CN107850526B - 评估细胞乳腺样品的方法和用于实践所述方法的组合物 - Google Patents
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Abstract
提供用于评估细胞乳腺样品的方法。所述方法的各方面包括以流式细胞计数法获得样品数据、细胞数据和其组合,并且然后基于所获得的数据评估所述细胞乳腺样品。此外,提供可用于实践所述方法的各种实施方案的组合物,例如试剂盒、***和程序。
Description
相关申请的交叉引用
按照美国法典第35篇第119条(e)款,本申请要求2015年5月26日提交的美国临时专利申请序列号62/166,583的申请日的优先权,所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。
引言
乳腺癌是美国第三种主要的癌症死亡原因。据估计,在2011年,美国有2,899,726名女性患有乳腺癌。在2014年,据估计,美国有新增232,670例乳腺癌,并且估计40,000人将死于此疾病。乳腺癌每年在每100,000名女性中造成22.2例死亡,并且美国大约12.3%的女性在其生命中的某个点将被诊断患有乳腺癌。
诊断的癌症期(其是指体内癌症的程度)决定治疗选择并且对于存活时间具有强烈影响。在1期(即,“局部的”,癌症局限于初级位点)诊断的乳腺癌的五年相对存活率是98.5%。然而,当在2期(即,“区域性的”,癌症扩散到区域***)诊断时,乳腺癌的五年相对存活率下降至84.6%,并且当在3期(即,“远距离的”,癌症已转移)诊断时下降至25%。由此,乳腺癌的早期检测和诊断极大地预测患者结果,包括治疗反应和存活。因为癌症转移与晚期癌症强烈相关,所以确定患者的癌症是否是转移性的对于执业医师选择治疗策略和/或作出是否开始治疗的患者结果预测可以是非常有用的步骤(乳腺癌监测和流行病学数据以seer.cancer.gov从美国国家癌症研究所检索)。
使诊断复杂化的因素中的一个是假阳性测试,其导致过度诊断。在美国,乳腺癌的过度诊断的估计百分比是30%。给出假阳性结果的***X线照相术是常见的。通过***X线照相术每年进行筛选、持续10年的60岁女性具有约50%的机率具有导致跟踪测试的至少1个假阳性和约20%的机率具有导致活组织检查的假阳性(参见Schwartz等人(2000)West JMed.173(5):307–312)。过度诊断可能是过于依赖主观判定(例如像由人类评价者(例如,细胞学家、组织学家或病理学家)所作出的主观判定)和或过少变量(例如,测试单一基因或蛋白质的表达)的测试的结果。已经显示,仅Her2蛋白的免疫组织化学在所有病例的40%中过高估计其过表达,这需要额外的测试以进行正确的诊断。除对于受试者的医学治疗的直接影响之外,假阳性测试结果对于受试者的身体和心理健康也可具有间接的负面影响。
除用于医学目的的诊断测试之外,制药工业依赖于癌症存在、癌症时期、癌症进展、以及癌症发展的确定作为用于评价治疗和新药物的措施。由此,部分地由于以上所讨论的那些因素,制药工业正舍弃免疫组织化学作为评价新药物和治疗的临床和临床前性能的方式,并且追求更量化的方法。此外,由于原发性癌症与转移性癌症之间的患者结果的巨大差异,对于了解癌症发展以便识别新的治疗靶标具有极大的兴趣。
发明概述
提供用于评估细胞乳腺样品的方法。所述方法的各方面包括以流式细胞计数法获得样品数据、细胞数据和其组合,并且然后基于所获得的数据评估细胞乳腺样品。此外,提供可用于实践所述方法的各种实施方案的组合物,例如试剂盒、***和程序。
附图简述
结合附图阅读以下详细描述时可最透彻地理解本发明。要强调的是,根据惯例,附图的各种特征不成比例。相反,为清楚起见,各种特征的尺寸任意地放大或缩小。在附图中包括以下各图。
图1描绘对于***受体、孕酮受体、Her2mRNA、HER2蛋白、DAPI、以及CD45标记的细胞的选通策略。
图2描绘针对根据图1选通的细胞生成的补偿矩阵。
图3描绘针对其生成数据的选通靶细胞群体的实例。
图4描绘DNA指数(DI)和细胞周期数据的生成。
图5描绘关于转移模型的表达CD44和E-钙粘着蛋白的细胞群体。
图6描绘her2mRNA和***受体标记物分离以及样品细胞群体的可分辨的WBC和肿瘤DNA指数。
图7描绘使用5个变量降阶模型的来自肿瘤和健康受试者的样品的统计学分离。
图8描绘使用完全转移模型的来自转移性肿瘤和非转移性肿瘤的样品的统计学分离。
图9描绘使用降阶转移模型的来自转移性肿瘤和非转移性肿瘤的样品的统计学分离。
图10描绘根据如本文所述的多参数模型的癌样品相对于正常样品分类。
图11描绘关于图10的正常样品的对照比较。
图12提供示出生成并评估用于癌样品和非癌样品分类的多参数模型的过程的流程图。
详细描述
提供用于评估细胞乳腺样品的方法。所述方法的各方面包括以流式细胞计数法获得样品数据、细胞数据和其组合,并且然后基于所获得的数据评估细胞乳腺样品。此外,提供可用于实践所述方法的各种实施方案的组合物,例如试剂盒、***和程序。
在描述本发明方法和组合物之前,应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物,因而,当然也可有所变化。还应理解,本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的,并且不意图具有限制性,因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求书。
在提供数值范围的情况下,应理解,还明确公开了此范围的上下限之间的各中间值,其中除非上下文另外明确地指出,精确到下限单位的十分位一。在规定范围中的任何规定值或中间值与在此规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的各个较小范围涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外,并且当两个界限之一、都不或全都包括在所述较小范围中时各个范围也涵盖在本发明内,除非是所述规定范围中的任何明确排除的极限值。在所述规定范围包括所述极限值中的一个或两个的情况下,本发明中还包括排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在实践或测试本发明时可使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料,但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料,本文中提到的所有公布均以引用的方式并入本文。应理解,如果有矛盾,本公开取代所并入公布的任何公开内容。
本领域的技术人员在阅读本公开时将显而易见的是,本文所描述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征,所述组分和特征可易于与任何其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何叙述的方法均可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
必须指出,除非上下文明确地另外规定,否则如在本文和所附权利要求书中使用,单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个此类细胞并且提及“所述肽”包括提及一种或多种肽及其为本领域的技术人员所知的等效物(例如多肽)等。
本文所讨论的公布仅仅提供它们在本公开的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些公布。此外,所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
方法
如上所概述的,本发明的实施方案涉及评估细胞乳腺样品(即,乳腺细胞的样品或乳腺细胞样品)的方法。“细胞乳腺样品”意指含有例如利用如以下更详细地描述的那些方法从受试者的乳腺(即,从乳腺组织)得到的细胞的样品。根据本文所述的方法,通过以下更详细地描述的以流式细胞计数法分析样品来从样品获得数据,接着通过评价数据来对样品进行评估。
数据
从样品获得的数据可包括各种数据类别,包括但不限于例如样品数据和细胞数据。“样品数据”意指有关作为整体的样品并且表示样品的一个或多个特征的数据。样品数据可通过分析整个样品或样品的一部分(即,从样品采样)来获得。“细胞数据”意指有关样品的个体细胞并且表示特定细胞的一个或多个特征的数据。细胞数据可在“每个细胞”或个体细胞基础上表达或者可表达为2个或更多个细胞(诸如但不限于样品的所有细胞或样品细胞的某一部分,包括特定群体或亚群的细胞)的统计学特征(例如,平均值)。
在从样品的一部分获得样品数据的情况下,在样品的所述部分上进行的一个或多个样品测量可外推到整个样品,如与常规采样过程一致。在一些实施方案中,从其获得样品数据的样品部分可以是样品的多至50%或更多,包括但不限于例如样品的45%、样品的40%、样品的35%、样品的33%、样品的30%、样品的25%、样品的20%、样品的15%、样品的10%、样品的5%、样品的4%、样品的3%、样品的2%、样品的1%、样品的0.5%、样品的0.1%等,任选地包括样品的0.01%的最小值和样品的99.99%的最大值。
在一些情况下,可重复分析样品的多个部分,以便在将所测得的特征外推到整个样品时增加置信。所分析的样品的重复部分的数量将根据例如正在分析的特定样品特征和所述样品部分的大小而变化。在一些情况下,重复测量的数量可以是2个或更多,包括但不限于例如3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多等,任选地包括100个重复的最大值。在其他情况下,单个测量可用于评估特定样品特征。
从样品获得的数据可直接或可不直接需要使用标记物、标签或染色来对样品进行标记或染色以便允许获取特定数据特征。例如,在一些情况下,数据(包括样品数据和细胞数据)可在不对样品的细胞进行标记或染色的情况下获得。在其他情况下,数据(包括样品数据和细胞数据)获取可需要对样品的细胞进行标记或染色。
在某些实施方案中,从样品获得的数据可包括在不需要检测标签的情况下获得的样品数据。可在不检测标签的情况下获得的样品数据包括但不限于例如样品中的细胞总数量的计数(即,总细胞计数)、样品中的单一细胞数量的计数(即,单一细胞计数)、特定样品体积中的细胞数量的计数(即,细胞计数/体积或细胞浓度或细胞密度)、样品中的非单一细胞数量的计数(例如,双重计数)、样品中特定大小或大小范围的细胞数量的计数(例如,细胞大小计数)、样品中特定大小或大小范围的细胞数量的浓度(例如,细胞大小浓度或细胞大小密度)、特定粒度或粒度范围的细胞数量的计数(例如,细胞粒度计数)、特定粒度或粒度范围的细胞的浓度(例如,细胞粒度浓度或细胞粒度密度)等。在一些情况下,在不使用标签的情况下检测此类样品数据提供某些优点,包括但不限于例如使用额外的标签用于其他目的的能力、更快速地检测特定样品数据特征、容易使用、节省成本等。
在某些实施方案中,从样品获得的数据可包括使用检测标签获得的样品数据。可在检测标签的情况下获得的样品数据包括但不限于可在没有标签的情况下检测到的以上所述的那些样品特征,其中此类特征可包括但不限于例如样品中的细胞总数量的计数(即,总细胞计数)、样品中的单一细胞数量的计数(即,单一细胞计数)、特定样品体积中的细胞数量的计数(即,细胞计数/体积或细胞浓度或细胞密度)、样品中的非单一细胞数量的计数(例如,双重计数)、样品中特定大小或大小范围的细胞数量的计数(例如,细胞大小计数)、样品中特定大小或大小范围的细胞数量的浓度(例如,细胞大小浓度或细胞大小密度)、特定粒度或粒度范围的细胞数量的计数(例如,细胞粒度计数)、特定粒度或粒度范围的细胞的浓度(例如,细胞粒度浓度或细胞粒度密度)等。在一些情况下,使用标签(例如,非特异性细胞标签)来检测可在没有标签的情况下检测的样品数据实现特定的优点,包括但不限于例如更快速地检测样品数据、更准确地检测样品数据等。
在一些情况下,使用检测标签获得的样品数据可包括在不使用标签的情况下不可通过流式细胞术检测的样品数据,包括但不限于例如细胞周期数据或增殖数据等。例如,在一些情况下,样品数据可使用荧光核标签(例如,DNA标签)来获得并且可包括样品细胞周期数据(例如,包括样品的处于细胞周期的一个或多个特定时期的细胞的计数或百分比)或样品增殖数据(例如,包括样品的增殖或未增殖的细胞的计数或百分比)等。在一些情况下,样品细胞周期数据可包括但不限于样品的处于细胞周期的G1期的细胞的计数或百分比、样品的处于细胞周期的G2期的细胞的计数或百分比、样品的处于细胞周期的S期的细胞的计数或百分比、样品的处于细胞周期的M期的细胞的计数或百分比、样品的处于细胞周期的G0期的细胞的计数或百分比、以及其组合。样品的处于细胞周期的特定时期的细胞的计数或百分比的组合包括但不限于例如“G1后”,其包括例如S、G2和M的组合。
在需要的情况下,使用标签获得的样品数据还包括表示样品的未使用特定标签标记的细胞的数量或百分比的阴性标记数据或样品数据,包括但不限于例如使用阴性活力染料获得的活力数据,所述阴性活力染料包括但不限于碘化丙啶(PI)、7-氨基-放线菌素D(7-AAD)、以及可从商业经销商获得的那些,诸如可固定活力染料eFluor 455UV/450/506/520/660/780(Affymetrix eBioscience,San Diego,CA)、活/死可固定蓝色/紫色/浅绿色/黄色染色剂(Life Technologies,Grand Island,NY)、Zombie浅绿色/绿色/近红外/红色/紫外/紫色/黄色(BioLegend,San Diego,CA)等。
在一些情况下,样品数据可包括样品数据的组合,包括在使用或不使用标签的情况下获得的样品数据的组合。例如,在一些情况下,样品数据可包括与细胞周期数据或细胞活力数据组合的细胞计数或细胞密度数据及其亚组合。
在某些实施方案中,标签可用于实现样品的细胞划分以便获得细胞的一个或多个亚群的数据。例如,样品的细胞可基于存在或不存在检测到的标签来划分,并且数据可针对划分的细胞来获得。在其他情况下,样品的细胞可基于检测到的标签的水平(例如,高于阈值水平的检测)来划分,并且数据可针对划分的细胞来获得。用于将样品的细胞划分为一个或多个亚群的标签将根据待获得的具体数据而变化,并且可包括但不限于例如细胞类型标记物的标签、免疫表型标记物的标签、癌症表型标记物的标签、非特异性细胞标签和染色剂(例如,荧光核标签、DNA染色剂等)等。此类标签和标记物的实例在本文中进行描述。在一些情况下,细胞的亚群可以是表达细胞类型标记物的细胞(例如,检测到的标签指示标记物在细胞上存在和/或高于阈值水平的标记物在细胞上存在),并且数据基于细胞的亚群来获得(例如,样品中所述亚群的细胞数量、样品中所述亚群的细胞浓度等)。例如,在一些情况下,基于细胞亚群的数据可包括但不限于样品中上皮细胞的数量或浓度、样品中白细胞的数量或浓度、样品中表达生物标记物的细胞的数量或浓度、样品中表达生物标记物的上皮细胞的数量或浓度、样品中表达生物标记物的WBC的数量或浓度等。
任何样品数据参数或细胞数据参数(包括但不限于本文所述的那些)可具体地针对划分的细胞亚群来确定。例如,在一些情况下,细胞的亚群可基于识别标记物的表达来划分,并且可针对所述亚群确定一个或多个样品数据参数或细胞数据参数。在一些情况下,可划分细胞的上皮亚群,并且可针对所述上皮亚群确定一个或多个样品数据参数或细胞数据参数。例如,在一些情况下,可划分细胞的上皮亚群,并且可针对所述上皮亚群确定细胞周期参数(例如,处于细胞周期的G1期的细胞的计数或百分比、处于细胞周期的S期的细胞的计数或百分比、处于细胞周期的M期的细胞的计数或百分比、处于细胞周期的G2期的细胞的计数或百分比、处于G1后的细胞的计数或百分比等)。在一些情况下,可划分细胞的上皮亚群,并且可确定表达或不表达特定生物标记物的上皮细胞的计数或百分比,包括但不限于例如其中所述特定的生物标记物是免疫标记物(例如,CD44、CD45等)。
在一些情况下,标记物阈值(例如,表示标签阈值)通过对已知在其主题标记物的水平方面不同的两个单独的细胞群体中的标记物的水平进行比较来确定。例如,例如在流式细胞仪上测量已知具有高水平的标记物X的第一细胞群体并且与已知具有低水平的标记物X的第二细胞群体进行比较,并且所述比较用于确定可用于将细胞分类为具有低水平或高水平标记物X的阈值水平,并且细胞群体因此可进行划分。
在一些情况下,标记物阈值(例如,表示标签阈值)通过对细胞群体(例如,具有未知水平的标记物X的细胞群体或怀疑含有具有不同水平的标记物X的细胞亚群的细胞群体)内的标记物水平进行比较来确定。例如,在具有足够数量的池、使得可例如在直方图上绘制测量值的流式细胞仪上测量标记物X的水平,并且基于标记物X的个体细胞水平显示两个或更多个细胞亚群之间的分离。因此,流式细胞仪操作员然后可确定亚群之间的可用于将细胞分类为属于特定亚群(例如,具有低水平的标记物X的亚群或具有高水平的标记物X的亚群)的阈值水平,并且所述群体因此可进行划分。
在一些情况下,标记物阈值(例如,表示标签阈值)基于流式细胞仪的检测极限。例如,如果细胞群体的细胞具有任何可检测水平的特定标记物,则所述细胞可识别为具有特定标记物(即,对于特定标记物是阳性的)。同样,如果细胞群体的细胞不具有可检测水平的特定标记物,则所述细胞可识别为不具有特定标记物(即,对于特定标记物是阴性的)。因此,根据需要,流式细胞仪的检测水平可用于确定标记物阈值。
在一些情况下,标记物阈值(例如,表示标签阈值)基于例如来自先前执行的对照实验的先前确定的标记物水平(即,参考标记物水平)或先前获取的参考表达水平。例如,在例如来自癌症患者和健康患者(诸如本文所述的那些)的先前分析的样品中确定的标记物水平可用于确定标记物阈值水平。在一些情况下,从健康受试者获得的细胞的预期标记物水平可用于确定正常标记物水平,使得可确定表示正常标记物范围的标记物阈值。在此类情况下,正常标记物范围以外(即,高于或低于正常标记物范围)的标记物表达被认为高于或低于特定标记物阈值。在一些情况下,使用此类先前确定的标记物水平或先前确定的阈值水平允许对细胞进行分析并且在对照或参考细胞样品不存在的情况下识别细胞亚群。
可针对作为整体的样品细胞或针对特定亚群的细胞获得如本文所述的细胞数据。可在使用或不使用标签的情况下获得细胞数据。可在使用标签的情况下获得的细胞数据包括但不限于例如细胞大小数据、细胞粒度数据、细胞自体荧光数据、细胞体积等。在不使用标签的情况下获得的细胞数据可通过任何便利的流式细胞计数方法来获取,所述流式细胞计数方法包括检测并分析前向散射(FSC)、侧向散射(SSC)、或自体荧光(在任一个或多个荧光检测器处检测)等。
在一些情况下,包括细胞体积的细胞数据可通过使用一个或多个电子检测器来采集。例如,细胞体积的测量值可包括基于库尔特原理(Coulter Principle)或由穿过电场的细胞引起的所述场中的电流阻抗的电子体积测量值(即,库尔特体积)。在一些情况下,根据本文所述的方法制备的样品细胞可维持非制备细胞(包括非固定细胞)的电子细胞体积,包括至少70%的非固定体积、至少75%的非固定体积、至少80%的非固定体积、至少85%的非固定体积、至少90%的非固定体积等,任选地包括100%的非固定体积的最大值。
在一些情况下,细胞数据可通过使用一种或多种细胞标签来获得,例如通过将一种或多种细胞标记物与结合所述标记物(即,生物标记物)的特异性结合剂结合来获得。特异性结合剂例如由于特异性结合成员的固有的可检测特征(例如,荧光、磁力、电荷、电阻抗、颜色、反射等)本身可充当可检测标签,或者所述特异性检测成员可通过将可检测标签连接或结合到特异性结合成员来间接地检测。特异性结合成员和可检测标签以下更详细地进行讨论。此类特异性结合成员可用于获得细胞数据,包括但不限于例如生物标记物表达、DNA含量、细胞周期特征、细胞周期时期、细胞增殖等。
在一些情况下,细胞数据可包括针对样品的WBC群体而获得的细胞数据。可在如本文所述的评估中进行评价的WBC细胞数据将根据所使用的测定法和标记物而变化,并且可包括如针对本文所述的其他细胞和细胞群体获得的所述细胞数据的任何分量,包括但不吸纳与例如细胞大小、细胞体积、DNA含量、生物标记物表达、细胞周期特征、细胞周期时期、细胞增殖等。在一些情况下,WBC数据可包括WBC群体的增殖性组分或G1细胞周期时期组分的测量值。在一些情况下,WBC数据可包括WBC群体的生物标记物信号或生物标记物信号的组合的测量值。出于本文所述的方法的目的,所评估的WBC生物标记物信号不限于免疫标记物并且可包括例如对其他类别的其他生物标记物的信号的评估,所述其他生物标记物包括但不限于癌症和/或乳腺癌生物标记物、细胞粘着生物标记物、细胞周期或细胞增殖生物标记物等。在一些情况下,在进行如本文所述的评估时可用作数据的WBC群体的特定生物标记物或生物标记物组合的信号可以是高于或低于特定阈值的生物标记物或其组合的信号。
生物标记物数据是指细胞的生物标记物信息可从其得到的任何类型的数据。在一些情况下,生物标记物数据是包括由在测定中采用的标记的生物标记物探针的标签发射的信号的数据。生物标记物数据可呈以下形式:发射光的存在和振幅、光信号所来源于的细胞或其他物体的分散位置的数量、信号源的相对放置、以及在细胞中的每个位置处发射的光的颜色(波长和波宽)。生物标记物数据可采取定性、半定量或定量数据的形式。定性数据简单地是生物标记物的存在或不存在。半定量或定量数据是提供细胞中的生物标记物的量(例如,拷贝数量、浓度等)的某一指示的数据。例如,半定量数据可采取感兴趣的生物标记物的拷贝数量高于某一阈值数量的指示的形式。定量数据提供细胞中的生物标记物的绝对值(例如,拷贝数量、量等)的指示。半定量和定量数据可总体上称为生物标记物定量数据。
本公开的各方面包括呈组合形式的比单独的个体数据类型具有更强的预测能力的数据组合。如对于本领域的技术人员易于显而易见的,本文所述的数据类型中的任一种可在标记和采集组合数据的物理方面不造成显著干扰的适当情况下进行组合。例如,在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集样品数据和细胞数据的组合并且评价数据以便以比从单独的样品数据或细胞数据所获得的更强的预测能力来进行乳腺癌评估。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集样品数据和WBC数据的组合并且评价数据以便以比从单独的样品数据或WBC数据所获得的更强的预测能力来进行乳腺癌评估。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集细胞数据和WBC数据的组合并且评价数据以便以比从单独的细胞数据或WBC数据所获得的更强的预测能力来进行乳腺癌评估。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集样品数据、细胞数据和WBC数据的组合并且评价数据以便以比从单独的样品数据、细胞数据或WBC数据或其亚组合所获得的更强的预测能力来进行乳腺癌评估。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集两种或更多种不同类型的样品数据的组合。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集两种或更多种不同类型的细胞数据的组合。在一些情况下,对乳腺细胞样品的细胞的评估可包括采集两种或更多种不同类型的WBC数据的组合。
样品
含有乳腺细胞的样品可使用任何便利的样品采集方法来获得,所述方法包括但不限于用于获得实体组织活组织检查物和活组织检查抽吸物的那些活组织检查方法。在一些情况下,含有乳腺细胞的样品可作为出于除了获得样品以外的目的执行的单独的医学过程的一部分来获得,所述医学过程包括但不限于手术过程。在其他情况下,含有乳腺细胞的样品可独立地(例如,不作为单独的医学过程的一部分)获得。样品采集方法将变化并且将取决于例如采集是否作为额外的医学过程的一部分来执行、待获得的样品的具体类型、获得样品的主要目的和/或处理和/或分析样品的方法。
在一些情况下,样品可通过手术活组织检查来获得。手术活组织检查的任何便利且适当的技术可用于采集待根据本文所述的方法进行分析的样品,所述技术包括但不限于例如切除活组织检查、切取活组织检查、丝定位活组织检查等。在一些情况下,手术活组织检查可作为具有除了获得样品以外的主要目的手术过程的一部分来获得,所述手术过程例如包括但不限于乳腺部分切除术、乳腺区段切除术、四分之一切除术、乳腺单纯切除术、乳腺整体切除术、根治性乳腺切除术、改良的根治性乳腺切除术、保留皮肤的乳腺切除术、隆胸、***再造、***手术、腋下***清除、前哨***手术等。
在一些情况下,样品可通过针吸活组织检查(needle biopsy)来获得。针吸活组织检查的任何便利且适当的技术可用于采集待根据本文所述的方法进行分析的样品,所述技术包括但不限于例如细针抽吸(FNA)、核芯针吸活组织检查、立体定位核芯活组织检查、真空辅助活组织检查等。
FNA活组织检查可在可触知的和不可触知的病变两者上执行,并且涉及将例如范围是18至25规格的小规格针导入到团块或怀疑区域中和提取细胞材料。FNA使用或不使用共成像来执行可变化并且将取决于各种因素,包括病变是否是可触知的。在FNA使用共成像来执行的情况下,所述技术可称为图像引导FNA,并且可包括但不限于放射成像技术,诸如超声、计算机断层摄影术(CT)、荧光镜检查、***X线照相术、MRI等。可用于采集如本文所述的样品的FNA技术及其变型将变化并且具体技术的选择将取决于各种因素,包括但不限于例如受试者的特征、具体检测的病变的特征、分析过程等。此类FNA技术的变型包括但不限于例如端部开口针(即,“弗伦奇技术(French technique)”)、负压技术、成像引导FNA等。由此,具体的FNA技术可包括或可不包括吸入负压。例如,在弗伦奇技术中,在病变内进行的FNA的短的快速冲击导致细胞移位并且通过毛细管作用实现针内的有效采集而不需要吸入负压。在一些情况下,例如当(例如,囊性病变的)流体过量时,柱塞移除的注射器可用于通过FNA进行的采集样品中。在一些情况下,可利用负压来将样品抽到注射器中。在一些情况下,可使用注射器支架或抽吸枪或抽吸手柄。
核芯针吸活组织检查可在可触知的和不可触知的病变两者上执行,并且涉及将空心核芯针导入到团块或怀疑区域中和提取细胞材料。核芯针吸活组织检查使用或不使用共成像来执行可变化并且将取决于各种因素,包括病变是否可触知。在核芯针吸活组织检查使用共成像来执行的情况下,所述技术可称为图像引导核芯针吸活组织检查或立体定位核芯针吸活组织检查,并且可包括但不限于放射成像技术,诸如超声、计算机断层摄影术(CT)、荧光镜检查、***X线照相术、MRI等。此类核芯针吸活组织检查技术的变型包括但不限于例如真空辅助核芯活组织检查、成像引导核芯活组织检查等由此,具体的核芯针吸活组织检查技术可包括或可不包括在***核芯活组织检查针之前在皮肤中进行切割。例如,在真空辅助核芯活组织检查中,制做小切口并且将空心探针通过切口放置并导向到病变位点,并且然后通过真空压力将圆筒的组织拉到探针中。一般来讲,核芯针吸活组织检查比所述的FNA技术获得更多的组织。
在一些情况下,术语“针吸活组织检查”可通常是指可在没有麻醉的情况下执行或可仅需要局部麻醉并且不被认为是手术过程的任何乳腺活组织检查。在一些情况下,此类活组织检查可利用除了“针”以外的装置,诸如但不限于可用于获得钻取活组织检查物(例如,皮肤钻取活组织检查物)的那些装置。此类装置包括但不限于例如用于采集通常在怀疑患有炎性乳腺癌或佩吉特氏病(Paget’s disease)时获得的皮肤钻取活检组织检查物的那些装置。
根据所采用的具体的活组织检查方法并且取决于具体受试者和/或受试者的具体病变的详情,可执行一个活组织检查或多个活组织检查。例如,在一些情况下,可执行单一活组织检查(例如,单一FNA活组织检查或单一核芯针吸活组织检查)来对具体的受试者或具体的受试者的病变进行足够的采样。在其他情况下,可执行多个活组织检查(例如,多个FNA活组织检查或多个核芯针吸活组织检查)以用于从受试者或受试者的病变采集单个样品或多个样品。在采集多个活组织检查物的情况下,活组织检查物的实际数量将根据具体的受试者和/或受试者的具体的一个病变或多个病变而变化,并且由此其范围可以是2个至10个或更多个活组织检查物,包括但不限于例如2个活组织检查物、3个活组织检查物、4个活组织检查物、5个活组织检查物、6个活组织检查物、7个活组织检查物、8个活组织检查物、9个活组织检查物、10个活组织检查物等。多个活组织检查物可以同时的方式采集或者可在预先确定的时间段内(例如,作为监测方案的一部分)采集。
所采集的乳腺细胞的样品可包含各种乳腺细胞类型,包括但不限于例如叶的细胞、小叶的细胞、导管的细胞、乳腺上皮细胞、脂肪组织的细胞、脂肪细胞、***细胞、成纤维细胞、韧带细胞、神经细胞、***细胞、***细胞、血管细胞、皮肤细胞、***细胞、乳晕复合体细胞等。乳腺细胞的样品还可包含非乳腺来源的细胞,包括但不限于例如血液细胞、红细胞、白细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、组织细胞等。
根据本文所述的方法采集的乳腺细胞的样品可以是固体、半固体或液体样品。例如,在一些情况下,由于所利用的采集技术(例如,引起细胞的解离或抽吸的技术),所采集的样品在采集之后可以是液体样品。在其他情况下,由于所利用的采集技术(例如,手术采集或核芯样品采集),所采集的样品在采集之后可以是固体或半固体样品。在所采集的样品是固体或半固体样品的实施方案中,样品细胞可解离以在采集之后形成液体样品。解离固体和半固体组织样品的方法包括但不限于机械解离、化学解离、酶解离、以及其组合。
在一些情况下,可在从受试者的乳腺采集之后并且在进行处理和/或固定以用于如本文所述的分析之前对乳腺细胞的样品的细胞进行操纵。对所采集的乳腺细胞的操纵可出于各种目的来执行,所述目的包括但不限于研究目的。例如,在一些情况下,所采集的细胞可进行体外培养以用于各种研究目的,包括但不限于细胞扩增、实验化合物或治疗物测试等。在一些情况下,所采集的细胞可进行体内培养或异种移植到宿主动物中以用于研究目的,包括但不限于细胞扩增、实验化合物或治疗物测试等。任何便利且适当的体外细胞培养和/或体内异种移植技术可用于如本文所述的对乳腺细胞样品的细胞的操纵。在此操纵(例如,体外或体内操纵)之后,可对所述样品进行处理并且/或者可固定样品的细胞并且根据本文所述的方法采集并分析数据。
在采集或制备样品之后,可根据需要固定和/或透化所得的乳腺细胞的液体细胞样品。由此,所述方法的各方面可包括通过使样品与合适的固定试剂接触来固定细胞样品。感兴趣的固定试剂是在所需时间点处固定细胞的那些固定试剂。可采用任何便利的固定试剂,其中合适的固定试剂包括但不限于:甲醛、多聚甲醛、甲醛/丙酮、甲醇/丙酮、IncellFP(IncellDx公司)等。例如,已发现在约1%至2%的最终浓度下使用的多聚甲醛是良好的交联固定剂。在一些情况下,样品中的细胞通过使细胞与透化试剂接触来透化。感兴趣的透化试剂是允许标记的生物标记物探针(例如,如以下更详细地描述的探针)进入细胞内环境的试剂。可采用任何便利的透化试剂,其中合适的试剂包括但不限于:温和清洁剂,诸如Triton X-100、NP-40、皂草苷等;甲醇等。
在一些情况下,所采集的液体样品(例如,如通过使细胞解离的FNA获得的液体样品)立即与旨在使样品细胞准备用于进一步进行处理的溶液(例如,固定溶液、透化溶液、染色溶液、标记溶液、或其组合)接触,以便使可能在制备细胞之前或在分析细胞之前发生的样品细胞的降解最小化。“立即接触”意指样品细胞或样品本身与主题药剂或溶液接触而没有与采集样品的时间的不必要延迟。在一些情况下,样品在从采集样品的时间后的6或更少小时内立即与制备药剂或溶液接触,采集样品的时间后的所述时间包括但不限于例如5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、30min或更少、20min或更少、15min或更少、10min或更少、5min或更少、4min或更少、3min或更少、2min或更少、1min或更少等,任选地包括使样品与制备药剂或溶液物理地接触所需要的最小时间量的下限,所述下限在一些情况下可以1sec至30sec或更多的数量级计。
所述方法的实施方案的各方面包括以某种方式执行样品的制备和/或样品细胞的固定,使得所制备的样品细胞维持非制备细胞的特征,包括原位(即,在采集之前)的非制备细胞和/或采集之后但是在固定和/或透化和/或标记之前的非固定细胞的特征。可维持的此类特征包括但不限于例如细胞形态学特征,包括但不限于例如细胞大小、细胞体积、细胞形状等。通过样品制备保护细胞特征可通过任何便利的手段来评价,所述手段包括例如将制备的细胞与细胞的一个或多个对照样品(诸如非制备或非固定或未标记样品)进行比较。将制备样品的细胞与具有特定的测量特征的非制备样品的细胞进行比较可提供对所述特征的某一百分比的保护,所述百分比将根据所评价的具体特征而变化。根据本文所述的方法制备的细胞的细胞特征的百分比保护将变化并且其范围可以是维持50%或更多,包括但不限于例如维持60%或更多、维持65%或更多、维持70%或更多、维持75%或更多、维持80%或更多、维持85%或更多、维持90%或更多等,并且任选地具有维持100%的最大值。在一些情况下,对特定细胞特征的保护可基于与所述特征的参考值(例如,来自一个或多个对照细胞的预先确定的测量、来自基于非制备细胞的已知参考标准等)的比较来评价。
如文本所述,在某些实施方案中,可对样品的细胞进行标记。细胞标记可通过使用一种或多种标记反应混合物来实现。在制备反应混合物时,所述样品可使用任何便利的方案与一种或多种特异性结合剂(例如,标记的生物标记物探针)接触或组合。根据需要,接触和/或组合可使用混合来进行。样品与一种或多种特异性结合剂的接触在孵育条件下执行,所述孵育条件提供药剂在样品细胞上或样品细胞中与其相应的生物标记物(如果存在的话)的结合。在一些情况下,药剂和样品在15℃至50℃的范围内(诸如20℃至约45℃)的温度下接触并组合。接触可使用混合或搅拌(例如,使用涡旋等)来执行以提供反应组分和样品的足够组合。
所得的反应混合物然后可维持或孵育一段时间,之后在流式细胞仪上获得数据(例如,如以下更详细地描述的样品数据和/或细胞数据)。在一些情况下,反应混合物在15℃至50℃的范围内(诸如20℃至约45℃)的温度下孵育一段时间,所述时间的范围是约30分钟至72小时,诸如1小时至24小时,包括1小时至3小时。在以上孵育步骤之后,所述样品可立即进行测定或保存以在随后的时间进行测定。在一些实施方案中,如果保存的话,则所述样品在降低温度下保存;例如在冰上保存。
在需要的情况下,可洗涤所得的反应混合物和样品的标记细胞,例如以去除任何未结合的药剂和其他样品组分。洗涤可使用任何便利的方案来执行,例如通过使反应混合物与合适的洗涤缓冲液组合并且将细胞从液体分离。根据需要,给定的洗涤方案可包括一个或多个不同的洗涤步骤。在任何洗涤方案之后,标记的细胞可重悬浮在合适的流体(例如,洗涤缓冲液或另一种缓冲液(例如,运行缓冲液))中,以用于例如通过流式细胞计数分析进行的后续分析。
在制备样品和/或固定样品的细胞之后,可对样品进行处理以立即获得数据或者可在一段时间内不从样品获得数据,例如从而实现样品的保存和/或转运。在对样品进行处理而对数据采集没有有害影响之前的时间段的长度将取决于各种因素,包括但不限于例如样品的总体稳定性、样品保存条件、标记是否用于制备样品以及如果是的话标记样品的细胞时使用何种具体的标签、和/或具体的样品制备,包括样品的细胞固定条件。“对数据采集没有有害影响”意指没有对从样品采集的数据(包括,例如,样品数据和/或细胞数据)的任何方面的显著负面影响,使得在制备一段时间之后从样品获得的数据和/或对样品进行的评估基本上相当于在制备之后立即获得的数据或评估。例如,在一些情况下,使用稳定的细胞固定剂保护样品的细胞和细胞标记,使得可在样品采集和制备许多天之后对样品进行处理以用于数据采集,并且所获得的数据足以评价细胞和/或进行评估。在一段时间之后进行处理的标记样品包括但不限于例如抗体标记的样品、染色的(例如,DNA染色的)样品、mRNA标记的样品等。在其间对数据采集没有有害影响的时间段将根据以上所讨论的各种因素而变化,并且其范围可以是8小时至10天或更多,包括但不限于例如12或更多小时、1天或更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、7天或更多、8天或更多等。
药剂和标签
可采用各种不同类型的特异性结合剂,其中结合剂的具体类型至少部分地基于感兴趣的标记物的分子的具体类型来选择。感兴趣的特异性结合剂包括抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等。如本文所用的术语“抗体结合剂”包括足以结合到感兴趣的分析物的多克隆或单克隆抗体或片段。抗体片段可以是例如单体Fab片段、单体Fab’片段、或二聚体F(ab)'2片段。也在术语“抗体结合剂”的范围内的是通过抗体工程化产生的分子,诸如单链抗体分子(scFv)或通过替换重链和轻链的恒定区来产生嵌合抗体或通过替换恒定区和可变区的框架部分两者来产生人源化抗体而从单克隆抗体产生的人源化抗体或嵌合抗体。感兴趣的核酸结合剂是与细胞中的生物标记物核酸特异性地结合或特异性地杂交的核酸。这些核酸的长度可变化,只要所述长度足够使寡核苷酸充当特异性结合剂即可,并且在一些情况下,其范围是13至100nt,诸如14至50nt,例如15至25nt,包括但不限于例如15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、以及25nt。根据需要,构成这些核酸结合剂的寡核苷酸可以是DNA或RNA、或其合成类似物。
如上所述,特异性结合剂本身可充当可检测标签或者可包含连接的可检测标签或者可与可检测标签结合,从而实现检测。因此,除与感兴趣的生物标记物特异性地结合或特异性地杂交的特异性结合结构域之外,特异性结合剂还可包含可检测标签或可与可检测标签结合或连接到可检测标签。感兴趣的可检测标签是荧光染料。荧光染料(荧光团)可选自适用于成像应用(例如,荧光显微镜术)和流式细胞术应用的许多染料中的任一种。大量的染料可从各种来源商购获得,例如像Molecular Probes(Eugene,OR)和Exciton(Dayton,OH)。感兴趣的荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-异硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸;吖啶和衍生物,诸如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红、以及吖啶异硫氰酸酯;5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS);4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯(荧光黄VS);N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺;邻氨基苯甲酰胺;亮黄;香豆素和衍生物,诸如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151);花青和衍生物,诸如焰红染料(cyanosine)、Cy3、Cy5、Cy5.5、以及Cy7;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI);5',5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红);7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素;二乙基氨基香豆素;二亚乙基三胺五乙酸盐;4,4'-二异硫氰基二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸;4,4'-二异硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸;5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯);4-(4'-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL);4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC);曙红和衍生物,诸如曙红和曙红异硫氰酸酯;赤藓红和衍生物,诸如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯;乙啶;荧光素和衍生物,诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、氯三嗪荧光素(fluorescein chlorotriazinyl)、萘并荧光素、以及QFITC(XRITC);荧胺;IR144;IR1446;绿色荧光蛋白(GFP);珊瑚礁荧光蛋白(RCFP);丽丝胺TM;丽丝胺罗丹明、荧光黄;孔雀石绿异硫氰酸酯;4-甲基伞形酮;邻甲酚酞;硝基酪氨酸;副品红碱;尼罗红;俄勒冈绿(Oregon Green);酚红;B-藻红蛋白;邻苯二甲醛;芘和衍生物,诸如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯;活性红4(CibacronTM亮红3B-A);罗丹明和衍生物,诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X、罗丹明X异硫氰酸酯、硫罗丹明B、硫罗丹明101、硫罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、以及四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC);核黄素;玫瑰酸和铽螯合物衍生物;咕吨;或其组合。也可使用本领域的技术人员已知的其他荧光团或其组合,例如可从Molecular Probes(Eugene,OR)和Exciton(Dayton,OH)获得的那些。
也感兴趣的特异性结合成员是含有内在荧光的核酸染料或染色剂,包括特异性标记DNA的那些。对于DNA是特异性的(或相比于单链多核苷酸,优先地结合双链多核苷酸)并且因此可用作非特异性染色剂的染料和染色剂包括但不限于:Hoechst 33342(2'-(4-乙氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,1'H-2,5'-联苯并咪唑三盐酸盐)和Hoechst 33258(4-[6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1',3'-二氢1H,2'H-2,5'-二氟硼烷基-2'-亚基]-2,5-环己二烯-1-酮三盐酸盐)以及Hoechst系列的其他染料和染色剂;SYTO 40、SYTO 11、SYTO 12、SYTO13、SYTO 14、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 20、SYTO 21、SYTO 22、SYTO 23、SYTO 24、SYTO 25(绿色);SYTO 17、SYTO 59(红色)、DAPI、DRAQ5TM(对双链DNA具有高亲和力的蒽醌染料)、YOYO-1、碘化丙锭、YO-PRO-3、TO-PRO-3、YOYO-3和TOTO-3、SYTOX绿、SYTOX、甲基绿、吖啶同型二聚体、7-氨基放线菌素D、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。根据具体的染色剂和测定法,染色剂可在DNA检测、核检测、DNA定量、核定量、细胞周期指示剂、细胞增殖指示剂、DNA完整性指示剂等中起作用。
在采用多种不同的标记生物标记物探针时,每种不同探针的标签可被选择来提供可区分的信号。例如,在采用第一不同标记生物标记物探针和第二不同标记生物标记物探针的实施方案中,第二探针中的标签是产生可与第一探针的标签的第一荧光信号区分的荧光信号的荧光标签。因此,在激发第一荧光标签和第二荧光标签之后产生的第一荧光信号和第二荧光信号可彼此区分,这意味着两者可同时被检测并且来自一者的信号不修改或改变来自另一者的信号。每种不同的标签可产生可与任何其他标签区分的信号。例如,细胞可使用第三荧光标签染色,所述第三荧光标签产生可与第一荧光信号和第二荧光信号区分的第三荧光信号。
在如本文所述的生物标记物的检测和/或测量方面得到使用的特异性结合剂包括但不限于结合免疫标记物的特异性结合剂、结合癌症和/或乳腺癌生物标记物的特异性结合剂、结合细胞粘着生物标记物的特异性结合剂、结合细胞周期或细胞增殖生物标记物的特异性结合剂等。
如本文所用的免疫标记物是指结合免疫细胞的组分的那些细胞标记物(例如,细胞表面标记物和细胞内标记物)。免疫标记物包括但不限于识别为过去为免疫表型提供靶标的分化簇(CD)抗原的那些细胞表面分子。一般来讲,CD抗原和免疫标记物可由一种或多种不同的免疫细胞类型表达。然而,CD抗原和免疫标记物通常非排外地在免疫细胞类型上表达,并且在许多情况中,免疫标记物也可在非免疫细胞类型(包括但不限于例如上皮细胞)上表达。可用于本文所述的方法的免疫标记物将根据具体的测定法和/或待检测的具体细胞类型和/或细胞群体而变化。在一些情况下,在本文所述的方法中得到使用的免疫标记物包括但不限于例如CD44、CD45等。
如本文所用的乳腺癌生物标记物是指结合与癌症和/或癌症进展相关联的基因产物(例如,mRNA、蛋白质等)的那些细胞标记物(例如,细胞表面标记物和细胞内标记物)和与乳腺癌和乳腺癌进展(例如,包括乳腺癌转移的进展)特异性地相关联的那些细胞标记物。在一些情况下,在本文所述的方法中得到使用的癌症生物标记物和乳腺癌生物标记物可包括但不限于例如***受体蛋白、***受体转录物、孕酮受体蛋白、人类表皮生长因子受体2(HER2)蛋白、HER2转录物、磷酸化组蛋白H2A.X(p-H2A.X)、裂解的半胱天冬酶3等。在其他情况下,对样品细胞的评估可包括检测和/或测量乳腺癌生物标记物,包括但不限于例如丝氨酸蛋白酶尿激酶类型纤溶酶原激活物(uPA)、uPA抑制剂(PAI-1)、Thomsen–Friedenreich(TF)抗原、乳腺珠蛋白(h-MAM)、骨桥蛋白、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族成员(包括例如FGFR2)、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、去乙酰化酶(SIRT)家族成员、蜗牛1锌指蛋白、捻相关蛋白1(TWIST1)、锌指蛋白E-框结合同源异型框1(ZEB1)、***受体α、***受体β、p53、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2等。
如本文所用的细胞粘着生物标记物是指结合到细胞粘着(例如,细胞到细胞粘着、细胞到ECM(细胞外基质)粘着等)中涉及的细胞组分的那些细胞标记物(例如,细胞表面标记物和细胞内标记物)。此类细胞粘着组分可具有或可不具有额外的细胞信号传导作用,并且可与和转移和/或癌症进展相关的上皮到间充质转变相关联。可用于本文所述的方法的细胞粘着生物标记物将根据具体的测定法和/或待检测的具体细胞类型和/或细胞群体而变化。在一些情况下,可在本文所述的方法中得到使用的细胞粘着生物标记物包括但不限于例如波形蛋白、波形蛋白转录物、E-钙粘着蛋白、E-钙粘着转录物、异粘蛋白(MTDH、LYRIC、AEG-1等)、MTDH转录物等。
如本文所用的细胞周期生物标记物是指结合细胞的细胞周期机器的组分的那些细胞标记物(例如,细胞表面标记物和细胞内标记物)。在一些情况下,细胞周期生物标记物可用于采集与细胞周期时期或细胞是否是增殖性的相关的细胞数据。可用于本文所述的方法的细胞周期生物标记物将根据具体的测定法和/或待检测的具体细胞类型和/或细胞群体而变化。在一些情况下,可在本文所述的方法中得到使用的细胞周期生物标记物包括但不限于例如Ki67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E等。
以上所述的标记物包括细胞内标记物。如本文所用,术语“细胞内标记物”是指细胞的在细胞内、越过质膜外表面的组分。此类组分可在或可不在细胞的任何内部组分内,所述组分包括但不限于质膜的内表面、细胞质、细胞核、线粒体、内质网等。由此,标记或检测细胞内标记物需要将细胞内标记物的特异性标签或特异性结合剂转运穿过至少质膜的外表面。在一些情况下,细胞内标记物的标签或特异性结合剂可以是可透过膜,因此对于标记细胞内标记物不需要调控膜可透性。在一些实施方案中,细胞内标记物的标签或特异性结合剂可以是不可透过膜,因此对于标记细胞内标记物需要调控膜可透性,包括例如使用如本文所述的一种或多种透化试剂来制备和或处理细胞。
以上所述的标记物包括细胞表面标记物。如本文所用,术语“细胞表面标记物”是指细胞的部分地或完全地至少暴露在细胞的质膜的外表面上并且因此可在不调控细胞可透性的情况下(例如,在不使用如本文所述的一种或多种透化试剂的情况下)触及的组分。在一些情况下,细胞表面标记物包括细胞的具有一部分暴露在细胞膜的外表面上但是也包含细胞内部分和/或跨膜部分的组分。
如本文所述并且如对于本领域的普通技术人员易于显而易见的,本文所述的药剂和标签的任何组合可用于所述的细胞评估方法中,前提是所述组合是适当的并且所述组分不在物理上或光学上造成干扰。例如,其中可和/或应采用具体标签的变型或替换形式,以便使两种或更多种所需组分的组合在普通技术人员的技术范围内。作为非限制性实例,在生物标记物的特定荧光标签在光学上干扰(例如,具有重叠的发射光谱)具有特定发射波长的所需DNA标记剂时,生物标记物的荧光标签可使用与所需DNA标记剂没有或具有较少发射光谱重叠的不同荧光标签替换。
流式细胞术
如以上所概述的,本发明的方法包括以流式细胞计数法分析样品以获得数据。流式细胞术是使用多参数数据用于在流体介质中的不同颗粒(例如,细胞)类型(即,在标签(波长、强度)、大小等方面彼此不同的颗粒)之间进行识别和区分的方法。在以流式细胞计数法分析如上所述制备的样品时,首先将等分试样的样品导入到流式细胞仪的流动路径中。当在流动路径中时,样品中的细胞基本上一次一个地穿过一个或多个感测区,其中细胞中的每个单独地且单个地暴露于在单一波长下的光源(或在一些情况下,两个或更多个不同的光源)并且根据需要,细胞参数(例如,光散射参数)和/或生物标记物参数(例如,荧光发射)的测量值针对每个细胞单独进行记录。根据需要,针对每个细胞记录的数据进行实时分析或存储在数据存储和分析装置(诸如计算机)中以用于随后分析。
更具体地,在流式细胞术中,细胞在悬浮液中基本上一次一个地在流动路径中穿过一个或多个感测区,其中在每个区域中,每个细胞被能量源照射。能量源可包括发射单一波长的光(诸如由激光器(例如,He/Ne或氩)提供的光)的照明器或具有适当滤光器的汞弧灯。例如,在488nm处的光可用作具有单一感测区的流式细胞仪中的发射波长。对于发射在两个不同波长下的光的流式细胞仪,可采用发射光的额外波长,其中感兴趣的特定波长包括但不限于:405nm、535nm、561nm、635nm、642nm等。
在具有感测区的系列中,当细胞穿过感测区并且被能量源照明时,如果其标记有荧光标记物,则检测器(例如,光收集器,诸如光电倍增管(或“PMT”)、雪崩光电二极管(APD)等)用于记录穿过每个细胞的光(通常称为前向光散射)、与细胞流动通过感测区的方向正交反射的光(通常称为正交或侧光散射)和从细胞发射的荧光。所获得的每种类型的数据(例如,前向光散射(或FSC)、正交光散射(SSC)、以及荧光发射(FL1、FL2等))包括每个细胞(或每个“事件”)的单独参数。
流式细胞仪还可包括一个或多个电检测器。在某些实施方案中,电检测器可用于检测由穿过跨颗粒/细胞的路径中的孔传播的电场的颗粒或细胞引起的扰动。具有电检测器的此类流式细胞仪容纳使电场跨细胞所导向通过的流动路径或孔的电场传播的发射对应电能的来源。使用适当的检测器的任何便利的电场和/或场的组合可用于检测和/或测量穿过所述场的颗粒(或细胞),所述场包括但不限于例如直流电场、交流电场、射频场等。
