JP2003116536A - NEW alpha-1,2-MANNOSIDASE AND METHOD FOR PRODUCING alpha- MANNOSYL SACCHARIDE COMPOUND BY USING THE ENZYME - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new strain extracellularly producing α-1,2-mannosidase, a method for industrially advantageously producing the α-1,2-mannosidase by using the strain, and a method for mass-producing an α-mannosyl saccharide compound such as a mannooligosaccharide by using the produced enzyme. SOLUTION: This new α-1,2-mannosidase derived from the genus Paenibacillus has activities for (a) specifically degrading an α-1,2-mannoside bond at the nonreducing terminal of α-mannan or an oligosaccharide including the α-1,2- mannoside bond, and (b) forming the α-1,2-mannosyl saccharide compound by dehydrating or rearranging the mannose or a saccharide having the α-1,2- mannoside bond at the nonreducing terminal.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規α−１,２−
マンノシダーゼ及び該酵素を用いたα−マンノシル糖化
合物の製造法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel α-1,2-
The present invention relates to a mannosidase and a method for producing an α-mannosyl sugar compound using the enzyme.

【０００２】[0002]

【従来の技術】糖鎖は生体内で、細胞膜や細胞小器官の
膜、タンパク質の表面等に分布し、細胞同士や細胞とタ
ンパク質、タンパク質同士等、互いの認識に役立ってお
り、これにより、酵素や細胞の作用対象が決定された
り、タンパク質が目的の部位まで正確に運ばれたりする
等、生体反応に重要な役割を果たしている。糖鎖構造中
には、α−マンノシド結合したマンノオリゴ糖部分が多
く存在し、特に糖タンパク質に結合しているハイマンノ
ース型糖鎖で見られるような糖鎖の先端部分に位置して
いる場合が多い。2. Description of the Related Art Sugar chains are distributed in vivo on cell membranes, organelle membranes, protein surfaces, etc., and are useful for recognizing cells, cells and proteins, proteins, etc. It plays an important role in biological reactions, such as the target of action of enzymes and cells is determined, and the protein is accurately transported to the target site. In the sugar chain structure, there are many α-mannoside-linked manno-oligosaccharide moieties, and in particular, they may be located at the tip of the sugar chain as seen in high-mannose type sugar chains bound to glycoproteins. Many.

【０００３】このようなことから、マンノオリゴ糖部分
は糖鎖の認識に直接関与していると考えられており、こ
れらの研究を行う際の研究用試薬として安価なマンノオ
リゴ糖が求められている。また、研究用試薬としての糖
鎖の合成を考えた場合、化学的合成法では長い糖鎖でト
ータル収率が極めて低くなってしまうという問題点があ
るが、酵素合成法でマンノオリゴ糖部分を組み合わせる
という手法も一法であると考えられ、この場合も、マン
ノオリゴ糖が必要とされる。From the above, it is considered that the manno-oligosaccharide portion is directly involved in the recognition of sugar chains, and there is a demand for an inexpensive manno-oligosaccharide as a research reagent for conducting these studies. In addition, when considering the synthesis of sugar chains as research reagents, the chemical synthesis method has a problem that the total yield becomes extremely low with long sugar chains, but the enzymatic synthesis method combines the manno-oligosaccharide moiety. This method is also considered to be one method, and also in this case, manno-oligosaccharide is required.

【０００４】マンノオリゴ糖などのマンノシル糖化合物
は、天然物からの抽出によって得られるが、その量は極
微量であるので、化学合成により合成することが考えら
れている。しかしながら、化学合成による方法は、行程
が複雑であり、トータル収率が極めて低くなってしまう
という問題がある。これに対して、酵素合成法によれ
ば、マンノースを含む糖類からマンノオリゴ糖などのマ
ンノシル糖化合物を有利に製造できる。このため酵素と
して、α−マンノシダーゼ等が開発されている。Mannosyl sugar compounds such as manno-oligosaccharides are obtained by extraction from natural products, but since the amount thereof is extremely small, it is considered to be synthesized by chemical synthesis. However, the method using chemical synthesis has a problem that the process is complicated and the total yield is extremely low. On the other hand, according to the enzymatic synthesis method, a mannosyl sugar compound such as a mannooligosaccharide can be advantageously produced from a mannose-containing saccharide. Therefore, α-mannosidase and the like have been developed as enzymes.

【０００５】α−マンノシダーゼとしては、例えばタチ
ナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来のもの等を
用いるものが挙げられる（特開平５−４９４９２）。前
述した高マンノース型糖鎖に関しては、先端部にα−
１，２−マンノオリゴ糖が存在しているので、α−１，
２−マンノシダーゼが重要になるが、上記の酵素は、特
にこのような立体特異的なものを意図しているわけでは
ない。このα−１，２−マンノシダーゼについては、微
生物由来のものとして、アスペルギルス属に属する糸状
菌由来のもの（特開昭５７−５４５８８）、バチルス属
に属する細菌由来のもの（特開平５−６４５８６）、担
子菌由来のもの（Journal of Biotechnology７７（２０
００）ｐ．２５５−２６３）等が開発されている。Examples of α-mannosidase include those derived from plants such as jack bean or almond (Japanese Patent Laid-Open No. 5-49492). Regarding the high mannose type sugar chain described above, α-
Since 1,2-mannooligosaccharide is present, α-1,
Although 2-mannosidase is important, the above enzymes are not specifically intended for such stereospecificity. The α-1,2-mannosidase is derived from a microorganism, which is derived from a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus (JP-A-57-54588), or a bacterium belonging to the genus Bacillus (JP-A-5-64586). , Derived from Basidiomycetes (Journal of Biotechnology77 (20
00) p. 255-263) and the like have been developed.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】上記した従来のα−
１，２−マンノシダーゼは、いずれもα−１，２−マン
ノシダーゼ活性が低く、また、培養法、精製法が煩雑な
ものが多く、工業的に安価に生産することは困難である
という問題がある。更に、前記したバチルス属に属する
細菌由来の酵素は、縮合によるオリゴ糖生成率が低いと
いう問題点がある。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention
All the 1,2-mannosidases have low α-1,2-mannosidase activity, and many culture methods and purification methods are complicated, and it is difficult to industrially produce them at low cost. . Further, the above-mentioned bacteria-derived enzyme belonging to the genus Bacillus has a problem that the oligosaccharide production rate by condensation is low.

【０００７】従って、本発明の目的は、α−１，２−マ
ンノシダーゼを菌体外に生産する新規菌株と、この菌株
を用いてα−１，２−マンノシダーゼを工業的に有利に
製造する方法、及び製造した酵素を用いてマンノオリゴ
糖などのα−マンノシル糖化合物を多量生産させる方法
を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a novel strain which produces α-1,2-mannosidase extracellularly, and a method for industrially advantageously producing α-1,2-mannosidase using this strain. And a method for producing a large amount of an α-mannosyl sugar compound such as manno-oligosaccharide using the produced enzyme.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな状況に鑑み、マンノシダーゼを生産する微生物を土
壌から検索したところ、新たに、これまで全く知られて
いなかった新規なマンノシダーゼを生産する微生物を発
見し、その生理化学的性質からパエニバチルス・イリノ
イセンシス（Paenibacillus illinoisensis）と同定さ
れ、本発明を完成した。Means for Solving the Problems In view of the above situation, the present inventors searched for a mannosidase-producing microorganism from soil, and found that a novel mannosidase that had never been known was newly found. The producing microorganism was discovered, and it was identified as Paenibacillus illinoisensis from the physiochemical properties, and the present invention was completed.

【０００９】即ち、本発明は、次の通りのものである。 １．下記の特性を有する新規α−１，２−マンノシダー
ゼ。 （１）作用 （ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末
端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
が、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ （４）最適pH：５〜７ （５）安定温度：４０℃ （６）安定pH：５〜１２ （７）分子量：約４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ） ２．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス属由
来のものである上記１記載のα−１,２−マンノシダー
ゼ。 ３．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イ
リノイセンシス由来のものである上記１又は２記載のα
−１,２−マンノシダーゼ。 ４．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イ
リノイセンシスNo．１３株由来のものである上記１、２
又は３記載のα−１,２−マンノシダーゼ。 ５．酵素反応によりマンノース又は非還元末端にα−マ
ンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させて
α−マンノシル糖化合物を製造する方法において、酵素
として、上記１、２、３又は４記載のα−１,２−マン
ノシダーゼを用いることを特徴とするα−マンノシル糖
化合物の製造方法。 ６．α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ糖である上
記５記載のα−マンノシル糖化合物の製造方法。 ７．パエニバチルス属由来の細菌を培養し、その培養物
からα−１,２−マンノシダーゼを採取することを特徴
とするα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。 ８．パエニバチルス属由来の細菌がパエニバチルス・イ
リノイセンシスである上記７記載のα−１,２−マンノ
シダーゼの製造方法。 ９．α−１,２−マンノシダーゼ生産能を有するパエニ
バチルス・イリノイセンシスNo．１３株。That is, the present invention is as follows. 1. A novel α-1,2-mannosidase having the following properties. (1) Action (a) The α-1,2-mannoside bond at the non-reducing terminal position of the α-mannan or oligosaccharide containing the α-1,2-mannoside bond is specifically decomposed. (B) Mannose or a saccharide having an α-mannoside bond at the non-reducing end is dehydrated and condensed or transferred to produce an α-mannosyl sugar compound. (2) Substrate specificity α-mannan, α-1,2-mannobiose, oligosaccharide having an α-1,2-mannoside bond at the non-reducing end, p
It acts on -nitrophenyl-α-D-mannoside but does not substantially act on α-1,3-mannobiose and α-1,6-mannobiose. (3) Optimum temperature: 35 ° C to 45 ° C (4) Optimum pH: 5 to 7 (5) Stable temperature: 40 ° C (6) Stable pH: 5 to 12 (7) Molecular weight: about 400,000 (gel filtration HPLC) ) 2. The α-1,2-mannosidase according to 1 above, wherein the α-1,2-mannosidase is derived from the genus Paenibacillus. 3. The α according to 1 or 2 above, wherein the α-1,2-mannosidase is derived from Paenibacillus illinoisensis.
-1,2-mannosidase. 4. α-1,2-mannosidase is Paenibacillus illinoisensis No. The above 1, 2 derived from 13 strains
Alternatively, the α-1,2-mannosidase according to item 3. 5. In the method for producing an α-mannosyl sugar compound by dehydration condensation or transfer of mannose or a saccharide having an α-mannoside bond at the non-reducing end by an enzymatic reaction, the α-1 described in 1, 2, 3 or 4 above is used as the enzyme. A method for producing an α-mannosyl sugar compound, which comprises using 1,2-mannosidase. 6. 6. The method for producing an α-mannosyl sugar compound according to the above 5, wherein the α-mannosyl sugar compound is a manno-oligosaccharide. 7. A method for producing α-1,2-mannosidase, which comprises culturing a bacterium belonging to the genus Paenibacillus and collecting α-1,2-mannosidase from the culture. 8. 8. The method for producing α-1,2-mannosidase according to the above 7, wherein the bacterium derived from the genus Paenibacillus is Paenibacillus illinoisensis. 9. Paenibacillus illinoisensis No. having the ability to produce α-1,2-mannosidase. 13 shares.

【００１０】本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、
（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース
又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱
水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成
する特性を有するので、この特性を利用することによ
り、マンノオリゴ糖のα−マンノシル糖化合物を製造す
ることができる。The α-1,2-mannosidase of the present invention is
(A) the property of specifically degrading the α-1,2-mannoside bond at the non-reducing end position of the α-mannan or the oligosaccharide containing the α-1,2-mannoside bond, and (b) the mannose or the non-reducing end Since it has a characteristic of producing a α-mannosyl sugar compound by dehydration-condensation or transfer of a saccharide having an α-mannoside bond, the α-mannosyl sugar compound of a manno-oligosaccharide can be produced by utilizing this characteristic. .

