JP2003055396A - ペプチドの高速溶液合成方法 - Google Patents
ペプチドの高速溶液合成方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 オリゴ及びポリペプチドの高速溶液合成法、
特に副生物のより少い高速溶液合成法を開発する。 【解決手段】 本発明はペプチドの高速溶液合成方法に
関する。方法は段階（ａ）−（ｄ）： （ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用しアミノ
成分をアシル化する結合段階、（ｂ）捕捉剤を使用して
残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、該捕捉剤
が伸長中のペプチドの脱保護にも使用される消去段階、
（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、（ｄ）
場合によっては、１回または複数回の水性抽出段階の前
に挿入される独立の脱保護段階、の反復サイクルから成
り、残留する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として
遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンを使用す
る少なくとも１つの段階（ｂ）を含みこの段階を段階
（ｂ′）と呼ぶことを特徴とする。本発明方法では、最
終ペプチド配列が得られるまで伸長中のペプチドの単離
が不要である。この極めて効率的な方法は高純度のオリ
ゴ−及びポリペプチドの製造に役立つ。
特に副生物のより少い高速溶液合成法を開発する。 【解決手段】 本発明はペプチドの高速溶液合成方法に
関する。方法は段階（ａ）−（ｄ）： （ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用しアミノ
成分をアシル化する結合段階、（ｂ）捕捉剤を使用して
残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、該捕捉剤
が伸長中のペプチドの脱保護にも使用される消去段階、
（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、（ｄ）
場合によっては、１回または複数回の水性抽出段階の前
に挿入される独立の脱保護段階、の反復サイクルから成
り、残留する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として
遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンを使用す
る少なくとも１つの段階（ｂ）を含みこの段階を段階
（ｂ′）と呼ぶことを特徴とする。本発明方法では、最
終ペプチド配列が得られるまで伸長中のペプチドの単離
が不要である。この極めて効率的な方法は高純度のオリ
ゴ−及びポリペプチドの製造に役立つ。
Description
【０００１】本発明は、所望の配列の組立完了以前に伸
長中のペプチドの単離を要せずにペプチドを高速溶液合
成する新規な汎用性の方法に関する。
長中のペプチドの単離を要せずにペプチドを高速溶液合
成する新規な汎用性の方法に関する。
【０００２】ペプチドは固体支持体上で合成されるかま
たは溶液中で合成される。いずれの合成方法でも、結合
段階と脱保護段階とを交互に繰り返し、精製は両段階間
の合間処理として行われる。固相法では、固体支持体に
結合したままで配列の組立を完了し、最後に配列を支持
体から分離する。余剰試薬及び副生物は濾過によって除
去する。固相合成の明らかな利点は、多少とも応用範囲
が広く、全自動化が容易なことである。しかしながら、
幾つかの深刻な欠点も有している。例えば、反応が拡散
律速反応であること、使用される不均一条件下では一般
に反応がかなり遅いこと、欠失配列が生じないように比
較的大量の過剰試薬が必要なこと、である。更に、伸長
中のペプチドの全部の反応性側鎖を保護しなければなら
ない。不連続処理による精製を全く行わないので、非保
護側鎖の存在に起因する副反応が生じて最終生成物中の
不純物となる。固相法は大規模生産に応用するのが難し
くまた試薬及び材料についてもコスト高である。
たは溶液中で合成される。いずれの合成方法でも、結合
段階と脱保護段階とを交互に繰り返し、精製は両段階間
の合間処理として行われる。固相法では、固体支持体に
結合したままで配列の組立を完了し、最後に配列を支持
体から分離する。余剰試薬及び副生物は濾過によって除
去する。固相合成の明らかな利点は、多少とも応用範囲
が広く、全自動化が容易なことである。しかしながら、
幾つかの深刻な欠点も有している。例えば、反応が拡散
律速反応であること、使用される不均一条件下では一般
に反応がかなり遅いこと、欠失配列が生じないように比
較的大量の過剰試薬が必要なこと、である。更に、伸長
中のペプチドの全部の反応性側鎖を保護しなければなら
ない。不連続処理による精製を全く行わないので、非保
護側鎖の存在に起因する副反応が生じて最終生成物中の
不純物となる。固相法は大規模生産に応用するのが難し
くまた試薬及び材料についてもコスト高である。
【０００３】他方で、従来の溶液相合成法は容易に大規
模生産に容易に応用でき、試薬及び材料についても廉価
である。非保護側鎖の副反応によって生じた副生物は合
間の精製によって除去できるので、通常は完全に保護さ
れたアミノ酸は必要でない。しかしながら、溶液相合成
法では配列特異的プロトコルが必要であり、完全配列の
産生には極めて長時間を要する。双方の方法が上記のよ
うな欠点を有しているので、特にペプチドを大規模合成
するためにこれらの従来方法の両者の利点を併せ持つ方
法が要望されている。新しい方法には、高速で、大規模
化が容易で、応用範囲が広いことが要求される。
模生産に容易に応用でき、試薬及び材料についても廉価
である。非保護側鎖の副反応によって生じた副生物は合
間の精製によって除去できるので、通常は完全に保護さ
れたアミノ酸は必要でない。しかしながら、溶液相合成
法では配列特異的プロトコルが必要であり、完全配列の
産生には極めて長時間を要する。双方の方法が上記のよ
うな欠点を有しているので、特にペプチドを大規模合成
するためにこれらの従来方法の両者の利点を併せ持つ方
法が要望されている。新しい方法には、高速で、大規模
化が容易で、応用範囲が広いことが要求される。
【０００４】溶液相合成では、アミノ成分に対する定量
的な結合を確保するために、各結合段階で多少過剰な量
の活性化カルボキシル成分を使用するのが好ましい。こ
れによって最終生成物中に欠失配列が生じることを防止
できる。通常は、残留する活性化カルボキシル成分が合
間の水性処理中に破壊され除去されると想定されてい
る。しかしながら、結合段階後に残留する（活性化）カ
ルボキシル成分の除去が不完全であり、脱保護後に結合
が生じるので、挿入ペプチド配列が最終ペプチドの不純
物としてしばしば見出される。このような副反応の発生
を回避するために、残留する活性化カルボキシル官能基
を捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅ）（不活化）する捕捉段階を
結合段階の直後に導入し得る。捕捉剤（ｓｃａｖｅｎｇ
ｅｒ）として通常はアミンを使用する。捕捉剤としてポ
リアミンを使用すると、捕捉された化合物がそれぞれの
極性に依存して、好ましくは酸性の水相に盛んに抽出さ
れ得る［例えば、Ｋｉｓｆａｌｕｄｙ，Ｌ．ら（１９７
４）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９，１７８５
−１７８６］。伸長中のペプチドが水相中に失われるこ
とを避けるために、この抽出は通常は脱保護段階の前に
行う。しかしながらこの手順では多くの場合、捕捉され
た化合物の疎水性が原因で合間の精製が不完全であるこ
とが知見された。カルボキシル成分のアミノアシル部の
固有疎水性は、残存しているアミノ保護基によって増強
される。従って水性抽出が完全に有効ではない。
的な結合を確保するために、各結合段階で多少過剰な量
の活性化カルボキシル成分を使用するのが好ましい。こ
れによって最終生成物中に欠失配列が生じることを防止
できる。通常は、残留する活性化カルボキシル成分が合
間の水性処理中に破壊され除去されると想定されてい
る。しかしながら、結合段階後に残留する（活性化）カ
ルボキシル成分の除去が不完全であり、脱保護後に結合
が生じるので、挿入ペプチド配列が最終ペプチドの不純
物としてしばしば見出される。このような副反応の発生
を回避するために、残留する活性化カルボキシル官能基
を捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅ）（不活化）する捕捉段階を
結合段階の直後に導入し得る。捕捉剤（ｓｃａｖｅｎｇ
ｅｒ）として通常はアミンを使用する。捕捉剤としてポ
リアミンを使用すると、捕捉された化合物がそれぞれの
極性に依存して、好ましくは酸性の水相に盛んに抽出さ
れ得る［例えば、Ｋｉｓｆａｌｕｄｙ，Ｌ．ら（１９７
４）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９，１７８５
−１７８６］。伸長中のペプチドが水相中に失われるこ
とを避けるために、この抽出は通常は脱保護段階の前に
行う。しかしながらこの手順では多くの場合、捕捉され
た化合物の疎水性が原因で合間の精製が不完全であるこ
とが知見された。カルボキシル成分のアミノアシル部の
固有疎水性は、残存しているアミノ保護基によって増強
される。従って水性抽出が完全に有効ではない。
【０００５】最近では、Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら
［（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４３２４
−４３３８］が捕捉方法の改良を報告した。該方法で
は、ポリアミンを捕捉剤として使用することに加えて、
アミノ保護基１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン
−２−イルメトキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）を使用し
た。Ｂｓｍｏｃ官能基は塩基に対して極めて高い置換活
性を有している。その結果として、ポリアミンを使用す
る単一段階で、残留する活性化カルボキシル官能基が捕
捉され同時にＢｓｍｏｃ官能基が除去される。Ｂｓｍｏ
ｃ官能基の使用は、１シリーズの段階で比較的短時間に
ペプチドの組立ができるので、高速連続溶液相技術を使
用する（オリゴ）ペプチド製造方法の重要な改良である
と記載されている。
［（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４３２４
−４３３８］が捕捉方法の改良を報告した。該方法で
は、ポリアミンを捕捉剤として使用することに加えて、
アミノ保護基１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン
−２−イルメトキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）を使用し
た。Ｂｓｍｏｃ官能基は塩基に対して極めて高い置換活
性を有している。その結果として、ポリアミンを使用す
る単一段階で、残留する活性化カルボキシル官能基が捕
捉され同時にＢｓｍｏｃ官能基が除去される。Ｂｓｍｏ
ｃ官能基の使用は、１シリーズの段階で比較的短時間に
ペプチドの組立ができるので、高速連続溶液相技術を使
用する（オリゴ）ペプチド製造方法の重要な改良である
と記載されている。
【０００６】高速連続溶液合成による新規なペプチド合
成方法がここに知見された。該方法では、アミノ保護基
（活性化カルボキシル成分のＮ末端保護基）を本質的に
