KR20030094547A - A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell - Google Patents
A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030094547A KR20030094547A KR1020020031337A KR20020031337A KR20030094547A KR 20030094547 A KR20030094547 A KR 20030094547A KR 1020020031337 A KR1020020031337 A KR 1020020031337A KR 20020031337 A KR20020031337 A KR 20020031337A KR 20030094547 A KR20030094547 A KR 20030094547A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antibody
- hybridoma
- marker
- solution
- antigen
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Abstract
Description
본 발명은 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별을 위한 모노클로날 항체 스크리닝 방법 및 하이브리도마 선별용 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 표식인자-항원 결합체 용액과 검출하고자 하는 항체를생산하는 하이브리도마의 배양액을 혼합한 용액에 상기 항체를 특이적으로 포획하는 분자를 라인으로 도말한 테스트 스트립을 넣어 반응시킴으로써, 다양한 종류의 모노클노날 항체를 생산하는 다양한 하이브리도마 세포를 매우 간편하고 신속하고 정확하게 선별할 수 있는 하이브리도마 세포주의 스크리닝 방법 및 이 방법을 이용하는 하이브리도마 선별용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a monoclonal antibody screening method for the selection of hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies and a kit for hybridoma selection. More specifically, in the present invention, a test strip in which a molecule that specifically captures the antibody is mixed into a solution obtained by mixing a marker factor-antigen conjugate solution and a culture medium of a hybridoma producing the antibody to be detected. By reacting, the present invention relates to a method for screening hybridoma cell lines capable of selecting a variety of hybridoma cells that produce various kinds of monoclonal antibodies, very simply, quickly and accurately, and a kit for hybridoma selection using the method.
1975년, 콜러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)에 의하여 마우스의 하이브리도마(hybridoma)로부터 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 생산하는 기술이 개발된 이후로, 모노클로날 항체는 기초 생의학적 연구뿐만 아니라, 암 또는 전염병과 같은 질병의 진단 및 치료 과정에 광범위하게 사용되어 왔다. 즉, 모노클로날 항체는 질병 연구를 수행하고 있는 많은 과학자들이 사용하고 있는 중요하면서도 강력한 연구수단으로, 많은 의학적 진보를 초래하였다.Since the development of monoclonal antibodies from hybridomas in mice by Kohler and Milstein in 1975, monoclonal antibodies have been the basis for biomedical research. In addition to research, it has been widely used in the diagnosis and treatment of diseases such as cancer or infectious diseases. In other words, monoclonal antibodies are an important and powerful research tool used by many scientists conducting disease research, resulting in many medical advances.
모노클로날 항체는 다음 과정을 거쳐 제조된다. 먼저, 동물, 통상 마우스에 항원을 주사하여 면역하고; 그것의 비장으로부터 면역한 항원에 대한 항체를 생산하는 면역세포를 획득하고; 상기 획득한 면역세포를 계속적으로 세포분열하는 종양세포와 융합시켜 영구적으로 세포분열하는 하이브리도마를 제조하고; 상기 하이브리도마 세포주로부터 목적하는 항원 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하고; 상기 선별된 하이브리도마를 배양하여 모노클로날 항체를 획득하는 것이다.Monoclonal antibodies are prepared by the following procedure. First, an animal, usually a mouse, is immunized by injecting an antigen; Obtaining immune cells producing antibodies against antigens immunized from its spleen; Producing a hybridoma for permanent cell division by fusing the obtained immune cells with tumor cells that continuously divide; Selecting hybridomas that produce the desired antigen-specific antibody from the hybridoma cell line; The selected hybridomas are cultured to obtain monoclonal antibodies.
상기와 같은 과정에 의하여 제조된 하이브리도마가 모두 목적하는 항체를 생산할 수 있는 것은 아니다. 즉, 제조된 하이브리도마 클론 중 항체를 생산하는 하이브리도마일 가능성은 500분의 1 수준으로 매우 낮다. 현재, 약제 선택적 방법에의하여 융합이 일어나지 않은 세포들을 일차적으로 제거한 다음, 생장하고 있는 모든 하이브리도마의 배양 상등액을 대상으로 하나의 하이브리도마 당 1000∼2000 웰(well)을 테스트하는 하이브리도마 선별방법이 이용되고 있는데, 이러한 방법은 비교적 오랜 시간이 소요될 뿐만 아니라 복잡한 노동 집약적 과정이다.Not all hybridomas prepared by the above process can produce the desired antibody. In other words, the likelihood of producing hybridomas in the hybridoma clones produced is very low, at a level of 1/5. Currently, hybridomas are tested by 1000 to 2000 wells per hybridoma against primary culture supernatants of all hybridomas that have not been fused by drug-selective methods. Screening methods are used, which are relatively time consuming and are complex labor-intensive processes.
따라서, 모노클로날 항체를 스크리닝할 수 있는 효율적인 방법을 개발하는 것은 모노클로날 항체를 생산하는 양성의 하이브리도마 클론을 동정하는 작업을 단순화시킬 수 있으며, 선택된 하이브리도마 클론을 유지하는데 드는 노동력을 감소시킬 수 있는 것이다.Therefore, developing an efficient method for screening monoclonal antibodies can simplify the task of identifying positive hybridoma clones that produce monoclonal antibodies, and the labor required to maintain selected hybridoma clones. Can be reduced.