【００１１】本酵素の作用条件（ｐＨ５．０〜７．０、
反応温度４０℃：実施例２〜４参照）は、マンノースイ
ソメラーゼの作用条件（ｐＨ５．０〜９．０、温度４０
℃）とほぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼ
を併用することにより、フルクトースからα−マンノシ
ル糖化合物の製造が可能である。そして、本酵素は活性
が高く、例えば、従来知られているバチルス属のα−
１,２−マンノシダーゼに比べて、縮合によるオリゴ糖
生成率が顕著に優れている。また、本酵素は、発色物質
であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対し
て作用するので、活性測定等が容易である点において
も、特徴的である。更に、本酵素は、パエニバチルス・
イリノイセンシスに属する細菌を液体培養することによ
って培地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出
したり、アスペリギルス属の糸状菌を培養して製造され
る公知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に
適している。The action conditions of this enzyme (pH 5.0 to 7.0,
Reaction temperature 40 ° C .: Refer to Examples 2 to 4 under the operating conditions of mannose isomerase (pH 5.0 to 9.0, temperature 40).
C.), it is possible to produce an α-mannosyl sugar compound from fructose by using mannose isomerase together. The enzyme has a high activity, and for example, α-of the conventionally known Bacillus genus is used.
Compared with 1,2-mannosidase, the oligosaccharide production rate by condensation is remarkably superior. Further, since the present enzyme acts on p-nitrophenyl-α-D-mannoside which is a color-forming substance, it is also characteristic in that activity measurement and the like are easy. Furthermore, this enzyme is
Since it can be produced in the medium by liquid culture of bacteria belonging to Illinoisensis, it can be extracted from jack bean or the like, or can be easily cultured and purified as compared with known enzymes produced by culturing filamentous fungi of the genus Aspergillus, Suitable for mass production.

【００１２】従って、以上の本発明の酵素の特性を利用
することにより、マンノース（フルクトース）やα−
１，２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノ
オリゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率
よく製造することができるので、本酵素は、糖タンパク
や糖脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研
究やその薬理研究などに資することができ、マンノオリ
ゴ糖の工業生産を可能とする点で、非常に価値がある。
なお、パエニバチルス属の微生物が、α−１，２−マン
ノシダーゼを生産することについては未だ知られておら
ず、本発明のものが最初である点でも、技術的な価値が
高い。Therefore, by utilizing the above characteristics of the enzyme of the present invention, mannose (fructose) and α-
Since mannooligosaccharides, α-mannosyl sugar compounds and the like can be freely and efficiently produced from saccharides having a 1,2-mannoside bond, the present enzyme is a complex carbohydrate such as glycoprotein or glycolipid (particularly , High-mannose type) and its pharmacological research, and is extremely valuable in that it enables industrial production of mannooligosaccharides.
It should be noted that it is not yet known that microorganisms of the genus Paenibacillus produce α-1,2-mannosidase, and that the present invention is the first one, and thus has a high technical value.

【００１３】以下、本発明を更に説明する。 １． 菌株 本発明に使用するパエニバチルス・イリノイセンシスN
o．１３株は、本発明者らによって土壌中より発見され
た菌種であり、産業総合研究所生命工学工業技術研究所
に、ＦＥＲＭ Ｐ−１８２５６として寄託されている。The present invention will be further described below. 1. Strain Strain Paenibacillus illinoisensis N used in the present invention
o. The 13 strains are fungal species discovered in the soil by the present inventors and have been deposited as FERM P-18256 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute.

【００１４】パエニバチルス・イリノイセンシスNo．１
３株は、以下の菌学的諸性質を有する。 細胞の形及び大きさ：０．５×１．８〜２．４μｍのか
ん菌 運動性：＋ グラム染色性：＋ 胞子形成：＋ 酸素に対する態度：好気性 生育最適温度：３０℃ また、１６SrRNA配列の分析を行い、既知配列との相同
性を検索した結果、パエニバチルス・イリノイセンシス
の１６SrRNA配列と平均９８．５％の確率で一致してい
た。これらのことから、本菌はパエニバチルス・イリノ
イセンシスと判定した。Paenibacillus illinoisensis No. 1
The 3 strains have the following mycological properties. Cell shape and size: 0.5 × 1.8 to 2.4 μm Bacillus motility: + Gram stainability: + Sporulation: + Attitude toward oxygen: Optimal temperature for aerobic growth: 30 ° C. Also, 16S rRNA sequence As a result of searching for homology with a known sequence, it was found to match the 16S rRNA sequence of Paenibacillus illinoisensis with an average probability of 98.5%. From these facts, this bacterium was determined to be Paenibacillus illinoisensis.

【００１５】２． マンノシダーゼの産出 マンノシダーゼは、上記の菌株から生産されるものが好
ましいが、パエニバチルス属に属する微生物から生産さ
れるものであれば何れでもよく、例えば、パエニバチル
ス・アルギノリティクス、パエニバチルス・アミノリテ
ィクス、パエニバチルス・マセランス、パエニバチルス
・ポリミキサ等が挙げられる。また、これらの組換え酵
素も利用できる。分泌の場所は特に制限されず、菌体
内、菌体外の何れでもよい。2. Production of mannosidase Mannosidase is preferably produced from the above strains, but may be any one produced from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus, for example, Paenibacillus arginolytics, Paenibacillus aminolytics, Paenibacillus.・ Macerance, Paenibacillus polymixer, etc. In addition, these recombinant enzymes can also be used. The place of secretion is not particularly limited and may be inside or outside the cells.

【００１６】この酵素は、以下のような、通常の培養手
段により産出される。フルクトース、グルコース、マン
ノース、ガラクトース、異性化糖、蔗糖、マルトース、
キシロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、マン
ナンなど種々な糖、糖アルコール及びデキストリンなど
を炭素源とし、それに微生物の増殖に必要な窒素化合物
（酵母エキス、魚肉エキス、ペプトン、アミノ酸、など
の有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、
ミネラルを加えた培地で、２０〜３５℃、好ましくは３
０℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは
１〜３日培養する。分泌の場所が菌体内の場合、培養
後、濾過又は遠心分離により菌体を回収し、そのまま使
用するか、又は超音波若しくは自己消化法等により該酵
素を抽出し使用する。又、分泌の場所が菌体外の場合、
培養後、濾過又は遠心分離により菌体を除去し、濾過又
は上清をそのまま使用できるので、有利である。抽出さ
れた酵素は、必要により、硫酸アンモニウム、アセト
ン、メタノール、エタノール等で沈澱し、精製濃縮し、
又は乾燥保存する。This enzyme is produced by the usual culture means as described below. Fructose, glucose, mannose, galactose, isomerized sugar, sucrose, maltose,
Xylose, sorbitol, mannitol, starch, various sugars such as mannan, sugar alcohol and dextrin as a carbon source, and nitrogen compounds necessary for the growth of microorganisms (organic nitrogen sources such as yeast extract, fish meat extract, peptone, amino acid, etc., Or inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, urea, ammonium nitrate),
Medium with minerals added, 20-35 ° C, preferably 3
Culturing is performed at about 0 ° C. under aerobic conditions for 1 to 5 days, preferably 1 to 3 days. When the place of secretion is in the microbial cell, after culturing, the microbial cell is collected by filtration or centrifugation and used as it is, or the enzyme is extracted and used by ultrasonic waves or an autolysis method. Also, if the place of secretion is outside the cell,
After culturing, the microbial cells can be removed by filtration or centrifugation, and the filtration or the supernatant can be used as it is, which is advantageous. The extracted enzyme is, if necessary, precipitated with ammonium sulfate, acetone, methanol, ethanol, etc., purified and concentrated,
Alternatively, store it in a dry state.

