JP2003038173A - Method for selecting antibody, hybridoma, monoclonal antibody and use thereof - Google Patents
Method for selecting antibody, hybridoma, monoclonal antibody and use thereofInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は抗原抗体反応妨害物
質(以下、妨害物質を称することがある。)の存在下に
おいてもその影響をなるべく受けずに抗原と反応する性
質を有する抗体、すなわち妨害物質耐性抗体、その抗体
の選別方法、その抗体を産生するハイブリドーマおよび
その抗体の利用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antibody which has a property of reacting with an antigen in the presence of an antigen-antibody reaction-interfering substance (hereinafter sometimes referred to as an interfering substance) without being influenced by the substance, that is, an interfering substance. The present invention relates to a substance resistant antibody, a method for selecting the antibody, a hybridoma producing the antibody, and use of the antibody.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、環境測定分野などで、高価な機器
が不要であり、また、操作に習熟が不要であることか
ら、免疫測定法(イムノアッセイ、以下、IAと略記す
ることがある。)が繁用されている。しかしながら、I
Aで使用される測定対象物質に特異的に作用する抗体は
高分子量の蛋白質であるため、目的とする蛋白質に影響
を及ぼす種々の物質によりその抗体の活性が影響を受
け、その結果、測定対象物質の測定値が不正確となる場
合が生じてくることがある。一方、ppb(パートパービ
リオン、10億分の1)やppt(パートパートリオン、
1兆分の1)のオーダーなど、ごく微量の測定対象物質
を測定するためには、高倍率の濃縮操作が必要となる場
合があり、そのような場合は固相抽出法を利用した濃縮
(以下固相濃縮と略記することがある)や溶媒抽出によ
る濃縮(以下、溶媒濃縮と略記することがある)などの
操作により濃縮したサンプルを使用して測定対象物質が
測定されている。しかし、検体サンプル中には測定対象
物質以外にも種々雑多な化合物が混在しているため、固
相濃縮や溶媒濃縮による濃縮操作を行うと、抗体に影響
を及ぼす化合物、すなわち抗原抗体反応妨害物質も濃縮
される結果、抗体の活性が影響を受け、測定対象物質の
測定値に異常を来すケースも発生する。2. Description of the Related Art In recent years, an immunoassay (immunoassay, hereinafter abbreviated as IA) has been required because no expensive equipment is required and no operation proficiency is required in the field of environmental measurement. Is used frequently. However, I
Since the antibody specifically acting on the substance to be measured used in A is a high molecular weight protein, the activity of the antibody is affected by various substances that affect the target protein, and as a result, the substance to be measured is Occasionally, the measured value of a substance may be inaccurate. On the other hand, ppb (part per billion, 1 part per billion) and ppt (part per billion,
In order to measure a very small amount of a substance to be measured, such as the order of one trillionth, a high-magnification concentration operation may be required. In such a case, concentration using solid phase extraction method ( Hereinafter, the measurement target substance is measured using a sample concentrated by an operation such as solid phase concentration) and concentration by solvent extraction (hereinafter sometimes referred to as solvent concentration). However, since various miscellaneous compounds are mixed in the sample sample in addition to the substance to be measured, when the concentration operation by solid phase concentration or solvent concentration is performed, the compound that affects the antibody, that is, the substance that interferes with the antigen-antibody reaction, is detected. As a result of being concentrated, the activity of the antibody may be affected and the measured value of the substance to be measured may be abnormal.
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題の1つ
は、抗原のIAによる測定の際に、サンプル中に混在す
る可能性が高い抗原抗体反応妨害物質による影響を受け
にくい抗体を選別することにより、IAでの異常値の発
生を抑制する方法を提供することにある。本発明の他の
課題は、本発明で選別された抗体の利用により、異常値
の発生が少ないIAキットを提供することにある。One of the problems to be solved by the present invention is to select an antibody which is less likely to be affected by an antigen-antibody reaction interfering substance which is likely to be present in the sample when the antigen is measured by IA. Thus, it is to provide a method for suppressing the occurrence of an abnormal value in IA. Another object of the present invention is to provide an IA kit that causes less abnormal values by using the antibody selected in the present invention.
【0004】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、夾雑する
反応妨害物質の影響をなるべく受けないでIAにより種
々の物質を検出、測定する方法を確立すべく鋭意研究を
重ねた。その結果、IAで使用する抗体を選別するに際
し、反応妨害物質、例えば環境汚染物質またはその分解
物、殺菌消毒剤、または溶媒等の存在下に抗原および標
識抗原を抗体と反応させ、その反応率から反応妨害物質
に対する耐性の高い目的抗体を選別することにより、測
定対象物質の存在量が少ないために高倍率に濃縮したサ
ンプルでも対象物質の測定が可能となることを見出し
た。かかる知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本
発明を完成させるに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted extensive studies to establish a method for detecting and measuring various substances by IA without being affected by contaminating reaction-interfering substances as much as possible. As a result, when selecting an antibody to be used in IA, the antigen and the labeled antigen are reacted with the antibody in the presence of a reaction interfering substance such as an environmental pollutant or its degradation product, a sterilizing / disinfecting agent, or a solvent, and the reaction rate From this, it was found that by selecting the target antibody having high resistance to the reaction interfering substance, the target substance can be measured even in a sample concentrated at a high magnification because the amount of the target substance to be measured is small. As a result of further research based on such findings, the present invention has been completed.
【0005】すなわち、本発明は、(1)抗原抗体反応
を用いて測定対象物質に対する抗体を選別するに際し、
抗原抗体反応妨害物質の存在下に目的抗体を選別する抗
体の選別方法、(2)測定対象物質が環境汚染物質であ
る(1)記載の抗体の選別方法、(3)測定対象物質が
ホルモンである(1)記載の抗体の選別方法、(4)抗
体がモノクローナル抗体である(1)記載の抗体の選別
方法、(5)抗原抗体反応妨害物質が、環境汚染物質ま
たはその分解物、殺菌消毒剤または溶媒である(1)記
載の抗体の選別方法、(6)環境汚染物質が界面活性
剤、環境水またはその濃縮物、またはフミン物質である
(5)記載の抗体の選別方法、(7)界面活性剤が陰イ
オン界面活性剤、陽イオン界面活性剤または非イオン界
面活性剤である(6)記載の抗体の選別方法、(8)環
境水が、河川水、湖沼水、海水、上水処理工程水または
下水処理工程水である(6)記載の抗体の選別方法、
(9)殺菌消毒剤が塩素剤である(5)記載の抗体の選
別方法、(10)溶媒が、アルコール類、ニトリル類、
ケトン類またはエステル類である(5)記載の抗体の選
別方法、(11)測定対象物質又は測定対象物質のハプ
テンと蛋白質との複合体を抗原として免疫した動物から
得られるポリクローナル抗体、または測定対象物質又は
測定対象物質のハプテンと蛋白質との複合体を抗原とし
て免疫した動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫
細胞とを融合して得られる測定対象物質又は測定対象物
質のハプテンとその蛋白質との複合体に対するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られ
たモノクローナル抗体を、抗原抗体反応妨害物質の共存
下に抗原酵素複合体(標識抗原)、測定対象物又は測定
対象物質のハプテンとその蛋白質との複合体(抗原)を
反応させ、その反応率から抗原抗体反応妨害物質耐性抗
体を選別する(1)記載の抗体の選別方法、(12)
(11)記載の抗体の選別方法により選別された妨害物
質耐性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
(13)ハイブリドーマが、マウスハイブリドーマEE
2−227(FERMBP−7567)、マウスハイブ
リドーマE1−420(FERM BP−7568)又
はマウスハイブリドーマE2−73(FERM BP−
7569)である(12)記載のハイブリドーマ、(1
4)(11)記載の抗体の選別方法で選別された抗原抗
体反応妨害物質耐性抗体、(15)(12)記載のハイ
ブリドーマによって産生された抗原抗体反応妨害物質耐
性モノクローナル抗体、(16)(14)又は(15)
記載の抗原抗体反応妨害物質耐性抗体を必須の構成成分
として含んでなる測定対象物質の免疫学的分析用キッ
ト、および(17)(14)又は(15)記載の抗原抗
体反応妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んで
なる測定対象物質の免疫学的濃縮用キット、を提供す
る。That is, the present invention provides (1) when selecting an antibody against a substance to be measured using an antigen-antibody reaction,
A method for selecting an antibody for selecting a target antibody in the presence of an antigen-antibody reaction-interfering substance, (2) a method for selecting an antibody according to (1), wherein the measurement target substance is an environmental pollutant, and (3) a hormone for the measurement target substance. There is a method of selecting an antibody according to (1), (4) a method of selecting an antibody according to (1) in which the antibody is a monoclonal antibody, and (5) an antigen-antibody reaction-interfering substance is an environmental pollutant or a decomposed product thereof, and sterilization. The method for selecting an antibody according to (1), which is an agent or a solvent, (6) the method for selecting an antibody according to (5), wherein the environmental pollutant is a surfactant, environmental water or a concentrate thereof, or a humic substance. ) The method for selecting an antibody according to (6), wherein the surfactant is an anionic surfactant, a cationic surfactant or a nonionic surfactant, (8) environmental water is river water, lake water, sea water, or Water treatment process water or sewage treatment process water (6) selection method according antibodies,
(9) The method of selecting an antibody according to (5), wherein the germicidal disinfectant is a chlorine agent, (10) the solvent is an alcohol, a nitrile,
(5) The method for selecting an antibody which is a ketone or an ester, (11) a polyclonal antibody obtained from an animal immunized with a substance to be measured or a complex of a substance to be measured and a hapten and a protein as an antigen, or a substance to be measured A substance to be measured or a hapten of the substance to be measured and a protein thereof obtained by fusing spleen cells or lymph node cells of an animal immunized with a complex of a hapten of the substance or the substance to be measured and a protein as an antigen Monoclonal antibody obtained by culturing a hybridoma producing a monoclonal antibody against the complex of, in the presence of an antigen-antibody reaction-interfering substance, an antigen-enzyme complex (labeled antigen), a measurement target or a hapten of the measurement target and its A complex (antigen) with a protein is reacted, and an antigen-antibody reaction interfering substance resistant antibody is selected based on the reaction rate (1 Screening method of the antibodies described, (12)
A hybridoma producing an interfering substance-resistant monoclonal antibody selected by the method for selecting an antibody according to (11),
(13) The hybridoma is a mouse hybridoma EE
2-227 (FERMBP-7567), mouse hybridoma E1-420 (FERM BP-7568) or mouse hybridoma E2-73 (FERM BP-).
7569) and the hybridoma according to (12),
4) Antigen-antibody reaction-interfering substance resistant antibody selected by the antibody selection method according to (11), (15) Antigen-antibody reaction-interfering substance resistant monoclonal antibody produced by the hybridoma according to (12), (16) (14) ) Or (15)
A kit for immunological analysis of a substance to be measured, which comprises an antibody resistant to an antigen-antibody reaction interfering substance as an essential component, and the antibody resistant to an antigen-antibody reaction interfering substance according to (17), (14) or (15) A kit for immunological concentration of a substance to be measured, which is included as an essential component.
【0006】[0006]
【発明の実施の形態】本発明は、水性媒体中に、抗原抗
体反応における妨害物質と測定対象物質に対する抗体と
を共存させIAにより反応妨害物質耐性抗体を選別する
抗体の選別方法に関する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention relates to a method for selecting an antibody which reacts with an interfering substance in an antigen-antibody reaction and an antibody against the substance to be measured is coexisted in an aqueous medium to select a reaction-interfering substance resistant antibody by IA.
【0007】本発明に属するより具体的な抗体の選別方
法の例は次のとおりである。すなわち、測定対象物質に
対する抗体を含有する液を、そのまま、または予め担体
に固定化した種特異的抗体と接触させ、しかるべき時間
と温度で反応させることにより抗体含有液中の抗体を担
体に固定化する。固定化されなかった抗体含有液中の抗
体を洗浄液で洗浄除去後、抗原酵素複合体(標識抗
原)、測定対象物質(抗原)および反応妨害物質を固定
化抗体と接触させ反応させる。未反応の物質を洗浄除去
したのち、酵素基質を添加し発色させる。発色後または
発色停止後、吸光度や蛍光度を測定し、標準曲線から妨
害物質共存時と非共存時の測定濃度を比較し、妨害物質
耐性の度合いを計算する。計算の結果、反応妨害物質耐
性度の高い抗体を選別する。その抗体がモノクローナル
抗体である場合は、その抗体を産生するハイブリドーマ
を特定する。そのハイブリドーマを培養し、培養上清か
ら反応妨害物質耐性度の高い抗体を得る。これらの抗体
を利用して元の測定対象物質をIAにより分析する。An example of a more specific antibody selection method belonging to the present invention is as follows. That is, a solution containing an antibody against a substance to be measured is immobilized as it is or in contact with a species-specific antibody previously immobilized on a carrier, and reacted at an appropriate time and temperature to immobilize the antibody in the antibody-containing solution on the carrier. Turn into. After the antibody in the antibody-containing liquid that has not been immobilized is removed by washing with a washing liquid, the antigen-enzyme complex (labeled antigen), the substance to be measured (antigen) and the reaction-interfering substance are brought into contact with the immobilized antibody to react. After washing away unreacted substances, an enzyme substrate is added to develop color. After the color development or after the color development is stopped, the absorbance or fluorescence is measured, and the measured concentrations in the presence and absence of the interfering substance are compared from the standard curve to calculate the degree of the interfering substance resistance. As a result of the calculation, an antibody having a high degree of resistance to a reaction interfering substance is selected. When the antibody is a monoclonal antibody, the hybridoma producing the antibody is specified. The hybridoma is cultured, and an antibody highly resistant to a reaction interfering substance is obtained from the culture supernatant. The original substance to be measured is analyzed by IA using these antibodies.
【0008】本発明の選別対象とする抗体には、検出、
測定に使用されるいかなる抗体も含まれる。抗体として
は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙
げられる。The antibodies to be selected according to the present invention include detection,
Any antibody used for measurement is included. Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies.
【0009】本発明のIAにおける測定対象物質として
は、その抗体を使用して検出、測定される全ての物質が
含まれ、例えば、環境汚染物質の測定などにおける全て
の測定対象物質が挙げられる。測定対象物質の具体例と
しては、各種ホルモン類、植物ホルモン類、環境汚染物
質類、合成界面活性剤類、農薬類、カビ毒類、トキシン
類、薬剤類、アレルゲン類、微生物類などが挙げられ
る。The substances to be measured in the IA of the present invention include all substances to be detected and measured by using the antibody, for example, all the substances to be measured in measuring environmental pollutants. Specific examples of the substance to be measured include various hormones, plant hormones, environmental pollutants, synthetic surfactants, pesticides, mold poisons, toxins, drugs, allergens, microorganisms, etc. .
