JP2002529475A - 細胞培養上清由来の組換えヒトエリトロポイエチンを精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的に、組換えヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）を精製する方法に関する。本発明はまた、実質的に純粋なＥＰＯに関する。本方法は、純粋なＥＰＯを得るために、示差的沈降、疎水的相互作用クロマトグラフィー、種々の濃縮およびダイアフィルトレーションの工程、縦列した陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ならびに分子排除クロマトグラフィーを包含する。本方法は、高速液体クロマトグラフィー工程を包含しない。本方法はまた、本願手順に従って得られたＥＰＯを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 示差的沈降、疎水的相互作用、陰イオン交換、陽イオン交換、および分子排除
液体クロマトグラフィーを包含する一連の縦列した別々の工程により特徴付けら
れる、組換えヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）を得るための方法。従って、こ
の方法を使用することによって得られるＥＰＯが記載される。

【０００２】 （背景情報） ＥＰＯは骨髄における赤芽球の分化を刺激する糖タンパク質であり、従って、
循環する血液の赤血球の数を増加させる。ヒトにおける赤血球の平均寿命は１２
０日であり、従って、ヒトは毎日１／１２０の赤血球を失う。この損失は、適正
なレベルの赤血球を維持するために、連続的に回復されなければならない。

【０００３】 ＥＰＯの存在は、世紀の変わり目で初めて仮定され、それは５０年代初期にＲ
ｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖによって明確に立証された。Ｃａｒｎｏｔら
、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ）１４３：３８４−６（１９０６
）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ），１４３：
４３２−５（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１
１：３４４−６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔ、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１
１１：４６３−５（１９０６）；Ｒｅｉｓｓｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、１９５０、５
：３７２−８０（１９５０）およびＥｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，８：３４９−５
７（１９５３）を参照のこと。ＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖの実験は、
他の研究者によって即座に確認された。Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ，９：２
９９−３０９（１９５４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：２５５−８（１９５４）；およびＢｏｒｓｏｏｋら、Ｂ
ｌｏｏｄ，９：７３４−４２（１９５４）を参照のこと。

【０００４】 生物におけるＥＰＯ産生部位の同定は議論の論点であった。連続的な実験によ
って、腎臓を主要な器官として、そして管周囲の間細胞を合成部位として同定し
た。Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１７９：６３３−４（１９５７）；Ｋ
ｕｒａｔｏｗｓｋａら、Ｂｌｏｏｄ，１８：５２７−３４（１９６１）；Ｆｉｓ
ｈｅｒ、Ａｃｔａ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２６：２２４−３２（１９６１）；Ｆｉ
ｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２０５：６１１−２（１９６５）；Ｆｒｅｎｋｅｌ
ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１４９１：２９２−３（１９６８）
；Ｂｕｓｕｔｔｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１３
７，１：３２７−３０（１９７１）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌ、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａ
ｔｏｌ．，（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），４７４：２３８−４２（１９７２）；
Ｅｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，４４１：７７−８５（１９７４）；Ｋａｚａｌ、Ａ
ｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，５，２：９８−１０９（１９７５）；Ｓｈ
ｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９９，２：５０４−１０（１９
７６）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ
．，２８：１０１−２２（１９８８）；Ｊｅｌｋｍａｎｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．，１１，７：５８１−８（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８０，１３：４００８−１１（１９８３
）；Ｃａｒｏら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０３，６：９２２−３１
（１９８４）；Ｃａｒｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１２：３５７（１９８
４）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７０，１：３１６−８（１９８６）；
Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，７：２７３１−３
（１９８６）；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，７
：２７３１−３（１９８６）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７１，２：５
２４−７（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７１，２：５２４−７（１
９８８）；Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，２：６２
０−３（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７４，２：６４５−５１（１
９８９）を参照のこと。

【０００５】 総ＥＰＯの１０％〜１５％の範囲のより小さな割合は、成体の肝臓により産生
される。Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１２，３：２２７
−４２（１９７９）；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１５，２：１２
１−３２（１９８０）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃ
ｉ．，１１，１：３７−４６（１９８１）；Ｄｉｎｋｅｌａａｒら、Ｅｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．，９，７：７９６−８０３（１９８１）；Ｃａｒｏら、Ａｍ．Ｊ
．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４４：５（１９８３）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０２，２：２７４−８５（１９８３）；Ｎａｕｇｈ
ｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１３，５：４３２−８（１９
８３）；Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３，６００５：８０６−１０（１
９８５）；Ｅｒｓｌｅｖら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｔｈｅｒ．，３，３−４：１５９−１６４（１９８６）を参照のこと。産生さ
れたＥＰＯは、組織の低酸素およびＥＰＯ産生細胞数の増加によって起こるその
発現の程度に正比例する。

