JP2001507934A

JP2001507934A - 織物処理における使用のための新規な拡張セルラーゼ組成物

Info

Publication number: JP2001507934A
Application number: JP52891398A
Authority: JP
Inventors: ベンジャミンエスバウアー; カサリーンエイクラークソン; エドマンドエイラレナス; マイケルワード
Original assignee: ジェネンコーインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2001-06-19
Also published as: EP0948629B1; ATE274589T1; AU730115B2; EP0948629A2; WO1998028411A2; AU5530398A; WO1998028411A3; DK0948629T3; CA2275728A1; KR20000062296A; CN1246148A; DE69730446D1; US5989899A; DE69730446T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、織物の処理において有利に使用される修飾されたセルラーゼタンパク質に関する。特に、セルロース含有ファブリックを処理するための方法は、それが拡張されたという点で前駆体セルラーゼと異なるセルラーゼ組成物を含む水溶液を形成し、およびファブリックを処理するためにしばらくセルロース含有ファブリックを適切な条件下で水溶液と接触させるステップを含む。拡張されたセルラーゼは、以下を含んでもよい：付着されたポリマー成分または線維状成分を有する、少なくとも２つの異なったセルラーゼ単位または単一のセルラーゼからなる多量体組成物。

Description

【発明の詳細な説明】織物処理における使用のための新規な拡張セルラーゼ組成物１.発明の技術分野本発明は、洗浄剤および織物処理において、特別の機能を有する新規なセルラーゼ組成物に関する。本発明は、更にこの種の組成物の製造、および、この種の組成物を使用する織物の処理方法および／または洗浄方法に関し、および、特にセルラーゼのサイズを増大させおよび／またはその構造上の特性を変える成分が付着するように修飾されたセルラーゼによる織物の処理または洗浄を目的とする。２.従来技術セルラーゼは、セルロースのβ-D-グルコシド結合の加水分解ができる酵素である。セルロース分解性酵素は、伝統的に３つの主要なクラスに分類された：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオハイドロラーゼ(cellobi ohydrolases)およびβ-グルコシダーゼ(Knowles,J.ほか(1987)、TIBTECH5、255- 261)。そして、多数のバクテリア、酵母および菌により生産されることは公知である。セルロース分解性酵素の使用のために開発された適用のうちの主たるものは、（バイオ）エタノール産生のための（木材）セルロースパルプの砂糖への分解、『ストーンウォッシュ』および、『バイオポリッシュ』のような織物処理、および、洗浄剤組成物における使用を含むものである。したがって、セルラーゼは機械パルプ（例えばPCT公開番号WO 92/16687を参照）の処理において、有益なことは公知である。加えて、セルラーゼはフィード添加剤(例えばPCT公開番号WO91/0 4673参照、)として、および、穀粒の湿式製粉において、有益であることは公知である。しかし、第一に重要なことは、セルラーゼが織物の処理、すなわち、汚れまたは灰色がかった色合いの除去を補助するための洗浄剤組成物において、使用され(例えば洗浄剤がセルラーゼを取り入れると改良されたクリーニング機能を示す、英国出願番号2,075,028、2,095,275、および、2,094,826を参照のこと)、又は、セルラーゼが販売前の織物の処理、すなわち、織物の感触および外見を改善することに使用されることである。したがって、英国出願番号第1,358,599号は綿含有ファブリックの荒さを減らすための洗浄剤におけるセルラーゼの使用を開示し、および、織物の処理において、それらの色をより鮮やかにすることによって、使用するファブリックを改良するためにセルラーゼは使用される(例えばThe Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute R eport，vol．24，pp．54-61(1986)を参照のこと)。例えば、綿を含むファブリックを繰り返し水洗するとファブリックに灰色がかった色合いを与えるが、これは、時々「ピル」と呼ばれる(機械的作用によって、生じる)、粉砕され、および、乱雑にされたフィブリルによるものと思われる。この灰色がかった色合いは、特に色のついたファブリックに目立つ。結果として、繊維の乱された最上部層を除去して、このようにファブリックの全体的な外見を改善するセルラーゼの能力は有用であった。したがって、セルラーゼは多くの工業的プロセスに効果的なことが示された。それゆえに、当業分野において、一つ以上の特定の適用に関して特に効果的な機能特性を有する特定のセルラーゼ組成物または成分を求める傾向があった。この観点において、菌およびバクテリアにおいて生産された（表現された）セルラーゼは広くスクリーニングされ、かつ精細に調べられた。例えば、一定の菌、例えばTrichoderma spp（特にTrichoderma longibrachiatum）により生産されるセルラーゼは、セルロースの結晶質形を分解できる完全なセルラーゼ系統が大量に発酵手順を通して容易に生産できるので非常に注目された。この特定のセルラーゼ複合体は、工業的プロセスにおいて、実行できるように、詳細に分析されてその特定の成分の性質およびそれらの成分の能力について決定された。例えば、Wood et al，"Methods in Enzymology"，160，25，pages 234 et seq．(1988)は完全な菌類セルラーゼ系統がエキソーセルビオハイドロラーゼ（EC 3.2.1.91）("CBH ")、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）("EG"）、および、β-グルコシダーゼ(E C 3.2.1.21)"BG"と確認されるそれらを含むいくつかの異なる酵素分類を含むことを記載する。CBH、EG、および、BGの菌類セルラーゼ分類は、各分類内で複数成分を含むためによりさらに拡張することができる。米国特許第5,475,10 1号(Ward et al.)は、Trichoderma longibrachiatumからのEGIIIの精製、および、分子クローニングを開示する。PCT公開No.94/28117は、EGVと呼ばれているTri choderma reeseiから誘導される20-25 kDセルラーゼの単離、および配列を開示する。しかし、多くの成分が、Humicola spp.、Bacillus spp.、Thermomonospora sp p.およびFusarium spp.を含むTrichodermaまたは他のバクテリアのおよび菌類種からのものであり、これら工業用のプロセスにおいて、有益であるが、他の点においては最適状態には及ばない次善の特性を示す。例えば、一定のセルラーゼ成分は、感触または手ざわりを改善するか、ストーンウォッシュ加工した外見を与えるかまたはピルまたはフィブリルをファブリックから除去するという観点において、優れた織物の処理特性を与えるが、許容できない強度減量という結果を与える欠点を有する。優れた特性を有する代わりのセルラーゼ組成物または成分を研究者は探究した。米国特許第5,246,853号は、特定のエキソ-セロビオハイドロラーゼ成分を含まないセルラーゼ組成物を有する綿含有ファブリックを処理する方法を開示する。 PCT公開番号WO 95/24471は、コア、および、最高でも10のアミノ酸から成るＣ末端リンクを任意に含むファミリー７のセルラーゼ、およびこれらのセルラーゼの変異株から成る群から選ばれるセルラーゼ、特にポジション55にトリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニンを有し、および／または少なくとも12オングストロームの深さの間隙(cleft)に結合している基質を有するセルラーゼの使用を記載する。出願人によれば、これらのセルラーゼは、洗浄剤において使用されるアルカリ性pH範囲において、強化された活性を示す。 PCT公開番号WO 95/02675は、２つのセルラーゼを含む洗浄剤組成物を開示する。第一は保持型活性を有する。そして、好ましくは少なくとも0.01/secのKcatに対応するpH8.5におけるセロトリオース上の触媒活性を有し、および、微粒子の汚れ除去ができる。第二は触媒作用のドメインに結合した少なくとも一つの非触媒作用ドメインを含む複数ドメインを有する。そして、好ましくはセルラーゼタンパク質1mgにつき10^-4IUより高い、レッドアビセル7.5上に触媒活性を有し、および、色清澄ができる。 PCT公開番号WO 95/26398は、例えば、アミンをグルタミン酸またはアスパラギン酸残基のカルボキシル基に連結することによる、親または天然のセルラーゼのそれより高い少なくとも一つのpH単位であるpIの変更のために、改良された機能を有する化学的に修飾されたセルラーゼを開示する。複数酵素凝集体は、それらのサイズを増やすことによって、構成酵素のアレルギー誘発を減少させるために提案された。例えば、PCT公開No.94/10191は、単量体の親タンパク質より低いアレルギー誘発を示すオリゴマータンパク質を開示して、および、親酵素のサイズを増大するいくつかの一般的なテクニックを提案する。加えて、酵素凝集体は、単離した状況の下に改良された特性を示した。例えば、Naka et al.，Chem．Lett.，vol．8，pp．1303-1306(1991)は2-段ブロック共重合を通して、2-ブチル-2-オキサゾリン、および、2-メチル-2-オキサゾリンとの間にブロック共重合体を形成することにより調製されるワサビペルオキシダーゼ凝集体を開示する。凝集体は、水-飽和クロロホルム中において、天然の酵素より200倍以上高い活性を有した。グルタルアルデヒドの添加により調製される橋かけ酵素は、酵素安定化の手段として提案された。しかし、架橋はしばしば天然の酵素と比較して活性を低下させる。例えば、Khare et al.,Biotechnol.Bioeng.,vol.35,no.1,pp.94-98(1990) はグルタルアルデヒドにより生産される大腸菌β-ガラクトシダーゼの凝集体を開示する。55℃で熱的安定度の改良を示す一方、酵素凝集体は天然の酵素のそれの70.8%の活性のみを有するが、これは橋かけした後の活性を良好に保持したものと考えられた。これらの問題を克服するために、研究者は融合タンパク質を含む酵素の凝集体を開発した。このような融合タンパク質は、適切に発現される場合、大部分の工業用の適用（織物の処理を含む）において望ましいものとして提案されなかった。さらに、セルロース分解性二量体の使用は、特に有益性を示さなかった。いくつかまたは上記の領域の全てにおける適用を有する多くのセルラーゼ組成物に関連した技術の知識にもかかわらず、例えば、洗浄剤組成物の成分として織物処理において、パルプおよび紙の処理、食品加工、およびバイオマスの変換において有益である改良された特性を有する新しいセルラーゼ組成物の継続的な要求がある。このように、セルラーゼ組成物およびこれらの活性の理解の点から重要な改良があった一方、公知のセルラーゼ組成物の有益な効果を保持するが、一定の有害な活性（例えばファブリック処理の強度減量）に関して重要な改良を有する、代わりのセルラーゼ組成物の必要性が残る。発明の概要本発明は、工業用プロセス（例えば織物処理、織物の洗浄、フィード添加剤技術、ベーキングおよび食品プロセッシング、穀粉湿式製粉、およびバイオマス変換）において使用されるときに、改良された特性を有する新規なセルラーゼ組成物を与えることを目的とする。本発明の更なる目的は、織物処理において使用される際に、強度損失特性を低減させた新規なセルラーゼを与えることである。本発明によれば、セルロース含有ファブリック処理するための、次の工程を含む方法が提供される： (a)拡張されたという点で前駆体セルラーゼと異なるセルラーゼを含むセルラーゼ組成物を含む水溶液を形成する、 (b)セルロース含有ファブリックを処理するためにしばらくの時間、適切な条件下でセルロース含有ファブリックと水溶液を接触させる。本発明の好適な実施例において、セルラーゼは菌類またはバクテリア源（最も好ましくは糸状菌またはバチルス種）から誘導される。また、好ましくは、拡張されたセルラーゼは、少なくとも２つの結合されたセルラーゼ遺伝子の発現により形成される融合酵素、セルロース分解性多量体である発現生成物を含む。あるいは、拡張されたセルラーゼは、重合体又は繊維状置換基をセルラーゼ表面へ添加してその表面特性を変化させたセルラーゼを含む。本発明の効果は、セルロース含有ファブリックがセルラーゼ組成物が拡張されたセルラーゼでなくて前駆体セルラーゼを含むことを除いては同一の方法により処理されるセルロース含有ファブリックと比較して、本発明の拡張されたセルラーゼについては処理されるときに、低減された強度損失を示すということである。図面の簡単な説明図1A-1Bは、Trichoderma longibrachiatumからのEGIIIのDNA配列、および、対応するアミノ酸配列を示す。図２は、EGIII二量体を生産するために遺伝子融合構築物の概略図を示す。図３は、CBHI由来のリンカーを示している本発明に従って生産されるEGIII二量体の、仮説の三次構造を示す。図４は、第２のEGIII遺伝子のアミノ末端にCBHIリンカーによって、融合するE GIII遺伝子のカルボキシ末端を含むDNAセグメントの配列を示す。図５は、本発明のセルラーゼ、および天然のEGIIIにより処理される綿含有ファブリックの強度損失の比較結果を示す。図6A-6Bは、Trichoderma reeseiのEGIII二量体を発現するためのベクターの生産の概略を示すプラスミド構築物を示す。図７は、EGIII遺伝子を含むTrichoderma reeseiの遺伝子のDNAの一部の図表を示す。図８は、pTEXベクターの図表を示す。図９は、EGIII二量体を生産するために用いるPCR法のブロック線図を示す。発明の詳細な説明「セルロース含有ファブリック」は、セルロースを含む綿または非綿、または天然のセルロース誘導体および人工のセルロース誘導体を含むセルロース混合物を含む綿または非綿（例えばジュート、亜麻、ラミー、レーヨン、および、lyoc ell）でできている、縫製又は未縫製のファブリック、紡績糸または繊維を意味する。レーヨンのような公知技術である再生されたファブリックは、人工のセルロース含有ファブリックのタイトルの下に含まれる。他の人工のセルロース含有ファブリックは、化学的に修飾されたアセテート繊維、e.g、アセテートにより誘導されるセルロース、および、溶媒スパンアセテート繊維（例えばlyocel l）を含む。特に、いかなる紡績糸もまたはこの種の材料でできている繊維は、セルロース含有ファブリックの定義内に含まれる。セルロース含有材料は、しばしば材料（例えば合成繊維、および、天然の非セルロース性の繊維(例えばウール、および、絹)）の混合物に組み込まれる。「綿-含有ファブリック」は、綿織ファブリック、綿ニット、綿デニム、綿紡績糸、原綿などを含む純粋な綿または綿混合物でできている、縫製又は未縫製のファブリック、紡績糸または繊維を意味する。綿混合物が使用されるときに、ファブリック中の綿の量は少なくとも綿の約35重量パーセントであることが好ましい。混合物として使用されるときに、ファブリックにおいて併用できる材料は、ポリアミド繊維(例えばナイロン６、およびナイロン66)、アクリル繊維(例えばポリアクリロニトリル繊維)、およびポリエステル繊維(例えばポリエチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコール繊維、例えばビニロンポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、およびアラミド繊維のような、セルロースまたは合成繊維を含む一種以上の非綿繊維が挙げられる。「ストーンウォッシュ組成物」は、セルロース含有ファブリックをストーンウォッシュするための調合物を意味する。ストーンウォッシュ組成物は、消費者への販売のプレゼンテーションの前に、すなわち製造プロセスの間に、セルロース含有ファブリックを修飾するために用いる。これに対して、洗浄剤組成物は汚れた衣服のクリーニングを目的とする。「ストーンウォッシュ」は、「ストーンウォッシュされた」外見をデニムに与えるために、攪拌およびカスケード(シャワー)条件、すなわち、回転するドラム水洗機中で、セルラーゼ溶液によるセルロース含有ファブリックの処理を意味する。本発明に従うセルラーゼ溶液は、この分野で認識された方法である石の使用を、完全にまたは部分的に機能的に置き換えるものである。全体として本願明細書に引用したものとする米国特許第4,832,864号において、ストーンウォッシュされた外見をデニムに与えるための方法が記述されている。一般に、ストーンウォッシュ技術はインジゴ染色された綿デニムに適用されてきた。「洗浄剤組成物」は汚れたセルロース含有ファブリックの洗浄のための、洗浄媒体中で使用することを目的とする混合物を意味する。本発明において、セルラーゼおよび界面活性剤に加えて、この種の組成物は、追加の加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化因子、ブルーイング試剤および蛍光染料、凝結性インヒビター、マスキング剤、セルラーゼ活性化因子、抗酸化剤および可溶化剤を含んでもよい。この種の組成物は、汚れた衣服をきれいにするために一般に使用されるが、組成物をストーンウォッシュすることとは対照的に製造プロセスの間は使用されない。例えば、セルラーゼを含む洗浄剤組成物は、本願明細書に引用したものとするClarkson et al.，U.S.PatentNo.5,290,474及びEP公開No.271004に開示される。「誘導体」は、C-、および、Ｎ末端基どちらか又は両方への一つ以上のアミノ酸の添加、アミノ酸配列の一つ以上の異なるサイトにおける一つ以上のアミノ酸の置換、アミノ酸配列の一つ以上のサイト又はタンパク質のどちらかの一端又は両端における一つ以上のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列の一つ以上のサイトでの一つ以上のアミノ酸の挿入により前駆体タンパク質（例えば天然のタンパク質）から誘導されるタンパク質を意味する。酵素誘導体の製造は、天然のタンパク質をコードするDNA配列を修飾すること、適切なホストへのそのDNA配列の形質転換および発現を行い、誘導体酵素を形成することによって好ましくは成し遂げられる。本発明の誘導体は前駆体酵素アミノ酸配列（例えば野生型または天然状態の酵素）と比較して、変えられたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、このペプチドは前駆体酵素の特徴酵素性質を保持するが、若干の特定の態様の特性は変えられている。例えば、セルラーゼ誘導体は、増大された最適pHを有してもよくまたは温度または酸化安定性を増大するが、その特徴的なセルロース分解活性を保持する。同様に、本発明の誘導体は、そのセルロース-結合能力を阻害するかまたは強化するような方法で、付加、除去または修飾されたドメイン部分を結合しているセルロースを含む。本発明の誘導体はセルラーゼ誘導体をコードしているDNAフラグメントから誘導されてもよく、このとき発現されたセルラーゼ誘導体の機能的活性は保持されることが予想される。例えば、拡張されたセルラーゼをコードしているDNAフラグメントはさらに、セルラーゼDNA配列に5' か3'末端で結合し、コードされたセルラーゼドメインの機能の活性は保持される、ヒンジまたはリンカーをコードするDNA配列またはその部分を含んでもよい。誘導体は、酵素の特性を変えるためにさらに化学修飾を含む。「拡張されたセルラーゼ」は、その質量(分子量)、表面積または空間の容積を増大するために操作されたセルラーゼを意味する。例えば、拡張されたセルラーゼは、5'または3'末端又は内部ポジションに追加のDNAを取り入れる組換え型技術により、親セルラーゼをコードしているDNAを操作することにより生産されてもよい。発現されたセルラーゼは、追加の質量（分子量）をセルラーゼに与える追加のアミノ酸を取り入れる。追加のDNAが、異なったセルロース分解性本体をコードしてもよく(すなわち、少なくとも２つのセルロース分解性触媒部位を含む融合タンパク質を形成する)、または、追加の分離した非触媒的構造領域をコードしてもよく、またはセルラーゼ内の既存の構造を拡張してもよい。融合タンパク質が少なくとも２つの異なったセルラーゼサブユニットを含む場合、それは例えば２つの異なるセルラーゼ酵素、例えば、一つ以上の特異的エンドグルカナーゼ又はエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドロラーゼを、融合タンパク質に取り入れる各酵素の異なる特性を利用するために、取り入れることが可能である。例えば、若干のバチルス種から誘導されるエンドグルカナーゼは、特にアンチピリング、クリーニング、およびアンチグレー化において有益なことを示した一方、若干の菌類エンドグルカナーゼが特に色回復、および、摩耗のために有益なことを示した。このように、菌類エンドグルカナーゼ本体をバチルスエンドグルカナーゼ本体でつなぐことによって、各酵素の特徴を利用することは可能であると同時に、他の望ましい属性を導入する(例えば拡張されたセルラーゼにより処理される織物の強度損失を低減する)。あるいは、拡張されたセルラーゼは、二量体または多量体を形成する、橋かけセルラーゼ多量体（例えばグルタルアルデヒドにより化学的に結合される少なくとも２つのセルラーゼ酵素）を含んでもよい。これらのセルラーゼは、同じで酵素であっても異なる酵素であってもよい。橋かけセルラーゼ多量体か核融合酵素のいずれかについては、活性サイトが触媒的に機能するように残り、かつ基質への接触を保持するように、特定のサブユニットを正しい配置に置くことが望ましい。例えば、活性サイトが修飾された（拡張された）セルラーゼの基質から表面に出ない場合、活性が低減すると考えられる。基質が長い溶解しないポリマー炭水化物を含む場合、基質に各活性サイトの接触を容易にするようにこのような方法で酵素を正しい配置に置くことが好ましくてもよい。この種の活性サイトの一定方向への配列は、活性なサイト配向を最適化するリンクサイトの予測ができる、結晶構造または他の予測三次構造モデルの使用によって容易に行える。さらに代わりに、拡張されたセルラーゼを、分子量(質量)、表面積またはサイズを増大するように作用する、ペプチドまたは非ペプチドベースの成分を付着することにより形成されてもよい。例えば、ペギレーション(pegylation)は１つの代わりの方法であり、高分子量ポリエチレングリコール成分をセルラーゼに、In ada et al.，TIBTECH，vol．13，(1995)pp．86-91、および引用された文献に記載されるように付着させる。この文献の記載はこの明細書に引用したものとする。同様に、他の繊維状または重合体の成分をタンパク質表面にアミノ酸を修飾するための多くの公知の化学的技術によって、付着させてもよい。例えば、多糖、ポリペプチド、ポリエステル、合成のポリマー、脂質、脂肪酸、キチン、キトサンおよび界面活性剤を、酵素基質相互作用の変化に影響するタンパク質表面に付着してもよい。この種の技術は、特定の基を特定のタンパク質成分に結合するための該当する化学作用の有効性によって、のみ制限されるだけである。更に、酵素のDNA配列を修飾して、適当な条件で生育することを通して、合成のアミノ酸を取り入れることは可能であり、このとき合成のアミノ酸は、重合体又は繊維状成分からの官能基の付着を容易にする特質を備えている。タンパク質の表面に対して付着している成分の１つの目的は、セルラーゼおよび基質との間に表面相互作用を変えることである。従って、添加しているイオン性置換基（すなわち、カチオン性かアニオン性）は、この種の相互作用を変える。同様に荷電してないが極性である成分は、セルラーゼに変化した特性を与える。本発明の織物の処理は、セルラーゼを含む組成物を有する織物プロセッシングまたはクリーニングを企図する。この処理は、ストーンウォッシュすること、セルロース含有ファブリックのテクスチャ、感触および／または外見を修飾すること、又はセルロース含有ファブリックの製造又はクリーニング/回復の間使用される他の技術を含むが、これらに限定されるものではない。加えて、本発明における処理は、セルロース誘導体ファブリックまたは繊維からの、「未成熟である」か「死んでいる」(dead)綿の除去を企図する。末成熟な綿は、かなり成熟した綿より無定形であり、例えば不均一な染色のため、より劣る品質のファブリツク(存在する場合には)を結果として与える。本発明において、さらに企図される組成物は、汚れた製造されたセルロース含有ファブリックの水洗に用いられる拡張されたセルラーゼ成分を含む。例えば、拡張されたセルラーゼは、洗浄剤組成物において、洗浄物を洗浄するために使用されてもよい。有益な洗浄剤組成物は、本発明によれば特別な調合物（例えば前洗い、前浸透、および、家庭用途色回復組成物のような）を含む。ここで記述されるように、このような処理組成物は希釈を必要とする濃縮物形態または希薄溶液形態であってもよく又は直接セルロース含有ファブリックに適用されることができる形態であってもよい。織物のセルラーゼ処理のための一般的な処理テクニックは、例えばEP Publication No.22 0016およびGB出願番号1,368,599および2,095,275において記述される。本発明のセルロース誘導体材料の処理は、さらに動物飼料、パルプおよび／または紙、公知技術である食品および穀粒、の処理を企図する。例えば、セルラーゼは動物のフィードの値を増大し、木原紙料の排出能(drainability)を改善し、食品生成物を強化し、および、穀粉湿式製粉プロセスまたは乾いた製粉プロセスの間、穀粒の繊維を減らすことは公知である。本発明の処理は、例えば、緩衝液、界面活性剤および／または精練剤を含む他の任意の成分と共に、セルラーゼの効果的な量を含む水溶液を調製することを含む。セルラーゼ酵素組成物の効果的な量は、その目的のために充分なセルラーゼ酵素の濃度である。このように、例えば、本発明のストーンウォッシュ組成物のセルラーゼの「効果的な量」は、所望の効果、例えば、縫い目およびファブリックパネル上にすり切れた、および色あせた外観を与えるその量である。同様に、セルロース含有ファブリックの感触および／または外見を改善することを目的とする組成物のセルラーゼの「効果的な量」は、感触の測定できる改良を与える（例えばファブリツクまたは外見の平滑性を改善する、例えばピルおよびフィブリルを除去する(これはファブリックの外見の鋭さを減らす傾向がある)）量である。使用されるセルラーゼの量はまた、使用される機器、使用されるプロセスパラメータ(セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液に対する露光時間、など)、およびセルラーゼ活性（例えば、より活性でないセルラーゼ組成物と比べて、より活性なセルラーゼ組成物が使用される特定の溶液はより低い濃度のセルラーゼを必要とする）に依存する。処理されるファブリックが添加される水溶性処理溶液のセルラーゼの正確な濃度は、熟練当業者によって、目的の結果及び上記の因子に基づいて容易に決定されることができる。ストーンウォッシュプロセスでは、セルラーゼが総タンパクの約0.5〜5,000ppm、および最も好ましくは約10〜200pp mの濃度で水溶性処理溶液が存在することが一般に好ましかった。セルロース含有ファブリックの感触および／または外見の改良のための組成物において、セルラーゼが総タンパクの約0.1〜2000ppm、および最も好ましくは約0.5〜200ppmの濃度の水溶性処理溶液であることが一般に好ましかった。好適な処理実施態様において、緩衝液の濃度が溶液のpHを維持するのに十分であるような範囲内で緩衝液が処理組成物中において使用され、このとき使用されるセルラーゼは次に、使用されるセルラーゼの性質に依存する。使用される緩衝液の正確な濃度は、熟練した当業者が容易に考慮に入れることができるいくつかの因子に依存する。例えば、好適な実施例において、緩衝液濃度と同様に緩衝液が、最適のセルラーゼ活性のための必要なpH範囲内で最終的なセルラーゼ溶液の pHを保持するように選ばれる。本発明の拡張されたセルラーゼの最適ｐＨ範囲の決定は、周知技術に従って確実にすることができる。拡張されたセルラーゼの活性範囲内のpHでの適切な緩衝液は、本分野の当業者にとって周知である。セルラーゼ、および緩衝液に加えて、処理組成物は任意に界面活性剤を含んでもよい。例えば、適切な界面活性剤として、セルラーゼ、およびファブリックと融和性のいずれの界面活性剤、例えばアニオン性、非イオン性、および、両性界面活性剤を含む。使用のための適切なアニオン界面活性剤は、ここで直鎖又は分枝アルキルベンゼンスルホナート、直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテルサルフェート、アルキルまたはアルケニルサルフェート、オレフィンスルホナート、アルカンスルホナートなど。アニオン界面活性剤の適切な対イオンは、アルカリ金属イオン(例えばナトリウムおよびカリウム)、アルカリ土金属金属イオン(例えばカルシウムおよびマグネシウム)、アンモニウムイオン、および、炭素数２または３の1〜3のアルカノール基を有するアルカノールアミン、が挙げられる。両性界面活性剤は、第四アンモニウム塩スルホナートおよびベタイン型両性界面活性剤を含む。この種の両性界面活性剤は、同じ分子内に両方の正および負の荷電された基を有する。非イオン性界面活性剤は、一般にポリオキシアルキレンエーテル並びにその高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、および脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。界面活性剤の混合物は、また、当業者にとって公知の方法で使用されることができる。濃縮した拡張されたセルラーゼ組成物は、ここで記述される方法により使用のために調製できる。この種の濃縮物は、好ましくは水溶液中に、上記したセルラーゼ組成物、緩衝液、および界面活性剤の濃縮した量を含む。そのように処方される場合、拡張されたセルラーゼ濃縮物は各成分の必要条件濃度を有する拡張されたセルラーゼ製造を速く、かつ正確に調製するように素早く水で希釈できる。水溶性濃縮物が処方される場合、これらの濃縮物は上記したようにセルラーゼ溶液の成分の必要条件濃度に達するように希釈されることができる。すでに明らかなように、この種の拡張されたセルラーゼ濃縮物は、セルラーゼ溶液の容易な調合を可能とすると共に、それが使用される場所への組成物の容易な運送を可能する。処理濃縮物は、技術的に認識されたいかなる形態（例えば液体、エマルション、ゲルまたはペースト）をもとりえる。この種の形態は、当業者にとって周知である。固体の拡張されたセルラーゼ濃縮物が使用される場合は、セルラーゼ組成物は細粒、粉末、集塊または固体のディスクであってもよい。粒剤は、粒剤の洗浄媒体へ溶解の割合を減らす材料を含むように処方できる。全体として本願明細書に引用したものとする米国特許第5,254,283号において、この種の材料、および粒剤は開示される。本発明の拡張されたセルラーゼ組成物と共に、又はその代わりに石、軽石、充填剤、溶媒、酵素活性化剤、および再沈殿防止剤他を含む他の材料を、組成物の条件使用(eventual use)に依存して、所望により使用できる。例として、ストーンウォッシュ方法を詳細に後述するが、記述されるパラメータは熟練した当業者によって、ほかの応用のために容易に修飾、すなわち、ファブリックの感触および／または外見を改善できる。セルロース含有ファブリックは、ストーンウォッシュ組成物と処理組成物とを混合することにより、処理組成物と、有効量のセルラーゼを含むストーンウォッシュ組成物を含む拡張されたセルラーゼとを接触させ、およびファブリック付近にセルラーゼ酵素をこのようにして持ってくる。その後、拡張されたセルラーゼおよびファブリックを含む水溶液は攪拌される。処理組成物が水溶液である場合、ファブリックは直接溶液に浸されてもよい。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮物である場合には、濃縮物はセルロース含有ファブリックを含む水浴中に希釈される。ストーンウォッシュ組成物が固体状態（例えば前洗い液ゲルまたは固形スティック）である場合、ストーンウォッシュ組成物をファブリック又は洗浄液に対して組成物を直接適用することによって、接触させてもよい。セルロース含有ファブリックは、ストーンウォッシュ溶液と共に酵素を作用させてセルロース含有ファブリックにストーンウォッシュされた外見を与えるのに有効な条件でインキュベートされる。例えば、ストーンウォッシュする間、pH、液比、温度、および反応回数は、ストーンウォッシュ組成物が作用する条件を最適化するように調整されてもよい。「有効な条件」は、必然的にセルラーゼ酵素を能率的にセルロース含有ファブリックと反応させる、pH、浴比、および温度に関連し、この場合ストーンウォッシュされた効果を生じる。一般に、本発明の拡張されたセルラーゼは、親セルラーゼ（複数）の使用のための使用可能な条件の下に使用されなければならない。しかし、この種の条件は当業者によって、容易に確かめられる。本発明のストーンウォッシュ組成物のための有効な反応条件は、対応する従来技術セルラーゼ組成物について使用される周知の方法と実質的に同様である。従って、本発明のストーンウォッシュ組成物を使用するための条件を最大にすることは当業技術内のことである。ストーンウォッシュの間の液比、すなわちここで使用したファブリックの重さに対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重さの比率は、一般に所望のストーンウォッシュ効果をデニムファブリックにおいて成し遂げるのに十分な量であって、かつ、使用されるプロセスによって決定される。好ましくは、液比は約4:1から約50:1であり、より好ましくは、約5:1から約20:1、および、最も好ましくは約10:1から約15:1である。本発明のストーンウォッシュ組成物によってストーンウォッシュする間の反応温度は、２つの競争因子により決定される。第一に、より高い温度は一般に促進反応動力学（すなわちより速い反応）に対応し、これはより低い温度で必要な反応時間と比べて、反応時間を短縮する。従って、反応温度は一般に少なくとも約 10℃以上である。第２に、セルラーゼは一定の反応温度を越えると活性を失うタンパク質であり、この温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。このように、反応温度があまりに高くなる場合、セルラーゼが変性する結果として、セルロース分解活性は消失する。当業技術において、セルラーゼ使用のための標準温度は一般に35℃〜65℃であり、この条件はまた本発明のセルラーゼに適すると考えられるが、特定の拡張されたセルラーゼに関して、最適温度条件は周知技術に従い決定されなればならない。反応時間は、ストーンウォッシュが起こる特定の条件に依存する。例えば、pH 、温度、およびセルラーゼの濃度は全て最適の反応時間に影響する。一般に、反応時間は約５分から約５時間まで、および、好ましくは約10分から約３時間まで、および、好ましくは、約20分から約１時間までである。さらに他の本発明の好適な実施例によれば、本発明の拡張されたセルラーゼは、洗浄剤組成物において使用されてもよい。本発明の洗浄剤組成物は、前洗い液組成物、プレ浸透組成物として、または標準洗浄またはリンスサイクルの間のクリーニングに有益である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効な量のセルラーゼ、界面活性剤、および任意に後述する他の成分を含む。本発明の洗浄剤組成物において、使用されるセルラーゼの有効な量は、セルロース含有ファブリック上に、セルラーゼによって、得られる公知の望ましい効果（例えば、デピリング、軟化、アンチピリング、表面繊維除去、灰色化の防止(a nti-graying)、およびクリーニング）を与えるのに十分な量である。好ましくは、洗浄剤組成物のセルラーゼは洗浄剤の約10ppm〜約20,000ppmの濃度で使用される。洗浄媒体への希釈後のセルラーゼ酵素の濃度が、総タンパクの約0.01〜約1000 ppmの範囲、好ましくは約0.02ppm〜約500ppm、および、最も好ましくは約0.5ppm 〜約250ppmであるように、洗浄剤組成物において、使用されるセルラーゼ酵素の濃度が選択されることが好ましい。洗浄剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が洗浄溶液を形成するように水を添加して希釈される範囲に依存する。本発明の洗浄剤組成物は、当業技術において、認識されたいずれの形態であってもよく、例えば、液体、粒剤、エマルション、ゲルまたはペーストであってもよい。この種の形態は、熟練した当業者にとって周知である。固体の洗浄剤組成物が使用されるときには、セルラーゼは好ましくは粒剤として処方される。好ましくは、粒剤は、さらにセルラーゼ保護剤を含むように処方されることができる。粒剤は、粒剤の洗浄媒体への溶解の割合を減らす材料を含むように処方できる。全体として本願明細書に引用したものとする米国特許第5,254,283号において、この種の材料、および粒剤が開示される。本発明の洗浄剤組成物は、界面活性剤、すなわち洗浄剤組成物の使用において、周知であるアニオン性、非イオン性、および、両性界面活性剤を使用する。本発明の洗浄剤組成物に用いられる適切なアニオン界面活性剤としては、直鎖または分枝アルキルベンゼンスルホナート、直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテルサルフェート、アルキルまたはアルケニルサルフエート、オレフィンスルホナート、およびアルカンスルホナートが挙げられる。アニオン界面活性剤の適切な対イオンは、アルカリ金属イオン(例えばナトリウムおよびカリウム)、アルカリ土金属金属イオン(例えばカルシウムおよびマグネシウム)、アンモニウムイオン、及び炭素数２または３の1〜3のアルカノール基を有するアルカノールアミン、を含む。両性界面活性剤は、第四アンモニウム塩スルホナート、および、ベタイン型両性界面活性剤を含む。この種の両性界面活性剤は、同じ分子の両方の正および負の荷電された基を有する。非イオン性界面活性剤は、一般にポリオキシアルキレンエーテル、並びにその高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル、などを含む。本発明に用いられる適切な界面活性剤は、British Patent Application No．2 094 826 A,に開示される。この記載は本願明細書に引用したものとする。このような界面活性剤の混合物をまた、使用することができる。界面活性剤または界面活性剤の混合物は、本発明の洗浄剤組成物において、全洗浄組成物の約１重量パーセント〜約95重量パーセント、および、好ましくは全洗浄剤組成物の約５重量パーセント〜約45重量パーセントの量において、一般に使用される。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗浄剤組成物は、任意に以下の成分のうちの少なくとも１つを含むことができる：セルラーゼ以外のヒドロラーゼ適切なヒドロラーゼとしては、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフェートモノエステルヒドロラーゼ、および、エステル結合に作用するホスフェートジエステルヒドロラーゼ;グリコシル化合物に作用するグリコシドヒドロラーゼ;N-グリコシル化合物を加水分解する酵素;エーテル結合に作用するチオエーテルヒドロラーゼ:および、α-アミノ-アシル-ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル-アミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、およびペプチド結合に作用するペプチジル- ペプチドヒドロラーゼが挙げられる。カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、およびペプチジル-ペプチドヒドロラーゼは、それらの中で好ましい。適切なヒドロラーゼは、(1)ペプチジル-ペプチドヒドロラーゼに属するプロテアーゼ(例えばペプシン、ペプシンB、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギロペプチターゼ(aspergillopeptidase)A、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチターゼ(clostridiopeptidase)B、カリクレイン、ガストリシン(gastrisin)、カテプシンD.、ブロメリン、ケラチナーゼ(kerati nase)、キモトリプシンC、ペプシンC、アスペルギロペプチターゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼA、および、B)、および、アミノペプチダーゼ)、(2 )グリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼは、この群から除く）α- アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ(chitinase)、およびデキストラナーゼである。α-アミラーゼおよびβ-アミラーゼは、それらの中で好ましい。それらは酸から中性系において機能するが、バクテリアから得られるものはアルカリ性の系において、高い活性を示す;(3)カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼおよびクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼ。リパーゼは、特にそれらの中で効果的である。セルラーゼ以外のヒドロラーゼは、目的に応じて必要により洗浄剤組成物に組み込まれる。精製されたタンパク質に関して、0.001〜5重量パーセント、および、好ましくは0.02〜3重量パーセントの量で取り入れられることが好ましい。この酵素は、粗酵素単独または洗浄剤組成物の他の成分と組み合わせて粒剤形態で使用されなければならない。粗酵素の粒剤は、精製された酵素が粒剤中に0.001 〜50重量パーセント量となるような量において使用される。粒剤は、0.002〜20 重量％、好ましくは0.1〜10重量パーセントの量で使用される。セルラーゼと同様に、これらの粒剤は、酵素-保護薬剤、および、溶解抑制剤材料を含むように処方できる。カチオン界面活性剤および長鎖脂肪酸塩この種のカチオン界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩、a-スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸-型界面活性剤、ホスフェートエステル界面活性剤、3〜4のアルキル置換基および１つ以下のフェニル-置換されたアルキル置換基を有する第四アンモニウム塩を含む。適切なカチオン界面活性剤、および、長鎖脂肪酸塩はBritish Patent Application No.2 094 826 Aにおいて、開示される。この特許の開示は本願明細書に引用したものとする。組成物は、約１〜約20の重量パーセントまでこの種のカチオン界面活性剤、および、長鎖脂肪酸の中で塩を含んでもよい。ビルダー A．二価金属イオン封鎖剤。組成物は、約０から約50重量パーセントの以下の化合物のアルカリ金属塩、および、アルカノールアミン塩から成っている基から選ばれる一つ以上のビルダー成分を含んでもよい：ホスフェート、ホスホン酸エステル、ホスホノカルボキシレート、アミノ酸の塩、アミンのポリアセテート高分子電解質、非解離ポリマー、ジカルボン酸の塩、および、アルミノシリケート塩。適切な二価金属イオン封鎖剤が、British Patent Application No．2 094 826 Aにおいて、開示される。この特許の開示は本願明細書に引用したものとする。 B．アルカリまたは無機電解質アルカリまたは無機の電解質として以下の化合物のアルカリ金属塩の一つ以上を、これを含む組成物に基づいて約１〜約30重量パーセントまで、好ましくは約５〜約50重量パーセントまで含んでもよい：シリケート、炭酸エステル、および、並びに有サルフェート機アルカリ(例えばトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、および、トリイソプロパノールアミン)。再沈殿防止剤(Antiredeosition Agents) 組成物は、約0.1〜約５重量パーセントの、以下の化合物の一つ以上を再沈殿防止剤として含んでもよい：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロース。それらの中で、本発明のセルラーゼ組成物を有するカルボキシメチル-セルロースおよび／またはポリエチレングリコールの組合せは、特に有益な汚れ除去組成物を提供する。漂白剤漂白剤（例えばモノ過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム/過酸化水素付加物、および、塩化ナトリウム/過酸化水素付加物）または/および、スルホン化されたフタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような感光性の脱色染料と組み合わせて本発明のセルラーゼを使用するとさらに洗浄効果を改善する。同様に、EP 684 304に記載されているように、漂白剤、および漂白触媒が使用されてもよい。ブルーイング薬剤および蛍光染料必要に応じて、多様なブルーイング薬剤、および蛍光染料は組成物に取り入れられてもよい。適切なブルーイング薬剤、および蛍光染料はBritish Patent App lication No．2 094 826 Aにおいて開示されており、この特許の開示は本願明細書に引用したものとする。ケーキングインヒビター以下のケーキングインヒビター(凝結阻害剤)は、粉状の洗浄剤に取り入れられてもよい:p-トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホ琥珀酸塩、タルク、細かく微粉状にされたシリカ、アモルファスシリカ、クレー、ケイ酸カルシウム(例えばJohns Manville社のミクロセル)、炭酸カルシウム、および酸化マグネシウム。セルラーゼ活性抑制因子のマスキング剤本発明のセルラーゼ組成物は、若干の事例において、銅、亜鉛、クロム、水銀、鉛、マンガンまたは銀イオンまたはそれらの化合物の存在下で非活性化される。多様なメタルキレート化剤および金属沈澱化剤はこれらのインヒビターに対して有効である。これらとして、任意の添加剤に関して上記にリストを挙げたような二価金属イオン金属イオン封鎖剤並びにケイ酸マグネシウム、および硫酸マグネシウムが挙げられる。セロビオース、グルコース、およびグルコノラクトンは時々インヒビターとして作用する。できる限りセルラーゼとこれらのサッカライドの共存在を避けることが好ましい。共存在が不可避の場合には、例えば、コーティングすることによって、セルラーゼとサッカライドとの直接接触を避けることが必要である。長鎖脂肪酸塩、およびカチオン界面活性剤は、若干の事例においてインヒビターとして作用する。しかし、それらの直接接触が錠剤化またはコーティングのような若干の手段によって防止できる場合、セルラーゼを有するこれらの物質の共存在は可能である。必要に応じて、上述のマスキング剤、および方法は本発明において使用されてもよい。セルラーゼ-活性化因子活性化因子は、セルラーゼの種類に従い変化する。タンパク質類、コバルトおよびその塩、マグネシウムおよびその塩、並びにカルシウムおよびその塩、カリウムおよびその塩、ナトリウムおよびその塩、または単糖（例えばマンノース、およびキシロース）の存在下で、セルラーゼは活性化され、およびこれらの洗浄力は著しく改良される。抗酸化剤例えば、抗酸化剤はtert-ブチル-ヒドロキシトルエン、4,4'-ブチリデンビス( 6-tert-ブチル-3-メチルフェノール)、2,2'-ブチリデンビス(6-tert-ブチル-4- メチルフェノール)、モノスチレン化クレゾール、ニスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ニスチレン化フェノール、および1,1-ビス（4-ヒドロキシ-フェニル）シクロヘキサンを含む。可溶化剤例えば、可溶化剤は低級アルコール(例えばエタノール)、ベンゼンスルホナート塩、低級アルキルベンゼンスルホナート塩（例えばp-トルエンスルホナート塩）グリコール(例えばプロピレングリコール)、アセチルベンゼンスルホナート塩、アセトアミド誘導体、ピリジンジカルボン酸アミド、ベンゾアート塩、およびウレアを含む。本発明の洗浄剤組成物は、酸性からアルカリ性pHの幅広いpH範囲において使用できる。好適な実施例において、本発明の洗浄剤組成物は、約５を超え12までのｐＨを有する弱い酸性であるか、中性であるかまたはアルカリ性の洗浄剤洗剤培地において、使用されることができる。必要な場合には、上記の成分以外に香料、緩衝液、保恒剤、染料などが本発明の洗浄剤組成物について使用できる。この種の成分は、当業技術において、従来使用される量で使用される。本発明において、使用される洗浄剤ベースが粉末の形であるときに、それは噴霧乾燥方法、および造粒法を含むいかなる公知の製造方法によっても調製されるものであってもよい。特に噴霧乾燥方法、アグロメレーション方法、ドライミキシング方式または非タワー経路方法によって、得られる洗浄剤ベースが好ましい。噴霧乾燥方法によって得られる洗浄剤ベースは、調製条件に関して制限されない。