【0010】各種ホルモン類の中で動物ホルモンとして
は、エストロゲン、エストラジオール(E2)、エスト
ロン(E1)、エストリオール(E3)などの女性ホル
モン類、アンドロゲン、テストステロン、デヒドロアン
ドロステロン、アンドロステンジオンなどの男性ホルモ
ン類、チロキシン(T3)、トリヨードチロニン(T
4)などの甲状腺ホルモン類、エチニルエストラジオー
ル、ジエチルスチルベストロール、ラロキシフェン、タ
モキシフェン、モキセストロール、アリルエストレノー
ル、メストラノール、リネストレノール、酢酸クロルマ
ジノン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロ
ン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、レボノルゲス
トレル、プレグナンジオール、クロミフェンなどの合成
ホルモン類、プロゲストロン、ゼラノール、トレンボロ
ン、クレンブテロール(βアゴニスト)などのホルモン
類が挙げられ、また、これらの代謝物である抱合体(例
えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体など)およびそ
れらの分解物もこれらに包含される。Among various hormones, as animal hormones, female hormones such as estrogen, estradiol (E2), estrone (E1) and estriol (E3), androgens, testosterone, dehydroandrosterone, androstenedione, etc. Androgens, thyroxine (T3), triiodothyronine (T
4) and other thyroid hormones, ethinylestradiol, diethylstilbestrol, raloxifene, tamoxifen, moxestrol, allylestrenol, mestranol, linenestrenol, chlormadinone acetate, dydrogesterone, medroxyprogesterone, norethisterone, norgestrel, levonorgestrel, Examples include synthetic hormones such as pregnanediol and clomiphene, and hormones such as progesterone, zeranol, trenbolone, and clenbuterol (β agonist). In addition, conjugates (eg, glucuronide conjugates, sulfate conjugates) that are metabolites thereof are included. (Including coalescing) and their decomposition products are also included in these.
【0011】植物ホルモン類としては、イソリクイリチ
ゲニン、フロレチン、クメストロール、ヘスペレチン、
ナリンゲニン、アピゲニン、バイカレイン、クリシン、
ルテオリン、ガランギン、ケンフェロール、ケルセチ
ン、エクオール、ビオカニンA、ダイゼイン、ホルムオ
ノネチン、ゲニステイン、ベツリンなどが挙げられ、ま
た、これらの代謝物、分解物もこれに包含される。The plant hormones include isoliquiritigenin, phloretin, coumestrol, hesperetin,
Naringenin, apigenin, baicalein, chrysin,
Luteolin, galangin, kaempferol, quercetin, equol, biocanin A, daidzein, formonenetin, genistein, betulin and the like are included, and their metabolites and degradation products are also included.
【0012】測定対象物質としての環境汚染物質類とし
ては、フタル酸ベンジルブチル、フタル酸ジエチル、フ
タル酸ジ−n−ブチル、フタル酸ジイソブチル、フタル
酸ジ−n−プロピル、フタル酸ジ−n−ペンチル、フタ
ル酸ジ−n−ヘキシル、フタル酸ジシクロヘキシル、フ
タル酸ジ(2−エチルヘキシル)、フタル酸ジオクチ
ル、フタル酸モノ(2−エチルヘキシル)、フタル酸ジ
イソノニル、フタル酸ジイソデシル、フタル酸ジ−n−
オクチル、フタル酸ジトリデシルなどのフタル酸エステ
ル類、アジピン酸ジ(2−エチルヘキシル)などのアジ
ピン酸エステル類、4−エチルフェノール、3−t−ブ
チルフェノール、4−s−ブチルフェノール、4−t−
ブチルフェノーエル、4−プロピルフェノール、4−イ
ソペンチルフェノール、4−t−ペンチルフェノール、
オクチルフェノール、4−オクチルフェノール、4−t
−オクチルフェノール、4−(1,1,3,3,−テト
ラメチルブチルフェノール)、4−ノニルフェノール
(直鎖)、4−ノニルフェノール(枝分かれ)、ノニル
フェノール(混合異性体)などのアルキルフェノール
類、ビスフェノールA、テトラブロモビスフェノールA
などのジフェニルアルカン類、ポリ臭素化ビフェニルな
どのPBB類、ポリ臭素化ビフェニルエーテル類、スチ
レン、スチレン2量体、スチレン3量体、2−クロロフ
ェノール、2,4−ジクロロフェノール、2,4,6−
トリクロロフェノール、ペンタクロロフェノールなどの
クロロフェノール類、t−ブチル化ヒドロキシアニソー
ル(BHA)、n−ブチルベンゼン、ベンゾフェノン、
6−ブロモ−2−ナフトール、ジブロモ酢酸、2−ブロ
モプロパン、4−ニトロトルエン、オクタクロロスチレ
ンなどの内分泌攪乱化学物質などが挙げられ、また、こ
れらの代謝物、分解物もこれに包含される。Environmental pollutants to be measured include benzyl butyl phthalate, diethyl phthalate, di-n-butyl phthalate, diisobutyl phthalate, di-n-propyl phthalate, di-n-phthalate. Pentyl, di-n-hexyl phthalate, dicyclohexyl phthalate, di (2-ethylhexyl) phthalate, dioctyl phthalate, mono (2-ethylhexyl) phthalate, diisononyl phthalate, diisodecyl phthalate, di-n-phthalate
Phthalates such as octyl and ditridecyl phthalate, adipates such as di (2-ethylhexyl) adipate, 4-ethylphenol, 3-t-butylphenol, 4-s-butylphenol, 4-t-
Butylphenoel, 4-propylphenol, 4-isopentylphenol, 4-t-pentylphenol,
Octylphenol, 4-octylphenol, 4-t
-Alkylphenols such as octylphenol, 4- (1,1,3,3, -tetramethylbutylphenol), 4-nonylphenol (straight chain), 4-nonylphenol (branched), nonylphenol (mixed isomer), bisphenol A, tetra Bromobisphenol A
Such as diphenylalkanes, PBBs such as polybrominated biphenyls, polybrominated biphenyl ethers, styrene, styrene dimers, styrene trimers, 2-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4, 6-
Chlorophenols such as trichlorophenol and pentachlorophenol, t-butylated hydroxyanisole (BHA), n-butylbenzene, benzophenone,
Examples thereof include endocrine disrupting chemicals such as 6-bromo-2-naphthol, dibromoacetic acid, 2-bromopropane, 4-nitrotoluene, and octachlorostyrene, and their metabolites and degradation products are also included.
【0013】さらに、2,3,7,8−テトラクロロダ
イオキシン(2,3,7,8-TCDD)などのダイオキシン類(Poly
chlorinated dibenzodioxins(PCDDs))、2,3,7,
8−テトラクロロジベンゾフラン( 2,3,7,8-TCDF)など
のジベンゾフラン類(Polychlorinated dibenzofurans
(PCDFs))、アロクロール1016、アロクロール1221、ア
ロクロール1232、 アロクロール1242、アロクロール124
8、アロクロール1254、アロクロール1260、アロクロー
ル1262、アロクロール1268、ビフェノクス、ハロワック
ス1000、ハロワックッス1051、ハロワックス1099などの
PCB類(Polychlorinated Biphenyls(PCBs))、アセ
ナフテン、アセナフチレン、アンスラセン、ベンゾ[a]
アンスラセン、ベンゾ[a]ピレン、ベンゾ[b]フルオラン
セン、ベンゾ[g.h.i]ペリレン、ベンゾ[k]フルオランセ
ン、ビフェニル、クリセン、クレオソート、1,2−ジ
クロロベンゼン、2−エチルトルエン、4−エチルトル
エン、ヘキサクロロベンゼン、ジベンゾ[a,h]アンスラ
セン、フルオランセン、フルオレン、ナフタレン、1−
メチルナフタレン、2−メチルナフタレン、1−クロロ
ナフタレン、o-クレゾール、フェナンスレン、n-プロピ
ルベンゼン、ピレン、1,2,4−トリメチルベンゼ
ン、1,3,5−トリメチルベンゼン、ガソリン、ケロ
セン、ジェットA燃料(Jet A fuel)、JP-4、JP-5、Fu
el oil #1、Fueloil #2、 Fuel oil #4、Fuel oil #6、
Heating fuel、ジーゼル油、タービン油、などの多環芳
香族炭化水素類(Polynuclear Aromatic Hydrocarbons
(PAHs))、環状多環芳香族炭化水素類(C-PAH)、 全石
油炭化水素類(Total PetroleumHydrocarbons(TPH
s))、BTEX(benzene,toluene,ethyl benzene,and xylen
s)、ベンゼン、2−アミノ−4,6−ジニトロトルエ
ン、4−アミノー2,6−ジニトロトルエン、2,4−
ジニトロアニリン、1,3−ジニトロベンゼン、2,4
−ジニトロフェノール、2−ニトロトルエン、3−ニト
ロトルエン、2,4−ジニトロトルエン、2,6−ジニ
トロトルエン、ピクリン酸、メチルー2,4,6−トリ
ニトロフェニルニトラミン、1,3,5−トリニトロベ
ンゼン、トリニトロトルエン(TNT)、オクタヒドロ−
1,3,5,7−テトラニトロ−1,3,5,7−テト
ラゾシン、ニトログリセリン、ニトログアニジン、ペン
タエリスリトール4硝酸、RDX爆薬(RDX Explosive
s)、3塩化金、硝酸銀、水銀、トリハロメタン、トリ
クロロエチレン、テトラクロロエチレンなども含まれ
る。Furthermore, dioxins such as 2,3,7,8-tetrachlorodioxin (2,3,7,8-TCDD) (Poly
chlorinated dibenzodioxins (PCDDs)), 2, 3, 7,
Dibenzofurans (Polychlorinated dibenzofurans) such as 8-tetrachlorodibenzofuran (2,3,7,8-TCDF)
(PCDFs)), Aroclor 1016, Aroclor 1221, Aroclor 1232, Aroclor 1242, Aroclor 124
PCBs such as 8, Aroclor 1254, Aroclor 1260, Aroclor 1262, Aroclor 1268, Bifenox, Halowax 1000, Halowax 1051, Halowax 1099, etc. (Polychlorinated Biphenyls (PCBs)), acenaphthene, acenaphthylene, anthracene, benzo [a]
Anthracene, benzo [a] pyrene, benzo [b] fluorane, benzo [ghi] perylene, benzo [k] fluorane, biphenyl, chrysene, creosote, 1,2-dichlorobenzene, 2-ethyltoluene, 4-ethyltoluene, Hexachlorobenzene, dibenzo [a, h] anthracene, fluoranthene, fluorene, naphthalene, 1-
Methylnaphthalene, 2-methylnaphthalene, 1-chloronaphthalene, o-cresol, phenanthrene, n-propylbenzene, pyrene, 1,2,4-trimethylbenzene, 1,3,5-trimethylbenzene, gasoline, kerosene, jet A Fuel (Jet A fuel), JP-4, JP-5, Fu
el oil # 1, Fuel oil # 2, Fuel oil # 4, Fuel oil # 6,
Polynuclear Aromatic Hydrocarbons such as heating fuel, diesel oil, turbine oil, etc.
(PAHs)), cyclic polycyclic aromatic hydrocarbons (C-PAH), total petroleum hydrocarbons (TPHs)
s)), BTEX (benzene, toluene, ethyl benzene, and xylen
s), benzene, 2-amino-4,6-dinitrotoluene, 4-amino-2,6-dinitrotoluene, 2,4-
Dinitroaniline, 1,3-dinitrobenzene, 2,4
-Dinitrophenol, 2-nitrotoluene, 3-nitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, 2,6-dinitrotoluene, picric acid, methyl-2,4,6-trinitrophenylnitramine, 1,3,5-trinitrobenzene , Trinitrotoluene (TNT), octahydro-
1,3,5,7-Tetranitro-1,3,5,7-tetrazocine, nitroglycerin, nitroguanidine, pentaerythritol tetranitrate, RDX explosive (RDX Explosive
s) Also included are gold trichloride, silver nitrate, mercury, trihalomethane, trichlorethylene, tetrachloroethylene and the like.
【0014】合成界面活性剤類としては、例えば直鎖ア
ルキルベンゼンスルホン酸及びその塩などの陰イオン界
面活性剤、ノニルフェノルエトキシレート、オクチルフ
ェノールエトキシレートなどの非イオン界面活性剤など
が挙げられ、又、これらの代謝物、分解物もこれに包含
される。Examples of synthetic surfactants include anionic surfactants such as linear alkylbenzene sulfonic acid and salts thereof, nonionic surfactants such as nonylphenol ethoxylate and octylphenol ethoxylate, and the like. , These metabolites and degradation products are also included in this.
【0015】農薬類としては、カルプロパミド、チオカ
ルバマート系化合物、クロルフェナピル、プレチラクロ
ール、プロピザミド、クロルメコート、マラチオン、フ
ェニトロチオン、イミダクロプリド、カルバリル、イナ
ベンフィド、ブタミホス、プロベナゾール、イソプロチ
オラン、ベンタゾン、トルクロホスメチル、フェンスル
ホチオン、ベンダイオカルブ、イプロジオン、イソキサ
チオン、ピリミカーブ、オキサミル、ダミノジッド、ホ
キシム、イマザリル、ミクロブタニル、トリフルミゾー
ル、ダイアジノン、プロピコナゾール、ビテルタノー
ル、フェノキシ酢酸類、酸アミド系化合物の他、2,4-
D、2,4-DNT、2,4-D酪酸ブチル、アセトアニリド、アセ
トクロール、アラクロール、スルホン酸アラクロール、
アルディカルブ、アルディカルブスルホン、アルディカ
ルブスルフォキサイド、 アルドリン、アメトリン、ア
トラジン、アジンフォス、ベノミール、α−BHC、δ−B
HC、γ−BHC(リンデン)、ビオレスメトリン、キャプタ
ン、カルバリル、カルベンダジム、カルボフラン、クロ
ルダン、クロロタロニル、クロルピリホス、クロルピリ
ホスーメチル、クロロスルフロン、シアナジン、シクロ
ジエン、DDD、DDE、DDT、ディカンバ、ジクロルプロ
プ、ディルドリン、ディクアット、ドルスバン、エンド
スルファン、エンドリン、エチル化アトラジン、フェニ
トロチオン、ヘプタクロル、ヘキサジノン、ヒドロキシ
アトラジン、イマザキン、イマザピル、イソプロツロ
ン、メツルフロン、メタラキシル、メソミル、メソプレ
ン、メトラクロル、メトリブジン、モリネート、パラコ
ート、パラチオン、ピクロラム、ピリミホスメチル、プ
ロシミドン、プロメトン、プロメトリン、レルダン、シ
ルベックス、シルベックス2,4,5-TP、シマジン、チアベ
ンダゾール、トキサフェン、トリアスルフロン、トリア
ジン、トリクロロピリヂノール、トリクロピル、トリフ
ルラリン、尿素系除草剤などがも挙げられ、これらの代
謝物、分解物もこれに含まれる。Examples of pesticides include carpropamide, thiocarbamate compounds, chlorfenapyr, pretilachlor, propizzamide, chlormecote, malathion, fenitrothion, imidacloprid, carbaryl, inabenfide, butamiphos, probenazole, isoprothiolane, bentazone, tolclofos-methyl, fensulfothion, bendaiocalybone, benzulfiobuone. , Iprodione, isoxathion, pirimicarb, oxamyl, daminozide, phoxime, imazalil, microbutanyl, triflumizole, diazinon, propiconazole, bitertanol, phenoxyacetic acid compounds, acid amide compounds, 2,4-
D, 2,4-DNT, 2,4-D butyl butyrate, acetanilide, acetochlor, alachlor, sulfonate sulfonate,
Aldicarb, aldicarb sulfone, aldicarb sulfoxide, aldrin, ametrine, atrazine, azinphos, benomir, α-BHC, δ-B
HC, γ-BHC (lindane), biolesmethrin, captan, carbaryl, carbendazim, carbofuran, chlordane, chlorothalonil, chlorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, chlorosulfuron, cyanazine, cyclodiene, DDD, DDE, DDT, dicamba, dichlorprop, dieldrin, Diquat, Dorsban, Endosulfan, Endrin, Ethylated Atrazine, Fenitrothion, Heptachlor, Hexazinone, Hydroxyatrazine, Imazaquin, Imazapyr, Isoproturon, Metulfuron, Metalaxyl, Mesomil, Mesoprene, Metrachlor, Metribuzin, Molinate, Paraquat, Parathion, Pichloram, Pythram, Pythramine, Pythram Procymidone, Promethon, Promethrin, Lerdan, Sylvex, Sylvex 2,4,5-T P, simazine, thiabendazole, toxaphene, triasulfuron, triazine, trichloropyridinol, triclopyr, trifluralin, urea herbicides and the like are also included, and metabolites and decomposition products thereof are also included therein.