流式细胞仪还包括数据获取、分析和记录装置,诸如计算机,其中当每个细胞穿过感测区时,多个数据通道记录来自针对每个细胞的每个检测器的数据。分析***的目的在于对细胞进行分类和计数(其中每个细胞本身呈现为数字化参数值的集)并且为作为整体的样品累积数据。在本公开的方法中以流式细胞计数法测定细胞时,流式细胞仪可设置来在所选的参数上触发以便从背景、噪音和/或预定极限区分感兴趣的细胞。“触发”是指用于检测参数的预定阈值。其通常用作检测细胞穿过激光束或电场的手段。检测到超过所选参数的阈值的事件触发针对细胞获取数据,包括光散射和荧光数据。不针对介质中引起低于阈值的响应的所测定的细胞或其他组分获取数据。在一些情况下,触发参数可以是检测到由细胞穿过光束引起的前向散射光。流式细胞仪然后针对细胞检测并采集数据,包括光散射数据、荧光数据等。
然后通过基于针对整个群体采集的数据进行“选通”进一步分析感兴趣的特定亚群。为了选择适当的门,例如通过调整器具的配置(包括,激发参数、采集参数、补偿参数等)对数据进行绘制以便获得亚群的适当分离。在一些情况下,此过程通过在二维点图上绘制前向光散射(FSC)相对于侧(即,正交)光散射(SSC)来进行。流式细胞仪操作员然后所需的细胞亚群(即,门内的那些细胞)并且排除不在门内的细胞。在需要的情况下,操作员可通过使用计算机屏幕上的光标在所需亚群周围划线来选择门。然后通过对这些细胞的其他参数(诸如荧光)进行绘制来进一步分析仅在门内的那些细胞。
可采用能够从相同的等分式样的流体样品获得例如如以上所述的样品数据和细胞数据两者的任何流式细胞仪。感兴趣的流式细胞仪***的非限制性实例是可从商业供应商获得的那些,所述商业供应商包括但不限于例如Becton-Dickenson(Franklin Lakes,NJ)、Life Technologies(Grand Island,NY)、Acea Biosciences(San Diego,CA)、Beckman-Coulter公司(Indianapolis,IN)、Bio-Rad Laboratories公司(Hercules,CA)、Cytonome公司(Boston,MA)、Amnis公司(Seattle,WA)、EMD Millipore(Billerica,MA)、Sony Biotechnology公司(SanJose,CA)、Stratedigm公司(San Jose,CA)、UnionBiometrica公司(Holliston,MA)、Cytek Development(Fremont,CA)、Propel Labs公司(Fort Collins,CO)、Orflow Technologies(Ketchum,ID)、handyem公司(Québec,Canada)、Sysmex公司(Kobe,Japan)、Partec Japan公司(Tsuchiura,Japan)、Bay bioscience(Kobe,Japan)、Furukawa Electric有限公司(Tokyo,Japan)、On-chip Biotechnologies有限公司(Tokyo,Japan)、Apogee Flow Systems有限公司(Hertfordshire,United Kingdom)等。
在一些情况下,如本文所述的方法可使用流式细胞仪***来执行,所述流式细胞仪***具有指定用于检测和用于评价样品的每个数据分量(例如,细胞数据分量或样品数据分量)的数据获取、检测特定细胞类型、和/或对样品进行评估的单一检测器。例如,在一些情况下,利用两个荧光标签的方法可使用流式细胞仪***来执行,所述流式细胞仪***具有指定用于检测第一荧光标签的单一检测器和指定用于检测第二标签的第二检测器。
在一些情况下,如本文所述的方法可使用流式细胞仪***来执行,所述流式细胞仪***具有指定用于检测和用于评价样品的多个数据分量(例如,细胞数据分量或样品数据分量或其分量组合)的数据获取、检测特定细胞类型、和/或对样品进行评估的单一检测器。在一些情况下,被配置用于获取多个(即,两个或更多个)数据分量的此类检测器可用于顺序数据获取,这意味着按顺序一次一个地获取多个数据分量。在一些情况下,被配置用于获取多个数据分量的此类检测器可用于同时数据获取,这意味着一次同时获取多个数据分量,并且随后分离或解析个体数据分量(例如,在检测器内以光学的方式进行、在检测器内以电的方式进行、在信号处理模块内以电子的方式进行)。在一些情况下,根据流式细胞仪***的配置和待执行的所需分析,检测器可利用顺序数据获取和同时数据获取两者。流式细胞仪***不限于指定的检测器和多个检测器,并且可包括指定用于检测单个数据分量的检测器和检测多个数据分量的检测器两者。
以下进一步描述流式细胞计数***配置、部件和其变型。
样品评价
主题公开的方法的各方面包括通过在流式细胞仪上获得数据来评价例如呈乳腺细胞的流体样品形式的细胞乳腺样品。如本文所述,不同的数据分量(例如,样品数据和细胞数据)可在此评价中组合。在一些情况下,所述评价比单独使用的个体数据分量中的任一个具有更好的预测能力(即,可更强地支持结论)。
根据所获得的数据、细胞样品的类型、和/或进行评价的目的,评价可通过任何便利或适当的手段来执行。例如,在一些情况下,对样品的评价通过考虑从样品获得的组合数据来进行。在一些情况下,评价包括将组合数据与一个或多个对照或参考值进行比较。在其他情况下,评价通过实施参考所获得的数据的算法或决策树来进行。在其他情况下,评价通过实施参考所获得的数据的统计学测试(例如,统计学模型的测试)来进行。根据所获得的具体数据和/或进行评价的目的,算法、决策数可或统计学测试可通过计算机,例如利用计算机的处理功能执行通过人可能不可靠地执行的数学步骤来实施。
在一些情况下,本文所述的方法可包括检测样品中的特定细胞类型和/或识别样品中的特定细胞类型。例如,在一些情况下,所述方法包括确定所测定的细胞样品包含癌细胞(即,癌细胞在样品中被检测到)。在这些实施方案中,所述方法包括识别一种或多种癌细胞在样品中的存在,其中所述识别基于所获得的数据(例如,如上所述的样品数据和/或细胞数据)来进行。
在一些情况下,所述方法包括确定所测定的细胞样品包含非癌细胞,其中非癌细胞的存在指示受试者中的癌症。在这些实施方案中,所述方法包括识别(即,检测到)一种或多种非癌细胞在样品中的存在,其中所述识别基于所获得的数据(例如,如上所述的样品数据和/或细胞数据)来进行。在某些情况下,指示受试者中的癌症的此类非癌细胞包括WBC和/或WBC的一个或多个特定亚群。
在一些情况下,所述方法包括确定所测定的细胞样品包含某些癌细胞和/或某些非癌细胞,其中某些癌细胞和/或某些非癌细胞的存在指示受试者中的转移性癌症。在这些实施方案中,所述方法包括识别(即,检测到)一种或多种癌细胞和/或一种或多种非癌细胞在样品中的存在,其中所述识别基于所获得的数据(例如,如上所述的样品数据和/或细胞数据)来进行。
在一些情况下,对所获得的样品数据的评价可基于预先确定的样品数据参数。预先确定的样品数据参数可以是参考值(例如,提供用于与所获得的实验值进行比较的参考值),或者预先确定的样品数据可以是用户定义的(例如,通过测量对照样品(例如,健康对照、癌对照、或其他参考对照和其组合)的样品数据参数)。预先确定的样品数据参数可针对任何样品数据(例如,包括本文所述的那些)进行提供或用户定义。
在一些情况下,预先确定的样品数据参数可包括样品细胞密度参数。例如,在一些情况下,所获得的样品数据可与已知健康样品的预先确定的样品细胞密度进行比较来评价,所述预先确定的样品细胞密度的范围小于10,000至30,000个细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品)或更多,包括但不限于例如10,000个细胞/300μl的分析样品、15,000个细胞/300μl的分析样品、20,000个细胞/300μl的分析样品、25,000个细胞/300μl的分析样品、30,000个细胞/300μl的分析样品等。在一些情况下,预先确定的样品细胞密度数据参数可以是指示健康样品的样品细胞密度阈值,其中在所述阈值处或低于所述阈值的样品细胞密度指示样品是健康样品的可能性。例如,指示健康样品的样品细胞密度阈值可包括但不限于80,000个或更少细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品)的样品细胞密度,包括但不限于例如80,000个或更少细胞/300μl的分析样品、70,000个或更少细胞/300μl的分析样品、60,000个或更少细胞/300μl的分析样品、50,000个或更少细胞/300μl的分析样品、40,000个或更少细胞/300μl的分析样品、30,000个或更少细胞/300μl的分析样品、20,000个或更少细胞/300μl的分析样品等。
在一些情况下,所获得的样品数据可与已知肿瘤样品的预先确定的样品细胞密度进行比较来评价,所述预先确定的样品细胞密度的范围小于80,000至1,000,000个细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品)或更多,包括但不限于例如80,000个细胞/300μl的分析样品、90,000个细胞/300μl的分析样品、100,000个细胞/300μl的分析样品、110,000个细胞/300μl的分析样品、120,000个细胞/300μl的分析样品、130,000个细胞/300μl的分析样品、140,000个细胞/300μl的分析样品、150,000个细胞/300μl的分析样品、160,000个细胞/300μl的分析样品、170,000个细胞/300μl的分析样品、180,000个细胞/300μl的分析样品、190,000个细胞/300μl的分析样品、200,000个细胞/300μl的分析样品等。在一些情况下,预先确定的样品细胞密度数据参数可以是指示肿瘤样品的样品细胞密度阈值,其中在所述阈值处或高于所述阈值的样品细胞密度指示样品是肿瘤样品的可能性。例如,指示肿瘤样品的样品细胞密度阈值可包括但不限于50,000个或更多细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品)的样品细胞密度,包括但不限于例如50,000个或更多细胞/300μl的分析样品、60,000个或更多细胞/300μl的分析样品、70,000个或更多细胞/300μl的分析样品、80,000个或更多细胞/300μl的分析样品、90,000个或更多细胞/300μl的分析样品、95,000个或更多细胞/300μl的分析样品、100,000个或更多细胞/300μl的分析样品、105,000个或更多细胞/300μl的分析样品等。
在一些情况下,所获得的样品数据可与预先确定的样品细胞密度进行比较来评价,其中此比较提供相对样品细胞密度。相对样品细胞密度可通过将所测得的样品细胞密度与所测得的对照或参考值(例如,已知的健康对照或参考或已知的肿瘤对照或参考)的细胞密度进行比较来确定。例如,当样品的相对样品细胞密度大于或等于(≥)2倍的健康参考或对照的样品细胞密度时,所确定的相对样品细胞密度可指示肿瘤样品,所述倍数包括但不限于例如≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3.0倍、≥3.1倍、≥3.2倍、≥3.3倍、≥3.4倍、≥3.5倍、≥3.6倍、≥3.7倍、≥3.8倍、≥3.9倍、≥4.0倍、≥4.1倍、≥4.2倍、≥4.3倍、≥4.4倍、≥4.5倍、≥4.6倍、≥4.7倍、≥4.8倍、≥4.9倍、≥5.0倍、≥5.1倍、≥5.2倍、≥5.3倍、≥5.4倍以及≥5.5倍的健康参考或对照的样品细胞密度。
在一些情况下,所获得的样品数据可与已知转移性肿瘤样品的预先确定的样品细胞密度进行比较来评价,所述预先确定的样品细胞密度的范围小于200,000至1,000,000个细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品)或更多,包括但不限于例如200,000个细胞/300μl的分析样品、250,000个细胞/300μl的分析样品、300,000个细胞/300μl的分析样品、450,000个细胞/300μl的分析样品、500,000个细胞/300μl的分析样品、550,000个细胞/300μl的分析样品、600,000个细胞/300μl的分析样品、650,000个细胞/300μl的分析样品、700,000个细胞/300μl的分析样品、750,000个细胞/300μl的分析样品、800,000个细胞/300μl的分析样品、850,000个细胞/300μl的分析样品、900,000个细胞/300μl的分析样品、950,000个细胞/300μl的分析样品、1,000,000个细胞/300μl的分析样品等。在一些情况下,预先确定的样品细胞密度数据参数可以是指示转移性肿瘤样品的样品细胞密度阈值,其中在所述阈值处或高于所述阈值的样品细胞密度指示样品是转移性肿瘤样品的可能性。例如,指示转移性肿瘤样品的样品细胞密度阈值可包括但不限于200,000个或更多细胞/分析样品的体积(例如,300μl的分析样品),包括但不限于例如250,000个或更多细胞/300μl的分析样品、300,000个或更多细胞/300μl的分析样品、350,000个或更多细胞/300μl的分析样品、400,000个或更多细胞/300μl的分析样品、450,000个或更多细胞/300μl的分析样品、500,000个或更多细胞/300μl的分析样品、550,000个或更多细胞/300μl的分析样品、600,000个或更多细胞/300μl的分析样品、650,000个或更多细胞/300μl的分析样品、700,000个或更多细胞/300μl的分析样品、750,000个或更多细胞/300μl的分析样品、800,000个或更多细胞/300μl的分析样品、850,000个或更多细胞/300μl的分析样品等。在比较样品的样品细胞密度例如以便确定肿瘤样品是否是转移性肿瘤样品时,可采用任何便利的样品细胞密度测量,包括但不限于单一细胞计数、上皮细胞计数等。
在一些情况下,所获得的样品数据可与预先确定的样品细胞密度进行比较来评价,其中此比较提供相对样品细胞密度。相对样品细胞密度可通过将所测得的样品细胞密度与所测得的对照或参考值(例如,已知的肿瘤对照或参考或已知的转移性肿瘤对照或参考)的细胞密度进行比较来确定。例如,当样品的相对样品细胞密度大于或等于(≥)2倍的非转移性肿瘤参考或对照样品的样品细胞密度时,所确定的相对样品细胞密度可指示转移性肿瘤样品,所述倍数包括但不限于例如≥2.5倍、≥3.0倍、≥3.5倍、≥4.0倍、≥4.5倍、≥5.0倍、≥5.5倍、≥6.0倍、≥6.5倍、≥7.0倍、≥7.5倍、≥8.0倍、≥8.5倍、≥9.0倍、≥9.5倍、≥10.0倍、≥10.5倍、≥11.0倍、≥11.5倍、≥12.0倍、≥12.5倍、≥13.0倍、≥13.5倍、≥14.0倍、≥14.5倍、≥15.0倍、≥15.5倍、≥16.0倍、≥16.5倍、≥17.0倍、≥17.5倍、≥18.0倍、≥18.5倍、≥19.0倍、≥19.5倍、≥20.0倍、≥20.5倍以及≥21.0倍的非转移性肿瘤参考或对照样品的样品细胞密度。
在一些情况下,对所获得的细胞数据的评价可基于预先确定的细胞数据参数。预先确定的细胞数据参数可以是参考值(例如,提供用于与所获得的实验值进行比较的参考值),或者预先确定的细胞数据可以是用户定义的(例如,通过测量对照样品的细胞(例如,健康对照、癌对照、或其他参考对照和其组合)或样品的对照亚群(例如,选通亚群)的细胞数据参数)。预先确定的细胞数据参数可针对任何细胞数据(例如,包括本文所述的那些)进行提供或用户定义。
在一些情况下,预先确定的细胞数据参数可包括每细胞DNA含量参数,例如上皮细胞每细胞DNA含量参数。例如,在一些情况下,所获得的细胞数据可与针对样品的正常上皮细胞或正常非上皮细胞类型(包括但不限于例如样品的WBC)计算或先前获得的预先确定的每细胞DNA含量参数进行比较来评估。由此,在一些情况下,所测得的DNA含量(例如,样品细胞或样品细胞的亚群(例如,样品的上皮细胞)的平均DNA含量)可与预先确定的每细胞DNA含量参数进行比较以得到主题细胞或细胞的主题亚群的相对每细胞DNA含量值。在一些情况下,样品细胞或其亚群的相对每细胞DNA含量值可高于指示样品具有是肿瘤样品的增加可能性的特定阈值。例如,大于或等于正常细胞的阈值DNA含量值的相对DNA含量可指示样品具有是肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可大于或等于(≥)1.05倍的正常细胞的DNA含量,包括但不限于例如≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.10倍、≥1.11倍、≥1.12倍以及≥1.13倍的正常细胞的DNA含量。
在一些情况下,所获得的细胞数据可与针对样品的肿瘤细胞计算或先前获得的预先确定的每细胞DNA含量参数来评价。由此,在一些情况下,所测得的DNA含量(例如,样品细胞或样品细胞的亚群(例如,样品的上皮细胞)的平均DNA含量)可与肿瘤细胞的预先确定的每细胞DNA含量参数进行比较以得到主题细胞或细胞的主题亚群的相对于肿瘤细胞(例如,非转移性肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞)的相对每细胞DNA含量值。在一些情况下,样品细胞或其亚群的相对每细胞DNA含量值可高于指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性的特定阈值。例如,大于或等于非转移性肿瘤细胞的阈值DNA含量值的相对DNA含量可指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可大于或等于(≥)1.05倍的非转移性肿瘤细胞的DNA含量,包括但不限于例如≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.10倍、≥1.11倍、≥1.12倍、≥1.13倍、≥1.14倍以及≥1.15倍的非转移性肿瘤细胞的DNA含量。
在一些情况下,预先确定的细胞数据参数可包括细胞增殖参数,例如上皮细胞增殖参数。例如,在一些情况下,所获得的细胞数据可与健康样品的预先确定的细胞增殖百分比进行比较来评价,其中所述增殖百分比可表达为处于细胞周期的特定时期(例如,G1、S、G2、M等)或除了细胞周期的G1期以外的细胞周期时期(例如,“G1后”)的细胞(例如,上皮细胞)的百分比。在一些情况下,健康样品的上皮细胞的上皮细胞增殖参数是15%或更小(例如,其中细胞的15%处于G1后并且细胞的85%处于G1期),包括但不限于例如14%或更小、13%或更小、12%或更小、11%或更小、10%或更小、9.5%或更小、9.0%或更小、8.5%或更小、8.0%或更小以及7.5%或更小。在一些情况下,肿瘤样品的上皮细胞的上皮细胞增殖参数是20%或更大(例如,其中细胞的20%处于G1后并且细胞的80%处于G1期),包括但不限于例如20.5%或更大、21.0%或更大、21.5%或更大、22.0%或更大、22.5%或更大、23.0%或更大、23.5%或更大以及24.0%或更大。在一些情况下,大于或等于健康样品的预先确定的阈值增殖百分比的相对增殖百分比可指示主题样品具有是肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可大于或等于(≥)1.1倍的健康样品的增殖百分比,包括但不限于例如≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2.0倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6、≥2.7倍以及≥2.8倍的健康样品的增殖百分比。
在一些情况下,预先确定的细胞数据参数可包括每细胞生物标记物表达参数,例如上皮每细胞生物标记物表达参数。例如,在一些情况下,所获得的细胞数据可与传达为平均荧光强度或中值平均荧光强度的预先确定的上皮每细胞生物标记物表达值进行比较来评价。例如,在一些情况下,所获得的生物标记物表达数据可与针对非转移性肿瘤样品的上皮细胞计算或先前获得的预先确定的每细胞生物标记物表达参数来评估,所述表达参数包括但不限于例如非转移性肿瘤样品的上皮细胞的Her2生物标记物探针的平均荧光强度(MFI)。由此,在一些情况下,所测得的Her2MFI(例如,样品细胞或样品细胞的亚群(例如,样品的上皮细胞)的平均Her2MFI)可与预先确定的每细胞Her2MFI参数进行比较以得到主题细胞或细胞的主题亚群的相对每细胞Her2MFI值。在一些情况下,样品细胞或其亚群的相对每细胞Her2MFI值可高于指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性的特定阈值。例如,大于或等于非转移性肿瘤样品的阈值Her2MFI值的相对Her2MFI可指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可大于或等于(≥)1.50倍的非转移性肿瘤样品的Her2MFI,包括但不限于例如≥1.75倍、≥2.0倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍以及≥2.7倍的非转移性肿瘤样品的Her2MFI。
在一些情况下,预先确定的细胞数据参数可包括每细胞细胞体积参数,例如上皮每细胞细胞体积参数。例如,在一些情况下,所获得的细胞数据可与表达为平均红细胞体积(MCV)或中值MCV的预先确定的上皮每细胞细胞体积进行比较来评价。例如,在一些情况下,所获得的细胞体积数据可与针对健康样品的上皮细胞计算或先前获得的预先确定的每细胞细胞体积参数进行比较来评价,所述体积参数包括但不限于例如健康样品的上皮细胞的中值MCV。由此,在一些情况下,所测得的样品细胞体积可与预先确定的细胞体积参数进行比较以得到主题细胞或细胞的主题亚群的相对细胞体积值。在一些情况下,样品细胞或其亚群的相对细胞体积值可高于指示样品具有是肿瘤样品的增加可能性的特定阈值。例如,大于或等于健康样品的阈值细胞体积参数的相对细胞体积值可指示样品具有是肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可大于或等于(≥)1.50倍的健康样品的细胞体积参数,包括但不限于例如≥1.55倍、≥1.60倍、≥1.65倍、≥1.70倍、≥1.75倍、≥1.80倍以及≥1.85倍的健康样品的细胞体积参数。
在一些情况下,样品细胞或其亚群的相对细胞体积值可高于指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性的特定阈值。例如,小于或等于非转移性肿瘤样品的阈值细胞体积参数的相对细胞体积值可指示样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可小于或等于(≤)0.75倍的非转移性肿瘤样品的细胞体积参数,包括但不限于例如≤0.70倍、≤0.65倍、≤0.60倍、≤0.55倍以及≤0.50倍的非转移性肿瘤样品的细胞体积参数。
在一些情况下,预先确定的细胞数据参数可包括WBC参数,例如WBC背景生物标记物信号参数、WBC增殖参数等。例如,在一些情况下,所获得的WBC细胞数据可与预先确定的背景生物标记物信号(例如,WBC的背景ER生物标记物信号、WBC的背景PR生物标记物信号、WBC的背景组合ER/PR生物标记物信号等)进行比较来评价,其中预先确定的背景生物标记物信号可以是WBC或WBC的亚群的生物标记物的平均荧光或生物标记物的中值荧光。在一些情况下,小于或等于健康样品的预先确定的阈值WBC背景生物标记物信号的相对WBC背景生物标记物信号可指示主题样品具有是肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可小于或等于(≤)0.95倍的健康样品的WBC背景生物标记物信号,包括但不限于例如≤0.94倍、≤0.93倍、≤0.92倍、≤0.91倍、≤0.90倍、≤0.89倍、≤0.88倍、≤0.87倍、≤0.86倍、≤0.85倍、≤0.84倍、≤0.83倍、≤0.82倍、≤0.81倍以及≤0.80倍的健康样品的WBC背景生物标记物信号。
在一些情况下,所获得的WBC样品数据可与预先确定的WBC样品参数进行比较来评价。例如,在一些情况下,所获得的WBC样品数据(例如,样品中的WBC的百分比)可与预先确定的WBC样品参数(例如,样品中的WBC的百分比)进行比较来评价。在一些情况下,非转移性肿瘤样品的WBC样品百分比参数是17%或更大,包括但不限于例如18%或更大、19%或更大、20%或更大、21%或更大、22%或更大以及23%或更大。在一些情况下,转移性肿瘤样品的WBC样品百分比参数是15%或更小,包括但不限于例如14%或更小、13%或更小、12%或更小、11%或更小、10%或更小以及9%或更小。在一些情况下,小于或等于非转移性肿瘤样品的预先确定的阈值WBC百分比的样品中的相对WBC百分比可指示主题样品具有是转移性肿瘤样品的增加可能性,其中所述阈值可小于或等于(≤)0.70倍的非转移性肿瘤样品的WBC百分比,包括但不限于例如≤0.65倍、≤0.60倍、≤0.55倍、≤0.50倍、≤0.45倍以及≤0.40倍的非转移性肿瘤样品的WBC百分比。
可用于评价所获得的数据的参数不限于以上具体描述的那些。用于执行对细胞乳腺样品的评估的任何数据类型(包括如本文所述的样品数据和细胞数据)的可用参数可易于根据所述方法来确定,所述方法包括但不限于针对特定数据以流式细胞计数法测定对照样品,例如对照健康样品和/或对照肿瘤样品。在一些情况下,可用的数据参数可通过执行对所获取的数据的统计学分析(包括但不限于本文所述的统计学测试方法)来确定。在一些情况下,可用的数据参数可通过执行对两种或更多种所获取的数据类型的统计学分析(包括但不限于多变量统计学分析和多变量统计学建模)来确定。
可用参数的组合可通过评价已知训练集的样品(例如,包含已知健康样品和已知癌样品的样品的训练集)或样品数据(例如,来自已知健康样品和已知癌样品的数据的训练集)来构建能够将样品分类为癌性或非癌性的多参数统计学模型来确定。在一些情况下,所述模型可基于所需数量的参数来构建。多参数模型中的参数数量将根据所述模型是否局限于预先确定或所需数量的参数或者模型内的参数数量是否不受局限并且允许在确定最好的或最高效的参数集方面变化而变化。多参数模型中的参数数量将变化并且其范围可以是2个至20个或更多,包括但不限于例如2个至20个、2个至15个、2个至14个、2个至13个、2个至12个、2个至11个、2个至10个、2个至9个、2个至8个、2个至7个、2个至6个、2个至5个、2个至4个、3个至20个、3个至15个、3个至14个、3个至13个、3个至12个、3个至11个、3个至10个、3个至9个、3个至8个、3个至7个、3个至6个、3个至5个、4个至20个、4个至15个、4个至14个、4个至13个、4个至12个、4个至11个、4个至10个、4个至9个、4个至8个、4个至7个、4个至6个、5个至20个、5个至15个、5个至14个、5个至13个、5个至12个、5个至11个、5个至10个、5个至9个、5个至8个、5个至7个、10个至20个、15个至20个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15等。
在一些情况下,多参数模型的参数可基于将数据的训练集输入到线性回归模型中并且以所需特异性和/或敏感性确定能够将样品分类为癌性或非癌性的参数集来确定。所需水平的敏感性和/或特异性将变化并且其范围可以是例如至少80%或更大,包括但不限于例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等。在一些情况下,敏感性和特异性两者是至少80%,包括但不限于例如至少85%、至少90%、至少95%等。多参数模型的敏感性和/或特异性可在已知样品上进行测试以确认或核实模型对于不同于训练集的样品和/或数据的样品和/或数据的敏感性和/或特异性,所述样品和/或数据从训练集的所述样品和/或数据发展。
评估
如上所概述的,本公开的各方面涉及基于对从样品获得的数据的评价来对来自受试者的细胞乳腺样品进行评估。术语“受试者”、“个体”、和“患者”在本文中可互换使用并且是指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者,并且在一些情况下包括人类。
在一些情况下,所述评估包括评估肿瘤性疾病在受试者中的存在,即判断或鉴定受试者是否患有肿瘤性疾病。如本文所用,术语“肿瘤性疾病”是指特征在于异常组织生长的疾病和病状,包括癌症。在本公开的各方面中,肿瘤性疾病评估包括乳腺癌评估,其中如本文所用的术语“乳腺癌”通常包括乳腺组织的肿瘤性疾病,包括但不限于例如前癌、原位癌症、侵入性癌症、癌(carcinomas)、肉瘤、腺癌、导管癌、原位导管癌、侵入性导管癌、小叶癌、侵入性小叶癌、炎性乳腺癌、佩吉特氏病、叶状肿瘤、血管肉瘤、腺样囊性癌、低级腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、***状癌、管状癌、化生性癌、微***癌、混合癌(例如,具有侵入性导管和小叶两者的特征)等。
在一些情况下,个体具有临床上非显著量的乳腺瘤,或者未患有乳腺癌。例如,本公开的评估在不具有发展乳腺瘤或乳腺癌的增加风险的个体的乳腺瘤监测方面得到使用,所述个体例如健康个体或先前不具有阳性乳腺癌筛选测试(即,指示乳腺瘤存在的乳腺癌筛选测试)的个体。
在一些情况下,个体具有临床上显著量的乳腺瘤,即例如由于增加乳腺癌形成的任何综合征或原因而引起的与健康个体相比高于平均量的乳腺瘤。例如,本公开的评估在具有增加的乳腺癌发病率的个体的乳腺癌监测方面得到使用,例如,评估可用于具有乳腺癌的个体中的乳腺癌监测。
在一些情况下,个体具有发展乳腺癌的增加风险。由于任何已知的风险因素的存在,此类个体可具有乳腺癌的增加风险,所述风险因素例如家族病史或阳性筛选测试(例如,包括乳腺癌基因测试)或先前存在乳腺癌或先前去除或治疗乳腺癌。增加乳腺癌的风险的其他此类因素包括但不限于女性性别、年龄增加(例如,超过45岁、超过55岁等)、乳腺癌相关基因中存在基因突变(例如,BRCA1中的突变、BRCA2中的突变、ATM中的突变、TP53中的突变、CHEK2中的突变、PTEN中的突变、CDH1中的突变、STK11中的突变、PALB2中的突变等)、癌症相关基因中存在基因突变、乳腺癌的家族史、乳腺癌的个人史、白种人种族、非洲裔美国人种族、高乳腺组织密度(例如,腺组织和/或纤维组织与脂肪组织的高比率)、绝经后状态、绝经激素疗法、存在非增殖性病变(例如,纤维化、囊肿、中度增生、非硬化性腺病、导管扩张、良性叶状肿瘤、单***瘤、脂肪坏死、导管周围纤维化、鳞状上皮化生、顶浆分化上皮化生、上皮相关钙化、脂肪瘤、错构瘤、血管瘤、神经纤维瘤、腺肌瘤等)、没有异型性的增殖性病变(例如,导管增生、纤维腺瘤、硬化性腺病、***状瘤病、放射状瘢痕等)、具有异型性的增殖性病变(例如,非典型性导管增生(ADH)、非典型性小叶增生(ALH)等)、存在原位小叶癌、暴露于***和孕酮的生命时间增加(例如,月经开始较早、更年期开始较晚等)、胸部暴露于放射增加(例如,对胸部区域的放射疗法等)、二乙基己烯雌酚暴露增加、具有孩子、具有大于30岁的孩子、口服避孕药、饮酒、超重、肥胖等。
在某些情况下,根据本文所述的方法,当个体具有乳腺癌的单个风险因素时,指示在个体中增加对乳腺癌的监测。在某些情况下,根据本文所述的方法,当个体具有乳腺癌的多个(例如,多于一个,例如2-5个,例如约2个、约3个、约4个、或约5个)风险因素时,指示在个体中增加对乳腺癌的监测。在某些情况下,根据本文所述的方法,当个体具有单个或组合的相对风险时,指示在个体中增加对乳腺癌的监测,所述相对风险如通过从单个风险因素或多个风险因素计算相对风险的任何便利的方法计算,所述相对风险等于或大于约1.1,例如约1.1至约1.4、约1.3至约2.0、大于约2.0、大于约2.5、大于约3、大于约4、大于约5、大于约7.5、大于约10、大于约15、大于约20等,任选地具有约200的最大值。在一些情况下,乳腺癌中的具体的单个风险因素或多个风险因素的相对风险可包括在例如Singletary,S.E.(2003)Ann Surg.237(4):474–482中所描述的那些,所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
增加的监测意指在大于针对相当的(例如,年龄匹配、性别匹配、种族匹配等)健康个体所建议的频率下的增加的筛选。在某些实施方案中,增加的监测可在大于针对不指示增加的监测的相当的健康个体所建议的乳腺癌筛选频率的约1.5至5倍下执行,例如约1.5至2倍的正常频率、约2至3倍的正常频率、约3至4倍的正常频率、或约4至5倍的正常频率下执行。在某些情况下,增加的监测要求每三年一次、每两年一次、每年一次、每半年一次、每年三次、或每季度一次的评估。
在一些情况下,监测可在已知患有乳腺瘤的受试者上执行,例如以便评估受试者的乳腺瘤的恶性,例如以确定受试者是否患有转移性乳腺癌。增加的监测可如上所述在具有发展转移性乳腺癌的增加风险的受试者中执行。在一些情况下,受试者的乳腺瘤的恶性的监测可在受试者中识别和/或检测到乳腺瘤并且持续一段时间之后开始,所述一段时间的范围是6个月或更多,包括但不限于例如6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年等和/或无限期。具体受试者的恶性监测评估的频率将根据存在于受试者中的具体的乳腺瘤而变化,包括但不限于例如每三年一次、每两年一次、每年一次、每半年一次、每年三次、或每季度一次等。
在一些情况下,如本文所述的评估包括对乳腺瘤的存在评估和对检测到的乳腺瘤的恶性的评估两者。例如,从由受试者获得的单个细胞样品获得的数据可根据如本文所述的方法进行评价,并且根据所述评价,可进行评估以确定受试者是否患有乳腺瘤并且如果患有乳腺瘤,乳腺瘤是否是转移性的。在其他情况下,指示乳腺瘤存在的从第一患者样品进行的乳腺瘤评估可指示需要从受试者获得一个或多个额外的样品以用于额外的测试,例如恶性测试、确认测试等。
在一些情况下,如本文所述的评估可包括使用针对乳腺癌的已知的基于载玻片的细胞学分级***进行比较或对比,所述分级***包括但不限于例如Fisher分级***、Mouriquand分级***、Robinson分级***、Howell分级***、Khan分级***、Taniguchi分级***等。此类分级***通常利用巴氏(Pap)染色FNA涂片并且利用细胞特性、细胞核特征,并且已经描述于例如Saha等人(2013)J.Cytol.30(2):87-93中,所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。在一些情况下,如本文所述的评估可包括使用针对乳腺癌的已知的基于载玻片的组织学分级***进行比较或对比,所述分级***包括但不限于例如Scarff-Bloom-Richardson***、诺丁汉组织学分级(NHG)等。
