JPH0223897A - 遺伝子配列の分析方法及びその為のキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子配列を分析する方法及びそうした配列
の分析に有用なキラ）Ｋ関する。

遺伝子配列の同定は、生物学、医学そしてバイオテクノ
ロジーの研究において重要な課程である。

遺伝物質の各部分に関する定量的な情報及び遺伝物質の
同定は、広範囲の応用領域にわたって非常な関心が持た
れている。こうした情報は、例えば、細胞や有機体（ｏ
ｒｇ４ｎｉｓｍ　）あるいはより高等な個々の有機体の
同定を１ジエネテイツクフインガープリント（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｎｔ　）　’によって可
能にする特定の遺伝物質の存在及び量に関する知識は、
病気の研究、診断及び治療において重要である。遺伝子
断片あるいは遺伝子配列の同定による遺伝子地図の作成
にもまた大きな関心が寄せられている。こうした遺伝子
配列に現在使用されているいくつかの方法は、　サザン
プロツテイング（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ
　）法′として定式化されており、それは、関係する遺
伝子配列の同定に遺伝子プローブを用いるものである。

遺伝子プローブは、通常、既知のヌクレオチド配列の遺
伝物質の断片から得られるＤＮＡ（またはＲＮＡ）の１
本鎖である。プローブは相補的二重らせん（ｄｏｕｂｌ
ｅｈｅｌｉｃｅｓ　）あるいは二本鎖（ｄｕｐｌｅｘｅ
ｓ　）の形成によって同一またはほぼ同一の相補的遺伝
子配列を同定する。サザンプロッティングの技法におい
ては、遺伝子断片は先づ、電気泳動によりゲル中でサイ
ズに従って分離され、その分離された断片は、断片の相
対的位置を変えることなくニトロセルロースシート上に
移行され、そのシートに放射性標識のある特定の遺伝子
プローブが付される。

次に、その遺伝子プローブとハイブリダイズして放射性
ハイブリッドあるいは二本鎖を形成した制限断片を示す
、オートラジオグラフが得られる。

当出願の出１頭人Ｃｈ　ｉ　ａ　−Ｇｅ　ｅ　Ｗａｎ　
ｇによって１９８７年８月２８８に出願された米国特許
５ｅｒｉａ１人９０゜７８９はここに参照文献として開
示されているが、これは、固相支持体にｍＲＮＡ分子を
結合し、遺伝子プローブ分子の結合した標識マイクロビ
ーズの水懸濁液にその固相支持体を接触させることから
なる、遺伝子発現の分析法を開示し且つフレイムする。

遺伝子プローブ分子は、分析されるべき未知あるいは標
的ｍＲＮＡ分子より成り且つその特徴な笥つ配列とハイ
ブリダイズする配列から成るものであり、従って標識マ
イクロビーズは、支持体上の凛的ｍＲＮＡ分子に結合す
る。遺伝子発現は、標的ｍＲＮＡ分子と結合していない
マイクロビーズから固相支持体を分離し、標識された結
合マイクロビーズを検出することによって分析される。

開示された好ましい検出法は金属元素標識によるＸ線螢
光法である。

クローニング、ハイブリダイゼーシ盲ン及び放射性遺伝
子プローブの技術は１０Ｍ３ｎｉ３ｔｉｓらによる’　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１
９８２年に詳述されており、この文献も参照文献として
ことに記されている。

ｇ！識マイクロビーズは、イムノアッセイ法の様ないく
つかの分析法に使用されてきた。米国特許第４．４５４
．２３３号、１９８４年６月１２日及び第４．４３６゜
８２６号、１９８４年３月１３日、これらはいずれも本
出願人Ｃｈ　ｉ　ａ　−Ｇｅ　ｅ　Ｗａｎ　ｇに対し付
与されたものであるが、これらの特許には、マイクロビ
ーズに関する広範囲の先行技術が記述されている。これ
らの特許の開示はここに参照文献として示す。これらの
特許は、抗体ディテクタと結合する微小球（ｍ１ｃｒｏ
ｓｐｈｅｒｅｓ　）の使用、及びＸ線螢光法を含むいく
つかの方法により検出可能な付加（ｔａｇｇｉｎｇ　）
あるいは標識レポータの使用を開示している。本出願人
に付与された米国特許第４，６６３．２７７号、１９８
７年５月５日の開示はここに参照文献として記すが、こ
の特許は固相増幅法（５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）を用いた
、ウィルスまたは蛋白質の検出方法を記述している。標
本中の標的ウイルスまたは蛋白質をその標的と複合体を
形成する抗体で被覆した固相支持体と接触させ、次に抗
体で被覆した微小球をその標的複合体に結合させる。Ｘ
線茅光分析の使用が開示され、異種の標的を同時に検定
し得ることが示されている。

本発明によれば、予め決定された分析条件下、水性媒質
（ａｑｕｅｏｕｓ　ｍｅｄｉｕｍ　）中に、（１）分析
されるべき配列（標的配列）を含む遺伝物質及び（２）
（ｉ）上記標的配列に対する遺伝子プローブと（ｉｉ）
標識マイクロビーズに結合したレポータ分子とが弱くハ
イブリダイズしたヌクレオチド二本鎖を付加混合し；解
離したレポータ分子を解離していないプローブーレポー
タ二本鎖から分別し；分別された、解離していないレポ
ータ分子に結合したマイクロビーズの唄識を検出するこ
とから成り：上記遺伝子プローブが上記予め決定された
分析条件下、上記レポータ分子に対してよりも、上記標
的配列忙対し、より強くハイブリダイズし得；それ忙よ
って標的配列が上記二本鎖の遺伝子プローブとハイブリ
ダイズし、レポータ分子が上記プローブーレポータ二本
鎖から解離する；遺伝子配列を分析する為の方法が提供
される。

本発明によれば着た、遺伝子標的を含む遺伝物質を含有
した水性媒質中で遺伝子配列を分析する為のキットが提
供される。上記キットは、以下の成分を上記媒質中に一
体的に含有するかまたは、その媒質の別の部分圧含有す
る水性媒質から成る：Ａ、　　（ｉ）上記標的配列及び
（ｌｔ）Ｉｌ識マイクロビーズに結合したレポータ分子
とが弱くハイブリダイズしたヌクレオチド二本鎖；及び
Ｂ、レポータ分子（ｔｑが遺伝子プローブ（わとハイブ
リダイズしていない時、上記レポータ分子と選択的にハ
イブリダイズすることの可能な複数の、ヌクレオチドか
らなるホモポリマー。

本発明の更なる具体例において、以下の事項より成る遺
伝子配列の分析法が提供される。すなわち、この分析法
は、予め決定された分析条件下水性媒質中で、（１）分
析されるべき配列（標的配列）を含む遺伝物質及び（１
）　（ａ）標識マイクロビーズに結合した、上記標的配
列に対する遺伝子プローブ、と（ｂ）ホモポリマー分子
とが弱くハイブリダイズしたヌクレオチド二本鎖を付加
混合し、上記遺伝子プローブが予め決定された分析条件
下、上記ホモポリマーに対してよりも上記標的配列に対
して、より強くハイブリダイズすることが可能であり；
それにより、標的配列がプロープーホモボＩＪ　Ｙ−二
本鎖の遺伝子プローブと結合して標的−プローブ二本鎖
を形成し、形成された標的−プローブ二本鎖の遺伝子プ
ローブによって担持された標識マイクロビーズが上記ホ
モポリマーから解離され；残されたプローブ−ホモポリ
マー二本鎖を標的−プローブ二本鎖から分離し、残され
たプローブ−ホモポリマー二本鎖中の標識マイクロビー
ズの標識を検出し最初に与えられたプローブ−ホモポリ
マー二本鎖中の標識の数からの減少を計測することから
成る。

上記更なる具体例において、本発明によればまた、分析
されるべき遺伝子標的配列を含む遺伝物質を含有する水
性溶媒中で遺伝子配列を分析する為のキットが提供され
る。該キットは、（ａ）上記標的配列に対する遺伝子プ
ローブであって標識マイクロビーズに結合したプローブ
と（ｂ）ホモポリマー分子とが弱くハイブリダイズした
二本鎖から成る成分（５）を含有する水性媒質から成り
、上記遺伝子プローブは予め決定された分析条件下、上
記ホモポリマーに対してよりも、上記標的配列に対して
、より強くハイブリダイズすることが可能である。

サザンプロッティング法の様な先行技術は、分析される
べき試料を固体に結合し遺伝子プローブの様なディテク
タを液相中にアプライし、それを分析される試料の残存
結合部位に結合するといった異種の過程から成る検定を
含んでいた。固体に分析される試料を結合することによ
りかなりの数の結合部位がふさがって使用し得なくなる
可能性があるので分析感度が低下する。更には、先行技
術には一連の長時間を要する手作業が含まれている。