좋은 스크리닝 방법은 첫째, 스크리닝 과정이 짧아야 한다. 하이브리도마가 과잉생장하지 않도록 보호하기 위하여 24시간 안에 양성 클론을 동정하여야 하는데, 이는 대부분의 하이브리도마 세포가 대체로 같은 생장률로 자라기 때문이다. 둘째, 스크리닝 과정이 쉽고 단순해야 한다. 일반적으로, 성공적인 융합은 융합 1회 당 1000개 이상의 클론을 생산하므로, 모든 웰에 대하여 수행할 수 있을 만큼 테스트 과정이 충분히 쉬워야 한다. 셋째, 스크리닝된 클론들은 EIA, 웨스턴 블럿 및 면역 침전법(immune precipitation) 등 어떤 종류의 테스트 방법에서도 사용될 수 있는 응용가능성을 갖추어야 한다.Good screening methods firstly, the screening process should be short. Positive clones should be identified within 24 hours to protect the hybridomas from overgrowing, since most hybridoma cells grow at approximately the same growth rate. Second, the screening process should be easy and simple. In general, successful fusions produce more than 1000 clones per fusion, so the test procedure should be easy enough to perform for all wells. Third, screened clones must have applicability that can be used in any type of test method, such as EIA, Western blot and immuno precipitation.
항체 포획 분석(antibody capture assay), 항원 포획 분석(antigen capture assay) 및 기능적 스크리닝(functional screening) 방법 등이 하이브리도마의 동정을 위한 방법으로 알려져 있는데, 최근에는 항체 또는 항원 포획 분석법이 많이 이용되고 있다. 그중, 널리 이용되고 있는 항체 포획 분석 방법인 효소면역분석법(Enzyme-ImmunoAssay, EIA)은 다음의 순차적인 과정; 항원 또는 항체를 고상(solid phase)에 부착하고, 하이브리도마 배양액 내에 존재하는 항체 및 하기의 효소에 의하여 발색하는 표식인자로 라벨링된 항원을 각각 상기 고상에 부착된 항원과 결합시키고, 결합하지 않은 항체 또는 결합하지 않은 라벨링된 항원을 세척하여 제거한 다음, 결합된 항원 또는 항원과 결합된 항원 또는 항체를 특이적으로 인식하는 이차 용제(secondary reagent)를 처리하여 검출하는 것이다. 이 방법은 6시간 이상의 긴 시간이 소요되고, 세척기 또는 EIA reader와 같은 고가의 장비가 필요하여 그 이용에 어려움이 있어 왔다.Antibody capture assays, antigen capture assays, and functional screening methods are known to identify hybridomas. Recently, antibody or antigen capture assays have been widely used. have. Among them, Enzyme-ImmunoAssay (EIA), which is a widely used antibody capture assay, includes the following sequential processes; The antigen or antibody is attached to the solid phase, and the antigens labeled with the antibodies present in the hybridoma culture and the markers developed by the following enzymes are respectively bound to the antigens attached to the solid phase and not bound. The antibody or unbound labeled antigen is washed and removed, and then detected by treating a bound antigen or a secondary reagent that specifically recognizes the antigen or antibody bound with the antigen. This method takes a long time of 6 hours or more and requires expensive equipment such as a washing machine or an EIA reader.
이에, 본 발명자들은 상기와 같이 시간 및 노동력이 많이 소모되고 고가의 장비가 필요하여 제한적으로 이용되어 온 기존의 모노클로날 항체 검출 방법상의 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 멤브레인상에 검출하고자 하는 항체를 포획할 수 있는 물질을 라인으로 도말하여 테스트 스트립을 제조하고, 표식인자-항원 결합체 용액과 검출하고자 하는 하이브리도마 배양액을 혼합한 용액에 상기 테스트 스트립을 넣어 준 후 검출 밴드의 생성 유무를 확인하여 검색하는 본 발명 모노클로날 항체 스크리닝 방법이, 별도의 특별한 장비 없이도 5분 이내에 하이브리도마가 생산하는 목적 항체들을 유의성 있게 검출할 수 있고, 특히 다양한 종류의 모노클로날 항체를 생산하는 다양한 하이브리도마 세포주를 간편하게 검색할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the inventors of the present invention have been studied to solve the problems of the conventional monoclonal antibody detection method, which has been used in a limited manner because it requires a lot of time and labor and requires expensive equipment. A test strip was prepared by smearing a substance capable of capturing the antibody with a line, and the test strip was placed in a mixture of the marker-antigen conjugate solution and the hybridoma culture to be detected, and then the detection band was generated. The monoclonal antibody screening method of the present invention, which identifies and searches, can significantly detect target antibodies produced by hybridomas within 5 minutes without any special equipment, and in particular, produces various kinds of monoclonal antibodies. We found that hybridoma cell lines can be easily searched, A has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하기 위한 모노클로날 항체의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for screening monoclonal antibodies for selecting hybridomas producing monoclonal antibodies.
본 발명의 다른 목적은 상기 모노클로날 항체의 스크리닝 방법을 이용하는 하이브리도마 선별용 키트를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma screening kit using the screening method of the monoclonal antibody.
도 1은 본 발명 하이브리도마 선별용 키트의 테스트 스트립의 구성을 보이는 그림이다.1 is a view showing the configuration of a test strip of the hybridoma screening kit of the present invention.
도 2는 하이브리도마 세포주의 선별을 위한 본 발명 모노클로날 항체 스크리닝 방법에 사용되는 테스트 플레이트, 테스트 스트립 및 시약을 보이는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing test plates, test strips and reagents used in the present monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell lines.