在一些情况下,所述方法还包括如果所述方法产生对受试者中中乳腺瘤的评估(例如,判断或鉴定(诸如呈预测的形式))或对受试者中转移性乳腺癌的评估,则执行对受试者的进一步分析。例如,在本发明的方法产生对受试者中乳腺瘤或受试者中转移性乳腺癌的评估的情况下,所述方法然后还可包括向受试者提供采取进一步的动作的建议,所述进一步的动作例如呈进一步的诊断过程的形式,诸如活组织检查或进一步的活组织检查。在一些情况下,所述方法包括采取进一步的诊断动作。进一步的诊断动作可包括但不限于如本文所述的核芯活组织检查或手术活组织检查。如果活组织检查指示受试者中可能存在癌症或癌变前病变或转移性乳腺癌,则可采取进一步的诊断和治疗过程,诸如乳腺部分切除术或乳腺整体切除术,在所述切除术中去除部分乳腺或整个乳腺,并且可进行或可不进行进一步的病理学检查。
在一些实施方案中,提供对乳腺癌(在一些情况下是转移性乳腺癌)的乳腺瘤评估(例如呈判断或鉴定所述乳腺癌的存在的形式)和在一些情况下对所述乳腺癌的诊断、确定患有乳腺癌的受试者的疗法、监控患有乳腺癌的受试者等包括生成书面报告,所述书面报告包括技术人员对受试者的当前健康状态的评估(即,“诊断评估”)、对受试者的预后的评估(即,“预后评估”)、对可能的治疗方式的评估(即,“治疗评估”)和/或对疗法反应性的评估(即,“预后评估”)。因此,主题方法还可包括生成或输出提供诊断评估、预后评估、治疗评估、或监控评估、以及其组合的结果的报告的步骤,所述报告可呈电子介质(例如,计算机监控器上的电子显示)的形式或呈有形介质(例如,打印在纸或其他有形介质上的报告)的形式提供。
在一些情况下,如本文所述的评估作为治疗方式的一部分执行,例如以评估治疗的有效性或确定治疗的最佳时间或确定是否需要对治疗进行调控。例如,在一些情况下,可采集治疗前样品并且根据本文所述的方法进行评估,并且根据所述评估,选择治疗方案。在其他情况下,采集治疗后样品并且根据本文所述的评估与治疗前样品进行比较以便评价治疗有效性。在其他情况下,执行一个或多个治疗后评估以最佳地确定进一步疗法的时间。例如,如本文所述的评估可作为(例如,之前、期间和/或之后)的新辅助疗法的一部分来执行,其中执行新辅助疗法以便减少初级治疗之前的肿瘤。在一个实施方案中,执行手术并且在手术之后执行一个或多个评估以确定进一步的疗法(例如,化疗、放射疗法、激素疗法、额外的手术等)的疗程。
在一些情况下,对细胞乳腺样品的评估在将样品导入到细胞仪中之后的短时间段内进行。因此,可在6小时或更少的时间段内向用户提供结果,所述时间段诸如3小时或更少,例如2小时或更少,包括1小时或更少,任选地包括通过细胞仪处理样品或样品的足够部分以进行评估所需要的时间的最小值,包括但不限于例如5min、10min、20min、以及30min。在需要的情况下,总体测定时间(其范围是从受试者获得样品到将结果递送给受试者)是6小时或更少,诸如5小时或更少,例如4小时或更少,包括3小时或更少,例如2小时或更少,任选地包括物理地采集样品并且处理样品或样品的足够部分所需要的时间的最小值,包括但不限于例如30min、45min、以及1小时。
试剂盒
在又一方面,本发明提供用于实践例如如上所述的主题方法的试剂盒。主题试剂盒可包括可用于实践如上所述的方法的以上所述的试剂、装置、或***的任何组合,包括但不限于例如所述的特异性结合剂或标签中的一种或多种。主题试剂盒还可包括一种或多种样品制备试剂,包括但不限于例如细胞固定剂、细胞透化试剂、细胞标记试剂、缓冲液、稀释剂等。以上组分可存在于单独的容器中,或者一种或多种组分可组合到单个容器(例如,玻璃或塑料小瓶)中。
试剂盒还可包括样品获得装置,例如针吸活组织检查装置、核芯活组织检查装置、钻取活检组织检查装置、手术活组织检查装置、真空辅助活组织检查装置等。在一些情况下,试剂盒还可包括用于细胞解离的一种或多种试剂和/或装置,包括但不限于例如酶、酶抑制剂、清洁剂、细胞解离介质或缓冲液、涡旋装置、章动装置(nutatingdevice)、摇摆装置等。主题试剂盒还可包括对照试剂和样品,包括但不限于例如对照细胞样品(例如,阳性对照细胞样品、阴性对照细胞样品等)、校准试剂(例如,荧光珠、标记前细胞等)。
除以上部件之外,主题试剂盒还可包括用于实践主题方法的指令。这些指令可以各种形式存在于主题试剂盒中,所述形式中的一种或多种可存在于所述试剂盒中。这些指令可存在的一种形式如在合适的介质或基片(例如,在其上打印信息的一张纸或多张纸)上打印的信息、在试剂盒的包装中、在包装插页中等。又一手段是计算机可读介质,例如在其上记录有信息的磁盘、CD、可移动驱动器(例如,闪存装置)等。可存在的又一手段是网站地址,其可通过互联网用以在移送位点处存取信息。任何便利的手段均可存在于试剂盒中。
***
本发明的各方面包括用于实践主题方法的***。感兴趣的***包括被配置来针对例如如上所述的样品数据和细胞数据两者测定流体样品的流式细胞仪。感兴趣的流式细胞仪***包括例如可从商业供应商获得的那些,所述商业供应商包括但不限于例如Becton-Dickenson(Franklin Lakes,NJ)、Life Technologies(Grand Island,NY)、AceaBiosciences(San Diego,CA)、Beckman-Coulter公司(Indianapolis,IN)、Bio-RadLaboratories公司(Hercules,CA)、Cytonome公司(Boston,MA)、Amnis公司(Seattle,WA)、EMD Millipore(Billerica,MA)、Sony Biotechnology公司(San Jose,CA)、Stratedigm公司(San Jose,CA)、Union Biometrica公司(Holliston,MA)、Cytek Development(Fremont,CA)、Propel Labs公司(Fort Collins,CO)、Orflow Technologies(Ketchum,ID)、handyem公司(Québec,Canada)、Sysmex公司(Kobe,Japan)、Partec Japan公司(Tsuchiura,Japan)、Bay bioscience(Kobe,Japan)、Furukawa Electric有限公司(Tokyo,Japan)、On-chipBiotechnologies有限公司(Tokyo,Japan)、Apogee Flow Systems有限公司(Hertfordshire,United Kingdom)等。
在一些情况下,流式细胞仪包括:流动通道;至少第一光源,其被配置来将光导向到流动通道的测定区(其中在一些情况下,细胞仪包括两个或更多个光源);一个或多个检测器,其被配置来接收来自流动通道的测定区的具有第一发射波长的光和来自流动通道的测定区的具有第二发射波长的光;以及电检测器,其被配置来通过检测由测定区中的样品细胞引起的电流变化来测量细胞体积。此细胞仪具有除电检测器之外的至少一个检测通道。在一些情况下,所述装置可包括多于一个检测通道,例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个等。
本发明的各方面还包括信号处理模块,其被配置来从一个或多个检测器和电检测器接收样品数据和细胞数据,以输出基于样品数据和细胞数据两者的受试者是否患有乳腺瘤或转移性乳腺癌的评估的结果。信号处理模块可作为单一装置整合到细胞仪中,或者与细胞仪分开,其中信号处理模块和细胞仪例如通过有线或无线通信协议彼此通信。
因此,本发明的各方面还包括被配置来预测例如如以上所述的受试者中的乳腺瘤或转移性乳腺癌的存在的***,例如基于计算机的***。“基于计算机的***”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置、和数据存储装置。本发明的基于计算机的***的最小硬件包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置、以及数据存储装置。本领域的技术人员可易于认识到,当前可用的基于计算机的***中的任一种适于在本发明中使用。数据存储装置可包括任何制造品,其包括如上所述的本发明的信息的录制品或可访问此制造品的存储器访问装置。
在计算机可读介质上“记录”数据、程序或其他信息是指用于使用如本领域已知的任何此类方法存储信息的过程。基于用于访问所存储的信息的方法,可选择任何便利的数据存储结构。各种数据处理器程序和格式可用于存储,例如文字处理文本文件、数据库格式等。
“处理器”提及将执行其所需要的功能的任何硬件和/或软件组合。例如,在本文中任何处理器可以是可编程数字微处理器,诸如可以电子控制器、主机、服务器或个人计算机(台式或便携式)形式获得。在处理器可编程的情况下,合适的程序可从远程位置传送到处理器,或先前保存于计算机程序产品(诸如便携式或固定式计算机可读存储介质,无论是基于磁性、光学或固态装置)中。例如,磁性介质或光盘可携带程序,并且可由在其对应站点处与每个处理器通信的合适读取器读取。
主题***的实施方案包括以下部件:(a)通信模块,其用于例如通过用户计算机促进所述***与一个或多个用户之间的信息传递,如以下所述的;以及(b)处理模块,其用于执行本发明的定量分析方法中涉及的一个或多个任务。
在某些实施方案,计算机程序产品据描述包括具有存储于其中的控制逻辑(计算机软件程序,包括程序代码)的计算机可用介质。所述控制逻辑在由计算机的处理器执行时致使处理器执行本文所述的功能。在其他实施方案中,一些功能主要被实施于使用例如硬件状态机器的硬件中。由硬件状态机器实施以便执行本文所述的功能可使用任何便利的方法和技术实现。
除例如如上所述的传感器装置和信号处理模块之外,本发明的***还可包括多种额外的部件,诸如数据输出装置(例如,监控器和/或扬声器)、数据输入装置(例如,接口端口、键盘等)、流体处理部件、电源等。
在一些情况下,所述***还可包括其反应混合物衍生物(例如,从其产生的洗涤的细胞),其中反应混合物例如通过组合样品、一种或多种可检测特异性结合剂和任选的额外的标签来如上所述进行制备。
实用性
如本文所述的对细胞乳腺样品的评估在各种应用中得到使用。此类评估可用于获取可用于进行有关样品和/或样品细胞的确定的样品数据和/或细胞数据。可根据本文所述的方法评估的样品以上已详细描述并且通常包括实验室研究样品(例如,针对非临床研究用途所描述的那些)、临床研究样品、患者样品、诊断样品、预后样品、治疗样品等。所述的样品评价的组合数据可用于将样品彼此进行比较,例如,如可用于将两个研究样品(例如,使用两种不同的实验药剂进行处理的两个研究样品)进行比较、将实验样品与对照进行比较(例如,将处理样品与未处理对照进行比较)以及可用于将样品与参考(例如,对照参考或参考值,诸如健康或癌样品或健康或癌水平)进行比较。
如上所述,基于所采集的数据的评估在检测肿瘤性细胞和在对受试者是否具有肿瘤性病变进行评估和/或预测检测到的病变的恶性方面得到使用。在不受理论约束的情况下,如本文所述的基于组合的样品数据和细胞数据的各种因素的评估利用乳腺癌的多模型发展原因以来帮助癌症检测和/或转移性疾病的识别。
本文所述的评估在针对疾病筛选受试者方面得到使用,作为怀疑的健康个体中的第一线检测和/或作为针对具有发展肿瘤性疾病或转移性疾病的增加风险的那些个体的监测机制。所述评估可独立地执行或与常规的例行筛选和活组织检查组合,从而加快检测速率、降低假阴性和假阳性评估的比率、并且大体上提高与乳腺癌检测、监控和治疗相关的护理标准。
除以上所述的患者评估之外,所述评估还在评价从乳腺癌发展和治疗的实验室、临床前和临床模型获得的样品数据的研究设置方面得到使用。例如,由于所述方法的细胞性质,异种移植物(例如,人类衍生的异种移植物)可直接从宿主动物测定并且根据本文所述的方法进行评价,例如作为在具有直接临床相关性的此类模型中研究乳腺癌发展的方法。此类异种移植物和/或癌症的其他动物模型(包括但不限于乳腺癌)也可在实验治疗方式或药剂下进行研究,所述实验治疗方式或药剂利用本文所述的评估作为测定此类治疗方式或药剂的有效性的方法。此外,鉴于本文所述的细胞评估的非主观性和公正的方式,所述方法还在与临床研究的组合方面得到使用,例如在针对治疗有效性评价处理前和处理后样品和/或通过在临床试验的过程中的一个或多个评估在测试期间监控治疗有效性方面得到使用。
以上所述用途绝不应认为具有限制性,因为本文所述的方法和***可具有本文未描述的额外的实用性。
计算机相关实施方案
本发明的各方面还包括各种计算机相关实施方案。具体地,可使用计算机执行前述部分所述的数据分析方法。因此,本发明提供一种用于分析使用以上方法产生的数据以便进行乳腺瘤评估或转移性乳腺瘤评估的基于计算机的***。
在某些实施方案中,所述方法被以“程序”的形式编码到物理计算机可读介质上,其中如本文所用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和/或数据以用于实行和/或处理的任何存储或传输介质。存储介质的实例包括:软盘、磁带、CD-ROM、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘、或计算机可读卡诸如PCMCIA卡等,无论此类装置在计算机内部还是外部。可将含有信息的文件“存储”在计算机可读介质上,其中“存储”意指记录信息使得可由计算机在稍后日期访问和检索。感兴趣的介质是非暂时介质,即物理介质,在所述物理介质中程序与物理结构相关联,诸如被记录到物理结构上。非暂时介质不包括通过无线协议传输的电子信号。
关于计算机可读介质,“永久性存储器”是指永久的存储器。永久性存储器不在结束向计算机或处理器供应电力时被擦除。计算机硬盘驱动器、CD-ROM、软盘和DVD全部是永久性存储器的实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性存储器的实例。永久性存储器中的文件可以是可编辑和可重写的。
实验
提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和描述,并且并非意图限制本发明人看待其发明的范围,也非意图表示以下实验是执行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如用量、温度等)的准确性,但也应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出,否则份数是重量份,分子量是重均分子量,温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。
分子和细胞生物化学中的一般方法可在标准教科书中找到,诸如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编,John Wiley&Sons1999);Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996);Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等人编,Academic Press 1999);Viral Vectors(Kaplift&Loewy编,Academic Press 1995);Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编,Academic Press1997);以及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998),所述标准教科书的公开内容以引用的方式并入本文。本公开中提及的试剂和装置可从商业销售商获得,所述商业销售商诸如Abcam、Biolengend、Life Technologies、Sigma-Aldrich、CST、Biosearch、Sony Biotechnology等。
实施例1
校准
在执行流式细胞计数测定之前,校准流式细胞仪(SonyBiotechnology EC800规格),使得:(1)对齐检查珠在所有采集的参数中实现小于2.5%的HPCV(半峰CV),(2)8个峰彩虹珠展示FL1、FL2、FL3、FL4和FL5中的8个不同的峰,并且(3)6个峰珠展示FL3和FL4中的6个不同的峰。
材料
在实施例1中利用以下抗体和探针:
除以上之外,也在实施例1中利用以下非限制性列表的试剂和设备:1X PBS+2%BSA;1X PBS+2%FBS/FCS;微离心管;一次性12x 75mm锥形管(聚丙烯);自动移液器或等效的吸移管(2-20μL、20-200μL、200-1000μL范围);涡旋混合器;离心机;真空抽吸器;43℃±1℃水浴。
样品制备
通过在中等设置下轻轻涡旋1-2秒来混合流体样品,或者通过用手指弹动管来混合流体样品。观察细胞以确保细胞团解离。对细胞过度涡旋或粗暴处理将导致过量的碎片并影响结果。
组织抽吸和固定
使用弗伦奇技术采集细针抽吸(FNA)样品。简而言之,弗伦奇技术涉及端部开口针,没有连带的吸入负压。在病变内进行的短的快速冲击导致细胞移位并且通过毛细管作用实现针内的有效采集。可附接柱塞移除的注射器以用于采集过量的流体。无论使用何种附接,装置的端部必须向大气打开以实现样本的正确采集;此开口在所述过程期间一定不能被指尖覆盖,在单独使用针的情况下尤其如此。
根据此采样技术抽吸乳腺肿瘤块。对乳腺肿瘤进行采样一次,并且然后在回收样品之后,将抽吸物直接注射到含有1mL IncellFP的小瓶中。
mRNA杂交
在到达IncellDx之后,在2mL试剂1中固定细胞。在细胞计数器上执行细胞计数以确定细胞密度和对于400,000个细胞需要移取的体积。向3个12x75mm管等分400,000个细胞。在1mL试剂2(杂交前缓冲液1)中洗涤细胞,轻轻地手动混合,并且在室温下在600x g下离心5分钟。抽吸上清液,保证细胞团不被破坏;在管的相反侧上执行抽吸。添加1mL试剂3(杂交前缓冲液2),轻轻地手动混合细胞,并且在室温下在600x g下离心5分钟。如前述抽吸上清液。
通过向管1混合适当体积的试剂4(杂交缓冲液)(101.5μL/样品)和1.5μL的HER2mRNA探针并且向管2混合所述适当体积的试剂4和1.5μL的MTDH mRNA探针来制备杂交混合物。向每个样品管添加103μL。轻轻地手动混合细胞。在预加热的43±1℃水浴中孵育30分钟来实现反应。
细胞严格洗涤
向每个样品管添加1mL预热的试剂6(严格洗涤缓冲液1),并且轻轻地手动混合细胞。将细胞在室温下在600x g下离心5分钟。如上抽吸上清液。向每个样品管添加1mL预热的试剂7(严格洗涤缓冲液2),并且轻轻地手动混合细胞。在43℃水浴中孵育15分钟来实现反应。将细胞在室温下在600x g下离心5分钟。如上抽吸上清液。
一抗杂交管1&2
添加1mL 1X PBS+2%BSA。将细胞在室温下在600x g下离心5分钟。如上抽吸上清液。如下制备E-钙粘着蛋白、ER和PR一抗的100μL工作稀释液:
管1:90μL PBS+2%BSA中的5μL ER和5μL PR。
管2:99μL PBS+2%BSA中的1μL E-钙粘着蛋白。
向管2添加100μL E-钙粘着蛋白抗体稀释液,并且向管1添加100μL ER&PR抗体稀释液。使管在黑暗中在室温下孵育30分钟。用1mL 1X PBS+2%FBS洗涤细胞。在室温下将管保持静置5分钟。将管在室温下在400x g下离心5分钟。如上抽吸上清液。重复一次洗涤、离心和抽吸步骤。
二抗杂交
制备以下100μL工作稀释液:
管1:5μL HER2PE、5μL CD45、1μL抗兔647、89PBS+2%BSA
管2:5μL CD44、5μL CD45、1μL抗兔647、89μL PBS+2%BSA
管3:2μL裂解的半胱天冬酶3、2μL H2A.X、2μL波形蛋白、5μL CD45、89μL PBS+2%BSA
向适当的管添加100μL抗体稀释液。将管在黑暗中在室温下孵育30分钟。用1mL 1XPBS+2%FBS洗涤细胞。在室温下将管保持静置5分钟。将管在室温下在400x g下离心5分钟。如上抽吸上清液。重复一次洗涤、离心和抽吸步骤。
DAPI杂交
根据以下图表制备DAPI DNA染料在1X PBS中的稀释液的5mL等分式样:
所需浓度 | DAPI体积 | PBS体积 |
1μg/mL | 5μL | 4995μL |
向每个样品管添加200μL的稀释DAPI,并且轻轻地手动混合细胞。将细胞在黑暗中在室温下孵育30分钟,之后样品准备用于在配备有3个三激光***的流式细胞仪上进行细胞计数分析。
样品分析
按照初始乳腺采集方案,在EC800流式细胞仪(SonyBiotechnology公司,SanJose,CA)上采集样品,在30,000个总事件时停止。
以管1(ER/PR/Her2/HER2/DAPI/CD45)开始,建立单一细胞门Q并且施加SSC/CD45。调整增益,直至WBC区域处于如图1所描绘的通道200中为止,并且一旦建立,就通过首先将FL1补偿应用到所有其他参数中、并且使用FL2、FL3、FL4和FL5继续进行来创建补偿矩阵。完成的补偿矩阵与图2类似。
一旦完成补偿,就应用选通以生成关于靶细胞群体的统计(图3)。当选通时,ER+的肿瘤群体在背景水平以外,并且这是记录了ER平均荧光强度(MFI)、Her2MFI和HER2mRNAMFI的群体。CD45+%取作EIL(上皮浸润性白细胞)的三个管的平均值。如果文件具有30,000个事件,则输出FCS文件以针对DNA指数(DI)和S期%在ModFitLT中进行分析。记录细胞周期区域百分比。
在未生成30,000个事件的情况下,将Y(肿瘤)的MFI除以WBC(X)的MFI以计算肿瘤DI(参见图4)。将G1后%记录为三个管的平均值。来自将此手动技术与ModFitLT进行比较的临床性能研究的数据显示DI的100%一致性,并且G1后始终高于S期,如所预测的。
使用管2(E-钙粘着蛋白/CD44/MTDH mRNA/CD45/DAPI)继续进行,再次使用WBC来设定背景水平,并且使用管2重复管1的分析方式。
记录肿瘤群体的MFI和阳性%。WBC用于确定CD44是阳性的位置(WBC>90%)(参见图5)。描绘出这些分离群体外形的能力显示转移性建模中的统计学趋势。
将两个管的总读数添加到II期乳腺数据库,其中元数据与由样品ID连接的细胞复用数据进行网格划分。
总体测定规范
为了确保纵向性能,将所获得的每3个月的研究乳腺细胞样品结果与含有使用所有的抗体、mRNA探针和DAPI染色的WBC、MCF-7和SK-BR-3的FNA模拟图进行比较。
针对以下规范测定样品:ER信号和Her 2mRNA信号在相反方向上分离,CD44信号和MTDH mRNA在相反方向上分离,WBC和肿瘤混合DNA指数是清楚地可分辨的(参见图6)。
统计学分析
细胞复用TM创建一系列变量(如上所述的细胞计数读数),使用Excel电子表格中的元数据进行连接。由2位不同的科学家分析原始.cdf文件(细胞计数数据文件),之后将数据输入到电子表格中。一旦达成一致并且针对误差进行检查,就移植.csv文件以用于额外的分析。
在R(R Core Team(2014)R:A Language and Environment for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.R-project.org)中分析乳腺癌项目的数据。首先,计算健康组和非健康组两者的每个变量的最小值、第一四分位数、中值、平均值、第三四分位数以及最大值,并且创建用于比较两个组的框图。第二,使用非参数Mann-Whitney-Wilcoxon分析来确定在不假设健康组和非健康组两者的每个变量遵循正态分布的情况下,所述变量的群体分布是否相同。一旦建立差异,就使用基于树的模型和随机树林来创建分类和回归。最后,将线性回归模型应用到数据以将健康组与非健康组分离。
整个两个管组在每个事件上创建总计19个变量;这样大的数量将总体样品大小减小至32个肿瘤事件和6个正常事件。完全模型包含以下变量:总细胞计数、单一细胞计数、上皮细胞计数、G1..上皮平均值、X..选通..G1、X..CD45.EIL、X.ER.PR..WBC、X.Her2.mRNA..上皮、X.HER2.蛋白..上皮、X..CD44.上皮、X...E钙粘着蛋白..CD44...上皮、MCV.上皮、细胞计数器计数以及iCyt.计数。以下提供变量的系数:
变量 | 系数 |
(截距) | 1.677413e+01 |
总细胞计数 | 1.674432e-06 |
单一细胞计数 | 1.015261e-04 |
上皮细胞计数 | 1.122740e-04 |
G1..上皮平均值 | 1.890142e-02 |
X..选通..G1 | 1.499511e-01 |
X..CD45.EIL | 2.030679e-02 |
X.ER.PR..WBC | -4.266666e-03 |
X.Her2.mRNA..上皮 | -1.296829e-05 |
X.HER2.蛋白..上皮 | 1.088247e-03 |
X..CD44.上皮 | 2.834147e-02 |
E钙粘着蛋白..CD44...上皮 | -3.149327e-03 |
MCV.上皮 | 1.650797e-03 |
细胞计数器计数 | 3.486292e-07 |
iCyt.计数 | 2.258215e-06 |
然后基于得到的结果的p值、接着使用前进和后退步骤减少变量数量来找到降阶模型。因此,最终模型含有5个变量:G1..上皮平均值、X..选通..G1、X.ER.PR..WBC、MCV.上皮以及iCyt.计数。以下提供降阶模型的最终系数:
关于样品从其得到的受试者的此统计学分析的视觉表示提供在图7中。在统计学上,以上列出的5个变量将“肿瘤”细胞与“健康”细胞分离,因为它们是不相同的。
关于这些变量测量的对象和它们与癌症的关系在以下进行讨论。G1上皮平均值将肿瘤上皮的DNA含量与健康细胞的DNA含量进行比较(相关图形描述参见图4)。这反映基因组完整性的差异,并且在不受理论约束的情况下,可指示DNA条带***到癌性细胞中/DNA条带缺失。选通的G1是指处于细胞周期的G1的细胞的%。根据统计学分析,清楚的是,当进行肿瘤相对于正常的比较时,细胞周期的静息组分和增殖性组分不同。ER/PR WBC表示白细胞浸润的标记物的背景水平。此统计学差异是意外的统计学发现。MCV上皮是指个体细胞的平均红细胞体积(库尔特体积)。此统计学差异表示肿瘤细胞相对于正常细胞的形态学差异的数字特征。在开始此研究的一系列实验中,在非固定和固定状态中确认癌细胞(SK-BR-3和MCF-7)相对于正常人类乳腺细胞(HMEC)的“真实”大小差异。在这些相同的研究中,确认了固定在IncellFPTM中的细胞维持90%的非固定MCV。最后一个变量是iCyt计数,它是在300ul流体中穿过流动池的细胞的数量。此统计学差异表示肿瘤空间的FNA含有的细胞多于正常导管含有的细胞。
转移性模型遵循如上的相同过程,其由于包含MTDH(其在研究的中点处添加)和元数据中转移的清楚定义而使用较少的事件。完全模型包含以下18个变量:总细胞计数、单一细胞计数、上皮细胞计数、G1..上皮平均值、G1.WBC平均值、X..CD45.EIL、X..E钙粘着蛋白上皮、X.ER.PR..上皮、X.ER.PR..WBC、X.Her2.mRNA..上皮、X.HER2.蛋白..上皮、X.MTDH.mRNA..上皮、X..CD44.上皮、X...E钙粘着蛋白..CD44...上皮、MCV.上皮、iCyt.计数以及细胞计数器计数。基于完全模型的统计学分析的视觉表示提供在图8中。以下提供变量的系数:
Varible(变量) | 系数 |
(截距) | 2.208197e+00 |
总细胞计数 | 1.810922e-06 |
单一细胞计数 | 3.640926e-05 |
上皮细胞计数 | 5.714827e-05 |
G1..上皮平均值 | 5.756775e-03 |
G1.WBC平均值 | -1.809671e-04 |
X..CD45.EIL | -4.675704e-02 |
X..E钙粘着蛋白上皮 | -8.957555e-04 |
X.ER.PR..上皮 | 9.315181e-05 |
X.ER.PR..WBC | -2.078572e-03 |
X.Her2.mRNA..上皮 | 9.457119e-04 |
X.HER2.蛋白..上皮 | 1.547739e-03 |
X.MTDH.mRNA..上皮 | -3.113753e-04 |
X..CD44.上皮 | 2.866543e-02 |
X...E钙粘着蛋白..CD44...上皮 | 1.424379e-02 |
MCV.上皮 | -2.729672e-04 |
iCyt.计数 | 1.937675e-06 |
细胞计数器计数 | -3.300775e-06 |
基于结果的p值和前进和后退步骤方法使变量最小化来找到降阶模型,最终模型具有6个变量:HER2.蛋白..上皮、单一细胞计数、上皮细胞计数、G1..上皮平均值、G1.WBC平均值以及细胞计数器计数。基于降阶模型的统计学分析的视觉表示提供在图9中。以下提供最终模型的系数:
变量 | 系数 |
单一细胞计数 | 6.269065e-05 |
上皮细胞计数 | 1.320985e-04 |
G1..上皮平均值 | 4.083481e-03 |
G1.WBC平均值 | -6.268965e-03 |
X.HER2.蛋白..上皮 | 2.046613e-03 |
细胞计数器计数 | -3.962722e-06 |
实施例2
样品和数据采集
针对乳腺癌样品集(即,乳腺癌组织)和健康样品集(即,正常乳腺组织),通过基本上如上所述的流式细胞术采集数据。获得各种参数,包括输入来构建如下所述的分类模型的那些参数。
模型生成
使用根据乳腺癌组织和健康乳腺组织数据集所测得的参数生成分类模型。使用以下参数:总细胞计数、单一细胞计数、上皮细胞计数、MCV上皮、G1WBC平均值、G1上皮平均值、G1上皮百分比、DNA指数、G1后上皮百分比、CD45EIL百分比、(ER/PR)WBC、ER/PR上皮百分比、(ER/PR)上皮、(Her2mRNA)上皮、(HER2蛋白)上皮、MTDH mRNA、CD44+E-钙粘着蛋白+上皮百分比、E-钙粘着蛋白+CD44–上皮百分比、(E-钙粘着蛋白-CD44+百分比)上皮、波形蛋白上皮百分比、半胱天冬酶3上皮百分比、以及p H2A.X上皮百分比。
用于生成并评估多参数模型的一般方案提供在呈现在图12中的流程图中。简而言之,将非癌性(100)和癌性(101)样品的训练数据集输入到一般线性回归模型(102)中。在此实施例中,将以上参数的数据输入到以下一般线性回归模型中:
线性回归生成包含限定的参数集的多参数模型(103)(多参数模型)。将所述模型应用到包含健康(非癌性)和癌性样品两者的样品的测试集(104)。将多参数模型用于测试集的样品分类(105)以将样品识别为非癌性(106)或癌性(107)。比较基于多参数模型的样品分类(108),并且将所述比较用于分类评估(109)以确定生成的多参数模型的敏感性和特异性。提供了实施例,所述模型产生以95%敏感性和95%特异性分类癌样品相对于非癌样品的分类模型。使用此模型的乳腺癌和正常乳腺组织样品的样品分类的图形表示呈现在图10中。作为对照,也在正常样品之间执行使用所述模型的比较,例如,如图11所描绘的。
此实施例展示根据以上列出的个体测得的参数构建分类多参数模型的能力。这些结果展示此模型可用于以高特异性和敏感性成功地分类乳腺癌样品和正常组织样品。
尽管具有所附条款,但是本公开也由以下条款限定:
1.一种测定细胞乳腺样品的方法,所述方法包括:
a)以流式细胞计数法分析所述细胞乳腺样品,以获得:
i)包括样品细胞密度数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、增殖数据和细胞体积数据的上皮细胞数据;以及
iii)白细胞(WBC)数据;以及
b)评价所获得的样品数据、上皮细胞数据和WBC数据以评估所述细胞乳腺样品。
2.根据条款1所述的方法,其中所述WBC数据包括WBC的群体中至少一种乳腺癌生物标记物的水平。
3.根据条款1或2所述的方法,其中所述至少一种乳腺癌生物标记物包括***受体、孕酮受体、或其组合。
4.根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述细胞乳腺样品是细针抽吸样品。
5.根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述方法还包括固定并透化所述细胞乳腺样品的细胞。
6.根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述细胞乳腺样品的所述细胞在足以产生标记的细胞乳腺样品的条件下与标签接触。
7.根据条款6所述的方法,其中所述标签包括荧光核标签。
8.根据条款6所述的方法,其中所述标签包括选自由以下组成的组的细胞表面标记物:CD45、***受体、和孕酮受体。
9.根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述细胞与一种或多种洗涤溶液接触。
10.根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述细胞乳腺样品从受试者获得,并且所述评价包括评估所述受试者是否患有肿瘤性疾病。
11.根据条款10所述的方法,其中所述肿瘤性疾病是乳腺癌。
12.一种评估细胞乳腺样品的方法,所述方法包括:
a)以流式细胞计数法分析细胞乳腺样品:
i)包括样品细胞计数数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、上皮细胞计数数据和癌症生物标记物数据的上皮细胞数据;以及
iii)包括WBC增殖数据的白细胞(WBC)数据;以及
b)评价所获得的样品数据、上皮细胞数据和WBC数据以评估所述细胞乳腺样品。
13.根据条款12所述的方法,其中所述癌症生物标记物数据包括人类表皮细胞生长因子受体2(HER2)表达数据。
14.根据条款13所述的方法,其中所述HER2表达数据包括HER2蛋白表达数据。
15.根据条款12至14中任一项所述的方法,其中所述细胞乳腺样品是细针抽吸样品。
16.根据条款12至15中任一项所述的方法,其中所述方法还包括固定并透化所述细胞乳腺样品的细胞。
17.根据条款12至16中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述细胞乳腺样品的所述细胞在足以产生标记的细胞乳腺样品的条件下与标签接触。
18.根据条款17所述的方法,其中所述标签包括荧光核标签。
19.根据条款17所述的方法,其中所述标签包括选自由以下组成的组的细胞表面标记物:CD45、***受体、孕酮受体、以及HER2。
20.根据条款12至19中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使所述细胞与一种或多种洗涤溶液接触。
21.根据条款12至20中任一项所述的方法,其中所述细胞乳腺样品从受试者获得,并且所述评价包括评估所述受试者是否患有肿瘤性疾病。