随意に選択できる捕捉剤を使用する。Ｃａｒｐｉｎｏの
方法と対照的に、過剰量の活性化カルボキシル官能基の
捕捉と同じ反応条件下ではＮ末端官能基の脱保護が必ず
しも生じない。従って、本発明方法はＣａｒｐｉｎｏの
方法よりもはるかに汎用性である。
成方法がここに知見された。該方法では、アミノ保護基
（活性化カルボキシル成分のＮ末端保護基）を本質的に
随意に選択できる捕捉剤を使用する。Ｃａｒｐｉｎｏの
方法と対照的に、過剰量の活性化カルボキシル官能基の
捕捉と同じ反応条件下ではＮ末端官能基の脱保護が必ず
しも生じない。従って、本発明方法はＣａｒｐｉｎｏの
方法よりもはるかに汎用性である。
【０００７】本発明の新規な方法は、有機溶媒中または
有機溶媒の混合物中でペプチドを高速溶液合成する方法
であって、以下の段階（ａ）−（ｄ）： （ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミ
ノ成分をアシル化する結合段階、（ｂ）捕捉剤を使用し
て残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、該捕捉
剤が伸長中のペプチドの脱保護にも使用される消去段
階、（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、
（ｄ）場合によっては、１回または複数回の水性抽出段
階の前に挿入される独立の脱保護段階、の反復サイクル
から成り、方法が、残留する活性化カルボキシル官能基
の捕捉剤として遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む
アミンを使用する少なくとも１つの段階（ｂ）を含みこ
の段階を段階（ｂ′）と呼ぶことを特徴とする。
有機溶媒の混合物中でペプチドを高速溶液合成する方法
であって、以下の段階（ａ）−（ｄ）： （ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミ
ノ成分をアシル化する結合段階、（ｂ）捕捉剤を使用し
て残留する活性化カルボキシル官能基を除去し、該捕捉
剤が伸長中のペプチドの脱保護にも使用される消去段
階、（ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、
（ｄ）場合によっては、１回または複数回の水性抽出段
階の前に挿入される独立の脱保護段階、の反復サイクル
から成り、方法が、残留する活性化カルボキシル官能基
の捕捉剤として遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む
アミンを使用する少なくとも１つの段階（ｂ）を含みこ
の段階を段階（ｂ′）と呼ぶことを特徴とする。
【０００８】本発明方法の進行中に、最終ペプチド配列
（即ち、本発明方法の最終生成物）が得られるまで伸長
中のペプチドを単離する必要がない。従って、従来の溶
液相法に比べて方法が有意に時間短縮され、大規模化が
容易である。本発明方法によれば、ポリアミンを捕捉剤
として使用する別の従来技術の方法のような疎水性の問
題がないので、残留する活性化カルボキシル成分が極め
て効率的に除去される。従って、高純度のペプチドが得
られる。
（即ち、本発明方法の最終生成物）が得られるまで伸長
中のペプチドを単離する必要がない。従って、従来の溶
液相法に比べて方法が有意に時間短縮され、大規模化が
容易である。本発明方法によれば、ポリアミンを捕捉剤
として使用する別の従来技術の方法のような疎水性の問
題がないので、残留する活性化カルボキシル成分が極め
て効率的に除去される。従って、高純度のペプチドが得
られる。
【０００９】好ましくは、本発明の段階（ａ）で使用さ
れる試薬のモル量は、カルボキシル成分、結合用添加剤
＞結合用試薬＞アミノ成分の順に少なくなる。好ましく
はまた、方法の段階（ａ）でプレ活性化カルボキシル成
分を使用する。
れる試薬のモル量は、カルボキシル成分、結合用添加剤
＞結合用試薬＞アミノ成分の順に少なくなる。好ましく
はまた、方法の段階（ａ）でプレ活性化カルボキシル成
分を使用する。
【００１０】別の好ましい実施態様では、段階（ｂ′）
で潜在アニオンを含むアミンを捕捉剤として使用する。
好ましくは、捕捉用アミン中の潜在アニオンは、伸長中
のペプチドに結合した永久保護基の存在下でも選択的に
除去され得る一時保護基を有している。特に好ましい実
施態様では、捕捉用アミン中の潜在アニオンの保護基
は、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の
置換活性と同様の置換活性を示す。このため、アニオン
を生じる捕捉剤の脱保護と伸長中のペプチドのＮ末端脱
保護とを単一処理段階で行うことができる。本発明方法
では、伸長中のペプチドのＮ末端に存在しまた場合によ
っては捕捉剤中に存在する一時保護基が水素化分解的に
除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除
去可能な基であるのが特に好ましい。好ましくは、該一
時保護基がベンジル型の基、例えば、（置換）ベンジル
基及びベンジルオキシカルボニル基である。好ましい捕
捉剤は、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む第一級
アミン、特にＣ末端が保護されたアミノ酸誘導体であ
る。捕捉用アミンは、カルボキシレート以外に、スルホ
ネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェートま
たはフェノレートなどを非限定例とする別のアニオン性
官能基を含有してもよい。捕捉剤として使用し得る極め
て好ましいアミノ酸は、β−アラニンまたはその誘導体
（例えば、エステルまたはシリルエステル誘導体）であ
る。最も好ましい捕捉剤はベンジルβ−アラニネートま
たはその塩である。本発明方法ではまた、遊離アニオン
または潜在アニオンを含むアミンの代わりに、遊離アニ
オンまたは潜在アニオンを含むチオールを捕捉剤として
使用し得る。捕捉剤は好ましくは、捕捉が必要な残留活
性成分に対して２倍−６倍のモル過剰量で使用する。
で潜在アニオンを含むアミンを捕捉剤として使用する。
好ましくは、捕捉用アミン中の潜在アニオンは、伸長中
のペプチドに結合した永久保護基の存在下でも選択的に
除去され得る一時保護基を有している。特に好ましい実
施態様では、捕捉用アミン中の潜在アニオンの保護基
は、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の
置換活性と同様の置換活性を示す。このため、アニオン
を生じる捕捉剤の脱保護と伸長中のペプチドのＮ末端脱
保護とを単一処理段階で行うことができる。本発明方法
では、伸長中のペプチドのＮ末端に存在しまた場合によ
っては捕捉剤中に存在する一時保護基が水素化分解的に
除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除
去可能な基であるのが特に好ましい。好ましくは、該一
時保護基がベンジル型の基、例えば、（置換）ベンジル
基及びベンジルオキシカルボニル基である。好ましい捕
捉剤は、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む第一級
アミン、特にＣ末端が保護されたアミノ酸誘導体であ
る。捕捉用アミンは、カルボキシレート以外に、スルホ
ネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェートま
たはフェノレートなどを非限定例とする別のアニオン性
官能基を含有してもよい。捕捉剤として使用し得る極め
て好ましいアミノ酸は、β−アラニンまたはその誘導体
（例えば、エステルまたはシリルエステル誘導体）であ
る。最も好ましい捕捉剤はベンジルβ−アラニネートま
たはその塩である。本発明方法ではまた、遊離アニオン
または潜在アニオンを含むアミンの代わりに、遊離アニ
オンまたは潜在アニオンを含むチオールを捕捉剤として
使用し得る。捕捉剤は好ましくは、捕捉が必要な残留活
性成分に対して２倍−６倍のモル過剰量で使用する。
【００１１】本発明の捕捉剤を使用すると、捕捉された
親水性化合物が得られる。このような化合物は脱保護段
階後に塩基性水相に盛んに抽出され得る。脱保護（適当
な場合）後には、捕捉された種に遊離アミノ官能基と遊
離カルボキシル官能基との双方が存在するので親水性が
増強される。従って、本発明方法によれば、捕捉された
親水性化合物を盛んに抽出することができるので合間の
精製が極めて有効である。更に、活性化されなかった余
剰のカルボキシル成分が存在していても、該カルボキシ
ル成分の一時的保護基が脱保護中に除去されているの
で、該カルボキシル成分は同時に反応混合物から抽出さ
れる。
親水性化合物が得られる。このような化合物は脱保護段
階後に塩基性水相に盛んに抽出され得る。脱保護（適当
な場合）後には、捕捉された種に遊離アミノ官能基と遊
離カルボキシル官能基との双方が存在するので親水性が
増強される。従って、本発明方法によれば、捕捉された
親水性化合物を盛んに抽出することができるので合間の
精製が極めて有効である。更に、活性化されなかった余
剰のカルボキシル成分が存在していても、該カルボキシ
ル成分の一時的保護基が脱保護中に除去されているの
で、該カルボキシル成分は同時に反応混合物から抽出さ
れる。
【００１２】本発明方法によれば、方法の少なくとも１
つのサイクル、場合によっては複数のサイクルが、残留
する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として遊離アニ
オンまたは潜在アニオンを使用する段階（ｂ′）を含
む。しかしながら、本発明の別の実施態様によれば、方
法が更に、段階（ｂ）で３−ジメチルアミノ−１−プロ
ピルアミンのようなポリアミンを捕捉剤として使用する
１つまたは複数のサイクルを含む。
つのサイクル、場合によっては複数のサイクルが、残留
する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤として遊離アニ
オンまたは潜在アニオンを使用する段階（ｂ′）を含
む。しかしながら、本発明の別の実施態様によれば、方
法が更に、段階（ｂ）で３−ジメチルアミノ−１−プロ
ピルアミンのようなポリアミンを捕捉剤として使用する
１つまたは複数のサイクルを含む。
【００１３】本発明の別の好ましい方法は、段階（ｂ）
では脱保護が生じることなく（即ち、捕捉剤が消去だけ
を行うような環境、例えばＺ保護基及び捕捉剤として潜
在アニオンを含むアミンを使用するような環境を選択す
る）、次段階（ｃ）で順次に塩基性、酸性及び塩基性の
抽出を行う１つまたは複数のサイクルから成る。上記抽
出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの
存在下で行う。この方法は、脱保護と順次に行う塩基性
抽出及び中性抽出とから成る後続段階（ｄ）を含む。こ
れらの抽出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カ
リウムの存在下で行う。
では脱保護が生じることなく（即ち、捕捉剤が消去だけ
を行うような環境、例えばＺ保護基及び捕捉剤として潜
在アニオンを含むアミンを使用するような環境を選択す
る）、次段階（ｃ）で順次に塩基性、酸性及び塩基性の
抽出を行う１つまたは複数のサイクルから成る。上記抽
出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの
存在下で行う。この方法は、脱保護と順次に行う塩基性
抽出及び中性抽出とから成る後続段階（ｄ）を含む。こ
れらの抽出は好ましくは、塩化ナトリウムまたは硝酸カ
リウムの存在下で行う。
【００１４】別の好ましい本発明方法は、段階（ｂ）で
消去及び脱保護の双方が行われ（例えば、Ｂｓｍｏｃ保
護基及び捕捉剤としてポリアミンを使用する）、次段階
（ｃ）で順次に塩基性抽出及び中性抽出を行う１つまた
は複数のサイクルから成る。上記抽出は好ましくは、塩
化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。
消去及び脱保護の双方が行われ（例えば、Ｂｓｍｏｃ保
護基及び捕捉剤としてポリアミンを使用する）、次段階
（ｃ）で順次に塩基性抽出及び中性抽出を行う１つまた
は複数のサイクルから成る。上記抽出は好ましくは、塩
化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。
【００１５】また、最終サイクルの段階（ａ）でカルボ
キシル成分の保護基がアミノ成分の永久保護基の置換活
性と同様の置換活性を示し、段階（ｂ）の捕捉剤がポリ
アミンから成る方法も好ましい。
キシル成分の保護基がアミノ成分の永久保護基の置換活
性と同様の置換活性を示し、段階（ｂ）の捕捉剤がポリ
アミンから成る方法も好ましい。
【００１６】本発明方法はペプチドの製造に常用されて
いる幾つかの有機溶媒中で行うことができる。極めて好
ましい有機溶媒は酢酸エチルである。また、酢酸エチル
と別の有機溶媒との混合物、例えばジクロロメタン、１
−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドまたはテトラヒドロフランとの混合物も好まし
い。本発明方法は、従来の溶液相ペプチド合成のこのよ
うな段階の使用温度として当業界で公知の温度で行うと
よい。しかしながら好ましくは方法を０−５０℃の温度
範囲内、特に周囲温度で行う。
いる幾つかの有機溶媒中で行うことができる。極めて好
ましい有機溶媒は酢酸エチルである。また、酢酸エチル
と別の有機溶媒との混合物、例えばジクロロメタン、１
−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドまたはテトラヒドロフランとの混合物も好まし
い。本発明方法は、従来の溶液相ペプチド合成のこのよ
うな段階の使用温度として当業界で公知の温度で行うと
よい。しかしながら好ましくは方法を０−５０℃の温度
範囲内、特に周囲温度で行う。
【００１７】本発明方法は、分割及び混合の方法を使用
するペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成に極
めて好適である。結合は個別に行われるが、個々の結合
混合物を合わせて抽出及び脱保護を行う。
するペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成に極
めて好適である。結合は個別に行われるが、個々の結合
混合物を合わせて抽出及び脱保護を行う。
【００１８】本発明方法は標準プロトコルを使用するの
で全自動化に極めて適している。本発明の新規な方法は
高純度のオリゴ−及びポリペプチドの製造に好適に使用
できる極めて効率的な方法である。
で全自動化に極めて適している。本発明の新規な方法は
高純度のオリゴ−及びポリペプチドの製造に好適に使用
できる極めて効率的な方法である。
【００１９】好適な本発明方法は、過剰量のカルボキシ
ル成分をアミノ成分に結合させる方法であり、結合試薬
及び所望の場合には添加剤を使用してカルボキシル官能
基を予め活性化するかまたはｉｎ ｓｉｔｕ活性化す
る。結合段階後に残留する活性化カルボキシル官能基
は、反応混合物に捕捉剤を添加し、通常はその後に水性
抽出を行うことによって捕捉される。捕捉後または捕捉
中に、当業界で公知の適当な方法を使用して一時的保護
基を除去し、通常はその後に、捕捉された化合物を水性
抽出によって除去する。同時に、場合によっては存在す
る活性化されなかった余剰のカルボキシル成分の一時的
保護基も脱保護中に除去され、また、別の水溶性試薬及
び副生物は反応混合物から抽出される。
ル成分をアミノ成分に結合させる方法であり、結合試薬
及び所望の場合には添加剤を使用してカルボキシル官能
基を予め活性化するかまたはｉｎ ｓｉｔｕ活性化す
る。結合段階後に残留する活性化カルボキシル官能基
は、反応混合物に捕捉剤を添加し、通常はその後に水性
抽出を行うことによって捕捉される。捕捉後または捕捉
中に、当業界で公知の適当な方法を使用して一時的保護
基を除去し、通常はその後に、捕捉された化合物を水性
抽出によって除去する。同時に、場合によっては存在す
る活性化されなかった余剰のカルボキシル成分の一時的
保護基も脱保護中に除去され、また、別の水溶性試薬及
び副生物は反応混合物から抽出される。
【００２０】アミノ成分という用語は、遊離アミノ官能
基を含む分子を意味する。より特定的にはアミノ成分
は、遊離アミノ官能基を含み別の官能基が所望の結合反
応を妨害しないように保護されている任意のアミン、ア
ミノ酸またはオリゴペプチドでよい。使用されるアミノ
酸またはオリゴペプチドのＣ末端官能基は、置換もしく
は未置換のアミドとしてまたはエステルとして保護され
得る。エステルの非限定例は、メチル、エチル、ｔ−ブ
チル、ベンジル、フェンアシル、３−（３−メチル）ペ
ンチル（Ｍｐｅ）、２−（２−フェニル）プロピル（Ｐ
ｐ）、２−クロロトリチル（Ｃｌｔ）、ジフェニル（４
−ピリジル）メチル（ＰｙＢｚｈ）、ジシクロプロピル
メチル（Ｄｃｐｍ）、９−フルオレニルメチル（Ｆ
ｍ）、アリル（Ａｌｌ）、２−（トリメチルシリル）エ
チル（Ｔｍｓｅ）、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチ
ル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチ
ルブチル］−アミノ｝ベンジル（Ｄｍａｂ）エステル及
び酵素的に開裂可能なエステルである［Ｒｏｅｓｋｅ，
Ｒ．Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ′，ｖ
ｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０１−１３６；Ｍｐｅにつ
いては：Ｋａｒｌｏｓｔｒｏｍ，Ａ．ａｎｄ Ｕｎｄｅ
ｎ，Ａ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．３７，４３４３−４２４６；Ｐｐについては：Ｙｕ
ｅ，Ｃ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．３４，３２３−３２６；Ｃｌｔについては：Ａｔ
ｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．ら（１９９５）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６，５６４５−５６
４８；ＰｙＢｚｈについては：Ｍｅｒｇｌｅｒ，Ｍ．ら
（２００１）Ｐ１５４，２ｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＆ １７
ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ；Ｄｃｐｍについては：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．
Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０，７７
１８−７７１９；Ｆｍについては：Ａｌ−Ｏｂｅｉｄ
ｉ，Ｆ．ら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５，２１５−２１８；Ａｌ
ｌについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６，
４９３−４９７；Ｔｍｓｅについては：Ｓｉｅｂｅｒ，
Ｐ．（１９７７）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６
０，２７１１−２７１６；Ｄｍａｂについては：Ｃｈａ
ｎ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２０９−２２１０］。ア
ミノ成分中の別の官能基を永久保護するためにはｔ−ブ
チル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好
ましい。これらの官能基の非限定例として、Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ側鎖の保護には−ｔ−
ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ及びＴｒｐ側鎖の保護にはｔ
−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及び
Ｈｉｓ側鎖の保護にはトリチル（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ側鎖
の保護には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン
−６−スルホニル（Ｐｍｃ）または２，２，４，６，７
−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
（Ｐｂｆ）がある［Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）：Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．２（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ
Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２
８４；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）については：Ｆｒａｎｚｅｎ，
Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，１６９９−１７００；Ａｓｎ（Ｔｒ
ｔ）及びＧｌｎ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，
Ｐ．ａｎｄ Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９９１）Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２，７３９−７４２；
Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎ
ｄ Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８，６０３１−６０３４；Ｐｍ
ｃについては：Ｒａｍａｇｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｇｒｅｅ
ｎ，Ｊ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．２８，２２８７−２２９０；Ｐｂｆについては：Ｃ
ａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４，７８２９−７８３２］。
基を含む分子を意味する。より特定的にはアミノ成分
は、遊離アミノ官能基を含み別の官能基が所望の結合反
応を妨害しないように保護されている任意のアミン、ア
ミノ酸またはオリゴペプチドでよい。使用されるアミノ
酸またはオリゴペプチドのＣ末端官能基は、置換もしく
は未置換のアミドとしてまたはエステルとして保護され
得る。エステルの非限定例は、メチル、エチル、ｔ−ブ
チル、ベンジル、フェンアシル、３−（３−メチル）ペ
ンチル（Ｍｐｅ）、２−（２−フェニル）プロピル（Ｐ
ｐ）、２−クロロトリチル（Ｃｌｔ）、ジフェニル（４
−ピリジル）メチル（ＰｙＢｚｈ）、ジシクロプロピル
メチル（Ｄｃｐｍ）、９−フルオレニルメチル（Ｆ
ｍ）、アリル（Ａｌｌ）、２−（トリメチルシリル）エ
