JP2002539782A - 不溶性マトリックス上に固定化された界面活性剤−リパーゼ複合体 - Google Patents

不溶性マトリックス上に固定化された界面活性剤−リパーゼ複合体

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Abstract

(57)【要約】 不溶性マトリックスおよび不溶性マトリックス上に固定化された界面活性剤被覆リパーゼ複合体を含むリパーゼ調製物。この新規生成物の調製方法および使用が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体、その調
製方法、および疎水性有機媒体中における油脂類（oils and fats）の例えばエ
ステル交換および／またはエステル置換を触媒するための生体触媒としての上記
複合体の使用に関する。この新規手順中には二つの工程が含まれる。最初の工程
では、この酵素を界面活性剤で被覆して活性化する。第二の工程では、この酵素
を特別のマトリックス上に固定化する。これらの工程は任意の順序で遂行できる
。
【０００２】
【従来の技術】
油脂類の構造および組成の酵素的修飾は、工業的および臨床的に大いに興味が
ある。この方法は部位特異的リパーゼを、基質として油脂類を利用したエステル
交換および／またはエステル置換反応において利用することにより達成される（
Macrea, A.R., 1983, J. Am. Oil Chem. Soc. 60:291-294)。
【０００３】 酵素法を用いると、所望の脂肪アシル基をトリアシルグリセロール分子の特定
位置に組み入れることが可能であるのに反して、従来型の化学的エステル交換は
部位特異性を有さない。従来は、トリグリセリド分子間のアシル移動を触媒する
金属ナトリウム、アルコキシナトリウムまたは塩化コバルトにより化学反応を促
進し、ランダム分布脂肪アシル残基を有するトリグリセリドの生成をもたらした
（Erdem-Senatalar, A., Erencek, E. および Erciyes, A.T., 1995, J. Am. Oi
l Chem. Soc. 72:891-894)。
【０００４】 最近、多数の研究が有機媒体中での各種エステル化反応に対する有望な生体触
媒としてのリパーゼの潜在的応用を論証している（Wisdom, R.A,. Duhill. P.,
および Lilly, M.D., 1987, Biotechnol. Bioeng. 29; 1081-1085) 。
【０００５】 １，３−位特異性リパーゼは、油脂類の加水分解を主として触媒し遊離脂肪酸お
よびグリセロールを生成させる。しかし最近の研究では、１．３−位特異性リパ
ーゼは、微量水性有機媒体中で二つの型のエステル化反応を触媒し得ることも示
している（Quinlan, P. & Moore, S., 1993, INFORM 4: 580-585)。これらの反
応の第一は、エステル交換またはアシドリシス反応であり、ここでは遊離脂肪酸
が各種トリグリセリドと反応して新規トリグリセリド分子が生じる。反応の第二
の型は、エステル置換反応であり、ここでは二つの異種トリグリセリド分子が反
応して新規トリグリセリド分子を与える（図１ａ−ｂ参照）。これらの酵素反応
の両方で、反応するトリグリセリドのｓｎ−２位は不変で残る。
【０００６】 一般的に、水濃度は酵素活性を決定するのに重要な役割を演ずる。また水濃度
は疎水性有機溶媒媒中で遂行される反応の平行状態にも影響する（Valiverty, R
.H., Halling, P.J. および Macrae, A.R., 1993, Biotechnol. Lett.l 15: 113
8-1138)。水は加水分解ならびに合成反応の両方で酵素活性にとり必要不可欠な
ので、トリグリセリドの加水分解および合成間の妥協として、水濃度を低下させ
て好ましからぬ反応の生起を最低限にする一方で、有効な水が酵素活性を維持す
るに十分であるようにする。
【０００７】 高い水濃度例えば溶媒重量の5重量％を超える濃度では、リパーゼはそれらの
自然の加水分解活性を好ましく保有するので、加水分解反応が進行する。しかし
低い水濃度例えば溶媒重量の1％未満の濃度では、リパーゼは逆反応すなわち合
成反応を触媒する。
【０００８】 有機媒体中での異種脂肪油間のエステル交換反応を促進するのに必要な典型的
な水濃度範囲は、疎水性有機溶媒の１〜１０重量％である。一般にこの水濃度は
加水分解反応も容易にし得るので、好ましからぬ部分グリセリド（モノおよびジ
グリセリド）が最初のトリグリセリド濃度の１０〜２０重量％の範囲で副生物と
して生ずる。
【０００９】 リパーゼの位置特異性を利用する範囲は、高付加価値特殊脂肪類を生産する食
品産業およびオレオ化学産業において特に大きい。例えば、ココアバター代替物
、擬似ヒトミルク脂肪および特定栄養的品質の他の構造化トリグリセリドが、１
，３−位置特異性リパーゼを用いて酵素的に取得できる（Vulfson, E.N., 1993,
Trends Food Sci. Technol. 4: 209-215 ）。
【００１０】 以上のために、天然に存在するα−３ポリ不飽和脂肪酸、または飽和脂肪酸の
悪影響のない、中鎖およびα−３ポリ不飽和脂肪酸の両方を有する新規構造化ト
リグリセリドを開発する必要がある。例えば、本質的長鎖脂肪酸で置換されたア
シル基の一つを有するＭＣＴ分子は、ＭＣＴおよびＬＣＴ両方の栄養的有利性を
提供するであろう。この接近方法は、極めて有用なトリグリセリドにより説明さ
れ、このトリグリセリドはポリ不飽和脂肪酸であるＥＰＡ，ＤＨＡまたはα−リ
ノレン酸のアシル形態を、ｓｎ−１およびｓｎ−３位置に中鎖脂肪アシル基を有
するトリグリセリド分子のｓｎ−２位置に組み込むことで形成される（Odle, J.
, 1997, J. Nutr. 127: 1061]。
【００１１】 トリグリセリド分子中に組み込まれた上記ポリ不飽和脂肪酸は、心血管疾患、
免疫不全およに炎症、アレルギー、糖尿病、腎臓疾患、抑うつ、能発育および癌
に関して幾つかの健康的利点を有することが分かった。その上、同一トリグリセ
リド分子中に組み込まれた中鎖脂肪酸は、ある種の臨床的用途において一層重要
であり、特に血清中コレステロール吸収および溶解を容易にするための用途、お
よび体消費のために容易に提供し得るエネルギー源提供のための用途において一
層重要である。
【００１２】 有機媒体中でリパーゼを使用するための多数の異なった接近方法が、リパーゼ
活性化および性能改善の目的で試みられてきた。これらには、微量水性有機溶媒
または二相系のいずれか中に懸濁したリパーゼ粉末の使用、および固定床および
流動床反応器中の多孔性マトリックス上に吸着させた天然リパーゼの使用が含ま
れる（Malcata らの 1990, J. Am. Oil Chem. Soc. 890-910）。その上、リパー
ゼは逆ミセル中に受容され、さらにある研究では、有機溶媒中でのリパーゼの溶
解性および分散性を増強する目的でリパーゼがポリエチレングリコールまたは親
水性残基にとりつけられた。
【００１３】 いずれの上記接近方法も、全ての酵素系に応用可能であることは見出せなかっ
た。しかし多くの場合、上記のように酵素がなにがしか処理された場合は、疎水
性有機系におけるリパーゼの活性、特異性、安定性および分散性に関してリパー
ゼの性能が改善された。
【００１４】 最近の研究では、界面活性剤被覆リパーゼ調製物の開発が報告されている（例
えば Basheer, S., Mogi, K. およびNakajima. M., 1995, Biotechnol. Bioeng.
45: 187-195）。この酵素修飾は、有機媒体中でのトリグリセリドと脂肪酸との
エステル化に関して、僅かに活性または完全不活性のリパーゼを高活性の生体触
媒に転化する。新規開発のこの界面活性剤−リパーゼ複合体はさらに研究され、
医薬用途で一層重要な構造化トリグリセドを生成させる目的での有機溶媒系エス
テル交換反応に使用されている（Tanaka. Y., J. および Funada, T., 1994, J.