도 3은 간염바이러스 표면 항원 HbS Ag에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 진단하기 위한 본 발명 모노클로날 항체 스크리닝 결과를 나타내는 밴드 사진이다.Figure 3 is a band photograph showing the results of the present invention monoclonal antibody screening for diagnosing hybridoma cell lines producing antibodies to hepatitis virus surface antigen HbS Ag.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표식인자-항원 결합체 용액 및 검출하고자 하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 배양액을 혼합한 용액에 상기 검출하고자 하는 항체를 특이적으로 포획하는 분자를 라인으로 도말한 테스트 스트립을 넣어 반응시킴으로써, 다수의 하이브리도마 세포 중 목적이 되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 매우 간편하고 신속하며 정확하게 선별할 수 있는 모노클로날 항체 스크리닝 방법을 제공함을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the present invention is a line with a molecule that specifically captures the antibody to be detected in a solution mixed with a marker-antigen conjugate solution and a hybridoma cell line culture producing the antibody to be detected. By inserting the test strips and reacting, it provides a method for screening monoclonal antibodies that can very easily, quickly and accurately select a hybridoma cell line that produces a target monoclonal antibody among a plurality of hybridoma cells. It features.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에 따른 모노클로날 항체 스크리닝 방법은 고상 면역크로마토그래피 (solid-phase immunochromatography)법을 응용하여 테스트 샘플 내에 존재하는 미량의 항체를 반-정량적(semi-quantitative)으로 검출하는 것으로, 항원-항체간의 고특이적 면역화학적 반응에 그 기초를 두고 있다. 구체적으로는, 표식인자로 표지한 항체 특이적 항원과 하이브리도마로부터 생성되어 하이브리도마 배양액에 존재하는 항체 사이의 간접 항체 샌드위치 분석(indirect antibody sandwich assay)에 기초를 두고 있다.The monoclonal antibody screening method according to the present invention is a semi-quantitative detection of a small amount of antibody present in a test sample by applying solid-phase immunochromatography. It is based on a high specific immunochemical response of the liver. Specifically, it is based on an indirect antibody sandwich assay between antibody specific antigens labeled with markers and antibodies generated from hybridomas and present in hybridoma cultures.
그 반응과정을 살펴보면, 테스트 플레이트 상에 적정량의 하이브리도마 배양액을 위치시키고, 여기에 표식인자로 표지한 항원 용액을 혼합한 후, 검출하고자하는 항체를 인식하는 항체 포획 분자를 멤브레인에 라인으로 도말하여 제조한 테스트 스트립을 각 웰에 꽂으면, 상기 시료 혼합 용액이 테스트 스트립에 흡수되면서 항체 검출 밴드가 나타나게 된다. 즉, 하이브리도마 세포가 목적이 되는 항체를 생산함으로써 배양액 내에 항체가 존재하는 경우, 항체는 시료 혼합 용액 중의 표식인자-항원 결합체와 결합한 다음 테스트 스트립을 따라 이동하다가 항체 포획 분자가 스프레이된 테스트 라인을 만나 결합하면 항체 검출 밴드가 나타나게 되는 것이고, 반대로 배양액 내에 항체가 존재하지 않는 경우에는 밴드가 나타나지 않는 것이다. 항체 검출 밴드 색깔의 진하기는 항체의 농도, 특히 항체 역가와 일치하기 때문에, 항체가 많이 생성되어 농도가 높은 경우에는 검출 밴드의 색이 진하게 나타난다.Looking at the reaction process, an appropriate amount of hybridoma culture was placed on a test plate, mixed with an antigen solution labeled with a marker, and then plated with antibody capture molecules in line with the membrane that recognize the antibody to be detected. And the test strips prepared in each well, the antibody detection band appears as the sample mixture solution is absorbed in the test strips. That is, if the antibody is present in the culture by hybridoma cells producing the desired antibody, the antibody binds to the marker-antigen conjugate in the sample mixture solution and then moves along the test strip and sprays the antibody capture molecule When bound to meet the antibody detection band will appear, on the contrary, if no antibody is present in the culture, the band does not appear. Since the intensity of the antibody detection band color is consistent with the concentration of the antibody, especially the antibody titer, the color of the detection band is darker when many antibodies are produced and the concentration is high.
본 발명 모노클로날 항체 스크리닝 방법은 다음의 과정으로 구성된다.The monoclonal antibody screening method of the present invention consists of the following procedures.
1. 항체 특이적 항원과 표식인자의 결합1.Binding of Antibody Specific Antigens to Markers
목적하는 항체에 대한 에피토프 부위가 존재하는 항원을 표식인자와 결합시킨다. 이때, 항체 및 항원과 결합하는 표식인자로는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle), 탄소 입자(carbon particle), 마그네틱 비드(magnetic bead), 염색된 폴리스티렌 비드(dyed polystyrene bead) 및 라텍스 비드(latex bead)등을 모두 이용할 수 있으나, 콜로이드성 금 입자를 사용하는 것이 가장 바람직하다.The antigen where the epitope site for the antibody of interest is present is bound to the marker. In this case, the markers that bind to the antibody and antigen include colloidal gold particles, carbon particles, magnetic beads, dyed polystyrene beads, and latex beads. bead) and the like, but it is most preferable to use colloidal gold particles.
