JP2005247822A - Coplanar pcb haptene, antibody against to coplanar pcb haptene and immunological measuring method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コプラナーＰＣＢハプテン、コプラナーＰＣＢに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法等に関する。 The present invention relates to a coplanar PCB hapten, an antibody against the coplanar PCB, an immunoassay method using the same, and the like.
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）は、化学的安定性や低い電気伝導性のため絶縁体や潤滑油などの様々な工業製品に利用されてきた。しかし、ＰＣＢは肝臓や甲状腺などへの毒性があり、とりわけノンオルト置換型ＰＣＢはコプラナーＰＣＢと呼ばれ、ダイオキシンと類似した作用を示す。日本におけるＰＣＢの生産は１９７２年に中止されたが、ＰＣＢは廃棄物などから環境に流出しており、人の健康や野生生物に影響を及ぼす恐れがある。 PCB (polychlorinated biphenyl) has been used in various industrial products such as insulators and lubricating oils because of its chemical stability and low electrical conductivity. However, PCB is toxic to the liver, thyroid gland, etc., and non-ortho-substituted PCB is called coplanar PCB, and exhibits an action similar to that of dioxin. PCB production in Japan was discontinued in 1972, but PCBs are discharged from the waste into the environment, which may affect human health and wildlife.
そこで、環境におけるＰＣＢ残留量をモニタリングすることは極めて重要である。一般に、ＰＣＢの測定はガスクロマトグラフィーを用いた機器分析で行われるが、この手法は煩雑で費用がかかる。 Therefore, it is extremely important to monitor the amount of PCB remaining in the environment. In general, measurement of PCB is performed by instrumental analysis using gas chromatography, but this method is complicated and expensive.
一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れているばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法である。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、ＰＣＢのような環境負荷化学物質の測定へも適用が進んでいる。近年、コプラナーＰＣＢの中でも特に毒性の高いＰＣＢ１２６やＰＣＢ１６９の測定が試みられている。 On the other hand, an immunological measurement method measures an antigen using an antigen-antibody reaction, and is not only excellent in measurement accuracy but also a quick, simple and economical measurement method. Conventionally, immunological measurement methods have played a major role as one of patient pathological analysis methods in the field of clinical diagnosis, but their application is also progressing to the measurement of environmentally hazardous chemical substances such as PCBs. In recent years, measurement of PCB 126 and PCB 169, which are particularly toxic among coplanar PCBs, has been attempted.
抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。これらの抗体は、反応性において十分な性能を持つが、ＰＣＢが水に不溶性であることから限定された条件下で測定しなければならないこと、および類似の構造を有する化学物質間で交差反応が起きる問題点があった。 In general, antibodies are collected from blood from immunized rabbits or goats, and so-called polyclonal antibodies that separate and purify antibodies contained therein, and so-called polyclonal antibodies that secrete cloned hybridomas capable of producing antibodies are separated and purified. There are monoclonal antibodies. These antibodies perform well in reactivity, but must be measured under limited conditions because PCBs are insoluble in water, and there is cross-reactivity between chemicals with similar structures. There was a problem that occurred.
前記免疫学的測定法を利用したＰＣＢの検出方法としては、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中で検出する方法（特許文献１を参照）、生物または化学発光を測定することによる検出方法（特許文献２を参照）、コプラナーＰＣＢを含むダイオキシン類を異性体レベルで検出する方法（特許文献３を参照）などが知られているが、特許文献１または３に記載の方法では検出感度が低い点、特許文献２に記載の方法では抗体の交差反応性については考慮されていない点などの問題があり、ＰＣＢの検出感度および定量性において未だ満足できるような方法は知られていない。
本発明の目的は、コプラナーＰＣＢに対して高感度かつコプラナーＰＣＢ間の類似化合物に対する交差反応性の明確な抗体を作製するためのハプテンおよびコプラナーＰＣＢ抗体、ならびに当該抗体を用いた感度および定量性に優れたコプラナーＰＣＢの免疫学的測定キットおよび免疫学的測定方法を提供することにある。 The object of the present invention is to increase the sensitivity and quantification of hapten and coplanar PCB antibodies for producing antibodies with high sensitivity to coplanar PCBs and clearly having cross-reactivity to similar compounds between coplanar PCBs, and the antibodies. The object is to provide an excellent immunoassay kit and immunoassay method for a coplanar PCB.
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コプラナーＰＣＢの中で弱いエストロジェン様活性を示し、ヒトや野生生物への影響が懸念されるＰＣＢ８０をハプテン候補として用いることにより、意外にもＰＣＢ８０のみならず毒性の高いコプラナーＰＣＢも高感度かつ定量的に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have surprisingly realized that PCB80, which exhibits weak estrogen-like activity among coplanar PCBs and is feared to affect humans and wildlife, is used as a hapten candidate. In addition, it was found that not only PCB80 but also highly toxic coplanar PCB can be detected with high sensitivity and quantitatively, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、下記式（１）： That is, the present invention provides the following formula (1):
本発明は、前記化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対する抗体に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。 The present invention relates to an antibody against coplanar PCB obtained by using the compound as a hapten and using a complex of the hapten and a polymer compound as an antigen. The antibody is preferably a monoclonal antibody.
前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０の測定方法に使用されることが好ましい。また、前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９、ＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９からなるコプラナーＰＣＢ群の測定方法に使用されることが好ましく、さらにＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９の測定方法に使用されることが好ましい。 The monoclonal antibody is preferably used in a method for measuring PCB80. The monoclonal antibody is preferably used in a method for measuring a coplanar PCB group consisting of PCB80, PCB126, PCB169, PCB111 and PCB189, and more preferably used in a method for measuring PCB126 and PCB169.
本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、ＰＫ−４Ｎ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４０）またはＰＫ−０Ｔ２であることが好ましい。 The present invention relates to a hybridoma that produces the monoclonal antibody. The hybridoma is preferably PK-4N2 (FERM P-19640) or PK-0T2.
本発明は、前記モノクローナル抗体を含んでなるコプラナーＰＣＢの測定キットに関する。前記キットは、さらに固相化抗原を含んでなり、前記固相化抗原は前記式（１）の化合物とは異なる化合物をハプテン部分として含むものであることが好ましい。 The present invention relates to a measurement kit for a coplanar PCB comprising the monoclonal antibody. Preferably, the kit further comprises an immobilized antigen, and the immobilized antigen preferably contains a compound different from the compound of the formula (1) as a hapten moiety.
前記キットにおいて、前記固相化抗原のハプテン部分が４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸、または２，４−ジクロロフェニル酢酸であることが好ましい。 In the kit, the hapten portion of the immobilized antigen is 4- (2,4-dichlorophenoxy) butyric acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-dichlorophenoxypropionic acid, or 2,4-dichlorophenylacetic acid. Preferably there is.
また、本発明は、前記モノクローナル抗体または前記キットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法に関する。 The present invention also relates to a method for measuring a coplanar PCB using the monoclonal antibody or the kit.