【００１７】また、上記の菌体、菌体処理物、濾液また
は上清からα−１，２−マンノシダーゼをさらに精製す
ることも可能であり、その方法としては、例えば、硫安
による塩析、エタノール、アセトン等による溶媒沈澱
法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による
一般的な酵素精製方法が採用される。例えば、パエニバ
チルス・イリノイセンシスNo．１３菌株を、酵母マンナ
ンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した培地中、
好気的な条件下で培養した培養液から菌体を分離除去
し、ついでDEAE−トヨパール６５０Ｓ（商品名：東ソー
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィー及び
トヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名：東ソー株式会社製）
によるゲル濾過クロマトグラフィーの各段階を経て精製
し、電気泳動的にほば均一な精製酵素標品を得ることが
出来る。It is also possible to further purify α-1,2-mannosidase from the above-mentioned cells, treated cells, filtrate or supernatant. Examples of the method include salting out with ammonium sulfate and ethanol. Solvent precipitation method using acetone, acetone, etc., ultrafiltration method, gel filtration method, general enzyme purification method using ion exchange resin, etc. are adopted. For example, Paenibacillus illinoisensis No. 13 strains in a medium containing yeast mannan as a main carbon source and yeast extract added,
The cells were separated and removed from the culture broth cultivated under aerobic conditions, followed by ion exchange chromatography using DEAE-Toyopearl 650S (trade name: Tosoh Corporation) and Toyopearl HW-55F (trade name: Tosoh Corporation). Made)
It is possible to obtain a purified enzyme preparation which is electrophoretically almost uniform by purifying through each step of gel filtration chromatography according to.

【００１８】本発明におけるα−１，２−マンノシダー
ゼ活性の測定法及び活性表示法は以下のとおりである。
酵母マンナンを基質として反応を行い、遊離するマンノ
ースを測定することによって行った。すなわち、酵母マ
ンナン（終濃度０．１％）と酵素液を含む反応液（０．
６Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中、４０℃で３０分
間、反応を行い、反応後、マンノースを標準として還元
糖をネルソン・ソモジ法によって測定した。酵素活性の
単位は、上記反応において１秒間に１モルのマンノース
を遊離する酵素量を１カタール（以下k a t）とした。The method of measuring the activity of α-1,2-mannosidase and the method of displaying the activity in the present invention are as follows.
The reaction was performed using yeast mannan as a substrate, and the released mannose was measured. That is, a reaction solution containing yeast mannan (final concentration 0.1%) and an enzyme solution (0.
The reaction was carried out in a 6 M phosphate buffer (pH 7.0) at 40 ° C. for 30 minutes, and after the reaction, reducing sugars were measured by the Nelson-Somogy method using mannose as a standard. As the unit of enzyme activity, the amount of the enzyme that liberates 1 mol of mannose per second in the above reaction was defined as 1 Qatar (hereinafter referred to as kat).

【００１９】本発明の新規α−１，２−マンノシダーゼ
の理化学的性質を以下に示す。 （１）作用 （ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末
端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
が、α−１，２−マンノビオース、α−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない（実施例３参照）。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ 本酵素について、２０〜６０℃の温度で、終濃度６０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０分間反応させ
て相対活性を調べたところ、最適温度は、図１に示すよ
うに３５℃〜４５℃であった。 （４）最適ｐＨ：５〜７ 本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソ
ン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて４０℃、
３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、
最適ｐＨは、図２に示すように５〜７であった。 （５）安定温度：４０℃以下 本酵素について、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）
中、０〜６０℃の範囲で１０分間処理した後、４０℃、
３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、
安定温度は、図１に示すように４０℃以下であった。 （６）安定ｐＨ：５〜１２ 本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソ
ン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて、４℃、
２４時間の処理を行った後、６０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）中で、４０℃、３０分間の酵素反応によ
って相対活性を調べたところ、安定ｐＨは、図２に示す
ように５〜１２であった。 （７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）The physicochemical properties of the novel α-1,2-mannosidase of the present invention are shown below. (1) Action (a) The α-1,2-mannoside bond containing the α-1,2-mannoside bond is specifically decomposed at the non-reducing terminal position of the oligosaccharide. (B) Mannose or a saccharide having an α-mannoside bond at the non-reducing end is dehydrated and condensed or transferred to produce an α-mannosyl sugar compound. (2) Substrate specificity α-mannan, α-1,2-mannobiose, oligosaccharide having an α-1,2-mannoside bond at the non-reducing end, p
It acts on -nitrophenyl-α-D-mannoside but does not substantially act on α-1,2-mannobiose and α-1,6-mannobiose (see Example 3). (3) Optimum temperature: 35 ° C to 45 ° C For this enzyme, a final concentration of 60 m at a temperature of 20 to 60 ° C
When the relative activity was examined by reacting in M phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes, the optimum temperature was 35 ° C to 45 ° C as shown in Fig. 1. (4) Optimum pH: 5-7 For this enzyme, 40 ° C. using a wide concentration buffer of Britton-Robinson with a final concentration of 20 mM,
When the relative activity was examined by enzyme reaction for 30 minutes,
The optimum pH was 5-7 as shown in FIG. (5) Stable temperature: 40 ° C or less About this enzyme, 60 mM phosphate buffer (pH 7)
Medium, after treating for 10 minutes in the range of 0-60 ℃, 40 ℃,
When the relative activity was examined by enzyme reaction for 30 minutes,
The stable temperature was 40 ° C. or lower as shown in FIG. (6) Stable pH: 5 to 12 For this enzyme, using a wide-area buffer of Britton-Robinson with a final concentration of 20 mM,
After the treatment for 24 hours, the relative activity was examined by an enzyme reaction in 60 mM phosphate buffer (pH 7.0) at 40 ° C. for 30 minutes, and the stable pH was 5 as shown in FIG. It was ~ 12. (7) Molecular weight: about 400,000 (gel filtration HPLC)