遺伝物質をもっと高い感度で、あるいは技巧要する手作
業の段階をより少なくして分析する方法が必要とされて
いる。本発明は、分析される遣伝子配列のプロフィール
が液相中で処理され、最少限の作業で迅速に決定され得
る均一な分析技術を提供する。

第１図は、本発明の分析の一具体例の概略図である。

第２図は、本発明の分析の他の具体例の概略図である。

遺伝物質としての核酸は、全ての生細胞に見い出される
。２つのタイプの核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及
びリボ核酸（ＲＮＡ）は、主として、それらのリボース
の糖単位において相異する。

個々の微生物は特有のヌクレオチド配列を含有し、その
ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部分によって同定すること
ができる。それらは特に豊富に存在するリポソームＲＮ
Ａ　（ｒＲＮＡ　）　Ｋよりて同定され得る。より高等
な有機体圧おいては、特有のＤＮＡ配列に加え、特定の
組織の各々の細胞はメツセンジャー几Ｎ　Ａ　（ｍＲＮ
Ａ　）の形で一組の遺伝子発現を含有している。この独
特の性質は、遺伝子プローブの使用による有機体あるい
は細胞の検出及び同定に強力な手段を提供する。

遺伝子プローブは適切な分析条件下、標的核酸配列の１
センス配列（５ｅｎｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）　’と
特異的にハイブリダイズすることのできる１アンチセン
ス配列（ａｎｔｔｓｅｎｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）　
’を有する核酸の一本鎖である。標的配列はＤ　Ｎ　Ａ
　、　ｒＲＮＡ。

あるいはｍＲＮＡである。ＤＮＡは通常二本鎖であるの
に対しＲＮＡは通常−重鎖である。温度の上昇によって
二本［’二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ　）　’は二本の相
補的な配列に変性され得、長い二重らせんほど高い融解
温度を有する。

遺伝プローブを使用する分析法は、検出（ｄｅｔｅｃｔ
−ｉｎｇ　）及び報告（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　）という
二つの機能を包含する′。特有のプローブ配列が、ノ１
イブリダイズし、アンチセンスーセンス二重らせんを形
成することＫより、標的配列のセンスを検出する０ハイ
プリダイゼーシ１ンの際、このアンチセンスーセンス二
重らせんは、レポータによってその存在を報告しなけれ
ばならない。レポータは、例えば付加酵素分子、螢光分
子、ＸＩｓ螢光によって検出可能な放射性原子あるいは
元素あるいは化合物である。本発明においては、標識レ
ポータを作成するのに数億の追跡原子を含むマイクロビ
ーズが用いられる。

レポータの作成にマイクロビーズを使用することにより
、各レポータは数億個の特定元素の追跡原子を担持し、
移動性固相の一つの報告単位として働く。各報告単位に
おける膨大な微の追跡分子は報告シグナルを高度に増幅
し、それは、標識として一個の放射性原子あるいは変色
分子を使用する場合とは対照的である。この様なマイク
ロビーズは、各々に異なった追跡元素を付加した１０あ
るいはそれ以上の報告チャンネルで同時に報告し得るＸ
線螢光測定において特に便利であり、それは、分析を内
的に検量（ｃ３１ｉｂｒａｔｊｎｇ　）するのみならず
標的遺伝子配列のプロフィールを同時に解析する機能に
役立つ。

こうしたマイクロビーズのサイズは、しかしなから、典
型的には、ウィルスのサイズにとどまり、従って、それ
らはヌクレオチド配列と共有結合することによりレポー
タを形成し得る一方、それらは指定された検出の為の結
合に対し悪影響を与え得る法外に大きな集合体を形成す
ることはない。

茎 本発明の方法によれば、遺伝子標的配列、それはＤＮＡ
の一本鎖分子であってもＲＮＡの一本鎖分子であっても
よいが、水懸濁液あるいは水性媒質中で分析される。予
めハイブリダイズした、標的配列の遺伝子プローブと頭
識マイクロビーズ随結合したレポータ分子との二重らせ
んを＃＆質中で、分析されるべき−または二の配列（標
的配列）を含む遺伝物質と混合する。その二重らせんは
、弱くハイブリダイズされたヌクレオチド二重らせんで
あつて、遺伝子プローブは、予め決定された分析条件下
、レポータ分子に対してよりも、標的配列に対しより強
くハイブリダイズすることが可能である。こうした条件
下、遺伝子プローブは標的配列のほうと選択的にハイブ
リダイズし、従って、存在するプロープーレポータニ重
らせんは解離し、［ａマイクロビーズに結合したレポー
タ分子を放出する。

解離したレポータ分子に結合したマイクロビーズの標識
の検出が、標的配列の存在及び量の測定である。Ｍ離し
たレポータ分子のマイクロビーズの標識を検出する為に
は解離したレポータ分子をそれ自体標識マイクロビーズ
を含む未解離のプローブーレポータニ重らせんから分別
することが必要である。分別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ　）は、解１１１またレポータ分子な固相支持
体中に集め水性媒質を除去する等のい（つかの方法（よ
って行われる。

マイクロビーズの標識は、例えば、着色化合物、紫外線
照射により螢光性の化合物、ｘｓｐａ光によって検出可
能な放射性追跡子あるいは金属元素あるいは化合物であ
る。標識としては、Ｘ線によって検出可能な金属元素や
化合物がより好ましい。

原子番号が２２を超えていて、そのＸ線螢光が空気中で
極端に希釈されない、比較的重い元素がより好ブしい。

そうした元素としては、Ｔｉ　、　Ｆｅ　。

Ｎｉ　、　Ｃｕ　、　Ｃｏ　、　Ｃｒ等が例示される。

より好ましい検出法はＸｇＪ螢光分析である。典型的Ｘ
ｉ螢光スペクトルにおいては、各追跡元素は個有のピー
クの位置あるいはエネルギーを持りている。その位置あ
るいはチャンネルにおけるカランティングレートは、対
応する元素を付加したマイクロビーズの数に比例する。

螢光は約１０−８モルのアルゴンガスをＸＩＩ！ディテ
クタ付近忙含む空気中で測定される。アルゴンシグナル
のチャンネルはマイクロビーズの標識の増幅因子を含ま
ない。

各々のマイクロビーズが１０８の増幅因子に寄与すると
仮定すると、マイクロビーズな使用することＫより数秒
で標的分子に対し１０−１６モルのシグナルレベルが達
成され得る。そうした系（ｓｙｓｔｅｍ　）を用いる分
析感度は当然、はるかに高い。

本発明で使用するマイクロビーズは、Ｐｏ１ｙｓｃｉ−
ｅｎｃｅ、　Ｉｎｃ　（Ｐａｕｌ　Ｖａｌｌｅｙ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｐａｒｋ、　％ｒｒ−ｉｎｇｔｏｎ
、　Ｐ　Ａ　１８９７６　）から入手し得る様な小型の
ラテックスピーズがより好ましい。マイクロビーズのサ
イズ（直径）は０．３マイクロメータ以下が好ましい。

感度を高める為には、０．１マイクロメータあるいはそ
れ以下といった０、２５マイクロメータ以下にすると良
い。マイクロビーズは、０．０５マイクロメータを下回
るサイズにはするべきではない。なぜならば、このサイ
ズより下になるとレポートシグナルが弱くなるからであ
る。

一定の分析条件下、遺伝子プローブ／レポータ分子二重
らせんが弱くハイブリダイズし、標的配列と遺伝子プロ
ーブがより強くハイブリダイズするという性質は、相補
的結合によって二重らせんを形成するそれぞれのヌクレ
オチド対の数に由来して得られるものである。本発明の
一具体例においては、標的配列は特徴的センス配列から
成り、遺伝子プローブは標的配列の特徴的センス配列に
相補的なアンチセンス配列から成り、レポータ分子は、
標的センス配列よりも短（、プローブのアンチセンス配
列と部分的に相補的な、センス配列から成る。このこと
は、解析条件下、プローブを標的に対しより強く結合さ
せるという結果を与え得る。温度やｐＨの様な条件を予
め決定し、遺伝子プローブがレポータ分子と弱くハイブ
リダイズして二重らせんを形成し、標的配列とは強くハ
イブリダイズして二重らせんを形成する様にする。

この目的の為には、分析は遺伝子プローブとレポータ分
子との二重らせんの融解温度の直ぐ下の温度において行
うことがより好ましい。

未解離のプロープーレポータ二重らせんから、解離した
レポータ分子を分別する一つの方法は、解離したレポー
タ分子を他の物質と結合させ、解離したレポータ分子に
識別する為の特徴が付与され得るようにし、あるいは、
未解離のプローブーレポータニ重らせんの位置とは異な
る位置でレポータ分子を集め得るようにする方法である
。これを行う一つの方法は水性媒質中に、解離したレポ
ータ分子にのみ選択的にハイブリダイズする性質、いく
つかのヌクレオチドポリマーを入れておくことである。