本発明の化合物は、コプラナーＰＣＢハプテンとして好適に用いられるものである。当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてコプラナーＰＣＢに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度なコプラナーＰＣＢ抗体を得ることができる。 The compound of the present invention is suitably used as a coplanar PCB hapten. By using the complex of the hapten and the high molecular compound as an antigen, an immune response against a coplanar PCB can be successfully induced in an animal, and a specific and highly sensitive coplanar PCB antibody can be obtained.
本発明の抗体は、特異的かつ高感度にコプラナーＰＣＢを検出することができる。当該抗体がモノクローナル抗体の場合、コプラナーＰＣＢ、特にＰＣＢ８０に対して高感度であり、しかも他の類似化合物に対する交差反応性が明確である。前記モノクローナル抗体を交差反応性により単独または組み合わせて用いることにより、ＰＣＢ８０に構造が類似する他のコプラナーＰＣＢをも同時に検出することができるとともに、それらの類似化合物を分別して検出することもできる。 The antibody of the present invention can detect coplanar PCBs specifically and with high sensitivity. When the antibody is a monoclonal antibody, it is highly sensitive to a coplanar PCB, particularly PCB80, and has a clear cross-reactivity to other similar compounds. By using the monoclonal antibody alone or in combination due to cross-reactivity, other coplanar PCBs similar in structure to PCB80 can be detected simultaneously, and those similar compounds can also be detected separately.
本発明のハイブリドーマは、前記モノクローナル抗体を安定して産生することができ、当該ハイブリドーマを培養することにより、大量のモノクローナル抗体を製造することができる。 The hybridoma of the present invention can stably produce the monoclonal antibody, and a large amount of the monoclonal antibody can be produced by culturing the hybridoma.
本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体を含むことにより、コプラナーＰＣＢの免疫学的測定方法に好適に用いられ、コプラナーＰＣＢを特異的、高感度および簡便に測定することのできる手段を提供することができる。本発明のキットが前記式（１）とは異なる構造を有する化合物を含有する固相化抗原をさらに含む場合、より高感度に測定することができる手段を提供することができる。 By including the monoclonal antibody of the present invention, the kit of the present invention is suitably used for an immunoassay method for coplanar PCB, and provides a means capable of specifically, highly sensitively and easily measuring coplanar PCB. be able to. When the kit of the present invention further comprises a solid-phased antigen containing a compound having a structure different from that of formula (1), a means capable of measuring with higher sensitivity can be provided.
本発明のコプラナーＰＣＢの測定方法は、本発明のモノクローナル抗体またはキットを用いることにより感度、特異性および操作の簡便性にすぐれた効果を奏する。 The method for measuring a coplanar PCB of the present invention exhibits excellent effects in sensitivity, specificity and ease of operation by using the monoclonal antibody or kit of the present invention.
本発明は、下記式（１）： The present invention provides the following formula (1):
前記式（１）において、−Ｏ−（ＣＨ2 ）3 −はＰＣＢ８０（３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル）に導入したスペーサーアームを表わす。前記スペーサーアームは、ＰＣＢ８０と結合対象の高分子化合物との間に適度なスペースを与える。
In the above formula (1), —O— (CH 2 ) 3 — represents a spacer arm introduced into PCB80 (3,3 ′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl). The spacer arm provides an appropriate space between the
前記式（１）において、前記スペーサーアームに隣接するカルボキシ基が、後述する高分子化合物と共有結合することにより、複合体を形成する。 In the formula (1), a carboxy group adjacent to the spacer arm is covalently bonded to a polymer compound described later to form a complex.
前記コプラナーＰＣＢハプテンの製造は、公知の合成方法により行なうことができ、特に限定されるものではないが、例えば下記反応式： The coplanar PCB hapten can be produced by a known synthesis method and is not particularly limited. For example, the following reaction formula:
前記反応式において、出発原料として２，６−ジクロロフェノール（２）を用い、臭素化反応により２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）を得る（工程（ａ））。 In the above reaction formula, 2,6-dichlorophenol (2) is used as a starting material, and 2,6-dichloro-4-bromophenol (3) is obtained by bromination reaction (step (a)).
得られた式（３）の化合物を、塩基の存在下、４−ブロモ酪酸エチル（４）と反応させて、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）を得る（工程（ｂ））。 The resulting compound of formula (3) is reacted with ethyl 4-bromobutyrate (4) in the presence of a base to give ethyl 2,6-dichloro-4-bromophenoxybutyrate (5) (step (b) )).
得られた式（５）の化合物を、触媒（例えば、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム）の存在下、３，５−ジクロロフェニルボロニックアシッド（６）と反応させて、２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）を得る（工程（ｃ））。 The resulting compound of formula (5) is reacted with 3,5-dichlorophenylboronic acid (6) in the presence of a catalyst (eg, tetrakis (triphenylphosphine) palladium) to give 2,6-dichloro-4 -Ethyl (3,5-dichlorophenyl) phenoxybutyrate (7) is obtained (step (c)).
得られた式（７）の化合物をアルカリまたは酸により加水分解して、前記目的化合物（１）を得る（工程（ｄ））。 The obtained compound of formula (7) is hydrolyzed with an alkali or an acid to obtain the target compound (1) (step (d)).
前記各工程における詳細な合成方法は、実施例１に記載している。 A detailed synthesis method in each of the above steps is described in Example 1.
このようにして得られたコプラナーＰＣＢハプテンは、牛血清アルブミン（BSA)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン(OVA) 、スカシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いる。 The coplanar PCB hapten obtained in this way has high concentrations of bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), ovalbumin (OVA), mussel hemocyanin (KLH), thyroglobulin (TG), immunoglobulins and the like. After forming a complex with a molecular compound (protein), it is used as an immunogen.
複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記コプラナーＰＣＢハプテンのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。 The formation method of a composite_body | complex can be performed by a well-known method, and is not specifically limited. For example, a complex can be formed by reacting the carboxy group of the coplanar PCB hapten with the functional group of the polymer compound by a mixed acid anhydride method or an active ester method.
本発明は、前記ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対する抗体を提供する。 The present invention provides an antibody against a coplanar PCB obtained by using a complex of the hapten and a polymer compound as an antigen.
本明細書におけるコプラナーＰＣＢとは、ポリ塩化ビフェニルの塩素の置換位置がノンオルト型またはモノオルト型であって各原子が同一平面上に位置する構造を有するＰＣＢをいう。コプラナーＰＣＢの具体例は、ＩＵＰＡＣ＃で例示すると、ＰＣＢ７７、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９、ＰＣＢ１０５、ＰＣＢ１１１、ＰＣＢ１１４、ＰＣＢ１１８、ＰＣＢ１２３、ＰＣＢ１５６、ＰＣＢ１５７、ＰＣＢ１６７、ＰＣＢ１８９があげられる。本発明においては、ＰＣＢ７７、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１１１、ＰＣＢ１８９、ＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９が好ましく、その抗体が得られていないＰＣＢ８０、ＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９ならびに毒性等価係数（ＴＥＦ）が高いＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９がより好ましい。
The coplanar PCB in this specification refers to a PCB having a structure in which the chlorine substitution position of polychlorinated biphenyl is a non-ortho type or a mono-ortho type, and each atom is located on the same plane. Specific examples of the coplanar PCB include PCB77, PCB80, PCB81, PCB126, PCB169, PCB105, PCB111, PCB114, PCB118, PCB123, PCB156, PCB157, PCB167, and PCB189 when exemplified by IUPAC #. In the present invention, PCB 77,
本発明の抗体は、コプラナーＰＣＢ、特にＰＣＢ８０に対する特異性を有する抗体である。 The antibody of the present invention is an antibody having specificity for coplanar PCB, particularly PCB80.
