JP2002533071A - 新規変異体egiii様セルラーゼ組成物 - Google Patents
新規変異体egiii様セルラーゼ組成物Info
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Abstract
Description
る。特に、本発明はトリコデルマ レーセイ(Trichoderma ree sei )により産生される配列に相関しているが、例えば、温度ストレスに対す
る耐性を提供するある種の突然変異を持つ、真菌および細菌からの突然変異体セ
ルラーゼ酵素ファミリーに関している。背景技術 セルラーゼはセルロースのβ−D−グルコシド結合を加水分解できる酵素であ
る。セルロース分解酵素は伝統的に3つの主なクラス:エンドグルカナーゼ、エ
キソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼに分類
されており(Knowles,J.et al.,(1987),TIBTEC H 5,255−261);多数の細菌、酵母および真菌により産生されること
が知られている。
、(生物)エタノール生産のための(木材)セルロースパルプの糖への分解、”
ストーンウォッシング”および”生物研磨”のような、および洗浄剤成分として
の織物処理が含まれている。従って、セルラーゼはメカニカルパルプの処理に有
用であることが知られている(例えば、PCT出願番号WO92/16687を
参照されたい)。さらに、セルラーゼは飼料添加物(例えば、PCT出願番号W
O91/04673を参照されたい)としておよび穀物浸漬製粉に有用であるこ
とが知られている。
りまたは灰色がかった色の除去を助けるために洗浄剤組成物として(例えば、英
国特許出願第2,075,028、2,095,275および2,094,82
6号を参照されたい、それらは洗浄剤にセルラーゼを取り込ませた場合の改良さ
れた洗浄性能を示している)、または織物の感触および外観を改良するための、
販売に先立った織物の処理に有用である。従って、英国特許出願第1,358,
599号は綿含有織物のざらざら感を減少させるための洗浄剤におけるセルラー
ゼの使用を例示しており、およびセルラーゼは中古織物の色をより力強くするこ
とによる中古織物改良のため、織物の処理に使用されている(例えば、静岡県立
浜松織物工業研究所レポート24巻、pp54−61を参照されたい(1986
))。例えば、綿含有織物の繰り返し洗浄は織物に灰色がかった色を生じさせ、
それは破壊されたおよび秩序が乱された織物によると信じられており、機械的作
用により起こされた”ピル”としばしば称されている。この灰色がかった色は色
の付いた織物で特に顕著である。そのため、秩序が乱された織物の最上層を除去
し、織物の全体の外観を改良するセルラーゼの能力は価値がある。
って、一つまたはそれ以上の特別の応用に関して特に有効な動作プロフィールを
持つ特異的セルラーゼ組成物または構成要素を探求する趨勢が本分野に存在する
。この見解から、真菌および細菌で産生(発現)されたセルラーゼが興味の対象
になっている。例えば、トリコデルマspp.(特にトリコデルマ ロンギブラ キアツム )のようなある種の真菌により産生されるセルラーゼは、セルロースの
結晶形を崩壊させることができる完全セルラーゼ系が発酵法により大量に容易に
産生されるので、より大きな注目を集めている。この特異的複合体は、その特異
的成分の性質、および工業的過程において発揮されるこれらの構成要素の能力を
決定するために広範囲に分析されてきた。例えば、Wood et al.,”
Methods in Enzymology”,160,25,234ページ
以下参照(1988)は、エキソ−セロビオヒドロラーゼ(EC3.2.1.9
1)(”CBH”)、エンドグルカナーゼ(EC3.2.1.4)(”EG”)
およびβ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)(”BG”)として同定さ
れたものを含んでいるいくつかの異なった酵素分類から成る完全真菌セルラーゼ
系を記載している。CBH、EGおよびBGの真菌セルラーゼ分類はさらに拡大
でき、各々の分類内に複数の構成要素が含まれている。米国特許第5,475,
101号(Wardら)はトリコデルマ ロンギブラキアツムから誘導されたE
GIIIと称される一つの特に有用な酵素の精製および分子クローニングを開示
している。
いる一連のDNA配列の任意の一つから成る核酸によりコードされているエンド
グルカナーゼを開示している。
7−222(1990)、はアスペルギルス アクレアタスにより産生されるエ
ンドグルカナーゼF1−CMCをコードしているcDNA配列を記載しており、
それはアミノ酸列NNLWG、ELMIWおよびGTEPFTを含んでいる。S
akamoto et al.,Curr.Genet.,Vol.27,pp
.435−439(1995)、はアスペルギルス カワキイ IFO4308
からのエンドグルカナーゼCMCase−1をコード化しているcDNA配列を
記載しており、それはアミノ酸列ELMIWおよびGTEPFTを含んでいる。
Ward et al.はNNLWG、ELMIWおよびGTEPFTを含んで
いるEGIIIの配列を記載している。さらに、二つのセルラーゼ配列、一つは エルウィニア カロトバラからおよびロドテルムス マリヌスから、がSaar
ilahti et al.,Gene,Vol.90,pp.9−14(19
90)およびHreggvidsson et al.,Appl.Envir on.Microb .,Vol.62,No.8,pp.3047−3049(
1996)に記載されており、それはアミノ酸列ELMIWを含んでいる。
物に関連する本分野での知識にもかかわらず、セルラーゼが有用である応用での
条件下で(即ち、家庭用洗浄剤、ストーンウォッシング剤構成要素またはランド
リー洗浄剤)改良された安定性を持つ新規セルラーゼ組成物が引き続いて求めら
れている。発明の要約 改良された安定性を持つ新規変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼ
組成物を提供するのが本発明の目的である。
II様セルラーゼ組成物を提供するのが本発明のさらなる目的である。 ランドリー洗浄剤を含む洗浄剤応用において優れた性能を提供するであろう組
成物を含んでいる新規変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼを提供す
るのが本発明のさらなる目的である。
規変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼを提供するのが本発明のさら
なる目的である。
マスを減少させるための改良された特性を持つ新規変異体EGIIIまたはEG
III様セルラーゼ組成物を提供するのが本発明のさらなる目的である。
を含む改良された性能を与えるため、一つまたはそれ以上のアミノ酸が修飾また
は欠失されている変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼが提供される
。好適には修飾されるべきアミノ酸はトリコデルマ レーセイからのEGIII
中の残基T2、S3、A8、F10、S18、A24、S25、F30、G31
、V36、L38、A42、A46、D47、Q49、Q61、Q64、I65
、A66、Q69、A83、S86、S90、V109、T110、Y111、
K123、D126、S133、Q134、G135、V139、T145、Q
162、N164、T166、Y168、N174、R180、K183、N1
86、A188、G189、V192、L193、S205、G206、N20
9、A211、T214および/またはI217の位置に該当する。別の好適な
態様において、修飾されるべきアミノ酸は残基T2S、S3(L/F)、A8(
S/D/G)、F10(Y/E/A/W)、S18(N/Y/L)、A24(R
/K/Q)、S25(N/T)、F30(N/E/S/W)、G31Q、V36
(Y/E/G)、L38(S/N)、A42(V/I)、A46(V/T)、D
47(N/E/T/A)、Q49(N/S/E)、Q61(P/A)、Q64(
G/V/A、I65(R/V/Y/K)、A66(Q/E)、Q69(T/E/
R)、A83(V/W)、S86(N/T/Q)、S90(N/T)、V109
(P/E/A)、T110(N/S/G)、Y111(S/G/W)、K123
(R/A)、D126(N/G)、S133(Q/D/T/F)、Q134(V
/G/H)、G135(A/S)、V139(I/L)、T145(N/K/S
/D)、Q162(P/E/S)、N164(Q/D/T)、T166(N/E
/R)、Y168F/W、N174D、R180(Q/V/A/E)、K183
(R/H/Q)、N186(P/S)、A188(D/R)、G189(S/E
)、V192L、L193(I/Q/T)、S205(N/D/P)、G206
A、N209T、A211(R/S/N)、T214(S/H/R)および/ま
たは1217(Q/V/L)の位置に該当する。最も好適には、修飾されたアミ
ノ酸はA24(K/Q/R)、G31Q、Q64(G/V/A)、V139L、
Y168F、N174D、V192L、G206Aおよび/またはN209Tに
該当する。
ゼよりも悪い安定性を持ち、変更のためにここで同定された任意の残基にEGI
IIとの相同性を持つ変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼを本発明
は提供する。
またはEGIII様酵素中の同等の位置の間でのチロシン、アスパラギンまたは
アスパラギン酸から成る残基の挿入、または204および205位間でのグリシ
ン、グルタミンまたはスレオニンから成る残基の挿入が置換に含まれている。
ゼはエンドグルカナーゼである。また好適には、酵素は真菌または細菌源から、
最も好適には糸状菌から誘導される。
I様セルラーゼをコード化しているDNAが提供される。また、そのDNAを含
んでいる発現ベクター、そのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞、お
よびそのような宿主細胞により産生された変異体EGIIIまたはEGIII様
セルラーゼが提供される。
またはEGIII様酵素の安定性(特に熱ストレス下での)に重要である。従っ
て、EGIIIまたはEGIII様酵素を織物処理(例えば、ランドリー洗浄剤
またはストーンウォッシング成分)、バイオマスの減少、飼料添加物の生産また
は飼料の処理、紙またはパルプに基づいた製品生産のための木材パルプの処理、
およびグルコース、高フルクトースコーンシロップおよび/またはアルコールの
生成を容易にするための穀物浸漬製粉または乾燥製粉間のデンプンの処理に使用
することは本発明の範囲内である。発明の詳細な説明 出願者はトリコデルマ レーセイからのEGIIIと相同性を持つセルラーゼ
ファミリーの新規酵素を単離した。これらのセルラーゼの分析により、著しい相
同性にもかかわらず、セルラーゼ間で異なった性能を生じる結果となった。特に
、フミコーラ インソレンス、フミコーラ グリセア、メムノレラ エキナータ 、フサリウム ジャバニクムおよびエメリセラ デセルトルからのEGIII様
セルラーゼは熱ストレス条件下で優れた性能を持っていることが発見された。こ
れらのより高い性能を持つEGIII様セルラーゼ中の残基をEGIII中の残
基を比較することにより、より安定なセルラーゼおよびEGIII間の残基の相
違を同定することが可能であり、より安定なEGIII様セルラーゼの改良され
た熱安定性に重要である残基が同定される。従って、EGIIIと異なったEG
III様セルラーゼ中の残基を最適化することにより、EGIII様セルラーゼ
の熱安定性をさらに改良することが可能であろう。同様に、これらの比較的より
安定なEGIII様セルラーゼ中の残基とEGIIIまたはより不安定な類似体
の残基を比較することにより、より安定なセルラーゼおよびEGIIIまたはよ
り不安定なEGIII様セルラーゼ間における残基の相違を同定することが可能
であり、従って、より安定なEGIII様セルラーゼの熱安定性を改良するため
に重要である残基が同定される。従って、EGIIIまたは他のより不安定なE