【0016】カビ毒類としては、アフラトキシン、T2
トキシン、オクラトキシン、ゼアラレノン、DON(デ
オキシニバレノール、ボミトキシン)、フモニシンなど
が挙げられ、また、これらの代謝物、分解物もこれに包
含される。トキシン類としては、麻痺性貝毒、黄色ブド
ウ球菌エンテロトキシン(A,B,C,D,E)などが
挙げられ、また、これらの代謝物、分解物もこれに包含
される。Mold venoms include aflatoxin, T2
Examples include toxin, ochratoxin, zearalenone, DON (deoxynivalenol, vomitoxin), fumonisin, and the like, and their metabolites and degradation products are also included therein. Examples of the toxins include paralytic shellfish poison, Staphylococcus aureus enterotoxin (A, B, C, D, E), and their metabolites and degradation products are also included therein.
【0017】薬剤類としては、ペニシリン、セファロス
ポリン、ペネム、モノバクタム、クラブラン酸などの骨
格を含有するβ−ラクタム系抗生物質、モネンシン、サ
リノマイシン、エンジュラサイジンなどのポリエーテル
系抗生物質、カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗
生物質、エンロフロキサンなどのニューキノロン系合成
抗菌剤、サルファメタジン、サルファジメトキシンなど
のサルファ剤、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン
などの抗生物質、ジゴキシン、テオフィリン、フェノバ
ルビタール、トレンボロンなどの薬剤が挙げられ、また
これらの代謝物、分解物もこれに包含される。Examples of the drugs include β-lactam antibiotics having a skeleton such as penicillin, cephalosporin, penem, monobactam and clavulanic acid, polyether antibiotics such as monensin, salinomycin, and enjuracidin, kanamycin. Such as aminoglycoside antibiotics, new quinolone synthetic antibacterial agents such as enrofloxane, sulfamethazine, sulfadimethoxine and other sulfa drugs, chloramphenicol, gentamicin and other antibiotics, digoxin, theophylline, phenobarbital, trenbolone and other drugs. Moreover, these metabolites and degradation products are also included in this.
【0018】アレルゲン類としては、ハウスダスト、ダ
ニ、ネコ上皮、イヌ上皮、スギ、ヒノキ、ハンノキ、ハ
ルガヤ、カモガヤ、オオアワガエリ、ブタクサ、ヨモ
ギ、アスペルギルス、カンジダ、アルテルナリア、卵
白、牛乳、小麦、米、大豆、タラ、マグロ、カニ、エ
ビ、ペニシリウム、クラドスポリウム、チェダーチー
ズ、牛肉、鶏肉、サケなどのアレルゲンが挙げられ、ま
た、これらの代謝物、分解物もこれに包含される。Examples of allergens are house dust, mites, feline epithelium, dog epithelium, cedar, cypress, alder tree, cypress, cypress, thornweed, ragweed, mugwort, aspergillus, candida, alternaria, egg white, milk, wheat, rice, Examples include allergens such as soybean, cod, tuna, crab, shrimp, penicillium, cladosporium, cheddar cheese, beef, chicken and salmon, and their metabolites and decomposition products are also included.
【0019】微生物類としては、サルモネラ、リステリ
ア、大腸菌、クリプトスポリジウム、ジアルジア、カン
ピロバクター、黄色ブドウ球菌、エルシニア、腸炎ビブ
リオ、真菌などの病原菌が挙げられ、その構成成分もこ
れに包含される。The microorganisms include pathogenic bacteria such as Salmonella, Listeria, Escherichia coli, Cryptosporidium, Giardia, Campylobacter, Staphylococcus aureus, Yersinia, Vibrio parahaemolyticus, and fungi, and the constituents thereof are also included therein.
【0020】一方、抗原抗体反応妨害物質としては抗体
や酵素などのたんぱく質に影響を与える物質、例えば環
境汚染物質類、その分解物、殺菌消毒剤類、溶媒類など
が挙げられる。環境汚染物質類やその分解物としては、
界面活性剤類、環境水およびその濃縮物、フミン物質類
等が挙げられる。On the other hand, examples of the antigen-antibody reaction interfering substance include substances that affect proteins such as antibodies and enzymes, for example, environmental pollutants, degradation products thereof, bactericidal disinfectants, solvents and the like. As environmental pollutants and their decomposition products,
Surfactants, environmental water and its concentrates, humic substances and the like can be mentioned.
【0021】界面活性剤類としては、油脂、脂肪酸など
のカルボン酸型、アルキルサルフェート、アルキルエー
テルサルフェートなどの硫酸エステル型および/または
アルキル(アリル)スルホネート、(アルキル)ナフタ
リン酸などのスルホン酸型やアルキルリン酸エステルな
どのリン酸エステル型などの陰イオン界面活性剤類、4
級アンモニウム型などの陽イオン界面活性剤類、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンア
ルキルアリルエーテル、その他のエーテルなどのエーテ
ル型、多価アルコール系エステル・エーテルやその他の
エステルエーテルなどのエステルエーテル型、多価アル
コール・エステルなどの非イオン界面活性剤類が挙げら
れる。フミン物質としては、フルボ酸、フミン酸、フミ
ンおよびまたはその塩などが挙げられる。Examples of the surfactants include carboxylic acid types such as fats and oils, fatty acids, sulfuric acid ester types such as alkyl sulfates and alkyl ether sulfates, and / or sulfonic acid types such as alkyl (allyl) sulfonates and (alkyl) naphthalic acids. Anionic surfactants such as phosphoric acid ester type such as alkyl phosphoric acid ester, 4
Cationic surfactants such as quaternary ammonium type, ether type such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl allyl ether and other ethers, ester ether type such as polyhydric alcohol ester / ether and other ester ethers , Nonionic surfactants such as polyhydric alcohols and esters. Examples of humic substances include fulvic acid, humic acid, humic acid and / or salts thereof.
【0022】環境水およびその濃縮物としては、河川
水、湖沼水、海水、上水処理工程水、下水処理工程水お
よびそれらの濃縮物が挙げられる。殺菌消毒剤類として
は塩素剤類である塩素ガスや次亜塩素酸とその塩が挙げ
られる。Examples of the environmental water and its concentrate include river water, lake water, sea water, tap water treatment process water, sewage treatment process water, and concentrates thereof. Examples of sterilizing agents include chlorine gas, which is a chlorine agent, and hypochlorous acid and its salts.
【0023】溶媒としては、アルコール類、ニトリル
類、ケトン類、エステル類などが挙げられ、アルコール
類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、
ブタノール、ニトリル類としては、アセトニトリル、ケ
トン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン
(MIBK)、エステル類としては、酢酸エチル、などが挙
げられる。Examples of the solvent include alcohols, nitriles, ketones and esters, and examples of the alcohols include methanol, ethanol, propanol,
Butanol and nitriles include acetonitrile, ketones include acetone and methyl isobutyl ketone (MIBK), and esters include ethyl acetate.
【0024】測定対象物質に対する抗体であるイムノグ
ロブリン(Ig)の製造や、該Igに対する抗体(即ち
抗Ig抗体)の製造は、自体公知の方法、例えば、エン
ザイムイムノアッセイ、第46頁〜71頁及び第85頁
〜110頁(P.TIJSSEN著、石川栄治監訳、東京化学同
人(1989))に記載された方法あるいはこれに準じ
る方法により行うことができる。Production of immunoglobulin (Ig), which is an antibody against the substance to be measured, and production of an antibody against the Ig (that is, anti-Ig antibody), are known per se, for example, enzyme immunoassay, pages 46 to 71, and The method described in pages 85 to 110 (P.TIJSSEN, translated by Eiji Ishikawa, Tokyo Kagaku Dojin (1989)) or a method analogous thereto.
【0025】これらの方法において、自体免疫原と成り
うる測定対象物質はそのまま、自体免疫原性を持たない
測定対象物質はそのハプテンを作製した後キャリヤー蛋
白質との複合体(免疫原)を形成させて動物に接種す
る。複合体を形成させて免疫する際のキャリヤー蛋白質
としては、例えば、牛血清アルブミン(以下、BSAと
略す)、卵白アルブミン(以下、OVAと略す)、スカ
シ貝ヘモシアニン(以下、KLHと略す)、牛チログロ
ブリン(以下、BTGと略す)などが挙げあられる。In these methods, the substance to be measured which can be an immunogen itself is left as it is, and the substance to be measured which has no immunogenicity is prepared by forming its hapten and then forming a complex (immunogen) with a carrier protein. Inoculate the animals. Carrier proteins used for immunization by forming a complex include, for example, bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), ovalbumin (hereinafter abbreviated as OVA), keyhole limpet hemocyanin (hereinafter abbreviated as KLH), bovine. Examples thereof include thyroglobulin (hereinafter abbreviated as BTG).
【0026】測定対象物質とキャリヤー蛋白質との複合
体の形成は、例えば、式(1)
A−R (1)
(式中、Rは、COOH、NH2又はSHを、Aは、R
基の離脱により、測定対象物質となる基を示す。)で表
される化合物(ハプテン)を、自体公知の方法によりキ
ャリヤー蛋白質に融合させることにより行うことができ
る。例えば、RがCOOHで、Aがポリオキシエチレン
アルキルフェニルエーテルとなる式(1)で表される化
合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルと無水コ
ハク酸を脱水縮合(ハーフエステル)することにより製
造できる〔キャンサー・バイオケミストリー・バイオフ
ィジックス(Cancer Biochem. Biophys.),7,175
(1984)〕。RがNH2で、Aがポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテルとなる式(1)で表される
化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸
基を塩化チオニルにより塩酸化した後〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(J. Am. Che
m. soc.),60,2540(1938)〕、アンモニア
で処理することにより製造できる〔オーガニック・ファ
ンクショナル・グループ・プレパレーションズ(Organi
c Functional Group Preparations)、第1巻、382
頁〕。The formation of the complex between the substance to be measured and the carrier protein can be carried out, for example, by the formula (1) AR (1) (wherein R is COOH, NH 2 or SH, and A is R).
Indicates the group that becomes the measurement target substance when the group is eliminated. The compound (hapten) represented by () can be fused with a carrier protein by a method known per se. For example, a compound represented by the formula (1) in which R is COOH and A is polyoxyethylene alkylphenyl ether can be produced by dehydration condensation (half ester) of polyoxyalkylphenyl ether and succinic anhydride [ Cancer Biochem. Biophys., 7,175
(1984)]. The compound represented by the formula (1) in which R is NH 2 and A is polyoxyethylene alkylphenyl ether is obtained by oxidizing the hydroxyl group of polyoxyalkylphenyl ether with thionyl chloride [Journal of American Chemical・ Society (J. Am. Che
m. soc.), 60, 2540 (1938)], and can be produced by treating with ammonia [Organic Functional Group Preparations (Organi
c Functional Group Preparations), Volume 1, 382
page〕.
【0027】RがSHで、Aがポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテルとなる式(1)で表される化合物
は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩
化チオニルにより塩酸化した後〔ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティー(J. Am. Chem. So
c.),60,2540(1938)〕、水酸化ナトリウ
ムと反応させることにより製造できる〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(J. Am. Che
m. Soc.),72,1843,(1950)〕。The compound represented by the formula (1) in which R is SH and A is polyoxyethylene alkyl phenyl ether is obtained by converting the hydroxyl group of polyoxyalkyl phenyl ether to hydrochloric acid with thionyl chloride [Journal of American・ Chemical Society (J. Am. Chem. So
c.), 60, 2540 (1938)], and can be produced by reacting with sodium hydroxide [Journal of American Chemical Society (J. Am. Che.
m. Soc.), 72, 1843, (1950)].