媒質中に入れるヌクレオチドポリマーは、ヌクレオチド
から成るホモポリマーであることがより好ましい。

レポータ分子は更に１ホモポリマーとハイブリダイズす
る様に調整されたハイブリダイズ可能な配列から成るも
のでも良い。ホモポリマーと塩基対を形成することので
きるい（つかのヌクレオチドはそのハイブリダイズ可能
な配列から成るものでありても良い。あるいはホモポリ
マーと塩基対を形成することのできるヌクレオチドはハ
イブリダイズ可能な配列とレポータ分子のセンス配列の
両方から成るものであっても良い。ホモポリマーとレポ
ータ分子とのハイブリダイズー・シロンは、この時塩基
対を形成することの可能なヌクレオチドの数と分析条件
とに依存する。本発明のより好ましい具体例においては
、レポータ分子が遺伝子プローブから解離するときには
塩基対を形成するヌクレオチドの数は、予め決定された
分析条件下において、ハイブリダイズ可能な配列とホモ
ポリマーとのレポーターホモポリマー二重らせんを形成
する為に十分な数であるが、レポータ分子が遺伝子プロ
ーブとハイブリダイズする時には、遺伝子プローブによ
って上記塩基対形成ヌクレオチドの一部がブロックされ
る為に反応条件下、レポーターホモポリマー二重らせん
を形成する為にはそのヌクレオチドの数は不十分である
。塩基対形成ヌクレオチドが、ハイブリダイズ可能な配
列とレポータ分子のセンス配列との両方から成る時は、
センス配列の塩基形成ヌクレオチドは、レポータのハイ
ブリッド可能な配列の近（に位置することが好ましい。

上記ホモポリマーはＸヌクレオチドと、Ｘヌクレオチド
のレポータ分子の塩基対形成ヌクレオチドで構成され得
、この場合： ＸがｄＣＯ時、ＹはＧ； ＸがＣの時、ＹはＧ； ＸがｄＧＯ時、ＹはＣ； ＸがＧの時、ＹはＣ； ＸがｄＣの時、ＹはｄＧ； ＸがＣの時、ＹはｄＧ； ＸがｄＧの時、ＹはｄＣ； ＸがＧの時、ＹはｄＣである。

部品マイクロビーズを含有する解離したレポータ分子が
媒質中のホモポリマーとハイブリダイズすることにより
分別された時に、結果として形成されたホモポリマーと
レポータ分子との二重らせんは種々の方法によってプロ
ーブーレポータ分子から識別され得る。そうした方法の
一つは、ホモポリマーの位置を固定することである。こ
れはホモポリマーを固相支持体に結合し、そこに解離し
たレポータをレポーターホモポリマー二重らせんの形成
により集めることによりて行なわれる。固相支持体は、
ホモポリマーが結合することのできるものであればいか
なる材料から成るものでもよく、ガラスあるいは親水性
重合体ラテックスのようなものが使用され祷る。例えば
支持体は、水性媒質を内部に包含する容器であっても良
く、また、ホモポリ！−は、その容器の内面の特定の位
置に結合させても良い。

ホモポリマーをこうした固相支持体上の特定の位置に結
合すると有利な検出方法が使用され得る。

この検出方法はマイクロビーズが金属元素または化合物
で標識されている時に用いられる。こうして、解離した
レポータ分子に結合した標識マイクロビーズは、Ｘ線螢
光分析によって、固相支持体上に集められた解離レポー
タ分子に照射する為のＸ線または電子線源及び狭く密な
角度（ｎ４ｒｒｏｗｓｏｌｉｄ　ａｎｇｌｅ　）を見る
ことの可能なＸ線螢光検出器を用い、検出され得る。こ
の目的の為、固相支持体上の固定されたホモポリマーの
位置は、検出器及び水性媒質との関係において選択し、
それにより、その検出器が、上記水性媒質中の未解離の
レポータ分子によって放射された有意な数の（ｓｉｇ−
ｎｉｆｉｃａｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ　）の螢光Ｘ１Ｉｉｔ
を観測することなく、集められた解良しボータ分子によ
って放射された螢光Ｘ線を本質的に測定するようにする
。それは結果として解離レポータ分子を未解離のものか
ら分離する。

レポーターホモポリマー二重らせんの形成により固定さ
れた位置建築められた未解離のレポータ分子の標的を検
出する為の他の方法は、固相支持体の位置から水性媒質
を除去し、必要な場合にはその固相支持体を洗浄するも
のである。これ九より未解離の１０−プーレポータ二重
らせんをホモボリマーーレポータニ重らせんの付着した
固相支持体から除去するという結果が得られる。こ５し
て、その位置にあるレポータ分子の標識が適切なあらゆ
る手段によりて検出され得る。なぜならば、未解離のプ
ローブーレポータニ重らせん中のレポータ分子の捺Ｍの
存在の結果として現れる１ノイズ′シグナルに検出を邪
魔されないからである。

水性媒質中でホモポリマー分子を用いる勘合、固相支持
体圧ホモポリマーを固着する作秦以外の過程が行なわれ
る。例えば、ホモポリマー分子は、自由に流動して（ｆ
ｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ　）　イても良く、結果とし
く生ずるホモボリマーーレポータニ重らせんは未解離の
プローブーレポータニ重らせんから臓別され得る。この
方法の一つは、ホモポリマー分子に標識を付することで
ある。各々のホモポリマー分子を磁力で標識したマイク
ロビーズに結合しても良い。こうして、解離し標識され
たレポータ分子は、形成された、磁力の標識を有するレ
ポーターホモポ、リマー二重らせんにより、未解離のプ
ローブーレポータ二重らせんから分別される。

こうした磁力で標識されたレポーターホモポリマー二重
らせんは、磁石の引力によって所望の湯所に集めること
ができる。その位置においてレポータ分子に結合したマ
イクロビーズの標識が検出され得る。未解離のプローブ
ーレポータニ重らせんからの干渉は、集められた二重ら
せんから水性媒質を除去するなど、上述の手段忙よって
防止することができる。

本発明の方法はまた、未知の標的配列の分析と同時に行
う対照区の（ｃｏｎｔｒｏｌ　）分析を採用するもので
あっても良い。これもまた、水性溶媒中に対照区として
既知量の標的配列と弱くハイブリダイズしたヌクレオチ
ド二重らせんを加えて混合することにより行うことがで
きる。これらの二重らせんは、既知の標的配列に対する
遺伝子プローブと、標識されたマイクロビーズに結合し
たレポータ分子によりて形成され、そのマイクロビーズ
は、未知の標的配列に対するレポータ分子の標識とは異
なる金属元素で標識されている。既知標的配列に対する
遺伝子プローブは、予め決定された解析条件下、最初に
ハイブリダイズしたレポータ分千に対してよりも既知の
標的配列に対してより強く結合することが可能である。

未知及び既知の標的配列の双方が付加混合されると、既
知の標的配列に対する遺伝子プローブから解離したレポ
ータ分子に結合したマイクロビーズの標識も、未知の標
的配列に関するマイクロビーズの標識も、同時且つ別個
に検出される。これは、異なったレポータ分子を標識す
る異なった金属元素のＸ線螢光の特徴の分析によって行
うことができる。既知の標的配列の分析結果に対し、未
知の標的配列の分析結果を検量（ｃａｌｉｂｒａｔｅ　
）するのは容易である。

対照区の標的配列の使用はまた、−個のマイクロビーズ
に結合し得るレポータ分子の故のバラつきを補う為にも
用いられ得る。マイクロビーズは、実質的には、−個の
マイクロビーズにつき一個のレポータ分子が用いられる
様ＫＭ整される。−個のマイクロビーズに二以上のレポ
ータ分子が結合すると、−個のビーズに結合したレポー
タ分子の解離を二以上の標的配列が惹起させ得る。この
場合、マイクロビーズのカウントは、標的配列の量の測
定に関し、正確な値よりも低い結果を与える。

この点は、対照区の使用によって十分補正することがで
きる。対照区においては、未知の標的配列の分析釦用い
たと同一の方法で、レポータ分子をマイクロビーズに結
合する。あるいは、−個のマイクロビーズに結合してい
るレポータ分子の数が判っていれば、それに従って分析
結果を検量することができる。

検出段階にＸ線螢光分析を使用することにより、複数の
異なる未知標的配列を同時に解析することもまた可能で
ある。これを行う場合、遺伝物質のサンプル中の異種の
標的配列は、水性媒質中で、異なりた種々のハイブリダ
イズしたヌクレオチド二重鎖を付加混合することにより
解析される。各々の異なる二重鎖は、第一に異なったタ
イプの遺伝子プローブから成り、それによって個々の異
種の標的配列とハイブリダイズすることができ、また第
二に異なる標識を付したマイクロビーズに結合したレポ
ータ分子から成り、異なった二重らせんのマイクロビー
ズは異なった金属元素の標識を持っている。遺伝物質を
水性媒質中に導入後個々の櫃的配列如対応するマイクロ
ビーズを持ったレポータ分子が解離する。それらは同時
且つ別個に、各々異なる金属元素のＸ線螢光特性を分析
して、異なる標識をされたマイクロビーズのＩＩＡ識を
検出することにより、検出される。