콜로이드성 금 입자는 최근 전자 현미경 분야 및 항원항체 분석에 널리 이용되고 있는데, 전자밀도(electron-density)가 높고, 염색 정도를 객관화할 수 있으며, 세포 구조와 뚜렷이 구별되는 contrast가 높은 물질이기 때문에 전자 현미경관찰 시 표식인자로 이용되고 있다. 또한, 콜로이드성 금 입자는 손쉽게 부유액을 제조할 수 있고, 대부분의 단백질과 쉽게 결합하면서도 단백질의 특성을 변화시키지 않기 때문에 항원과 결합시킨 후 항체의 표식인자로 이용되고 있는데, 특히 입자크기 3∼20㎛의 서로 다른 크기의 금 입자를 혼용하는 경우, 여러 종류의 항체를 동시에 표지할 수 있기 때문에 매우 유용하다.Colloidal gold particles have recently been widely used in the field of electron microscopy and antigen antibody analysis, because of their high electron-density, objective staining, and high contrast, which are clearly distinguished from the cell structure. It is used as a marker for microscopic observation. In addition, colloidal gold particles can be easily prepared in suspension, and because they bind easily with most proteins but do not change protein properties, they are used as markers of antibodies after binding to antigens. Particularly, particle sizes of 3-20 It is very useful to mix gold particles of different sizes of micrometer because they can label several kinds of antibodies at the same time.
콜로이드성 금 입자와 항체 결합 항원을 결합시키는 과정에서, 콜로이드성 금 용액의 산도를 조절하여 적정 크기의 금 입자가 항원 단백질과 결합할 수 있도록 작용하는 용액을 첨가할 수 있다. 콜로이드성 금 입자들이 항원 단백질과 결합할 때 반응 용액의 산도가 단백질의 PI(등전위점) 값 이하로 내려가면 단백질과 결합한 콜로이드성 금 이온 입자들이 서로간에 반발력을 유지시켜주던 이온 장력을 상실하게 되어 엉킴 현상이 일어나면서 침전이 발생하게 되는데, 이러한 현상을 골드 크래쉬 현상이라고 한다. 즉, 항원과 콜로이드성 금 입자의 커플링은 용액의 pH가 결합 항원의 PI 값보다 약간 높을 때 가장 활성화되고, 크래쉬 현상도 일어나지 않으므로, 특정 용액을 첨가하여 커플링이 일어나는 용액의 pH를 조절하여 주는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있는 표식인자인 콜로이드성 금 입자 용액의 본래 색은 자주색인데, 결합 항원과 반응하여 자주색이 보라색으로 급격히 변하는 순간을 골드 크래쉬 현상이 일어나는 것으로 보고, 이 순간 pH를 조절해주는 물질을 첨가하는 것이 좋다. 이러한 조절용액으로는 포타슘 카보네이드 완충액(Potassium Carbonate Buffer), 보다 바람직하게는 100mM 농도의 포타슘 카보네이드 완충액을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정하는 것은 아니다.In the process of binding the colloidal gold particles with the antibody-binding antigen, a solution that controls the acidity of the colloidal gold solution to allow the gold particles of the appropriate size to bind the antigenic protein may be added. When the colloidal gold particles bind to the antigenic protein, when the acidity of the reaction solution falls below the PI (isopotential point) value of the protein, the colloidal gold ion particles bound to the protein lose the ion tension that maintains the repulsive force between them. The entanglement causes precipitation to occur, which is called a gold crash. That is, the coupling between the antigen and the colloidal gold particles is most activated when the pH of the solution is slightly higher than the PI value of the binding antigen, and no crash occurs. Therefore, by adding a specific solution, the pH of the solution where the coupling occurs is It is desirable to give. The original color of the colloidal gold particle solution, which is a marker that can be preferably used in the present invention, is purple, and when the purple color suddenly changes to purple when reacted with the binding antigen, the gold crash phenomenon occurs. It is good to add the substance. Such a control solution is preferably potassium carbonate buffer (Potassium Carbonate Buffer), more preferably, a potassium carbonate buffer solution of 100mM concentration, but is not limited thereto.
콜로이드성 금 입자와 항원의 결합 후, 항원과 결합하지 않은 콜로이드성 금 입자를 블러킹 용액을 사용하여 블러킹하는 것이 바람직하다. 이러한 블러킹 용액으로는 증류수에 용해시킨 BSA 용액, 보다 바람직하게는 농도 15%의 BSA 용액을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정하는 것은 아니다.After binding of the colloidal gold particles to the antigen, it is preferable to block the colloidal gold particles not bound to the antigen by using a blocking solution. As the blocking solution, a BSA solution dissolved in distilled water, more preferably, a BSA solution having a concentration of 15% may be used, but is not limited thereto.
상기 블러킹이 끝난 후 용액 중에서 결합하지 않고 남아 있는 항원을 세척하여 제거하는 것이 바람직하다. 이러한 세척액으로는 10mM 농도의 포타슘 포스페이트 완충액에 2%의 BSA를 녹인 용액을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정하는 것은 아니다.After the blocking is completed, it is preferable to wash away the antigen remaining in the solution without binding. As such a washing solution, a solution of 2% BSA dissolved in 10 mM potassium phosphate buffer may be used, but is not limited thereto.
