WO2022172986A1 - アデノ随伴ウイルスを産生するためのキットおよびその利用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to kits and integration vectors for producing adeno-associated virus-producing cells. Furthermore, the present invention relates to an adeno-associated virus-producing cell, a method for producing the same, and a method for producing an adeno-associated virus.
- Adeno-associated virus (also called AAV) is a linear, single-stranded DNA virus belonging to the Parvoviridae family.
- the wild-type AAV genome contains replication regulatory genes (rep genes) and capsid structural genes (cap genes), flanked by inverted terminal repeats (ITRs) for viral replication and packaging.
- AAV vectors are capable of transducing genes into either proliferating or non-proliferating cells, and are particularly capable of long-term expression in non-dividing cells. AAV is also considered non-pathogenic and is poorly immunogenic. