜8、95℃ 約2時間の場合は、平均分
子量は約20万であった。
いて、生理活性を調べた。その結果、式(I)で示され
る硫酸化糖は、国際公開第00/62785号パンフレ
ット、実施例1−(2)記載の方法で、HGF産生誘導
活性を調べたところ、当該活性が確認できた。また、式
(I)の硫酸化糖について、国際公開第99/4128
8号パンフレット、実施例8ならびに実施例9記載の方
法で保湿性を調べたところ、非常に有用であることが確
認できた。
用した糖鎖工学用試薬として有用な様々な分子量の硫酸
化フカンオリゴ糖の製造方法が提供される。また、構造
が解明された種々の硫酸化フカンオリゴ糖が提供され
る。
1−(1)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
1−(1)の13C−NMRスペクトルを示す図であ
る。
1−(1)の質量分析(マス)スペクトルを示す図であ
る。
1−(2)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
1−(2)の13C−NMRスペクトルを示す図であ
る。
1−(2)の質量分析(マス)スペクトルを示す図であ
る。
1−(3)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
1−(3)の13C−NMRスペクトルを示す図であ
る。
1−(3)の質量分析(マス)スペクトルを示す図であ
る。
糖1−(4)の1H−NMRスペクトルを示す図であ
る。
糖1−(4)の13C−NMRスペクトルを示す図であ
る。
糖1−(4)の質量分析(マス)スペクトルを示す図で
ある。
糖2−(1)−2の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
糖2−(1)−2の 13C−NMRスペクトルを示す図
である。
糖2−(1)−2の質量分析(マス)スペクトルを示す
図である。
糖2−(2)の1H−NMRスペクトルを示す図であ
る。
糖2−(2)の13C−NMRスペクトルを示す図であ
る。
糖2−(2)の質量分析(マス)スペクトルを示す図で
ある。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)の1H−NM
Rスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)の13C−N
MRスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(1)の質量分析
(マス)スペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(2)の1H−NM
Rスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(2)の13C−N
MRスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(2)の質量分析
(マス)スペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(3)の1H−NM
Rスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(3)の13C−N
MRスペクトルを示す図である。
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖1−(3)の質量分析
(マス)スペクトルを示す図である。
Claims (6)
- 【請求項1】下記の理化学的性質を有することを特徴と
する硫酸化フカン又はその塩: (1)構成糖:フコースを含有し、(2)下記一般式
(I)で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする: 【化1】 (式中、RはH又はSO3Hであって、Rの少なくとも
1つはSO3Hであり、nは1以上の整数である)、
(3)Alteromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分
解酵素により低分子化され、下記一般式(II)、(I
II)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XV
I)で表される化合物より選択される1種類以上の化合
物が生成する: 【化2】 【化3】 【化4】 【化5】 【化6】 【化7】 (全式中、RはH又はSO3Hであり、Rの少なくとも
1つはSO3Hである。) - 【請求項2】下記一般式(I)中、nが1〜5であるこ
とを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖。 【化8】 (式中、RはH又はSO3Hであり、Rの少なくとも1
つはSO3Hである。) - 【請求項3】請求項1または2記載の硫酸化フカンにAl
teromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分解酵素を
作用させてその分解物を採取することを特徴とする硫酸
化フカンオリゴ糖の調製方法。 - 【請求項4】硫酸化フカンがガゴメ(Kjellmaniella cr
assifolia)、マコンブ(Laminaria japonica)、ある
いはレッソニア ニグレッセンス(Lessonianigrescen
s)由来である請求項3記載の硫酸化フカンオリゴ糖の
調製方法。 - 【請求項5】請求項3記載の方法で調製される硫酸化フ
カンオリゴ糖。 - 【請求項6】下記一般式(II)、(III)、(XI
II)、(XIV)、(XV)、(XVI)から選択さ
れる化学構造を有する硫酸化フカンオリゴ糖またはその
塩: 【化9】 【化10】 【化11】 【化12】 【化13】 【化14】 (全式中、RはH又はSO3Hであり、Rの少なくとも
1つはSO3Hである。)
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