2. 검출하고자 하는 하이브리도마 세포주의 배양액과 표식인자-항원 결합체 용액의 혼합2. Mixing of the culture medium and the marker-antigen conjugate solution of the hybridoma cell line to be detected
본 발명의 하이브리도마는 면역원이 되는 항원을 동물체에 주입하여 면역하고, 상기 항원에 대한 항체를 생산하는 동물체의 면역세포를 획득한 후, 이를 연속적으로 세포 분열하는 종양세포와 융합하여 제조한 것으로, 항체를 생산하는 융합세포를 나타낸다. 상기와 같은 본 발명 하이브리도마는 당업계에서 알려진 통상의 방법 및 물질을 이용하여 제작한 모든 종류의 하이브리도마를 포함한다.The hybridoma of the present invention is prepared by injecting an antigen to be an immunogen into an animal and immunizing, obtaining immune cells of the animal producing the antibody against the antigen, and then fusion with tumor cells that continuously divide the cells. , Fusion cells producing the antibody are shown. Such hybridomas of the present invention include all types of hybridomas prepared using conventional methods and materials known in the art.
3. 테스트 스트립의 멤브레인에 항체 포획 분자 도말3. Smear Antibody Capture Molecule on Membrane of Test Strip
멤브레인으로는 항체 포획 분자(anti-mouse capture molecule)의 고정 (immobilization)이 가능한 필름 타입(film type)의 고상(solid-phase) 지지체이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 포어 사이즈(pore size)가 0.5∼20㎛인 니트로셀룰로오스, 나일론, 니토로아세테이트 또는 폴리스티렌(polystyrene) 등을 사용하는것이 좋으나, 이에 한정하는 것은 아니다.As the membrane, any film-type solid-phase support capable of immobilization of antibody capture molecules can be used, but the pore size is preferably used. It is preferable to use nitrocellulose, nylon, nitoroacetate or polystyrene having a thickness of 0.5 to 20 μm, but is not limited thereto.
본 발명의 항체 포획 분자로는 모든 종류의 마우스 IgG 또는 IgM 특이 이차항체 즉, 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체, 단백질 G(protein G), 단백질 A(protein A) 또는 이들 분자들을 포함하는 모든 종류의 유전자 재조합 단백질을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.Antibody capture molecules of the invention include all types of mouse IgG or IgM specific secondary antibodies, i.e., anti-mouse IgG or IgM antibodies, protein G, protein A, or any kind comprising these molecules. Genetic recombinant protein may be used, but is not limited thereto.
4. 시료 혼합 용액과 테스트 스트립의 반응4. Reaction of Sample Mix Solution with Test Strip
테스트 스트립 상에 아무런 밴드도 생기지 않은 경우 음성으로 판정한다. 즉, 하이브리도마 배양액에 에피토프 특이적 항체(IgG)가 존재하지 않는다는 것이며, 이는 하이브리도마 세포가 목적하는 항체를 생산하지 않는다는 것을 나타낸다.If no band is present on the test strip, a negative judgment is made. That is, no epitope specific antibody (IgG) is present in the hybridoma culture, which indicates that the hybridoma cells do not produce the desired antibody.
반면, 테스트 스트립 상에 나타난 자적색의 밴드는 하이브리도마 배양액 내에 에피토프 특이적 항체가 존재한다는 것을 나타낸다. 항체 검출 밴드의 색의 진하기는 시료 중에 존재하는 항체의 역가(titer) 및 항체와 항원간의 친화도와 관계있는 것이다.On the other hand, a purple red band on the test strip indicates the presence of epitope specific antibodies in the hybridoma culture. The intensity of the color of the antibody detection band is related to the titer of the antibody present in the sample and the affinity between the antibody and the antigen.
본 발명에 따른 모노클로날 항체의 상기 스크리닝 방법 이외에, 표식인자-마우스 항체 포획 분자 결합체 용액을 하이브리도마 배양액과 혼합하여 제조한 시료 혼합 용액과; 항원을 멤브레인 상에 고정시켜 제조한 테스트 스트립을 이용하는 모노클로날 항체의 스크리닝 방법도 이용할 수 있다.In addition to the above screening method for monoclonal antibodies according to the present invention, a sample mixed solution prepared by mixing a marker factor-mouse antibody capture molecular conjugate solution with a hybridoma culture solution; Methods for screening monoclonal antibodies using test strips prepared by immobilizing antigen on the membrane can also be used.
본 발명에 따른 모노클로날 항체의 스크리닝 방법을 이용하여, 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마 선별용 키트(kit)를 제조할 수 있다. 즉, 멤브레인지지 플레이트(membrane support plate)에 위치시킨 멤브레인 위에 항체 포획 분자를 라인으로 도말한 테스트 스트립과 표식인자-항원 결합체 시약으로 구성되는 키트(도 1); 또는 멤브레인상에 항원을 라인으로 도말한 테스트 스트립과 표식인자-항체 포획 분자 결합체 시약으로 구성되는 키트를 각각 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 선별용 키트는 통상의 키트 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.Using the method for screening monoclonal antibodies according to the present invention, a kit for hybridoma selection for producing monoclonal antibodies can be prepared. That is, a kit consisting of a test strip and marker-antigen conjugate reagents in which the antibody capture molecules are lined on a membrane placed on a membrane support plate (FIG. 1); Alternatively, a kit consisting of a test strip and a marker-antibody capture molecular conjugate reagent, each of which are lined with antigen on a membrane, may be prepared. Hybridoma selection kits that produce monoclonal antibodies can be prepared by conventional kit preparation methods.
본 발명에 따른 모노클로날 항체의 스크리닝 방법은 그 과정이 간편하고 기존의 방법에 비해 시간이 단축되며, 고가의 장비 없이도 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별이 가능한 장점이 있다.The screening method of the monoclonal antibody according to the present invention has the advantage that the process is simple and the time is shorter than the conventional method, it is possible to select a hybridoma cell line producing monoclonal antibody without expensive equipment.