本発明の主要な特徴の一つである、固体に固定させるこ
となく行う、水性媒質中での標的配列の均一ナハイプリ
ダイゼーシ曹ンは、本発明の更なる具体例に示されてい
る。この具体例においては、遺伝子プローブはネガティ
ブに相関する分析におけるレポータとして標識され、機
能し、それ忙より別個にレポータ分子を使用することを
省略し得る。

この別の具体例においては、標的配列を含有する遺伝物
質は予め決定された分析条件下水性媒質中で、（ａ）標
識マイクロビーズに結合した、上記標的配列に対する遺
伝子プローブと（′ｂ）ホモポリマーとが弱く結合した
ヌクレオチド二重らせんと混合する。上記遺伝子プロー
ブは、予め決定された分析条件下、上記ホモポリマーに
対してよりも上記標的配列忙対してより強くハイブリダ
イズすることができる。標的配列はこうしてプローブ−
ホモポリマー二重らせんの遺伝子プローブとハイブリダ
イズして標的−プローブ二重らせんを形成し、形成され
た標的−プローブ二重らせんの遺伝子プローブによって
担持された標識マイクロビーズは上記ホモポリマーから
解離する。残りのプロープーホそポリマー二重らせんは
娯的−プローブ二重らせんから分離され、残りのプロー
ブ−ホモポリマー二重らせん中の標識マイクロビーズの
標識が検出される。

最初に用意した二重らせんの、弱ハイブリダイゼーシ１
ンと、標的配列を含む二重らせんの、より強いハイプリ
ダイゼーシ曹ンとは、第一の具体例と同一の方法により
得られる。これを行う為には、標的配列は特徴的なセン
ス配列から成り、遺伝子プローブは、（１）上記標的配
列の特徴的センス配列に相補的なアンチセンス配列と（
２）ホモポリマーとハイブリダイズするように調整され
たハイブリダイズ可能な配列とから成る。ホモポリマー
と＊ｉ対を形成し得るいくつかのヌクレオチドは、上記
ハイブリダイズ可能な配列または上記ハイブリダイズ可
能な配列と、遺伝子プローブのアンチセンス配列との両
方から成る。

塩基対形成ヌクレオチドの数は、予め決定された分析条
件下、プローブ−ホモポリマー二重らせんの遺伝子プロ
ーブとホモポリマーとが、標的配列が存在しない状態に
おいて、ハイブリダイズしたままの状態に保たれる為に
十分な数でなければならず、しかしまた、標的配列が水
性媒体中に存在する時には、標的配列によって、環基対
形成ヌクレオチドの一部がブロックされることにより、
反応条件下、ハイブリダイズした状態を維持する為には
不十分な数でなければならない。塩基対形成ヌクレオチ
ドは、ハイブリダイズ可能な配列と遺伝子プローブのア
ンチセンス配列との両方から成り、またアンチセンス配
列の塩基対形成ヌクレオチドはハイブリダイズ可能な配
列の近くに位置することがより好ましい。ホモポリマー
は、上述したようＫＸヌクレオチドとＹヌクレオチドの
遺伝子プローブの塩基対形成ヌクレオチドの組合せで構
成し得る。

温度やｐＨ等の分析条件は、遺伝子プローブがホモポリ
マーと弱くハイブリダイズして二重らせんを形成し、標
的配列とは強くハイブリダイズして二重らせんを形成す
るよ５に予め決定する。分析は遺伝子プローブとホモポ
リマーとの二重らせんの融解温度の直ぐ下の温度で行う
のが好ましい。

分析結果をチエツクする為、必要な５合は、分析を遺伝
子プローブとホモポリマーとの二重らせんの融解温度の
直ぐ下の温度において行い、プローブ−ホモポリマー二
重らせんの標識のカウントの減少を先ず測定した後に分
析温度を（ａ）上記遺伝子プローブのハイブリダイズ可
能な配列から成る塩基対形成ヌクレオチドと（ｂ）上記
ホモポリマーとの間で形成され得る二重らせんの融解温
度を下回る温度迄下げる。プローブ−ホモポリマー二重
らせん中の標識マイクロビーズのＮ識を検出して最初の
測定に比較して標識カウントの増加を測定する。マイク
ロビーズも上記と同様にして標識し、Ｘ線螢光分析も好
ましい検出方法である。

プローブ−ホモポリマー二重らせんのホモポリマーは一
定の位置で固相支持体に結合すると良い。

これは、上記のように水性媒質の容器の一部であっても
良い。こうすることによりて残りのプローブ−ホモポリ
マー二重らせんを、標的−プローブ二重らせんから、狭
く密な角度（ｎａｒｒｏｗ　ｓｏｌｉｄ３ｎｇｌｅ　）
のＸ線螢光検出器を用いて上記のように分離することが
可能である。あるいは、水性媒質を固相支持体から除去
し、その固相支持体を場合によりては洗浄して標的−プ
ローブ二重らせんを除去し、ノイズを減少させることも
できる。

本発明の他の具体例においては、対照区として既知標的
配列が使用され得、上述の方法と同様の方法により複数
の未知標的配列が分析され得る。

対照区を使用する場合、この方法はまた、対照区として
既知量の既知標的配列と、弱くハイブリダイズしたヌク
レオチド二重らせんとを水性媒質中で混合することから
成る。上記二重らせんは、（ｃ）既知標的の遺伝子プロ
ーブと（ｄ）ホモポリマー分子とで構成されているもの
であり、上記プローブ（ｃ）は、標識マイクロビーズに
結合しており、上記マイクロビーズは未知標的に対する
遺伝子プローブの標識とは異なる金属元素で標識されて
いる。

遺伝子プローブ（ｃ）は、予め決定された分析条件下、
ホモポリマー（ｄ）　Ｋ対してよりも上記既知標的配列
に対して、より強くハイブリダイズすることが可能であ
る。以下のものが同時且つ別個に検出される：すなわち
１．未知標的（ａ）−ホモポリマー（ｂ）二重らせんに
対する残りのプローブ中にある標識マイクロビーズの標
識及び■、残りの１０−プ（ｃ）　−ホモポリマー（ｄ
）二重らせん中にあるＩｒ！！４識マイクロビーズの標
識が上記の異なる金属元素のＸ＠螢光特性の分析により
検出される。標的配列の分析は対照区の分析に対して検
量される。複数の標的配列を同時に決定する為には、こ
の場合は遺伝物質が異種の分析される標的配列を包含す
るので、上。

記異種配列は、種々の異なる弱くハイブリダイズしたヌ
クレオチド二重らせんを水性媒質中で混合する。異なる
各二重らせんは、（ａ）各々のタイプが、分析される異
種の標的配列のうちの特定の一つとハイブリダイズし得
、遺伝子プローブの各タイプが異なる標識の付されたマ
イクロビーズ忙結合している、異なるタイプの遺伝子プ
ローブと（ｂ）ホモポリマー分子とから成り、異なる二
重らせんのマイクロビーズは異なる金属元素標識を持つ
。異なった金属元素の各々のＸ線螢光特性の分析により
、残りのプローブ−ホモポリマー二重らせん中のマイク
ロビーズの異なる標識を同時且つ別個に検出する。

本発明によれば、キットが提供される。該キットは、本
発明の具体例のうちのいずれかＫよる分析を可能にする
要素から成るものであれば良い。

−具体例においては、キットの必須成分は水性媒質中に
一体的に含まれているかまたは媒質の別々の部分に含ま
れている。これらの成分は、Ａ、　　（ｉ）標的配列に
対する遺伝子プローブと（ｉｉ）標識マイクロビーズ忙
結合したレポータ分子とが弱くハイブリダイズして成る
ヌクレオチド二重らせん；及び Ｂ、上記レポータ分子が遺伝子プローブ（ｉ）と結合し
ていない時にレポータ分子（＋ｇと選択的忙ハイブリダ
イズすることのできる、ヌクレオチドから成る複数のホ
モポリマーである。

上記キットの成分の特徴は、上述のように本発明の方法
の最初の具体例と関連する。

このキットの具体例では、該キットにより異種の標的配
列が同時に分析され得、成分Ａは更にハイブリダイズし
た異種のヌクレオチド二重らせんから成り、各々の異な
る二重らせんは（ｉ）分析されるＭｆｌ！の顕的配列の
うちの特定のものとハイブリダイズすることのできる異
なるタイプの遺伝子プローブ、と（ｉＱ異なる標識を有
するマイクロビーズに結合したレポータ分子とから成る
。異なる二重らせんのマイクロビーズは異なる金属元素
標識を有し、上記の異なる二重らせんは同一の水性媒質
上かまたはその別々の部分に含まれる。