Am. Oil Chem. Soc.71:331-334）。
【００１５】 この問題への他の接近方法において、各種固定化酵素反応装置が微量水性疎水
系有機媒体中でのリパーゼ触媒反応に使用された（例えば Basheer. S., Mogi,
k., Nakajima, M., 1995, Process Biochemistry 30: 531-536）。これらの装
置には、流動床反応器およびスラリー反応器が含まれる。開示された研究では、
無機マトリックス上に固定化されたリパーゼがバッチ反応系および固定床バイオ
レアクター系の両方に使用された。しかし使用リパーゼは界面活性剤で被覆され
ず、したがって無リパーゼ系と同じ限界を有した。 これらの限界には： １．プロセス完了後の酵素回収の困難性； ２．反応媒体中の遊離リパーゼの急速な活性低下； ３．高価な酵素の回収性の問題； ４．有機溶媒中の遊離リパーゼの低合成活性； が含まれる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
上記戦略のいずれもが、油脂類のエステル置換およびエステル交換反応の管理
において遭遇する技術的問題点を満足に解決するには至らなかった。したがって
本発明の目的は、従来法より一層高い効率で油脂類のエステル化反応を触媒し得
るリパーゼ調製物の提供にある。
【００１７】 本発明の他の目的は、マトリックスへの固定化および界面活性剤で被覆するこ
とによる処理の両方を組み込んだリパーゼ調製物の提供にある。
【００１８】 本発明のさらなる目的は、最小限の活性損失で工業規模の繰り返し使用に耐え
るリパーゼ調製物の提供にある。
【００１９】 本発明のさらなる目的は、上記不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパ
ーゼ複合体の調製方法の提供にある。
【００２０】 本発明のさらなる目的は、上記不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパ
ーゼ複合体を用いた、構造化トリアシルグリセロールの調製方法の提供にある。
【００２１】 本発明の他の目的および利点は、記載が進むにつれて明瞭になろう。
【００２２】
【課題を解決するための手段】発明の概要 このたび（１）界面活性剤被覆、および（２）不溶性マトリックスへの固定化
；による粗リパーゼの二重修飾が、エステル置換およびエステル交換反応を触媒
する酵素の効率を、これら二処理のいずれか単独に比べて相乗的に改良すること
が予想外にも見出され、かつこれが本発明の一つの目的である。さらにこの酵素
調製物を粒状で提供することにより、上記二重修飾リパーゼのエステル化反応の
ための触媒安定性を増強し得ることが予想外にも判明した。
【００２３】 本発明は、不溶性マトリックスおよび不溶性マトリックス上に固定化された界
面活性剤被覆リパーゼ複合体を含むリパーゼ調製物を主として指向する。
【００２４】 不溶性マトリックス上へのリパーゼ複合体の固定化は、幾つか異なった方法で
成就できる。しかし本発明の好ましい実施態様によれば、この界面活性剤被覆リ
パーゼ複合体は、不溶性マトリックス上に共有結合的、イオン結合的または物理
的に結合される。
【００２５】 本発明には多数のマトリックス型が包含され、これらのマトリックスは無機不
溶性マトリックスおよび有機不溶性マトリックスからなる群から選択される。
【００２６】 本発明の好ましい実施態様において無機不溶性マトリックスは、アルミナ、珪
藻土、セライト、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、イオン交換樹脂、シリカゲ
ルおよび炭からなる群から選択される。上記イオン交換樹脂は任意の適切な材料
のものであり得るが、好ましい実施態様では、アンバライト（Amberlite）およ
びダウエックス（Dowex）からなる群から選択される。
【００２７】 任意の適切な有機不溶性マトリックスが使用可能であるが、好ましい実施態様
では、有機不溶性マトリックスはユーペルギット（Eupergit）、エチルスルホキ
シルロースおよびステアリン酸アルミニウムからなる群から選択される。
【００２８】 好ましい実施態様においてリパーゼ含有量は界面活性剤被覆リパーゼ複合体の
２〜２０重量％である。一層好ましい実施態様では、リパーゼ含有量は調製物の
０．０１〜１．０重量％である。
【００２９】 本発明は上記リパーゼ調製物を提供し、この場合、界面活性剤被覆リパーゼ複
合体中の界面活性剤には親水性部分に結合した脂肪酸が含まれる。好ましい実施
態様において脂肪酸は、モノラウレート、モノミリステート、モノパルミテート
、モノステアレート、ジラウレート、ジミリステート、ジパルミテート、ジステ
アレート、トリラウレート、トリミリステート、トリパルミテートおよびトリス
テアレートからなる群から選択される。好ましい実施態様において親水部分は、
糖、ホスフエート基、カルボキシル基およびヒドロキシル化有機残基からなる群
から選択される。一層好ましい実施態様において糖は、ソルビトール、スクロー
ス、グルコースおよびラクトースからなる群から選択される。脂肪酸および親水
部分は任意の適切な型の結合手により連結され得るが、この場合の脂肪酸および
親水部分はエステル結合を介して結合される。
【００３０】 リパーゼは任意の便宜的な源から誘導または得られるが、好ましい実施態様に
おいては、リパーゼは微生物から誘導される。微生物および多細胞生物両方の多
数の異なった種が、本発明のリパーゼ調製物のためのリパーゼ源として使用でき
る。しかし本発明は、Burkholderia sp. 、Candida antractica B 、Candida ru
gosa 、Pseudomonas sp. 、Candida antractica A 、Porcine pancreas lipas
e 、Humicola sp. 、Mucor miehei 、Rhizopus javan. 、Pseudomnas fluor.、C
andida cylindrcae 、Aspergillus niger 、Phizopus oryzae 、Mucor javanic
us 、Rhizopus sp.、Rhizopus japonicus および Candida antractica からなる
群から選択された種から誘導されるリパーゼの使用を特に指向する。
【００３１】 さらなる観点において本発明はリパーゼ調製物を指向し、この調製物は不溶性
マトリックスおよび、不溶性マトリックス上に固定化された界面活性剤被覆リパ
ーゼ複合体を含み、上記リパーゼ複合体は有機溶媒中に提供される。好ましい実
施態様において、有機溶媒はｎ−ヘキサン、トルエン、イソオクタン、ｎ−オク
タン、ベンゼン、シクロヘキサンおよびジイソプロピルエーテルからなる群から
選択される。本発明は、油脂類のエステル化、エステル交換およびエステル置換
ならびにトリグリセロールおよび脂肪アルコールのアルコーリシスに対する触媒
としての上記リパーゼ調製物の使用をさらに指向する。好ましい実施態様におい
てリパーゼ調製物は、トリアシルグリセロールに関して１、３−位特異性を有す
る触媒として使用される。
【００３２】 他の観点において本発明は上記のようなリパーゼ調製物を指向し、この場合の
上記調製物は粒状をなす。
【００３３】 本発明は、上記のようなリパーゼ調製物を指向し、この場合の不溶性マトリッ
クスは脂肪酸誘導体で修飾されている。
【００３４】 さらなる観点において本発明は、上記のような酵素調製物を指向し、この調製
物は水の添加を要せずに反応環境中で使用するためのものである。
【００３５】 本発明は、界面活性剤被覆固定化リパーゼ複合体の安定性を改良する方法も包
含し、この方法には複合体を処理基質と接触させるに先立って粒状化することが
含まれる。
【００３６】 さらなる観点において、本発明は不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リ
パーゼ複合体を調製する方法を提供し、この方法は次ぎの工程を任意の順序で含
む： （ａ）水性媒体中でリパーゼを、一定濃度および一定温度でリパーゼの被覆が得
られるのに十分な時間帯に亙って界面活性剤界と接触させる工程；および （ｂ）水性媒体中で上記リパーゼを、一定濃度で上記マトリックス上へのリパー
ゼの固定化が達成されるのに十分な条件下および時間帯に亙って不溶性マトリッ
クスと接触させる工程。
【００３７】 上記方法の好ましい実施態様では、リパーゼを先ず不溶性マトリックスと接触
させ、その後、界面活性剤と接触させる。発明の他の好ましい実施態様では、リ
パーゼを先ず界面活性剤と接触させ、その後、不溶性マトリックスと接触させる
。
【００３８】 本発明の好ましい実施態様において上記方法には、マトリックス固定化界面活
性剤被覆リパーゼ複合体の、それが形成された水性溶液からの分離がさらに含ま
れる。なお一層好ましい実施態様において、この方法には上記マトリックス固定
化界面活性剤被覆リパーゼ複合体の乾燥工程もさらに含まれる。この乾燥工程は
任意の従来型方法で成就し得るが、好ましい実施態様では上記乾燥を凍結乾燥に
より実施する。他の好ましい実施態様では、マトリックス固定化界面活性剤被覆
リパーゼ複合体を水含有量１００重量ｐｐｍ未満に乾燥する。
【００３９】 他の好ましい実施態様においては、上記方法で使用する水性溶液は緩衝水性溶
液である。
【００４０】 上記方法のさらに他の好ましい実施態様では、リパーゼと界面活性剤とを次ぎ
の方法により水性媒体中で接触させる： （ｉ） 界面活性剤を有機溶媒中に溶解して界面活性剤溶解溶液を取得し、さら
に （ｉｉ） リパーゼおよび上記溶解界面活性剤溶液を上記水性媒体中で混合する
。
【００４１】 他の好ましい実施態様では、この方法は水溶液の超音波処理をさらに含む。
【００４２】 本発明における方法のさらに他の好ましい実施態様では、不溶性マトリックス
は、アルミナ、珪藻土、セライト、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、イオン交
換樹脂、シリカゲルおよび炭、ユーペルギット（Eupergit）、エチルスルホキシ
セルロース、ステアリン酸アルミニウム、および脂肪酸誘導体処理セライトまた
は他の無機マトリックスからなる群から選択される。
【００４３】 他の好ましい実施態様では、本発明における方法の界面活性剤には、親水性部
位に結合した脂肪酸が含まれる。一層好ましい実施態様では、上記脂肪酸はモノ
ラウレート、モノミリステート、モノパルミテート、モノステアレート、ジラウ
レート、ジミリステート、ジパルミテート、ジステアレート、トリラウレート、
トリミリステート、トリパルミテートおよびトリステアレートからなる群から選
択される
【００４４】 他の好ましい実施態様では、親水性部位は糖、ホスフエート基、カルボキシル
基およびヒドロキシル化有機残基からなる群から選択される。一層好ましい実施
態様において、糖はソルビトール、スクロース、グルコースおよびラクトースか
らなる群から選択される。
【００４５】 本発明の他の好ましい実施態様において、脂肪酸および親水性部分はエステル
結合手を介して結合する。
【００４６】 本発明における方法の好ましい実施態様において、リパーゼは生物から誘導さ
れる。一層好ましい実施態様においてリパーゼは、多細胞微生物から誘導される
。リパーゼは任意の適切な宿主から誘導され得るが、好ましい実施態様ではリパ
ーゼは、Burkholderia sp. 、Candida antarctica B 、Candida rugosa 、Pseud
omonas sp. 、Candida antractica A 、Porcine pancreatic lipase 、Humico
la sp. 、Mucor miehei 、Rhizopus javan. 、Pseudomnas fluor.、Candida cy
lindrcae 、 Aspergillus niger 、Phizopus oryzae 、Mucor javanicus 、Rhiz
opus sp.、Rhizopus japonicus および Candida antarctica からなる群から選
択された種から誘導される。
【００４７】 他の観点において、本発明は二つの基質間でのエステル化、アシドリシス、エ
ステル置換、エステル交換、またはアルコーリシスによる構造化トリアシルグリ
セロールの調製方法を指向し、この方法には不溶性マトリックス固定化界面活性
剤被覆リパーゼ複合体の上記基質との接触工程が含まれる。
【００４８】 この方法の好ましい実施態様において、マトリックス固定化界面活性剤被覆
リパーゼ複合体は有機溶媒の存在下に基質と接触させる。
【００４９】 この方法の他の好ましい実施態様において基質の少なくとも一つは、油類、脂
肪酸、トリアシルグリセロールおよび脂肪アルコールからなる群から選択される
。多数の異なった型の油類がこの方法に使用し得るが、好ましい実施態様では油
類はオリーブ油、大豆油、落花生油、魚油、パーム油、綿実油、ヒマワリ油、Ni
gellas sativa 油、カノラ油およびコーン油からる群から選択される。他の好ま
しい実施態様において脂肪酸は、中鎖および短鎖脂肪酸およびこれらのエステル
誘導体からなる群から選択される。一層好ましい実施態様において、脂肪酸はオ
レイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、アラキドン
酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびこれらのエステル誘導体
からなる群から選択される。
【００５０】 上記方法は任意の適切な容器中で遂行し得るが、好ましい実施態様では上記方
法は槽反応器はまた固定床反応器中で実施される。
【００５１】 この方法はまた、上記方法に従って調製したトリアシルグリセロールも包含し
、このトリアシルグリセロールはココアバター代替品、特別規定食用ヒトミルク
脂肪様トリグリセリド、または医療用の構造化トリグリセリドとして使用される
。 以下、添付図面を参照しながら本発明を例示目的で記載する。
【００５２】 （好ましい実施態様の具体的記載） 本発明は、有機または無機不溶性マトリックス（例えば粒状固形支持体)上に
固定化された界面活性剤界被覆リパーゼまたはホスホリパーゼ複合体に関し、こ
の複合体は特に油脂類のエステル交換およびエステル置換反応ならびに脂肪アル
コールのアルコーリシスを触媒するのに使用される。また本発明は粒状酵素調製
物の調製に備えるが、この調製物は増進された活性安定性を示す。とりわけ本発
明は、所望の栄養的または生化学的性質を有する構造化トリアシルグリセロール
を調製するために使用できる。本発明は、不溶性マトリックス固定化界面活性剤
被覆リパーゼまたはホスホリパーゼ複合体の調製方法ならびに不溶性マトリック
ス固定化界面活性剤被覆リパーゼまたはホスホリパーゼ複合体を用いた油脂類の
修飾加工方法をさらに指向する。
【００５３】 本発明の原理および操作は図面および図面に伴う記載を参照することにより、
よりよく理解できるはずである。
【００５４】 その応用において本発明は、次ぎの記載で明らかにされ、または図面で説明さ
れた諸成分の詳細な構成および配列にのみ限定されないことは了解されるべきで
ある。本発明は他の実施態様も可能であり、または各種様式で実行または実施可
能である。また、ここに採用した表現法および述語は記載目的のものであり、限
定とみなすべきではない。
【００５５】 本発明によれば、界面活性剤界被覆リパーゼまたはホスホリパーゼは三つの異
なった方法で不溶性マトリックス上に固定化される： （ｉ）無機または有機不溶性マトリックス上への疎水性（物理的）吸着を通じて
の固定化；（ｉｉ）各種イオン交換樹脂（極性または無極性マトリックス）上へ
のイオン的相互反応を通じての固定化；および（ｉｉｉ）ユーペルギット(有機
マトリックス)等の不溶性マトリックスへの共有結合的固定化を通じての固定化
。
【００５６】 ここに記載の手順により調製された固定化界面活性剤被覆リパーゼは、トリグ
リセリドと脂肪酸との間のエステル交換反応、ワックスエステル生産のためのト
リグリセリドと脂肪アルコールとの間の一段アルコーリシス反応を触媒するのに
使用し、さらに二種の異なったトリグリセリド間または二種の異なった脂肪油間
のエステル置換反応を触媒するのにも使用される。
【００５７】 諸結果は、限定はされないが脂肪酸糖エステル等の脂質型界面活性剤で被覆し
たリパーゼが有機合成に使用し得るリパーゼ活性化を引き起こし、殆どの場合、
この修飾加工が比較的不活性な粗リパーゼを高度活性な生体触媒に転化すること
を示す。リパーゼ酵素が反応器から容易に回収できる反応器、または連続使用が
可能な効率的酵素エステル交換／置換反応用バイオ反応器を開発するためには、
有機および無機マトリックス上に固定化した界面活性剤−リパーゼ複合体が用い
られた。
【００５８】 有機または無機マトリックス上に固定化された界面活性剤被覆リパーゼは、同
一生体触媒バッチを用いた５回の連続エステル交換反応において高いエステル交
換／置換活性を示し、ほんの僅かな活性損失を示した。マトリックス結合界面活
性剤処理酵素の粒状化は酵素安定性を顕著に増進し、活性の実質的損失なしに繰
り返し使用が可能であることがさらに分かった。
【００５９】 本発明に従って調製した固定化界面活性剤−リパーゼ複合体を医薬および食品
工業において潜在的用途を有する構造化トリグリセリドの調製のために使用した
。本発明における方法に従って合成した対象トリグリセリドはパーム油の硬質画
分等の長鎖トリグリセリドとカプリン酸等の短鎖脂肪酸とのエステル交換により
生成させた。固定化界面活性剤被覆リパーゼで触媒された反応では、対象トリグ
リセリドに対して１，３−位置特異性を有する生成物が圧倒的に生じた。モノお
よびジグリセリドも加水分解副反応で生じたが、これらの％は通常は最初のトリ
グリセリド濃度の７重量％未満であった。異なった固形マトリックス上に固定化
された界面活性剤−リパーゼ複合体の操業安定性は極めて高く、特に任意の粒状
化工程後には高く、かつ有意な酵素活性損失は観察されなかった。
【００６０】 固定化界面活性剤界−リパーゼ複合体を用いたエステル交換反応は、物性に関
して特別な特徴を示す脂肪を得る目的でも実施された。例えば、液状オリーブ油
を、一層健康的なオリーブ油に基づマーガリン調製用の混合油を得る目的で、パ
ーム油硬質画分を用いてエステル置換した。この酵素方法は、化学的油類水素添
加またはエステル交換法に対する有用な別法である。
【００６１】 かくして、本発明の教示によればリパーゼ調製物が提供され、この調製物は不
溶性マトリックスおよび、不溶性マトリックス上に固定化され界面活性剤被覆リ
パーゼ複合体を含む。
【００６２】 この明細書中および下記特許請求の範囲中に用いたような、"リパーゼ”なる
用語は、この特定酵素のみには限定されず、ホスホリパーゼ、プロテアーゼおよ
びグリコシダーゼ等の類似酵素もまた包含されることを意味する。他の適切な酵
素は、熟練化学者にとって明瞭であろう。
【００６３】 好ましい実施態様に従えば複合体は、疎水性（物理的）相互反応を経由して、
イオン的相互反応を経由して、または共有結合的固定化を経由して不溶性マトリ
ックス上に固定化される。
【００６４】 本発明の好ましい実施態様における不溶性マトリックスは、無機不溶性マトリ
ックスであり、"不溶性"なる用語は極性（例えば水）および非極性（疎水性）溶
媒中への溶解性に欠けることを指す。本発明に従った無機不溶性マトリックスは
、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、セライト、炭酸カルシウム、シリカゲ
ル、木炭 、 硫酸カルシウム、ならびに限定はされないがアンバーライト（Ambe
rlite）およびダウエックス（Dowex）等のイオン交換樹脂である。物理的固定化
の場合、最も好ましく採用される無機不溶性マトリックスは珪藻土（ＤＥ）であ
る。イオン的固定化の場合、最も好ましく採用される無機不溶性マトリックスは
アンバーライトおよびダウエックスであり、これらは強いイオン交換体である。
【００６５】 本発明はに従った適切な有機固形マトリックスには、共有結合固定化の場合は
ユーペルギットおよびイオン的相互反応の場合はエチルスルホキシセルロースで
ある。任意の他の適切な有機固形マトリックスも本発明の範囲を逸脱しない限り
使用できる。
【００６６】 本発明の他の好ましい実施態様において、リパーゼは界面活性剤被覆リパーゼ
複合体の２〜２０重量％、好ましくは５〜１１重量％を占める。さらに本発明の
好ましい実施態様においてリパーゼは、調製物の０．０１〜１重量％を占める。
好ましくはリパーゼは調製物の約０．７重量％を占める。
【００６７】 本発明の好ましい実施態様によれば、使用する界面活性剤は脂質であり、この
脂質中には親水性部分に結合した脂肪酸が含まれる。この脂肪酸は好ましくは、
モノラウレート、モノミリステート、モノパルミテート、モノステアレート、ジ
ラウレート、ジミリステート、ジパルミテート、ジステアレート、トリラウレー
ト、トリミリステート、トリパルミテートまたはトリステアレートである。限定
はされないが親水部分は好ましくはソルビトール、スクロース、グルコースおよ
びラクロース等の糖、ホスフエート基、カルボキシル基またはポリヒドロキシル
化有機残基である。通常、脂肪酸および親水部分はエステル基を介して結合する
。
【００６８】 本発明の好ましい実施態様によれば、リパーゼは微生物または多細胞生物から
導かれる。リパーゼ抽出に用いられる既知の種には、Burkholderia sp. 、Candi
da antarctica B 、Candida rugosa 、Pseudomonas sp. 、Candida antractica
A 、Porcine pancreas 、Humicola sp. 、Mucor miehei 、Rhizopus javan.
、Pseudomnas fluor 、Candida cylindrcae 、 Aspergillus niger 、Phizopus
oryzae 、Mucor javanicus 、Rhizopus sp.、Rhizopus japonicus および Cand
ida antractica が含まれる。
【００６９】 本発明の好ましい実施態様によれば、リパーゼ調製物は有機溶媒中でリパーゼ
触媒活性を維持する。リパーゼ触媒活性中には、加水分解、エステル化、エステ
ル交換、エステル置換、アシドリシスおよびアルコーリシス、好ましくはトリア
シルグリセロールに関して１，３−位特異性のアシドリシスおよびアルコーリシ
スが含まれる。有機溶媒は、ｎ−ヘキサン、トルエン、イソオクタン、ｎ−オク
タン、ベンゼン、シクロヘキサンおよびジイソプロピルエーテル等の疎水性溶媒
であるが、これらには限定されない。
【００７０】 さらに本発明によれば、不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複
合体の調製方法が提供される。この方法には次ぎの方法的工程が含まれ、この場
合、第一工程では、リパーゼ、不溶性マトリックスおよび界面活性剤界を水性溶
液、好ましくは緩衝溶液中で接触させる。第二工程では、マトリックス固定化界
面活性剤被覆リパーゼ複合体形成のために状態調節（例えば超音波処理）が提供
される。この観点では二つの別案が利用できる。第一は、リパーゼを先ず界面活
性剤界と相互反応させ、その後においてのみ界面活性剤被覆リパーゼをマトリッ
クスと相互反応させる。これに反して第二は、リパーゼを先ずマトリックスと相
互反応させ、その後においてのみマトリックス固定化リパーゼを界面活性剤界と
反応させる。
【００７１】 本発明の好ましい実施態様によれば、この方法には、水性溶液からのマトリッ
クス固定化界面活性剤界被覆リパーゼ複合体の分離工程がさらに含まれる。
【００７２】 本発明の他の好ましい実施態様によれば、この方法には、マトリックス固定化
界面活性剤被覆リパーゼ複合体を乾燥する工程がさらに含まれる。乾燥は凍結乾
燥、流動床乾燥またはオーブン中での乾燥が好ましく有効である。乾燥後、マト
リックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体は、１００重量ｐｐｍ未満、好ま
しくは５０重量ｐｐｍ未満、最も好ましくは２０重量ｐｐｍ未満の水含有量を示
す。
【００７３】 本発明による方法の好ましい実施態様においては、水性溶液中でのリパーゼ、
不溶性マトリックスおよび界面活性剤界の接触は、有機溶媒（例えばエタノール
）中に界面活性剤界を溶解し界面活性剤溶解溶液を取得し；リパーゼおよび界面
活性剤溶解溶液（例えば滴下）を水性溶液中で混合し；生成懸濁物を超音波処理
し；この水性溶液中に不溶性マトリックスを添加することにより実施する。別法
として、リパーゼを先ず不溶性マトリックスと相互反応させ、その後においての
み界面活性剤界と接触させる。
【００７４】 好ましい実施態様に従えば、上記リパーゼ調製物の不溶性マトリックスは脂肪
酸誘導体で修飾される。かくすると、ステアリン酸アルミニウム、脂肪酸誘導体
処理セライトおよび無極性または弱極性イオン交換樹脂等の疎水化担体上への疎
水化リパーゼの固定化が、高活性酵素調製の目的で可能になる。
【００７５】 さらに本発明はに従えば構造化トリアシルグリセロールの調製方法が提供され
、この方法は、エステル化、エステル置換、エステル交換、アシドリシス、また
は不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体を基質と接触させる
ことからなる二つの基質間のアルコーリシスによる。マトリックス固定化界面活
性剤被覆リパーゼ複合体と基質との接触は有機溶媒の存在下に実施する。
【００７６】 好ましい実施態様において基質の少なくとも一つは、脂肪油、脂肪酸またはト
リアシルグリセロールである。脂肪油は上記脂肪油中の任意のものでよい。脂肪
酸は中鎖もしくは短鎖脂肪酸またはそれらのエステル誘導体である。適切な脂肪
酸は例えばオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸
、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびこれらのエ
ステル誘導体である。
【００７７】 本発明の好ましい実施態様において、マトリックス固定化界面活性剤被覆リパ
ーゼ複合体と基質との接触は、反応器例えば槽反応器または固定床反応器中で実
施される。
【００７８】 さらに本発明に従えば油脂類（例えばトリアシルグリセロール）の物理的諸性
質の変更方法が提供され、この方法は、不溶性マトリックス固定化界面活性剤界
被覆リパーゼ複合体を、好ましくは有機溶媒の存在下に基質と接触させることか
らなる、少なくとも二つの油脂類基質間のエステル置換またはエステル交換によ
る。
【００７９】 さらに本発明に従えばワックスエステル生産のための長鎖トリグリセリド（Ｌ
ＣＴ）および長鎖脂肪アルコール（ＬＣＦＡＬ）の物理的諸性質の変更方法が提
供され、この方法は、不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体
を好ましくは有機溶媒の存在下に基質と接触させることからなる、少なくともこ
の種二つの基質間のアルコーリシスによる。
【００８０】 好ましい実施態様によれば、マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合
体は、基質の２〜３０重量％を占める。他の好ましい実施態様によれば油／脂肪
基質は、液状油類および固形脂肪である。油類は上記油類のいずれかであり、天
然または水素添加型である。
【００８１】 さらに本発明に従えば、上記方法で調製したトリアシルグリセロールが提供さ
れる。このトリアシルグリセロールは、ココアバター代替物、ヒトミルク脂肪様
物、、特別規定食用または医療向け構造化トリグリセリド等の使途に役立つ。
【００８２】 さらに本発明に従えば、リパーゼおよび有機溶媒を含む調製物が提供される。
このリパーゼは、基質に関して両エステル化（エステル交換および置換反応）、
アシドリシス、アルコーリシスおよび加水分解触媒活性を有し、エステル化およ
び加水分解両生成物を生じさせる。加水分解生成物は全生成物の約７重量％未満
、好ましくは約５重量％未満、一層好ましくは約３重量％未満を占める。
【００８３】
【実施例】
次ぎに実施例に言及するが、実施例は上記の記載と共に制限なしの様式で本発
明を説明する。
【００８４】実験手順 材料 各種の粗製リパーゼ調製物がこの研究で試験された。研究に用いた市販リパー
ゼ調製物ならびにそれらの種源および供給者を次表１に掲げる。この研究に用い
た全ての脂肪酸およびトリグリセリドはFluka (Switzerland) から入手し、供給
者からの報告のように、これらは少なくとも純度９９％であった。オリーブ油、
ヒマワリ油、パーム油、カノーラ油、コーン油および Nigella sativa 油は地方
の供給者（Galilee地方、Israel) から得られた。魚油、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンおよび界面活性剤被覆リパーゼ複合体に対する支持体として
用いるＤＥを含む無機マトリックス、アルミナおよびシリカゲルはSigma(USA)か
ら入手した。
【００８５】 分析等級n−ヘキサンおよび他の採用溶媒は、全て分析等級のものであり、Bio Lab (Israel) から入手した。ソルビタンモノラウリン酸塩、ソルビタンモノ
ミリスチン酸塩、ソルビタンモノパルミチン酸塩およびソルビタンモノステアリ
ン酸塩を含むソルビタン脂肪酸エステル、ならびに、各種のＨＬＢ値を示すモノ
−、ジ−、および トリステアリン酸スクロースエステルの混合物を含むスクロ
ース脂肪酸エステルはKao Pure Chemicals Ind. (Tokyo, Japan) から得られた
。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）は Sigma (USA)から入手
した。修飾リパーゼの支持体として使用した無機および有機マトリックスには、
珪藻土（ＤＥ）、アルミナおよびシリカゲルが含まれ；イオン交換樹脂はSigma
(USA)から購入した。ユーペルギットＣ「EupergitC」および ユーペルギットＣ２
５０Ｌ「EupergitC 250L 」（多孔性球状、直径それぞれ約１５０から２００μｍ
）はRhom(Germany)から入手した。
【表１】
【００８６】リパーゼ修飾および物理的吸着を経由した固定化 粗製酵素を先ず脂質界面活性剤または他の酵素活性化剤例えばアラビアガムま
たはポリエチレングリコールで被覆した。典型的酵素修飾手順および固定化手順
は次ぎのようである：粗製酵素（リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼおよ
びグリコシダーゼ；タンパク含有量約150mg/L)をpH 約 の１Ｌのホスフエート
溶液 またはトリス緩衝液中に溶解し、１０℃で３０分間攪拌した。エタノール
（２０ｍｌ）または他の溶媒中に溶解した脂質界面活性剤または他の酵素活性剤
（０．５ｇ）をこの攪拌溶液中に滴下した。生成酵素溶液を１５分間超音波処理
し、次いで１０℃で３時間激しく攪拌した。不溶性有機マトリックス（ポリプロ
ピレン、ステアリン酸アルミニウムまたはキチン等（２０ｇ）またはセライト「C
elite」、アルミナ、シリカゲルまたはセラミック支持体等２０ｇ）を攪拌酵素溶
液中に添加した。溶液を１０℃でさらに５時間磁気攪拌した。沈殿物を遠心分離
（12000rpm）(Sorval Centrifuge, RC-5B型）または濾過により捕集し、次ぎの
２種の方法の一つにより処理した： １． 湿潤沈殿を−２０℃で一昼夜冷凍後、親油化した。形成した粉末はバッチ
式酵素反応に直接使用でき、または粒状で修飾され、かつ粒径５０〜１０００μ
ｍの粒状固定化酵素を取得するために粒状化し得る。粒状化加工は、澱粉、メチ
ルセルロースもしくはエチルセルロース、ガム、アガロースまたは他のバインダ
ーを用いて遂行した。例えば澱粉を用いた粒状化は次ぎのように実施する：澱粉
溶液（４ｇの澱粉／２０ｍｌ・水）を２０℃でゲル化する。このゲルを６０℃に
冷却し、修飾および固定化した酵素湿潤粉末中に導入する。この混合物を高速ミ
キサー中で均一化し、次いで押出し、４０〜６０℃で４８時間乾燥する。この固
定化酵素を篩分け、５０〜１０００μｍ範囲の粒子を得る。この粒状酵素は主と
して充填カラム中で使用する。
【００８７】 ２．修飾および固定化後に形成した湿潤沈殿を上記のように澱粉または他の結合
試薬と共に直接粒状化した。
【００８８】イオン吸着を経由する酵素修飾および固定化 上記の修飾、固定化および粒状化手順はイオン交換樹脂と共同しても用いられ
る。採用樹脂の型には次ぎが含まれる：強および弱塩基性イオン交換樹脂、強お
よび弱酸性イオン交換樹脂、および弱極性および無極性イオン交換樹脂。実験に
用いた市販樹脂（Sigma, ＵＳＡから入手）の例には次ぎが含まれる：「Dowex 22
」、「Dowex 1X2-400」、「Dowex 2x8-100」、セルロースホスフエート、「Amberlite
IRA-95」 、「Amberlite IRA-200」、 「Amberlite IRA-900」、 「Amberlite XAD-7」
、 「Amberlite XAD-16」 、「DiannonSA-10A」、 「Ectoela」セルロース、 「Sephdex
」 およびスルホキシエチルセルロース。典型的修飾固定化酵素は前記手順に従っ
て調製された。
【００８９】共有結合を経由した酵素修飾および固定化 二つの異なった手順を採用した。最初の手順によれば、酵素を先ず界面活性剤
で被覆し、次いでリパーゼ−界面活性剤複合体をユーペルギット「Eupergit」マト
リックスに共有的に結合させたが、このマトリックスは活性オキシラン基を含む
。 目的達成のために、粗製リパーゼ（１ｇタンパク質）を１リットルのトリス
またはホスフエート緩衝液ｐＨ５．８中に溶解した。この酵素溶液を３０℃で３
０分間激しく磁気攪拌した。エタノール３０ｍｌ中に溶解したソルビタンモノス
テアレート（０．５ｇ）をこの攪拌酵素溶液中に滴下した。生じたコロイド状酵
素溶液を１０分間超音波処理し、次いで１０℃で３時間攪拌した。「Eupergit C」
または「Eupergit C250L」（１２５ｇ）および５％過酸化水素溶液１２ｍｌを酵素
溶液に加え、生成懸濁物を１分間手で揺さぶり、次いで２３℃で４８時間保温し
た。沈殿を濾過し、トリスまたはホスフエート緩衝液ｐＨ５．８で洗浄し一昼夜
凍結乾燥した。
【００９０】 第二の手順によれば、リパーゼを先ず「Eupergit」マトリックスに共有的に結合
させ、次いで結合リパーゼを界面活性剤で被覆した。この手順中に含まれる化学
を図２に示す。
【００９１】 目的達成のために、粗製リパーゼ（１ｇタンパク）を１リットルのトリスまた
はホスフエート緩衝液ｐＨ５．８中に溶解した。この酵素溶液を３０℃で１０分
間激しく磁気攪拌した。「Eupergit C」または「Eupergit C250L」（１２５ｇ）およ
び５％過酸化水素溶液１２ｍｌを酵素溶液に加え、生成懸濁物を１分間手で揺さ
ぶり、次いで２３℃で４８時間保温した。、エタノール３０ｍｌ中に溶解したソ
ルビタンモノステアレート（０．５ｇ）を懸濁物中に温和にしんとうしながら滴
下した。生じた懸濁物を１０分間超音波処理し、次いで１０℃で６時時間保温し
た。沈殿を濾過し、トリスまたはホスフエート緩衝液ｐＨ５．８で洗浄し一昼夜
凍結乾燥した。
【００９２】 共有結合的に固定化したリパーゼの対照として、酵素溶液中への界面活性剤の
添加なしに同一固定化手順を行った。
【００９３】 目的達成にために、粗製リパーゼ（１ｇタンパク）を１リットルのトリスまた
はホスフエート緩衝液ｐＨ５．８中に溶解した。この酵素溶液を３０℃で１０分
間激しく磁気攪拌した。「Eupergit C」または「Eupergit C250L」（１２５ｇ）およ
び５％過酸化水素溶液１２ｍｌを酵素溶液に加え、生成懸濁物を１分間手で揺さ
ぶり、次いで２３℃で４８時間保温した。沈殿物を濾過し、トリスまたはホスフ
エート緩衝液ｐＨ５．８で洗浄し一昼夜凍結乾燥した。
【００９４】 Bradford 法に従ったタンパク質測定によれば、この方法により調製した酵素
調製物はタンパク０．９〜１．５重量％を含んでいた。
【００９５】反応モデル 3種の異なった反応モデルを修飾および固定化酵素活性の試験に使用し、粗製
酵素の対応活性および無修飾固定化酵素の対応活性と比較した。
【００９６】 １．有機溶媒系および無溶媒系中のラウリン酸およびドデシルアルコール間のエ
ステル化反応。
【００９７】 このエステル化反応は、通常ラウリン酸２００ｍｇおよびドデシルアルコール
１８６ｍｇを含むｎ−ヘキサン１０ｍｌ中にリパーゼ調製物１０ｍｇを添加して
開始させた。反応物を４０℃で磁気攪拌した。試料を定期的に採取（５０μｌ）
し、Milliporeフイルターで濾過（０．４５μｍ）し、次いで内部標準としてｎ
−ヘキサデカンを含む類似容量のｎ−ヘキサン溶液と混合した。
【００９８】 ２．２種のトリグリセリド間のエステル置換反応；有機溶媒系または無溶媒系に
おけるトリパルミチンおよびトリステアリン。
【００９９】 このエステル置換反応は、通常トリパルミチン４０ｍｇおよびトリステアリン
４０ｍｇを含むｎ−ヘキサン１０ｍｌ中にリパーゼ調製物１０ｍｇを添加して開
始させた。反応物を４０℃で磁気攪拌した。試料を定期的に採取（５０μｌ）し
、Milliporeフイルターで濾過（０．４５μｍ）し、次いで内部標準としてｎ−
ヘキサデカンを含む類似容量のｎ−ヘキサン溶液と混合した。
【０１００】 ３．有機溶媒系または無溶媒系におけるオリーブ油およびセチルアルコール間の
アルコーリシス反応。
【０１０１】 このアルコーリシス反応は、通常オリーブ油５００ｍｇおよびセチルアルコー
ル５００ｍｇを含むｎ−ヘキサン１０ｍｌ中にリパーゼ調製物１０ｍｇを添加し
て開始させた。反応物を４０℃で磁気攪拌した。試料を定期的に採取（５０μｌ
）し、Milliporeフイルターで濾過（０．４５μｍ）し、次いで内部標準として
トリデカノインを含む類似容量のｎ−ヘキサン溶液と混合した。
【０１０２】 特に限定しない限り、全ての実験は上基条件下に実施した。各エステル化反応
は二重に実施した。全ての実験においてｎ−ヘキサンはモレキユラーシーブ上で
乾燥し、水含有量を６ｍｇ／リットル未満の最小限にした。
【０１０３】タンパク質含有量 修飾および固定化したリパーゼのタンパク質含有量をmicrokejldahl法で測定
した。
【０１０４】バッチ系における酵素活性 活性化修飾酵素、不溶性マトリックス上に固定化した修飾および固定化酵素、
粗製酵素および不溶性マトリックス中に固定化した酵素の活性を、基質入り１ｍ
ｌガラス瓶を用いて試験した。ガラス瓶を４０℃でしんとうし、一定時間を隔て
た後に分析した。反応速度は、基質の転化率７％／タンパク質ｍｇ未満において
測定した。
【０１０５】修飾および固定化酵素の操業安定性 粒状化修飾および固定化酵素の操業安定性を、反応モデルとしてｎ−ヘキサン
中のオリーブ油とセチルアルコールとのアルコーリシスを用いてジャケット付き
カラム反応器（内径０．５ｃｍおよび長さ１５ｃｍ）中で試験した。酵素粒子を
このカラムに充填し、充填酵素を通じて基質溶液を循環した。１時間後に循環を
止め、反応溶液を分析した。各実験作業後、溶液を廃棄し、新規基質溶液の装入
に先立ち充填固定化酵素を有機溶媒（ｎ−ヘキサン）で洗浄した。この手順を１
０〜２０回繰り返した。
【０１０６】実験結果 実施例１ リパーゼ調製物のタンパク質含有量 異種粗製リパーゼ、ソルビタンモノステアレート（SMS)で修飾したリパーゼ、
セライト上に固定したリパーゼ、およびセライト上に固定したSMS修飾リパーゼ
のタンパク質含有量を上記のように測定した。結果を表ＩＩに示す。
【０１０７】 これらの結果は、各種の調製物間でタンパク質濃度にかなり広い変動があるこ
とを示す。界面活性剤被覆マトリックス固定酵素の場合、タンパク質含有量は０
．０５％から１．１２重量％まで調製物に用いた酵素に応じて変動する。類似の
変動が、酵素 Lilipase を異種脂質界面活性剤または他の活性剤で処理し、任意
にセライト上に固定化した場合にも観察された。この研究の結果を表IIIに示す
。
【０１０８】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【０１０９】実施例２ リパーゼ調製物のエステル化、エステル置換およびアルコーリシス活性 リパーゼ調製 各種リパーゼ調製物（上記のように調製）の酵素活性の比較を行った。比較目
的のために、結果（表IVに示す）を反応速度（ｒｉ）として表わす。
【０１１０】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【０１１１】 これらの結果は、この研究に使用した粗製リパーゼは、天然形態における低水
濃度では、測り得る程度のエステル化活性またはエステル置換活性に欠けること
を示す。対照的に、界面活性剤ソルビタンモノステアレートによる修飾、および
、独立にセライト上への固定化の両方は、エステル化およびエステル置換の検地
可能な程度を生じさせた。しかし、酵素がこれら両方の処理に与えられると、エ
ステル化およびエステル置換反応両方の反応速度はより一層大きな程度に高まっ
た。表IVに示した数値的結果から、修飾の２段階すなわち界面活性剤処理および
マトリックス上への固定化の間には予想外の相乗作用があることは明瞭である。
【０１１２】 図３に、DE−固定化界面活性剤被覆「Saiken-100」 （三角）および「Lipase A10
-FG」（四角）がトリパルミチンおよびカプリン酸のエステル交換反応に使用され
た場合の、パルミチンの転化率を時間に関して示す。かくして測定されたエステ
ル交換反応速度は、それぞれ０．０９８および０．１０４ｍｍｏｌ／分−生体触
媒ｍｇであった。
【０１１３】実施例３ 固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体の脂肪酸特異性 各種異種脂肪酸基質に対する本発明の無機マトリックス固定化界面活性剤被覆
リパーゼ複合体の特異性を、各種鎖長脂肪酸とトリパルミチンとのエステル交換
をモニターすることにより試験した。結果を表Vに示す。反応条件は次のようで
ある： 粗製リパーゼ調製物のエステル交換活性を、トリアシルグリセロール基質とし
てトリパルミチン（５０ｍｇ）および中鎖脂肪酸基質としてカプリン酸（３５ｍ
ｇ）を用いてｎ−ヘキサン中で試験した。非固定化界面活性剤被覆リパーゼ（５
〜１０％タンパク質含有）、または無機マトリックス界面活性剤被覆リパーゼ（
０．２〜２％タンパク質含量）のエステル交換活性を同一基質を用いてｎ−ヘキ
サン中で試験した。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】 表Vから、本発明における固定化界面活性剤被覆「Lilipase」複合体は、脂肪酸
とトリパルミチンとのエステル交換を１、３−位置特異的に顕著に触媒すること
が分かる。加水分解生成物濃度は初期トリパルミチン濃度の５重量％を越えなか
った。
【０１１６】 さらに、本発明における無機マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合
体は、基質として選択される脂肪酸により影響されることが分かる。このように
、パルミチン酸およびステアリン酸等の一層長鎖のアルキル鎖を有する脂肪酸は
、一層短い鎖を有する脂肪酸よりもDE固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体に対
する一層良好な基質になる。
【０１１７】実施例４ 無機マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体に及ぼす選択界面活性剤 の影響 表VIは、リパーゼの被覆に用いたソルビタン脂肪酸エステルの型が、セライト
固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体のエステル交換活性に影響することを示す
。
【０１１８】 ソルビタンモノステアレートを被覆に使用した場合、複合体のエステル交換活
性が最高になった。しかし、ソルビタンエステル中の一層短鎖脂肪酸を用いると
、複合体活性の低下を来す。
【０１１９】
【表１２】
【０１２０】実施例５ 不溶性マトリックス上への修飾リパーゼの物理的結合 各種不溶性マトリックス上に固定化した「Lilipase A-10FG」の場合のエステル
化、エステル置換、アルコーリシス活性を測定し、ソルビタンモノステアリン酸
塩で修飾し、各種無機マトリックス上に固定化した「Lilipase A-10FG」の活性と
比較した。結果を表ＶＩＩに示す。
【表１３】
【０１２１】 この研究で使用した固定化酵素に対する最も適切な担体は、モノステアリン酸
アルミニウムおよび脂肪酸処理セライトである。表ＶＩＩから分かるように、モ
ノステアリン酸アルミニウムおよび脂肪酸処理セライト上に固定化された非修飾
「Lilipase」は、三つの反応モデルにおいて比較的良好な活性を与えた。この表に
示した結果は、第一工程での界面活性剤による酵素修飾および引き続く脂肪酸処
理不溶性マトリックス上への修飾酵素の固定化が、酵素活性におけるさらなる向
上を招来することを証明する。上表に見られるように、脂肪酸誘導体修飾および
脂肪酸誘導体処理不溶性マトリックス（モノステアリン酸アルミニウム、脂肪酸
誘導体処理セライト）上への固定化リパーゼの活性は、脂肪酸誘導体処理不溶性
マトリックス上に固定化されたリパーゼの活性よりもはるかに大きい。
【０１２２】実施例６ 酵素活性に及ぼすイオン交換樹脂選択の影響 各種イオン交換樹脂上に固定化した「Lilipase-10FG」の、および固定化に先立
ちソルビタンモノステアレートで修飾した同一酵素のエステル化、エステル置換
およびアルコーリシス活性を比較した。比較結果（反応速度として表わした）を
表ＶＩＩＩに示す。
【０１２３】
【表１４】
【０１２４】 これらの研究は、固定化すると修飾酵素のエステル化およびエステル置換活性
が劇的に増加することを例証する。その上、表ＶＩＩからは、親水基を構造中に
有するイオン交換樹脂は、界面活性剤修飾酵素に対する担体として一層良好に挙
動することが分かる。
【０１２５】実施例７ 不溶性マトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複合体を用いた、各種脂肪油 からの構造化トリグリセリドの生合成 表ＩＸは、各種脂肪油とカプリン酸間のｎ−ヘキサンおよび無溶媒系中での６
０℃におけるエステル交換反応の速度を示す。このエステル交換反応は、ＤＥ−
固定化界面活性剤被覆「Lilipase A10-FG」複合体により触媒された。
【０１２６】 ＤＥ−固定化界面活性剤被覆「Lilipase」複合体は、各種脂肪油のｎ−ヘキサン
中でのカプリン酸とのエステル交換を顕著に触媒した。最高のエステル交換反応
が、オリーブ油を用いた際に得られた。同様の反応速度が、エステル交換を無溶
媒系中で実施した際に得られた。
【０１２７】
【表１５】
【０１２８】実施例８ 修飾および固定化した酵素の操業安定性 繰り返しサイクルに亙って用いた酵素調製物の安定性を上記方法欄で述べたよ
うに測定した。この研究目的に対し、「Lilipase A10-FG」をオリーブ油のワック
スエステルへの転化触媒として用いた。活性は、各実験の完了が１時間を要する
１０回の実験作業で測定した。活性水準はオリーブ油の転換率％として測定した
。反応条件は次ぎのようである： オリーブ油２０ｇおよびセチルアルコール２０ｇを含むｎ−ヘキサン１００ｍ
ｌを固定化酵素充填床に４０℃で速度２．３ｍｌ／分で循環した。粒状酵素充填
に用いたカラムは、長さ１２ｃｍ、内径０．７５ｃｍであった。この研究結果を
図５〜１２に示す。
【０１２９】 図５は、（無修飾）セライト上に固定し２％澱粉を用いて粒状化した「Lilipas
e A10-FG 」の活性は低く、かつ、活性は各再使用毎に低減したことを示す。図６
は、ソルビタンモノステアレートで修飾し、次いでセライト（造粒なし）上に固
定化した後の同一リパーゼの活性は、同一非修飾リパーゼの活性よりも９倍も高
かったことを示す。図２から、第１、第２および第３実験作業後には急激な活性
損失があることが分かり、その原因は固定化酵素の流出に起因し得る。図７〜１
６は、有機溶媒中の酵素活性が、澱粉、エチルセルロース、ガム、澱粉等の各種
結合試薬を用いた粒状化により本質的に維持され得ることを示す。粒状加工は、
酵素充填カラム中での流れも容易にする。使用バインダーは次ぎのようである。
図７ 澱粉２％ 図８ エチルセルロース２％ 図９ アラビアガム２％ 図１０ エチルセルロース２％ 図１１ アガロース２％ 図１２ 澱粉４％ 図１２〜１６ 澱粉２％
【０１３０】 固定化は、図５〜９および１２〜１３に示す実験ではセライト上、図１０およ
び１１では「Amberlite IRA-900」 上、図14 ではモノステアリン酸アルミニウム
上、図１５では「Amberlite XAD-16」 上 、および図１６では 「Amberlite XAD-７
」上で行った。界面活性剤でリパーゼを修飾した全ての場合、処理に用いた界面
活性剤は図１３の実験以外はソルビタンモノステアレートであり、図１３の場合
はソルビタントリステアレートであった。
【０１３１】実施例９ 修飾および非修飾リパーゼの「Eupergit」 への共有結合
【０１３２】
【表１６】
【０１３３】 表Ｘから、異なったリパーゼが同様に処理され場合に異なったエステル交換活
性を示すことが分かる。この結果は使用リパーゼの源の違いに帰せられる。全て
の粗製リパーゼは記載条件下では極めて低いエステル交換活性を示したが、一方
、これらを「Eupergit」 上に共有結合的に固定化すると活性は若干増加した。リ
パーゼを界面活性剤で被覆すると、それらのエステル交換活性は顕著に増加する
ことは興味深い。パルミチンの１，３−特異性を有するエステル交換生成物への
最高の転化率は２時間の反応後に達成され、リパーゼを先ず「Eupergit」 上に共
有結合的に固定化し、次いで界面活性剤で被覆した場合に達成される。界面活性
剤で被覆された「Lilipase A10-FG」はこの観点で試験された３種のリパーゼのう
ちで最高のエステル交換活性を生じた。
【０１３４】実施例１０ 酵素活性に及ぼすバインダーの影響 上記のように異なったバインダーが修飾固定化リパーゼの粒状化に対して 使用されてきた。表ＸＩは、第１および第２実験作業でオリーブ油をそのワック
スエステルに転化する場合の平均転化率を示し、この場合、ソルビタンモノステ
アレートで修飾したセライト上に固定化した「Lilipase A10-FG」の粒状化のため
に、異なったバインダーを用いた。全てのバインダーの転化率は、粒子の乾燥重
量基準で２％であった。これらの実験では、粒状化酵素をカラムに充填し１０回
実験を行った。
【０１３５】 ソルビタンモノステアリン酸エステルで修飾し、かつセライト上に固定化し、
次いで異なったバインダー（２％）で粒状化した「Lilipase A10-FG」を用いた第
１および第２実験におけるオリーブ油のワックスエステルへの平均転化率 反応条件：２ｇのオリーブ油および２ｇのセチルアルコールを含むｎ−ヘキサン
１００ｍｌを固定化酵素充填床に速度２．５ｍｌ／分、４０℃で循環した。カラ
ム寸法：長さ１２ｃｍ、内径 ０．７５ｃｍ。
【０１３６】
【表１７】
【０１３７】 上表から、澱粉、アラビアガムおよびカラヤガムはこの研究で試験した中では
最も有効であり、活性生体触媒を生じた。
【０１３８】 本発明はを特定実施態様との関連で記載してきたが、多くの別法、修飾、変更
は当業者には明瞭であろう。発明の精神および特許請求の広い範囲以内にあるこ
の種の別法、修飾および変更の全てが包含されるべく意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 １，３−位特異性を有するリパーゼで触媒されたエステル交換アシドリシスを
示した説明図である。Ｐはグリセロール結合パルミチン酸、Ｃはグリセロール結
合カプリン酸を示す。ＰＡおよびＰＣはそれぞれ遊離のパルミチン酸およびカプ
リン酸を示す。
【図１ｂ】 １，３−位特異性を有するリパーゼで触媒されたエステル置換を示した説明図
である。Ｐはグリセロール結合パルミチン酸、Ｃはグリセロール結合カプリン酸
を示す。
【図２】 「Eupergit C250L」へのリパーゼの共有結合的固定化に引き続き、共有結合的に
固定化された酵素の界面活性剤被覆に伴う化学を示した説明図である。
【図３】 物理的に固定化されたエステル交換反応プロフイルを示した説明図である。反
応条件はトリパルミチン５０ｍｇ、カプリン酸３５ｍｇ、ｎ−ヘキサン１０ｍｌ
中のDE上に固定化した面活性剤被覆リパーゼ（「Saiken 100」三角、または「Lili
pase A10-FG」四角２０ｍｇ）。反応系は磁気攪拌し、４０℃で恒温に保持した。
【図４】 DEに物理的に固定化された「LilipaseA10-FG」を用いたパルミチンとカプリン酸
とのエステル交換反応の場合のArrheniusプロットを示した説明図である。
【図５】 セライト上に固定化され、２％澱粉で粒状化された「LilipaseA10-FG」の機能的
安定性を示した棒グラフの説明図である。
【図６】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化した粉末「Lilipas
eA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図である。
【図７】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、２％澱粉で粒
状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図である。
【図８】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、エチルセルロ
ースで粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図であ
る。
【図９】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、２％アラビア
ガムで粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図であ
る。
【図１０】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、「Amberlite IRA-900」上に固定化し、
エチルセルロースで粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフ
の説明図である。
【図１１】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、２％アガロー
スで粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図である
。
【図１２】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、４％澱粉で粒
状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図である。
【図１３】 ソルビタントリステアレートで修飾し、セライト上に固定化し、２％澱粉で粒
状化した「Lilipase A10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図である。
【図１４】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、モノステアリン酸アルミニウム上に固
定化し、２％澱粉で粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフ
の説明図である。
【図１５】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、「Amberlite XAD-16」上に固定化し、２
％澱粉で粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図で
ある。
【図１６】 ソルビタンモノステアレートで修飾し、「Amberlite XAD-7」上に固定化し、２
％澱粉で粒状化した「LilipaseA10-FG」の機能安定性を示した棒グラフの説明図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/96 Ｃ１２Ｎ 9/96 11/08 11/08 Ａ 11/12 11/12 Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｐ 7/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B018 LB07 MD14 ME03 ME07 ME08 ME14 4B033 NA02 NA03 NA27 NB22 NB38 NB45 NB62 NC03 NC04 ND02 4B050 CC07 DD03 DD04 GG10 HH02 HH03 KK06 KK07 KK20 LL01 LL02 LL05 4B064 AD87 CA33 CA34 CA38 CB24 CC04 CD04 DA01 DA10 4H059 BA12 BA13 BA26 BA30 BA33 BB02 BB03 BC03 BC13 BC48 CA35 CA36 CA37 CA48

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 不溶性マトリックス、およびこの不溶性マトリックス上に固定された界面活性
    剤被覆リパーゼ複合体を含む、リパーゼ調製物。
  2. 【請求項２】 界面活性剤被覆リパーゼ複合体が、共有結合的に、イオン結合的に、または物
    理的に不溶性マトリックスに結合している、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  3. 【請求項３】 不溶性マトリックスが、無機不溶性マトリックスおよび有機不溶性マトリック
    スからなる群から選択される、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  4. 【請求項４】 無機不溶性マトリックスが、アルミナ、珪藻土、セライト、炭酸カルシウム、
    硫酸カルシウム、イオン交換樹脂、シリカゲルおよび炭からなる群から選択され
    る、請求項３に記載のリパーゼ調製物。
  5. 【請求項５】 イオン交換樹脂が、アンバーライト（Amberlite）およびダウエックス（Dowex
    ）からなる群から選択される、請求項４に記載のリパーゼ調製物。
  6. 【請求項６】 有機不溶性マトリックスが、ユーペルギット（Eupergit）、エチルスルホキシ
    セルロースおよびステアリン酸アルミニウムからなる群から選択される、請求項
    ３に記載のリパーゼ調製物。
  7. 【請求項７】 リパーゼの含有量が、界面活性剤被覆リパーゼ複合体の2〜２０重量％である
    、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  8. 【請求項８】 リパーゼの含有量が、調製物の０．０１〜１．０重量％である、請求項１に記
    載のリパーゼ調製物。
  9. 【請求項９】 界面活性剤被覆リパーゼ複合体が、親水部分に結合した脂肪酸を含む、請求項
    １に記載のリパーゼ調製物。
  10. 【請求項１０】 脂肪酸が、モノラウレート、モノミリステート、モノパルミテート、モノステ
    アレート、ジラウレート、ジミリステート、ジパルミテート、ジステアレート、
    トリラウレート、トリミリステート、トリパルミテートおよびトリステアレート
    からなる群から選択される、請求項９に記載のリパーゼ調製物。
  11. 【請求項１１】 親水部分が、糖、ホスフエート基、カルボキシル基およびヒドロキシル化有機
    残基からなる群から選択される、請求項９に記載のリパーゼ調製物。
  12. 【請求項１２】 糖が、ソルビトール、スクロース、グルコースおよびラクトースからなる群か
    ら選択される、請求項１１に記載のリパーゼ調製物。
  13. 【請求項１３】 脂肪酸および親水部分がエステル結合を介して結合している、請求項９に記載
    のリパーゼ調製物。
  14. 【請求項１４】 リパーゼが微生物に由来する、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  15. 【請求項１５】 リパーゼが、Burkholderia sp. 、Candida antractica B 、Candida rugosa
    、Pseudomonas sp. 、Candida antractica A 、Porcine pancreas lipase 、H
    umicola sp. 、Mucor miehei 、Rhizopus javan. 、Pseudomnas fluor.、Candid
    a cylindrcae 、 Aspergillus niger 、Phizopus oryzae 、Mucor javanicus
    、Rhizopus sp.、Rhizopus japonicus および Candida antractica からなる群
    から選択された種に由来する、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  16. 【請求項１６】 リパーゼが多細胞生物に由来する、請求項１４に記載のリパーゼ調製物。
  17. 【請求項１７】 不溶性マトリックス、およびこの不溶性マトリックス上に固定された界面活性
    剤界被覆リパーゼ複合体を含む、リパーゼ調製物であって、このリパーゼ調製物
    が有機溶媒中で提供されるリパーゼ調製物。
  18. 【請求項１８】 有機溶媒が、ｎ−ヘキサン、トルエン、イソオクタン、ｎ−オクタン、ベンゼ
    ン、シクロヘキサンおよびジイソプロピルエーテルからなる群から選択される、
    請求項１７に記載のリパーゼ調製物。
  19. 【請求項１９】 油脂類のエステル化反応、エステル交換反応およびエステル置換反応ならびに
    トリグリセロールおよび脂肪アルコールのアルコーリシスに対する触媒として使
    用するための、請求項１７に記載のリパーゼ調製物。
  20. 【請求項２０】 トリアシルグリセロールに関して１,３−位特異性を示す触媒として使用する
    ための、請求項１９に記載のリパーゼ調製物。
  21. 【請求項２１】 上記調製物が粒状である、請求項１に記載のリパーゼ調製物。
  22. 【請求項２２】 不溶性マトリックスが脂肪酸誘導体で修飾されている、請求項１に記載のリパ
    ーゼ調製物。
  23. 【請求項２３】 水の添加を必要とせずに反応環境中で使用するための、請求項１に記載の酵素
    調製物。
  24. 【請求項２４】 界面活性剤で被覆された固定化リパーゼ複合体の安定性改良方法であって、反
    応させる基質と上記複合体とを接触させるに先立ち上記複合体を粒状化する方法
    。
  25. 【請求項２５】 不溶性マトリックスに固定化された界面活性剤被覆リパーゼ複合体の調製方法
    であって、 （ａ） リパーゼの被覆が得られるのに十分な時間帯に亙ってリパーゼを一定濃
    度および一定温度において水性媒体中で界面活性剤界と接触させる工程；および
    （ｂ） 不溶性マトリックス上へのリパーゼの固定化が達成されるに十分な条件
    下および時間帯に亙って上記リパーゼを一定濃度において水性媒体中で不溶性マ
    トリックスと接触させる工程； を所望の順序で含む方法。
  26. 【請求項２６】 上記リパーゼを先ず不溶性マトリックスと接触させ、次いで界面活性剤界と接
    触させる、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 リパーゼを先ず界面活性剤界と接触させ、次いで不溶性マトリックスと接触さ
    せる、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 （ｃ）水性溶液中で形成させたマトリックス固定化界面活性剤被覆リパーゼ複
    合体を、水溶液から分離する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 （ｄ）マトリックスに固定化された界面活性剤被覆リパーゼ複合体を乾燥する
    工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 乾燥が凍結乾燥により遂行される、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 マトリックスに固定化された界面活性剤被覆リパーゼ複合体を水含有量１００ 重量ppm未満になるまで乾燥する、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 水性溶液が緩衝水性溶液である、請求項２５に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 リパーゼと界面活性剤界とを水性媒体中で接触させる方法であって、 （ｉ） 界面活性剤溶解溶液を得るために上記界面活性剤界を有機溶媒中に溶解
    し；さらに （ｉｉ） 上記リパーゼおよび上記溶解界面活性剤溶液を上記水性媒体中で混合
    する； ことによる、請求項２５に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 水性溶液を超音波処理することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 不溶性マトリックスが、アルミナ、珪藻土、セライト、炭酸カルシウム、硫酸
    カルシウム、イオン交換樹脂、シリカゲル、炭、ユーペルギット（Eupergit）、
    エチルスルホキシセルロース、ステアリン酸アルミニウム、および脂肪酸誘導体
    処理セライトまたは他の無機マトリックスからなる群から選択される、請求項２
    ５に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 界面活性剤が、親水性部分に結合した脂肪酸を含む、請求項２５に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 脂肪酸が、モノラウレート、モノミリステート、モノパルミテート、モノステ
    アレート、ジラウレート、ジミリステート、ジパルミテート、ジステアレート、
    トリラウレート、トリミリステート、トリパルミテートおよびトリステアレート
    からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 親水部分が、糖、ホスフエート基、カルボキシル基およびヒドロキシル化有機
    残基からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 糖が、ソルビトール、スクロース、グルコースおよびラクトースからなる群か
    ら選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 脂肪酸および親水部分がエステル結合を介して結合している、請求項３６の方
    法。
  41. 【請求項４１】 リパーゼが生物に由来する、請求項２５に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 リパーゼが多細胞微生物に由来する、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 リパーゼが、Burkholderia sp. 、Candida antarctica B 、Candida rugosa
    、Pseudomonas sp. 、Candida antractica A 、Porcine pancreatic lipase
    、Humicola sp. 、Mucor miehei 、Rhizopus javan. 、Pseudomnas fluor.、Can
    dida cylindrcae 、 Aspergillus niger 、Phizopus oryzae 、Mucor javanicu
    s 、Rhizopus sp.、Rhizopus japonicus および Candida antarctica からなる
    群から選択された種に由来する、請求項４１に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 二つの基質間のエステル化反応、アシドリシス、エステル置換反応、エステル
    交換反応またはアルコーリシスによる構造化トリアシルグリセロールを調製する
    ための方法であって、不溶性マトリックスに固定化された界面活性剤被覆リパー
    ゼ複合体を上記基質と接触させる方法。
  45. 【請求項４５】 マトリックスに固定化された界面活性剤被覆リパーゼ複合体を有機溶媒の存在
    下に基質と接触させる、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 少なくとも一つの基質が、油類、脂肪酸、トリアシルグリセロールおよび脂肪
    アルコールから成る群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 油類が、オリーブ油、大豆油、落花生油、魚油、パーム油、綿実油、ヒマワリ
    油、Nigellas sativa 油、カノラ油およびコーン油からる群から選択される、請
    求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 脂肪酸が、中鎖および短鎖脂肪酸およびこれらのエステル誘導体からなる群か
    ら選択される、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン
    酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびこれらの
    エステル誘導体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 槽型反応器中または固定床反応器中で実施される、請求項４４に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ココアバター代替品、特別規定食用ヒトミルク脂肪様トリグリセリド、または
    医療用途に対する構造化トリグリセリドとして使用するための、請求項４４に記
    載の方法に従がって調製したトリアシルグリセロール。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006158359A (ja) * 2004-12-10 2006-06-22 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 膜タンパク質複合材料及びその製造方法
JP2007300855A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Nisshin Oillio Group Ltd リパーゼ活性の回復方法
JPWO2005097984A1 (ja) * 2004-04-08 2008-02-28 日清オイリオグループ株式会社 リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用
JP2010515450A (ja) * 2007-01-08 2010-05-13 トランス バイオディーゼル リミテッド 改善及び安定化された活性の固定化界面酵素
WO2016013582A1 (ja) * 2014-07-22 2016-01-28 日清オイリオグループ株式会社 粉末油脂組成物、粉末油脂組成物を含む食品及びこれらの製造方法
US11147285B2 (en) 2015-09-24 2021-10-19 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powdery fat or oil composition and method for producing same
US11220654B2 (en) 2016-01-21 2022-01-11 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powderizing agent for liquid component
US11219224B2 (en) 2016-01-21 2022-01-11 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Thickener for liquid component
US11241020B2 (en) 2016-01-21 2022-02-08 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powderizing agent for liquid component
US11246322B2 (en) 2016-01-21 2022-02-15 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Thickener for liquid component

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL142952A (en) 2001-05-03 2005-12-18 Enzmotec Ltd Process for enzyme-catalyzed production of 1,2 diacylated phospholipids
KR100485090B1 (ko) * 2002-01-14 2005-04-22 주식회사 포스코 이온성 액체로 코팅된 효소
IL152290A0 (en) * 2002-10-14 2003-05-29 Enzymotec Ltd Immobilization of compounds on polymeric matrix
US20060233863A1 (en) 2003-02-10 2006-10-19 Enzymotec Ltd. Oils enriched with diacylglycerols and phytosterol esters and unit dosage forms thereof for use in therapy
IL158139A0 (en) 2003-09-25 2004-09-27 Enzymotec Ltd Stabilized formulations of phosphatidyl serine
US8052992B2 (en) 2003-10-22 2011-11-08 Enzymotec Ltd. Glycerophospholipids containing omega-3 and omega-6 fatty acids and their use in the treatment and improvement of cognitive functions
US20050130937A1 (en) 2003-10-22 2005-06-16 Enzymotec Ltd. Lipids containing omega-3 and omega-6 fatty acids
IL158555A0 (en) 2003-10-22 2004-05-12 Enzymotec Ltd Human breast milk lipid mimetic as dietary supplement
EP1796726A2 (en) 2004-08-10 2007-06-20 Enzymotec Ltd. Mixture of phytosterol ester(s) and 1,3-diglyceride(s) for use in the treatment of medical conditions
US7473539B2 (en) 2004-09-20 2009-01-06 Sunho Biodiesel Corporation Methods for producing alkyl esters
EP2439268B1 (en) * 2005-06-16 2015-11-04 DSM Nutritional Products AG Immobilized enzymes and methods of using thereof
IL183084A0 (en) 2007-05-09 2007-09-20 Trans Biodisel Ltd Modified-immobilized enzymes of high tolerance to hydrophilic substrates in organic media
DE102008006716A1 (de) * 2008-01-30 2009-08-13 BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung Lipasenformulierung
US8846338B2 (en) 2008-08-07 2014-09-30 Lipogen Ltd. Processes for the preparation of phosphatides
NZ623342A (en) 2010-04-26 2014-12-24 Enzymotec Ltd Methods and lipid compositions for promoting development of gut flora

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0349684A (ja) * 1989-07-18 1991-03-04 Ajinomoto Co Inc リパーゼ固定化酵素剤の調製方法
JPH0662859A (ja) * 1992-08-20 1994-03-08 Amano Pharmaceut Co Ltd 固定化修飾酵素、該固定化修飾酵素を用いるエステル合成方法
WO1994028118A1 (en) * 1993-05-20 1994-12-08 Loders Croklaan B.V. Immobilized lipases
JPH07135972A (ja) * 1993-09-22 1995-05-30 Ajinomoto Co Inc リパーゼ酵素剤及び該リパーゼ酵素剤を用いる油脂の改質法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK638688D0 (da) * 1988-11-16 1988-11-16 Novo Industri As Partikelformet immobiliseret lipase-praeparat, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
JP2002504819A (ja) * 1997-06-05 2002-02-12 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールトランスフェラーゼタンパク質
EP0882798A1 (en) * 1997-06-06 1998-12-09 Akzo Nobel N.V. Process for the preparation of a monoester-containing esterification product of a polyoxyalkylated sucrose
WO1999015689A1 (en) * 1997-09-24 1999-04-01 Enzymothec Ltd. Surfactant-lipase complex immobilized on insoluble matrix

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0349684A (ja) * 1989-07-18 1991-03-04 Ajinomoto Co Inc リパーゼ固定化酵素剤の調製方法
JPH0662859A (ja) * 1992-08-20 1994-03-08 Amano Pharmaceut Co Ltd 固定化修飾酵素、該固定化修飾酵素を用いるエステル合成方法
WO1994028118A1 (en) * 1993-05-20 1994-12-08 Loders Croklaan B.V. Immobilized lipases
JPH07135972A (ja) * 1993-09-22 1995-05-30 Ajinomoto Co Inc リパーゼ酵素剤及び該リパーゼ酵素剤を用いる油脂の改質法

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005097984A1 (ja) * 2004-04-08 2008-02-28 日清オイリオグループ株式会社 リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用
JP4828418B2 (ja) * 2004-04-08 2011-11-30 日清オイリオグループ株式会社 リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用
US8110386B2 (en) 2004-04-08 2012-02-07 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Lipase powder, methods for producing the same and use thereof
JP2006158359A (ja) * 2004-12-10 2006-06-22 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 膜タンパク質複合材料及びその製造方法
JP2007300855A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Nisshin Oillio Group Ltd リパーゼ活性の回復方法
JP2010515450A (ja) * 2007-01-08 2010-05-13 トランス バイオディーゼル リミテッド 改善及び安定化された活性の固定化界面酵素
KR20170033870A (ko) * 2014-07-22 2017-03-27 닛신 오일리오그룹 가부시키가이샤 분말 유지 조성물, 분말 유지 조성물을 포함하는 식품 및 이들의 제조 방법
JP5937771B1 (ja) * 2014-07-22 2016-06-22 日清オイリオグループ株式会社 粉末油脂組成物、粉末油脂組成物を含む食品及びこれらの製造方法
WO2016013582A1 (ja) * 2014-07-22 2016-01-28 日清オイリオグループ株式会社 粉末油脂組成物、粉末油脂組成物を含む食品及びこれらの製造方法
US11292989B2 (en) 2014-07-22 2022-04-05 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powdered fat/oil composition, food including powdered fat/oil composition, and methods for producing same
KR102511744B1 (ko) 2014-07-22 2023-03-20 닛신 오일리오그룹 가부시키가이샤 분말 유지 조성물, 분말 유지 조성물을 포함하는 식품 및 이들의 제조 방법
US11147285B2 (en) 2015-09-24 2021-10-19 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powdery fat or oil composition and method for producing same
US11220654B2 (en) 2016-01-21 2022-01-11 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powderizing agent for liquid component
US11219224B2 (en) 2016-01-21 2022-01-11 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Thickener for liquid component
US11241020B2 (en) 2016-01-21 2022-02-08 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Powderizing agent for liquid component
US11246322B2 (en) 2016-01-21 2022-02-15 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Thickener for liquid component

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