GIII様セルラーゼ中のこれらの残基を変更することにより、EGIIIの熱
安定性をさらに改良することが可能であろう。それ故、本発明は安定性データな
らびにEGIII様セルラーゼの配列比較により可能になるすべてのそのような
修飾を包含している。配列アラインメントは異なったEGIII様セルラーゼを
使用して得られるであろうが、配列の数および相同性の程度に依存して一つのア
ラインメントと別のアラインメントはわずかに異なっているであろう。適切な修
飾を決定するために適した実験は、本開示に関係する当業者には日常的なもので
ある。
III様セルラーゼに関しており、そのセルラーゼはEGIIIまたはEGII
I様セルラーゼを産生する生物体から得られる。特に好適な態様において、変異
体は本明細書で同定されるような一つまたはそれ以上の残基が、その部位で改良
された安定性を与える残基で置き換えられていることにより特徴付けられる。好
適には、修飾されるべきアミノ酸はトリコデルマ レーセイからのEGIII中
の残基2、8、10、18、24、25、30、31、36、38、42、46
、47、49、61、64、65、66、69、83、86、90、109、1
10、111、123、126、133、134、135、139、145、1
62、164、166、168、174、180、183、186、188、1
89、192、193、304、205、206、209、211、214およ
び/または217の位置に該当する。別の好適な態様において、修飾されるべき
アミノ酸はEGIII中の残基T2S、S3(L/F)、A8(S/D/G)、
F10(Y/E/A/W)、S18(N/Y/L)、A24(R/K/Q)、S
25(N/T)、F30(N/E/S/W)、G31Q、V36(Y/E/G)
、L38(S/N)、A42(V/I)、A46(V/T)、D47(N/E/
T/A)、Q49(N/S/E)、Q61(P/A)、Q64(G/V/A、I
65(R/V/Y/K)、A66(Q/E)、Q69(T/E/R)、A83(
V/W)、S86(N/T/Q)、S90(N/T)、V109(P/E/A)
、T110(N/S/G)、Y111(S/G/W)、K123(R/A)、D
126(N/G)、S133(Q/D/T/F)、Q134(V/G/H)、G
135(A/S)、V139(I/L)、T145(N/K/S/D)、Q16
2(P/E/S)、N164(Q/D/T)、T166(N/E/R)、Y16
8F/W、N174D、R180(Q/V/A/E)、K183(R/H/Q)
、N186(P/S)、A188(D/R)、G189(S/E)、V192L
、L193(I/Q/T)、S205(N/D/P)、G206A、N209T
、A211(R/S/N)、T214(S/H/R)および/または1217(
Q/V/L)の位置に該当する。最も好適には、修飾されたアミノ酸はA24(
K/Q/R)、G31Q、Q64(G/V/A)、V139L、Y168F、N
174D、V192L、G206Aおよび/またはN209Tに該当する。
ゼよりも悪い安定性を持ち、変更のためにここで同定された任意の残基にEGI
IIとの相同性を持つ変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼを本発明
は提供する。
またはEGIII様酵素中の同等の位置の間でのチロシン、アスパラギンまたは
アスパラギン酸から成る残基の挿入、または204および205位間でのグリシ
ン、グルタミンまたはスレオニンから成る残基の挿入が置換に含まれている。
ばならない。本発明に従って改良されたタンパク質は前駆体タンパク質のアミノ
酸配列に由来するアミノ酸配列を含んでいる。前駆体タンパク質は天然に存在す
るタンパク質または組換え体タンパク質であろう。改良されたタンパク質のアミ
ノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失
または挿入により前駆体タンパク質のアミノ酸配列から誘導される。そのような
修飾は一般に、前駆体タンパク質それ自体の操作というよりもむしろ前駆体タン
パク質のアミノ酸配列をコード化している前駆体DNA配列に行われる。前駆体
DNA配列のそのような操作に適した方法には、本明細書に開示されている、お
よび米国特許第4,760,025および5,185,258号(本明細書にお
いて援用される)で共通して所有されている方法が含まれる。
発明の性質を明確にするために以下に定義されている。 ”セルラーゼ”は本分野の酵素ではよく分類された種類であり、セルロースポ
リマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオースおよび/またはグルコ
ースへ加水分解できる酵素が含まれる。セルラーゼ酵素の共通の例にはエキソ−
セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが含まれ、セルロース分解性生
物(特に真菌および細菌を含んで)の多くの種から得ることが可能である。
5,101号およびトリコデルマ レーセイ セルラーゼおよびその他のヒドロ
ラーゼに関する第2回TRICELシンポジウム抄録、Suominen &
Reinikainen編,Espoo Finland(1993),pp.
153−158(Foundation for Biotechnical
and Industrial Fermentation Research
,Vol.8)に記載されているエンドグルカナーゼ成分を意味している。そこ
に議論されているように、EGIIIはトリコデルマ レーセイ(ロンギブラキ
アツム)から誘導され、約5.8の至適pH、約7.4の等電点(pl)および
約25kDの分子量により特徴付けられている。トリコデルマ レーセイからの
EGIIとして通常呼ばれている酵素は、以前は幾人かの著者により分献ではE
GIIIの命名がなされていたが、その酵素は本明細書でEGIIIと定義され
た酵素とは、分子量、plおよび至適pHの点で実質的に異なっている。
EGIII様セルラーゼ”とはEGIIIと共通したある種のアミノ酸列を持っ
ていることによりEGIIIと関係付けられる酵素を意味している。本明細書で
使用する場合、EGIII様セルラーゼはまたトリコデルマ レーセイからのE
GIIIも包含されることが意図されている。それ故、EGIII様セルラーゼ
には: (a)Asn−Asn−(Leu/Phe/Lys/IIe)−Trp−G
ly (b)Glu−(Leu/Phe/IIe)−Met−IIe−Trp (c)Gly−Thr−Glu−Pro−Phe−Thr; (d)(Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Ar
g)−(Val/Pro)−(Lys/Ala)−(Ser/Ala)−(Ty
r/Phe);および (e)Lys−Asn−Phe−Phe−Asn−Tyr の一つまたはそれ以上から成る群より選択されるアミノ酸列を含んでいるアミノ
酸配列から成る、セルロース分解活性を持っている酵素が含まれる。一つの態様
において、本発明の酵素はさらにEGIIIに対する有意な構造および/または
配列相同性を持っている。それ故、本発明の具体化での一つの態様において、酵
素はEGIIIに対して少なくとも30%、好適には少なくとも40%および最
も好適には少なくとも60%のアミノ酸同一性を持っている。しかしながら、相
同性単独では、本明細書に記載された方法により同定された特定の酵素がEGI
II様酵素を意味するかどうかの適切な尺度ではないことを認識しなければなら
ない。従って、相同的酵素が実際にここに記載および例示した方法により検出さ
れるが、相同性の程度を本発明の範囲を制限するものとしてみてはならない。
察されるであろうことが期待される。しかしながら、EGIII様セルラーゼの
適当な供給源としては、細菌または真菌源からの、特に放線菌類、バチルスまた
は糸状菌に由来するものが挙げられる。好適な態様において、セルラーゼは糸状
菌ファミリー後生動物、好適には真正子嚢菌類から誘導される。後生動物の内、
EGIII様セルラーゼを産生する真菌系統発生的分類では、栄養胞子性核菌類
(アクレモニウム属を含んで)、ソルダリア目(チエラビア属を含んで)、ボタ
ンタケ目(フザリウム属、ネシチア属、バーティシリウム属、ミロテシウム属お
よびグリオクラディウム属のようなアカツブタケ属;およびボタンタケ属)およ
びユーロチウム目(アスペルギルス属およびペニシリウム属のような栄養胞子性
トリココーマ科)が含まれる。
オフィオストマータ類、フィラコーラ類、ソルダリア類またはマメザヤタケ類に
属している。また好適には、真正子嚢菌類はバッカクキン科、メラノスポラ科、
ネクトリア科または栄養胞子性ボタンタケ類から成るボタンタケ類に属している
。さらに好適には、真正子嚢菌類はボタンタケ科に属しているが、該ボタンタケ
科はトリコデルマを含んでいない。最も好適には、真正子嚢菌類はグリオクラデ ィウムspp .、フザリウムspp.、アクレモニウムspp.、ミセリオフト ラspp .、ベルチシリウムspp.、ミロセシウムspp.、ペニシリウムs pp .、ケトミウムspp.、エメルセラspp.およびファネロカエテspp .である。EGIII様セルラーゼを所有しているとして企図された特別の生物
体にはケトミウム サーモフィウム変異体therm.、ケトミウム アトロブ ルンネウム 、ケトミウム ブラシリエンス、ケトミウム グロボスム、ケトミウ ム ヴィテリウム、ペシロマイセス リラシヌス、ケトミウム サーモフィウム 変異体ジシツム 、フミコーラ インソレンス、メムノニエラ エキナータ、フザ リウム エキセチ、フザリウム オキシスポルム、フザリウム スチボイデス、 メセリオフトラ サーモフィラ、フザリウム ジャパニクム、フミコーラ グリ セア変異体サーモイデア 、スチベラ サーモフィラ、メラノカルプス アルボマ イセス 、アルスロボトリス スペルバ、ミセリオフソラ ヒヌニレア、ケトミウ ム パチポジオデス、ミロセシウム ヴェルカリア、ペニシリウム クリソゲヌ ム 、マルブランケア スルフレア、エメリセラ デセルトルム、アクレモニウム ストリクム、シリンドロカルポン ヘテロネマおよびウロクラディウム カル タルム が含まれている。放射菌内では、ストレプトマイセスがEGIII様セル
ラーゼを持っているようである。
う。 (a)Asn−Asn−(Leu/Phe/Lys/IIe)−Trp−G
ly (b)Glu−(Leu/Phe/IIe)−Met−IIe−Trp (c)Gly−Thr−Glu−Pro−Phe−Thr; (d)(Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Ar
g)−(Val/Pro)−(Lys/Ala)−(Ser/Ala)−(Ty
r/Phe);および (e)Lys−Asn−Phe−Phe−Asn−Tyr の一つまたはそれ以上から成る群より選択されるアミノ酸列をコードしているD
NAプライマーが構築され、確立された方法に従ってセルラーゼ活性を持ってい
る酵素をコード化しているDNA、および遺伝子、を得るために使用された。加
えて、本発明のEGIIIは、EGIII様セルラーゼと本明細書同定されたセ
ルラーゼ主鎖の一つを使用して、分子生物学での通常の方法(例えば、PCRク
ローニング)により得られるであろう。
に対応している縮重したプライマーが製造された。ペプチドは、標準PCR反応
を開始させるのに適した条件下、標的生物体(即ち、その中でEGIII様セル
ラーゼを得ようとする生物体)からのゲノムDNAと混合した。この態様におい
て、ペプチド(a)および/または(d)に対応する縮重プライマーとともに(
c)および/または(e)に対応するプライマーを選択し、これらのプライマー
でPCRを実施するのが都合がよい。PCR反応を実行した後、得られたDNA
はポリアクリルアミドゲルにかけ、ペプチド(a)および/または(d)に加え
て(c)および/または(e)を含むEGIII断片のサイズに対応するバンド
(即ち、400−1000塩基対の範囲にあるもの)を選抜する。これらの断片
をプールし、ペプチド(a)および/または(d)に対応するプライマーととも
にペプチド(b)に対応するプライマーを用いて、もしくはペプチド(c)およ
び/または(e)に対応するプライマーとともにペプチド(b)に対応するプラ
イマーを用いて、再増幅する。期待されるサイズ(EGIII様セルラーゼの場
合、バンドは約250−500塩基対範囲に対応するであろう)の強いバンドを
切り出して配列決定する。この配列は次に正確に一致したプライマーを設計する
ために使用され、これらのプライマーはゲノムDNA末端の迅速増幅と称されて
いる技術で使用して完全長遺伝子を得る、例えば、Mizobuchi et
al.,BioTechniques,Vol.15,No.2,pp.215
−216(1993)を参照されたい。
うかを分析するため、標的生物体から得られたゲノムライブラリーに対するハイ
ブリダイゼーションプローブとして縮重DNAを使用することも可能である。有
用なハイブリダイゼーションアッセイは以下のようである:特定の標的源からの
ゲノムDNAを製造元の使用説明書に従って、制限酵素、例えば、EcoRI、
HindIII、BamHI、ClaI、KpnI、MluI、SpeI、Bg
lII、NcoI、XbaI、XhoIおよびXmaI(New Englan
d Biolabs,Inc.,Beverly,MAおよびBoehring
er Mannheimにより供給された)による分解により断片化する。試料
は次に、DNA断片の分離がサイズで可視化できるようにアガロースゲル(例え
ば、0.7%アガロースのような)で電気泳動する。ゲルは蒸留H2Oで簡単に
すすぎ、次に穏やかに振とうしながら適当な溶液(例えば、0.25M HCl
のような)で脱プリンし、続いて30分間変性された(例えば、0.4M Na
OH中で)。復元工程では、穏やかに振とうしながらゲルを1.5M NaCl
、1Mトリス、pH7.0、中に30分間置いた。次にDNAは適当な陽性に荷
電したメンブラン、例えば、Maximum Strength Nytran
Plusメンブラン(Schleicher & Schuell,Keen
e,N.H.)上に移動溶液(例えば、6XSSC(900mM NaCl、9
0mMクエン酸三ナトリウム)のような)を使用して移さなければならない。完
全に移し終わったら(一般的に約2時間またはそれ以上)、洗浄液(例えば、2
X SSC[2X SSC=300mM NaCl、30mMクエン酸三ナトリ
ウム])のような)を使用してメンブランをすすぎ、室温で風乾する。メンブラ
ンは次に適したプリハイブリダイゼーション溶液(例えば、100ml中:30
−50mlのホルムアミド、25mlの20X SSPE(1X SSPE=0
.18M NaCl、1mM EDTA、10mM NaH2PO4、pH7.7
)、2.5mlの20%SDS、1mlの10mg/ml切断ニシン***DNA
)中でプリハイブリダイズする。
より単離され、ゲルから断片が切り出され、および切り出されたゲルから回収さ
れなければならない。この精製DNA断片は次に標識される(例えば、Mega
prime標識システムを使用説明書に従って使用すると、DNA中にP32が取
り込まれる(Amersham International plc,Buc
kinghamshire,England))。標識されたプローブは95℃
で5分間加熱することにより変性し、すぐにメンブランを含んでいる前記プリハ
イブリダイゼーション溶液を加える。ハイブリダイゼーション反応は適当な時間
および適当な条件下、例えば、穏やかに振とうしながら37℃で18時間進行さ
せるべきであろう。メンブランをすすぎ(例えば、2X SSC/0.3%SD
S中で)、次に穏やかにかき混ぜながら適当な洗浄液で洗浄する。望まれるスト
リンジェシーはメンブラン(フィルター)が洗浄される条件を反映するであろう
。
のに必要な相同性の程度)はハイブリダイゼーション後にサザンブロットからの
フィルターが洗浄される洗浄条件に大きく依存するであろう。本明細書で定義さ
れる”低ストリンジェシー”とはサザンブロットからのフィルター洗浄が20℃
で15分間、0.2X SSC/0.1%SDS溶液での洗浄から成っているこ
とであろう。標準ストリンジェシー条件は、37℃で30分間、0.2X SS
C/0.1%SDS溶液での二回目の洗浄をさらに含む洗浄工程から成っている
。
対応しているEGIIIコード化遺伝子と同定されたDNAは、日常の方法によ
り単離され、日常の技術に従って、対応するEGIII様セルラーゼを発現する
ために使用されるでろう。好適なクローニング法には、例えば、Mizobuc
hi et al.,BioTechniques,Vol.15,No.2,
pp.215−216(1993)に記載されているゲノムDNA末端の迅速増
幅法が含まれる。クローン化遺伝子を得た後、ベクター内へのDNA挿入(ベク
ターは続いて適した宿主細胞を形質転換できる)のための日常的な方法が使用さ
れる。形質転換された宿主細胞を適当な条件下で培養すると、EGIII様セル
ラーゼの産生が生じ、それは特定の応用のために必要なように採取、精製および
調製できる。
脈において、精製または単離とは一般的に、本来的に(例えば、起源生物体)付
随しているいくつかまたはすべての天然に存在する置換基、またはEGIIIセ
ルラーゼに関連して起源生物体により発現される他のセルラーゼまたは酵素から
EGIII様セルラーゼを単離したせいでその天然の状態からEGIII様セル
ラーゼが変えられたことを意味している。同様に、本発明のEGIII様セルラ
ーゼを、天然の状態では本来存在しない他の成分と結合させてもよい。単離また
は精製はイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿または他のタンパ
ク質塩沈殿技術、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、マイクロフ
ィルトレーション、ゲル電気泳動または濃度勾配での分離のような本分野で認め
られている分離技術により達成され、最終組成物では望まれない全細胞、細胞破
片、不純物、外来性タンパク質または酵素が除かれる。
セルラーゼ中の残基とは、一次配列相同性、三次構造相同性(結晶構造またはコ
ンピューターモデル化により示されるよな)または機能的等価性により示される
、EGIIIの位置と等価な位置に存在する残基を意味している。変異体EGI
II様セルラーゼは前駆体EGIII様セルラーゼのアミノ酸配列から誘導され
るアミノ酸配列を持っている。前駆体セルラーゼは天然に存在するセルラーゼお
よび組換え体セルラーゼ(本明細書で説明されるような)を含んでいる。EGI
II様セルラーゼ変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つまたはそ
れ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体EGIII様セルラーゼ
アミノ酸配列から誘導される。そのような修飾は一般に、前駆体タンパク質それ
自体の操作というよりもむしろ前駆体タンパク質のアミノ酸配列をコード化して
いる前駆体DNA配列に行われる。前駆体DNA配列のそのような操作に適した
方法には、本明細書に開示されている、および米国特許第4,760,025お
よび5,185,258号(本明細書において援用される)で共通して所有され
ている方法が含まれる。置換または欠失のために、界面活性剤存在下での不安定
性の原因となる位置に対応する特異的残基が本明細書で同定された。アミノ酸位
置番号(即ち、+11)は図1に示された成熟トリコデルマ レーセイEGII
I配列に割り当てられた番号を示している。本発明はトリコデルマ レーセイE
GIIIで特に同定された残基と等価である位置のアミノ酸残基を含むEGII
I様セルラーゼの突然変異に関している。前駆体セルラーゼの残基(アミノ酸)
はトリコデルマ レーセイEGIIIの残基と等価である(もしそれが相同的で
あるか(即ち、一次かまたは三次構造での位置が対応している)、またはトリコ デルマ レーセイEGIII中の特異的残基またはその残基の一部と機能的に類
似していれば(即ち、同一または類似の化学的または構造的に結合する、反応す
るまたは相互作用するための機能的能力を持っている))。本明細書で使用され
る場合、番号付けは図2に示されているように、成熟EGIIIアミノ酸配列の
番号に対応するように意図されている。
系材料および合成セルロース系材料(ジュート、アマ、ラミー、レーヨンおよび
リオセル)からなるセルロース混紡物含有の綿または非綿から作られた、任意の
縫製されたまたは縫製されていない織物、織り糸または繊維を意味している。合
成セルロース含有織物の項目の下に含まれるのはレーヨンのような本分野でよく
知られている再生織物である。他の合成セルロース含有織物には化学的に修飾さ
れたセルロース繊維(例えば、酢酸で誘導体化されたセルロース)および溶媒で
紡がれたセルロース繊維(例えば、リオセル)が含まれる。特に、セルロース含
有織物の定義内に含まれるものは、そのような材料で作られた織り糸または繊維
である。セルロース含有材料はしばしば、合成繊維および羊毛および絹のような
天然の非セルロース系材料と混紡物内へ組み込まれる。
または縫製されていない織物、織り糸または繊維を意味しており、綿織物、綿ニ
ット、綿デニム、綿織糸、原料綿などが含まれる。綿混紡物が用いられた場合、
織物中の綿の量は好適には綿重量で少なくとも約35%である。混紡物として用
いられた場合、織物中で用いられる相手の材料は、ポリアミド繊維(例えば、ナ
イロン6およびナイロン66)、アクリル繊維(例えば、ポリアクリロニトリル
繊維)およびポリエステル繊維(例えば、ポリエチレンテレフタラート)、ポリ
ビニルアルコール繊維(例えば、ビニロン)、塩化ポリビニル繊維、塩化ポリビ
ニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維およびアラミド繊維のような
セルロース系材料または合成繊維を含む一つまたはそれ以上の非綿繊維を含むこ
とができる。
ングで使用するための処方を意味している。ストーンウォッシング成分は消費者
販売のための展示に先立って(即ち、製造過程の間に)、セルロース含有織物を
変形するために使用される。対照的に、洗浄剤成分は汚れた衣類のクリーニング
が意図されている。
を与えるため、撹拌およびカスケード条件下(即ち、回転ドラム洗浄機)、セル
ロース含有織物のセルラーゼ溶液での処理を意味している。本発明に従ったセル
ラーゼ溶液はそのような分野で認められている方法でのストーン使用を完全にま
たは部分的に、機能的に置き換えていくであろう。デニムに”ストーンウォッシ
ングした”外観を与えるための方法は米国特許第4,832,864号(全体が
本明細書において援用される)に開示されている。一般に、ストーンウォッシン
グ技術はインジゴ染色綿デニムに応用されてきた。
使用することが意図された混合物である。本明細書の文脈において、そのような
組成物はセルラーゼおよび界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、ビルダー
、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤および蛍光色素、ケーキング阻害剤、マスキン
グ剤、セルラーゼ活性化剤、抗酸化剤、および可溶化剤を含んでいてもよい。そ
のような組成物は一般に汚れた衣類のクリーニングのために使用され、ストーン
ウォッシング組成物とは対照的に製造過程の間には使用されない。セルラーゼを
含んでいる洗浄剤組成物は、例えば、Clarkson et al.,米国特
許第5,290,474号および欧州特許出願第271004号(本明細書にお
いて援用される)に開示されている。
れ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の一つまたは多数の異なった部位での
一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、タンパク質のどちらかまたは両方の末端
またはアミノ酸配列中の一つまたはそれ以上の部位における一つまたはそれ以上
のアミノ酸の欠失、またはアミノ酸配列中の一つまたはそれ以上の部位における
一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入により、前駆体タンパク質(例えば、天然
のタンパク質)から誘導されるタンパク質を意味している。天然のタンパク質を
コード化しているDNA配列を修飾し、適した宿主内でそのDNA配列を形質転
換し、および修飾したDNA配列を発現させて誘導体化酵素を形成させることに
より酵素変異体の製造が達成される。本発明の変異体EGIII様酵素は、前駆
体酵素アミノ酸配列と比較すると改変されたアミノ酸配列から成るペプチドを含
んでおり、変異体EGIII様酵素は前駆体酵素に特徴的なセルロース分解特性
を保持しているが、いくつかの特異的な点において改変された特性を持っている
。例えば、変異体EGIII様酵素は広範囲のpH至適性、または高い温度また
は酸化的安定性を持っているが、その特徴的セルロース分解活性は保持している
。本発明に従った変異体はセルラーゼ変異体EGIII様酵素をコード化してい
るDNA断片から誘導されるが、そこで発現されたセルラーゼ誘導体の機能的活
性は保持されている。例えば、セルラーゼをコード化しているDNA断片はさら
に、コード化されているセルラーゼドメインの機能的活性は保持されるように、
セルラーゼDNA末端の5’かまたは3’末端に結合されたヒンジまたはリンカ
ーをコード化しているDNA配列またはその一部を含んでいてもよい。
配列へ作動可能なように結合されているDNA配列を含んでいるDNA構築物を
意味している。そのような調節配列は転写を達成するためのプロモーター、転写
を調節するための随意のオペレーター配列、mRNA上に適したリボソーム結合
部位をコード化している配列、および転写および翻訳の終結を調節する配列を含
んでいる。枯草菌で使用されるベクターのために好適なプロモーターはAprE であり;大腸菌で使用される好適なプロモーターはLacプロモーターであり; サッカロマイセス セレビジエで使用される好適なプロモーターはPGK1プロ
モーターであり;黒色アスペルギルスで使用される好適なプロモーターはgla A であり;およびトリコデルマ レーセイのための好適なプロモーターはcbh l である。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純に潜在性ゲノム挿入
物であろう。適した宿主内に形質転換されたら、ベクターは宿主ゲノムとは独立
して複製および機能するであろうし、または適した条件下、ゲノムそれ自身内へ
組み込まれるであろう。本明細書において、プラスミドおよびベクターはしばし
ば相互交換的に使用される。しかしながら、本発明は等価な機能を果たしおよび
本分野で既知である(または既知になる)発現ベクターの他の形を包含すること
を意図している。従って、広範囲な宿主/発現ベクターの組み合わせが、本発明
のDNA配列の発現に用いられるであろう。有用な発現ベクターは、例えば、種
々の既知のSV40誘導体、および細菌プラスミド、例えば、colE1、pC
R1、pBR322、pMb9、pUC19およびそれらの誘導体を含む大腸菌
からのプラスミド、より広い宿主幅のプラスミド、例えば、RP4、ファージD
NA、例えば、ファージλの多くの誘導体(例えば、NM989)および他のD
NAファージ(例えば、M13および糸状一本鎖DNAファージ)、2μプラス
ミドまたはそれらの誘導体のような酵母プラスミド、真核細胞で有用なベクター
、動物細胞で有用なベクターおよびプラスミドおよびファージDNAの組み合わ
せから誘導されたベクター、ファージDNAまたは他の発現調節配列を用いて修
飾されているプラスミドのような、染色体、非染色体および合成DNA配列から
成っている。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は本分野では知られており
、一般的には、例えば、Sambrook et al.,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Col
d Spring Harbor Press(1989)に記載されている。
しばしば、本発明のDNA配列を含んでいるそのような発現ベクターは、組み込
みを通しての特定の種のゲノム内への直接挿入により単細胞宿主内へ形質転換さ
れる(例えば、Bennett & Lasure,More Gene Ma nipulations in Fungi ,Academic Press,
San Diego,pp.70−76(1991)および真菌宿主内の標的化
ゲノム挿入を説明している引用論文を参照されたい、本明細書において援用され
る)。
クターのための適した宿主を意味している。本発明に有用な宿主細胞は一般的に
は原核生物または真核生物宿主であり、発現が達成できる任意の形質転換可能な
微生物が含まれる。特には、宿主株は枯草菌、大腸菌、トリコデルマ レーセイ 、サッカロマイセス セレビジエまたは黒色アスペルギルスであろう。宿主細胞
は組換えDNA技術を使用して、構築されたベクターにより形質転換またはトラ
ンスフェクトされる。そのような形質転換宿主細胞は変異体EGIII様酵素を
コード化しているベクターを複製または所望のペプチド産物を発現できる。本発
明に従った好適な態様において、”宿主細胞”はトリコデルマ sp.の細胞か
ら作製された細胞およびプロトプラストを意味している。
、タンパク質のN末端部分に結合されたアミノ酸の配列を意味している。シグナ
ル配列のこの定義は機能的なものである。細胞外タンパク質の成熟形は、分泌過
程間に切断されるシグナル配列を持っていない。
化している一つまたはそれ以上のDNA断片またはDNA変異体断片を含んでい
るヌクレオチド配列を意味しており、それは適当な宿主細胞内への形質転換によ
り変異体EGIII様セルラーゼの発現を起こすために使用できる。
ナルまたはエンハンサー領域のような制御領域が構造遺伝子に結合され、その遺
伝子の発現を調節していることを意味している。
よび使用に関している。これらの酵素は好適には、前記の方法に従って同定およ
び単離された遺伝子を利用する組換え法により調製される。しかしながら、本発
明に使用するための酵素は、天然の単離物からの精製のような他の認知された手
段によっても得られる。
るべき微生物はトリコデルマ sp.に由来する株を含むことが都合がよいこと
が本発明により想像される。従って、本発明に従ったEGIII様セルラーゼを
調製するための好適な様式は、前記のように検出されたEGIII様セルラーゼ
の一部またはすべてをコード化しているDNAの少なくとも断片を含んでいるD
NA構築物でトリコデルマ sp.宿主細胞を形質転換することを含んでいる。
DNA構築物は一般的には機能的にプロモーターに結合されるであろう。形質転
換された宿主細胞は次に、所望のタンパク質を発現するような条件下で増殖させ
る。続いて、所望のタンパク質産物は実質的に均一になるように精製される。
DNAのための最良の発現担体は異なっていることも事実であろう。従って、変
異体EGIII様セルラーゼの起源生物体と系統発生的に類似している形質転換
宿主中でタンパク質を発現させるのが最も都合がよいであろう。従って、トリコ デルマsp .発現システムのここでの説明は例示の目的でのみ提供されており、
本発明の変異体EGIII様セルラーゼを発現するための一つの選択である。し
かしながら、当業者はもし適切なら異なった宿主細胞中で変異体EGIII様セ
ルラーゼをコード化しているDNAを発現したいと思うであろうが、変異体EG
III様セルラーゼの起源が最適な発現宿主を決定していると考えられるべきこ
とを理解しなければならない。さらに、当業者は、本分野で利用可能なツールを
利用して日常の技術を通して特定の遺伝子のための最良の発現システムを選択で
きるであろう。
r−Neiss et al.Appl.Microbiol.Biotech nology ,20(1984)pp.46−53、に記載されているRL−P
37は高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL−P
37の機能的等価物には、トリコデルマ レーセイ(ロンギブラキアツム)株R
UT−C30(ATCC番号56765)および株QM9414(ATCC番号
26921)が含まれる。これらの株はまた、EGIII様セルラーゼの過剰発
現にも有用であろうことが期待される。
ーゼを得ることを望む場合、EGIII様セルラーゼをコード化しているDNA
を含んでいるDNA構築物またはプラスミドの導入に先立って、一つまたはそれ
以上のセルラーゼ遺伝子が欠失されているトリコデルマ宿主細胞株を得るのが有
用である。そのような株は米国特許第5,246,853号およびWO92/0
6209に開示されている方法により調製される(それらの開示は本明細書にお
いて援用される)。一つまたはそれ以上のセルラーゼ遺伝子が失われた宿主微生
物中でEGIII様セルラーゼを発現することにより、同定および続いての精製
法が単純化される。クローン化されているトリコデルマ sp.から任意の遺伝
子が欠失できる、例えば、cbh1、cbh2、egl1およびegl3遺伝子
ならびにEGIIIおよび/またはEGVタンパク質をコード化している遺伝子
(例えば、各々米国特許第5,475,101号およびWO94/28117を
参照されたい)。
既知の方法によりプラスミド内へ挿入することにより達成される。欠失プラスミ
ドは次に適当な制限酵素部位で切断され(所望の遺伝子コード領域に内部で)、
遺伝子コード配列またはその一部は選択可能マーカーにより置換される。欠失ま
たは破壊されるべき遺伝子座位に隣接するDNA配列(好適には約0.5から2
.0kb)は選択可能マーカー遺伝子の両側に残存する。適切な欠失プラスミド
は一般的に、隣接DNA配列および除去されるべき選択可能マーカー遺伝子を一
つの直線状断片として含んでいる遺伝子が欠失された断片を得ることが可能なよ
うに、特有の制限酵素部位を持っている。
ければならない。選択された微生物中で発現される選択可能マーカー遺伝子が適
している。例えば、トリコデルマ sp.に関して、形質転換体中での選択可能
マーカーの存在がその特性に有意に影響しないように選択可能マーカーが選択さ
れる。そのような選択可能マーカーはアッセイ可能産物をコード化している遺伝
子である。例えば、宿主株中での欠損が宿主株において栄養要求性表現型を示す トリコデルマ sp .遺伝子の機能性コピーが使用される。
され、従ってそれは形質転換の選択可能マーカーを提供する。pyr4- 誘導株
はフルオロオロチン酸(FOA)に耐性であるトリコデルマ sp.株の選択に
より得られるであろう。pyr4遺伝子はウリジンの生合成に必要とされる酵素
であるオロチジン−5’−一リン酸脱炭酸酵素をコード化している。無損傷のp yr4 遺伝子を持つ株はウリジンを欠く培地中で増殖するが、フルオロオロチン
酸に感受性を持っている。機能性オロチジン一リン酸脱炭酸酵素を欠きおよび増
殖にウリジンを必要とするpyr4- 誘導株はFOA耐性で選択することにより
選択可能である。FOA選択技術を使用すると、機能性ピロホスホリボシル オ
ロチン酸トランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。こ
れらの細胞をこの酵素をコード化している遺伝子の機能性コピーで形質転換する
ことが可能である(Berges and Barreau,Curr.Gen et .,19,1991,pp.359−365)。誘導株の選択は前記を参照
し、FOA耐性技術を使用して容易に実行され、従って、pyr4遺伝子が選択
可能マーカーとして好適に用いられる。
ルラーゼ遺伝子を含んでいる一つのDNA断片が欠失プラスミドから単離され、
適当なpyr4- トリコデルマ宿主の形質転換に使用された。形質転換体が次
にpyr4遺伝子産物を発現するおよびそれ故に宿主株のウリジン栄養要求性を
捕捉するその能力に基づいて同定および選択される。次に得られた形質転換体に
ついてサザンブロッティングが実施され、欠失されるべき遺伝子のゲノムコピー
コード領域の一部またはすべてをpyr4選択可能マーカーで置き換える二重交
差組込みを同定および確認する。
しているが、本発明はこれらのベクターに限定されるわけではない。上の技術を
使用して、トリコデルマ sp.株において種々の遺伝子が欠失および置き換え
できる。加えて、上で議論したような任意の選択可能マーカーが使用できる。実
際、クローン化され、同定された任意のトリコデルマ sp.遺伝子が上記の戦
略を使用してゲノムから欠失できる。
可能マーカーに対応する遺伝子を欠くかまたは持っているトリコデルマ sp.
の誘導体である。例えば、もしpyr4の選択可能マーカーが選択されたとした
ら、形質転換過程においては特異的pyr4- 誘導体株が受容体として使用され
る。同様に、アスペルギルス ニデュランス遺伝子amdS、argB、trp C 、niaDと等価なトリコデルマ sp.遺伝子を含んでいる選択可能マーカ
ーを使用してもよい。対応する受容体株はそれ故、各々amdS- 、argB- 、 trpC- 、niaD- のような誘導体株でなければならない。
入するために調製される。本発明に従うと、EGIII様セルラーゼをコード化
しているDNAは機能的セルロース分解活性を持つタンパク質をコード化するの
に必要なすべてのDNAを含んでいる。EGIII様セルラーゼまたは誘導体を
コード化しているDNA断片またはDNA変異体断片は、真菌プロモーター配列
(例えば、cbh1またはegl1遺伝子のプロモーター)に機能的に結合され
ている。
Aの一つ以上のコピーが株内へ組換えられることも企図される。EGIII様セ
ルラーゼをコード化しているDNAは、セルラーゼをコード化しているDNAを
運んでいる発現ベクターの構築により調製されるであろう。EGIII様セルラ
ーゼをコード化している挿入されたDNA断片を運んでいる発現ベクターは、与
えられた宿主生物体中で自発的に複製できるか、または宿主のDNA(典型的に
はプラスミド)内へ組み込むことができる任意のベクターである。好適な態様に
おいて、遺伝子の発現を得るために二つの型の発現ベクターが企図された。第一
のものは、プロモーター、遺伝子コード領域およびターミネーター配列がすべて
発現されるべき遺伝子に起源を発するDNA配列を含んでいる。遺伝子切断は望
まれる場所で望まれないDNA配列(例えば、望まれないドメインをコード化し
ている)を欠失させ、それ自身の転写および翻訳調節配列の制御下で発現される
べきドメインを残すことにより得られる。選択可能マーカーもまたベクター上に
含まれており、新規遺伝子配列の多数のコピーの、宿主内への組込みのための選
択を可能にしている。
能マーカーに必要な配列を含んでいる。遺伝子またはその一部のコード領域が、
発現カセットプロモーターおよびターミネーター配列の転写調節下にあるように
、この一般目的発現ベクター内へ挿入できる。例えば、pTEXはそのような一
般目的発現ベクターである。遺伝子またはその一部は強力なcbh1プロモータ
ーの下流に挿入できる。
列は転写および翻訳配列へ作動可能なように結合されなければならない、即ち、
構造遺伝子の読み枠内の適したプロモーター配列およびシグナル配列。プロモー
ターは宿主細胞中で転写活性を示すDNA配列であり、宿主細胞に対して同種の
または異種のタンパク質をコード化している遺伝子から誘導されるであろう。シ
グナルペプチドはEGIII様セルラーゼまたはその誘導体の細胞外産生を提供
する。シグナル配列をコード化しているDNAは好適には発現されるべき遺伝子
に天然に付随するものであるが、任意の適した起源(例えば、トリコデルマから
のエキソ−セロビオヒドロラーゼまたはエンドグルカナーゼ)からのシグナル配
列が本発明で企図される。
ーを結合するために使用された方法および適したベクター内への挿入は本分野で
はよく知られている。
イクロインジェクション、マイクロポレーション、生物分解性ボンバードメント
などのような既知の技術に従って宿主細胞内へ導入されるであろう。
る細胞壁の透過性は非常に低いことを考えに入れなければならない。従って、所
望のDNA配列、遺伝子または遺伝子断片の取り込みは最も少ない。形質転換過
程に先立って、誘導体株(即ち、機能性遺伝子を欠き、使用された選択可能マー
カーが対応している)中のトリコデルマ sp.細胞壁の透過性を増加させる多
くの方法が存在する。
真菌菌糸からのプロトプラストの調製が挙げられる。菌糸は発芽した栄養胞子か
ら得ることができる。菌糸を、細胞壁を消化する酵素で処理するとプロトプラス
トが得られる。プロトプラストは次に懸濁培地中、浸透圧安定化剤の存在により
保護される。これらの安定化剤にはソルビトール、マンニトール、塩化カリウム
、硫酸マグネシウムなどが含まれる。通常、これらの安定化剤の濃度は0.8M
から1.2Mの間で変化する。懸濁培地中、約1.2Mのソルビトールを使用す
るのが好適である。
に依存している。一般的に、約10mM CaCl2および50mM CaCl2 の間の濃度が取り込み溶液で使用される。取り込み溶液ではカルシウムイオンに
対する要求のほかに、他の成分としてTE緩衝液(10mMトリス、pH7.4
;1mM EDTA)または10mM MOPS、pH6.0緩衝液(モルホリ
ンプロパンスルホン酸)のような緩衝化系およびポリエチレングリコール(PE
G)が一般的に含まれている。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させるよ
うに作用することが信じられており、それ故、培地内容物は宿主トリコデルマ sp .株の細胞質内へ送達され、プラスミドDNAが核へ輸送されるのを可能に
すると信じられている。この融合はしばしば宿主染色体内へそっと組み込まれた
プラスミドDNAの多数のコピーを残す。
ml、好適には2x108/mlの密度で含んでいる懸濁液が形質転換に使用さ
れた。適当な溶液(例えば、1.2Mソルビトール;50mM CaCl2)に
懸濁したこれらのプロトプラストまたは細胞の100マイクロリットル量が所望
のDNAと混合される。一般的に、高濃度のPEGが取り込み溶液へ加えられる
。0.1から1容量の25%PEG4000をプロトプラスト懸濁液へ加えるこ
とができる。しかしながら、約0.25容量をプロトプラスト懸濁液へ加えるの
が好適である。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム
などのような添加物が取り込み溶液へ加えられ、形質転換を助ける。
伝子またはDNA配列の取り込みを促進するために追加のPEGが混合物に加え
られる。25%PEG4000は一般に形質転換混合物の5から15倍の容量で
加えられる;しかしながら、より多いまたはより少ない容量が適しているであろ
う。25%PEG4000は形質転換混合物の約10倍の容量が好適である。P
EGを加えた後、形質転換混合物は次にソルビトールおよびCaCl2溶液を加
える前に室温でインキュベートする。プロトプラスト懸濁液はさらに次に増殖培
地の融解物を加える。この増殖培地は形質転換体の増殖のみを許している。所望
の形質転換体の増殖に適した任意の増殖培地が本発明で使用できる。しかしなが
ら、もしPyr+ 形質転換体が選択されていたら、ウリジンを含んでいない増殖
培地を使用するのが好適である。続いて起こるコロニーはウリジンを枯渇させた
増殖培地上に移し、精製する。
ギザギザしたよりもなめらかな輪郭を持つ環状コロニーの形成により、不安定な
形質転換体から安定な形質転換体が区別される。加えて、いくつかの場合には、
固形非選択的培地(即ち、ウリジンを含んでいる)上で形質転換体を増殖させ、
この培養培地から胞子を採取し、およびウリジンを欠く選択培地上で芽吹くおよ
び増殖するであろうこれらの胞子のパーセントを決定することにより安定性の更
なる試験が行われるであろう。
が、新規EGIII様セルラーゼまたはその誘導体の適した翻訳後プロセッシン
グの結果として、液体培地中での増殖後に宿主細胞から活性な形で回収される。
中の塩(例えば、硫酸アンモニウム)によるタンパク質沈殿による培地からの細
胞の分離を含む通常の技術により培地から回収される。さらに、イオン交換クロ
マトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラ
フィー法が使用される。抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)は天然の
精製EGIII様セルラーゼに対して高められ、または合成ペプチドがEGII
I様セルラーゼ分子の一部から調製され、ポリクローナル抗体を高めるのに使用
された。
またはクリーニングが企図された。そのような処理にはストーンウォッシング、
セルロース含有織物の質感、感触および/または外観の改良、またはセルロース
含有織物の製造またはクリーニング/再コンディショニング間に使用されるその
他の技術が含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、本発明の文
脈内で、処理するとはセルロース性織物または繊維からの”未熟な”または”死
んだ”綿の除去も企図している。未熟な綿は成熟綿よりも著しく無定形であり、
存在した場合、例えば、染斑のため織物の質が落ちる。本発明で企図された組成
物はさらに、汚れて製造されたセルロース含有織物の洗浄で使用するためのセル
ラーゼ成分を含んでいる。例えば、セルラーゼはランドリー洗浄のための洗浄剤
組成物にも使用される。本発明に従った有用な洗浄剤組成物には、前洗浄、前浸
漬および家庭用色回復組成物のような特別の処方を含んでいる。そのような処理
組成物は、本明細書で説明するように、希釈を必要とする濃縮液の形でまたは希
釈溶液の形で、またはセルロース含有織物へ直接的に応用できる形であろう。織
物のセルラーゼ処理の一般的処理技術は、例えば、EP出願第220 016号
およびGB出願第1,368,599および2,095,275号に記載されて
いる。
/または紙、食品および穀物の本分野で既知の目的のための処理が含まれる。例
えば、セルラーゼは動物飼料の価値を高め、木材パルプの廃棄率を改良し、食品
生産物の価値を高め、および穀物浸漬製粉または乾式製粉過程間に穀物の繊維を
減少させることが知られている。
剤を含む他の追加の成分と一緒に有効量のセルラーゼを含んでいる水性溶液を調
製することを含んでいる。セルラーゼ酵素組成物の有効量は、意図する目的に十
分なセルラーゼ酵素の濃度である。従って、例えば、本発明に従ったストーンウ
ォッシング組成物におけるセルラーゼの”有効量”は所望の効果(例えば、継ぎ
目および織物の一画に摩損したおよび色あせた外観を生み出す)を提供するであ
ろう量である。同様に、セルロース含有織物の感触および/または外観を改良す
ることが意図された組成物における”有効量”とは感触(例えば、織物の滑らか
さの改良)または外観(例えば、織物外観の鮮明さを減少させがちであるピルお
よび小繊維を除去する)に観察できる改良を生み出すであろう量である。用いら
れるセルラーゼの量はまた、使用される装置、用いられるプロセスパラメーター
(セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼへの暴露時間など)、およびセルラー
ゼ活性(例えば、特定の溶液はより低い濃度を必要とするであろうが、そこでは
より活性の低いセルラーゼ組成物と比較してより活性なセルラーゼ組成物が使用
される)にも依存している。処理されるべき織物が加えられる水性処理溶液にお
けるセルラーゼの正確な濃度は、上記の因子ならびに所望の結果に基づいて、当
業者は容易に決定できる。ストーンウォッシング過程においては、約0.5から
5,000ppmおよび最も好適には約10から200ppm総タンパク質の濃
度で水性処理溶液中にセルラーゼが存在するのが一般的に好適である。セルロー
ス含有織物の感触および/または外観の改良のための組成物においては、約0.
1から2,000ppmおよび最も好適には約0.5から200ppm総タンパ
ク質の濃度で水性処理溶液中にセルラーゼが存在するのが一般的に好適である。
られたセルラーゼの性質に依存している)溶液のpHを保つのに十分である緩衝
液濃度であるように緩衝液が処理組成物に用いられる。用いられる緩衝液の正確
な濃度は、当業者が容易に考えに入れられるいくつかの因子に依存するであろう
。例えば、好適な態様において、緩衝液ならびに緩衝液濃度は、至適セルラーゼ
活性に必要とされるpH範囲内に最終セルラーゼ溶液のpHが維持されるように
選択される。本発明のセルラーゼの至適pH範囲の決定はよく知られた技術に従
って確認できる。セルラーゼの活性範囲内pHの適した緩衝液は当業者にはよく
知られている。
。適した界面活性剤にはセルラーゼおよび織物に合致した任意の界面活性剤が含
まれ、例えば、陰イオン性、非イオン性および両性界面活性剤が含まれる。ここ
で使用するための適した陰イオン性界面活性剤には、直鎖または分岐鎖アルキル
ベンゼンスルホナート;直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を持っ
ているアルキルまたはアルケニルエーテルスルファート;アルキルまたはアルケ
ニルスルファート;オレフィンスルホナート;アルカンスルホナートなどが含ま
れる。陰イオン性界面活性剤のために適した対イオンにはナトリウムおよびカリ
ウムのようなアルカリ金属イオン;カルシウムおよびマグネシウムのようなアル
カリ土類金属イオン;アンモニウムイオン;および炭素数2または3のアルカノ
ール基を1から3持っているアルカノールアミンが含まれる。両性界面活性剤に
は四級アンモニウム塩スルホナートおよびベタイン型両性界面活性剤が含まれる
。そのような両性界面活性剤は同一の分子中に陽性および陰性の両方の荷電基を
持っている。非イオン性界面活性剤は一般にポリオキシアルキレンエーテル、な
らびにその高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、お
よび脂肪酸グリセリンモノエステルを含んでいる。界面活性剤の混合物もまた当
業者には既知の様式で用いることができる。
のような濃縮物は前記のセルラーゼ組成物、緩衝液および界面活性剤の濃縮量を
、好適には水溶液として含んでいる。そのように処方された場合、必要な各々の
成分濃度を持っているセルラーゼ調製物を迅速におよび正確に調製できるように
、セルラーゼ濃縮物は水で容易に希釈できる。水性濃縮物が処方された場合、こ
れらの濃縮物は上に示したようにセルラーゼ溶液中の成分の必要とされる濃度に
達するように希釈できる。容易に明らかなように、そのような濃縮物はセルラー
ゼ溶液の容易な処方を可能にし、ならびに組成物が使用されるであろう場所への
組成物の容易な輸送を可能にする。処理濃縮液は本分野で容認された任意の形状
(例えば、液体、乳液、ゲルまたはペーストなど)にできる。
状または固形円盤であろう。顆粒は、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減少させる
ための物質を含ませるように処方できる。そのような物質および顆粒は米国特許
第5,254,283号(全体が本明細書において援用される)に開示されてい
る。
て使用でき、組成物の最終的使用に依存して石、軽石、充填剤、溶媒、酵素活性
化剤、および抗析出剤が含まれる。
メーターは他の応用(即ち、織物の感触および/または外観の改良)のために容
易に修正される。処理組成物とストーンウォッシング組成物を混ぜ合わせること
により、セルロース含有織物と有効量のセルラーゼを含んでいるセルラーゼ含有
ストーンウォッシング組成物接触させ、それによりセルラーゼ酵素を織物の近傍
に持っていく。続いて、セルラーゼおよび織物を含んでいる水性溶液をかき混ぜ
る。もし処理組成物が水性溶液であれば、織物は溶液に直接浸漬する。同様に、
ストーンウォッシング組成物が濃縮物である場合は、濃縮物はセルロース含有織
物とともにウォーターバス内で希釈される。ストーンウォッシング組成物が固体
形の場合(例えば、前洗浄ゲルまたは固形の棒)、ストーンウォッシング組成物
は、組成物を織物または洗浄液へ直接加えることにより接触させる。
ンウォッシングされた外観を与えるのに有効な条件下、ストーンウォッシング溶
液とインキュベートする。例えば、ストーンウォッシングの間、pH、溶液比、
温度および反応時間は、ストーンウォッシング組成物が働く条件を最適にするよ
うに調節される。”有効な条件”とは必然的にセルラーゼ酵素がセルロース含有
織物と有効に反応する(この場合、ストーンウォッシング効果を生み出す)pH
、溶液比および温度を意味している。しかしながら、そのような条件は容易に当
業者により容易に確認される。本発明のストーンウォッシング組成物に有効な反
応条件は、対応する従来の技術のセルラーゼ組成物で使用された既知の方法と実
質的に類似している。従って、本発明のストーンウォッシング組成物を使用する
ための条件を最高にすることは当業者の範囲内である。
るストーンウォッシング組成物溶液(即ち、洗浄溶液)の重量の比は一般的には
、デニム織物で所望のストーンウォッシング効果を達成するのに十分な量であり
、使用される方法に依存する。好適には、溶液比は約4:1から約50:1;よ
り好適には約5:1から約20:1;および最も好適には約10:1から約15
:1である。
つの競合する因子により支配されている。第一に、より高い温度は一般的に反応
動力学に対応しており(即ち、より速い反応)、それはより低い温度で必要とさ
れる反応時間と比較すると反応時間の減少を可能にする。従って、反応温度は一
般的に低くとも10℃およびそれ以上である。第二に、セルラーゼはタンパク質
であり、ある反応温度を超えると活性を失い、その温度は使用されるセルラーゼ
の性質に依存している。従って、反応温度が許容されるよりも非常に高かったら
、セルラーゼが変性する結果としてセルロース分解活性が失われる。本分野にお
けるセルラーゼ使用の標準温度は一般に35℃から65℃の範囲であり、その条
件は本発明のセルラーゼにも適していると期待されるが、至適温度条件は使用さ
れた特異的セルラーゼに関し、よく知られた技術に従って確認されなければなら
ない。
ば、pH、温度およびセルラーゼの濃度すべてが最適反応時間に影響するであろ
う。一般的に、反応時間は約5分から約5時間、好適には約10分から約3時間
、およびより好適には約20分から約1時間である。
に用いられるであろう。本発明に従った洗浄剤組成物は前洗浄組成物、前浸漬組
成物または通常の洗浄またはすすぎサイクル間のクリーニングのために有用であ
る。好適には、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤およ
び随意に以下に記載するような他の成分を含んでいる。
物に対してセルラーゼにより生み出されることが知られている所望の効果、例え
ば、脱ピリング、柔軟化、抗ピリング、表面繊維除去、抗灰色化およびクリーニ
ング、を与えるのに十分な量である。好適には、洗浄剤組成物中のセルラーゼは
洗浄剤の約10ppmから約20,000ppmの濃度で用いられる。
希釈により、セルラーゼ酵素の濃度が約0.01から約1000ppm、好適に
は約0.02ppmから約500ppm、および最も好適には約0.5ppmか
ら約250ppm総タンパク質の範囲である。洗浄剤組成物中に用いられるセル
ラーゼ酵素の量は洗浄溶液を形成するために水の添加により洗浄剤が希釈される
であろう程度に依存するであろう。
、ゲルまたはペーストであろう。そのような形は当業者にはよく知られている。
固形洗浄組成物が用いられる場合、セルラーゼは顆粒として好適に処方される。
好適には、顆粒はセルラーゼ保護剤を追加で含むように処方できる。顆粒は、洗
浄媒質への顆粒の溶解速度を減少させる物質を含むように処方できる。そのよう
な物質および顆粒は米国特許第5,254,283号(全体が本明細書において
援用される)に開示されている。
剤組成物での使用がよく知られている陰イオン性、非イオン性および両性界面活
性剤が含まれる。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加え、本発明の洗浄剤組
成物は随意に一つまたはそれ以上の下記の成分を含むことができる:セルラーゼを除いた加水分解酵素 適した加水分解酵素には、エステル結合に作用するカルボン酸エステル加水分
解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸モノエステル加水分解酵素、および
リン酸ジエステル加水分解酵素;グリコシル化合物に作用するグリコシド加水分
解酵素;N−グリコシル化合物を加水分解する酵素;エーテル結合に作用するチ
オエーテル加水分解酵素;およびペプチド結合に作用するa−アミノ−アシル−
ペプチド加水分解酵素、ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素、アシル−アミノ酸
加水分解酵素、ジペプチド加水分解酵素およびペプチジル−ペプチド加水分解酵
素が含まれる。これらの中で好適であるのはカルボン酸エステル加水分解酵素、
グリコシド加水分解酵素およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素である。適し
た加水分解酵素には以下のものが含まれる:(1)ペプシン、ペプシンB、レニ
ン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、エンテ
ロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、
フィブリノシン、サブチリシン、アスペルギロペプチダーゼA、コラゲナーゼ、
クロストリジオペプチダーゼB、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD、
ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC、ペプシンC、アスペルギロペプ
チダーゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびBおよびアミノペ
プチダーゼのようなペプチジル−ペプチド加水分解酵素に属しているプロテアー
ゼ;(2)グリコシド加水分解酵素(必須の構成要素であるセルラーゼはこの群
から除かれている)α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イン
ベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼおよびデキストラーゼ。こ
れらは酸から中性系で機能するが、細菌から得られたものはアルカリ性系で高い
活性を示す;(3)カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラー
ゼおよびクロロフィラーゼを含むカルボン酸エステル加水分解酵素。これらの中
で特に有効なのはリパーゼである。
内へ取り込まれる。0.001から5重量パーセント、およびより好適には0.
02から3重量パーセント(精製されたタンパク質として)の量を好適に組み込
むべきである。この酵素は洗浄剤組成物中、粗酵素単独または他の成分と組み合
わせて作られた顆粒の形で使用すべきである。粗酵素の顆粒は、顆粒中で精製さ
れた酵素が0.001から50重量パーセントである量で使用される。顆粒は0
.002から20および好適には0.1から10重量パーセントの量で使用され
る。セルラーゼでは、これらの顆粒は酵素保護剤および溶解遅延物質を含むよう
に処方できる。ビルダー A.二価金属イオン封鎖剤 組成物は以下の化合物のアルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩から成る
群より選択される一つまたはそれ以上のビルダー成分を約0から約50重量パー
セント含んでいるであろう:リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、
アミノ酸の塩、アミノポリ酢酸塩高分子量電解質、非解離性ポリマー、二カルボ
ン酸の塩およびアルミノケイ酸塩。適した二価金属イオン封鎖剤は英国特許出願
第2 094 826 Aに開示されている(その開示は本明細書において援用
される)。B.アルカリまたは無機電解質 組成物は、下記の化合物の一つまたはそれ以上のアルカリ金属塩の組成に基づ
いて、約1から約50重量パーセント、好適には約5から約30重量パーセント
、アルカリまたは無機電解質として含んでいるであろう:ケイ酸塩、炭酸塩およ
び硫酸塩ならびにトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノール
アミンおよびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリ。抗再沈殿剤 組成物は一つまたはそれ以上の下記の化合物を約0.1から約5重量パーセン
ト、抗再沈殿剤として含んでいるであろう:ポリエチレングリコ−ル、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロース。
−ルと本発明のセルラーゼ組成物の組み合わせは特に有用なごみ除去組成物を提
供した。漂白剤 一過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム
/過酸化水素付加体および塩化ナトリウム/過酸化水素付加体または/およびス
ルホン酸化フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような光感受性漂白色
素のような漂白剤と組み合わされた本発明のセルラーゼの使用は洗浄効果をさら
に改良する。同様に、EP683 304に開示されているような漂白剤および
漂白触媒を使用してもよい。青味剤および蛍光色素 種々の青味剤および蛍光色素が必要に応じ、組成物へ組み込まれるであろう。
適した青味剤および蛍光色素は英国特許出願第2 094 826 Aに開示さ
れている(その開示は本明細書において援用される)。ケーキング阻害剤 以下のケーキング阻害剤が粉末状洗浄剤に組み込まれるであろう:p−トルエ
ンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、
細かく微粉状にしたシリカ、無定形シリカ、粘土、ケイ酸カルシウム(John
s Manville Co.のMicro−Cellのような)、炭酸カルシ
ウムおよび酸化マグネシウム。セルラーゼ活性を阻害する因子のためのマスキング剤 本発明のセルラーゼ組成物はいくつかの場合、銅、亜鉛、クロム、水銀、鉛、
マンガン、または銀イオンまたはそれらの化合物の存在で不活性化される。種々
の金属キレート剤および金属沈殿剤がこれらの阻害剤に対して有効である。それ
らには、例えば、追加の添加物に関して前に掲げたような二価金属イオン封鎖剤
ならびにケイ酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが含まれる。
する。可能な限りこれらのサッカリドとセルラーゼの共存は避ける方が好適であ
る。共存が避けられない場合、サッカリドとセルラーゼの直接接触を避ける必要
があり、例えば、それらをコーティングする。
る。しかしながら、これらの物質とセルラーゼの共存は、もしそれらの直接的接
触が錠剤化またはコーティングのようないくつかの手段により防止されていれば
可能である。
あろう。セルラーゼ活性化剤 活性化剤は特定のセルラーゼに依存して変化するであろう。タンパク質、コバ
ルトおよびその塩、マグネシウムおよびその塩、カルシウムおよびその塩、カリ
ウムおよびその塩、ナトリウムおよびその塩、またはマンノースおよびキシロー
スのようなモノサッカリドの存在下、多くのセルラーゼは活性化され、それらの
洗浄力は顕著に改良される。抗酸化剤 抗酸化剤には、例えば、tert−ブチル−ヒドロキシトルエン、4,4’−
ブチリデンビス(6−tert−ブチル−3−メチルフェノール)、2,2’−
ブチリデンビス(6−tert−ブチル−4−メチルフェノール)、一スチレン
化クレゾール、一スチレン化フェノール、二スチレン化フェノールおよび1,1
−ビス(4−ヒドロキシ−フェニル)シクロヘキサンが含まれる。可溶化剤 可溶化剤には、例えば、エタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホ
ン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩
、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼンスルホン酸塩、
アセトアミド、ピリジンカルボン酸アミド、安息香酸塩および尿素が含まれる。
。好適な態様において、本発明の洗浄剤組成物は約5から約12を超えないpH
を持っている弱酸性、中性またはアルカリ性洗浄剤洗浄媒質中で使用できる。
の洗浄剤組成物とともに使用できる。そのような成分は本分野でこれまで使用さ
れてきた量で都合よく用いられる。
を含む既知の製造法により製造されるであろう。噴霧乾燥法、凝塊形成法、乾燥
混合法または非塔式経路法により得られた洗浄剤基剤が特に好適である。噴霧乾
燥法により得られた洗浄剤基剤は製造状態に関して制限を受けない。噴霧乾燥法
により得られた洗浄剤基剤は中空の顆粒であり、表面活性剤およびビルダーのよ
うな熱耐性成分の水性スラリーを熱空間へ噴霧することにより得られる。噴霧乾
燥後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリビルダーが加えられる。噴霧−乾燥−
顆粒化または凝塊形成法のようにして得られた高密度、顆粒性洗浄剤基剤でも、
基剤の製造後に種々の成分が加えられるであろう。
ろう。洗浄剤中でのセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を起こ
さないために、カルボキシメチルセルロースは組成物への組み込みの前に顆粒化
または被覆するのが望ましい。
および家庭用使用において、これらで通常用いられる温度、反応時間および溶液
比でインキュベートされる。インキュベーション条件(即ち、本発明の洗浄剤組
成物によるセルロース含有織物の処理に有効な条件)は当業者により容易に確認
可能であろう。従って、本洗浄剤組成物による処理に有効な適切な条件は、既知
のセルラーゼを含む同様の洗浄剤組成物で用いた条件に対応しているであろう。
防止、表面繊維除去またはクリーニングを提供するための十分な活性が存在する
適切な溶液中、中程度のpHでの前洗浄剤としても処方されるであろう。洗浄剤
組成物が前浸漬(例えば、前洗浄または前処理)組成物である場合、液体、スプ
レー、ゲルまたはペースト組成物として、セルラーゼ酵素は前浸漬または前処理
組成物の総重量に基づいて約0.0001から約1重量パーセントで一般的に用
いられる。そのような組成物において、界面活性剤が随意に用いられており、用
いられる場合は一般的に、前浸漬物の総重量に基づいて約0.005から約20
重量パーセントの濃度で存在しているであろう。該組成物の残りには、前浸漬に
使用される通常の成分、即ち、希釈剤、緩衝化剤、他の酵素(プロテアーゼ)な
どが通常の濃度で含まれている。
色回復のための独立型組成物(例えば、米国特許第4,738,682号、全体
が本明細書において援用される)として、ならびに斑点除去および脱ピリングお
よび抗ピリング(ピリング防止)のために家庭用として使用できることが企図さ
れている。
の加工に特に有用であろう。これらの追加の工業的応用は各々、例えば、PCT
出願第95/16360号およびフィンランド許可特許第87372号に開示さ
れている。
が、それらは本発明の例示のために提供されており、どのような意味でも本発明
の範囲を制限すると解釈してはならない。実施例 実施例1 EGIII様セルラーゼをコード化しているゲノムDNAの調製 EGIII様セルラーゼが特定の生物体のDNAによりコード化されているか
どうかを決定するPCR反応を行う目的のため、いくつかの異なった微生物でゲ
ノムDNAが調製された。
34;ケトミウム ブラシリエンス 寄託番号CBS 140.50;ケトミウ ム ビテリウム 寄託番号CBS 250.85;エメリセラ デセルトル 寄
託番号CBS 653.73;フザリウム エキセチ 寄託番号CBS 185
.34;グリオクラジウム ロゼウム 寄託番号CBS 443.65;フミコ ーラ グリセア 変異体サーモイジア 寄託番号CBS 225.63;ミセリ オプトラ サーモフィラ 寄託番号 ATCC 48102−48104;ペニ シリウム ノタツム 寄託番号 ATCC 9178,9179;およびファネ ロカエテ クリソスポリウム 寄託番号 ATCC 28326から得られ、標
準法に従って単離された。
oCyclerのような標準PCR機で下記の条件で実施された: 1)98℃で1分 1サイクル; 2)94℃で1分 40℃で90秒 72℃で1分 3)工程2を30サイクル繰り返す 4)72℃で7分 1サイクル 5)保存およびさらなる分析のため15℃へ温度を下げる。
使用するため以下のDNAプライマーが構築された。タンパク質およびDNA配
列において本明細書で使用されたすべての記号はIUPAC IUB 生化学命
名委員会コードに対応している。