キットの具体例は対照区の使用が可能である。

この場合キットは更に： Ｃ０成分人を含有する水性媒質とは別の水性媒質の部分
に含有される、対照区としての既知量の既知標的配列；
及び り、　　（ｉｉｉ）既知標的配列に対する遺伝子プロー
ブと（ｉｖ）標識マイクロビーズに結合したレポータ分
子とが弱くハイブリダイズして成る付加的ヌクレオチド
二重らせんであつて、上記マイクロビーズがレポータ分
子（ｉ）の標識とは異なる金属元素でｗ４識されており
、上記遺伝子プローブは予め決定された分析条件下、上
記レポータ分子に対してよりも、上記既知標的配列に対
して、より強くハイブリダイズする。

キットの更なる具体例は、上記の方法を行う為に有用で
ある。このキットは、（ａ）標識マイクロビーズに結合
した、上記標的配列の遺伝子プローブと、Φ）ホモポリ
マーとが弱くハイブリダイズして成るヌクレオチド二重
らせんから成る成分四を含む水性媒質から成り、上記遺
伝子プローブは予め決定された分析条件下、ホモポリマ
ーに対してよりも、標的配列に対して、より強くハイブ
リダイズすることが可能である。

このキットの成分の特徴は、上述のよ５に分析方法の具
体例と関連している。

このキットは更にホモポリマーの結合した固相支持体を
その構成要素とすることもでき、その固体は、水性媒質
の容器の一部であっても良い。

キットは、異種の頒的配列を分析するように調整され得
る。この場合、成分四は更に異なる４類のハイブリダイ
ズしたヌクレオチド二重らせんから成り、異なりた各々
の二重らせんは、（ａ）分析される上記の異なる４類の
標的配列とハイブリダイズし得、異なる標識をしたマイ
クロビーズに結合した、異なるタイプの遺伝子プローブ
と（ｂ）ホモポリマー分子とから成り、異なった二重ら
せんのマイクロビーズは異なりた金属元Ｘｉ識を持ち、
上記の異なる二重らせんは同一の水性媒質中かまたはそ
の媒質の別々の部分に含まれている。

対照区の標的配列を分析する場合には、キットは更Ｋ　
：　Ｂ、　　成分Ａ、を含有する水性媒質とは別の水性
媒質の部分に含まれる、対照区としての、既知量の既知
標的配列；及び ｃ、ｉ＜ハイブリダイズして成る劇のヌクレオチド二重
らせんであって、上記別の二重らせんは、（ｃ）上記既
知標的配列に対する遺伝子プローブと（ｄ）ホモポリマ
ー分子とから成り、上記遺伝子プローブ（ｃ）は標識マ
イクロビーズに結合し、上記マイクロビーズは未知の標
的配列と対する遺伝子プローブ（ａ）の標識とは異なっ
た金属元素で標識されており、上記遼伝子プローブ（ｃ
）は、予め決定された分析条件下、上記ホモポリマー（
ｄ）に対してよりも上記既知標的配列に対し、より強く
ハイブリダイズすることができる。

本発明の分析は、高い測定感度で、迅速且つ容易に行５
ことができるところに利点がある。固相支持体に結合さ
せること釦より標的配列結合部位のロスは無い。本発明
の方法は、先行技術において要求された遠心分離、そし
て多くの場合における洗浄といったいくつかの段階を省
くものである。

マイクロビーズの使用によりマイクロビーズ中あるいは
マイクロビーズ上に担持される多数の標識の増幅因子の
為、検出の感度が高い。より好ましい方法として掲げた
ｘｉｖ光法のような、他の検出法の一つを選択すること
により、放射性物質を扱い、処理する必要を除去するこ
とができる。羨者の方法は更に、対照区及び／またはい
（っかの未知の標的配列を同時て分析し得るという利点
を有する。

新規方法の実施例を第１図及び第２図に示す。

第１図は、本発明の上記最初に説明した具体例による三
段階の間における水性媒質中の構成成分を示している。

成分が水性媒質（示されていない）中に存在することが
理解される。アンチセンス配列２を有する遺伝子プロー
ブ１はレポータ分子３と二重らせんを形成する。レポー
タ分子３は、センス配列４、ハイブリダイズ可能な配列
５及び標ｇ４（示されていない）を有するマイクロビー
ズ６から成る。この段階においても、固相支持体８に結
合したホモポリマー配列７は媒質中にある。段Ｉ＠Ｂは
センス配列１０を有する未知の標的配列９を含む遺伝物
質の導入である。

段階Ｂの標的配列の導入に絖き、段階Ｃは、水性媒質中
に結果として含まれる成分について表している。レポー
タ３は、プローブ１との間忙おける二重らせんから解離
し、ホモポリマー７は、ハイブリダイズ可能な配列５及
びレポータ３のセンス配列４の一部との間にハイブリダ
イゼーシ、−；Ｖ″′より二重らせんを形成し、その際
、マイクロビーズ６は固形支持体８の位置に存在する。

プローブ１はレポータ分子との間における、以前からの
二重らせんから解離し、プローブ１のアンチセンス配列
２と標的９のセンス配列１０とのハイブリダイゼーショ
ンにより、標的９と二重らせんを形成する。媒質は更に
レポータ分子３と遺伝子プローブ１との間における未解
勉の二重らせんを含んでいる。

第２図は、上述の、本発明の他の具体例を示し、段階Ａ
、Ｂ及びＣにおいて水性媒質（示されていない）中に存
在する成分を示す。段階Ａは遺伝物質の導入前、分析の
開始時点圧おけろ水性媒質を示す。媒質は、アンチセン
ス配列１２を有する遺伝子プローブ１１及びハイブリダ
イズ可能な配列Ｂ及び標識（示されていない）を有する
マイクロビーズを含有する。固相支持体８に結合したホ
モポリマー７は、ハイブリダイズ可能な配列Ｂ及びプロ
ーブ１１のアンチセンス配列１２の一部とのハイブリダ
イゼーション忙より、プローブ１１との間に二重らせん
を形成する。段５１Ｂは、センス配列１０から成る未知
の標的配列９を含む遺伝物質の媒質への導入を示す。段
階Ｃは、遺伝物質導入後に存在する成分を示す。遺伝子
プローブ１１は、ホモポリマー７から解離し標的配列の
センス配列１０と遺伝子プローブのアンチセンス配列１
２との間で新しい二重らせんを形成した。マイクロビー
ズはその際ホモポリマー７の固相支持体８上の場所から
、二番らせんと共に運び去られる。

図を簡単にする為、各段階において、各成分を一つだけ
示したが、通常は複数のそうした成分が存在することが
認識される。

以下の実施例は例示の為に呈示されるものであって、本
発明を限定するものではない。実施例中では商業的に入
手可能なデオキシヌクレオチドホモポリマーが使用され
ている。ホモポリマーの支持体への結合、及びマイクロ
ビーズの様なラデックスへのレポータ分子の結合の詳細
は、上記ＭａｒＩｉ−ａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　’
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ“のテキストに
記されている。ウィルス及び細胞のｍｙｃ及びｒ３ｓ　
ＤＮＡクローンは商業的に人手可能である。

適切なりＮＡ断片を既知の方法で調製する。異なるレベ
ルの工及び工配列を発現することの知られた種々のセル
ライン及び初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙＣ６１１ｓ　）を
テストに用いることができる。ｒａｓ及びｍｙｃに対応
する適切な発ガン遺伝子は商業的に入手可能である。

ＤＮＡ二重らせんの融解温度（Ｔｍ）は多くの場合知ら
れているか、または公式から求めることができる： Ｔｍ　−３Ｑ℃＋１８．５　（ｌｏｇ濃度ＮａＣ１）Ｄ
ＮＡ二重らせんの融解温度は凡そ以下の通りであること
が知られている： 塩基対の数　　　　Ｔｍ ＣＣ） 実施例１ 遺伝物質の制限断片をｒ３ｓ及び二重ガン遺伝子の存在
と量について分析することができる。以下のものを含有
する水性媒質を調製する＝（１）　　ガラス製支持体に
結合した２０Ｃヌクレオチドのホモポリマー配列； （２）　　（ａ）　ｒａｓに対応するアンチセンス配列
を有し２５ヌクレオチドを有する遺伝子プローブが、（
ｂ）レポータ分子とハイブリダイズして成る二重らせん
であって、上記レポータ分子は、ハイブリダイズ可能な
配列中に８Ｇヌクレオチドを有し、センス配列は１５ヌ
クレオチドを有し、ＡＴに対するＧＣの割合が１であっ
てプローブの上記アンチセンス配列のヌクレオチドに対
し相補的であり、レポータ分子のセンス配列は、ハイブ
リダイズ可能な配列の近くに位置し、３Ｇヌクレオチド
から成り；レポータ分子はＣｒ原子で標識したマイクロ
ビーズに結合され； （Ａ）　　上記（２）と同一の二重らせんであるが、遺
伝子プローブのアンチセンス配列が工ＶＣ対応するもの
でありてマイクロビーズがＴｉ原子で標識されている二
重らせん。

分析は約５０℃にて行う。１５塩基対の融解温度は約５
５℃であるから、上記二重らせん（２）及び（Ａ）は媒
質中で、レポータセンス配列と、同数の遺伝子プローブ
アンチセンス配列との１５塩基対から成る弱いハイブリ
ッドとして維持される。１５塩基対のハイブリッドは分
析温度の直ぐ下にその融解温度を有する。

分析温度においてはレポータ分子とホモポリマーとの間
におけるハイブリッドは形成されない。

なぜならば、ホモポリマーと塩基対を形成し得る、レポ
ータ分子のハイブリッド可能な配列はわずか８Ｇヌクレ
オチドであって、８ＧＣ対のハイブリッドは分析温度を
はるかに下回る３５℃においてその融解温度を有するか
らである。

標的思及び工配列を含む遺伝子制限断片を水性媒質中に
導入する。遺伝子プローブのアンチセンス配列は２５ヌ
クレオチドを有するので、遺伝子プローブは弱くハイブ
リダイズしたブローブーレポータニ重らせんから解離し
て標的ｒＢｓ及びｍｙｃ配列との間に、より強くハイブ
リダイズした二重らせんを形成する。解離した各々のプ
ローブーレポータニ重らせんは、その最初の二重らせん
のプローブとハイブリダイズしていた、標的配列忙特異
的な標識を有するマイクロビーズに結合したレポータ分
子を放出する。

解離したレポータ分子はハイブリダイゼーシ田ンにより
て二重らせんを形成する。なぜならば、遺伝子プローブ
から放出された際、レポータ分子は、そのハイブリダイ
ズ可能な配列中に８Ｇヌクレオチド、その近くＫそのセ
ンス配列中の３Ｇヌクレオチドを更に含み、それらはも
はやプローブとのハイブリダイゼーシヨンによってブロ
ックされず、合計１１Ｇヌクレオチドがホモポリマーと
ハイブリダイズし得るからである。ＩＩＧＣ塩基対を有
するホモボリマーーレポータハイブリッドが形成され、
その融解温度は分析温度を上回る約６３℃である。

ホモポリマーーレポータニ重らせんのマイクロビーズは
ガラス支持体の一定の場所に固定される。

■識の検出は、上述の通りＸ線螢光忙よりて行う。

Ｃｒからの螢光シグナルは、毘の量に相関し、ＴＩから
の螢光シグナルはｍｙｃの量に相関し、このシグナルも
同時に得られる。

実施例２ 実施例１で記した制限断片を分析する。以下のものを含
有する水性媒質を準備する： （ｉ）以下の二重らせん； （ａ）ガラス支持体に一方の末端が結合した２０Ｃヌク
レオチドを有するホモポリマーであつて、そのホモポリ
マーは（ｂ）　Ｂ　ｏヌクレオチドを含有する、ハイブ
リダイズ可能な配列と２５スクレオチドのｒａｓ　Ｋ対
応するアンチセンス配列を有する遺伝子プローブとハイ
ブリダイズし、上記アンチセンス配列はハイブリダイズ
可能な配列の末端に位置する３Ｇヌクレオチドを含有す
るように選択され；遺伝子プローブは、Ｃｒ原子で標識
されたマイクロビーズに結合しており； （ｉｉ）上記（ｉ）と同様の二重らせんであるが、遺伝
子プローブのアンチセンス配列はｍｙｃで、マイクロビ
ーズがＴｉ原子で標識されている二重らせん。

この様に支持体の一定の位置に存在する各標識タイプの
マイクロビーズの量が基本となる既知の量であり、その
量はあるいは、Ｘ線螢光によって測定される分析温度は
４５℃である。

各ホモポリマー−プローブ二重らせんは、ホモポリマー
中のヌクレオチドとハイブリダイズした、遺伝子プロー
ブ中の上記ヌクレオチドと同数の、合計１１０Ｃ対から
成る。ＩＩＧＣ塩基対の融解温度は６３℃であり、分析
温度４５℃を上回るので、ホモポリマー−プローブ二重
らせん（ｉ）及び（ｉｉ）はハイブリッドとして媒質中
に残される。

標的ｒ３ｓ及び！配列を含む遺伝子断片は水性媒質中に
導入する。遺伝子プローブのアンチセンス配列は２５ヌ
クレオチドを有するので、それは標的配列とより強くハ
イブリダイズし、それにより標的は、遺伝子プローブの
ハイブリダイズ可能な配列の近くにあるアンチセンス配
列の３Ｇヌクレオチドをブロックする。これにより、ホ
モポリマーとハイブリダイズすることのできる遺伝子プ
ローブのＧヌクレオチドが減らされ、ハイブリダイズ可
能な配列の８Ｇヌクレオチドとなる。８０Ｃ対の二重ら
せんの融解温度は約３５℃で、それは分析温度を下回る
ものである。従って、遺伝子プローブはホモポリマーか
ら放出され、標識マイクロビーズな運び去り、プローブ
−標的二重らせんとして媒質中に存在する。