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含され、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）2 フラグメントなどのように抗原結合性を有する抗体の一部も包含される。これら抗体の中でも、モノクローナル抗体が好ましい。 As used herein, “antibody” includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and also includes a part of an antibody having antigen-binding properties such as Fab fragment and F (ab ′) 2 fragment. Of these antibodies, monoclonal antibodies are preferred.
前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０に対する特異性と他のコプラナーＰＣＢに対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ50値を有することが好ましい。ここでＩＣ50値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。 The monoclonal antibody preferably has the following IC 50 value in order to clarify the specificity for PCB80 and the cross-reactivity for other coplanar PCBs. Here, the IC 50 value refers to the concentration of a specimen exhibiting 50% inhibition when a standard inhibition curve is obtained by indirect competitive ELISA or direct competitive ELISA.
すなわち、本抗体は、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ８０に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。 That is, this antibody preferably has an IC 50 against PCB80 by indirect competition ELISA of 5.0 ng / ml or less, more preferably 3.0 ng / ml or less.
本抗体は、ＰＣＢ１２６を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１２６に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。 In the case where the subject of the present invention is PCB126, the IC 50 against PCB126 by indirect competitive ELISA is preferably 5.0 ng / ml or less, more preferably 3.0 ng / ml or less.
本抗体は、ＰＣＢ１６９を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１６９に対するＩＣ50が３．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。 When PCB 169 is the subject of measurement, this antibody preferably has an IC 50 against PCB 169 by indirect competition ELISA of 3.0 ng / ml or less, more preferably 1.0 ng / ml or less.
本抗体は、ＰＣＢ１１１を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１１１に対するＩＣ50が２５ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。 When PCB 111 is used as the measurement target, the IC 50 for PCB 111 by indirect competition ELISA is preferably 25 ng / ml or less, more preferably 10 ng / ml or less.
本抗体は、ＰＣＢ１８９を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１８９に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。 When PCB189 is used as the measurement target, the present antibody preferably has an IC 50 against PCB189 by indirect competitive ELISA of 5.0 ng / ml or less, more preferably 3.0 ng / ml or less.
前記抗体の製造方法は、公知であり、本発明の抗体も常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000) ）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って前記コプラナーＰＣＢハプテンと高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法に従ってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。 The method for producing the antibody is known, and the antibody of the present invention can also be produced according to a conventional method (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 to 11.13 (2000)). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, a complex of the coplanar PCB hapten and a polymer compound is formed according to a conventional method, and then the complex is applied to a non-human animal such as a rabbit. Immunization can be obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, the complex is immunized to a non-human animal such as a mouse according to a conventional method, and a hybridoma cell prepared by cell fusion of the obtained spleen cell and myeloma cell is screened. It can be obtained by culturing an antibody-producing hybridoma (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 to 11.11).
抗体の調製は、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィーなどの濃縮・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。 The antibody can be prepared by appropriately combining concentration and purification methods such as ultrafiltration, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and affinity chromatography.
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法についてより詳細に説明する。 The present invention also provides a hybridoma that produces the monoclonal antibody. Hereinafter, a method for producing a hybridoma using a mouse will be described in more detail.
以下、Ｂａｌｂ／ｃマウスを例にして説明する。前記のように調製した抗原（免疫原）を２ｍｇ／ｍｌ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）を入れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。マウスのミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００）溶液１ｍｌをゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、さらに含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０5 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗コプラナーＰＣＢ抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。 Hereinafter, a Balb / c mouse will be described as an example. The antigen (immunogen) prepared as described above is dissolved in a physiological phosphate buffer so as to be about 2 mg / ml, mixed with an adjuvant in an equal amount, and then intraperitoneally administered to Balb / c mice. Thereafter, booster immunization is carried out about every 2 weeks. The spleen of the mouse in which the antibody titer in the serum of blood collected from the tail blood vessel has been increased is excised, and the cells are removed from the spleen in a petri dish containing DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium). The medium is transferred to a centrifuge tube, a large piece of tissue is allowed to settle, the supernatant in which the spleen cells are suspended is gently removed, the single cell suspension is centrifuged at low speed, and the cells are collected to prepare spleen cells. Mouse myeloma cells (P3 × 63Ag8.653) are mixed at a cell number ratio of 5: 1 (myeloma cells: spleen cells) and centrifuged at low speed to collect the cells. After loosening the precipitated cells, 1 ml of a 50% polyethylene glycol (molecular weight 1,500) solution warmed to 37 ° C. is slowly added to effect cell fusion. After cell fusion, 9 ml of DMEM medium is added, and 40 ml of fetal bovine serum DMEM medium is further added. The cells collected by centrifugation are suspended by adding HAT medium so that the number of cells becomes 5 × 10 5 cells / ml, and the cell suspension is dispensed into a 96-well plastic plate in an amount of 250 μl / well. Incubate in an incubator at 37 ° C., 5% carbon dioxide and humidified conditions. One week later, half of the medium in the well is replaced with HAT medium and cultured for 10 to 14 days. The activity of the antibody in the culture solution is examined by ELISA, and the hybridoma is cloned by limiting dilution for the cells of the well producing the target antibody. Cloning yields a stable hybridoma strain producing an anti-coplanar PCB antibody.
本発明では、前記方法によりハイブリドーマを作製し、ＰＫ−０Ｔ２、ＰＫ−４Ｎ２等のハイブリドーマ株を樹立した。このうち、ＰＫ−４Ｎ２について、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４０の下、２００４年１月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（郵便番号３０５−００４６、茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。 In the present invention, hybridomas were prepared by the method described above, and hybridoma strains such as PK-0T2 and PK-4N2 were established. Of these, PK-4N2, under the deposit number FERM P-19640, on January 22, 2004, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Postal Code 305-0046, 1-chome East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) No. 1 No. 3).
本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに上述のように精製・濃縮することができる。 The hybridoma of the present invention can be cultured using a medium (for example, DMEM containing 10% fetal bovine serum), and the centrifuged supernatant of the culture solution can be used as a monoclonal antibody solution. In addition, ascites can be generated by injecting the hybridoma into the abdominal cavity of an animal from which the hybridoma is derived, and the obtained ascites can be used as a monoclonal antibody solution. These antibody solutions can be further purified and concentrated as described above.