【0028】本発明における測定対象物質に対する抗体
は、自体公知の方法、すなわち測定対象物質または、上
記のような測定対象物質のハプテンとキャリアー蛋白質
との複合体(免疫原)で免疫した動物から得られるポリ
クローナル抗体又は該免疫した動物の脾細胞又はリンパ
節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに産生させること
により製造することができる。動物を免疫するには、測
定対象物質又は上記で得られたハプテンとキャリアー蛋
白質との複合体を動物に接種する。接種する動物として
は、例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、
モルモット、ニワトリなどが用いられるが、測定対象物
質に対するモノクローナル抗体が所望の場合には、マウ
スが特に好ましく用いられる。接種方法としては、通常
実施される方法でよく、例えば、マウスに対し1回に約
1〜100μg、好ましくは50〜100μgを等容量
(0.1ml)の生理食塩水及びフロイントの完全アジ
ュバンド又はRIBIアジュバンドシステムT Mで乳化
して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に2〜3週毎に
2〜6回接種する方法がとられる。ポリクローナル抗体
を得る場合には接種された動物の血清から、採取するこ
とにより行われる。モノクローナル抗体を得るには、さ
らに次の操作が行われる。これらの免疫動物、例えば、
マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫3〜5日
後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。免疫する方法
としては、既知のインビトロ免疫法( in vitro immuni
zation)やマウスフットパッド法( Mouse Foot Pad )
などを使用すれば、より短期間で抗体価が上昇する。The antibody to the substance to be measured in the present invention is obtained by a method known per se, that is, from the substance to be measured or from an animal immunized with the complex (immunogen) of the hapten of the substance to be measured and a carrier protein. It can be produced by producing a hybridoma producing a monoclonal antibody obtained by fusing the polyclonal antibody obtained or the spleen cells or lymph node cells of the immunized animal with myeloma cells. To immunize an animal, the substance to be measured or the complex of the hapten obtained above and a carrier protein is inoculated into the animal. The animals to be inoculated include, for example, goat, sheep, rabbit, rat, mouse,
Although guinea pigs, chickens, etc. are used, when a monoclonal antibody against the substance to be measured is desired, mice are particularly preferably used. The method of inoculation may be a method that is usually carried out. For example, about 1 to 100 μg, preferably 50 to 100 μg per mouse is used in equal volumes (0.1 ml) of saline and Freund's complete adjuvant or emulsified in RIBI adjuvant system T M, back, a method of inoculating 2-6 times every 2-3 weeks subcutaneously or intraperitoneally abdomen taken. When a polyclonal antibody is obtained, it is collected from the serum of the inoculated animal. The following operation is further performed to obtain a monoclonal antibody. These immunized animals, for example,
An individual with a high antibody titer is selected from mice, and 3 to 5 days after the final immunization, the spleen or lymph node is collected, and the antibody-producing cells contained therein are fused with myeloma cells. As a method for immunization, a known in vitro immunization method (in vitro immuni
zation) and Mouse Foot Pad method
The antibody titer increases in a shorter period of time by using such as.
【0029】融合操作は既知の方法に従って実施でき、
融合促進剤としては、ポリエチレングリコール(以下、
PEGと略す)や、センダイウイルスなどが挙げられる
が、好ましくは、PEGが用いられる。既知の電気パル
スを用いた方法( Pulse Electric Fusion )によって
も実施できる。骨髄腫細胞としてはNS−1、P3U
1、Sp2/Oなどが用いられ、特にP3U1が好まし
い。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は約
1:1〜10:1で、これに分子量約1,000〜6,
000のPEGが約10〜80%の濃度で添加され、約
20〜37℃、好ましくは30〜37℃で約3〜10分
インキュベートするのがよい。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の産生、精製も自体公知の方法で行う
ことが出来る。得られたモノクローナル抗体は、測定対
象物質や、式(1)で表される化合物に対する抗体とな
る。The fusion operation can be carried out according to known methods,
As the fusion accelerator, polyethylene glycol (hereinafter,
(Abbreviated as PEG), Sendai virus and the like, but PEG is preferably used. It can also be carried out by a method using a known electric pulse (Pulse Electric Fusion). NS-1, P3U as myeloma cells
1, Sp2 / O, etc. are used, and P3U1 is particularly preferable. For example, a preferred ratio of splenocytes to myeloma cells is about 1: 1 to 10: 1 with a molecular weight of about 1,000-6,6.
000 PEG is added at a concentration of about 10 to 80%, and it is good to incubate at about 20 to 37 ° C, preferably 30 to 37 ° C for about 3 to 10 minutes. The production and purification of the monoclonal antibody by the hybridoma can also be performed by a method known per se. The obtained monoclonal antibody becomes an antibody against the substance to be measured and the compound represented by the formula (1).
【0030】抗体の産生、精製方法の具体例としては、
例えば、前記「エンザイム・イムノアッセイ」第46〜
71頁、第85〜110頁に記載され、塩析(Na2S
O4、(NH4)2SO4)、イオン交換体(DEA
E、QAE、CM/セルロース、セファデックス、セフ
ァロースなど)、ゲル濾過(セファデックス G-200、Bio
-gel P-300など)、電気泳動(アガロースゲルによるゾ
ーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など)、
超遠心(ショ糖密度勾配遠心法)、アフィニティークロ
マトグラフィー(固定化プロテインA(Protein A Seph
arose、Protein ASuperose など) 固定化プロテインG
(Protein-G Sepharoseなど))などの方法が挙げられ
る。Specific examples of antibody production and purification methods include:
For example, the aforementioned "enzyme immunoassay" No. 46-
71, pp. 85-110, salting out (Na 2 S
O 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , and ion exchanger (DEA
E, QAE, CM / cellulose, Sephadex, Sepharose, etc.), gel filtration (Sephadex G-200, Bio
-gel P-300, etc.), electrophoresis (zone electrophoresis with agarose gel, isoelectric focusing, isokinetic electrophoresis, etc.),
Ultracentrifugation (sucrose density gradient centrifugation), affinity chromatography (immobilized protein A (Protein A Seph
arose, Protein A Superose, etc.) Immobilized protein G
(Protein-G Sepharose, etc.)) and the like.
【0031】本発明で用いる抗体固定化用担体(以下、
担体と称することもある。)としては、免疫測定法にお
いて通常用いられるものを用いることができる。その例
としては、例えば、マイクロプレート(例、96ウェル
マイクロプレート、24ウェルマイクロプレート、19
2ウェルマイクロプレート、384ウェルマイクロプレ
ートなど)、試験管(例、ガラス試験管、プラスチック
試験管)、ガラス粒子、ポリスチレン粒子、修飾ポリス
チレン粒子、ポリビニル粒子、ラテックス(例、ポリス
チレン・ラテックス)、ニトロセルロース膜、臭化シア
ン活性化濾紙、DBM活性化濾紙、粒状固相(例、セフ
ァロース、セファデックス、アガロース、セルロース、
セファクリルなど)、鉄含有ポリカーボネート膜、マグ
ネット含有ビーズなどが挙げられる。担体に抗体を担持
させるには、自体公知の方法〔例、上記「エンザイムイ
ムノアッセイ」第268〜296頁、「アフィニティー
クロマトグラフィーハンドブック」(アマシャム ファ
ルマシア バイオテク株式会社(1998年12月20
日発行)〕などで担持できる。The antibody-immobilizing carrier used in the present invention (hereinafter,
It may also be called a carrier. As the), those usually used in the immunoassay can be used. Examples thereof include microplates (eg, 96-well microplate, 24-well microplate, 19-well microplate,
2-well microplate, 384-well microplate, etc.), test tube (eg, glass test tube, plastic test tube), glass particle, polystyrene particle, modified polystyrene particle, polyvinyl particle, latex (eg polystyrene latex), nitrocellulose Membrane, cyanogen bromide activated filter paper, DBM activated filter paper, granular solid phase (eg, sepharose, sephadex, agarose, cellulose,
Sephacryl), iron-containing polycarbonate film, magnet-containing beads and the like. For carrying an antibody on a carrier, a method known per se [eg, "Enzyme Immunoassay" pp. 268 to 296, "Affinity Chromatography Handbook" (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. (December 20, 1998))
Issued daily)] etc.
【0032】抗原抗体反応妨害物質耐性抗体を取得する
ときの抗体含有液としては、免疫中の動物の血清、HAT
スクリーニングにより融合細胞(ハイブリドーマ)のコ
ロニーが確認されたwellの培養上清、クローニング途中
のハイブリドーマの培養上清、クローニングにより純化
されたハイブリドーマの培養上清、マウス腹水で増殖し
た純化ハイブリドーマの腹水液、またはマウス腹水液か
ら精製された抗体液など、抗体取得行程のどの段階の抗
体含有液を使用しても良い。なお、抗体含有液の抗体濃
度により、抗体含有液を希釈して添加する場合もある。
この希釈倍数は、抗体濃度とアッセイ条件により異なる
が、通常数倍から数十万倍迄希釈して測定する必要が出
てくる場合もある。抗原酵素複合体(標識抗原)として
は、取得中の抗体と反応するものであれば、どのような
構造のものでも良い。また、酵素およびその基質として
は、通常の酵素免疫測定法で使用される酵素およびその
基質であればどの様なものでも良く、アルカリホスファ
ターゼ、アルコール脱水素酵素、β−D−ガラクトシダ
ーゼ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、西洋わさび
ペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、インベルターゼ、アセテートキナーゼ
やその基質などが好ましいが、測定感度の点から西洋わ
さびペルオキシダーゼとその基質が好ましい。The antibody-containing liquid for obtaining the antibody resistant to the antigen-antibody reaction interfering substance includes serum of an immunized animal, HAT
Culture supernatant of wells in which colonies of fused cells (hybridomas) were confirmed by screening, culture supernatant of hybridoma during cloning, culture supernatant of hybridoma purified by cloning, ascites fluid of purified hybridoma grown in mouse ascites, Alternatively, an antibody-containing solution at any stage of the antibody acquisition process such as an antibody solution purified from mouse ascites fluid may be used. The antibody-containing solution may be diluted and added depending on the antibody concentration of the antibody-containing solution.
This dilution factor varies depending on the antibody concentration and assay conditions, but in some cases it may be necessary to dilute and measure from several times to several hundreds of thousands times. The antigen-enzyme complex (labeled antigen) may have any structure as long as it reacts with the antibody being obtained. Further, the enzyme and its substrate may be any enzyme and its substrate used in a usual enzyme immunoassay method, such as alkaline phosphatase, alcohol dehydrogenase, β-D-galactosidase, glucose-6. -Phosphate dehydrogenase, horseradish peroxidase, xanthine oxidase, glucose oxidase, invertase, acetate kinase and its substrate are preferable, but horseradish peroxidase and its substrate are preferable from the viewpoint of measurement sensitivity.
【0033】抗原酵素複合体(標識抗原)の添加濃度
は、測定対象物質(抗原)および妨害物質を添加しない
ブランク時に吸光度が1〜2となるようにリン酸緩衝
液、生理的食塩水等で希釈しておくのがよい。添加する
測定対象物質は、妨害物質無添加時の阻害率が約50%と
なるよう緩衝液や10%メタノール等で希釈し、妨害物質
の添加濃度は、最終濃度で1〜1000 mg/Lとなるよう緩衝
液や10%メタノール等で段階希釈する。環境水およびそ
の濃縮物などの妨害物質は、原液またはその濃縮液を使
用する。環境水の濃縮液の作製は、溶媒濃縮、固相濃縮
や蒸発乾燥による濃縮など、既知のどのような方法でも
良く、その濃縮倍率は、用いる環境水の種類により異な
ってくるが、固化してしまい、緩衝液や溶媒等で溶解液
を作製することができなくなるような状態にならなけれ
ば、どのような濃縮倍率でも良い。なお、妨害物質とし
て溶媒を使用するときは100%未満の範囲で添加する。
抗原酵素複合体(標識抗原)、測定対象物質(抗原)、
妨害物質は混合後、固定化測定対象物質抗体または固定
化種特異的抗体と結合した測定対象物質抗体と反応させ
るが、反応温度および反応時間は、測定対象物質抗体や
種特異的抗体が変性しない温度および時間であればどの
様な条件でも良いが、4℃では一晩(16〜24時間)、室
温では0.1〜4時間が好ましい。未反応物質の洗浄液は、
上記抗体が変性しない洗浄液であればどのような液でも
良いが、pHの変動を押さえるために、リン酸緩衝化生理
食塩水(PBS)や、ツイーン−20を含むT−PBS等が好ま
しい。The addition concentration of the antigen-enzyme complex (labeled antigen) is adjusted with a phosphate buffer, physiological saline or the like so that the absorbance becomes 1 to 2 when blank without addition of the substance to be measured (antigen) and the interfering substance. It is better to dilute. The target substance to be added should be diluted with a buffer solution or 10% methanol so that the inhibition rate when no interfering substance is added is approximately 50% .The final concentration of interfering substance is 1 to 1000 mg / L. Dilute serially with buffer solution or 10% methanol, etc. For interfering substances such as environmental water and its concentrate, use the stock solution or its concentrate. The concentrated solution of environmental water may be prepared by any known method such as solvent concentration, solid phase concentration or concentration by evaporative drying. The concentration rate varies depending on the type of environmental water used, but it does not solidify. Any concentration ratio may be used as long as the solution cannot be prepared with a buffer solution or a solvent. When using a solvent as an interfering substance, add it in the range of less than 100%.
Antigen-enzyme complex (labeled antigen), substance to be measured (antigen),
After the interfering substance is mixed, it is reacted with the immobilized target substance antibody or the target substance antibody bound to the immobilized species-specific antibody, but the reaction temperature and reaction time do not denature the target substance antibody or species-specific antibody. Although any conditions may be used as long as the temperature and the time, it is preferable that the temperature is 4 ° C. overnight (16 to 24 hours), and the room temperature is 0.1 to 4 hours. The washing liquid for unreacted substances is
Although any solution may be used as long as it is a washing solution that does not denature the antibody, phosphate buffered saline (PBS), T-PBS containing Tween-20 and the like are preferable in order to suppress pH fluctuation.
【0034】発色用の酵素基質は、使用した酵素の基質
であればどのようなものでも良い。例えば、アルカリホ
スファターゼの場合は、比色法では、p−ニトロフェニ
ルリン酸、フェニルリン酸/4−アミノアンチピリン、
蛍光法では、4−メチルウンベリフェリルリン酸、o−
メチルフルオレッセイン酸、フラボン−3−ジリン酸、
化学発光法では、オキシデレクターゼ/エタノール/AD
H/NADH、イソルミノール/マイクロペルオキシダ−
ゼ、アスコルビン酸−2−リン酸/ルシゲニン/OH-、B
CIP(5−ブロム−4−クロロ−3−インドキシリル)
リン酸)/イソルミノール/マイクロペルオキシダ−
ゼ、AMPPD(3−(2′−スピロアダマンタン)−4−
メトキシ−(3′−ホスホリルオキシ)フェニル1,2
−ジオキセタン)、CSPD(3−(2−クロリナルドアダ
マンタン)−4−メトキシ−(3′−ホスホリルオキ
シ)フェニル1,2−ジオキセタン)、生物発光法で
は、D−ルシフェリンリン酸/ルシフェラーゼなどが、
ペルオキシダーゼの場合は、比色法では、5−アミノサ
リチル酸/過酸化水素、ABTS(2,2′−アジノジ(3
−エチルベンズチアゾリン)−6−スルホン酸)/過酸
化水素、テトラメチルベンチジン/過酸化水素、o−フ
ェニレンジアミン/過酸化水素、蛍光法では、ホモバニ
リン酸/過酸化水素、チラミン/過酸化水素、p−ヒド
ロキシフェニルプロピオン酸/過酸化水素、化学発光法
では、ルミノール/過酸化水素、ルミノール/過酸化水
素/p−ヨードフェノールなどが、グルコースオキシダ
ーゼの場合は、比色法では、グルコース/西洋わさびペ
ルオキシダ−ゼ/ABTS(2,2′−アジノジ(3−エチ
ルベンズチアゾリン)−6−スルホン酸)、蛍光法で
は、グルコース/西洋わさびペルオキシダ−ゼ/p−ヒ
ドロキシフェニルプロピオン酸、化学発光法では、グル
コース/ルミノール/Fe(CN)6 3+、グルコース/TCPO
(ビス(2,4,6−トリクロロフェニル)オキザレー
ト)/ANS(8−アニリノナフタレンスルホン酸、グル
コース/イソルミノール/マイクロペルオキシダ−ゼ、
グルコース/ルシゲニン/OH-/塩化銅などが、β−D−
ガラクトシダーゼの場合は、比色法では、o−ニトロフ
ェニルβ−D−ガラクトピラノシド、蛍光法では、4−
メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトシド、化学発
光法では、ラクトース/グルコースオキシダーゼ/イソ
ルミノール/マイクロペルオキシダ−ゼ、ラクトース/
グルコースオキシダーゼ/TCPO(ビス(2,4,6−ト
リクロロフェニル)オキザレート)/ANS(8−アニリ
ノナフタレンスルホン酸)、AMPGD(3−(4−メトキ
シスピロ(1,2−デオキシジオキシタン−3,2′−
トリデカン−4−フェニル)、o−NPGal(o−ニトロ−
β−D−がラクトシド)/GalDH(ガラクト−スデハイド
ロゲナーゼ)/NAD+/NADH、生物発光法では、o−NPGal
(o−ニトロ−β−D−がラクトシド)/GalDH(ガラク
ト−スデハイドロゲナーゼ)/NAD+/NADHなどが、グル
コース−6−リン酸脱水素酵素の場合は、吸光度法で
は、グルコース−6−リン酸/NADP+、化学発光法で
は、グルコース−6−リン酸/NAD(P)+/NAD(P)Hなど、
数多くの基質が知られており、使用する酵素の基質であ
ればどのような基質でも使用可能である。The enzyme substrate for color development may be any substrate as long as it is a substrate for the enzyme used. For example, in the case of alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate / 4-aminoantipyrine,
In the fluorescence method, 4-methylumbelliferyl phosphate, o-
Methyl fluorescein acid, flavone-3-diphosphoric acid,
For chemiluminescence, oxydelectase / ethanol / AD
H / NADH, Isoluminol / Microperoxida
Ze, ascorbic acid-2-phosphoric acid / lucigenin / OH -, B
CIP (5-bromo-4-chloro-3-indoxysilyl)
Phosphoric acid) / isoluminol / microperoxida
Ze, AMPPD (3- (2'-spiroadamantane) -4-
Methoxy- (3'-phosphoryloxy) phenyl 1,2
-Dioxetane), CSPD (3- (2-chlorinal adamantane) -4-methoxy- (3'-phosphoryloxy) phenyl 1,2-dioxetane), and bioluminescence methods such as D-luciferin phosphate / luciferase,
In the case of peroxidase, 5-aminosalicylic acid / hydrogen peroxide, ABTS (2,2'-azinodi (3
-Ethylbenzthiazoline) -6-sulfonic acid) / hydrogen peroxide, tetramethylbenzidine / hydrogen peroxide, o-phenylenediamine / hydrogen peroxide, homovanillic acid / hydrogen peroxide, tyramine / hydrogen peroxide in the fluorescence method , P-hydroxyphenylpropionic acid / hydrogen peroxide, luminol / hydrogen peroxide, luminol / hydrogen peroxide / p-iodophenol in the chemiluminescence method, and glucose / western in the case of glucose oxidase in the colorimetric method. Wasabi peroxidase / ABTS (2,2'-azinodi (3-ethylbenzthiazoline) -6-sulphonic acid), fluorescent method: glucose / horseradish peroxidase / p-hydroxyphenylpropionic acid, chemiluminescent method , Glucose / luminol / Fe (CN) 6 3+ , glucose / TCPO
(Bis (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate) / ANS (8-anilinonaphthalene sulfonic acid, glucose / isoluminol / microperoxidase,
Glucose / lucigenin / OH - / copper chloride, etc., β-D-
In the case of galactosidase, o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside was used in the colorimetric method, and 4-o in the fluorescence method.
Methylumbelliferyl β-D-galactoside, lactose / glucose oxidase / isoluminol / microperoxidase, lactose /
Glucose oxidase / TCPO (bis (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate) / ANS (8-anilinonaphthalene sulfonic acid), AMPGD (3- (4-methoxyspiro (1,2-deoxydioxytan-3) , 2'-
Tridecane-4-phenyl), o-NPGal (o-nitro-
β-D- is lactoside) / GalDH (galactose-dehydrogenase) / NAD + / NADH, o-NPGal by bioluminescence method
When (o-nitro-β-D- is lactoside) / GalDH (galactose-dehydrogenase) / NAD + / NADH is glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose- 6-phosphate / NADP + , in the chemiluminescence method, glucose-6-phosphate / NAD (P) + / NAD (P) H, etc.
Many substrates are known, and any substrate can be used as long as it is a substrate for the enzyme used.
【0035】発色後は、そのまま、または反応停止液を
添加して、所定の波長で測定する。例えば、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、p−ニトロフェニルリン酸基
質では比色法405nmで、4−メチルウンベリフェリルリ
ン酸基質では蛍光法で、AMPPDやCSPDでは化学発光法
で、ペルオキシダ−ゼの場合は、5−アミノサリチル酸
基質では比色法492nmで、ABTS基質では比色法340nmまた
は414nm(酸化物)で、o−フェニレンジアミン基質では
比色法492nm(pH1.0)または445nm(pH5.0)で、テトラ
メチルベンチジン基質では比色法655nmまたは450nm(塩
酸や硫酸で反応停止時)、p−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸では蛍光法で、ルミノール/過酸化水素基質で
は、化学発光法で測定する。測定後は、市販のデータ処
理ソフトウェア−(例えばデルタソフト)などを使用
し、妨害物質を添加したものと添加しないものについて
濃度を算出する。得られた濃度を下記のとおり妨害物質
の有無による回収率により比較し、より高濃度の妨害物
質の添加時でも回収率が100%に近くなるもの(50
〜200%)を、妨害物質耐性の高い抗体として選択す
る。回収率は次の計算式により算出する。
回収率(%)=測定対象物質算出濃度/添加した測定対
象物質濃度x100
所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種
々の方法が使用できるが、例えば、測定対象物質のハプ
テンを結合させたOVAを吸着させたマイクロプレート
にハイブリドーマ培養上清を添加し、ついで、西洋わさ
びペルオキシダーゼ(以下、HRPと略す)標識した抗
マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固相に結合
した抗体を検出するELISA法などが挙げられる。抗
体活性陽性のハイブリドーマを直ちにクローニングに供
するが、通常これは即知の限界希釈法などで容易に実施
される。After color development, measurement is carried out as it is or after addition of a reaction stop solution at a predetermined wavelength. For example, in the case of alkaline phosphatase, the colorimetric method is 405 nm for the p-nitrophenyl phosphate substrate, the fluorescence method is for the 4-methylumbelliferyl phosphate substrate, the chemiluminescence method is for AMPPD and CSPD, and the peroxidase case is for peroxidase. Is a colorimetric method 492 nm for the 5-aminosalicylic acid substrate, 340 nm or 414 nm (oxide) for the ABTS substrate and 492 nm (pH 1.0) or 445 nm (pH 5.0) for the o-phenylenediamine substrate. ), The colorimetric method is 655 nm or 450 nm for the tetramethylbenzidine substrate (when the reaction is stopped with hydrochloric acid or sulfuric acid), the fluorescence method is used for p-hydroxyphenylpropionic acid, and the chemiluminescence method is used for the luminol / hydrogen peroxide substrate. . After the measurement, a commercially available data processing software (for example, Delta Soft) is used, and the concentrations of the substances with and without addition of the interfering substance are calculated. The obtained concentrations are compared by the recovery rates with and without interfering substances as shown below, and the recovery rate is close to 100% even when a higher concentration of interfering substances is added (50
~ 200%) are selected as antibodies with high resistance to interferents. The recovery rate is calculated by the following formula. Recovery rate (%) = concentration of calculated target substance / concentration of added target substance × 100 Various methods can be used for screening the desired antibody-producing hybridoma. For example, OVA to which the hapten of the target substance is bound is adsorbed. The hybridoma culture supernatant was added to the microplate, and then a horseradish peroxidase (hereinafter, abbreviated as HRP) -labeled anti-mouse immunoglobulin antibody was added to detect the antibody bound to the plate solid phase. To be Hybridomas positive for antibody activity are immediately subjected to cloning, which is usually easily performed by the well-known limiting dilution method or the like.
【0036】クローン化されたハイブリドーマ上清の抗
体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を
産生するハイブリドーマを選別し、目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することが
できる。このような方法により得られるハイブリドーマ
としては、例えば、後述の実施例1において得られたマ
ウス−ハイブリドーマEE2−227、E1−420及
びE2−73が挙げられる。これらは独立行政法人産業
技術総合研究所 特許生物寄託センターに、2001年
4月25日、それぞれ受託番号FERM−BP756
7、FERM−BP7568およびFERM−BP75
69として寄託されている。The antibody titer of the cloned hybridoma supernatant is measured by the above-mentioned method, and the hybridoma producing a stable antibody having a high titer is selected to obtain the hybridoma producing the target monoclonal antibody. You can Examples of hybridomas obtained by such a method include mouse-hybridomas EE2-227, E1-420, and E2-73 obtained in Example 1 described later. These are deposited in the Patent Biological Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, on April 25, 2001, under the deposit number FERM-BP756.
7, FERM-BP7568 and FERM-BP75
Deposited as 69.
【0037】[0037]
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。
実施例1
1.モノクローナル抗体の取得
1−1 ハプテンの作成
(1)エチニルエストラジオール抗体用ハプテンの作成
エチニルエストラジオール(EE2)1.0gとナトリウムメ
チラート0.76gをエタノール35mlに溶解し、更にモノク
ロル酢酸0.41gを添加した後、22時間加熱還流した、減
圧濃縮後、水、酢酸エチル各約100mlを加えて分液し
た。水層を酢酸エチル50mlで洗浄後、濃塩酸で水層を酸
性化した(pH1-2)。酢酸エチル100mlおよび50mlで抽出
後、有機層を飽和食塩水30mlで洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムにて脱水した。減圧濃縮液を-20℃で2日間静置す
ることにより一部が結晶化した。この一部を採取し、種
結晶とした。濃縮液を少量のアセトンに溶解し、ヘキサ
ンおよび種結晶を加え結晶を沈殿させた。濾取した結晶
を減圧乾燥することにより目的物EE2-3-カルボキシメチ
ルエーテル(EE2−3CME)を取得した。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. Example 1 1. Acquisition of Monoclonal Antibody 1-1 Preparation of hapten (1) Preparation of hapten for ethinyl estradiol antibody 1.0 g of ethinyl estradiol (EE2) and 0.76 g of sodium methylate were dissolved in 35 ml of ethanol, and 0.41 g of monochloroacetic acid was further added. The mixture was heated under reflux for 22 hours, concentrated under reduced pressure, and about 100 ml of water and ethyl acetate were added to separate the layers. After washing the aqueous layer with 50 ml of ethyl acetate, the aqueous layer was acidified with concentrated hydrochloric acid (pH 1-2). After extraction with 100 ml and 50 ml of ethyl acetate, the organic layer was washed with 30 ml of saturated saline and dried over anhydrous sodium sulfate. A part of the solution was crystallized by allowing the concentrated solution under reduced pressure to stand at -20 ° C for 2 days. A part of this was collected and used as a seed crystal. The concentrated solution was dissolved in a small amount of acetone, hexane and seed crystals were added to precipitate crystals. The target product EE2-3-carboxymethyl ether (EE2-3CME) was obtained by drying the crystals collected by filtration under reduced pressure.
【0038】(2)17β-エストラジオール抗体用ハプ
テンの作成
17β-エストラジオール(E2)1.0gとナトリウムメチラー
ト0.82gをエタノール35mlに溶解し、更にモノクロル酢
酸0.45gを添加した後、2日間加熱還流した、減圧濃縮
後、水約300ml、酢酸エチル約200mlを加えて分液した。
水層を酢酸エチル50mlで洗浄後、濃塩酸で水層を酸性化
した(pH1-2)。酢酸エチル100mlで2回抽出後、有機層を
飽和食塩水30mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて脱水
した。減圧濃縮液を少量のアセトンに溶解し、イソプロ
ビルエーテル(IPE)を加え結晶を沈殿させた。濾取し
た結晶をIPEにて洗浄後、減圧乾燥することにより目的
物E2-3-カルボキシメチルエーテル(E2−3CME)
を取得した。(2) Preparation of hapten for 17β-estradiol antibody 1.0 g of 17β-estradiol (E2) and 0.82 g of sodium methylate were dissolved in 35 ml of ethanol, and 0.45 g of monochloroacetic acid was further added, followed by heating under reflux for 2 days. After concentration under reduced pressure, about 300 ml of water and about 200 ml of ethyl acetate were added to separate the layers.
After washing the aqueous layer with 50 ml of ethyl acetate, the aqueous layer was acidified with concentrated hydrochloric acid (pH 1-2). After extracting twice with 100 ml of ethyl acetate, the organic layer was washed with 30 ml of saturated saline and dehydrated with anhydrous sodium sulfate. The concentrated solution under reduced pressure was dissolved in a small amount of acetone, and isoprovir ether (IPE) was added to precipitate crystals. The crystals collected by filtration are washed with IPE and then dried under reduced pressure to obtain the desired product E2-3-carboxymethyl ether (E2-3CME).
Got
【0039】(3)エストロン抗体用ハプテンの作成
エストラジオール-3.17-ジアセテート(E2-3,17-diAce)2
0gを酢酸25mlに溶解し、これを冷やしながら無水クロム
酸9g、酢酸27ml、水4mlの混液の4/5を徐々に加え
る。一夜攪拌後、水を加えてクロロホルムで抽出し、炭
酸カリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後、減
圧濃縮した。濃縮液をベンゼンに溶解後、カラムクロマ
トグラフィー(Wako gel 2w)にかけ、熱ベンゼンで溶出
し、粗6-オキソ- E2-3,17-diAceを分取した(TLCで確認
しながら原料を除去)。本物質を2-メトキシ-エタノー
ルに溶解し、20%NaOHを同量加え、100℃、1時間反応さ
せた。希塩酸にて酸性化後、酢酸エチルで溶出し、硫酸
ナトリウムで脱水後、減圧濃縮し、メタノールから再結
晶させた(6オキソ-E2)。6オキソ-E2 300mgをエタノール
2mlに溶解し、炭酸カリウム微細粉末を50mg添加し、ベ
ンジルブロマイド50μlを添加し、撹拌(70℃, 2時間)
し、濃縮物をメタノールを用い、再結晶化した (6-オキ
ソ- E2-3-ベンジルエーテル)。6-オキソ- E2-3-ベンジ
ルエーテルをメタノールに溶解し、カルボキシメトキシ
ルアミン・1/2HClとナトリウムメトキシド(1.2モル量)
を少量の水で溶かし、メタノールで薄めて加えた。 室
温で1時間反応させ、2/3を蒸発させ、水とHClで酸性化
後、酢酸エチル抽出、硫酸ナトリウムで脱水した。ヘキ
サンに溶解後、シリカゲルカラムに供与し、メタノール
で溶出することにより、精製後、メタノールから再結晶
させた。再結晶した物質0.6gをアセトン2mlに溶解し、
無水クロム酸1g、酢酸5ml、水1mlの混液の半分を加え、
発熱が終了後、酢酸エチルにより、抽出し、蒸発乾固し
た(6-オキソ-E1-3-ベンジルエーテル)。6-オキソ-E1-
3-ベンジルエーテル 400mgをメタノール5mlに溶解し、5
% Pd・C 100mgを加え水素を通して攪拌した。1時間反
応後蒸発乾固させ、メタノールから再結晶させることに
より、目的物6-オキソ-E1-6カルボキシメチルオキシム
(E1−6CMO)を取得した。(3) Preparation of hapten for estrone antibody Estradiol-3.17-diacetate (E2-3,17-diAce) 2
0 g is dissolved in 25 ml of acetic acid, and 4/5 of a mixed solution of 9 g of chromic anhydride, 27 ml of acetic acid and 4 ml of water is gradually added while cooling. After stirring overnight, water was added and the mixture was extracted with chloroform, washed with potassium carbonate solution, dehydrated with sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. After the concentrated solution was dissolved in benzene, it was subjected to column chromatography (Wako gel 2w) and eluted with hot benzene to collect crude 6-oxo-E2-3,17-diAce (remove the raw material while confirming by TLC). . This substance was dissolved in 2-methoxy-ethanol, 20% NaOH was added in the same amount, and the mixture was reacted at 100 ° C for 1 hour. After acidification with dilute hydrochloric acid, elution with ethyl acetate, dehydration with sodium sulfate, concentration under reduced pressure, and recrystallization from methanol (6oxo-E2). 6oxo-E2 300mg ethanol
Dissolve in 2 ml, add 50 mg of fine powder of potassium carbonate, add 50 μl of benzyl bromide, and stir (70 ℃, 2 hours)
The concentrate was recrystallized from methanol (6-oxo-E2-3-benzyl ether). 6-oxo-E2-3-benzyl ether was dissolved in methanol, and carboxymethoxylamine 1 / 2HCl and sodium methoxide (1.2 molar amount)
Was dissolved in a small amount of water, diluted with methanol and added. The reaction was carried out at room temperature for 1 hour, 2/3 was evaporated, acidified with water and HCl, extracted with ethyl acetate and dried over sodium sulfate. After dissolving in hexane, the product was applied to a silica gel column and eluted with methanol to purify it, and then recrystallized from methanol. 0.6 g of the recrystallized substance is dissolved in 2 ml of acetone,
Add half of the mixture of chromic anhydride 1 g, acetic acid 5 ml, water 1 ml,
After the exotherm had ended, it was extracted with ethyl acetate and evaporated to dryness (6-oxo-E1-3-benzyl ether). 6-oxo-E1-
Dissolve 400 mg of 3-benzyl ether in 5 ml of methanol,
% Pd.C 100 mg was added and hydrogen was stirred. After reacting for 1 hour, the mixture was evaporated to dryness and recrystallized from methanol to obtain the desired product 6-oxo-E1-6 carboxymethyl oxime (E1-6CMO).
【0040】1−2 免疫原の調製
1−1で得られた3種のハプテンについてそれぞれ、ハ
プテン0.1モル、水溶性カルボジイミド0.14モル、N-ヒ
ドロキシコハク酸イミド0.14モルをジメチルスルホキシ
ド2ml中で一晩反応させて、活性化エステルを作成し
た。次にスカシガイヘモシアニン(KLH)10mgを0.13モル
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)溶液に溶解し、本活性化エス
テル200μlを添加後、一晩4℃で反応させた。ダルベッ
コリン酸緩衝液(PBS)に対する透析により未反応の試薬
を除去し、免疫原として凍結保存した1-2 Preparation of Immunogen For each of the three haptens obtained in 1-1, 0.1 mol of hapten, 0.14 mol of water-soluble carbodiimide, and 0.14 mol of N-hydroxysuccinimide were added overnight in 2 ml of dimethyl sulfoxide. Reacted to make an activated ester. Next, 10 mg of keyhole limpet hemocyanin (KLH) was dissolved in a 0.13 molar sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution, 200 μl of the activated ester was added, and the mixture was reacted overnight at 4 ° C. Unreacted reagents were removed by dialysis against Dulbecco's Phosphate buffer (PBS) and stored frozen as an immunogen.
【0041】1−3 免疫
1−2で得られた免疫原を500μg/mlとなるようにPBSに
溶解し、等量のフロイントアジュバントまたはRIBIアジ
ュバントシステムに添加した。充分乳濁後、BALB/Cマウ
ス(メス)に100μg/マウスで皮下投与し、2週間(フ
ロインド)もしくは3週間(RIBI)間隔で追加免疫を実
施した。5〜6回の追加免疫後、最大の血清抗体価を示し
た個体について、同免疫原を静脈投与し(50μg/0.1ml P
BS/マウス)最終免疫とした。1-3 Immunization The immunogen obtained in 1-2 was dissolved in PBS at 500 μg / ml and added to an equal amount of Freund's adjuvant or RIBI adjuvant system. After sufficient emulsification, 100 μg / mouse was subcutaneously administered to BALB / C mice (female), and booster immunization was performed at 2 week (Freund) or 3 week (RIBI) intervals. After 5 to 6 booster immunizations, the same immunogen was intravenously administered (50 μg / 0.1 ml P
(BS / mouse) The final immunization.
【0042】1−4 細胞融合
1−3で最終免疫を実施したマウスから脾臓を摘出し
(最終免疫から3日後)、脾臓細胞を調製した。別途培
養したマウスミエローマ細胞と脾臓細胞を1:5の割合
でポリエチレングリコール(平均分子量4000)存在下で
接触させ、細胞融合を実施し、融合細胞(ハイブリドー
マ)を得た。このハイブリドーマをHAT培地に懸濁後、9
6wellマイクロプレートに巻き込み、炭酸ガスインキュ
ベーター(37℃、5%CO2)中で培養した。1-4 Spleen was excised from the mouse which was finally immunized by cell fusion 1-3 (3 days after the last immunization) to prepare spleen cells. Separately cultured mouse myeloma cells and spleen cells were contacted at a ratio of 1: 5 in the presence of polyethylene glycol (average molecular weight 4000), and cell fusion was performed to obtain fused cells (hybridomas). After suspending this hybridoma in HAT medium,
It was rolled up in a 6-well microplate and cultured in a carbon dioxide gas incubator (37 ° C, 5% CO2).
【0043】1−5 ハイブリドーマのスクリーニング
(1)アッセイプレートの作成
ヤギ抗マウスIgAGM抗体(ICN/Cappel製、#55461)をPBS
に50μg/mlで溶解し、マイクロプレートに100μl/well
で添加した。4℃で一晩反応させた後、0.05%Tween20を
含むPBS(T-PBS)にて洗浄後(300μl/wellで2回)、PBSに
て4倍稀釈したブロックエース(雪印乳業(株)、東
京)を200μl/well添加した。4℃で一晩以上反応させ
た後、使用時まで冷蔵で保存した。1-5 Screening of hybridoma (1) Preparation of assay plate Goat anti-mouse IgAGM antibody (ICN / Cappel, # 55461) was used in PBS.
Dissolve 50 μg / ml in 100 μl / well in a microplate.
Added in. After reacting overnight at 4 ° C, after washing with PBS containing 0.05% Tween 20 (T-PBS) (twice at 300 μl / well), Block Ace diluted 4 times with PBS (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.), (Tokyo) was added at 200 μl / well. After reacting at 4 ° C overnight or more, it was stored refrigerated until use.
【0044】(2)抗原酵素複合体(標識抗原)の作成
1−1で作成した3種のハプテンについてそれぞれ、ハ
プテン0.1モル、水溶性カルボジイミド0.14モル、N-ヒ
ドロキシコハク酸イミド0.14モルをジメチルスルホキシ
ド2ml中で一晩反応させて、活性化エステルを作成し
た。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)10mgを0.13
モル重炭酸ナトリウム(NaHCO3)溶液10mlに溶解し、本活
性化エステル15μlを添加後、一晩4℃で反応させた。
限外ろ過により未反応の試薬を除去し、3mg/mlの濃度で
冷蔵保存した。(2) Preparation of antigen-enzyme complex (labeled antigen) For each of the three haptens prepared in 1-1, 0.1 mol of hapten, 0.14 mol of water-soluble carbodiimide and 0.14 mol of N-hydroxysuccinimide were added to dimethyl sulfoxide. The activated ester was made by reacting in 2 ml overnight. Next, add horseradish peroxidase (HRP) 10 mg to 0.13
It was dissolved in 10 ml of a molar sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) solution, 15 μl of the activated ester was added thereto, and the mixture was reacted overnight at 4 ° C.
The unreacted reagent was removed by ultrafiltration and refrigerated at a concentration of 3 mg / ml.
【0045】(3)1次スクリーニング(抗原結合能試
験)
1−4で細胞を巻き込んだマイクロプレートについて、
細胞の増殖が確認されたwellの培養液100μlを(1)で作
成したアッセイプレート(使用前にPBS(またはT-PBS)に
て洗浄後(300μl/wellで2回))へ添加した。室温で1時
間反応後、T-PBSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、1−
5(2)で作成した目的抗体の標識抗原をT-PBSに5000倍希
釈して、マイクロプレートに添加した。室温で1時間反
応後、T-PBSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、TMBハ゜ーオキシ
タ゛ーセ゛基質キット(日本バイオ・ラッド、東京、#172-10
66: 以下発色基質)を100μl/wellで添加した。30
分室温で反応後、1Nリン酸を100μl/wellで添加し、
発色反応を停止させた。450nmの波長で吸光度を読みと
り、吸光度1を越える細胞については24wellマイクロプ
レートへスケールアップした。(3) Primary screening (antigen-binding ability test) Regarding the microplate in which cells were involved in 1-4,
100 μl of the culture solution in the well in which cell growth was confirmed was added to the assay plate prepared in (1) (washed with PBS (or T-PBS) before use (300 μl / well twice)). After reacting for 1 hour at room temperature, wash with T-PBS (300 μl / well 3 times), 1-
The labeled antigen of the target antibody prepared in 5 (2) was diluted 5000-fold with T-PBS and added to the microplate. After reacting at room temperature for 1 hour, the plate was washed with T-PBS (300 μl / well three times), and TMB peroxidase substrate kit (Nippon Bio-Rad, Tokyo, # 172-10).
66: The following chromogenic substrate) was added at 100 μl / well. Thirty
After reacting at room temperature for 1 minute, 1N phosphoric acid was added at 100 μl / well,
The color reaction was stopped. The absorbance was read at a wavelength of 450 nm, and cells having an absorbance of more than 1 were scaled up to a 24-well microplate.
【0046】(4)2次スクリーニング(女性ホルモン妨
害試験)
1−5(3)で24wellマイクロプレートへスケールアップ
した細胞について、充分な細胞増殖が確認されたwellの
培養液を(1)で作成したアッセイプレート(使用前にPBS
(またはT-PBS)にて洗浄後(300μl/wellで2回))へ100μ
lずつ複数のwellに添加した。室温で1時間反応後、T-P
BSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、測定対象とする女性
ホルモン(1ng/ml in 10%メタノール(以下MeOH))、も
しくは10% MeOHのみ(対照)と目的抗体の標識抗原(T-P
BSで5000倍希釈)を等量混合し、マイクロプレートに添
加した。室温で1時間反応後、T-PBSにて洗浄し(300μl
/wellで3回)、発色基質を100μl/wellで添加した。30
分室温で反応後、1Nリン酸を100μl/well添加し、発
色反応を停止させた。450nmの波長で吸光度を読みと
り、対照と比較して、女性ホルモンの存在により吸光度
の低下が20%以上確認された細胞について常法に従いク
ローニングを実施し、以下に示す目的抗体産生ハイブリ
ドーマ候補株を取得した。(4) Secondary screening (female hormone interference test) For cells scaled up to a 24-well microplate in 1-5 (3), a well culture medium in which sufficient cell growth was confirmed was prepared in (1). Assay plate (PBS before use
(Or T-PBS) after washing (300 μl / well twice) to 100 μ
l was added to each well. After reacting for 1 hour at room temperature, TP
Wash with BS (300 μl / well three times), and measure the female hormone (1 ng / ml in 10% methanol (hereinafter MeOH)) or 10% MeOH only (control) and the labeled antigen (TP) of the target antibody.
(5000-fold diluted with BS) were mixed in equal amounts and added to the microplate. After reacting at room temperature for 1 hour, wash with T-PBS (300 μl
chromogenic substrate was added at 100 μl / well. Thirty
After the reaction at room temperature for 1 minute, 100 μl / well of 1N phosphoric acid was added to stop the color reaction. The absorbance was read at a wavelength of 450 nm, and compared with the control, cloning was performed according to a conventional method on cells in which the decrease in absorbance was confirmed to be 20% or more due to the presence of female hormone, and the target antibody-producing hybridoma candidate strain shown below was obtained. did.
【0047】1−6 精製抗体の取得
細胞培養上清については45−50%飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、マウス腹水はそのまま常法により、プロ
テインGアフィニティークロマトグラフィーにて抗体を
取得、精製した。1-6 Acquisition of Purified Antibody The cell culture supernatant was fractionated with 45-50% saturated ammonium sulfate, and the mouse ascites was subjected to protein G affinity chromatography according to a conventional method to obtain and purify the antibody.
【0048】2.妨害物質耐性抗体の選別
1−5(4)で取得した細胞の培養上清を用いて、各抗体
の妨害物質耐性試験を実施した。なお、妨害物質として
は環境中に高濃度で存在し、かつ測定試料前処理段階で
測定物質と共に濃縮される可能性のある物質である、界
面活性剤およびフミン物質を使用した。2. Selection of Interfering Substance Resistant Antibodies Using the culture supernatant of the cells obtained in 1-5 (4), an interfering substance resistant test of each antibody was carried out. As the interfering substance, a surfactant and a humic substance, which are substances present in the environment at a high concentration and possibly concentrated together with the measurement substance in the pretreatment stage of the measurement sample, were used.