チル（Ｔｍｓｅ）、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチ
ル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチ
ルブチル］−アミノ｝ベンジル（Ｄｍａｂ）エステル及
び酵素的に開裂可能なエステルである［Ｒｏｅｓｋｅ，
Ｒ．Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ′，ｖ
ｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０１−１３６；Ｍｐｅにつ
いては：Ｋａｒｌｏｓｔｒｏｍ，Ａ．ａｎｄ Ｕｎｄｅ
ｎ，Ａ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．３７，４３４３−４２４６；Ｐｐについては：Ｙｕ
ｅ，Ｃ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．３４，３２３−３２６；Ｃｌｔについては：Ａｔ
ｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．ら（１９９５）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６，５６４５−５６
４８；ＰｙＢｚｈについては：Ｍｅｒｇｌｅｒ，Ｍ．ら
（２００１）Ｐ１５４，２ｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＆ １７
ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ；Ｄｃｐｍについては：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．
Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０，７７
１８−７７１９；Ｆｍについては：Ａｌ−Ｏｂｅｉｄ
ｉ，Ｆ．ら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５，２１５−２１８；Ａｌ
ｌについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６，
４９３−４９７；Ｔｍｓｅについては：Ｓｉｅｂｅｒ，
Ｐ．（１９７７）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６
０，２７１１−２７１６；Ｄｍａｂについては：Ｃｈａ
ｎ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２０９−２２１０］。ア
ミノ成分中の別の官能基を永久保護するためにはｔ−ブ
チル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好
ましい。これらの官能基の非限定例として、Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ側鎖の保護には−ｔ−
ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ及びＴｒｐ側鎖の保護にはｔ
−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及び
Ｈｉｓ側鎖の保護にはトリチル（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ側鎖
の保護には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン
−６−スルホニル（Ｐｍｃ）または２，２，４，６，７
−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
（Ｐｂｆ）がある［Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）：Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．２（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ
Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２
８４；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）については：Ｆｒａｎｚｅｎ，
Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，１６９９−１７００；Ａｓｎ（Ｔｒ
ｔ）及びＧｌｎ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，
Ｐ．ａｎｄ Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９９１）Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２，７３９−７４２；
Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）については：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎ
ｄ Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８，６０３１−６０３４；Ｐｍ
ｃについては：Ｒａｍａｇｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｇｒｅｅ
ｎ，Ｊ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．２８，２２８７−２２９０；Ｐｂｆについては：Ｃ
ａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４，７８２９−７８３２］。
【００２１】カルボキシル成分という用語は、遊離カル
ボキシル官能基を含む分子を意味する。より特定的に
は、カルボキシル成分は、遊離カルボキシル官能基を有
しており別の官能基が所望の結合反応を妨害しないよう
に保護されている任意のカルボン酸、アミノ酸またはオ
リゴペプチドでよい。好ましい実施態様では、使用され
るアミノ酸またはオリゴペプチドのアミノ基がベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）官能基によって一時的に保護さ
れている。官能基の別の非限定例は、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、
フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ
ｃ）、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル
（Ｍｓｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）官
能基、オルトニトロベンゼンスルホニル（ｏ−ＮＢＳ）
のようなアリールスルホニル型の官能基、及び、酵素的
に開裂可能な官能基である［Ｇｅｉｇｅｒ，Ｒ．ａｎ
ｄ，Ｋｏｎｉｇ，Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍ
ｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−９９；
Ａｌｌｏｃについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ａｎｄ Ｕｎｖ
ｅｒｚａｇｔ，Ｃ．（１９８４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．９６，４２６−４２７；アリールスルホニルについ
ては：Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８，５８３１−５８３
４］。カルボキシル成分中の別の官能基を永久保護する
ためには、アミノ成分に関して上述したようなｔ−ブチ
ル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ま
しい。カルボキシル成分を、活性エステル、好ましく
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾー
ル−１−イル、ペンタフルオロフェニルまたは４−ニト
ロフェニルエステルとして、ハロゲン化物、Ｎ−カルボ
キシ無水物または対称無水物として予め活性化してもよ
い。あるいは、カルボキシル成分を、混合無水物とし
て、または、結合試薬、例えばカルボジイミド、好まし
くはＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）または１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ウロニウム
またはホスホニウム塩を使用し、場合によっては結合用
添加剤、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＨＯＮＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−
ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢ
ｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
（ＨＯＡｔ）または６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）の存在下、及び、必要
な場合には第三級アミンの存在下でｉｎ ｓｉｔｕで活
性化してもよい［Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏ
ｌ．１（１９７９）（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉ
ｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｘ
ｕ，Ｊ．−Ｃ．（２０００）Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．
１８，４５６−４６６］。
ボキシル官能基を含む分子を意味する。より特定的に
は、カルボキシル成分は、遊離カルボキシル官能基を有
しており別の官能基が所望の結合反応を妨害しないよう
に保護されている任意のカルボン酸、アミノ酸またはオ
リゴペプチドでよい。好ましい実施態様では、使用され
るアミノ酸またはオリゴペプチドのアミノ基がベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）官能基によって一時的に保護さ
れている。官能基の別の非限定例は、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、
フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ
ｃ）、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル
（Ｍｓｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）官
能基、オルトニトロベンゼンスルホニル（ｏ−ＮＢＳ）
のようなアリールスルホニル型の官能基、及び、酵素的
に開裂可能な官能基である［Ｇｅｉｇｅｒ，Ｒ．ａｎ
ｄ，Ｋｏｎｉｇ，Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍ
ｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−９９；
Ａｌｌｏｃについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ａｎｄ Ｕｎｖ
ｅｒｚａｇｔ，Ｃ．（１９８４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．９６，４２６−４２７；アリールスルホニルについ
ては：Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８，５８３１−５８３
４］。カルボキシル成分中の別の官能基を永久保護する
ためには、アミノ成分に関して上述したようなｔ−ブチ
ル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ま
しい。カルボキシル成分を、活性エステル、好ましく
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾー
ル−１−イル、ペンタフルオロフェニルまたは４−ニト
ロフェニルエステルとして、ハロゲン化物、Ｎ−カルボ
キシ無水物または対称無水物として予め活性化してもよ
い。あるいは、カルボキシル成分を、混合無水物とし
て、または、結合試薬、例えばカルボジイミド、好まし
くはＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）または１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ウロニウム
またはホスホニウム塩を使用し、場合によっては結合用
添加剤、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＨＯＮＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−
ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢ
ｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
（ＨＯＡｔ）または６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）の存在下、及び、必要
な場合には第三級アミンの存在下でｉｎ ｓｉｔｕで活
性化してもよい［Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏ
ｌ．１（１９７９）（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉ
ｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｘ
ｕ，Ｊ．−Ｃ．（２０００）Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．
１８，４５６−４６６］。
【００２２】一時的保護基は当業界で公知の方法によっ
て除去し得る（上記参照）。Ｚ官能基は、例えば水素ガ
スまたはホルミエートを水素供与体として用いた（標
準）手順を使用する水素化分解によって除去し得る。こ
の処理中に、ベンジル型保護基は完全に除去され、ｔ−
ブチル型の保護基または同様の置換活性をもつ官能基は
維持される。後者は、当業者に公知のアシドリシスによ
って除去し得る。
て除去し得る（上記参照）。Ｚ官能基は、例えば水素ガ
スまたはホルミエートを水素供与体として用いた（標
準）手順を使用する水素化分解によって除去し得る。こ
の処理中に、ベンジル型保護基は完全に除去され、ｔ−
ブチル型の保護基または同様の置換活性をもつ官能基は
維持される。後者は、当業者に公知のアシドリシスによ
って除去し得る。
【００２３】塩基性水性抽出という用語の意味は当業者
に理解されるであろう。しかしながら、塩基性水性抽出
は好ましくは、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウ
ムの水溶液を使用し、所望の場合には塩化ナトリウムま
たは硝酸カリウムの存在下で行う。活性水性抽出という
用語は、酸性条件下でアミノ成分をプロトン化形態（ア
ンモニウム）で抽出するかまたは塩基性条件下でカルボ
キシル成分を脱プロトン形態（カルボキシレート）で抽
出するような処理を意味する。
に理解されるであろう。しかしながら、塩基性水性抽出
は好ましくは、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウ
ムの水溶液を使用し、所望の場合には塩化ナトリウムま
たは硝酸カリウムの存在下で行う。活性水性抽出という
用語は、酸性条件下でアミノ成分をプロトン化形態（ア
ンモニウム）で抽出するかまたは塩基性条件下でカルボ
キシル成分を脱プロトン形態（カルボキシレート）で抽
出するような処理を意味する。
【００２４】本発明を以下の実施例でより詳細に説明す
るが、本発明がこれらの記載に限定されないことを理解
されたい。
るが、本発明がこれらの記載に限定されないことを理解
されたい。
【００２５】実施例１
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ
（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ 第１サイクル ：２０℃の酢酸エチルとジクロロメタンと
の混合物中の４．３４ｇのＨ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏｔ
Ｂｕの撹拌溶液に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール、７．７６ｇのＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−
ＯＨ、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍ
ｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を
反応が完了するまで撹拌した後、１．２１ｍｌの４−メ
チルモルホリン及び３．５１ｇのベンジルβ−アラニネ
ートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を
更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣ
ｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２Ｃ
Ｏ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ 第１サイクル ：２０℃の酢酸エチルとジクロロメタンと
の混合物中の４．３４ｇのＨ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏｔ
Ｂｕの撹拌溶液に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール、７．７６ｇのＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−
ＯＨ、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍ
ｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を
反応が完了するまで撹拌した後、１．２１ｍｌの４−メ
チルモルホリン及び３．５１ｇのベンジルβ−アラニネ
ートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を
更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣ
ｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２Ｃ
Ｏ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２６】保護されたジペプチドＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢ
ｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層をパラ
ジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によっ
て処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％
ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を
酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗浄し、集め
た有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３
０％ＮａＣｌで抽出した。
ｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有機層をパラ
ジウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によっ
て処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％
ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を
酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗浄し、集め
た有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３
０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２７】第２サイクル：２０℃のジペプチドＺ−Ａ
ｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む
有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール、７．１８ｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４．２０ｇの１
−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４−メチルモルホ
リンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹
拌した後、１．２１ｍｌの４−メチルモルホリン及び
３．５１ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンス
ルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌
し、５％Ｎａ２ＣＯ ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ
４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％Ｎａ
Ｃｌで抽出した。
ｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む
有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール、７．１８ｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４．２０ｇの１
−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４−メチルモルホ
リンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹
拌した後、１．２１ｍｌの４−メチルモルホリン及び
３．５１ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンス
ルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌
し、５％Ｎａ２ＣＯ ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ
４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％Ｎａ
Ｃｌで抽出した。
【００２８】保護されたトリペプチドＺ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有
機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化
分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ
３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過し
た。残渣を酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗
浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％Ｎａ
Ｃｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
ｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含む有
機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化
分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ
３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過し
た。残渣を酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗
浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％Ｎａ
Ｃｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００２９】第３サイクル：２０℃のトリペプチドＨ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏｔ
Ｂｕを含む有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、４．２１ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４
−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が
完了するまで撹拌した後、１．２５ｍｌの３−ジメチル
アミノ−１−プロピルアミンを添加した。混合物を更に
３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、
５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ、５％Ｎａ２ＣＯ３／
１０％ＮａＣｌ、３０％ＮａＣｌ及び水で抽出した。有
機層を蒸発乾固し、残渣をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエ
ーテルで研和し、乾燥すると、所望の保護されたテトラ
ペプチドが出発物質Ｈ−Ｓｅｒ（ ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを
基準として９５％の収率で得られた。方法は６時間以内
に終了した。
Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏｔ
Ｂｕを含む有機層に、３．２４ｇの１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、４．２１ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び２．４２ｍｌの４
−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が
完了するまで撹拌した後、１．２５ｍｌの３−ジメチル
アミノ−１−プロピルアミンを添加した。混合物を更に
３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、
５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ、５％Ｎａ２ＣＯ３／
１０％ＮａＣｌ、３０％ＮａＣｌ及び水で抽出した。有
機層を蒸発乾固し、残渣をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエ
ーテルで研和し、乾燥すると、所望の保護されたテトラ
ペプチドが出発物質Ｈ−Ｓｅｒ（ ｔＢｕ）−ＯｔＢｕを
基準として９５％の収率で得られた。方法は６時間以内
に終了した。
【００３０】逆相ＨＰＬＣによる純度：９８．１％（２
９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％
までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，
５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳ
による同定：ｍ／ｚ４２５．４［Ｍ−Ｂｏｃ−３ｔＢｕ
＋Ｈ］＋，４６９．４［Ｍ−４ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５２
５．４［Ｍ−３ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５８１．４［Ｍ−２ｔ
Ｂｕ＋Ｈ］＋，６３７．４［Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋，６９
３．４［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ
１．１６（ｓ，９Ｈ），１．４４（ｍ，２７Ｈ），２．
５９（ｄｄ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．０
９（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ），３．６９−
３．８６（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．６
７−４．７８（ｍ，２Ｈ），５．２０（ｂｓ，１Ｈ），
６．６８（ｄ，１Ｈ），７．１２−７．３４（ｍ，７
Ｈ）。
９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％
までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，
５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳ
による同定：ｍ／ｚ４２５．４［Ｍ−Ｂｏｃ−３ｔＢｕ
＋Ｈ］＋，４６９．４［Ｍ−４ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５２
５．４［Ｍ−３ｔＢｕ＋Ｈ］＋，５８１．４［Ｍ−２ｔ
Ｂｕ＋Ｈ］＋，６３７．４［Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋，６９
３．４［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ
１．１６（ｓ，９Ｈ），１．４４（ｍ，２７Ｈ），２．
５９（ｄｄ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．０
９（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ），３．６９−
３．８６（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．６
７−４．７８（ｍ，２Ｈ），５．２０（ｂｓ，１Ｈ），
６．６８（ｄ，１Ｈ），７．１２−７．３４（ｍ，７
Ｈ）。
【００３１】実施例２
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢ
ｕ第１サイクル ：２０℃の酢酸エチル中の１３００ｇのＨ
−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌの撹拌溶液に、１０１４ｇ
の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２７５６ｇのＺ
−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１３７８ｇの１−（３′−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
塩酸塩及び１４９５ｍｌの４−メチルモルホリンを添加
した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、
３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５ｇのベ
ンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を
添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２Ｃ
Ｏ ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣ
ｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
ｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢ
ｕ第１サイクル ：２０℃の酢酸エチル中の１３００ｇのＨ
−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌの撹拌溶液に、１０１４ｇ
の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２７５６ｇのＺ
−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１３７８ｇの１−（３′−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
塩酸塩及び１４９５ｍｌの４−メチルモルホリンを添加
した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌した後、
３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５ｇのベ
ンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を
添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２Ｃ
Ｏ ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣ
ｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３２】保護されたジペプチドＺ−Ｏｒｎ（Ｂｏ
ｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着
チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理し
た。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％ＮａＣｌ
を添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチ
ルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１５
％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。個別の水相
を酢酸エチルで再抽出した。
ｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着
チャコールの存在下の接触水素化分解によって処理し
た。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％ＮａＣｌ
を添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチ
ルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１５
％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。個別の水相
を酢酸エチルで再抽出した。
【００３３】第２サイクル：２０℃のジペプチドＨ−Ｏ
ｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層を集め
て、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
１９９３ｇのＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの１−
（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホリン
を添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌し
た後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５
ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネー
ト塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎ
ａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％
ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出
した。
ｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層を集め
て、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
１９９３ｇのＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの１−
（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホリン
を添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌し
た後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１０５
ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネー
ト塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎ
ａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％
ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出
した。
【００３４】保護されたトリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｏｒ
ｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジ
ウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって
処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％Ｎ
ａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢
酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ ３
／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
ｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジ
ウム付着チャコールの存在下の接触水素化分解によって
処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１５％Ｎ
ａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢
酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ ３
／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３５】第３サイクル：２０℃のトリペプチドＨ−
Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有
機層に、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの
１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ
ルボジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホ
リンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹
拌した後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１
０５ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホ
ネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５
％Ｎａ２ＣＯ３、５％ＫＨＳＯ４及び５％Ｎａ２ＣＯ３
で抽出した。
Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有
機層に、１０１４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１３２０ｇの
１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ
ルボジイミド塩酸塩及び７５４ｍｌの４−メチルモルホ
リンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹
拌した後、３７７ｍｌの４−メチルモルホリン及び１１
０５ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホ
ネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５
％Ｎａ２ＣＯ３、５％ＫＨＳＯ４及び５％Ｎａ２ＣＯ３
で抽出した。
【００３６】保護されたトリペプチドＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有
機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化
分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ
３を添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エ
チルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３及び
１０％ＮａＣｌで抽出した。
Ｌｅｕ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕを含む有
機層をパラジウム付着チャコールの存在下の接触水素化
分解によって処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ
３を添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エ
チルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３及び
１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００３７】第４−第７サイクル：これらのサイクル
は、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨに代えて、Ｚ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（４４９７ｇの対応するジシク
ロヘキシルアンモニウム塩から遊離）、２２１８ｇのＺ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２５３８ｇのＺ−Ｔｒｐ−
ＯＨ及び２１７２ｇのＺ−Ｈｉｓ−ＯＨをそれぞれ使用
し、第３サイクルの手順に従って行った。しかしながら
第５サイクル以後は捕捉段階中の４−メチルモルホリン
及びベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネー
ト塩の量を倍加した。第５サイクルでは捕捉後の抽出を
３５℃で行った。第７サイクルでは、結合温度を３℃と
し、１０１４ｇの４−メチルヒドロキシベンゾトリアゾ
ールに代えて２５６１ｇの６−クロロ−１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールを使用し、また、１時間の結合後に
１３２ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド塩酸塩を補充した。第７サイク
ルでも、水素化分解後の抽出を３５℃で行った。第７サ
イクルの終了後、有機層を蒸発乾固すると、所望の保護
されたノナペプチドが出発物質Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．
ＨＣｌを基準として７３％の収率で得られた（即ち、各
化学処理段階の平均収率９８％）。
は、１９９３ｇのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨに代えて、Ｚ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（４４９７ｇの対応するジシク
ロヘキシルアンモニウム塩から遊離）、２２１８ｇのＺ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２５３８ｇのＺ−Ｔｒｐ−
ＯＨ及び２１７２ｇのＺ−Ｈｉｓ−ＯＨをそれぞれ使用
し、第３サイクルの手順に従って行った。しかしながら
第５サイクル以後は捕捉段階中の４−メチルモルホリン
及びベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネー
ト塩の量を倍加した。第５サイクルでは捕捉後の抽出を
３５℃で行った。第７サイクルでは、結合温度を３℃と
し、１０１４ｇの４−メチルヒドロキシベンゾトリアゾ
ールに代えて２５６１ｇの６−クロロ−１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールを使用し、また、１時間の結合後に
１３２ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド塩酸塩を補充した。第７サイク
ルでも、水素化分解後の抽出を３５℃で行った。第７サ
イクルの終了後、有機層を蒸発乾固すると、所望の保護
されたノナペプチドが出発物質Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ．
ＨＣｌを基準として７３％の収率で得られた（即ち、各
化学処理段階の平均収率９８％）。
【００３８】逆相ＨＰＬＣによる純度：９０．６％（２
９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％
までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，
５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳ
による同定：ｍ／ｚ５４３．６［Ｍ−Ｂｏｃ−２ｔＢｕ
＋２Ｈ］２＋，５７１．６［Ｍ−Ｂｏｃ−ｔＢｕ＋２
Ｈ］２＋，５９９．６［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋，６４
９．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１２９８．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％
までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，
５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳ
による同定：ｍ／ｚ５４３．６［Ｍ−Ｂｏｃ−２ｔＢｕ
＋２Ｈ］２＋，５７１．６［Ｍ−Ｂｏｃ−ｔＢｕ＋２
Ｈ］２＋，５９９．６［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋，６４
９．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１２９８．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３９】結論：不連続処理による中間体の単離を要
せずに保護ペプチドを製造できた。第一実施例で得られ
た生成物の純度及び同定は、本発明方法を使用すると余
剰の（活性化された）カルボキシル成分が処理の全段階
で完全に除去されており挿入ペプチド配列が全く形成さ
れなかったことを証明する。第二実施例の合成は更に、
本発明方法による合成が大規模生産に容易に応用できる
ことを証明する。双方の実施例で、生成物が比較的短時
間のうちに高収率及び高純度で得られた。
せずに保護ペプチドを製造できた。第一実施例で得られ
た生成物の純度及び同定は、本発明方法を使用すると余
剰の（活性化された）カルボキシル成分が処理の全段階
で完全に除去されており挿入ペプチド配列が全く形成さ
れなかったことを証明する。第二実施例の合成は更に、
本発明方法による合成が大規模生産に容易に応用できる
ことを証明する。双方の実施例で、生成物が比較的短時
間のうちに高収率及び高純度で得られた。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 パウルス・ベルナルドウス・ウイルヘルム
ス・テン・コルテナール
オランダ国、5340・ベー・ハー・オツス、
ペー・オー・ボツクス・20、デイオシン
ス・ベー・フエー
(72)発明者 コルネリス・アルベルト・グルーソン・ハ
ースノート
オランダ国、5340・ベー・ハー・オツス、
ペー・オー・ボツクス・20、デイオシン
ス・ベー・フエー
Ｆターム(参考） 4H045 AA20 AA50 BA13 BA15 EA60
FA20 FA31 FA44 FA58 FA61
GA01 HA02 HA03
Claims (27)
- 【請求項１】 有機溶媒中または有機溶媒の混合物中で
ペプチドを高速溶液合成する方法であって、該方法が、
以下の段階（ａ）−（ｄ）： （ａ）過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミ
ノ成分をアシル化する結合段階、 （ｂ）捕捉剤を使用して残留する活性化カルボキシル官
能基を除去し、前記捕捉剤が伸長中のペプチドの脱保護
にも使用される消去段階、 （ｃ）１回または複数回の水性抽出段階、及び、 （ｄ）場合によっては、１回または複数回の水性抽出段
階の前に挿入される独立の脱保護段階、の反復サイクル
から成り、 該方法が、残留する活性化カルボキシル官能基の捕捉剤
として遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンを
使用する少なくとも１つの段階（ｂ′）と呼ぶ段階
（ｂ）を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 段階（ａ）で使用する試薬のモル量を、
カルボキシル成分、結合用添加剤＞結合用試薬＞アミノ
成分の順に減少させることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 段階（ａ）でプレ活性化したカルボキシ
ル成分を使用することを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】 段階（ｂ′）で潜在アニオンを含むアミ
ンを捕捉剤として使用することを特徴とする請求項１か
ら３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 捕捉用アミン中の潜在アニオンが、伸長
中のペプチドに結合した永久保護基の存在下でも選択的
に除去できる一時保護基を有していることを特徴とする
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 捕捉用アミン中の潜在アニオンが、伸長
中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の置換活性
と同様の置換活性を示す一時保護基を有していることを
特徴とする請求項４または５に記載の方法。 - 【請求項７】 一時保護基が水素化分解的に除去可能な
基であり、永久保護基がアシドリシス的に除去可能な基
であることを特徴とする請求項５または６に記載の方
法。 - 【請求項８】 一時保護基がベンジル型の基であること
を特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 捕捉剤が遊離アニオンまたは潜在アニオ
ンを含む第一級アミンであることを特徴とする請求項４
から８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】 第一級アミンがＣ末端で保護されたア
ミノ酸誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１１】 アミノ酸がβ−アラニンまたはその誘
導体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 捕捉剤がベンジルβ−アラニネートま
たはその塩であることを特徴とする請求項１１に記載の
方法。 - 【請求項１３】 遊離アニオンまたは潜在アニオンを含
むアミンに代えて遊離アニオンまたは潜在アニオンを含
むチオールを捕捉剤として使用することを特徴とする請
求項１から８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 方法が１つまたは複数のサイクルから
成り、段階（ｂ）でポリアミンを捕捉剤として使用する
ことを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項１５】 方法が１つまたは複数のサイクルから
成り、段階（ｂ）で脱保護を生じさせないこと、及び、
次段階（ｃ）で順次に塩基性、酸性及び塩基性の抽出を
行うことを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項１６】 塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの
存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１５に記載
の方法。 - 【請求項１７】 脱保護並びに順次に塩基性及び中性の
抽出から成る後続段階（ｄ）を含むことを特徴とする請
求項１５または１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの
存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１７に記載
の方法。 - 【請求項１９】 １つまたは複数のサイクルを含み、段
階（ｂ）で消去と脱保護との双方を生じさせ、次段階
（ｃ）で順次に塩基性及び中性の抽出を行うことを特徴
とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２０】 塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの
存在下で抽出を行うことを特徴とする請求項１９に記載
の方法。 - 【請求項２１】 最終サイクルの段階（ａ）でカルボキ
シル成分の保護基が伸長中のペプチドの永久保護基の置
換活性と同様の置換活性を示し、段階（ｂ）の捕捉剤が
ポリアミンであることを特徴とする請求項１から２０の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２２】 有機溶媒または有機溶媒の混合物が、
酢酸エチル、または、酢酸エチルとジクロロメタンとの
混合物、酢酸エチルと１−メチル−２−ピロリジノンと
の混合物、酢酸エチルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
との混合物もしくは酢酸エチルとテトラヒドロフランと
の混合物であることを特徴とする請求項１から２１のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２３】 方法を０−５０℃の温度範囲内で行う
ことを特徴とする請求項１から２２のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項２４】 方法を周囲温度で行うことを特徴とす
る請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 請求項１から２４のいずれか一項に記
載の方法の応用であることを特徴とする分割及び混合の
方法を使用するペプチドライブラリーのコンビナトリア
ル合成方法。 - 【請求項２６】 請求項１から２５のいずれか一項に記
載の方法の応用であることを特徴とするペプチドの全自
動溶液合成方法。 - 【請求項２７】 請求項１から２６のいずれか一項に記
載の方法から成る方法に従って製造したペプチドまたは
ペプチド混合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01202753 | 2001-07-19 | ||
| EP01202753.8 | 2001-07-19 |
Publications (2)
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