また、本発明は、前記抗体を含むコプラナーＰＣＢの測定キットに関する。本発明の測定キットは、コプラナーＰＣＢ、好ましくはＰＣＢ８０に特異的に結合する抗体を含むことにより、コプラナーＰＣＢを簡便に測定することができ、後述のコプラナーＰＣＢの測定方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたコプラナーＰＣＢハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／またはコプラナーＰＣＢ標準溶液等を含む。 The present invention also relates to a measurement kit for coplanar PCB containing the antibody. By including an antibody that specifically binds to a coplanar PCB, preferably PCB80, the measurement kit of the present invention can easily measure the coplanar PCB, and can be suitably used in the method for measuring a coplanar PCB described below. it can. The kit further contains a labeled secondary antibody or a labeled coplanar PCB hapten (antigen), a buffer, a detection reagent, and / or a coplanar PCB standard solution, depending on the measurement method.
好ましいキットは、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法または直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものである。直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、本発明のモノクローナル抗体を固相化した担体をさらに含むことが好ましい。この場合、下記直接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。 A preferred kit is one that can be used in the following indirect competitive ELISA method or direct competitive ELISA method. When used in the direct competitive ELISA method, the kit preferably further comprises a carrier on which the monoclonal antibody of the present invention is immobilized. In this case, step (1) of the direct competitive ELISA method described below can be omitted.
間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、さらに固相化抗原を含むものが好ましく、当該固相化抗原を固相化した担体を含むことが好ましい。この場合、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。 When used in the indirect competitive ELISA method, this kit preferably further contains a solid-phased antigen, and preferably contains a carrier on which the solid-phased antigen is solid-phased. In this case, step (1) of the following indirect competitive ELISA method can be omitted.
前記固相化抗原は、本発明の抗体を製造するために用いるハプテンとは異なるハプテンを含むものである。前記固相化抗原のハプテン部分は、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸、または２，４−ジクロロフェニル酢酸であることが好ましい。 The solid-phased antigen contains a hapten different from the hapten used to produce the antibody of the present invention. The hapten portion of the immobilized antigen may be 4- (2,4-dichlorophenoxy) butyric acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-dichlorophenoxypropionic acid, or 2,4-dichlorophenylacetic acid. preferable.
また、前記固相化抗原は、前記固相化抗原用ハプテンと、牛血清アルブミン（BSA)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン(OVA) 、スカシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成することにより得られる。 The solid-phased antigen includes the solid-phased antigen hapten, bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), ovalbumin (OVA), scallop hemocyanin (KLH), thyroglobulin (TG) It is obtained by forming a complex with a polymer compound (protein) such as immunoglobulin.
前記固相化抗原用のハプテンは、公知の方法により合成することができ、市販品を利用することもできる。複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記固相化抗原用ハプテンのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。 The hapten for the solid-phased antigen can be synthesized by a known method, and a commercially available product can also be used. The formation method of a composite_body | complex can be performed by a well-known method, and is not specifically limited. For example, the complex can be formed by reacting the carboxy group of the hapten for immobilized antigen and the functional group of the polymer compound by a mixed acid anhydride method or an active ester method.
固相化抗原用のハプテンとして抗体製造用ハプテンと異なるものを選択することにより、抗体製造用ハプテンと同じものを固相化抗原用のハプテンとして用いてコプラナーＰＣＢを測定した場合と比較して、感度が１〜１５倍上昇する。 By selecting a hapten for an immobilized antigen that is different from the hapten for producing an antibody, the same hapten as the antibody producing hapten is used as a hapten for the immobilized antigen. Sensitivity increases 1 to 15 times.
本発明のキットは、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、前記固相化抗原、固相化抗原を保持する担体、コプラナーＰＣＢ抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含む。 When used in the indirect competitive ELISA method described below, the kit of the present invention includes the above-described immobilized antigen, a carrier holding the immobilized antigen, a coplanar PCB antibody, an enzyme-labeled secondary antibody, a detection reagent, and the like.
さらに、本発明は、前記抗体またはキットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989)) が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。 Furthermore, the present invention relates to a method for measuring a coplanar PCB using the antibody or kit. The measurement method is not particularly limited as long as it uses a normal antigen-antibody reaction. Radioisotope immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence or luminescence assay, aggregation method, Examples include immunoblotting and immunochromatography (Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol. II IRL Press Oxford (1989)), and ELISA is preferred from the viewpoint of sensitivity and simplicity. Examples of the enzyme used for ELISA include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase and the like.
ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。例えば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。 Examples of the measurement method by ELISA include indirect competitive ELISA and direct competitive ELISA. For example, the indirect competition ELISA can be performed by the following procedure.
（１）固相化抗原を担体に固相化する
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
(1) Solid-phased antigen is immobilized on a carrier The carrier to be used is not particularly limited as long as it is a carrier used for ordinary ELISA, but a microtiter plate having 96 holes, 48 holes, 192 holes, etc. is preferable. For immobilization, for example, a buffer containing the immobilization antigen may be placed on a carrier and incubated. The concentration of the antigen in the buffer is usually about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml. As the buffer solution, a known solution can be used according to the detection means.
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする
ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
(2) In order to prevent nonspecific adsorption of proteins to the solid phase surface of the carrier, the solid phase surface portion where the antigen for immobilization is not adsorbed is blocked with a protein unrelated to the antigen. , BSA or skim milk solution, or commercially available Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. Blocking is performed by adding the blocking agent to the carrier and, for example, incubating overnight at about 4 ° C. and then washing with a washing solution. Although there is no restriction | limiting in particular as a washing | cleaning liquid, The same buffer solution as said (1) can be used.
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度のコプラナーＰＣＢを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびコプラナーＰＣＢに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびコプラナーＰＣＢ−抗体複合体を生成させる
反応は、通常４〜３７℃で１〜２時間程度で行うことができる。
(3) Samples containing various concentrations of coplanar PCB and the monoclonal antibody solution of the present invention are added to the solid phase surface treated in (1) and (2), and the antibody competes with the immobilized antigen and coplanar PCB. The reaction to produce a solid-phased antigen-antibody complex and a coplanar PCB-antibody complex can be usually carried out at 4 to 37 ° C. for about 1 to 2 hours.
コプラナーＰＣＢは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、コプラナーＰＣＢを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、ジメチルスルホキシドなどがあげられ、含有量は、５〜５０重量％程度である。 Since the coplanar PCB is insoluble in water, the reaction solution can contain various organic solvents. What is necessary is just to select an organic solvent and its content as the said organic solvent in the range which dissolves coplanar PCB and does not inhibit an antigen-antibody reaction. Specific examples include methanol and dimethyl sulfoxide, and the content is about 5 to 50% by weight.
（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のコプラナーＰＣＢの量を決定することができる
固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（コプラナーＰＣＢ抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えばコプラナーＰＣＢ抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したコプラナーＰＣＢ抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
(4) By measuring the amount of the immobilized antigen-antibody complex, the amount of coplanar PCB in the sample can be determined from a calibration curve prepared in advance. The amount of the immobilized antigen-antibody complex is: An enzyme-labeled secondary antibody (an antibody recognizing a coplanar PCB antibody) can be added for measurement. For example, when a mouse monoclonal antibody is used as a coplanar PCB antibody, it is desirable to react with a coplanar PCB antibody bound to a carrier using an enzyme-labeled (eg, peroxidase or alkaline phosphatase) anti-mouse-goat antibody. The reaction may be performed under the same conditions as in (3) above. After the reaction, wash with buffer.
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からコプラナーＰＣＢの量を算出することができる
二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。
(5) The amount of coplanar PCB can be calculated from the calibration curve by adding a chromogenic substrate solution that reacts with the labeling enzyme of the secondary antibody bound to the carrier, and measuring the absorbance. Peroxidase as the enzyme that binds to the secondary antibody For example, a coloring substrate solution containing hydrogen peroxide and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine can be used. Usually, after adding a chromogenic substrate solution and reacting at room temperature for about 10 minutes, the enzyme reaction is stopped by adding sulfuric acid. When 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine is used, the absorbance at 450 nm is measured. When o-phenylenediamine is used, the absorbance at 492 nm is measured. In order to correct the background value, it is desirable to simultaneously measure the absorbance at 630 nm.
二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。 When alkaline phosphatase is used as the enzyme that binds to the secondary antibody, for example, color development is performed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, the NaOH reaction is added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 415 nm is measured. It is done.
コプラナーＰＣＢを添加しない反応溶液の吸光度に対して、コプラナーＰＣＢを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のコプラナーＰＣＢを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のコプラナーＰＣＢの濃度を算出することができる。 For the absorbance of the reaction solution to which no coplanar PCB is added, the rate of decrease in the absorbance of the solution reacted with the antibody by adding coplanar PCB is calculated as the inhibition rate. The concentration of coplanar PCB in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the inhibition rate of the reaction solution to which coplanar PCB of known concentration is added.
別の態様として、コプラナーＰＣＢの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡによって行うこともできる。 In another embodiment, the coplanar PCB can be measured by a direct competitive ELISA using, for example, the monoclonal antibody of the present invention as described below.
（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する
用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
(1) Immobilizing the monoclonal antibody of the present invention on a carrier The carrier used is preferably a microtiter plate having 96 holes, 48 holes, 192 holes or the like. For immobilization, for example, a buffer containing the immobilization antibody may be placed on a carrier and incubated. The concentration of the antibody in the buffer is usually about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml. As the buffer solution, a known solution can be used according to the detection means.
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする
ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
(2) In order to prevent non-specific adsorption of proteins to the solid phase surface of the carrier, the solid phase surface portion to which the antibody for solid phase immobilization is not adsorbed is blocked with a protein unrelated to the antibody. , BSA or skim milk solution, or commercially available Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. Blocking is performed by adding the blocking agent to the carrier and, for example, incubating overnight at about 4 ° C. and then washing with a washing solution. Although there is no restriction | limiting in particular as a washing | cleaning liquid, The same buffer solution as said (1) can be used.
（３）各種濃度のコプラナーＰＣＢを含む試料に、コプラナーＰＣＢハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する
酵素結合ハプテンの調製は、コプラナーＰＣＢハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
(3) Prepare a mixture of coplanar PCB hapten and enzyme-bound hapten combined with coplanar PCB hapten and sample containing various concentrations of coplanar PCB. The enzyme-bound hapten may be prepared by binding coplanar PCB hapten to enzyme. Any method may be used without particular limitation.
（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる
コプラナーＰＣＢと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。
(4) The mixture of step (3) is reacted with the antibody-immobilized carrier obtained in step (2). By the competitive inhibition reaction between coplanar PCB and enzyme-bound hapten, the complex of these and the immobilized carrier is formed. Generate. The reaction is carried out, for example, at about 25 ° C. for about 1 hour. After completion of the reaction, the carrier is washed with a buffer to remove the enzyme-bound hapten that did not bind to the immobilized antibody.
固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のコプラナーＰＣＢの量を決定する。 By measuring the amount of the immobilized antibody-enzyme linked hapten complex, the amount of coplanar PCB in the sample is determined from a calibration curve prepared in advance.
本工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からコプラナーＰＣＢの量を算出することができる。 In this step, the amount of coplanar PCB can be calculated from the calibration curve by adding a chromogenic substrate solution that reacts with the enzyme of the enzyme-bound hapten in the same manner as in the indirect competitive inhibition ELISA method described above and measuring the absorbance.
前記本発明の測定方法においては、測定対象物に応じた前処理をして試料とした後、前記間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡの工程（３）に供せられる。 In the measurement method of the present invention, the sample is pretreated according to the object to be measured to be used as a sample, and then subjected to the step (3) of the indirect competitive ELISA or direct competitive ELISA.
測定対象物が土壌または食品の場合、コプラナーＰＣＢが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノールに転溶させて緩衝液で希釈後、測定試料にする。簡便法として、メタノールで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。具体的には、例えば試料５ｇに、メタノール５ｍｌを加えて２０分間振とうする。室温で３０分間静置した後、抽出物の上層２ｍｌを２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を蒸留水で１：４に希釈し、これを前記工程（３）に供する。 When the measurement object is soil or food, all methods that can be extracted by the coplanar PCB can be used. The extract is dissolved in methanol, diluted with a buffer solution, and used as a measurement sample. As a simple method, a sample extracted with methanol and diluted with a buffer can be used as it is. Specifically, for example, 5 ml of methanol is added to 5 g of a sample and shaken for 20 minutes. After standing at room temperature for 30 minutes, the upper 2 ml of the extract is centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. The supernatant is diluted 1: 4 with distilled water and subjected to step (3).
測定対象物が環境水の場合、抽出工程を必要とせず、直接測定試料とすることが可能である。 When the measurement object is environmental water, an extraction step is not required and it can be directly used as a measurement sample.
本発明のモノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２を用いて、以下のようなコプラナーＰＣＢ群の測定方法を実施することができる。ＰＫ−０Ｔ２は、ＰＣＢ８０に対してＩＣ50値が２. ６ｎｇ／ｍｌと高感度に反応するのに対して、他のＰＣＢ、例えばＰＣＢ７７、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９およびＰＣＢ１８９とは全く反応しないことから、本抗体を用いることによって今までイムノアッセイによる測定法のなかったＰＣＢ８０の特異的かつ高感度測定を実施することができる。
Using the monoclonal antibodies PK-0T2 and PK-4N2 of the present invention, the following method for measuring coplanar PCBs can be carried out. PK-0T2, since the relative an IC 50 value is 2. react to 6 ng / ml and sensitive to
一方、ＰＫ−４Ｎ２を用いることによって、ＰＣＢ８０に対してＩＣ50値が０. ４６ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１２６に対してＩＣ50値が２. ３ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１６９に対してＩＣ50値が０. ６３ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１１１に対してＩＣ50値が２. ２ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１８９に対してＩＣ50値が１．９ｎｇ／ｍｌと、５種類のコプラナーＰＣＢのグループ特異的かつ高感度測定を実施することができる。また、ＰＫ−０Ｔ２とＰＫ−４Ｎ２とを適宜組み合わせて、感度と特異性の相違に基づいて分別することが可能である。 On the other hand, PK-4N2 by using, an IC 50 value with respect to an IC 50 value is 0. 46ng / ml, PCB126 respect PCB80 is 2. The IC 50 values against 3ng / ml, PCB169 is 0. 63 ng / With a IC 50 value of 2.2 ng / ml for ml and PCB111, and an IC 50 value of 1.9 ng / ml for PCB189, group-specific and highly sensitive measurement of five types of coplanar PCBs can be performed. . Further, PK-0T2 and PK-4N2 can be appropriately combined, and can be sorted based on differences in sensitivity and specificity.