ガラス支持体の一定の位置に固着したまま残存している
、ホモボリマーープローブニ重らせんのマイクロビーズ
の標識は、上述のよ５ＫＬ、てＸＩｓ螢光により検出さ
れる。Ｃｒからの螢光シグナルの減少は、ｒａｓ　ｔに
相関し、Ｔｉからの螢光ジグカルの減少も同時に測定さ
れ、それは」１量に相関する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の分析の一具体例の概略図である。第２
図は本発明の分析の他の具体例の概略図である。 代理人　三　宅　正　夫（他１名） 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ 手続補正書（自発） 平成元年 ５月２３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の事項からなる遺伝子配列の分析方法：予め決
   定された分析条件下、水性媒質中に（１）分析されるべ
   き配列（標的配列）を含む遺伝物質及び（２）（ｉ）上
   記標的配列に対応する遺伝子プローブと（ｉｉ）標識マ
   イクロビーズに結合したレポータ分子とが弱くハイブリ
   ダイズして成るヌクレオチド二重らせんであって、上記
   遺伝子プローブが、予め決定された分析条件下、上記レ
   ポータ分子に対してよりも上記標的配列に対し、より強
   くハイブリダイズすることができる、ヌクレオチド二重
   らせんを混合し； その際、標的配列が上記二重らせんの遺伝子プローブと
   ハイブリダイズし、それによりレポータ分子が上記プロ
   ーブ−レポータ二重らせんから解離し； 解離したレポータ分子を解離していないプローブ−レポ
   ータ二重らせんから分別し； 解離し、分別されたレポータ分子に結合しているマイク
   ロビーズの標識を検出しする。 ２、標的配列が特徴を示すセンス配列から成り、遺伝子
   プローブが上記標的配列の特徴を示すセンス配列に対し
   相補的なアンチセンス配列から成り、レポータ分子が標
   的センス配列よりも短いセンス配列であって、遺伝子プ
   ローブのアンチセンス配列の一部に対し相補的なセンス
   配列から成る、特許請求の範囲第１項による方法。 ３、遺伝子プローブが、レポータ分子と弱くハイブリダ
   イズした二重らせんを形成し、標的配列とは強くハイブ
   リダイズした二重らせんを形成する様に、温度及びｐＨ
   から選択される分析の条件が予め決定されている、特許
   請求の範囲第１項または第２項による方法。 ４、分析が遺伝子プローブとレポータ分子との二重らせ
   んの融解温度の直ぐ下の温度において行われる、特許請
   求の範囲第３項による方法。 ５、上記の解離したレポータ分子を解離していないレポ
   ータ分子から分別する為、解離したレポータ分子と選択
   的にハイブリダイズする複数のヌクレオチドポリマーを
   上記水性媒質中に入れておくことから成る、特許請求の
   範囲第２項による方法。 ６、ヌクレオチドポリマーがヌクレオチドから成るホモ
   ポリマー分子である、特許請求の範囲第５項による方法
   。 ７、レポータ分子が、更に上記ホモポリマーとハイブリ
   ダイズする様に調整された、ハイブリダイズ可能な配列
   から成り、上記ホモポリマーと塩基対を形成することの
   できるいくつかのヌクレオチドが上記ハイブリダイズ可
   能な配列あるいは上記ハイブリダイズ可能な配列とレポ
   ータ分子のセンス配列との両方から成る、特許請求の範
   囲第６項による方法。 ８、予め決定された分析条件下、レポータ分子が遺伝子
   プローブから解離している時、塩基対形成ヌクレオチド
   の数が、上記ハイブリダイズ可能な配列と上記ホモポリ
   マーとの間にレポーターホモポリマー二重らせんを形成
   する為に十分な数であり、レポータ分子が遺伝子プロー
   ブとハイブリダイズしている時には、上記遺伝子プロー
   ブによる塩基対形成ヌクレオチドの一部のブロッキング
   により、塩基対形成ヌクレオチドの数が、反応条件下、
   不十分な数である、特許請求の範囲第７項による方法。 ９、塩基対形成ヌクレオチドがハイブリダイズ可能な配
   列とレポータ分子のセンス配列との両方から成り、上記
   センス配列の塩基対形成ヌクレオチドが上記ハイブリダ
   イズ可能な配列の近くに位置する、特許請求の範囲第８
   項による方法。 １０、ホモポリマーが、レポーターホモポリマー二重ら
   せんの形成によって、解離したレポータが集められる固
   相支持体に結合される、特許請求の範囲第８項による方
   法。 １１、各ホモポリマー分子が、磁気で標識したマイクロ
   ビーズに結合され、解離した標識レポータ分子が、磁気
   による標識を有するレポーターホモポリマー二重らせん
   を形成し、所望の場所にレポーターホモポリマ二重らせ
   んを磁力によって集め、上記場所において、レポータ分
   子に結合したマイクロビーズの標識を検出することによ
   り、解離していないプローブ−レポータ二重らせんから
   、解離した標識レポータ分子が分別される、特許請求の
   範囲第８項による方法。 １２、上記マイクロビーズが、着色化合物、紫外線下螢
   光性の化合物、Ｘ線螢光により検出し得る、放射性追跡
   子あるいは金属元素あるいは化合物で標識されている、
   特許請求の範囲第１項乃至第２項による方法。 １３、マイクロビーズが金属元素または化合物で標識さ
   れ、解離したレポータ配列がＸ線螢光分析により検出さ
   れる、特許請求の範囲第１２項による方法。 １４、マイクロビーズが金属元素または化合物で標識さ
   れ、解離したレポータ分子に結合した標識マイクロビー
   ズが、固相支持体上に集められた解離レポータ分子に照
   射する為のＸ線または電子線源及び狭く密な角度（ａ　
   ｎａｒｒｏｗ　ｓｏｌｉｄ　ａｎｇｌｅ）を観察し得る
   Ｘ線螢光検出器とを使用して検出され、上記固相支持体
   上の固定されたホモポリマーの位置は、上記検出器及び
   上記水性媒体との関係で、上記検出器が上記水性媒体中
   の解離していないレポータ分子によって放出された有意
   数の螢光Ｘ線を観測することなく、上記集められた解離
   レポータ分子により放出された螢光Ｘ線を実質的に観測
   する様に選択される、特許請求の範囲第１０項による方
   法。 １５、更に以下のことから成る特許請求の範囲第１３項
   または１４項による方法： 対照区として既知量の既知標的配列及び弱くハイブリダ
   イズして成る更なるヌクレオチド二重らせんを水性媒体
   中に混合し、上記更なる二重らせんが、（ｉｉｉ）上記
   既知標的配列の遺伝子プローブと（ｉｖ）標識マイクロ
   ビーズに結合したレポータ分子とから成り、上記マイク
   ロビーズがレポータ分子（ｉｉ）の標識とは異なる金属
   元素で標識され、上記遺伝子プローブ（ｉｉｉ）が予め
   決定された分析条件下、レポータ分子（ｉｖ）に対して
   よりも、上記既知標的配列と、より強くハイブリダイズ
   することのでき、（Ａ）未知の標的配列に対する遺伝子
   プローブ（ｉ）から解離したレポータ分子（ｉｉ）に結
   合したマイクロビーズの標識及び同既知標的配列に対す
   る遺伝子プローブ（ｉｉｉ）から解離したレポータ分子
   （ｉｖ）に結合したマイクロビーズの標識とを上記異な
   る金属元素のＸ線螢光の分析により、同時且つ別個に検
   出し、既知標的配列の分析結果に対し、未知の標的配列
   の分析結果を検量（ｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇ）する。 １６、上記遺伝物質が分析されるべき異種の標的配列を
   含有し、上記異種の標的配列が、異種のハイブリダイズ
   したヌクレオチド二重らせんであって、（ｉ）分析され
   る異種の標的配列のうちの特定の一とハイブリダイズし
   得る、異なるタイプの遺伝子プローブ、と（ｉｉ）異な
   る標識を有するマイクロビーズに結合したレポータ分子
   とから成るヌクレオチド二重らせんを水性媒質中で混合
   し； 各々の異なる金属元素に特徴的なＸ線螢光を分析するこ
   とにより、異なった標識を有するマイクロビーズの標識
   を同時且つ別個に検出する、特許請求の範囲第１３、１
   ４または１５項による方法。 １７、以下のことから成る遺伝子配列を分析する方法； 予め決定された分析条件下、（ I ）分析されるべき配
   列（標的配列）を含む遺伝物質及び（II）（ａ）標識さ
   れたマイクロビーズに結合した、上記標的配列に対する
   遺伝子プローブ、と（ｂ）ホモポリマー分子とが弱くハ
   イブリダイズして成るヌクレオチド二重らせんを水性媒
   質中で混合し、上記遺伝子プローブが上記予め決定され
   た分析条件下、上記ホモポリマーに対してよりも、上記
   標的配列に対して、より強くハイブリダイズすることが
   でき； よって標的配列がプローブ−ホモポリマー二重らせんの
   遺伝子プローブとハイブリダイズして標的−プローブ二
   重らせんを形成し、形成された標的−プローブ二重らせ
   んの遺伝子プローブに担持された標識マイクロビーズが
   上記ホモポリマーから解離し； 残されたプローブ−ホモポリマー二重らせんを標的−プ
   ローブ二重らせんを分離し； 残されたプローブ−ホモポリマー二重らせん中の標識マ
   イクロビーズの標識を検出して、最初に与えられたプロ
   ーブ−ホモポリマー二重らせんにおける標識のカウント
   に比較してその減少を測定する。 １８、プローブ−ホモポリマー二重らせんのホモポリマ
   ーが、固相支持体にその一定の場所において結合してい
   る、特許請求の範囲第１７項による方法。 １９、標的配列が、特徴を示すセンス配列から成り、遺
   伝子プローブが（１）上記標的配列の特徴を示すセンス
   配列に対し相補的なアンチセンス配列及び（２）上記ホ
   モポリマーとハイブリダイズするように調整されたハイ
   ブリダイズ可能な配列から成り、上記ホモポリマーと塩
   基対を形成し得るいくつかのヌクレオチドは上記ハイブ
   リダイズ可能な配列または、上記ハイブリダイズ可能な
   配列と遺伝子プローブアンチセンス配列との両方から成
   る、特許請求の範囲第１７項または１８項による方法。 ２０、上記標的配列が存在しない時、予め決定された条
   件下、塩基対形成ヌクレオチドの数が、上記プローブ−
   ホモポリマー二重らせんの遺伝子プローブとホモポリマ
   ーとがハイブリダイズした状態で維持される為に十分な
   数であり、標的配列が水性媒質中に存在する時には、上
   記標的配列による上記塩基対形成ヌクレオチドの一部の
   ブロッキングにより、上記ヌクレオチドの数が、ハイブ
   リダイズした状態で維持する為には不十分である、特許
   請求の範囲第１９項による方法。 ２１、塩基対形成ヌクレオチドが、ハイブリダイズ可能
   な配列と遺伝子プローブのアンチセンス配列との両方か
   ら成り、上記アンチセンス配列の塩基対形成ヌクレオチ
   ドが、上記ハイブリダイズ可能な配列の近くに位置する
   、特許請求の範囲第２０項による方法。 ２２、遺伝子プローブが、ホモポリマーとの間に弱くハ
   イブリダイズして成る二重らせんを形成し、標的配列と
   の間には強くハイブリダイズして成る二重らせんを形成
   するように、温度及びｐＨから選択される分析の条件を
   予め決定する、特許請求の範囲第１７項乃至２１項によ
   る方法。 ２３、分析が遺伝子プローブとホモポリマーとの二重ら
   せんの融解温度の直ぐ下の温度において行なわれる、特
   許請求の範囲第２２項による方法。 ２４、先ず、プローブ−ホモポリマー二重らせんの標識
   のカウントの減少を測定した後、（ａ）上記遺伝子プロ
   ーブのハイブリダイズ可能な配列から成る塩基対形成ヌ
   クレオチドと（ｂ）上記ホモポリマーとにより形成され
   得る二重らせんの融解温度を下回るように分析温度を下
   げ、プローブ−ホモポリマー二重らせん中の標識マイク
   ロビーズの標識を検出して最初の測定におけるカウント
   と比較して標識のカウントの増加を測定する、特許請求
   の範囲第２３項による方法。 ２５、上記マイクロビーズが、着色化合物、紫外線下螢
   光性である化合物、放射性追跡子あるいはＸ線螢光によ
   って検出し得る金属元素または化合物で標識されている
   、特許請求の範囲第１７項乃至２４項による方法。 ２６、マイクロビーズが金属元素または化合物で標識さ
   れ、プローブ−ホモポリマー二重らせん中の標識マイク
   ロビーズがＸ線螢光分析によって検出される、特許請求
   の範囲第２５項による方法。 ２７、マイクロビーズが金属元素または化合物で標識さ
   れ、プローブ−ホモポリマー二重らせんに結合した標識
   マイクロビーズが、上記固相支持体上に集められたプロ
   ーブ−ホモポリマー二重らせんに照射する為のＸ線また
   は電子線源及び狭い密な角度（ａ　ｎａｒｒｏｗ　ｓｏ
   ｌｉｄ　ａｎｇｌｅ）を観察し得るＸ線螢光検出器を使
   用し、上記検出器が、上記水性媒質中で、標的−プロー
   ブ二重らせんにより放出される螢光Ｘ線の有意数を観測
   することなく、上記集められたプローブ−ホモポリマー
   二重らせんにより放出された螢光Ｘ線を実質的に観測す
   るように、上記固相支持体の一定の場所を上記検出器と
   上記水性媒質との関係において選択する、特許請求の範
   囲第１８項による方法。 ２８、更に以下のことから成る特許請求の範囲第２６項
   または２７項による方法： 対照区として既知量の既知標的配列と、弱くハイブリダ
   イズして成る更なるヌクレオチド二重らせんであって、
   （ｃ）上記既知標的配列に対する遺伝子プローブと（ｄ
   ）ホモポリマー分子とから成る二重らせんを水性媒質中
   で混合し、上記遺伝子プローブ（ｃ）が標識マイクロビ
   ーズに結合し、上記マイクロビーズが、未知の標的に対
   する遺伝子プローブ（ａ）の標識とは異なる金属元素で
   標識され、上記遺伝子プローブが、予め決定された分析
   条件下、上記ホモポリマー（ｄ）に対してよりも、上記
   既知標的配列と、より強くハイブリダイズすることがで
   き； I 、残存するプローブ（ａ）−ホモポリマー（ｂ）二
   重らせん中の標識マイクロビーズの標識と、II、残存し
   ているプローブ（ｃ）−ホモポリマー（ｄ）二重らせん
   中の標識マイクロビーズの標識を上記異なる金属元素の
   Ｘ線螢光特性の分析により同時且つ別個に検出し； 対照区の分析結果に対し、標的配列の分析結果を検量（
   ｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇ）する。 ２９、上記遺伝物質が分析されるべき異種の標的配列を
   含み、上記異種の標的配列が、水性媒質中で、弱くハイ
   ブリダイズした種々の異なるヌクレオチド二重らせんで
   あって（ａ）分析されるべき異種の標識配列のうちの特
   定の一とハイブリダイズし得、異なる標識を有するマイ
   クロビーズに結合している、異なったタイプの遺伝子プ
   ローブと（ｂ）ホモポリマーとから成るヌクレオチド二
   重らせんを混合することにより検出され、種々の異なる
   二重らせんのマイクロビーズが異なる金属元素標識を有
   し、 各々の異なる金属元素のＸ線螢光特性の分析により、残
   存するプローブ−ホモポリマー二重らせん中の、異なる
   標識を有するマイクロビーズの標識を同時且つ別個に検
   出する、特許請求の範囲第２６、２７または２８項によ
   る方法。 ３０、分析されるべき遺伝子標的配列を含む遺伝物質を
   含有する水性媒質中で、遺伝子配列を分析する為のキッ
   トであって上記キットが上記水性媒質中に一体的に、ま
   たは、該媒質の別の部分に以下の成分を含有するキット
   ： Ａ、（ｉ）上記標的配列に対する遺伝子プローブと（ｉ
   ｉ）標識マイクロビーズに結合したレポータ分子とが弱
   くハイブリダイズして成るヌクレオチド二重らせん；及
   び Ｂ、上記レポータ分子が遺伝子プローブ（ｉ）とハイブ
   リダイズしていない時にレポータ分子（ｉｉ）と選択的
   にハイブリダイズすることのできる複数のヌクレオチド
   からなるホモポリマー。 ３１、上記標的配列、遺伝子プローブ、レポータ分子、
   標識マイクロビーズ及びヌクレオチドから成るホモポリ
   マーが特許請求の範囲第２項、第７項乃至９項あるいは
   第１１項乃至第１３項のうちのいずれかに定義されてい
   る通りである、特許請求の範囲第３０項による方法。 ３２、更に、ホモポリマーが結合する固相支持体から成
   る、特許請求の範囲第３０項または３１項による方法。 ３３、異種の標的配列を分析する為の特許請求の範囲第
   ３０、３１または３２項によるキットであって、成分Ａ
   が更に、ハイブリダイズした種々の異なるヌクレオチド
   二重らせんから成り、種々の異なるヌクレオチドの各々
   が、（ｉ）異種の、分析されるべき標的配列のうちの特
   定の一とハイブリダイズし得る、異なったタイプの遺伝
   子プローブ、と（ｉｉ）異なる標識を有するマイクロビ
   ーズに結合したレポータ分子、とから成り、異なる種々
   の二重らせんのマイクロビーズが異なる金属元素標識を
   有し、上記種々の異なる二重らせんが同じ水性媒質中か
   またはその別々の部分に含まれている、キット。 ３４、更に以下のものを含む、特許請求の範囲第３０項
   乃至３３項によるキット： Ｃ、成分Ａ、を含有する水性媒質とは別個の水性媒質の
   部分に含有される既知量の既知標的配列；及び Ｄ、弱くハイブリダイズして成る更なるヌクレオチド二
   重らせんであって上記更なる二重らせんが（ｉｉｉ）上
   記既知の標的配列に対するプローブと（ｉｖ）標識マイ
   クロビーズに結合したレポータ分子とから成り、上記マ
   イクロビーズがレポータ分子（ｉｉ）の標識とは異なる
   金属元素で標識され、上記遺伝子プローブ（ｉｉｉ）が
   、予め決定した分析条件下、上記レポータ分子（ｉｖ）
   に対してよりも上記既知標的配列に対しより強くハイブ
   リダイズすることができる。 ３５、分析されるべき遺伝子標的配列を含む遺伝物質を
   含有する水性媒質中で遺伝子配列を分析する為のキット
   であって、（ａ）標識マイクロビーズに結合した上記標
   的配列に対する遺伝子プローブ、と（ｂ）ホモポリマー
   とが弱くハイブリダイズして成るヌクレオチド二重らせ
   んから成る成分（Ａ）を含み、上記遺伝子プローブが、
   予め決定された分析条件下上記ホモポリマーに対してよ
   りも、上記標的配列に対し、より強くハイブリダイズす
   ることができる、キット。 ３６、標的配列、遺伝子プローブ、標識マイクロビーズ
   及びホモポリマー分子が、特許請求の範囲第１９乃至２
   １項、第２５または２６項のうちのいずれかにおいて定
   義されている、特許請求の範囲第３５項によるキット。 ３７、更に、ホモポリマーが結合する固相支持体から成
   る特許請求の範囲第３５項または第３６項によるキット
   。 ３８、異種の標的配列を分析する為の、特許請求の範囲
   第３５、３６または３７項によるキットであって、成分
   （Ａ）が、更に種々の異なるハイブリダイズした二重ら
   せんから成り、各々の種々の異なる二重らせんが（ａ）
   異なった標識を有するマイクロビーズに結合し、分析さ
   れるべき異種の標的配列のうちの特定の一とハイブリダ
   イズすることのできる、異なったタイプの遺伝子プロー
   ブ、と（ｂ）ホモポリマー分子とから成り、種々の異な
   る二重らせんのマイクロビーズが異なった金属元素標識
   を有し、上記種々の異なる二重らせんが同一の水性媒質
   中かその別々の部分中に含有されている、キット。 ３９、更に以下のものを含む、特許請求の範囲第３５乃
   至３８項によるキット： Ｂ、成分Ａを含有する水性媒質とは別の水性媒質の部分
   に含有される、対照区としての既知量の既知標的配列；
   及び Ｃ、（ｃ）上記既知標的配列に対する遺伝子プローブと
   （ｄ）ホモポリマーとから成る、弱くハイブリダイズし
   た更なるヌクレオチドであって、上記マイクロビーズが
   、遺伝子プローブ（ａ）の標識とは異なる金属元素で標
   識され、上記遺伝子プローブ（ｃ）が、予め決定された
   分析条件下、上記ホモポリマーに対してよりも、上記既
   知標的配列に対し、より強くハイブリダイズする。