【００２０】３． α−マンノシル糖化合物の製造 本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、（ａ）α−
１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリ
ゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特
異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース又は非還元
末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合また
は転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する特性を
有する。また、本酵素は、前述した、従来のバチルス属
由来のもの（特開平５−６５４８６）とは違い、ｐ−ニ
トロフェニル−α−D−マンノシドに作用する基質特異
性を有する。上記のよう本酵素の特性を利用すれば、マ
ンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を製造する
ことが出来るので、以下説明する。3. Production of α-mannosyl sugar compound The α-1,2-mannosidase of the present invention is (a) α-
Characteristic of specifically degrading α-1,2-mannoside bond at the non-reducing end position of α-mannan or oligosaccharide containing 1,2-mannoside bond, and (b) α-mannoside bond at mannose or non-reducing end It has the property of producing an α-mannosyl sugar compound by dehydration condensation or transfer of a saccharide having Further, the enzyme has a substrate specificity that acts on p-nitrophenyl-α-D-mannoside, unlike the above-mentioned one derived from the genus Bacillus (JP-A-5-65486). Since the α-mannosyl sugar compound such as manno-oligosaccharide can be produced by utilizing the characteristics of the present enzyme as described above, it will be described below.

【００２１】１） 縮合反応によるマンノオリゴ糖の製
造 本酵素の縮合反応性を利用することにより、マンノース
を脱水縮合させてマンノオリゴ糖を製造することができ
る。例えば、マンノオリゴ糖としては、Ｍａｎ１−２Ｍ
ａｎ、Ｍａｎ１−３Ｍａｎ、Ｍａｎ１−６Ｍａｎなどを
製造することが出来る。マンノオリゴ糖の製造方法とし
ては、例えば、以下のようにして行うのがよい。高濃度
のマンノースを含む溶液に、パエニバチルス・イリノイ
センシス由来のα−１，２−マンノシダーゼを添加し、
その反応液を室温乃至８０℃、好ましくは４０℃でイン
キュベーションし、ＨＰＬＣにて反応の進行を観察し、
マンノオリゴ糖の含量が高まった時点で反応を停止した
のち、活性炭クロマトグラフィー等の精製手段を用いる
ことにより、目的物を得ることが出来る。1) Manno-oligosaccharide production by condensation reaction By utilizing the condensation reactivity of the present enzyme, mannose can be dehydrated and condensed to produce mannooligosaccharide. For example, as the manno-oligosaccharide, Man1-2M
An, Man1-3Man, Man1-6Man, etc. can be manufactured. The method for producing manno-oligosaccharide may be carried out as follows, for example. To a solution containing a high concentration of mannose, α-1,2-mannosidase derived from Paenibacillus illinoisensis was added,
The reaction solution is incubated at room temperature to 80 ° C., preferably 40 ° C., and the progress of the reaction is observed by HPLC,
After the reaction is stopped when the content of manno-oligosaccharide increases, the desired product can be obtained by using a purification means such as activated carbon chromatography.

【００２２】２） 転移反応によるα−マンノシル糖化
合物の製造 本酵素の転移反応性を利用することにより、マンノース
供与体とマンノース受容体からα−マンノシル糖化合物
を製造することができる。マンノース供与体としては、
例えばｐ−ニトロフェニル−α−マンノシド、メチル−
α−マンノシド、フェニル−α−マンノシド等が挙げら
れる。一方、マンノース受容体としては、マンノース、
マンノビオース、ラミナリビオース等が挙げられる。本
転移反応は、通常の反応条件下で行うことができる。基
質溶液としては、受容体と供与体とを含有する水溶液又
はジメチルスルホキシドなどの有機溶剤液が用いられ
る。その場合、受容体と供与体のモル比は１：５０〜５
０：１が好ましく、基質濃度は５〜５０重量％が好まし
い。本反応は、受容体と供与体とを含有する基質溶液
に、本酵素を作用させることにより行うが、反応時のｐ
Ｈと温度は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜７０℃が適
当である。2) Manufacture of α-mannosyl sugar compound by transfer reaction By utilizing the transfer reactivity of this enzyme, an α-mannosyl sugar compound can be manufactured from a mannose donor and a mannose acceptor. As a mannose donor,
For example, p-nitrophenyl-α-mannoside, methyl-
Examples include α-mannoside and phenyl-α-mannoside. On the other hand, as the mannose receptor, mannose,
Mannobiose, laminaribiose, etc. are mentioned. This transfer reaction can be carried out under usual reaction conditions. As the substrate solution, an aqueous solution containing an acceptor and a donor or an organic solvent solution such as dimethyl sulfoxide is used. In that case, the molar ratio of acceptor to donor is 1: 50-5.
0: 1 is preferable, and the substrate concentration is preferably 5 to 50% by weight. This reaction is carried out by reacting the enzyme with a substrate solution containing an acceptor and a donor.
As for H and temperature, a pH of 4 to 8 and a temperature of 20 to 70 ° C. are generally suitable.

【００２３】３） α−１，２−マンノシダーゼの使用
形態 α−１，２−マンノシダーゼとしては、菌体を通常の
方法で固定化したもの、菌体を機械的、酵素的、若し
くは、界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、又
は、それらを固定化したもの、菌体を破砕して破砕残
さを除去したもの、又は、それを固定化したもの、酵
素精製物、又は、それを固定化したもの、培養液また
は菌体を除去した培養上清、又はそれを濃縮、乾燥、及
び／あるいは固定化したもの等が挙げられる。固定化
は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラ
ギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなどを用い
た通常の固定化方法が使用できる。3) Form of use of α-1,2-mannosidase As α-1,2-mannosidase, bacterial cells are immobilized by a usual method, the bacterial cells are mechanically, enzymatically or surface-active. Those treated with an agent or organic solvent, those immobilized with them, those obtained by crushing bacterial cells to remove the crushed residue, or those immobilized with it, enzyme purified products, or fixing it And the like, the culture solution or the culture supernatant from which the bacterial cells have been removed, or the one obtained by concentrating, drying, and / or immobilizing the same. For immobilization, a general immobilization method using polyacrylamide, calcium alginate, carrageenan, an ion exchange carrier, chitosan beads and the like can be used.

【００２４】[0024]

【発明の実施の形態】以下、実施例によって本発明を詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特別
に標記がない場合、百分率はW／V％である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. Percentages are W / V% unless otherwise noted.

【００２５】[0025]

【実施例１】（α−１，２−マンノシダーゼの調整）酵
母マンナン０．２％、硫酸第２鉄（７水和）０．００３
％、硫酸マグネシウム（７水和）０．０４％、塩化カル
シウム（２水和）０．００６％、リン酸水素２カリウム
０．６９％、リン酸２水素カリウム０．２３％、硫酸ア
ンモニウム０．０５％、酵母エキス０．１５％を含む液
体培地８００ml（ｐＨ７．０）を、３Ｌの坂口フラスコ
に入れ、１昼夜培養したパエニバチルス・イリノイセン
シスNo．１３株を加え、３０℃で２晩培養した。次い
で、この培養液を９，000×ｇ、３０分間遠心して菌体
を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）に対して１晩透析を行い、粗酵素液を得た。粗
酵素液の活性測定を行ったところ、１９ｍｋａｔ／Ｌで
あった。Example 1 (Adjustment of α-1,2-mannosidase) Yeast mannan 0.2%, ferric sulfate (heptahydrate) 0.003
%, Magnesium sulfate (7 hydrate) 0.04%, calcium chloride (dihydrate) 0.006%, dipotassium hydrogen phosphate 0.69%, potassium dihydrogen phosphate 0.23%, ammonium sulfate 0.05 %, And 800 ml of liquid medium (pH 7.0) containing 0.15% of yeast extract were placed in a 3 L Sakaguchi flask and cultured for 1 day and night Paenibacillus illinoisensis No. 13 strains were added and cultured at 30 ° C. for 2 nights. Then, this culture solution was centrifuged at 9,000 × g for 30 minutes to remove the cells, and the supernatant was added to 10 mM potassium phosphate buffer (pH
It was dialyzed against 7.0) overnight to obtain a crude enzyme solution. When the activity of the crude enzyme solution was measured, it was 19 mkat / L.

【００２６】透析後の粗酵素液を１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｓカラムに吸着させ、０〜０．８Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。The dialyzed crude enzyme solution was adsorbed on a DEAE-Toyopearl 650S column equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and a 10 mM potassium phosphate buffer containing 0-0.8 M sodium chloride was added. (PH
The enzyme was eluted by the concentration gradient method of 7.0).

【００２７】溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析し
た後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸
着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜
０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出さ
せた。The eluted active fractions were collected, dialyzed against 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) overnight, and then equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) DEAE. -Adsorbed on a Toyopearl 650S column, washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride, then 0.1
The enzyme was eluted by the concentration gradient method of a 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 0.6 M sodium chloride.

【００２８】溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析し
た後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸
着させ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１
５〜０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を
溶出させた。The eluted active fractions were collected, dialyzed against 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) overnight, and then equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) DEAE. -Adsorbed on a Toyopearl 650S column, washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride, and then washed with 0.1
The enzyme was eluted by the concentration gradient method of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 to 0.45 M sodium chloride.

【００２９】溶出させた活性画分を集めて、限外濾過
（分画分子量１０，０００）で濃縮した後、１５ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたトヨ
パールＨＷ−５５Ｆカラムに供し、１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）により酵素を溶出させて、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により、均一なバンド
からなる精製酵素を得た。活性収率は１５％であった。The eluted active fractions were collected, concentrated by ultrafiltration (molecular weight cutoff 10,000), and equilibrated with 15 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) Toyopearl HW-55F column. The enzyme was eluted with a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and a purified enzyme consisting of uniform bands was obtained by polyacrylamide gel electrophoresis. The activity yield was 15%.

【００３０】[0030]

【実施例２】培養に用いる菌株を、それぞれ、パエニバ
チルス・イリノイセンシスＪＣＭ９９０７、パエニバチ
ルス・ポリミキサＪＣＭ２５０７、パエニバチルス・マ
セランスＪＣＭ２５００とした以外は、実施例１と同様
にして、粗酵素液を調製した。 それぞれの粗酵素液に
対して活性測定を行ったところ、それぞれ、１６ｍｋａ
ｔ／Ｌ、１２ｍｋａｔ／Ｌ、９ｍｋａｔ／Ｌであった。Example 2 A crude enzyme solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the strains used for culture were Paenibacillus illinoisensis JCM9907, Paenibacillus polymyxa JCM2507, and Paenibacillus macerans JCM2500, respectively. When the activity was measured for each crude enzyme solution, each was 16 mka
It was t / L, 12 mkat / L, and 9 mkat / L.

【００３１】[0031]

【実施例３】（基質特異性）各マンノビオース（α−
１,２−マンノビオース、α−１,３−マンノビオース、
α−１,６−マンノビオース）０．０５％含む３０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、実施例１のα
−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃、９０分間イ
ンキュベートした後、以下の分析条件で分析した。Example 3 (Substrate specificity) Each mannobiose (α-
1,2-mannobiose, α-1,3-mannobiose,
α-1,6-mannobiose) 0.05% containing 30 mM
In a potassium phosphate buffer (pH 7.0), α of Example 1 was added.
After adding -1,2-mannosidase and incubating at 40 ° C for 90 minutes, analysis was performed under the following analysis conditions.

【００３２】ＨＰＬＣ：ウォーターズ社製 検出器：示差屈折計（日立 Ｄ−２５００ クロマトイン
テグレーター） カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＰＷ（東ソー株式
会社製） 流速：０．５ｍｌ／分 溶出：水HPLC: Waters detector: Differential refractometer (Hitachi D-2500 Chromatointegrator) Column: TSK-GEL G2000PW (Tosoh Corporation) Flow rate: 0.5 ml / min Elution: Water

【００３３】分析結果は、図３〜５に示す。図３はα−
１,２−マンノビオース、図４はα−１,３−マンノビオ
ース、図５はα−１,６−マンノビオース、の結果であ
る。この結果によると、図３では、α−１，２−マンノ
ビオースが分解され、マンノースの位置にピークがシフ
トした。これに対して、図４（α−１,３−マンノビオ
ース）及び図５（α−１,６−マンノビオース）では、
ピークに変化はない。 この結果から、本酵素により、
α−１，２−マンノビオースのみが分解されたことが分
かる。The analysis results are shown in FIGS. Figure 3 is α-
1,2-mannobiose, FIG. 4 is the result of α-1,3-mannobiose, and FIG. 5 is the result of α-1,6-mannobiose. According to this result, in FIG. 3, α-1,2-mannobiose was decomposed and the peak was shifted to the position of mannose. On the other hand, in FIG. 4 (α-1,3-mannobiose) and FIG. 5 (α-1,6-mannobiose),
There is no change in the peak. From this result, with this enzyme,
It can be seen that only α-1,2-mannobiose was decomposed.

【００３４】[0034]

【実施例４】（縮合）６０％（Ｗ／Ｗ）のマンノース溶
液にマンノース１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように、
実施例１のα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０
℃、７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析
した。分析結果によると、全糖中に占めるマンノオリゴ
糖の割合は６．５％であった。この結果から、本酵素に
は、マンノースを脱水縮合させて、マンノオリゴ糖を生
成する活性があることが分かる。Example 4 (Condensation) In a 60% (W / W) mannose solution, 20 nkat was added per 1 g of mannose.
The α-1,2-mannosidase of Example 1 was added, and 40
The reaction was conducted at 72 ° C for 72 hours. The liquid after the reaction was analyzed by HPLC. According to the analysis result, the proportion of mannooligosaccharides in the total sugars was 6.5%. From this result, it is found that this enzyme has an activity of producing mannooligosaccharide by dehydration condensation of mannose.

【００３５】[0035]

【比較例１】（縮合）実施例４で用いた、実施例１のα
−１，２−マンノシダーゼに代えて、Bacillus sp. M−
90株由来のα−１．２−マンノシダーゼ（特開平５−６
４５８６）を使用した以外は、実施例４と同様にして、
マンノースの縮合を行った。分析結果によると、全糖中
に占めるマンノオリゴ糖の割合は２．２％であった。実
施例４と比較例１の分析結果の比較から、マンノースを
脱水縮合する活性は、本酵素の方が公知の酵素より高い
ことが分かる。Comparative Example 1 (Condensation) α of Example 1 used in Example 4
-1,2-mannosidase instead of Bacillus sp. M-
Α-1.2-mannosidase derived from 90 strains (JP-A-5-6
4586), but in the same manner as in Example 4,
Mannose condensation was performed. According to the analysis results, the proportion of mannooligosaccharides in the total sugars was 2.2%. From the comparison of the analysis results of Example 4 and Comparative Example 1, it can be seen that this enzyme has a higher activity of dehydrating and condensing mannose than the known enzyme.

【００３６】[0036]

【実施例５】（転移）供与体としてｐ−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マンノシド３０％、受容体としてラミナリビ
オースの３０％を含有する基質溶液（ｐＨ６）に、ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド１ｇ当たり２０ｎ
ｋａｔとなるように、実施例１のα−１，２−マンノシ
ダーゼを加え、４０℃、７２時間反応させた。反応後の
液をＨＰＬＣで分析した。分析結果によると、全糖中に
占める転移生成物の割合は０．９％であった。この結果
から、本酵素には、非還元末端にα−マンノシド結合を
有する糖類を転移させて、α−マンノシル糖化合物を生
成する活性があることが分かる。Example 5 (Transfer) To a substrate solution (pH 6) containing 30% of p-nitrophenyl-α-D-mannoside as a donor and 30% of laminaribiose as an acceptor, p-
20n per gram of nitrophenyl-α-D-mannoside
The α-1,2-mannosidase of Example 1 was added so as to obtain a kat, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 72 hours. The liquid after the reaction was analyzed by HPLC. According to the analysis result, the ratio of the transfer product in the total sugar was 0.9%. From this result, it can be seen that this enzyme has an activity of transferring a saccharide having an α-mannoside bond to the non-reducing end to produce an α-mannosyl sugar compound.

【００３７】[0037]

【発明の効果】（１）本発明の酵素は、α−１,２−マ
ンノシド結合の分解反応性やマンノース又は非還元末端
にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転
移させて、マンノオリゴ糖等のα−マンノシル糖化合物
を生成する性質等を有しているので、マンノオリゴ糖な
どのα−マンノシル糖化合物が製造し得る。また、本酵
素作用条件とマンノースイソメラーゼの作用条件とがほ
ぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼを併用す
ることにより、フルクトースからα−マンノシル糖化合
物が製造し得る。EFFECTS OF THE INVENTION (1) The enzyme of the present invention is capable of decomposing or transferring α-1,2-mannoside bond, mannose or a saccharide having an α-mannoside bond at a non-reducing terminal to give a manno-oligosaccharide. Since it has the property of producing an α-mannosyl sugar compound such as ## STR3 ## etc., an α-mannosyl sugar compound such as a manno-oligosaccharide can be produced. Further, since the conditions for the action of this enzyme and the conditions for the action of mannose isomerase are almost the same, the α-mannosyl sugar compound can be produced from fructose by using mannose isomerase together.

【００３８】（２）本酵素は活性が高く、例えば、従来
知られているバチルス属のα−１,２−マンノシダーゼ
に比べて、オリゴ糖生成率が数倍高い。(2) This enzyme has a high activity, and its oligosaccharide production rate is several times higher than that of the conventionally known α-1,2-mannosidase of the genus Bacillus.

【００３９】（３）本酵素は、発色物質であるｐ−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対して作用するの
で、活性測定等が容易である。(3) Since the present enzyme acts on p-nitrophenyl-α-D-mannoside which is a chromogenic substance, the activity can be easily measured.

【００４０】（４）本酵素は、パエニバチルス・イリノ
イセンシスに属する細菌を液体培養することによって培
地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出した
り、アスペルギルス属の糸状菌を培養して製造される公
知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に適し
ている。(4) This enzyme can be produced in a medium by liquid-culturing a bacterium belonging to Paenibacillus illinoisensis. Therefore, it can be extracted from jack bean or the like or produced by culturing a filamentous fungus of the genus Aspergillus. It is easier to culture and purify than the enzyme, and is suitable for mass production.

【００４１】（５）以上の本発明の酵素の特性を利用す
ることにより、マンノース（フルクトース）やα−１，
２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノオリ
ゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率よく
製造することができるので、本酵素は、糖タンパクや糖
脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研究や
その薬理研究などに資することができる点で、非常に価
値がある。(5) By utilizing the above characteristics of the enzyme of the present invention, mannose (fructose), α-1,
Since mannooligosaccharides, α-mannosyl sugar compounds and the like can be freely and efficiently produced from saccharides having a 2-mannoside bond, the present enzyme is a complex carbohydrate such as glycoprotein or glycolipid (especially It is extremely valuable in that it can contribute to research on mannose type) and its pharmacological research.

【００４２】（６）なお、パエニバチルス属の微生物
が、α−１，２−マンノシダーゼを生産することについ
ては未だ知られておらず、本発明のものが最初である点
でも、技術的な価値が高い。(6) It is not yet known that a microorganism belonging to the genus Paenibacillus produces α-1,2-mannosidase, and the present invention is the first to have a technical value. high.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の酵素の最適温度と安定温度を示す説明
図である。FIG. 1 is an explanatory diagram showing the optimum temperature and stable temperature of the enzyme of the present invention.

【図２】本発明の酵素の最適ｐＨと安定ｐＨを示す説明
図である。FIG. 2 is an explanatory diagram showing the optimum pH and stable pH of the enzyme of the present invention.

【図３】本発明の酵素によるα−１,２−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。FIG. 3 is a measurement curve diagram by high performance liquid chromatography showing the time-dependent resolution of α-1,2-mannobiose by the enzyme of the present invention.

【図４】本発明の酵素によるα−１,３−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。FIG. 4 is a measurement curve diagram by high performance liquid chromatography showing the time-dependent resolution of α-1,3-mannobiose by the enzyme of the present invention.

【図５】本発明の酵素によるα−１,６−マンノビオー
スについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマト
グラフィーによる測定曲線図である。FIG. 5 is a measurement curve diagram by high performance liquid chromatography showing the time-dependent resolution of α-1,6-mannobiose by the enzyme of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中島 佑 宮城県仙台市泉区加茂２丁目９番地１ Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 LL05 4B064 AF04 CA02 CB24 CC03 CD09 DA16 4B065 AA01X AC12 AC14 BA22 CA31    ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Yu Nakajima             2-9 Kamo 2-chome, Izumi-ku, Sendai City, Miyagi Prefecture F-term (reference) 4B050 CC01 DD02 LL05                 4B064 AF04 CA02 CB24 CC03 CD09                       DA16                 4B065 AA01X AC12 AC14 BA22                       CA31

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の（１）〜（７）の特性を有する新
規α−１,２−マンノシダーゼ。 （１）作用 （ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシ
ド結合を特異的に分解する。 （ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合
を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル
糖化合物を生成する。 （２）基質特異性 α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末
端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ
−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用する
が、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない。 （３）最適温度：３５℃〜４５℃ （４）最適pH：５〜７ （５）安定温度：４０℃ （６）安定ｐＨ：５〜１２ （７）分子量：約４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）1. A novel α-1,2-mannosidase having the following properties (1) to (7). (1) Action (a) The α-1,2-mannoside bond at the non-reducing terminal position of the α-mannan or oligosaccharide containing the α-1,2-mannoside bond is specifically decomposed. (B) Mannose or a saccharide having an α-mannoside bond at the non-reducing end is dehydrated and condensed or transferred to produce an α-mannosyl sugar compound. (2) Substrate specificity α-mannan, α-1,2-mannobiose, oligosaccharide having an α-1,2-mannoside bond at the non-reducing end, p
It acts on -nitrophenyl-α-D-mannoside but does not substantially act on α-1,3-mannobiose and α-1,6-mannobiose. (3) Optimum temperature: 35 ° C to 45 ° C (4) Optimum pH: 5 to 7 (5) Stable temperature: 40 ° C (6) Stable pH: 5 to 12 (7) Molecular weight: about 400,000 (gel filtration HPLC) ) 【請求項２】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
チルス属由来のものである請求項１記載のα−１,２−
マンノシダーゼ。2. The α-1,2-mannose according to claim 1, wherein the α-1,2-mannosidase is derived from the genus Paenibacillus.
Mannosidase. 【請求項３】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
チルス・イリノイセンシス由来のものである請求項１又
は２記載のα−１,２−マンノシダーゼ。3. The α-1,2-mannosidase according to claim 1 or 2, wherein the α-1,2-mannosidase is derived from Paenibacillus illinoisensis. 【請求項４】 α−１,２−マンノシダーゼがパエニバ
チルス・イリノイセンシスNo．１３株由来のものである
請求項１、２又は３記載のα−１,２−マンノシダー
ゼ。4. The α-1,2-mannosidase is Paenibacillus illinoisensis No. The α-1,2-mannosidase according to claim 1, 2 or 3, which is derived from 13 strains. 【請求項５】 酵素反応によりマンノース又は非還元末
端にα−マンノシド結合を有する糖質を脱水縮合又は転
移させてα−マンノシル糖化合物を製造する方法におい
て、酵素として、請求項１、２、３又は４記載のα−
１,２−マンノシダーゼを用いることを特徴とするα−
マンノシル糖化合物の製造方法。5. A method for producing an α-mannosyl sugar compound by dehydration condensation or transfer of mannose or a sugar having an α-mannoside bond at a non-reducing end by an enzymatic reaction, wherein the enzyme is used as an enzyme. Or α-described in 4
Α-characterized by using 1,2-mannosidase
A method for producing a mannosyl sugar compound. 【請求項６】 α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ
糖である請求項５記載のα−マンノシル糖化合物の製造
方法。6. The method for producing an α-mannosyl sugar compound according to claim 5, wherein the α-mannosyl sugar compound is a manno-oligosaccharide. 【請求項７】 パエニバチルス属由来の細菌を培養し、
その培養物からα−１,２−マンノシダーゼを採取する
ことを特徴とするα−１,２−マンノシダーゼの製造方
法。7. A bacterium derived from the genus Paenibacillus is cultured,
A method for producing α-1,2-mannosidase, which comprises collecting α-1,2-mannosidase from the culture. 【請求項８】 パエニバチルス属由来の細菌がパエニバ
チルス・イリノイセンシスである請求項７記載のα−
１,２−マンノシダーゼの製造方法。8. The α-of claim 7, wherein the bacterium derived from the genus Paenibacillus is Paenibacillus illinoisensis.
A method for producing 1,2-mannosidase. 【請求項９】 α−１,２−マンノシダーゼ生産能を有
するパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株。9. Paenibacillus illinoisensis No. having an α-1,2-mannosidase-producing ability. 13 shares.