［実施例］
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
[Example]
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and these are included in the technical scope of the present invention.
実施例１
（ａ）２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）の合成
２，６−ジクロロフェノール（２）３．２６ｇ（２０ミリモル）を酢酸２０ｍ lに溶解し、室温攪拌下に臭素３．３６ｇ（２１ミリモル）を滴下した。得られた混合物を９０℃で５時間加熱攪拌した後、反応混合物を減圧下に濃縮した。得られた残渣を水中に注ぎ込み、酢酸エチル７０ｍｌで抽出した。酢酸エチル抽出液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗結晶をｎ−へキサンから再結晶して、標記目的化合物４．０７ｇ（収率８４％）を得た。
Example 1
(A) Synthesis of 2,6-dichloro-4-bromophenol (3) 3.26 g (20 mmol) of 2,6-dichlorophenol (2) was dissolved in 20 ml of acetic acid, and 3.36 g of bromine was stirred at room temperature. (21 mmol) was added dropwise. The obtained mixture was heated and stirred at 90 ° C. for 5 hours, and then the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was poured into water and extracted with 70 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was washed successively with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The crude crystals obtained after the distillation were recrystallized from n-hexane to obtain 4.07 g (yield 84%) of the title object compound.
（ｂ）２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）の合成
２００ｍｌのナスフラスコに、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）２．４２ｇ（１０ミリモル）、４−ブロモ酪酸エチル（４）１．９５ｇ（１０ミリモル）、炭酸カリウム１．３８ｇ（１０ミリモル）およびアセトニトリル５０ｍｌを加え、５時間還流した。反応混合物を減圧下に濃縮した。得られた残渣を水中に注ぎ込み、酢酸エチル７０ｍｌで抽出した。酢酸エチル抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−へキサン／酢酸エチル＝２０／１〜１５／１）で精製することにより、標記目的化合物２．６４ｇ（収率７４％）を得た。
(B) Synthesis of ethyl 2,6-dichloro-4-bromophenoxybutyrate (5)
In a 200 ml eggplant flask, 2.42 g (10 mmol) of 2,6-dichloro-4-bromophenol (3), 1.95 g (10 mmol) of ethyl 4-bromobutyrate (4), 1.38 g of potassium carbonate (10 Mmol) and 50 ml of acetonitrile were added and refluxed for 5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was poured into water and extracted with 70 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was washed successively with water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The crude product obtained after the distillation was purified by silica gel column chromatography (n-hexane / ethyl acetate = 20/1 to 15/1) to obtain 2.64 g (yield 74%) of the title object compound. Obtained.
（ｃ）２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）の合成
１００ｍｌのナスフラスコに、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）１．７８ｇ（５ミリモル）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．２ｇ（O ．１７３ミリモル）、炭酸ナトリウム１．０６ｇ（１０ミリモル）を水５ｍｌに溶解した液およびベンゼン１０ｍｌを加えた。この混合物に、３，５−ジクロロフェニルボロニックアシッド（６）０．９５ｇ（５ミリモル）をメタノール５ｍｌに溶解した液を加え、１５時間還流した。反応混合物に飽和食塩水３０ｍ１を加え、ジエチルエーテル３０ｍｌで２回抽出した。エーテル抽出液を合わせ、これを無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。留去後に得られた粕生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−へキサン／酢酸エチル＝１５／１〜１０／１）で精製することにより、標記目的化合物１−８６ｇ（収率８８％）を得た。
(C) Synthesis of ethyl 2,6-dichloro-4- (3,5-dichlorophenyl) phenoxybutyrate (7) In a 100 ml eggplant flask, 1.78 g of ethyl 2,6-dichloro-4-bromophenoxybutyrate (5) (5 mmol), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) 0.2 g (O.173 mmol), sodium carbonate 1.06 g (10 mmol) dissolved in
（ｄ）２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸（１）の合成
２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）０．８４ｇ（２ミリモル）をエタノール７ｍｌに溶解した液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液８ｇ（４ミリモル）を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ込み、１Ｎ−塩酸を用いて酸性（ｐＨ１）とした後、酢酸エチル３０ｍ lで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、これを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗結晶を酢酸エチル／ｎ−へキサンから再結晶して、標記目的化合物０．４９ｇ（収率６２％）を得た。
(D) Synthesis of 2,6-dichloro-4- (3,5-dichlorophenyl) phenoxybutyric acid (1) 0.84 g of ethyl 2,6-dichloro-4- (3,5-dichlorophenyl) phenoxybutyrate (7) 2 mmol) was dissolved in 7 ml of ethanol, 8 g (4 mmol) of a 20% aqueous sodium hydroxide solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was poured into ice water, acidified with 1N hydrochloric acid (pH 1), and extracted twice with 30 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were combined, washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The crude crystals obtained after the distillation were recrystallized from ethyl acetate / n-hexane to obtain 0.49 g (yield 62%) of the title object compound.
実施例２（免疫原の調製）
免疫原としてスカシ貝へモシアニン（ＫＬＨ）と本発明ＰＣＢハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
Example 2 (Preparation of immunogen)
As an immunogen, a conjugate of scallop hemocyanin (KLH) and the PCB hapten of the present invention was prepared using an active ester method.
実施例１で製造した２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸（ＰＣＢハプテン）９．４５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．８８ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）−カルボジイミド塩酸塩４．７９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．５ｍｌに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に一晩放置した。 2.45 mg of 2,6-dichloro-4- (3,5-dichlorophenyl) phenoxybutyric acid (PCB hapten) prepared in Example 1, 2.88 mg of N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylamino) Provir) -carbodiimide hydrochloride (4.79 mg) was dissolved in 1.5 ml of N, N-dimethylformamide, and the solution was left in the dark at 25 ° C. overnight.
別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）２ｍｌにKLH を１５０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＫＬＨ溶液としておいた。 Separately, 150 mg of KLH was added to 2 ml of 0.1 M borate buffer (pH 9.2), and the mixture was stirred overnight to obtain a KLH solution.
このＫＬＨ溶液に、先に調製したＰＣＢハプテン溶液を徐々に滴下し、４℃で３時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、−３０℃で貯蔵した。上記のようにして得られたＰＣＢハプテンとＫＬＨとの結合体を免疫原として使用した。 To this KLH solution, the previously prepared PCB hapten solution was gradually added dropwise and stirred at 4 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, the mixture was dialyzed against physiological phosphate buffer (PBS, 10 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 7.0) at 4 ° C. overnight and stored at −30 ° C. The conjugate of PCB hapten and KLH obtained as described above was used as an immunogen.