또한, 스크리닝하고자 하는 목적 항체에 대한 특이항원을 부착한 항원-표식인자 및 항체 포획 분자를 임의적으로 다양하게 선택하여 수행하는 경우, 다양한 종류의 모노클로날 항체를 생산하는 다양한 하이브리도마 클론들을 하나의 플레이트 상에서 동시에 선별할 수 있는 장점이 있다. 즉, 하이브리도마가 생산하는 특정 모노클로날 항체를 검출하는 것에 국한되는 것이 아니라, 상기 하이브리도마가 생산하는 다양한 종류의 모노클로날 항체를 한 번의 스크리닝 과정으로 간편하게 검색할 수 있는 것이다.In addition, when randomly selecting and selecting an antigen-labeling factor and an antibody capture molecule attached with a specific antigen for the target antibody to be screened, one of the various hybridoma clones that produces various kinds of monoclonal antibodies is obtained. There is an advantage that can be screened on the plate at the same time. In other words, the present invention is not limited to detecting specific monoclonal antibodies produced by hybridomas, but various types of monoclonal antibodies produced by the hybridomas can be easily searched in one screening process.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만, 본발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 내용의 변형이 수행될 수 있으며, 이러한 변형도 본 발명의 권리범위에 포함된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto, and modifications of contents commonly known in the art may be performed, and such modifications are also provided in the present invention. It is included in the scope of right.
실시예 : 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별Example: Selection of Hybridoma Cell Lines Producing Monoclonal Antibodies
1단계. 항원 결합 금 용액의 제조Stage 1. Preparation of Antigen Binding Gold Solution
간염바이러스 표면 항원 HbS Ag을 50mM의 소듐 포스페이트 완충액(pH 8.0)을 이용하여 0.1∼0.5㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 또한, 콜로이드성 금 용액 30㎖당 100mM의 포타슘 카보네이트 완충액 300㎕를 첨가하여 상기 희석된 항원과 결합하는 콜로이드성 금 용액을 준비하였다.Hepatitis virus surface antigen HbS Ag was diluted to a concentration of 0.1-0.5 mg / ml using 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0). In addition, 300 μl of 100 mM potassium carbonate buffer was added per 30 ml of the colloidal gold solution to prepare a colloidal gold solution which binds to the diluted antigen.
상기 준비된 항원 용액을 최종농도가 10㎍/㎖가 되도록 하고 커플링 용액의 총 부피의 5%를 초과하지 않도록 하여(커플링 반응용액의 pH와 금이온 농도가 항원용액의 첨가로 인해 변하는 정도를 최소화하기 위함) stir bar가 들어 있는 깨끗한 병에 넣은 다음 stir plate에서 섞어주었다. 여기에, 상기 준비한 콜로이드성 금 용액을 혼합하였다. 항원과 콜로이드성 금 입자가 서로 결합함에 따라, 용액의 색이 밝은 붉은색에서 보라색으로 점차 변하였다. 이때, 용액의 색이 보라색으로 빠르게 변하면, 색이 어두운 보라로 변하는 것이 멈출 때까지 100mM의 포타슘 카보네이트 완충액을 2 내지 3방울 떨어뜨린 후 상온에서 15분 동안 저어주었다.The prepared antigen solution is brought to a final concentration of 10 µg / ml and not to exceed 5% of the total volume of the coupling solution (the degree of change in pH and gold ion concentration of the coupling reaction solution due to the addition of the antigen solution). Minimize) Put in stir bar clean bottle and mix on stir plate. Here, the colloidal gold solution prepared above was mixed. As the antigen and colloidal gold particles bound to each other, the color of the solution gradually changed from bright red to purple. At this time, if the color of the solution quickly changed to purple, the drop of 100 mM potassium carbonate buffer 2 to 3 drops until the color stops dark purple and stirred for 15 minutes at room temperature.
항원과 콜로이드성 금 용액 사이에 결합이 일어난 혼합용액을 적정 부피 사이즈의 원심분리 튜브에 넣은 후 4∼8℃에서 12000g로 20분간 원심분리하였다. 상기 튜브에 생성된 펠렛을 건드리지 않도록 조심하여 상등액을 제거하는데 이때, 흡입기를 사용하여 제거하는 것이 좋다.The mixed solution in which binding between the antigen and the colloidal gold solution occurred was placed in a centrifuge tube of an appropriate volume size and centrifuged at 12000 g for 20 minutes at 4 to 8 ° C. Carefully remove the supernatant so as not to touch the pellet produced in the tube, in which case it is preferable to remove it using an inhaler.
펠렛이 남아 있는 튜브에 10mM 포타슘 포스페이트 완충액을 상기 콜로이드성 금 용액의 약 절반 부피 정도 첨가하였다. 펠렛을 부유시키기 위하여 약 1∼2분간 세게 보텍스하거나 간단하게 소니케이션하였다. 이를 4℃에서 12000g로 20분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후, 10mM 포타슘 포스페이트 완충액 0.12 부피를 펠렛에 첨가하였다. 펠렛이 모두 부유될 때까지 보텍스하거나 소니케이트 베쓰에서 소니케이션하였다.10 mM potassium phosphate buffer was added to the tube with the pellet remaining about half the volume of the colloidal gold solution. The pellets were vigorously vortexed or simply sonicated for about 1 to 2 minutes to float. It was centrifuged at 12000 g for 20 minutes at 4 ° C. and the supernatant was removed, then 0.12 volumes of 10 mM potassium phosphate buffer was added to the pellets. The pellets were vortexed or sonicated in a sonicate bath until they were all suspended.