【0049】実験方法
1−5(4)に準じて、女性ホルモン測定感度が最も高く
なる培養上清の希釈倍率を求めた。次に、その濃度で培
養上清中の抗体を抗マウスIgGプレートに結合させて
おいたフ゜レートに対し、以下のサンプルと対象抗体の標識
抗原(T-PBSで5000倍希釈)を等量混合後、100μl添加
した。サンプルとしては直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウム(LAS)、アルキルフェノールエトキシレー
ト(APE)、アルキルエトキシレート(AE)(各0, 1, 10, 1
00, 1000mg/L in 10%MeOH)、フミン酸ナトリウム(0,
1, 10, 100mg/L in 10%MeOH)溶液に測定対象の女性ホル
モンを0.5μg/Lとなるように添加したもの、および添加
しないものを使用した。1−5(4)に準じてELISA測定を
行い、既知濃度の標準液により作製した標準曲線と比較
することによりサンプル中の女性ホルモン濃度を算出し
た。その算出値を添加した女性ホルモン濃度(0.5μg/
L)で割り100倍して回収率を算出した。According to the experimental method 1-5 (4), the dilution ratio of the culture supernatant which gives the highest sensitivity for measuring female hormone was determined. Next, after mixing the same amount of the following sample and the labeled antigen of the target antibody (diluted 5000 times with T-PBS) with the plate in which the antibody in the culture supernatant was bound to the anti-mouse IgG plate at that concentration , 100 μl was added. As samples, straight chain sodium alkylbenzene sulfonate (LAS), alkylphenol ethoxylate (APE), alkyl ethoxylate (AE) (0, 1, 10, 1 for each)
00, 1000mg / L in 10% MeOH), sodium humate (0,
A female hormone to be measured was added to 1, 10, 100 mg / L in 10% MeOH) solution so as to be 0.5 μg / L, and a female hormone was not added. ELISA measurement was performed according to 1-5 (4), and the female hormone concentration in the sample was calculated by comparison with a standard curve prepared using a standard solution of known concentration. Female hormone concentration (0.5 μg /
It was divided by L) and multiplied by 100 to calculate the recovery rate.
【0050】結果Result
【表1】 [Table 1]
【0051】抗EE2抗体では、本選択法で選出した抗EE2
-227抗体が、本選択法によらずに取得した抗EE2-8抗体
(対照)と比べて、約10〜100倍高濃度の妨害物質を
添加しても回収率が50〜200%程度であったことか
ら、その反応妨害物質に対する耐性度の高い抗体を産生
するマウスハイブリドーマEE2−227株(FEEM
BP−7567)を選別した。また、抗E2抗体では、
本選択法で選出した抗E2-73抗体が、本選択法によらず
に取得された3種(E2-CC, E2-NG, E2-RB)の市販ELISA
キット使用抗体に比べて、約10〜100倍高濃度の妨
害物質(界面活性剤)を添加しても、回収率が50〜2
00%であったことから、その反応妨害物質に対する高
い耐性度を有する抗体を産生するマウスハイブリドーマ
としてE2−73株(FEEM BP−7569)を選
別した。また、本選択法で選出した抗E1−420抗体
も抗E2−73抗体に匹敵する高い界面活性剤耐性を有
することから、その抗E1−420抗体を産生するマウ
スハイブリドーマとしてE1−420株(FERM−B
P−7568)を選別した。For the anti-EE2 antibody, the anti-EE2 antibody selected by this selection method was used.
-227 antibody is an anti-EE2-8 antibody obtained without using this selection method
Compared to the (control), the recovery rate was about 50-200% even when the concentration of the interfering substance was about 10 to 100 times higher. Therefore, a mouse producing an antibody highly resistant to the reaction interfering substance. Hybridoma strain EE2-227 (FEEM
BP-7567) was selected. Also, with anti-E2 antibody,
Anti-E2-73 antibody selected by this selection method was obtained by three types (E2-CC, E2-NG, E2-RB) commercial ELISA obtained without this selection method.
Even if an interfering substance (surfactant) of about 10 to 100 times higher concentration than the antibody used in the kit is added, the recovery rate is 50 to 2
Since it was 00%, E2-73 strain (FEEM BP-7569) was selected as a mouse hybridoma producing an antibody having a high degree of resistance to the reaction-interfering substance. In addition, since the anti-E1-420 antibody selected by this selection method also has high surfactant resistance comparable to that of the anti-E2-73 antibody, the E1-420 strain (FERM) as a mouse hybridoma producing the anti-E1-420 antibody. -B
P-7568) was selected.
【0052】実施例2 EE2-ELISAキットの作製
(1)「固相化プレート」の作製
Dulbecco'sPBS(-)(和光純薬 CodeNo.041-20211)に溶
解したヤギ抗マウスIgG抗体(ICN/Cappel社 CodeN0.55
479)を0.5μg/wellになるよう固相化プレート(Costa
r, EIA/RIA plate strip8, #2592)に分注し、4℃で
一晩静置後、洗浄液(T-PBS)300μLで3回洗浄した。
ブッロキング液(1%BlockAce(雪印乳業)+0.05%スラオフ72
N(武田薬品)in PBS)200 μL/wellを添加し、4℃で
一晩静置後、洗浄液(T-PBS)300μLで3回洗浄した。
ついで、PBS(含0.05%スラオフ72N+0.1%BSA)に溶解したエ
チニルエストラジオール抗体(EE2-227)を0.002μg/w
ellずつ添加し、4℃で一晩静置後、洗浄液(T-PBS)300
μLで3回洗浄した。ブッロキング液(1%BlockAce(雪
印乳業)+0.05%スラオフ72N(武田薬品)in PBS)200
μl/wellを添加し、4℃で一晩静置後、アスピレーター
で全量を吸引後、タッピングにより水分を除去した。脱
水乾燥した固相化プレートをアルミ袋に封入し、真空乾
燥機により脱気およびシールをして、2〜8℃の冷蔵庫に
保存した。Example 2 Preparation of EE2-ELISA kit (1) Preparation of “solid-phased plate” Goat anti-mouse IgG antibody (ICN / ICN /) dissolved in Dulbecco's PBS (-) (Wako Pure Chemical Industries Code No. 041-20211) Cappel CodeN 0.55
479) to 0.5 μg / well immobilized plate (Costa
r, EIA / RIA plate strip8, # 2592), the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then washed 3 times with 300 μL of a washing solution (T-PBS).
Broking liquid (1% BlockAce (Snow Brand Milk Products) + 0.05% Slaoff 72
N (Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. in PBS) (200 μL / well) was added, and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C., and then washed 3 times with 300 μL of a washing solution (T-PBS).
Next, 0.002 μg / w of ethinyl estradiol antibody (EE2-227) dissolved in PBS (containing 0.05% slough 72N + 0.1% BSA) was added.
Add each ell, leave it at 4 ℃ overnight, and wash solution (T-PBS) 300
Washed 3 times with μL. Broking Liquid (1% BlockAce (Snow Brand Milk Products) + 0.05% Slaoff 72N (Takeda) in PBS) 200
After adding μl / well and leaving it at 4 ° C. overnight, the whole amount was sucked with an aspirator and then water was removed by tapping. The dehydrated and dried solid-phased plate was enclosed in an aluminum bag, deaerated and sealed with a vacuum dryer, and stored in a refrigerator at 2 to 8 ° C.
【0053】(2)「EE2標準原液」(0.1mgEE2/L 10%Me
OH)の作製
原液1(1000mgEE2/L)の調製:エチニルエストラジオ
ール標準品(和光純薬CodeNo.055-05011)を、その含量
100%に対して100mgを正確に秤量し、100mlメスフラスコ
に入れ、メタノールでメスアップした。原液2(10mgEE
2/L)の調製:原液1 1mlをホールピペットで正確に
秤り取り、100mlメスフラスコに入れ、メタノールでメ
スアップする。標準原液(0.1mgEE2/L)の調製:原液
2 1mlをホールピペットで正確に秤取り、100mlメスフ
ラスコに入れ、メタノール、蒸留水でメスアップし最終
10%メタノール溶液となるよう調製した。適切な容器に4
mlの標準原液を入れ、2〜8℃の冷蔵庫に保存した。(2) "EE2 standard stock solution" (0.1 mg EE2 / L 10% Me
Preparation of stock solution 1 (1000mgEE2 / L): Ethinyl estradiol standard product (Wako Pure Chemical Industries Code No.055-05011)
100 mg was accurately weighed with respect to 100%, placed in a 100 ml volumetric flask, and the volume was measured up with methanol. Stock solution 2 (10mgEE
2 / L): Accurately weigh 1 ml of stock solution 1 with a whole pipette, put in a 100 ml volumetric flask, and make up to volume with methanol. Preparation of standard stock solution (0.1mgEE2 / L): Precisely weigh 1ml of stock solution 2 with a whole pipette, put it in a 100ml volumetric flask, make up with methanol and distilled water, and finish.
It was prepared to be a 10% methanol solution. 4 in a suitable container
ml standard stock solution was added and stored in a refrigerator at 2-8 ° C.
【0054】(3)「抗原酵素複合体溶液」の作製
水溶性カルボジイミド(WSC 同仁化学 ヘ゜フ゜チト゛合成用
CodeNo.348-03631)26mgとNヒドロキシサクシンイミ
ド(NHSI 和光純薬 ヘ゜フ゜チト゛合成用 CodeNo.089-0403
2)16mgをジメチルスルホキシド(DMSO和光純薬 特
級)2mlに溶解した。その内の0.5mlと実施例1で作成し
たハプテン(EE2-3CME)10mgを1mlのDMSOに溶解し、室
温で一晩反応させた。得られた反応液13μLと10ml の
1.1%NaHCO3に溶解したペルオキシダーゼ(POD ヘ゛ーリンカ゛
ー EIA用 CodeNo.814393)10mgを4℃で一晩撹拌しなが
ら反応させ、得られた反応液を分画分子量 30,000の限
外濾過膜で濾過し、0.05%スラオフ72N含有PBSで最終30m
lとすることにより、抗原酵素複合体溶液を得た。この
溶液200μlを適切な容器に分注後キャップをして2
〜8℃の冷蔵庫に保存した。(3) Preparation of "antigen-enzyme complex solution" Water-soluble carbodiimide (for WSC Dojindo Peptide synthesis)
Code No.348-03631) 26 mg and N-hydroxysuccinimide (NHSI Wako Pure Chemicals for peptide synthesis Code No.089-0403
2) 16 mg was dissolved in 2 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 0.5 ml of it and 10 mg of the hapten (EE2-3CME) prepared in Example 1 were dissolved in 1 ml of DMSO and reacted at room temperature overnight. 13 μL of the obtained reaction solution and 10 ml
10 mg of peroxidase (POD Berliner EIA Code No.814393) dissolved in 1.1% NaHCO3 was reacted with stirring at 4 ° C overnight, and the resulting reaction solution was filtered through an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 30,000 to obtain 0.05%. Slaof 72N final PBS 30m
By setting l, an antigen-enzyme complex solution was obtained. Dispense 200 μl of this solution into an appropriate container and cap it.
Stored in a refrigerator at ~ 8 ° C.
【0055】(4)「抗原酵素複合体溶解液」の作製
500μLのTween-20(和光純薬 化学用 CodeNo.160-115
22)を4.5mlの蒸留水に溶解し、10% Tween-20溶液を作
製する。Na2HPO4・12H2O 13.26 g、NaH2PO4・2H2O 2.
02 g、NaCl 14.61 g、10%Tween-20溶液 10ml、スラオフ72
N 200 μlを、蒸留水1Lに溶解後、その8mlを適切な容
器に分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保存し
た。(4) Preparation of “antigen-enzyme complex solution” 500 μL of Tween-20 (Code No. 160-115 for Wako Pure Chemical Industries)
22) is dissolved in 4.5 ml of distilled water to make a 10% Tween-20 solution. Na2HPO4 / 12H2O 13.26 g, NaH2PO4 / 2H2O 2.
02 g, NaCl 14.61 g, 10% Tween-20 solution 10 ml, slaof 72
After dissolving 200 μl of N in 1 L of distilled water, 8 ml of the solution was dispensed into an appropriate container, capped, and stored in a refrigerator at 2 to 8 ° C.
【0056】(5)「6倍濃縮洗浄液」の作製
20mlTween-20を200ml蒸留水に溶解し、10%Tween-20
溶液を作製した。Dulbecco'sPBS(-)(和光 生化学用
CodeNo.041-20211)12袋、スラオフ72N 0.3ml、10%T
ween-20 30mlを1Lの蒸留水に溶解後、50mlずつ、適
切な容器に分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保
存した。(5) Preparation of "6-fold concentrated washing solution" 20 ml Tween-20 was dissolved in 200 ml distilled water to prepare 10% Tween-20.
A solution was made. Dulbecco's PBS (-) (for Wako Biochemistry
CodeNo.041-20211) 12 bags, Slaoff 72N 0.3ml, 10% T
After dissolving 30 ml of ween-20 in 1 L of distilled water, 50 ml each was dispensed into an appropriate container, which was then capped and stored in a refrigerator at 2 to 8 ° C.
【0057】(6)「発色基質溶液-A」の作製
5,5'−テトラメチルベンチジン(TMBZ 同仁化学 試験
研究用 CodeNo.346-040301)13.4mgを、ジメチルホル
ムアミド(DMF 和光純薬 試薬特級 CodeNo.045-0291
6)1mlに溶解し、0.1 g/L Tween 20を含む0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.5)100mlと混合し、適切な褐色容器に
10mlずつ分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に
保存した。(6) Preparation of "Chromogenic Substrate Solution-A" 13.4 mg of 5,5'-tetramethylbenzidine (TMBZ Dojindo Chemical Research Code No.346-040301) was added to dimethylformamide (DMF Wako Pure Chemicals Reagent Special Grade). Code No.045-0291
6) Dissolve in 1 ml, mix with 100 ml of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.5) containing 0.1 g / L Tween 20, dispense 10 ml each in a suitable brown container, cap and then 2-8 ° C. Stored in the refrigerator.
【0058】(7)「発色基質溶液-B」の作製
30%過酸化水素水(和光 試薬特級Code No. 081-0421
5)を蒸留水により0.1g/Lまで希釈し、適切な容器に5
mlずつ分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保存
した。(7) Preparation of "coloring substrate solution-B" 30% hydrogen peroxide solution (Wako reagent special grade Code No. 081-0421
Dilute 5) to 0.1 g / L with distilled water and add to a suitable container.
After dispensing each ml, the tube was capped and stored in a refrigerator at 2 to 8 ° C.
【0059】(8)「発色停止液」の作製
1Nリン酸溶液を調製し、15mlずつ適切な容器に分注後キ
ャップをして、室温で保存する。以上のようにして作製
した(1)から(8)迄のキット構成品を、箱詰めする
ことにより、EE2-ELISAキットが完成した。(8) Preparation of "coloring stop solution" 1N phosphoric acid solution is prepared, dispensed in 15 ml aliquots into appropriate containers, capped, and stored at room temperature. The EE2-ELISA kit was completed by packaging the kit components (1) to (8) produced as described above in a box.