実施例３（固相化抗原の調製）
固相化抗原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸（２，４−ＤＢ）との結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
Example 3 (Preparation of immobilized antigen)
A conjugate of bovine serum albumin (BSA) and 4- (2,4-dichlorophenoxy) butyric acid (2,4-DB) as a solid-phased antigen was prepared using the active ester method.
２，４−ＤＢ６．２７ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．８８ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩４．７９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．５ｍｌに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に一晩放置した。別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）２ｍｌにＢＳＡを５０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＢＳＡ溶液としておいた。 2,4-DB 6.27 mg, N-hydroxysuccinimide 2.88 mg and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride 4.79 mg were dissolved in 1.5 ml of N, N-dimethylformamide. The solution was left in the dark at 25 ° C. overnight. Separately, 50 mg of BSA was added to 2 ml of 0.1 M borate buffer (pH 9.2), and stirred overnight to form a BSA solution.
このＢＳＡ溶液に、先に調製した２，４−ＤＢ溶液を徐々に滴下し、４℃で３時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ．ｐＨ７，０）に対して透析した後、−３０℃で貯蔵した。このようにして得られた２，４−ＤＢとＢＳＡとの結合体を固相化抗原として使用した。 To this BSA solution, the previously prepared 2,4-DB solution was gradually added dropwise and stirred at 4 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, the mixture was dialyzed against physiological phosphate buffer (PBS, 10 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl. PH 7,0) at 4 ° C. overnight and stored at −30 ° C. The conjugate of 2,4-DB and BSA thus obtained was used as an immobilized antigen.
実施例４（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫原を２ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量のアジュバント（商品名：Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ ＣｙｔＲｘ Ｃｏ製）を混合した。この混合物１００μ１を、４〜５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与した。その後、上記と同様の手順で、アジュバント（商品名：Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ ＣｙｔＲｘ Ｃｏ製）と等量混合した０．５ｍｇ／ｍｌの免疫原１００μｌを２週間毎に追加免疫した。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を入れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミで傷をつけ、注射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を取り出した。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させるために５分間静置した。脾細胞が浮遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を集め、脾細胞を調製した。
Example 4 (Production of monoclonal antibody-producing hybridoma)
The immunogen prepared in Example 2 was dissolved in PBS to 2 mg / ml, and an equal amount of adjuvant (trade name: manufactured by Titer Max Gold CytRx Co) was mixed therewith. 100 μl of this mixture was administered intraperitoneally to 4-5 week old female Balb / c mice. Thereafter, 100 μl of an immunogen of 0.5 mg / ml mixed with an adjuvant (trade name: manufactured by Titer Max Gold CytRx Co) in an equal amount was boosted every two weeks by the same procedure as described above. The spleen of a mouse with high antibody titer in blood serum collected from the tail blood vessel was removed, and the spleen removed in a petri dish containing Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM medium) was scratched with scissors The medium was injected into the spleen to remove the cells. The medium was transferred to a centrifuge tube and allowed to stand for 5 minutes to allow large tissue pieces to settle. The supernatant in which the spleen cells were suspended was gently taken, and the single cell suspension was centrifuged at 1250 rpm for 5 minutes to collect the cells, thereby preparing spleen cells.
マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾細胞）になるように脾細胞と混合し、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞を集めた。上清を除去し、遠心管をはじいて沈殿した細胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液１ｍｌを６０秒かけてゆっくり加え、細胞融合を行った。次いで、ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、更にウシ胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加した。遠心分離によって集められた細胞を、細胞数が５×１０5 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えた。細胞懸濁液を９６穴細胞培養プレートに２５０μｌ／ウェルの量を分注して、３７℃にて５％二酸化炭素の気相中でインキュベーションした。 Mouse myeloma cells (P3X63Ag8.653) were mixed with spleen cells at a cell ratio of 5: 1 (myeloma cells: spleen cells), and the cells were collected by centrifugation at 300 × g for 5 minutes. The supernatant was removed, and the precipitated cells were loosened by removing the centrifuge tube. Then, 1 ml of a 50% polyethylene glycol (molecular weight 1500) solution warmed to 37 ° C. was slowly added over 60 seconds to perform cell fusion. Next, 9 ml of DMEM medium was added, and 40 ml of DMEM medium containing 10% fetal calf serum was further added. HAT medium was added to the cells collected by centrifugation so that the number of cells was 5 × 10 5 cells / ml. The cell suspension was dispensed into a 96-well cell culture plate in an amount of 250 μl / well and incubated at 37 ° C. in a gas phase of 5% carbon dioxide.
１週間後、ウェル中の培地の半量を新鮮なＨＡＴ培地で置換して、１２日間培養した。培養上清中の抗体の活性をＥＬＩＳＡ法で調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、９６穴細胞培養プレートで、１０％ウシ胎児血清と８μｇ／ｍｌのインシュリンを含むＨＡＴ培地を用い、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを２度行った。クローニングした結果、最終的に抗ＰＣＢ抗体を産生する安定なハイブリドーマ２株を得た。このうち１つの株をＰＫ−０Ｔ２と名付け、他の１つの株をＰＫ−４Ｎ２と名付けた。 One week later, half of the medium in the well was replaced with fresh HAT medium and cultured for 12 days. The activity of the antibody in the culture supernatant is examined by ELISA, and the cells in the well producing the target antibody are HAT medium containing 10% fetal bovine serum and 8 μg / ml insulin in a 96-well cell culture plate. The hybridoma was cloned twice by the limiting dilution method. As a result of cloning, two stable hybridoma strains finally producing anti-PCB antibodies were obtained. Among these, one strain was named PK-0T2, and the other one was named PK-4N2.
実施例５（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ２株（ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。培養上清をモノクローナル抗体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液」、「モノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液」とした。調製したモノクローナル抗体溶液は、間接競合ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として用い、３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）との反応性を調べた。
Example 5 (Preparation of monoclonal antibody)
The hybridoma 2 strains (PK-0T2 and PK-4N2) obtained in Example 4 were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. The culture supernatant was used as a monoclonal antibody solution, which was designated as “monoclonal antibody PK-0T2 solution” and “monoclonal antibody PK-4N2 solution”, respectively. The prepared monoclonal antibody solution was used as a primary antibody of the indirect competitive ELISA method, and the reactivity with 3,3 ′, 5,5′-biphenyl tetrachloride (PCB80) was examined.
実施例６（間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定）
（１）９６穴マイクロプレートに２，４−ＤＢとＢＳＡとの結合体（３μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルとなるように加え、４℃で一晩インキュベーションしてプレートに吸着させた。ＰＢＳで４回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ、大日本製薬（株）製）溶液を２５０μ１／ウェルとなるように加え、４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄した。
Example 6 (Measurement of PCB80 by indirect competitive ELISA method)
(1) A conjugate of 2,4-DB and BSA (3 μg / ml) was added to a 96-well microplate at 100 μl / well and incubated overnight at 4 ° C. for adsorption onto the plate. After washing 4 times with PBS, Block Ace (Block-Ace, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted 4-fold with PBS was added to 250 μ1 / well and incubated at 4 ° C. overnight. Washed.