【０００６】 ＥＰＯは、貧血、特に腎不全に由来する貧血の処置において卓越した有効性を
示した。Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１
６，２：７３−７８（１９８７）；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓ
ｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１，３：１７７−１８１（１９８３）を参照のこと。しか
し、大量に産生する方法が利用できないことに起因して、その治療的な有用性は
制限されてきた。公知の抽出システムによって得られるＥＰＯの量および質は不
充分であった。近年、組換えＤＮＡ技術の使用によって大量のタンパク質を得る
事が可能となった。これらの技術の真核生物細胞への応用は、大規模なＥＰＯの
産生を可能にした。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）、同第５
，５４７，９３３号（Ｌｉｎ）、同第５，７５６，３４９号（Ｌｉｎ）、同第４
，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、および同第４，６７７，１９５（Ｈｅｗｉｃｋ
ら）を参照のこと。

【０００７】 ＥＰＯのような糖タンパク質の分離について、いくつかの技術が現在利用可能
である。限外濾過、カラム焦点電気泳動、平床電気泳動、ゲル濾過、電気泳動お
よび等速電気泳動、ならびにいくつかの他のクロマトグラフィー方法が、糖タン
パク質の精製のために利用されている。最も広範に使用されるクロマトグラフィ
ー技術は、イオン交換クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィーであっ
た。

【０００８】 イオン交換方法は、溶液の成分を、それらの異なる正味の電荷に従って識別し
、そして異なるイオン強度またはｐＨの溶離液を用いて、ステージにおいてかま
たは連続勾配の適用を通してのいずれかで溶出することよって単離する分離技術
である。この方法は、反対の電荷を有する成分の結合または静電気的吸着を誘導
するために、正電荷または負電荷のいずれかのゲルまたは樹脂マトリクスを使用
する。脱着または溶出の間、サンプル成分は、溶出させるために使用される溶液
または緩衝液中に存在するイオン、または目的の分子の正味の電荷を変更するｐ
Ｈの変化によって交換される。

【０００９】 逆相吸着クロマトグラフィーは、サンプル成分を、それらの異なる極性に従っ
て分離する工程を包含する。サンプル成分は、非共有結合により有機ポリマーで
被覆したシリカマトリクスから構成される樹脂を通して吸着される。成分の選択
的な脱着は、溶離液を含む非極性溶媒での溶出での後で生じる。

【００１０】 上記の分離技術は、最初は、比較的小さな疎水性または親水性の分子を分離す
るために利用された。より大きな分子（例えば、タンパク質、そして特に、複合
体タンパク質（例えば、リポタンパク質、核タンパク質、および糖タンパク質）
）の精製へのこれらの適用は、より近年のことである。多数の刊行物が、タンパ
ク質分離においてこれまでに達成された技術水準を例証する。

【００１１】 Ｓｏｆｅｒｅｔら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９７）；Ｏｌｓｏｎ編、「Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１９９５）；Ｆｒａｎ
ｋｓ編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｈｕｍａｎ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９３）：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
ｒ編、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９１
）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら編、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）
；Ｈａｒｒｉａら編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９０）；Ｂｒｏｗｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９９、１−２１、１９７９；Ｈａｒｒｉｓｏｎら
、「ＶＤＹＡＣ ＴＭ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ＨＰＬＣ」、第１−２
２頁（Ｔｈｅ Ｓｅｐ／Ａ／Ｒａ／Ｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐｓ、Ｈｅｓｐｅｒｉ
ａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９８４）を参照のこと。目的のタンパク質に対し
て惹起されたモノクローナル抗体の使用は、別の公知なタンパク質回収方法であ
る。

【００１２】 組換えＥＰＯを分離するためのいくつかの特定の方法が、近年報告された。こ
れらの方法のうちの１つは、選択的プロテアーゼ排除による陰イオン交換クロマ
トグラフィー、次いで、逆相クロマトグラフィーおよび濾過によるタンパク質精
製にある。米国特許第４，６６７，０１６号（Ｌａｉらに対する）を参照のこと
。この技術は、未知の比活性および純度のうちの１６％のＥＰＯの収率を主張す
る。

【００１３】 組換えＥＰＯの分離のために提案される別の方法は、部分的に精製されたタン
パク質を含む溶液に対する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
の適用にある。米国特許第４，６６７，１９５号（Ｈｅｗｉｃｋらに対する）を
参照のこと。この方法は、実施において再現不能であることが見出された。さら
に、ＲＰ−ＨＰＬＣによるタンパク質およびポリペプチドの分離のために一般的
に使用されるかまたは推奨される非極性溶媒は、目的のタンパク質から除去する
ことが困難でありかつヒトに対して潜在的に毒性である、アセトニトリルのよう
な試薬を含む。Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１４、６、
２２２３−７（１９８４）を参照のこと。しかし、タンパク質溶出のためのエタ
ノールおよび蟻酸水溶液もまた使用されていることに留意すべきである。Ｔａｋ
ａｇａｋｉら、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、５，４，１５３６−４１（１９８０）を参照のこと。

【００１４】 組換えヒトＥＰＯの産生に関する豊富な情報が存在するとしても、ヒトにおけ
るその利用について適したＥＰＯを産出する精製方法は、いまだ記載されていな
い。適切なタンパク質精製方法は、９９％を超える純度で、かつ凝集体化物質、
ｂ）分解された物質、ｃ）擬似（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）タンパク質、およびｄ）プ
ロテアーゼのような夾雑物を含まないＥＰＯを産出すべきである。９９％未満の
純度のタンパク質または上述の任意の夾雑物の存在は、ヒトに対して毒性であり
得る。

【００１５】 他方で、ＥＰＯ精製のために提案される方法の多くは、産業的規模でのタンパ
ク質産生に適用される場合に、効率的ではない。ＲＰ−ＨＰＬＣ方法は大量の有
機溶媒を使用し、これは精製コストを増加させる。さらに、有機溶媒は取り扱う
のがより困難であり、そして環境に対する汚染物質である。提案される他の精製
方法は、実施において再現不可能であるか、または低収率を有する。

【００１６】 （発明の要旨） 本発明の新規の方法は、詳細には、ＥＰＯ精製のための系を記載する。これに
より、高純度かつ高品質の産物の高回収が達成される。この産物は、ヒト医薬に
おける使用のための注射可能産物として、薬学的化合物を処方するために、さら
なる精製を伴わずに使用され得る。

【００１７】 本願発明の利点は、凝集体、分解された物質、または予期されない等電点値の
分子のような、任意の所望されない分子改変体を伴わない、プロテアーゼを含ま
ないＥＰＯの達成である。本願発明により得られるＥＰＯは９９％を超える純度
であり、そして任意のさらなる精製工程を伴わずに、ヒトへの投与に適切な薬学
的処方物を調製するために、利用され得る。本願発明により得られるＥＰＯは、
３．０と４．５との間の範囲である等電点を有する５〜８個のアイソフォーム、
および⁵⁹Ｆｅ取り込み−超低酸素赤血球増加症マウスアッセイ（⁵⁹Ｆｅ−ｉｎｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｘ−ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍ
ｉｃｅ ａｓｓａｙ）および２８０ｎｍでのＥＰＯ総質量分析アッセイによって
測定されて、１００，０００ ＩＵ／ｍｇタンパク質を超えるインビボの特異的
生物学的活性を含む微小異種タンパク質である。

【００１８】 本願発明のさらなる利点は、その環境的影響の低さである。本願方法は、ＲＰ
−ＨＰＬＣ技術に基づく分離工程を使用せず、従って、環境に対して有害であり
得る有機溶媒の使用を回避する、クリーンなプロセスである。

【００１９】 本願発明のさらに別の利点は、ストリンジェントな温度条件、有害な有機溶媒
、またはその生物学的活性に影響し得るかもしくはヒト用途に対して不適切な毒
性化合物を生じ得る他の溶液に対して、ＥＰＯが曝露されないことである。

【００２０】 以下の詳細な説明および実施例は、本願方法において実施される分離工程を例
証する。

【００２１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＥＰＯを精製する方法に関する。この方法は、以下の工程：示差的
沈降、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および分子排除
クロマトグラフィーの組み合わせによって、ＥＰＯを含む細胞培養上清を処理す
る工程を包含する。

【００２２】 好ましいＥＰＯ産生組換え細胞は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＥＰＯ
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ウイルス性プロモーターおよびウ
イルス性ターミネーターを含むベクターを含む。好ましい細胞は、メトトレキサ
ートおよびネオマイシン誘導化抗生物質の両方に対する耐性を付与するベクター
を含む。好ましくは、ＥＰＯ核酸分子は、Ｌｉｎ、「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ」（米国特許第４，７０
３，００８号）に記載される核酸分子を含む。好ましくは、ウイルス性プロモー
ターは、ＳＶ４０初期プロモーターである。

【００２３】 組換え細胞からＥＰＯを得る好ましい方法は、インシュリンを含有する培地中
で培養することである。詳細には、このような培養する工程は、本発明の宿主細
胞からＥＰＯおよびインシュリンを含む上清を分離する工程、この上清を濃縮す
る工程、そしてこの濃縮した産物を凍結する工程を包含する。好ましくは、培養
培地は、培養培地１リットルあたり０．５ｍｇと２０ｍｇとの間のインシュリン
を含む。

【００２４】 本発明はさらに、ＥＰＯを含む細胞培養上清を、順に以下の工程によって処理
する工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する：（ａ）示差的沈降、（ｂ
）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ
）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
および（ｆ）分子排除クロマトグラフィー。本発明は、以下の工程：示差的沈降
、疎水的相互作用クロマトグラフィー、２ダイアフィルトレーション工程、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび分子排除
クロマトグラフィーの組み合わせによって、ＥＰＯを含む細胞培養上清を処理す
る工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する。

【００２５】 本発明はさらに、ＥＰＯを含む細胞培養上清を、順に以下の工程によって処理
する工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する：（ａ）示差的沈降、（ｂ
）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ
）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｅ’）ダイアフィルトレーション、および（ｆ）分子排除クロマトグラフィー
。

【００２６】 上記および以下に記載される方法および組成物の示差的沈降工程は、この上清
に硫酸アンモニウムを添加し、続いて遠心分離する工程を包含する。

【００２７】 上記および以下に記載される方法および組成物の疎水的相互作用クロマトグラ
フィー工程は、疎水的相互作用マトリクスを使用する工程を包含する。好ましく
は、この相互作用マトリクスは、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａ
ｓｔ Ｆｌｏｗである。

【００２８】 上記および以下に記載される方法および組成物の陰イオン交換工程は、陰イオ
ン交換マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この陰イオン交換マ
トリクスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含む。

【００２９】 上記および以下に記載される方法および組成物の陽イオン交換工程は、陽イオ
ン交換マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この陽イオン交換マ
トリクスは、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含む。

【００３０】 上記および以下に記載される方法および組成物の分子排除工程は、分子排除マ
トリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この分子排除マトリクスは、
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＰである。

【００３１】 別の実施形態では、本発明は、実質的に純粋なＥＰＯを提供する。好ましくは
、このＥＰＯは、以下の工程の組み合わせによって産生される：示差的沈降、疎
水的相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換ク
ロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および分子排除クロマト
グラフィー。より好ましくは、このＥＰＯは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に
よって決定される場合に、９９％より高い純度を有する。

【００３２】 本発明の精製されたＥＰＯを使用する好ましい方法は、疾患の処置のためのヒ
トへの注射に適切な形態に凍結乾燥することを含む。詳細には、好ましい凍結乾
燥手順は、以下を包含する：薬学的組成物中にＥＰＯを配置する工程、第１のＥ
ＰＯ組成物を容器内にロードする工程であって、ここでこの容器は−３０℃以下
の温度である、工程；大気圧の下で、４時間以上の間、−３０℃以下の温度にて
このＥＰＯ組成物をインキュベートする工程；１時間以上の間、３０絶対ミクロ
ン（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｉｃｒｏｎ）以下の圧力でこの組成物をインキュベー
トする工程；および、５絶対ミクロン以下の圧力値を維持しつつ、少なくとも２
５℃に達するまで、１時間あたり３℃以下の温度を上昇させる工程。

【００３３】 凍結乾燥のための好ましい薬学的組成物は、ＥＰＯ、糖、塩、およびヒトアル
ブミンを含む。凍結乾燥のための特に好ましい組成物は、ＥＰＯ、マンニトール
、ＮａＣｌ、ＮａＨ₂ＰＯ₄、およびＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏを含む。

【００３４】 本発明を、以下の非限定的な実施例において、さらに詳細に記載する。

【００３５】 （実施例） （実施例１ 回収） ７，９２０ｇの硫酸アンモニウムを、ＥＰＯを産生する培養中のＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣）細胞から得られる滅菌濃縮溶液３０リットル中に溶解
した。硫酸アンモニウムの添加後、この溶液を、４℃で２４時間貯蔵した。多く
の夾雑タンパク質が沈降したが、ＥＰＯは溶液中に残存した。この産物を、Ｓｏ
ｒｖａｌｌ遠心機（ＨＧ４Ｌローターを使用）で、１０分間、５，０００ＲＰＭ
で遠心分離した。

【００３６】 （実施例２ 疎水的相互作用クロマトグラフィー） 先の工程から得られた物質を、以下のパラメーターに従って、Ｈｙｄｒｏｐｈ
ｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｌｏｗ ｓｕｂ．−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を使用し、クロマトグラフする。 １．装備： Ａ．プレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）： １）直径：１４ｃｍ ２）ベッド高：１９ｃｍ ３）マトリクス： ａ）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ｂ）容量：３，０００ｍｌ Ｂ．カラム： １）直径：２０ｃｍ ２）ベッド高：１９ｃｍ ３）マトリクス： ａ）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｌｏｗ
ｓｕｂ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ｂ）容量：６，０００ｍｌ ２．溶液および緩衝液： Ａ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．２ Ｂ．緩衝液Ｆ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、１．８Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ｐＨ７．
２ Ｃ．緩衝液Ｇ：１５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．２ Ｄ．２０％イソプロピルアルコール Ｅ．０．５Ｎ ＮａＯＨ ３．クロマトグラフされる物質： Ａ．先の実施例から生じた硫酸アンモニウム上清 Ｂ．サンプル条件： １）容量：３０，０００ｍｌ ２）伝導率：１９０〜２１０ｍＳｉ／ｃｍ ３）ｐＨ：７．２。

【００３７】 プレカラムを平衡化および衛生化するために、本明細書中以後に詳述される量
の以下の溶液または緩衝液を、プレカラムを通して連続的に通過させた：１．０
カラム容量（「ｖｃ」）（３ｌ）のＨ₂Ｏ；１．０ｖｃ（３ｌ）のＮａＯＨ（０
．５Ｎ）；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｇ、そして最後に１．５ｖｃ（４．５ｌ
）の緩衝液Ｆ。

【００３８】 カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液また
は緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（６ｌ）のＨ₂Ｏ
；１．０ｖｃ（６ｌ）の２０％イソプロピルアルコール；１．０ｖｃ（６ｌ）の
Ｈ₂Ｏ；１．０ｖｃ（６ｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（６ｌ）のＨ₂Ｏ
；１．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ｇ、そして最後に１．５ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｆ
。

【００３９】 一旦、プレカラムおよびカラムを平衡化すると、このカラムをプレカラムの後
に接続し、そしてクロマトグラフされる物質をロードした。このロードする工程
を、１９ｃｍ／時間流で４℃にて実施した。その後、同じ流速であるが室温で溶
出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を、以下の量
および順序でカラムを通して通過させた：２．５ｖｃ（１５ｌ）の緩衝液Ｆ（一
旦、この緩衝液を通過させれば、プレカラムを除去した）。一旦、プレカラムを
除去すると、クロマトグラフィーをＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで
実施した。このＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムには、緩衝液Ｆ−緩衝
液Ａの勾配を、総容量１０ｖｃ（６０ｌ）でこれらの緩衝液の５０：５０の比率
が達成されるまで、これらの緩衝液の８５：１５の比率から開始してアプライし
た。

【００４０】 勾配が完成すると、３０：７０の比率にある１．５ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｆ−
緩衝液Ａを、カラムを通して通過させ、そして最後に１．５ｖｃ（９ｌ）のＨ₂
Ｏを通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して
滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。

【００４１】 （実施例３ 濃縮およびダイアフィルトレーション） 先の実施例から生じた画分を、以下に記載される条件に従って、濃縮およびダ
イアフィルトレーションした： １．装備： Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ−Ｃａｔ．Ｎ^O３０２Ｓ Ｂ．チュービング：Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ−Ｃａｔ．Ｎ^O０６４０２−１８ Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ Ｓｃａｌｅ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣＤＵ Ｆ００６ＬＣ
２．溶液および緩衝液： Ａ．１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） Ｂ．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ Ｃ．０．１Ｎ ＮａＯＨ Ｄ．Ｈ₂Ｏ Ｅ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．２ ３．処理される物質： Ａ．先の実施例から生じた選択された画分 Ｂ．サンプル条件： １．容量：１５，０００〜３０，０００ｍｌ ２．伝導率：１３０〜１７０ｍＳｉ／ｃｍ ３．ｐＨ：７．２。

【００４２】 装備を最初に、清掃、衛生化、および平衡化し、そして以下の順序の溶液およ
び緩衝液を、この装備を通して流した：１０ｌの１０ｍＭ ＳＤＳ；４０ｌのＨ ₂ Ｏ；１０ｌの１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４０ｌのＨ₂Ｏ；１０ｌの０
．１Ｎ ＮａＯＨ；４０ｌのＨ₂Ｏ、そして最後に５ｌの緩衝液Ａ。次いで、こ
の装備を、通常の方法論に従う、選択された画分における緩衝液Ａに対する濃縮
およびダイアフィルトレーションのために使用されるように準備した。

【００４３】 濃縮した産物の最終容量は、２，０００〜３，０００ｍｌの間であり、その伝
導率は１，１００〜１，５５０μｍＳｉ／ｃｍであり、そしてそのｐＨは７．２
であった。

【００４４】 （実施例４ 陰イオン交換クロマトグラフィー） 先の実施例から生じる物質を、以下のように、陰イオン交換クロマトグラフィ
ーを使用してクロマトグラフした。 １．装備： Ａ．カラム： １）直径：１４ｃｍ ２）ベッド高：１９ｃｍ ３）マトリクス ａ）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ｂ）容量：３，０００ｍｌ ２．溶液および緩衝液 Ａ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．２ Ｂ．緩衝液Ｇ：１５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．２ Ｃ．緩衝液Ｎ：５０ｍＭ酢酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０ Ｄ．緩衝液Ｓ：５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０ Ｅ．０．５Ｎ ＮａＯＨ ３．クロマトグラフされる物質： Ａ．適正に濃縮およびダイアフィルトレーションされた、疎水的相互作用工程か
ら選択される画分 Ｂ．サンプル条件： １）容量：２，０００〜３，０００ｍｌ ２）伝導率：１，１００〜１，５５０μＳｉ／ｃｍ ３）ｐＨ：７．２。

【００４５】 カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液また
は緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）のＨ₂Ｏ
；１．０ｖｃ（３ｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｎ；
２．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ｓ；３．０ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｇ；そして最後に
、２．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ａ。

【００４６】 一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラフされる物質をロードした。この
ロードする工程を、３９ｃｍ／時間で室温にて実施した。その後、同じ流速およ
び温度で溶出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を
、以下の順序で通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ａおよび４．０ｖｃ（
１２ｌ）の緩衝液Ｓ。その後、総容量１．５ｖｃ（４．５ｌ）中における緩衝液
Ｓ−緩衝液Ｎの工程（５０：５０）を実施した。

【００４７】 一旦、この工程が完了すると、１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｎをこのカラ
ムに通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して
滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。

【００４８】 （実施例５ 陽イオン交換クロマトグラフィー） 先の実施例から生じた物質を、以下のように、陽イオン交換マトリクスを使用
してクロマトグラフした。 １．装備： Ａ．カラム： １）直径：１４ｃｍ ２）ベッド高：１９ｃｍ ３）マトリクス ａ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ｂ）容量：３，０００ｍｌ ２．溶液および緩衝液 Ａ．緩衝液Ｄ：１２．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、４ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０ Ｂ．緩衝液Ｅ：１２．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、４ｍＭクエン酸、０．５Ｍ Ｎ ａＣｌ、ｐＨ６．０ Ｃ．０．５Ｎ ＮａＯＨ ３．クロマトグラフされる物質 Ａ．ＮａＯＨｃｃでｐＨ６．０に調整され、そして４，８００μＳｉ／ｃｍの伝
導率（９３．５：６．５の比率にある緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅと等しい伝導率）に達
するまで希釈された、先の実施例から選択される画分 Ｂ．サンプル条件： １）容量：５，０００ｍｌ ２）伝導率：４，８００μＳｉ／ｃｍ（９３．５：６．５の比率にある緩衝液Ｄ
−緩衝液Ｅと等しい） ３）ｐＨ：６．０。

【００４９】 カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液また
は緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）のＨ₂Ｏ
；１．０ｖｃ（３ｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｅ、
そして最後に、９３．５：６．５の比率にある１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液
Ｄ−緩衝液Ｅ。

【００５０】 一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラフされる物質をロードした。この
ロードする工程を、３９ｃｍ／時間で室温にて実施した。その後、同じ流速およ
び温度で溶出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を
、以下の順序でカラムを通して通過させた：９３．５：６．５の比率にある１．
５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅ。その後、緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅの勾配
を、総容量２．０ｖｃ（６ｌ）でこれらの緩衝液の５０：５０の比率が達成され
るまで、これらの緩衝液の９３．５：６．５の比率から開始してアプライした。
一旦、勾配が完成すると、１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｅを、カラムを通し
て通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅
菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。

【００５１】 （実施例６ 濃縮およびダイアフィルトレーション） 先の実施例から生じた画分を、以下のパラメーターおよび条件に従って、濃縮
およびダイアフィルトレーションした。 １．装備： Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ−Ｃａｔ．Ｎ^O３０２Ｓ Ｂ．チュービング：Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ−Ｃａｔ．Ｎ^O０６４０２−１８ Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ Ｓｃａｌｅ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣＤＵ Ｆ００２ＬＣ
２．溶液および緩衝液： Ａ．１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） Ｂ．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ Ｃ．０．１Ｎ ＮａＯＨ Ｄ．Ｈ₂Ｏ Ｅ．緩衝液Ｂ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５ｍ ｇ／ｍｌラクトース、ｐＨ７．２ ３．処理される物質： Ａ．先の実施例から生じた選択された画分 Ｂ．サンプル条件： １．容量：６，０００ｍｌ ２．伝導率：５，０００〜８，０００ｍＳｉ／ｃｍ ３．ｐＨ：６．０。

【００５２】 装備を最初に、清掃、衛生化、および平衡化し、以下の順序の溶液および緩衝
液を、この装備を通して通過させた：１０ｌの１０ｍＭ ＳＤＳ；４０ｌのＨ₂
Ｏ；１０ｌの１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４０ｌのＨ₂Ｏ；１０ｌの０
．１Ｎ ＮａＯＨ；４０ｌのＨ₂Ｏ、そして最後に５ｌの緩衝液Ｂ。このように
して、この装備を、通常の方法論に従う、選択された画分における緩衝液Ｂに対
する濃縮およびダイアフィルトレーション手順のために使用されるように準備し
た。

【００５３】 濃縮した産物の最終容量は、３５０〜６００ｍｌであり、その伝導率は１５，
５００〜１９，０００ｍＳｉ／ｃｍであり、ｐＨは７．２であった。そしてこの
溶液を、４℃にて保存した。

【００５４】 （実施例７ 分子排除クロマトグラフィー） 先の実施例から生じた物質を、以下のように、分子排除マトリクスを使用して
クロマトグラフした。 １．装備： Ａ．カラム： １）直径：１０ｃｍ ２）ベッド高：７６ｃｍ ３）マトリクス ａ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ｂ）容量：６，０００ｍｌ ２．溶液および緩衝液： Ａ．緩衝液Ｂ：１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５ｍ ｇ／ｍｌラクトース、ｐＨ７．２ Ｂ．０．５Ｎ ＮａＯＨ ３．クロマトグラフされる物質 Ａ．濃縮された、先の実施例から選択された画分 Ｂ．サンプル条件： １．容量：３５０〜６００ｍｌ ２．伝導率：１５，５００〜１９，０００μＳｉ／ｃｍ ３．ｐＨ：７．２。

【００５５】 カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液また
は緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０カラム容量（「ｖｃ」
）（６ｌ）のＨ₂Ｏ；１．５ｖｃ（９ｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ、そして最後に
３．０ｖｃ（１８ｌ）の緩衝液Ｂ。一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラ
フされる物質から１００ｍｌをロードした。このロードする工程を、２７ｃｍ／
時間で室温にて実施した。その後、同じ流速および温度率で溶出を実施し、そし
て０．７５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｂを、カラムを通して通過させた。この手
順を、４〜６回（すなわち、クロマトグラフされる物質が完全に利用されるまで
）繰り返した。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅
菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。

【００５６】 この工程をもって精製プロセスを終結した。得られたＥＰＯは、９９％より優
れた程度の純度を有し、そしてこの精製プロセス全体で、約３０％の全体的な収
率を有した。

【００５７】 （実施例８ ＥＰＯアッセイ） 先の実施例で得られたＥＰＯを、以下のプロトコルに従って、正体および生物
学的活性についてアッセイした。

【００５８】 変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、ＥＰＯは、ＥＰＯについて予期されたよ
うな分子量の広範なバンドとして同定された。図１を参照のこと。このバンドは
、ウェスタンブロットアッセイにおいて、ＥＰＯについて予期されたように、ヒ
トＥＰＯに対して惹起されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体によ
り認識された。図２を参照のこと。グリカナーゼでの処理により、ＥＰＯについ
て予期されたような程度およびサイズでのグリコシド鎖の存在が証明された。図
３を参照のこと。産生されたＥＰＯは、ＥＰＯについて予期されたように、３．
０〜４．５の等電点を示す一連の種から構成されることが示された。図４を参照
のこと。

【００５９】 トランスフェクトされた細胞株の培養上清から精製された、単離されたタンパ
ク質の完全なアミノ酸配列は、天然のヒトエリトロポイエチンとの全くの相同性
を示した。この天然のヒトエリトロポイエチンの１６５個のアミノ酸配列は、以
下（配列番号１）の通りである。

【００６０】

【化１】 １６５個のアミノ酸鎖における４つのグリコシル化部位、ならびに複合体炭水
化物構造、そして特に、シアル酸末端残基（これは、ＥＰＯを特徴付ける）の存
在が確認された。これらの結果は、国際的なＥＰＯ基準との完全な一致を示した
超低酸素赤血球増加症マウス試験による、産生タンパク質の生物学的アッセイに
よって、さらに支持された。

【００６１】 本願方法に従って得られたＥＰＯサンプルを、逆相および分子排除高速液体ク
ロマトグラフィー分析に供した。両方のアッセイにおいて、９９％を超える純度
が証明された。図５および６を参照のこと。

【００６２】 以下の表は、本願手順に対応する、各分離工程の回収率を例証する。

【００６３】

【表１】 以下の表は、請求項２に特許請求される精製配列の累積回収率を例証する。

【００６４】

【表２】 本明細書中の上記で言及された全ての刊行物を、それらの全体において、本明
細書中で参考として援用する。

【００６５】 上述の本発明は、明確化および理解の目的ために幾分詳細に記載されたが、形
態および詳細において、種々の変更が、本発明および添付の特許請求の範囲の範
囲から逸脱することなくなされ得ることは、この開示を読んで当業者に理解され
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、精製後に、記載された方法に従って得られたＥＰＯサンプルの、ポリ
アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を例証する。レーン１、４、およ
び７では、分子量マーカーをロードした。レーン２、３、５、および６では、本
願手順に従って得られた種々の量の純粋なＥＰＯを泳動した。得られた産物の純
度および３４ｋＤａを超える見かけの分子量は、明らかに観察され得るように、
ヒト泌尿器ＥＰＯについて報告されたものと一致する。

【図２】 図２は、記載される方法に従って得られたＥＰＯサンプルの、ウェスタンブロ
ット分析を例証する。産生されたＥＰＯの正体を評価する（なぜなら、これは、
ヒトＥＰＯに対するモノクローナル抗体により認識されるため）。レーン１およ
び２では、それぞれヒトＥＰＯ標準および分子量マーカーをロードした。本願方
法に従って得られたＥＰＯサンプルを、レーン３〜５にロードした。

【図３】 図３は、記載される方法に従って得られ、グリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ
）で処理された、純粋なＥＰＯサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量
マーカーを、レーン１、４、および８にロードした。レーン２および７は、未処
理ＥＰＯに対応する。レーン３では、Ｏ−グリカナーゼ処理したＥＰＯをロード
した（；Ｏ−グリコシル化部位の存在を確証する）。レーン５では、Ｎ−グリカ
ナーゼで部分的に消化したＥＰＯをロードした。ＥＰＯについて予期されるよう
な分子量を有する３Ｎ−グリコシル化分子の存在が確認され得る。レーン６は、
Ｎ−グリカナーゼで消化したＥＰＯをロードし、そして完全に脱グリコシル化し
たタンパク質について予期される分子量が得られた。

【図４】 図４は、記載される方法に従って産生された、純粋なＥＰＯサンプルにおける
等電点の調査を例証する。ＥＰＯサンプルをレーン２、３、および４において泳
動し、等電点マーカーをレーン１および５において泳動した。ＥＰＯに対応する
アイソフォームの存在が確認され、これは、３．０〜４．５の範囲の等電点を示
す。

【図５】 図５は、逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、本明細書中に記載され
る方法に従って産生されたＥＰＯサンプルの純度を示す。

【図６】 図６は、分子排除高速液体クロマトグラフィーを使用して、本明細書中に記載
される方法に従って産生されたＥＰＯサンプルの純度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 メロ， カルロス アルゼンチン国 ブエノス アイレス， プシア， デル ビソ， アルシナ 2737 (72)発明者 ヴィダル， ジュアン アレジャンドロ アルゼンチン国 ブエノス アイレス 1425， グイス 1760， アパートメント エイ， ９ティーエイチ フロアー Ｆターム(参考） 4H045 AA10 AA20 BA53 CA40 DA13 EA24 FA74 GA06 GA10 GA15 GA21

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞培養上清から組換えヒトエリトロポイエチンを精製する
   方法であって、以下の工程： （ａ）示差的生理食塩水沈降； （ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー； （ｃ）濃縮およびダイアフィルトレーション； （ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー； （ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー； （ｆ）濃縮およびダイアフィルトレーション； （ｇ）分子排除クロマトグラフィー の組み合わせによる工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 工程ａ）から工程ｇ）を、以下の順：（ａ）、（ｂ）、（ｃ
   ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）で実施する、請求項１に記載の方法
   。
3. 【請求項３】 工程ａ）から工程ｇ）を、以下の順：（ａ）、（ｃ）、（ｄ
   ）、（ｅ）、（ｂ）、（ｆ）、および（ｇ）で実施する、請求項１に記載の方法
   。
4. 【請求項４】 工程ａ）が、前記培養上清に硫酸アンモニウムを添加し、続
   いて遠心分離する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 工程（ｂ）が、疎水的相互作用マトリクスを使用する工程を
   包含する、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 使用される前記疎水的相互作用マトリクスが、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗである、請求項５に記載の方法
   。
7. 【請求項７】 工程（ｄ）が、陰イオン交換マトリクスを使用する工程を包
   含する、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記陰イオン交換マトリクスが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
   Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗである、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 工程（ｅ）が、陽イオン交換マトリクスを使用する工程を包
   含する、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記陽イオン交換マトリクスが、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
    ｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗである、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 工程（ｇ）が、分子排除マトリクスを使用する工程を包含
    する、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 使用される前記分子排除マトリクスが、Ｓｅｐｈａｃｒｙ
    ｌ Ｓ−２００ ＨＰである、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法に従って産生された、実質的に純粋
    なエリトロポイエチン。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のエリトロポイエチンであって、該ＥＰ
    Ｏは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ならびに逆相
    液体クロマトグラフィーおよび分子排除液体クロマトグラフィーにより決定され
    る場合に、９９％を超える純度を有する、エリトロポイエチン。
15. 【請求項１５】 前記ＥＰＯが、３．０と４．５との間の等電点値の一連の
    アイソフォームによって特徴付けられる、請求項１３に記載のエリトロポイエチ
    ン。
16. 【請求項１６】 前記ＥＰＯが、配列番号１のアミノ酸配列に対して相同性
    を示す、請求項１３に記載のエリトロポイエチン。