【0060】実施例3 EE2-ELISA キットによる定量
実施例2により作成したEE2-ELISAキットを使用した定
量法は下記の通りである。
(1)「エチニルエストラジオール(EE2)標準液」の
調製
メタノールおよび蒸留水を用いてEE2標準原液(0.1mg/L
10%メタノール溶液)を希釈し、必要な濃度 (例え
ば0, 0.05, 0.1, 0.3 , 1.0, 3.0μg/L 10%メタノール
中)のEE2標準液を調製する。
(2)「抗原酵素複合体溶液」の調製
「抗原酵素複合体溶液」14μLに、「抗原酵素複合体溶
解液」 7mLを加えて溶解し、「抗原酵素複合体溶液」
を調製する。
(3)「混合液」の調製
測定試料または「EE2標準液」(いずれも10% メタノー
ル溶液)100μL/wellと「抗原酵素複合体溶液」100μL/
wellを「混合用マイクロプレート」上で混合する。
(4)抗原抗体反応(競合反応)
「抗EE2モノクローナル抗体固相化プレート」に(3)
で調製した「混合液」を100μL/wellずつ分注し、室温
で60分間反応させる。
(5)「洗浄液」の調製
抗原抗体反応時間中に、「6倍濃縮洗浄液」と蒸留水を
1:5の割合で混合し、「洗浄液」を調製する。
(6)未反応物の除去
抗原抗体反応液を捨て、「洗浄液」300μL/wellを用い
てwell内を3回洗浄する。
(7)「発色試薬」の調製
「発色基質溶液-A」と「発色基質溶液-B」を3:1の割合
で混合し、「発色試薬」を調製する。
(8)発色反応/反応停止
(7)で調製した「発色試薬」を100μL/well加え、室
温で30分間反応させた後、「発色停止液」を100μL/wel
l添加し反応を停止する。
(9)比色および濃度計算
プレートリーダーを用い、波長450nmで吸光度を測定
し、標準曲線から試料中のEE2濃度を算出する。Example 3 Quantification using EE2-ELISA kit The quantification method using the EE2-ELISA kit prepared in Example 2 is as follows. (1) Preparation of “ethinyl estradiol (EE2) standard solution” Using methanol and distilled water, EE2 standard stock solution (0.1 mg / L)
Dilute 10% methanol solution) to prepare the EE2 standard solution at the required concentration (eg 0, 0.05, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 μg / L in 10% methanol). (2) Preparation of “antigen-enzyme complex solution” 14 μL of “antigen-enzyme complex solution” was dissolved by adding 7 mL of “antigen-enzyme complex solution” to “antigen-enzyme complex solution”
To prepare. (3) Preparation of “mixed solution” Measurement sample or “EE2 standard solution” (10% methanol solution in each case) 100 μL / well and “antigen-enzyme complex solution” 100 μL / well
Mix wells on a "mixing microplate". (4) Antigen-antibody reaction (competitive reaction) (3) on "Anti-EE2 monoclonal antibody immobilized plate"
Dispense 100 μL / well of the “mixed solution” prepared in step 1, and allow to react for 60 minutes at room temperature. (5) Preparation of “washing solution” During the reaction time of antigen-antibody, “6 times concentrated washing solution” and distilled water were added.
Prepare a "washing liquid" by mixing at a ratio of 1: 5. (6) Removal of unreacted material The antigen-antibody reaction solution is discarded, and the inside of the well is washed 3 times with “washing solution” 300 μL / well. (7) Preparation of "coloring reagent""Coloring substrate solution-A" and "coloring substrate solution-B" are mixed at a ratio of 3: 1 to prepare "coloring reagent". (8) Coloring reaction / stop reaction Add 100 μL / well of the “coloring reagent” prepared in (7), react at room temperature for 30 minutes, and then add “coloring stop solution” to 100 μL / wel.
l Add and stop the reaction. (9) Colorimetric and concentration calculation Using a plate reader, the absorbance is measured at a wavelength of 450 nm, and the EE2 concentration in the sample is calculated from the standard curve.
【0061】実施例4 EE2-ELISA キットによる標準
曲線の作成
実施例3に従い作成した標準曲線を図1に示す。なお、
EE2濃度を縦軸に、EE2濃度0μg/Lの時の吸光度と各濃度
での吸光度の比率(阻害率、B/B0%)を横軸にプロット
している。この結果からEE2の定量可能範囲は0.05-3μg
/L程度と考えられた。Example 4 Preparation of Standard Curve by EE2-ELISA Kit The standard curve prepared according to Example 3 is shown in FIG. In addition,
The EE2 concentration is plotted on the vertical axis, and the ratio of the absorbance at each EE2 concentration of 0 μg / L and the absorbance at each concentration (inhibition rate, B / B0%) is plotted on the horizontal axis. From this result, the quantifiable range of EE2 is 0.05-3 μg
It was considered to be about / L.
【0062】実施例5 交差反応性試験
〔表2〕に示すエストロゲン類について実施例4と同様
にそれぞれの標準曲線を作成し、阻害率=50%となるとき
のEE2濃度(IC50)を求め下式により交差反応性を求め
た結果を〔表2〕に示す。
交差反応性(%)=求めるエストロゲンのIC50/EE2のI
C50x100Example 5 Cross-reactivity test A standard curve was prepared for each of the estrogens shown in Table 2 in the same manner as in Example 4, and the EE2 concentration (IC 50 ) when the inhibition rate = 50% was determined. The results of cross-reactivity obtained by the following formula are shown in [Table 2]. Cross-reactivity (%) = determine estrogen IC 50 / EE2 of I
C 50 x 100
【0063】[0063]
【表2】 [Table 2]
【0064】抗EE2-227抗体はEE2に対する特異性が非常
に高く、他のエストロゲン類とは殆ど反応しなかった。The anti-EE2-227 antibody had a very high specificity for EE2 and hardly reacted with other estrogens.
【0065】実施例6 下水処理水測定におけるLC-MS/
MSとELISA測定値の比較
下水処理水10Lについて、カ゛ラス繊維ろ紙でろ過後、1M
酢酸緩衝液(pH5.0)によりpHを5に調整した。ついでメタノー
ル5ml、蒸留水10mlでコンディショニングしたC-18固相カ
ートリッジに通水後、カートリッジを蒸留水、ヘキサン各5m
lで洗浄した。EE2をC-18固相カートリッジからジクロロ
メタン5mlで溶出後、溶出液を窒素気流下(40℃)で
蒸発乾固し、10%MeOHに溶解濃縮後、実施例−3によ
り、サンプル中のEE2濃度を定量した。なお、ELISA測定
には市販のEE2用ELISAキット(R-Biopharm GmbH、German、
#04330)も対照として用い、同封の操作説明書に従って
定量した。また、同様に処理したサンプルについて、辻
村らの方法(化学品検査協会創立50周年記念講演およ
び第4回研究発表会講演要旨集、1999、17−2
6)によりLC-MS/MS分析を行い、ELISA測定値と比較し
た。結果を〔表3〕に示す。Example 6 LC-MS / in sewage treatment water measurement
Comparison of MS and ELISA measurement values 10L of sewage treated water was filtered through glass fiber filter paper and then 1M
The pH was adjusted to 5 with an acetate buffer (pH 5.0). Then, after passing water through a C-18 solid phase cartridge conditioned with 5 ml of methanol and 10 ml of distilled water, the cartridge was distilled water and hexane each 5 m
washed with l. EE2 was eluted from the C-18 solid phase cartridge with 5 ml of dichloromethane, the eluate was evaporated to dryness under a nitrogen stream (40 ° C.), dissolved in 10% MeOH and concentrated, and then the EE2 concentration in the sample was measured according to Example-3. Was quantified. For the ELISA measurement, a commercially available EE2 ELISA kit (R-Biopharm GmbH, German,
# 04330) was also used as a control and quantified according to the enclosed operating instructions. In addition, regarding the sample treated in the same manner, the method of Tsujimura et al. (Abstracts commemorating the 50th anniversary of the Chemicals Inspection Association and the 4th Research Presentation Abstracts, 1999, 17-2
According to 6), LC-MS / MS analysis was performed and compared with the measured value of ELISA. The results are shown in [Table 3].
【0066】[0066]
【表3】 [Table 3]
【0067】本選択法により妨害物質耐性抗体として選
択取得したEE2-227抗体を用いたELISAキットでの測定値はL
C-MS/MS測定値と近似したが、本選択法を適用せずに取
得した抗体を使用した市販ELISAキットでの測定値はLC-
MS/MSの約8倍となり、濃縮液中に存在する反応妨害物
質の影響を受けているものと考えられた。The value measured by the ELISA kit using the EE2-227 antibody selectively obtained as an interfering substance resistant antibody by this selection method is L
Although it was close to the C-MS / MS measurement value, the measurement value with a commercial ELISA kit using the antibody obtained without applying this selection method was LC-
It was about 8 times that of MS / MS, which was considered to be influenced by the reaction-interfering substances present in the concentrate.
【0068】[0068]
【発明の効果】本発明の方法により選別された抗原抗体
反応妨害物質耐性抗体は、測定対象物を含む検体サンプ
ル中に抗原抗体反応妨害物質が夾雑していても、それに
影響されることなく測定対象物質を分析、測定すること
ができ、また測定対象物質の濃縮にも利用することがで
きる有用な抗体である。EFFECT OF THE INVENTION Antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant antibodies selected by the method of the present invention can be measured without being affected by the antigen-antibody reaction-interfering substance contained in the sample containing the measurement object. It is a useful antibody that can analyze and measure a target substance and can also be used for concentration of the target substance.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図1】 EE2-227抗体標準曲線Figure 1: EE2-227 antibody standard curve
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/531 C12N 15/00 C 33/577 5/00 B (72)発明者 小林 綾子 大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85 号 武田薬品工業株式会社生活環境カンパ ニー内 (72)発明者 廣部 将人 大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85 号 武田薬品工業株式会社生活環境カンパ ニー内 Fターム(参考) 4B024 AA11 BA41 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 EA50 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/531 C12N 15/00 C 33/577 5/00 B (72) Inventor Ayako Kobayashi Osaka City, Osaka Prefecture 2-17-85, 13 Sanhonmachi, Yodogawa-ku Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. Living environment company (72) Inventor Masato Hirobe 2-17-85, 13 Sanhonmachi, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. Living environment Company F term (reference) 4B024 AA11 BA41 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 EA50 FA74
Claims (17)
る抗体を選別するに際し、抗原抗体反応妨害物質の存在
下に目的抗体を選別する抗体の選別方法。1. A method for selecting an antibody, which comprises selecting a target antibody in the presence of an antigen-antibody reaction-interfering substance when selecting an antibody against a substance to be measured using an antigen-antibody reaction.
1記載の抗体の選別方法。2. The method for selecting an antibody according to claim 1, wherein the substance to be measured is an environmental pollutant.
載の抗体の選別方法。3. The method for selecting an antibody according to claim 1, wherein the substance to be measured is a hormone.
記載の抗体の選別方法。4. The antibody is a monoclonal antibody.
A method for selecting the described antibody.
たはその分解物、殺菌消毒剤、または溶媒である請求項
1記載の抗体の選別方法。5. The method for selecting antibodies according to claim 1, wherein the substance that interferes with the antigen-antibody reaction is an environmental pollutant or a decomposed product thereof, a bactericidal disinfectant, or a solvent.
その濃縮物、またはフミン物質である請求項5記載の抗
体の選別方法。6. The method for selecting an antibody according to claim 5, wherein the environmental pollutant is a surfactant, environmental water or a concentrate thereof, or a humic substance.
ン界面活性剤または非イオン界面活性剤である請求項6
記載の抗体の選別方法。7. The surfactant is an anionic surfactant, a cationic surfactant or a nonionic surfactant.
A method for selecting the described antibody.
工程水または下水処理工程水である請求項6記載の抗体
の選別方法。8. The method for selecting an antibody according to claim 6, wherein the environmental water is river water, lake water, seawater, water in the water treatment process or water in the sewage treatment process.
抗体の選別方法。9. The method of selecting an antibody according to claim 5, wherein the germicidal disinfectant is a chlorine agent.
トン類またはエステル類である請求項5記載の抗体の選
別方法。10. The method for selecting an antibody according to claim 5, wherein the solvent is an alcohol, a nitrile, a ketone or an ester.
ンと蛋白質との複合体を抗原として免疫した動物から得
られたポリクローナル抗体、または測定対象物質又は測
定対象物質のハプテンと蛋白質との複合体を抗原として
免疫した動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細
胞とを融合して得られる測定対象物質又は測定対象物質
のハプテンとその蛋白質との複合体に対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られた
モノクローナル抗体を、抗原抗体反応妨害物質の共存下
に抗原酵素複合体(標識抗原)、測定対象物質又は測定
対象物質のハプテンとその蛋白質との複合体(抗原)を
反応させ、その反応率から抗原抗体反応妨害物質耐性抗
体を選別する請求項1記載の抗体の選別方法。11. A polyclonal antibody obtained from an animal immunized with a substance to be measured or a complex of a hapten and a protein of the substance to be measured as an antigen, or a substance to be measured or a complex of a hapten and a protein of the substance to be measured. A hybridoma producing a monoclonal antibody against a substance to be measured or a complex of the substance to be measured hapten and its protein obtained by fusing spleen cells or lymph node cells of an animal immunized as an antigen with myeloma cells is cultured. The obtained monoclonal antibody is allowed to react with an antigen-enzyme complex (labeled antigen) in the presence of a substance that interferes with an antigen-antibody reaction, a substance to be measured or a complex of the hapten of the substance to be measured and its protein (antigen), and the reaction The method for selecting an antibody according to claim 1, wherein an antibody resistant to an antigen-antibody reaction interfering substance is selected based on the rate.
選別された抗原抗体反応妨害物質耐性モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ。12. A hybridoma producing an antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant monoclonal antibody selected by the antibody selection method according to claim 11.
マEE2−227(FERM BP−7567)、マウ
スハイブリドーマE1−420(FERM BP−75
68)又はマウスハイブリドーマE2−73(FERM
BP−7569)である請求項12記載のハイブリド
ーマ。13. The hybridomas are mouse hybridoma EE2-227 (FERM BP-7567) and mouse hybridoma E1-420 (FERM BP-75).
68) or mouse hybridoma E2-73 (FERM
The hybridoma according to claim 12, which is BP-7569).
された抗原抗体反応妨害物質耐性抗体。14. An antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant antibody selected by the antibody selection method according to claim 11.
て産生された抗原抗体反応妨害物質耐性モノクローナル
抗体。15. An antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant monoclonal antibody produced by the hybridoma according to claim 12.
妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んでなる測
定対象物質の免疫学的分析用キット。16. A kit for immunological analysis of a substance to be measured, which comprises the antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant antibody according to claim 14 or 15 as an essential component.
妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んでなる測
定対象物質の免疫学的濃縮用キット。17. A kit for immunological concentration of a substance to be measured, which comprises the antigen-antibody reaction-interfering substance-resistant antibody according to claim 14 or 15 as an essential component.
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-
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- 2002-05-16 JP JP2002141102A patent/JP2003038173A/en not_active Withdrawn
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