イマー 正プライマー FRG010:AAY AAY AAY HWI TGG
GG
TGG 逆プライマー FRG012:CCA DAT CAT IAR YTC
RTA
CC 逆プライマー FRG006:GTR AAN GGY TCR GTY
CC 逆プライマー FRG007:GTR AAN GGY TCY GTR
CC 逆プライマー FRG008:GTR AAN GGY TCY GTY
CC 逆プライマー FRG009:GTR AAR CAY TCN GTN
CC
号1644−947)のためのPCR条件は、10マイクロリットルの10X反
応緩衝液(10X反応緩衝液は100mMトリス HCl、pH8−8.5;2
50mM KCl;50 mM (NH4)2SO4;20mM MgSO4を含ん
でいる);各々0.2mM dATP、dTTP、dGTP、dCTP(最終濃
度)、1マイクロリットルの100ナノグラム/マイクロリットル ゲノムDN
A、1マイクロリットルのPWO マイクロリットル当たり1単位、500mM
プライマー(最終濃度)および水で100マイクロリットルに、から作られた1
00マイクロリットル溶液から成っている。溶液には鉱物油が層積された。
X1およびBOX1’のための正プライマーとBOX3からの逆プライマーを併
用し、ゲルで分離して400−1000塩基対範囲に断片を得た。得られた断片
はプールし、プールしたものを二つのほとんど等量の部分に分割した。第一のプ
ールはBOX1およびBOX1’からの正プライマーならびにBOX2からの逆
プライマーと一緒にした。第二のプールはBOX2からの正プライマーならびに
BOX3からの逆プライマーと一緒にした。遺伝子内のプライマーの位置を考え
、EGIII様セルラーゼに関連した大体のサイズを持つ断片(この場合、25
0−500塩基対間のものに対応する)を単離し、配列決定した。
ゲノム末端の迅速増幅)技術を使用することが可能であった。完全長遺伝子が得
られ、いくつかの追加のEGIII様皿配列と図3に提供されている。図3に示
されたように、ヒポクレア シュベイニッツイ、アスペルギルス アクレアタス 、アスペルギルス カワキイ(1)、アスペルギルス カワキイ(2)、アスペ ルギルス オリゼ、フミコーラ グリセア、フミコーラ インソレンス、ケトミ ウム ブラシリエンス、フザリウム エキセチ、フザリウム ジャパニクム(1
)、フザリウム ジャパニクム(2)、グリオクラジウム ロゼウム(1)、グ リオクラジウム ロゼウム(2)、グリオクラジウム ロゼウム(3)、グリオ クラジウム ロゼウム(4)、メンノニエラ エキナータ、放線菌11AG8、 ストレプトマイセス リビダンス CelB、ロドテルムス マリヌス、エメリ セラ デセルトルおよびエルウィニア カロトボーラから単離された完全長遺伝
子はすべてトリコデルマ レーセイからのEGIIIと有意の相同性を含んでい
る。実施例2 EGIIIおよびEGIII様セルラーゼの温度安定性試験 EGIIIおよびフミコーラ グリセア、フミコーラ インソレンス、エメリ セラ デセルトル、フザリウム ジャパニクムおよびメンノニエラ エキナータ から誘導されたEGIII様同族体が温度ストレス下での安定性を決定するため
に試験された。
することによりアッセイされた:0.1mg/mlおよび0.5mg/ml間で
50mMクエン酸/リン酸緩衝液(pH8.0)中のEGIIIおよびEGII
I様セルラーゼ溶液を48℃の水浴中でインキュベートした。計測時間点に10
0μlを採り、急速に冷却(または凍結)した。これらの試料中に残っている活
性を以下に詳細に説明するようにアッセイした。不可逆的熱不活性化曲線を、残
存活性vs時間をプロットすることにより得、データは単一指数関数減衰に適合
した。この指数関数的減衰の半減期が熱安定性の尺度として決定された。 活性アッセイ:96ウェルマイクロプレートのウェルに、10μlの酵素試料を
120μlの基質(4.2mg/ml o−ニトロフェニル セロビオシド)の
50mMリン酸カリウム溶液(pH6.7)へ加えた。プレートは40℃で10
分間インキュベートし、次に反応を70μlの0.2Mグリシンで停止させた。
410nmでの吸光度(基質の酵素的切断により放出されたo−ニトロフェノー
ルによる)をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。この終点410n
m読みとりは酵素試料中のセルラーゼ活性と比例した。
良された安定度を持っていた。従って、これらの残基の相違がEGIII同族体
の改良された安定性に決定的であることが明らかであり、そういうものとして、
これらの残基の修飾によるEGIII様セルラーゼさらなる改良はEGIII様
酵素の安定性の改良をさらに増強するであろう。
タンパク質アミノ酸配列を示しており、本発明に従って説明された残基が示され
ている。
のEGIIIのDNA配列を示している。
様セルラーゼの完全長配列のアラインメントを示しており、一次構造モデル化に
基づいた等価な残基が示されており、ヒポクレア シュベイニッツイ、アスペル ギルス アクレアタス、アスペルギルス カワキイ(1)、アスペルギルス カ ワキイ (2)、アスペルギルス オリゼ、フミコーラ グリセア、フミコーラ インソレンス 、ケトミウム ブラシリエンス、フザリウム エキセチ、フザリウ ム ジャパニクム(1)、フザリウム ジャパニクム(2)、グリオクラジウム ロゼウム(1)、グリオクラジウム ロゼウム(2)、グリオクラジウム ロ ゼウム (3)、グリオクラジウム ロゼウム(4)、メンノニエラ エキナータ 、放線菌11AG8、ストレプトマイセス リビダンス CelB、ロドテルム ス マリヌス、エメリセラ デセルトルおよびエルウィニア カロトボーラから
誘導されたものが含まれている。
様セルラーゼの完全長配列のアラインメントを示しており、一次構造モデル化に
基づいた等価な残基が示されており、フミコーラ インソレンス、フミコーラ グリセア 、トリコデルマ レーセイ、ヒポクレア シュベイニッツイ、メンノニ エラ エキナータ、フザリウム ジャパニクムおよびエメリセラ デセルトルか
ら誘導されたものが含まれている。
Claims (19)
- 【請求項1】 変異体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼであって、
但し該変異体はトリコデルマ レーセイ(Trichoderma reese i )からのEGIII中の残基T2、S3、A8、F10、S18、A24、S
25、F30、G31、V36、L38、A42、A46、D47、Q49、Q
61、Q64、I65、A66、Q69、A83、S86、S90、V109、
T110、Y111、K123、D126、S133、Q134、G135、V
139、T145、Q162、N164、T166、Y168、N174、R1
80、K183、N186、A188、G189、V192、L193、S20
5、G206、N209、A211、T214および/またはI217の一つま
たはそれ以上に対応する位置での置換または欠失を含んでいる。 - 【請求項2】 該セルラーゼが真菌、細菌または放線菌類に由来している請
求項1に記載のセルラーゼ。 - 【請求項3】 該セルラーゼがエンドグルカナーゼである請求項1に記載の
セルラーゼ。 - 【請求項4】 該真菌が糸状菌である請求項1に記載のセルラーゼ。
- 【請求項5】 該糸状菌が真正子嚢菌類に属している請求項4に記載のセル
ラーゼ。 - 【請求項6】 該真正子嚢菌類がアスペルギルスspp.、グリオクラディ ウムspp .、フザリウムspp.、アクレモニウムspp.、ミセリオフトラ spp .、ベルチシリウムspp.、ミロセシウムspp.、ペニシリウムsp p .である請求項5に記載のセルラーゼ。
- 【請求項7】 請求項1に記載のセルラーゼをコードしているDNA。
- 【請求項8】 請求項7のDNAを含んでいるベクター。
- 【請求項9】 請求項8のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項10】 以下の工程から成るセルラーゼの製造法: (a)セルラーゼを製造するのに適した条件下、適した培養培地中で請求項9
に記載の宿主細胞を培養し; (b)該製造されたセルラーゼを得る;および随意に (c)精製されたセルラーゼ製造物を提供するために該セルラーゼを精製する
。 - 【請求項11】 界面活性剤およびセルラーゼを含んでいる洗浄剤組成物で
あって、但し該セルラーゼは界面活性剤感受性残基に置換を含んでいる変異体E
GIII様セルラーゼから成っている。 - 【請求項12】 該変異体EGIIIまたはEGIIIセルラーゼがトリコ デルマ レーセイからのEGIII中の残基T2、S3、A8、F10、S18
、A24、S25、F30、G31、V36、L38、A42、A46、D47
、Q49、Q61、Q64、I65、A66、Q69、A83、S86、S90
、V109、T110、Y111、K123、D126、S133、Q134、
G135、V139、T145、Q162、N164、T166、Y168、N
174、R180、K183、N186、A188、G189、V192、L1
93、S205、G206、N209、A211、T214および/またはI2
17の一つまたはそれ以上の位置に置換または欠失を含んでいる請求項11に記
載の洗浄剤。 - 【請求項13】 該洗浄剤がランドリー洗浄剤である請求項12に記載の洗
浄剤。 - 【請求項14】 該洗浄剤が皿洗浄剤である請求項12に記載の洗浄剤。
- 【請求項15】 セルロース含有織物の処理における請求項1に記載の変異
体EGIIIまたはEGIII様セルラーゼの使用。 - 【請求項16】 飼料添加物としての請求項1に記載のEGIIIまたはE
GIII様セルラーゼの使用。 - 【請求項17】 木材パルプの処理における請求項1に記載のEGIIIま
たはEGIII様セルラーゼの使用。 - 【請求項18】 グルコースへのバイオマスの減少における請求項1に記載
のEGIIIまたはEGIII様セルラーゼの使用。 - 【請求項19】 ストーンウォッシングまたはインジゴ染色デニムにおける
請求項1に記載のEGIIIまたはEGIII様セルラーゼの使用。
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