사용시까지 냉장 온도에서 보관하였다.Store at refrigeration temperature until use.
제 2단계. 테스트 스트립의 제조Second step. Manufacture of test strips
폴리비닐 또는 폴리아세티이트 등의 재질로 만든 플라스틱판(폭 45nm)위에 넓이 2.5cm의 양면테이프를 플라스틱 하단부를 기준으로 맞추어 접착한 후 폭 2.5cm, 포어 사이즈 0.5㎛의 나이트로셀룰로스 멤브레인(Sartorius社)을 부착하였다. 0.5∼1㎎의 농도로 마우스 항체 포획 분자(anti-mouse IgG/M 또는 Protein G/A)를 50mM의 소듐 포스페이트(pH 7.5) 용액에 녹인 후 0.8㎕/㎝ 부피로 만들어 항체 포획 분자 용액을 제조하였다. 상기 용액을 바이오다트 스프레이에 넣은 후 biodot 4000 노즐을 사용하여 멤브레인 1cm 이동시 0.8㎕의 항체 포획 분자가 스프레이되도록 멤브레인상에 스프레이하여 100 멤브레인으로 제작하였다. 이와 같이 제작한 테스트 스트립의 구조를 보이는 그림을 도 1에 나타내었다.A 2.5 cm wide double-sided tape is bonded on a plastic sheet (45 nm wide) made of polyvinyl or polyacetate based on the bottom of the plastic, and then 2.5 cm wide and 0.5 µm nitrocellulose membrane (Sartorius) ) Is attached. The antibody capture molecule solution was prepared by dissolving mouse antibody capture molecules (anti-mouse IgG / M or Protein G / A) in 50 mM sodium phosphate (pH 7.5) at a concentration of 0.5 to 1 mg to a volume of 0.8 μl / cm. It was. The solution was placed in a biodart spray and sprayed onto the membrane such that 0.8 μl of antibody capture molecules were sprayed when the membrane was moved 1 cm using a biodot 4000 nozzle, thereby preparing 100 membranes. Figure 1 shows the structure of the test strip thus fabricated.
제 3단계. 항체의 검출Third step. Detection of antibodies
간염바이러스 표면 항원 HbS Ag를 면역한 마우스로부터 비장세포를 절취한후 미엘로마 세포와 전기융합하여 하이브리도마를 제조하였다.Hybridomas were prepared by cutting splenocytes from mice immunized with hepatitis virus surface antigen HbS Ag and then fusion with myeloma cells.
하이브리도마 세포주의 선별을 위한 모노클로날 항체 스크리닝 방법에 사용되는 테스트 플레이트, 테스트 스트립 및 사용되는 시약을 도 2의 사진으로 나타내었다.The test plates, test strips and reagents used in the monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell lines are shown in the photograph of FIG. 2.
상기 하이브리도마 배양 상등액 80㎕를 96웰 플레이트의 각 웰에 넣어주었다. 혈장(serum)이나 복수(ascite)를 테스트하는 경우에는, 3∼5㎕의 샘플을 PBS로 희석하여 80㎕가 되도록 한 후 테스트 플레이트의 웰에 넣어 주었다. 상기 준비된 항원결합 콜로이드성 금 용액 6㎕을 각각의 웰에 넣은 후 강화 완충액(enhance buffer) 10㎕를 마이크로피펫(micropipet)을 사용하여 각각의 테스트 튜브에 넣었다. 상기 제 3단계의 테스트 스트립을 용액이 이동하도록 하면서 테스트 웰에 넣어주고 5분 후 결과를 판독하였다.80 μl of the hybridoma culture supernatant was placed in each well of a 96 well plate. In the case of testing serum or ascite, 3-5 μl of the sample was diluted with PBS to 80 μl and placed in the well of the test plate. 6 μl of the prepared antigen-binding colloidal gold solution was added to each well, and then 10 μl of enhancement buffer was added to each test tube using a micropipet. The test strip of the third step was placed in a test well while allowing the solution to move and the results were read after 5 minutes.