（２）モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液またはモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液をＰＢＳ（ｐＨ８．０）で２倍希釈した溶液とＰＣＢ８０標準溶液の各々５０μｌをウェルに加え、ＰＫ−０Ｔ２は２５℃で１時間、ＰＫ−４Ｎ２は４℃で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄した。 (2) 50 μl each of a solution obtained by diluting a monoclonal antibody PK-0T2 solution or a monoclonal antibody PK-4N2 solution twice with PBS (pH 8.0) and a PCB80 standard solution are added to the wells, and PK-0T2 is added at 25 ° C. for 1 hour. , PK-4N2 was incubated at 4 ° C. for 2 hours, and then the plate was washed.
（３）西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）をＰＢＳで２０００倍に希釈し、該希釈液１００μｌをウェルに加え、２５℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄した。 (3) An anti-mouse IgG goat antibody (secondary antibody) conjugated with horseradish peroxidase was diluted 2000 times with PBS, 100 μl of the diluted solution was added to the well, incubated at 25 ° C. for 1 hour, and then the plate was washed. .
（４）０．２％のｏ−フェニレンジアミン発色溶液（１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．００３％過酸化水素水）１００μｌをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、４Ｎ硫酸５０μｌをウェルに加えて酵素反応を止め、４９２ｎｍおよび６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 (4) 100 μl of 0.2% o-phenylenediamine coloring solution (100 mM phosphate citrate buffer (pH 5.0), 0.003% hydrogen peroxide solution) was added to the well and incubated at 25 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 50 μl of 4N sulfuric acid was added to the well to stop the enzyme reaction, and absorbance at 492 nm and 630 nm was measured with a microplate reader.
好適には、上記の（２）に記載の工程において、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液の１０００倍希釈溶液またはモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液の５００倍希釈溶液と、メタノールに溶解したＰＣＢ８０標準溶液を５０ｎｇ／ｍｌから２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含む蒸留水で段階的に希釈した溶液をウェルに加え、二次抗体を２０００倍希釈したものを用いて、吸光度を測定した。Ｂ／Ｂｏ（％）を次式により算出した。
Ｂ／Ｂｏ（％）＝（ＰＣＢ８０標準溶液の吸光度）／（コントロールの吸光度）×100
モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図１に示す。モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定可能な範囲は０．７ｎｇ／ｍｌ〜７．０ｎｇ／ｍｌであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ50値）は２．６ｎｇ／ｍｌであった。また、モノクロ−ナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定可能な範囲は０．１５ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ50値）は０．４６ｎｇ／ｍｌであった。
Preferably, in the step described in (2) above, a 1000-fold diluted solution of the monoclonal antibody PK-0T2 solution or a 500-fold diluted solution of the monoclonal antibody PK-4N2 solution and a
B / Bo (%) = (absorbance of
The standard inhibition curve of PCB80 for the monoclonal antibody PK-0T2 solution and the standard inhibition curve of PCB80 for the monoclonal antibody PK-4N2 solution are shown in FIG. The measurable range of PCB80 by the indirect competition ELISA method using the monoclonal antibody PK-0T2 solution is 0.7 ng / ml to 7.0 ng / ml, and the value indicating 50% inhibition (IC 50 value) is 2.6 ng. / Ml. Moreover, the measurable range of PCB80 by indirect competitive ELISA using a monoclonal antibody PK-4N2 solution is 0.15 ng / ml to 1.5 ng / ml, and a value indicating 50% inhibition (IC 50 value) Was 0.46 ng / ml.
実施例７（抗体のメタノールに対する耐性）
ＰＣＢ８０希釈液におけるメタノール濃度に対するモノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液の耐性を調べた。
Example 7 (resistance of antibody to methanol)
The resistance of the monoclonal antibody PK-0T2 solution and the monoclonal antibody PK-4N2 solution to the methanol concentration in the
ＰＣＢ８０標準溶液を１０％〜１００％のメタノールを含む蒸留水で希釈したものを用い、上記実施例６と同様にしてＰＣＢ８０の標準阻害曲線を作成した。 A standard inhibition curve of PCB80 was prepared in the same manner as in Example 6 above using a PCB80 standard solution diluted with distilled water containing 10% to 100% methanol.
モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図２に、モノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図３に示す。 The standard inhibition curve of PCB80 for the monoclonal antibody PK-0T2 solution is shown in FIG. 2, and the standard inhibition curve of PCB80 for the monoclonal antibody PK-4N2 solution is shown in FIG.
図２および図３から明らかなように、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液は、１０％〜３０％のメタノールでは反応性に変化がなく、メタノールに対して耐性を有していることが明らかになつた。また、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液は、４０％のメタノールでも反応性に変化がなく、メタノールに対する耐性に優れていた。 As is clear from FIG. 2 and FIG. 3, the monoclonal antibody PK-0T2 solution and the monoclonal antibody PK-4N2 solution have no change in reactivity at 10% to 30% methanol and are resistant to methanol. It became clear that there was. Further, the monoclonal antibody PK-0T2 solution had no change in reactivity even with 40% methanol, and was excellent in resistance to methanol.
以上の結果から、本発明のコプラナーＰＣＢハプテンを用いて得られるモノクローナル抗体を使用する間接競合ＥＬＩＳＡ法により、コプラナーＰＣＢ分析の大幅な簡略化および測定時間の短縮が可能となり、多数の検体を迅速、簡便且つ低コストで測定できることがわかる。 From the above results, the indirect competitive ELISA method using the monoclonal antibody obtained by using the coplanar PCB hapten of the present invention can greatly simplify the coplanar PCB analysis and shorten the measurement time. It turns out that it can measure simply and at low cost.
実施例８（抗体のコプラナーＰＣＢ構造類似化合物に対する交差反応性）
ＰＣＢ８０と化学構造が類似している化合物について抗体ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例６に記載の方法と同様にして試験化合物のIC50値を求め、次式により計算した。
Example 8 (Cross-reactivity of antibody to coplanar PCB structure analog)
The cross-reactivity of antibodies PK-0T2 and PK-4N2 was examined for compounds similar in chemical structure to PCB80. The cross-reactivity was calculated according to the following formula after obtaining the IC 50 value of the test compound in the same manner as described in Example 6.
交差反応率（％）＝（ＰＣＢ８０のIC50値/ 試験化合物のIC50値）×100
上記式を用いて交差反応率を算出した結果を表１に示す。
Cross-reactivity rate (%) = (IC 50 values IC 50 values / test compound PCB 80) × 100
The results of calculating the cross-reaction rate using the above formula are shown in Table 1.
Claims (12)
A method for measuring a coplanar PCB, comprising using the kit according to claim 8.
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