噴霧乾燥方法によって得られる洗浄剤ベースは、熱い空間へ耐熱成分の水性スラリ（例えば界面活性剤、およびビルダー）をスプレーすることによって得られる中空粒剤(hollow granules)である。噴霧乾燥後、香料、酵素、漂白剤、無機のアルカリ性のビルダーを添加してもよい。またベース製造後に、例えば噴霧乾燥-造粒またはアグロメレーション方法によって得られる非常に濃い、顆粒状の洗浄剤ベースに多様な成分を添加してもよい。洗浄剤ベースが液体であるときに、それは均一溶液または不均一な分散液であってもよい。洗浄剤のセルラーゼによって、カルボキシメチルセルロースの分解を解消するには、組成物の混合の前にカルボキシメチルセルロースを粒剤にするかまたはコーティングすることが望ましい。本発明の洗浄剤組成物は、工業用および家庭用のセルロース含有ファブリック（例えば汚れたファブリック）と、これらの環境において、従来使用される温度、反応時間、および液比でインキュベートしてもよい。インキュベーション条件（すなわち本発明の洗浄剤組成物を有するセルロース含有ファブリックを処理するための有効な条件）は、当業者によって、容易に確かめられる。従って、本発明の洗浄剤による処理のための有効な適切な条件は、それらが既知のセルラーゼを含む同様の洗浄剤組成物を使用する条件に対応する。本発明の洗浄剤は、充分な活性が存在し、所望の改良、例えば軟化、デピリング、ピリング予防、表面繊維除去またはクリ-ニングを与える中間のpHにおいて、適切な溶液中で前洗い液としてさらに処方されてもよい。洗浄剤組成物がプレ浸漬（例えば前洗い液または前処理）組成物であるときに、拡張されたセルラーゼ酵素は一般に液体、スプレー、ゲルまたはペースト組成物のいずれかとして、プレ浸漬または前処理組成物の全重量に対して約0.0001〜約１重量パーセント使用される。このような組成物においては、界面活性剤が任意に使用されてもよく、および使用される場合にはプレ浸漬組成物の全重量に基づいて約0.005から約2 0の重量パーセントの濃度で一般に存在する。組成物の残りは、プレ浸漬において、使用される従来の成分（すなわち希釈剤、緩衝液、他の酵素（プロテアーゼ）など）をそれらの従来の濃度において含む。ここで記述されるトランケートされた(truncated)セルラーゼ酵素を含む組成物は、家庭の使用において、色を色あせたファブリックに戻すのに適切な独立した組成物として使用することができ(例えば U.S．Patent No．4,738,682参照、これは全体として本願明細書に引用したものとする)、同様にスポット-リムーバにおいて使用でき、およびデピリングおよびアンチピリング（ピリング防止）のために使用できることが企図される。本発明のセルラーゼの使用は、特に飼料添加物において、およびパルプおよび紙のプロセッシングにおいて有効でもよい。これらのさらなる工業的適用については、例えば、PCT Publication No.95/16360およびフィンランドGranted Paten t No.87372に記述される。さらに本発明、およびその効果示すために以下の特定の実施例を示すが、これらは本発明を示すために提供されており、どのような形であっても本発明の観点を制限するものではないと理解されるべきである。実施例実施例１組み換えDNA技術によるEGIII二量体のクローニング、および発現 (1)構築： EGIIIをコードしている遺伝子を含むDNAを、Trichoderma longibrachiatum （参照、例えば米国特許第5,475,101号。この特許の開示は本願明細書に引用したものとする）から単離した。簡単に述べると、全DNAは、Trichoderma longibr achiatum株RL-P37から抽出されてもよく、および多様な制限酵素により消化されてもよい。消化されたDNAは、アガロースゲル電気泳動にかけられ、ナイロン膜に移り、および放射性同位元素を使って識別された100bp PCRフラグメントを含むM13クローン由来DNAとハイブリダイズした。このサザン解析から、EGIIIコード領域の一部がゲノムＤＮＡの3kb Asp718フラグメントにあると決定される。ゲノムＤＮＡ中のEGIIIをコードする遺伝子を囲んでいる領域を図７に示す。また、本発明の実施例のDNAの調製に使用されたHindIII部位を示す。 EGIIIをコードしている遺伝子（配列番号NO：1）のDNA配列、および対応するアミノ酸配列（配列番号NO：2）を図１に示す。２つのEGIIIタンパク質分子との間に結合を生じさせるために、適切な結合配列を選ぶことが必要であった。ここで示されるストラテジーは、図２に示され、およびCBHI分子のリンカー領域を有する最初のEGIII分子のカルボキシ末端を接合することを含む。EGIII-リンカー融合は、次に第２のEGIII分子のアミノ末端に結ばれる。このタンパク結合を達成する遺伝子操作は後述する。図９に示すように、４つのPCR反応を利用して「PCRフラグメント４」と分類されるフラグメントを作製した。最初の３つのPCR反応は独立して作製された。これらの３つの反応フラグメントは、それらを第４のPCR反応に結合させる互いに相補性の末端を有する。EGIII、およびCBHIクローンの製造は、U.S.Patent No.5 ,475,101及びEP Patent No．137 280にて記載されるように調製されてもよい。「PCRフラグメント１」は、DNA鋳型としてHindIIIフラグメントEGIII遺伝子クローンを使用して調製された。前進プライマは、配列CGCCAATTTGGTACCGAGCCCTTC ACGGG（配列番号NO：3）を有した。逆進プライマは、配列GCCACGGTTTCCGCCGGGGT TGATAGATGCGGTCCAGG（配列番号NO：4）を有した。増幅の後、90塩基のフラグメントがつくられた。ＤＮＡフラグメントをNuSieveアガロースにおいて泳動し、ゲルから切断し、および回収した。「PCRフラグメント２」が、DNA鋳型としてCBH１遺伝子クローンを使用して調製された。前進プライマは配列CCTGGACCGCATCTATCAACCCCGGCGGAAACCGTGGC（配列番号NO：5）を有した。逆進プライマは、配列CCACTGGTCACAGCTGGTTTGAGACTGGGTA GGTCCGGG（配列番号NO：6）を有した。増幅の後、119塩基のフラグメントがつくられた。ＤＮＡフラグメントを、NuSieveアガロースにおいて、泳動し、ゲルから切断し、および回収した。「PCRフラグメント３」は、DNA鋳型としてHindIIIフラグメントEGIII遺伝子クローンを使用して調製された。前進プライマは、配列CCCGGACCTACCCAGTCTCAAACC AGCTGTGACCAGTGG（配列番号NO：7）を有した。逆進プライマは、配列GCAGCCGAAT TCAGAGCCGGCTGATGCTCC（配列番号NO：8）を有した。増幅の後、114塩基のフラグメントがつくられた。DNAフラグメントをNuSieveAgarose中で泳動し、ゲルから切断して、回収した。「PCRフラグメント４」は同じ反応の「PCRフラグメント１、２、および３」を合わせることにより調製された。そして、結果として得られる配列はDNA鋳型として使用される。前進プライマは、配列CGCCAATTTGGTACCGAGCCCTTCACGGG（配列番号NO：9）を有する。逆進プライマは、配列GCAGCCGAATTCAGAGCCGGCTGATGCTCC （配列番号NO：10）を有した。増幅の後、246塩基のフラグメントがつくられた。PCR反応生成物は、製造業者の説明書に従って、QiaquickPCR精製キット(Qiage n社（Chatsworth、CA）を使用して精製された。PCR反応生成物を次に製造業者説明書に従って、酵素Asp718 IおよびEcoR Iにより制限的に消化した。消化後、およそ225塩基のフラグメントがつくられた。ＤＮＡフラグメントをNuSieveアガロースにおいて泳動し、ゲルから切断し、回収して、および同じ制限エンドヌクレアーゼにより切断されたpUC19ベクターに結さつした。制限消化工程の前に、作製された「PCRフラグメント４」の配列は、図４に示されている。図６に示すように、EGIII遺伝子を含むTrichoderma longibrachiatum DNAのHi ndIIIフラグメントを有するpUC19ベクターは、ダイマーのための発現ビヒクルを産生するために使用された。図６にて説明したように、合成オリゴヌクレオチドが作製され、これは次に、pUC19::EG3ベクターから単離した0.72kb SfiI、およびAsp718Iフラグメント、およびPCRフラグメント４から単離した0.22kbAsp718I 、およびNgoM1フラグメントに結さつされる。形成されたフラグメントは、次にp UC19::EG3ベクターに挿入され、pUC19::ダイマーベクターを形成する。ダイマーの発現のために、プラスミドpTEXが、Sambrook et al．（1989）（図８に示される、pTEXベクターの製造の完全な説明のためのPCT Publication No． WO96/23928を参照すること。このディスカッションを本明細書で引用するものとする）の方法に従って作成される。プラスミドは、糸状菌Trichoderma longibra chiatumにおいて使用するための多目的発現ベクターとして設計される。発現カセットは、この機能を有益にするためのいくつかの固有の特徴を有する。転写は、強力なCBHI促進因子、およびT.longibrachiatumのためのターミネータ配列を使用して制御される。T.longibrachiatum pyr4選択可能なマーカー遺伝子はCBHI ターミネータに挿入され、および、全部の発現カセットは固有のNotI制限サイトまたは固有のNotI、およびNheI制限サイトを使用して切除されることができる。このように、pTEXが本発明の実施例のための好ましい発現カセットであるが、それは同様に便利な特性を有する多くの適切な発現カセットのうちの１つの単なる実施例てある。図６に示すように、ベクタ−pUC19::ダイマーはHindIIIにより切断され、およびT4ＤＮＡポリメラーゼにより埋められた突出末端、SacIIにより切断され、および2.Okbフラグメントを単離した。このフラグメントは、SacII、およびPmeI により切断されたpTEXベクターに、次に結さつされる。ダイマー発現ベクターは、強いCBHI促進因子を含み、人工的なEGIIIダイマー遺伝子を発現させる。第２のEGIII遺伝子の終止コドンは、EGIIIターミネータの約300の塩基に先行する。遺伝子pyr4は、選択可能なマーカーとしてTrichoderma への形質転換のために使用された。(2) 形質転換およびスクリーニング上で作製されたべクターは、４つのセルラーゼ遺伝子：CBHI、CBHII、EGIおよびEGIIが既に削除されたT.longibrachiatumの株を形質転換するために使用された(参照、例えば米国特許第5,472,864号)。安定な形質転換体を振とうフラスコにおいて生育させ、およびRBB-CMCアッセイを使用してエンドグルカナーゼ活性の分析を行った。エンドグルカナーゼ活性による評価により、最も高度に生産された４つの形質転換体を15L発酵槽において生育させた。培養液は、解析のために収穫された。SDS-PAGEゲル上で、新しいタンパクバンドは、約50KDの予測されたダイマーサイズで観測された。comassie染色により推定されるように、この新しいタンパク質は最も一般的なタンパク質であった。非形質転換コントロール株は、約50KDにおいてこの種のタンパクバンドを示さなかった。さらに、50KDバンドは、明らかにEGIII抗体によりプローブされたウェスタンブロットに反応する。従って、形質転換された株は、その主要な発酵産物として新しい新規なEGIII ダイマー酵素を生じる。実施例２比強度損失この例は、その親酵素より少ない強度損失をもたらすために発明のセルラーゼ組成物の能力を研究する。この実施例では、例えば米国特許番号5,328,841、5,4 72,864、および5,475,101に記載される方法により生産されるTrichoderma longi brachiatumの遺伝的に変えられた株から生産されるEGIIIの最適ｐＨを反映する、pH５で保持した水溶性セルラーゼ溶液が使用される。詳細には、この実施例において分析された最初のセルラーゼは、野生型EGIIIを含む組成物であった。分析された第２のセルラーゼは、実施例１において記述されるEGIII二量体であった。セルラーゼ組成物は、染色されたデニムをストーンウォッシュする間の綿-含有ファブリックへの効果および評価される対応するファブリックの強度損失上の効果についてテストされた。ストーンウォッシュされたデニムファブリックを、工業用のウォッシャーおよびドライヤーを以下の条件で使用して作製した：クエン酸塩/リン酸緩衝液@pH５ 38L全容積摂氏120-135度６対の等しい重さのバラストを有するデニムパンツ１時間実行 15-30ppm EGIIIまたはEGIII二量体(ファブリックの等価摩耗を得るために添加される)。強度損失は、Instron Testerを使用して充填方向（FTS）の引張強度を決定すること、および結果は、セルラーゼが添加されなかった点を除いて同じ溶液により処理されたファブリックのFTSと比較して評価された。この解析の結果は、次のように決定されるパーセント強度損失として報告される： FTSxはセルラーゼを含む場合の充填材方向引張強度、およびFTSyはセルラーゼを含まない場合の充填材方向引張強度である。この解析の結果は図５に示され、拡張されたセルラーゼ（EGIII二量体）により処理した織物は、等しい摩耗が得られるように酵素を添加した場合、親EGIII セルラーゼにより処理されたそれらよりかなり少ない強度損失を示したことが示されている

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クラークソンカサリーンエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 94110 サンフランシスコトゥエンティエイスストリート 53 (72)発明者ラレナスエドマンドエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 94038 モスビーチネヴァダ 301 (72)発明者ワードマイケルアメリカ合衆国カリフォルニア州 94114 サンフランシスコトゥエンティフォースストリート 4372

Claims

【特許請求の範囲】 1. 以下の工程を含むセルロース含有ファブリックの処理方法： (a)拡張されたという点で前駆体セルラーゼと異なるセルラーゼを含むセルラーゼ組成物を含む水溶液を形成する、 (b)適切な時間および条件下に前記セルロース含有ファブリックと前記水溶液とを接触させ、前記セルロース含有ファブリックを処理する。 2. 前記セルラーゼ組成物が前記拡張されたセルラーゼの代わりに前駆体セルラーゼを含むことを除いては同様の方法で処理されたセルロース含有ファブリックと比較して、前記セルロース含有ファブリックが減少した強度損失を示す、請求項１に記載の方法。 3. 前記セルラーゼが、菌類、細菌類または植物源から誘導される、請求項１に記載の方法。 4. 前記セルラーゼが、糸状菌またはBacillus sp.由来のものである、請求項３に記載の方法。 5. 前記セルラーゼが、Bacillus spp.、Trichoderma spp.、Humicola spp.、フザリウムspp.、Thermomonospora spp.由来のものである、請求項４に記載の方法。 6. 前記セルラーゼが、Trichoderma longibrachiatum由来のものである、請求項５に記載の方法。 7. 前記拡張されたセルラーゼが、EGIIIから誘導される、請求項６に記載の方法。 8. 前記拡張されたセルラーゼが、追加のアミノ酸残基、ポリマー成分又は繊維状成分の組み込みにより修飾された前駆体セルラーゼを含む、請求項１に記載の方法。 9. 前記拡張されたセルラーゼが前記前駆体セルラーゼの多量体を含む、請求項８に記載の方法。 10．前記多量体がEGIII成分を含む、請求項９に記載の方法。 11．前記多量体がCBHIリンカー配列によって結合したEGIIIの二量体を含む、請求項10に記載の方法。 12．前記拡張されたセルラーゼが、付着したポリマー成分を有する前駆体セルラーゼを含む、請求項８に記載の方法。 13．前記ポリマー成分または線維状成分が、ポリエチレングリコール、ポリサッカライド、ポリペプチド、ポリエステル、合成ポリマー、脂質、脂肪酸、キチン、キトサンまたは界面活性剤を含む、請求項12に記載の方法。 14．発酵可能なバイオマスの生産における拡張されたセルラーゼの使用。 15．動物飼料添加剤としての拡張されたセルラーゼの使用。 16．穀粉湿式製粉におけるセルロースベース不純物を消化するための拡張されたセルラーゼの使用。