판독 결과 사진을 도 3에 나타내었다. 도 2에서 간염바이러스 표면 항원 HbS Ag을 면역하여 분리한 비장세포와 미엘로마를 융합하여 제조한 하이브리도마를 테스트한 샘플 스트립에서는 선명한 자적색의 밴드가 나타났으나, 항원을 스트립에 처리하지 않은 대조군에서는 밴드가 나타나지 않았다. 상기 결과를 통하여, 하이브리도마 세포주의 선별을 위한 본 발명 모노클로날 항체의 스크리닝 방법을 이용하여 항체를 발현하는 하이브리도마를 손쉽게 검색할 수 있음을 알 수 있다.The photograph of the reading is shown in FIG. 3. In FIG. 2, a bright purple-red band appeared in the sample strips tested for hybridomas prepared by fusion of spleen cells immunized with hepatitis virus surface antigen HbS Ag and myeloma, but the antigens were not treated on the strips. No band appeared in the control group. Through the above results, it can be seen that the hybridoma expressing the antibody can be easily searched using the screening method of the monoclonal antibody of the present invention for the selection of the hybridoma cell line.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 모노클로날 항체 스크리닝 방법은 표식인자로 표지한 항체 특이적 항원과 검출하고자 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양액을 혼합한 용액에 상기 항체를 특이적으로 포획하는 분자를 라인으로 도말한 테스트 스트립을 넣어 반응시킴으로써, 다수의 하이브리도마 세포 중 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 별도의 장비 없이도 매우 간편하고 신속하며 정확하게 선별 또는 스크리닝할 수 있는 모노클로날 항체의 스크리닝 방법 및 이 방법을 이용하여 제조한 하이브리도마 선별용 키트를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.As described above, the monoclonal antibody screening method according to the present invention specifically binds the antibody to a solution obtained by mixing the antibody-specific antigen labeled with a marker and a culture medium of hybridoma producing the antibody to be detected. By reacting the trapping molecule with a test strip of lines, the monoclonal cells can be screened or screened very easily, quickly and accurately without the need for additional equipment. There is an excellent effect of providing a method for screening raw antibodies and a hybridoma screening kit prepared using the method.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020031337A KR20030094547A (en) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020031337A KR20030094547A (en) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030094547A true KR20030094547A (en) | 2003-12-18 |
Family
ID=32385840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020020031337A KR20030094547A (en) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20030094547A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160029229A (en) | 2014-09-04 | 2016-03-15 | 영남대학교 산학협력단 | Smart cart and method for unlocking a connection ring using the smart cart |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0249007A2 (en) * | 1986-04-14 | 1987-12-16 | The General Hospital Corporation | A method of screening hybridomas |
| EP0267781A2 (en) * | 1986-11-10 | 1988-05-18 | The Ontario Cancer Institute | Method for selecting hybridomas producing antibodies specific to the P-glycoprotein cell surface antigen and a CDNA clone encoding the C-term |
| US4879217A (en) * | 1987-04-28 | 1989-11-07 | Agri-Diagnostics Associates | Test for Rhizoctonia brown and yellow patch |
| JPH0829427A (en) * | 1994-07-12 | 1996-02-02 | Tonen Corp | Immunoassay of non-a, non-b hepatitis virus associated antigen, monoclonal antibody used therefor, and hybridoma for producing this antibody |
| JP2003038173A (en) * | 2001-05-18 | 2003-02-12 | Takeda Chem Ind Ltd | Method for selecting antibody, hybridoma, monoclonal antibody and use thereof |
-
2002
- 2002-06-04 KR KR1020020031337A patent/KR20030094547A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0249007A2 (en) * | 1986-04-14 | 1987-12-16 | The General Hospital Corporation | A method of screening hybridomas |
| EP0267781A2 (en) * | 1986-11-10 | 1988-05-18 | The Ontario Cancer Institute | Method for selecting hybridomas producing antibodies specific to the P-glycoprotein cell surface antigen and a CDNA clone encoding the C-term |
| US4879217A (en) * | 1987-04-28 | 1989-11-07 | Agri-Diagnostics Associates | Test for Rhizoctonia brown and yellow patch |
| JPH0829427A (en) * | 1994-07-12 | 1996-02-02 | Tonen Corp | Immunoassay of non-a, non-b hepatitis virus associated antigen, monoclonal antibody used therefor, and hybridoma for producing this antibody |
| JP2003038173A (en) * | 2001-05-18 | 2003-02-12 | Takeda Chem Ind Ltd | Method for selecting antibody, hybridoma, monoclonal antibody and use thereof |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160029229A (en) | 2014-09-04 | 2016-03-15 | 영남대학교 산학협력단 | Smart cart and method for unlocking a connection ring using the smart cart |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4775636A (en) | Blot overlay assay using colloidal metal particles | |
| US9588117B2 (en) | Detecting cells secreting a protein of interest | |
| WO1994007138A1 (en) | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations | |
| JP5199067B2 (en) | Immunoagglutination reagent kit and antigen measurement method | |
| US5591830A (en) | Detection of complexes which include basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| JP3652029B2 (en) | Highly sensitive immunoassay | |
| JP6016789B2 (en) | Method for suppressing non-specific reaction in PIVKA-II measuring reagent | |
| EP3264085A1 (en) | Immunoassay method and assay reagent used in said method | |
| JP3537331B2 (en) | Type IV collagen immunoassay and reagents | |
| US4977082A (en) | Type VI bacterial FC receptors | |
| EP3306319B1 (en) | Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same | |
| AP156A (en) | Agglutination assay. | |
| EP0664453A1 (en) | Detection of basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| CN114134123A (en) | Monoclonal antibody of pregnancy-associated glycoprotein and application of monoclonal antibody in early pregnancy detection of cattle | |
| KR20030094547A (en) | A monoclonal antibody screening method for selection of hybridoma cell line producing monoclonal antibodies and kit for selection of hybridoma cell | |
| US20030044849A1 (en) | Methods for screening monoclonal antibodies on heterogeneous antigen substrates | |
| CN116535511B (en) | Immunohistochemical antibody for detecting PD-L1 and application thereof | |
| CN117003880B (en) | Anti-thiocyanate fluorescein monoclonal antibody and application thereof | |
| JPS59173760A (en) | Method and reagent for immunochemical measurement | |
| US4948725A (en) | Novel type VI bacterial Fc receptors | |
| US5264370A (en) | Detection of basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| TW202342979A (en) | Detection method and detection reagent | |
| US5085984A (en) | Novel type VI bacterial Fc receptors | |
| WO2003028625A2 (en) | Methods for screening monoclonal antibodies on heterogeneous antigen substrates | |
| JPH08166382A (en) | Method and kit for detecting material under detection in urine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |