JP2003116536A - 新規α−１，２−マンノシダーゼ及び該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 α−１，２−マンノシダーゼを菌体外に生産
する新規菌株と、この菌株を用いてα−１，２−マンノ
シダーゼを工業的に有利に製造する方法、及び製造した
酵素を用いてマンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化
合物を多量生産させる方法を提供すること。 【解決手段】 （ａ）α−１,２−マンノシド結合を含
むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−
１,２−マンノシド結合を特異的に分解する、及び
（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する作用を有するパエニバチルス属由来
の新規α−１,２−マンノシダーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規α−１,２−
マンノシダーゼ及び該酵素を用いたα−マンノシル糖化
合物の製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】糖鎖は生体内で、細胞膜や細胞小器官の
膜、タンパク質の表面等に分布し、細胞同士や細胞とタ
ンパク質、タンパク質同士等、互いの認識に役立ってお
り、これにより、酵素や細胞の作用対象が決定された
り、タンパク質が目的の部位まで正確に運ばれたりする
等、生体反応に重要な役割を果たしている。糖鎖構造中
には、α−マンノシド結合したマンノオリゴ糖部分が多
く存在し、特に糖タンパク質に結合しているハイマンノ
ース型糖鎖で見られるような糖鎖の先端部分に位置して
いる場合が多い。

【０００３】このようなことから、マンノオリゴ糖部分
は糖鎖の認識に直接関与していると考えられており、こ
れらの研究を行う際の研究用試薬として安価なマンノオ
リゴ糖が求められている。また、研究用試薬としての糖
鎖の合成を考えた場合、化学的合成法では長い糖鎖でト
ータル収率が極めて低くなってしまうという問題点があ
るが、酵素合成法でマンノオリゴ糖部分を組み合わせる
という手法も一法であると考えられ、この場合も、マン
ノオリゴ糖が必要とされる。

【０００４】マンノオリゴ糖などのマンノシル糖化合物
は、天然物からの抽出によって得られるが、その量は極
微量であるので、化学合成により合成することが考えら
れている。しかしながら、化学合成による方法は、行程
が複雑であり、トータル収率が極めて低くなってしまう
という問題がある。これに対して、酵素合成法によれ
ば、マンノースを含む糖類からマンノオリゴ糖などのマ
ンノシル糖化合物を有利に製造できる。このため酵素と
して、α−マンノシダーゼ等が開発されている。

【０００５】α−マンノシダーゼとしては、例えばタチ
ナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来のもの等を
用いるものが挙げられる（特開平５−４９４９２）。前
述した高マンノース型糖鎖に関しては、先端部にα−
１，２−マンノオリゴ糖が存在しているので、α−１，
２−マンノシダーゼが重要になるが、上記の酵素は、特
にこのような立体特異的なものを意図しているわけでは
ない。このα−１，２−マンノシダーゼについては、微
生物由来のものとして、アスペルギルス属に属する糸状
菌由来のもの（特開昭５７−５４５８８）、バチルス属
に属する細菌由来のもの（特開平５−６４５８６）、担
子菌由来のもの（Journal of Biotechnology７７（２０
００）ｐ．２５５−２６３）等が開発されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記した従来のα−
１，２−マンノシダーゼは、いずれもα−１，２−マン
ノシダーゼ活性が低く、また、培養法、精製法が煩雑な
ものが多く、工業的に安価に生産することは困難である
という問題がある。更に、前記したバチルス属に属する
細菌由来の酵素は、縮合によるオリゴ糖生成率が低いと
いう問題点がある。

【０００７】従って、本発明の目的は、α−１，２−マ
ンノシダーゼを菌体外に生産する新規菌株と、この菌株
を用いてα−１，２−マンノシダーゼを工業的に有利に
製造する方法、及び製造した酵素を用いてマンノオリゴ
糖などのα−マンノシル糖化合物を多量生産させる方法
を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな状況に鑑み、マンノシダーゼを生産する微生物を土
壌から検索したところ、新たに、これまで全く知られて
いなかった新規なマンノシダーゼを生産する微生物を発
見し、その生理化学的性質からパエニバチルス・イリノ
イセンシス（Paenibacillus illinoisensis）と同定さ
れ、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は、次の通りのものである。 １．下記の特性を有する新規α−１，２−マンノシダー
ゼ。 （１）作用 （ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末
端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
が、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ （４）最適pH：５〜７ （５）安定温度：４０℃ （６）安定pH：５〜１２ （７）分子量：約４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ） ２．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス属由
来のものである上記１記載のα−１,２−マンノシダー
ゼ。 ３．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イ
リノイセンシス由来のものである上記１又は２記載のα
−１,２−マンノシダーゼ。 ４．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イ
リノイセンシスNo．１３株由来のものである上記１、２
又は３記載のα−１,２−マンノシダーゼ。 ５．酵素反応によりマンノース又は非還元末端にα−マ
ンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させて
α−マンノシル糖化合物を製造する方法において、酵素
として、上記１、２、３又は４記載のα−１,２−マン
ノシダーゼを用いることを特徴とするα−マンノシル糖
化合物の製造方法。 ６．α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ糖である上
記５記載のα−マンノシル糖化合物の製造方法。 ７．パエニバチルス属由来の細菌を培養し、その培養物
からα−１,２−マンノシダーゼを採取することを特徴
とするα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。 ８．パエニバチルス属由来の細菌がパエニバチルス・イ
リノイセンシスである上記７記載のα−１,２−マンノ
シダーゼの製造方法。 ９．α−１,２−マンノシダーゼ生産能を有するパエニ
バチルス・イリノイセンシスNo．１３株。

【００１０】本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、
（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース
又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱
水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成
する特性を有するので、この特性を利用することによ
り、マンノオリゴ糖のα−マンノシル糖化合物を製造す
ることができる。

【００１１】本酵素の作用条件（ｐＨ５．０〜７．０、
反応温度４０℃：実施例２〜４参照）は、マンノースイ
ソメラーゼの作用条件（ｐＨ５．０〜９．０、温度４０
℃）とほぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼ
を併用することにより、フルクトースからα−マンノシ
ル糖化合物の製造が可能である。そして、本酵素は活性
が高く、例えば、従来知られているバチルス属のα−
１,２−マンノシダーゼに比べて、縮合によるオリゴ糖
生成率が顕著に優れている。また、本酵素は、発色物質
であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対し
て作用するので、活性測定等が容易である点において
も、特徴的である。更に、本酵素は、パエニバチルス・
イリノイセンシスに属する細菌を液体培養することによ
って培地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出
したり、アスペリギルス属の糸状菌を培養して製造され
る公知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に
適している。

【００１２】従って、以上の本発明の酵素の特性を利用
することにより、マンノース（フルクトース）やα−
１，２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノ
オリゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率
よく製造することができるので、本酵素は、糖タンパク
や糖脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研
究やその薬理研究などに資することができ、マンノオリ
ゴ糖の工業生産を可能とする点で、非常に価値がある。
なお、パエニバチルス属の微生物が、α−１，２−マン
ノシダーゼを生産することについては未だ知られておら
ず、本発明のものが最初である点でも、技術的な価値が
高い。

【００１３】以下、本発明を更に説明する。 １． 菌株 本発明に使用するパエニバチルス・イリノイセンシスN
o．１３株は、本発明者らによって土壌中より発見され
た菌種であり、産業総合研究所生命工学工業技術研究所
に、ＦＥＲＭ Ｐ−１８２５６として寄託されている。

【００１４】パエニバチルス・イリノイセンシスNo．１
３株は、以下の菌学的諸性質を有する。 細胞の形及び大きさ：０．５×１．８〜２．４μｍのか
ん菌 運動性：＋ グラム染色性：＋ 胞子形成：＋ 酸素に対する態度：好気性 生育最適温度：３０℃ また、１６SrRNA配列の分析を行い、既知配列との相同
性を検索した結果、パエニバチルス・イリノイセンシス
の１６SrRNA配列と平均９８．５％の確率で一致してい
た。これらのことから、本菌はパエニバチルス・イリノ
イセンシスと判定した。

【００１５】２． マンノシダーゼの産出 マンノシダーゼは、上記の菌株から生産されるものが好
ましいが、パエニバチルス属に属する微生物から生産さ
れるものであれば何れでもよく、例えば、パエニバチル
ス・アルギノリティクス、パエニバチルス・アミノリテ
ィクス、パエニバチルス・マセランス、パエニバチルス
・ポリミキサ等が挙げられる。また、これらの組換え酵
素も利用できる。分泌の場所は特に制限されず、菌体
内、菌体外の何れでもよい。

【００１６】この酵素は、以下のような、通常の培養手
段により産出される。フルクトース、グルコース、マン
ノース、ガラクトース、異性化糖、蔗糖、マルトース、
キシロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、マン
ナンなど種々な糖、糖アルコール及びデキストリンなど
を炭素源とし、それに微生物の増殖に必要な窒素化合物
（酵母エキス、魚肉エキス、ペプトン、アミノ酸、など
の有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、
ミネラルを加えた培地で、２０〜３５℃、好ましくは３
０℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは
１〜３日培養する。分泌の場所が菌体内の場合、培養
後、濾過又は遠心分離により菌体を回収し、そのまま使
用するか、又は超音波若しくは自己消化法等により該酵
素を抽出し使用する。又、分泌の場所が菌体外の場合、
培養後、濾過又は遠心分離により菌体を除去し、濾過又
は上清をそのまま使用できるので、有利である。抽出さ
れた酵素は、必要により、硫酸アンモニウム、アセト
ン、メタノール、エタノール等で沈澱し、精製濃縮し、
又は乾燥保存する。

【００１７】また、上記の菌体、菌体処理物、濾液また
は上清からα−１，２−マンノシダーゼをさらに精製す
ることも可能であり、その方法としては、例えば、硫安
による塩析、エタノール、アセトン等による溶媒沈澱
法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による
一般的な酵素精製方法が採用される。例えば、パエニバ
チルス・イリノイセンシスNo．１３菌株を、酵母マンナ
ンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した培地中、
好気的な条件下で培養した培養液から菌体を分離除去
し、ついでDEAE−トヨパール６５０Ｓ（商品名：東ソー
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィー及び
トヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名：東ソー株式会社製）
によるゲル濾過クロマトグラフィーの各段階を経て精製
し、電気泳動的にほば均一な精製酵素標品を得ることが
出来る。

【００１８】本発明におけるα−１，２−マンノシダー
ゼ活性の測定法及び活性表示法は以下のとおりである。
酵母マンナンを基質として反応を行い、遊離するマンノ
ースを測定することによって行った。すなわち、酵母マ
ンナン（終濃度０．１％）と酵素液を含む反応液（０．
６Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中、４０℃で３０分
間、反応を行い、反応後、マンノースを標準として還元
糖をネルソン・ソモジ法によって測定した。酵素活性の
単位は、上記反応において１秒間に１モルのマンノース
を遊離する酵素量を１カタール（以下k a t）とした。

【００１９】本発明の新規α−１，２−マンノシダーゼ
の理化学的性質を以下に示す。 （１）作用 （ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末
端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
が、α−１，２−マンノビオース、α−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない（実施例３参照）。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ 本酵素について、２０〜６０℃の温度で、終濃度６０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０分間反応させ
て相対活性を調べたところ、最適温度は、図１に示すよ
うに３５℃〜４５℃であった。 （４）最適ｐＨ：５〜７ 本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソ
ン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて４０℃、
３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、
最適ｐＨは、図２に示すように５〜７であった。 （５）安定温度：４０℃以下 本酵素について、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）
中、０〜６０℃の範囲で１０分間処理した後、４０℃、
３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、
安定温度は、図１に示すように４０℃以下であった。 （６）安定ｐＨ：５〜１２ 本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソ
ン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて、４℃、
２４時間の処理を行った後、６０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）中で、４０℃、３０分間の酵素反応によ
って相対活性を調べたところ、安定ｐＨは、図２に示す
ように５〜１２であった。 （７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）

【００２０】３． α−マンノシル糖化合物の製造 本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、（ａ）α−
１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリ
ゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特
異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース又は非還元
末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合また
は転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する特性を
有する。また、本酵素は、前述した、従来のバチルス属
由来のもの（特開平５−６５４８６）とは違い、ｐ−ニ
トロフェニル−α−D−マンノシドに作用する基質特異
性を有する。上記のよう本酵素の特性を利用すれば、マ
ンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を製造する
ことが出来るので、以下説明する。

【００２１】１） 縮合反応によるマンノオリゴ糖の製
造 本酵素の縮合反応性を利用することにより、マンノース
を脱水縮合させてマンノオリゴ糖を製造することができ
る。例えば、マンノオリゴ糖としては、Ｍａｎ１−２Ｍ
ａｎ、Ｍａｎ１−３Ｍａｎ、Ｍａｎ１−６Ｍａｎなどを
製造することが出来る。マンノオリゴ糖の製造方法とし
ては、例えば、以下のようにして行うのがよい。高濃度
のマンノースを含む溶液に、パエニバチルス・イリノイ
センシス由来のα−１，２−マンノシダーゼを添加し、
その反応液を室温乃至８０℃、好ましくは４０℃でイン
キュベーションし、ＨＰＬＣにて反応の進行を観察し、
マンノオリゴ糖の含量が高まった時点で反応を停止した
のち、活性炭クロマトグラフィー等の精製手段を用いる
ことにより、目的物を得ることが出来る。

【００２２】２） 転移反応によるα−マンノシル糖化
合物の製造 本酵素の転移反応性を利用することにより、マンノース
供与体とマンノース受容体からα−マンノシル糖化合物
を製造することができる。マンノース供与体としては、
例えばｐ−ニトロフェニル−α−マンノシド、メチル−
α−マンノシド、フェニル−α−マンノシド等が挙げら
れる。一方、マンノース受容体としては、マンノース、
マンノビオース、ラミナリビオース等が挙げられる。本
転移反応は、通常の反応条件下で行うことができる。基
質溶液としては、受容体と供与体とを含有する水溶液又
はジメチルスルホキシドなどの有機溶剤液が用いられ
る。その場合、受容体と供与体のモル比は１：５０〜５
０：１が好ましく、基質濃度は５〜５０重量％が好まし
い。本反応は、受容体と供与体とを含有する基質溶液
に、本酵素を作用させることにより行うが、反応時のｐ
Ｈと温度は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜７０℃が適
当である。

【００２３】３） α−１，２−マンノシダーゼの使用
形態 α−１，２−マンノシダーゼとしては、菌体を通常の
方法で固定化したもの、菌体を機械的、酵素的、若し
くは、界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、又
は、それらを固定化したもの、菌体を破砕して破砕残
さを除去したもの、又は、それを固定化したもの、酵
素精製物、又は、それを固定化したもの、培養液また
は菌体を除去した培養上清、又はそれを濃縮、乾燥、及
び／あるいは固定化したもの等が挙げられる。固定化
は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラ
ギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなどを用い
た通常の固定化方法が使用できる。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、実施例によって本発明を詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特別
に標記がない場合、百分率はW／V％である。

【００２５】

【実施例１】（α−１，２−マンノシダーゼの調整）酵
母マンナン０．２％、硫酸第２鉄（７水和）０．００３
％、硫酸マグネシウム（７水和）０．０４％、塩化カル
シウム（２水和）０．００６％、リン酸水素２カリウム
０．６９％、リン酸２水素カリウム０．２３％、硫酸ア
ンモニウム０．０５％、酵母エキス０．１５％を含む液
体培地８００ml（ｐＨ７．０）を、３Ｌの坂口フラスコ
に入れ、１昼夜培養したパエニバチルス・イリノイセン
シスNo．１３株を加え、３０℃で２晩培養した。次い
で、この培養液を９，000×ｇ、３０分間遠心して菌体
を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）に対して１晩透析を行い、粗酵素液を得た。粗
酵素液の活性測定を行ったところ、１９ｍｋａｔ／Ｌで
あった。

【００２６】透析後の粗酵素液を１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｓカラムに吸着させ、０〜０．８Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。

【００２７】溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析し
た後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸
着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜
０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出さ
せた。

【００２８】溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析し
た後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸
着させ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１
５〜０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を
溶出させた。

【００２９】溶出させた活性画分を集めて、限外濾過
（分画分子量１０，０００）で濃縮した後、１５ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたトヨ
パールＨＷ−５５Ｆカラムに供し、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）により酵素を溶出させて、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により、均一なバンド
からなる精製酵素を得た。活性収率は１５％であった。

【００３０】

【実施例２】培養に用いる菌株を、それぞれ、パエニバ
チルス・イリノイセンシスＪＣＭ９９０７、パエニバチ
ルス・ポリミキサＪＣＭ２５０７、パエニバチルス・マ
セランスＪＣＭ２５００とした以外は、実施例１と同様
にして、粗酵素液を調製した。 それぞれの粗酵素液に
対して活性測定を行ったところ、それぞれ、１６ｍｋａ
ｔ／Ｌ、１２ｍｋａｔ／Ｌ、９ｍｋａｔ／Ｌであった。

【００３１】

【実施例３】（基質特異性）各マンノビオース（α−
１,２−マンノビオース、α−１,３−マンノビオース、
α−１,６−マンノビオース）０．０５％含む３０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、実施例１のα
−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃、９０分間イ
ンキュベートした後、以下の分析条件で分析した。

【００３２】ＨＰＬＣ：ウォーターズ社製 検出器：示差屈折計（日立 Ｄ−２５００ クロマトイン
テグレーター） カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＰＷ（東ソー株式
会社製） 流速：０．５ｍｌ／分 溶出：水

【００３３】分析結果は、図３〜５に示す。図３はα−
１,２−マンノビオース、図４はα−１,３−マンノビオ
ース、図５はα−１,６−マンノビオース、の結果であ
る。この結果によると、図３では、α−１，２−マンノ
ビオースが分解され、マンノースの位置にピークがシフ
トした。これに対して、図４（α−１,３−マンノビオ
ース）及び図５（α−１,６−マンノビオース）では、
ピークに変化はない。 この結果から、本酵素により、
α−１，２−マンノビオースのみが分解されたことが分
かる。

【００３４】

【実施例４】（縮合）６０％（Ｗ／Ｗ）のマンノース溶
液にマンノース１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように、
実施例１のα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０
℃、７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析
した。分析結果によると、全糖中に占めるマンノオリゴ
糖の割合は６．５％であった。この結果から、本酵素に
は、マンノースを脱水縮合させて、マンノオリゴ糖を生
成する活性があることが分かる。

【００３５】

【比較例１】（縮合）実施例４で用いた、実施例１のα
−１，２−マンノシダーゼに代えて、Bacillus sp. M−
90株由来のα−１．２−マンノシダーゼ（特開平５−６
４５８６）を使用した以外は、実施例４と同様にして、
マンノースの縮合を行った。分析結果によると、全糖中
に占めるマンノオリゴ糖の割合は２．２％であった。実
施例４と比較例１の分析結果の比較から、マンノースを
脱水縮合する活性は、本酵素の方が公知の酵素より高い
ことが分かる。

【００３６】

【実施例５】（転移）供与体としてｐ−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マンノシド３０％、受容体としてラミナリビ
オースの３０％を含有する基質溶液（ｐＨ６）に、ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド１ｇ当たり２０ｎ
ｋａｔとなるように、実施例１のα−１，２−マンノシ
ダーゼを加え、４０℃、７２時間反応させた。反応後の
液をＨＰＬＣで分析した。分析結果によると、全糖中に
占める転移生成物の割合は０．９％であった。この結果
から、本酵素には、非還元末端にα−マンノシド結合を
有する糖類を転移させて、α−マンノシル糖化合物を生
成する活性があることが分かる。

【００３７】

【発明の効果】（１）本発明の酵素は、α−１,２−マ
ンノシド結合の分解反応性やマンノース又は非還元末端
にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転
移させて、マンノオリゴ糖等のα−マンノシル糖化合物
を生成する性質等を有しているので、マンノオリゴ糖な
どのα−マンノシル糖化合物が製造し得る。また、本酵
素作用条件とマンノースイソメラーゼの作用条件とがほ
ぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼを併用す
ることにより、フルクトースからα−マンノシル糖化合
物が製造し得る。

【００３８】（２）本酵素は活性が高く、例えば、従来
知られているバチルス属のα−１,２−マンノシダーゼ
に比べて、オリゴ糖生成率が数倍高い。

【００３９】（３）本酵素は、発色物質であるｐ−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対して作用するの
で、活性測定等が容易である。

【００４０】（４）本酵素は、パエニバチルス・イリノ
イセンシスに属する細菌を液体培養することによって培
地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出した
り、アスペルギルス属の糸状菌を培養して製造される公
知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に適し
ている。

【００４１】（５）以上の本発明の酵素の特性を利用す
ることにより、マンノース（フルクトース）やα−１，
２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノオリ
ゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率よく
製造することができるので、本酵素は、糖タンパクや糖
脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研究や
その薬理研究などに資することができる点で、非常に価
値がある。

【００４２】（６）なお、パエニバチルス属の微生物
が、α−１，２−マンノシダーゼを生産することについ
ては未だ知られておらず、本発明のものが最初である点
でも、技術的な価値が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の最適温度と安定温度を示す説明
図である。

【図２】本発明の酵素の最適ｐＨと安定ｐＨを示す説明
図である。

【図３】本発明の酵素によるα−１,２−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。

【図４】本発明の酵素によるα−１,３−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。

【図５】本発明の酵素によるα−１,６−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中島 佑 宮城県仙台市泉区加茂２丁目９番地１ Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 LL05 4B064 AF04 CA02 CB24 CC03 CD09 DA16 4B065 AA01X AC12 AC14 BA22 CA31

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（１）〜（７）の特性を有する新
   規α−１,２−マンノシダーゼ。 （１）作用 （ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
   またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
   ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
   を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
   糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末
   端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
   −ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
   が、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノ
   ビオースには実質的に作用しない。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ （４）最適pH：５〜７ （５）安定温度：４０℃ （６）安定ｐＨ：５〜１２ （７）分子量：約４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
2. 【請求項２】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
   チルス属由来のものである請求項１記載のα−１,２−
   マンノシダーゼ。
3. 【請求項３】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
   チルス・イリノイセンシス由来のものである請求項１又
   は２記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
4. 【請求項４】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
   チルス・イリノイセンシスNo．１３株由来のものである
   請求項１、２又は３記載のα−１,２−マンノシダー
   ゼ。
5. 【請求項５】 酵素反応によりマンノース又は非還元末
   端にα−マンノシド結合を有する糖質を脱水縮合又は転
   移させてα−マンノシル糖化合物を製造する方法におい
   て、酵素として、請求項１、２、３又は４記載のα−
   １,２−マンノシダーゼを用いることを特徴とするα−
   マンノシル糖化合物の製造方法。
6. 【請求項６】 α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ
   糖である請求項５記載のα−マンノシル糖化合物の製造
   方法。
7. 【請求項７】 パエニバチルス属由来の細菌を培養し、
   その培養物からα−１,２−マンノシダーゼを採取する
   ことを特徴とするα−１,２−マンノシダーゼの製造方
   法。
8. 【請求項８】 パエニバチルス属由来の細菌がパエニバ
   チルス・イリノイセンシスである請求項７記載のα−
   １,２−マンノシダーゼの製造方法。
9. 【請求項９】 α−１,２−マンノシダーゼ生産能を有
   するパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株。