22.根据条款21所述的方法,其中所述肿瘤性疾病是转移性乳腺癌。
23.一种试剂盒,其包括:
a)荧光核标签;以及
b)一种或多种可检测地标记的细胞表面标记物结合成员,其中所述细胞表面标记物选自由以下组成的组:CD45、***受体、孕酮受体、HER2、以及其组合。
24.根据条款23所述的试剂盒,其还包括固定溶液。
25.根据条款23或24所述的试剂盒,其还包括一种或多种洗涤溶液或标记缓冲液。
26.根据条款23至25中任一项所述的试剂盒,其还包括被配置来从受试者获得细胞乳腺样品的样品采集装置。
27.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由存在于所述测定区中的标记的流体细胞乳腺样品中的第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
电子检测器,其被配置来通过检测由所述测定区中的所述细胞乳腺样品的细胞引起的电流变化来测量细胞体积;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器和所述电子检测器接收信号并且输出乳腺癌细胞是否存在于所述样品中的结果。
28.根据条款27所述的流式细胞术***,其中具有所述第一发射波长的所述光和具有所述第二发射波长的所述光被两个单独的荧光检测器接收。
29.根据条款27或28所述的流式细胞术***,其中所述流动池还包括标记的流体细胞乳腺样品,其包含荧光核标签和第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员。
30.根据条款27至29中任一项所述的流式细胞术***,其中所述细胞表面标记物选自由以下组成的组:CD45、***受体、和孕酮受体。
31.根据条款27至30中任一项所述的流式细胞术***,其中所述一个或多个荧光检测器被配置来接收由存在于所述测定区中的所述样品中的第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第三发射波长的光。
32.根据条款31所述的流式细胞术***,其中具有所述第一发射波长的所述光、具有所述第二发射波长的所述光和具有所述第三发射波长的所述光被至少两个单独的荧光检测器接收。
33.根据条款32所述的流式细胞术***,其中具有所述第一发射波长的所述光、具有所述第二发射波长的所述光和具有所述第三发射波长的所述光被三个单独的荧光检测器接收。
34.根据条款31至33中任一项所述的流式细胞术***,其中所述流动池还包括标记的流体细胞乳腺样品,其包含荧光核标签、第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员和第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员。
35.根据条款31至34中任一项所述的流式细胞术***,其中所述细胞表面标记物选自由以下组成的组:CD45、***受体、和孕酮受体。
36.根据条款27至35中任一项所述的流式细胞术***,其中所述***被配置来从所述结果获得针对从其获得所述样品的受试者的乳腺癌评估。
37.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光、由第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光以及由存在于所述测定区中的乳腺细胞的标记的流体样品中的第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第三发射波长的光;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器接收信号并且输出转移性乳腺癌细胞是否存在于所述样品中的结果。
38.根据条款37所述的流式细胞术***,其中具有所述第一发射波长的所述光、具有所述第二发射波长的所述光和具有所述第三发射波长的所述光被至少两个单独的荧光检测器接收。
39.根据条款38所述的流式细胞术***,其中具有所述第一发射波长的所述光、具有所述第二发射波长的所述光和具有所述第三发射波长的所述光被三个单独的荧光检测器接收。
40.根据条款37至39中任一项所述的流式细胞术***,其中所述流动池还包括标记的流体细胞乳腺样品,其包含荧光核标签、第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员和第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员。
41.根据条款37至40中任一项所述的流式细胞术***,其中所述细胞表面标记物选自由以下组成的组:CD45、***受体、孕酮受体以及HER2。
42.根据条款37至41中任一项所述的流式细胞术***,其中所述***被配置来从所述结果获得针对从其获得所述样品的受试者的转移性乳腺癌评估。
43.一种计算机可读介质,其包括用于由计算机执行的程序,所述程序包括:
a)用于分析由以下产生的信号以产生数据的指令:
i)一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由结合到标记的流体细胞乳腺样品的细胞的荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由结合到所述样品的细胞的可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
ii)电子检测器,其被配置来通过检测电流变化来测量所述样品的细胞的
细胞体积;
b)用于在计算机可读介质上存储所述数据的指令;以及
c)用于输出所述数据的指令。
44.根据条款43所述的计算机可读介质,其中所述程序还包括用于从所述数据获得针对从其获得所述样品的受试者的乳腺癌评估的指令。
45.一种计算机可读介质,其包括用于由计算机执行的程序,所述程序包括:
a)用于分析由一个或多个荧光检测器产生的信号以产生数据的指令,所述一个或多个荧光检测器被配置来接收由结合到标记的流体细胞乳腺样品的细胞的荧光核标签发射的具有第一发射波长的光、由结合到所述样品的细胞的第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光以及由结合到所述样品的细胞的第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第三发射波长的光;
b)用于在计算机可读介质上存储所述数据的指令;以及
c)用于输出所述数据的指令。
46.根据条款45所述的计算机可读介质,其中所述程序还包括用于从所述数据获得针对从其获得所述样品的受试者的转移性乳腺癌评估的指令。
虽然为了清楚理解的目的,已经通过说明和实施例较详细地描述了上述发明,但是对于本领域的普通技术人员易于显而易见的是,根据本发明的教义,可对其进行某些改变和修改而不脱离所附权利要求书的精神或范围。
前述内容仅说明本发明的原理。应了解,本领域的技术人员将能够设想各种布置,虽然这些布置未在本文中明确地描述或示出,但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外,本文所叙述的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想,并且应解释为不对此类具体叙述的实施例和条件构成限制。此外,本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。另外,希望此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发的等效物,即不管结构如何,所开发的执行相同功能的任何元件。因此,本发明的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反,本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
Claims (6)
1.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由存在于所述测定区中的标记的流体细胞乳腺样品中的第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
电子检测器,其被配置来通过检测由所述测定区中的所述细胞乳腺样品的细胞引起的电流变化来测量细胞体积;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器和所述电子检测器接收信号并且输出细胞样品的流式细胞计数分析的结果;以及
所述结果包括:
i)包括样品细胞密度数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、增殖数据和细胞体积数据的上皮细胞数据;以及
iii)白细胞(WBC)数据,包括以下数据中的一项或两项:乳腺癌生物标记物数据和WBC数据的样品百分比,
评价模块,评价所获得的样品数据来评估所述细胞乳腺样品:
i)与所述样品细胞密度数据的样品数据进行比较的参考值是每体积分析样品50,000个或更多细胞;
ii)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
iii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;
iv)与所述细胞体积数据进行比较的参考值大于或等于对照细胞体积的1.50倍;以及
v)与所述乳腺癌生物标志物数据进行比较的参考值低于或等于存在于对照的WBC中的乳腺癌生物标志物水平的0.95倍的生物标志物水平;或
vi)它们的组合。
2.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光、由第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光以及由存在于所述测定区中的乳腺细胞的标记的流体样品中的第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第三发射波长的光;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器接收信号并且输出细胞样品的流式细胞计数分析的结果;以及
所述结果包括:
i)包括样品细胞密度数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、增殖数据和细胞体积数据的上皮细胞数据;以及
iii)白细胞(WBC)数据,包括以下数据中的一项或两项:乳腺癌生物标记物数据和WBC数据的样品百分比,
评价模块,评价所获得的样品数据来评估细胞乳腺样品:
i)与所述样品细胞密度数据的样品数据进行比较的参考值是每体积分析样品50,000个或更多细胞;
ii)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
iii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;
iv)与所述细胞体积数据进行比较的参考值大于或等于对照细胞体积的1.50倍;以及
v)与所述乳腺癌生物标志物数据进行比较的参考值低于或等于存在于对照的WBC中的乳腺癌生物标志物水平的0.95倍的生物标志物水平;或
vi)它们的组合。
3.一种计算机可读介质,其包括用于由计算机执行的程序,所述程序包括:
a)用于分析由以下产生的信号以产生数据的指令:
i)一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由结合到标记的流体细胞乳腺样品的细胞的荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由结合到所述样品的细胞的可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
ii)电子检测器,其被配置来通过检测电流变化来测量所述样品的细胞的细胞体积;
b)用于在计算机可读介质上存储所述数据的指令;
c)用于输出所述数据的指令;以及
输出的所述数据包括:
i)包括样品细胞密度数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、增殖数据和细胞体积数据的上皮细胞数据;以及
iii)白细胞(WBC)数据,包括以下数据中的一项或两项:乳腺癌生物标记物数据和WBC数据的样品百分比,
d)评价所获得的样品数据来评估所述细胞乳腺样品的指令:
i)与所述样品细胞密度数据的样品数据进行比较的参考值是每体积分析样品50,000个或更多细胞;
ii)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
iii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;
iv)与所述细胞体积数据进行比较的参考值大于或等于对照细胞体积的1.50倍;以及
v)与所述乳腺癌生物标志物数据进行比较的参考值低于或等于存在于对照的WBC中的乳腺癌生物标志物水平的0.95倍的生物标志物水平;或
vi)它们的组合。
4.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由存在于所述测定区中的标记的流体细胞乳腺样品中的第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
电子检测器,其被配置来通过检测由所述测定区中的所述细胞乳腺样品的细胞引起的电流变化来测量细胞体积;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器和所述电子检测器接收信号并且输出细胞样品的流式细胞计数分析的结果;以及
所述结果包括:
i)包括样品细胞计数数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、上皮细胞计数数据和癌症生物标记物数据的上皮细胞数据;以及
iii)包括WBC增殖数据的白细胞(WBC)数据,
评价模块,评价所获得的样品数据来评估所述细胞乳腺样品:
i)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
ii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;或
iii)它们的组合。
5.一种流式细胞术***,其包括:
流式细胞仪,其包括流动池;
光源,其被配置来将光导向到所述流动池的测定区;
一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由荧光核标签发射的具有第一发射波长的光、由第一可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光以及由存在于所述测定区中的乳腺细胞的标记的流体样品中的第二可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第三发射波长的光;
信号处理模块,其被配置来从所述一个或多个荧光检测器接收信号并且输出细胞样品的流式细胞计数分析的结果;以及
所述结果包括:
i)包括样品细胞计数数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、上皮细胞计数数据和癌症生物标记物数据的上皮细胞数据;以及
iii)包括WBC增殖数据的白细胞(WBC)数据,
评价模块,评价所获得的样品数据来评估细胞乳腺样品:
i)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
ii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;
iii)与乳腺癌生物标志物数据进行比较的参考值低于或等于存在于对照的WBC中的乳腺癌生物标志物水平的0.95倍的生物标志物水平;或
iv)它们的组合。
6.一种计算机可读介质,其包括用于由计算机执行的程序,所述程序包括:
a)用于分析由以下产生的信号以产生数据的指令:
i)一个或多个荧光检测器,其被配置来接收由结合到标记的流体细胞乳腺样品的细胞的荧光核标签发射的具有第一发射波长的光和由结合到所述样品的细胞的可检测地标记的细胞表面标记物结合成员发射的具有第二发射波长的光;
ii)电子检测器,其被配置来通过检测电流变化来测量所述样品的细胞的细胞体积;
b)用于在计算机可读介质上存储所述数据的指令;
c)用于输出所述数据的指令;以及
输出的所述数据包括:
i)包括样品细胞计数数据的样品数据;
ii)包括DNA含量数据、上皮细胞计数数据和癌症生物标记物数据的上皮细胞数据;以及
iii)包括WBC增殖数据的白细胞(WBC)数据,
d)评价所获得的样品数据来评估所述细胞乳腺样品的指令:
i)与所述DNA含量数据进行比较的参考值大于或等于对照DNA含量的1.05倍;
ii)与所述增殖数据进行比较的参考值比对照的增殖至少高出20%;
iv)与乳腺癌生物标志物数据进行比较的参考值低于或等于存在于对照的WBC中的乳腺癌生物标志物水平的0.95倍的生物标志物水平;或
v)它们的组合。
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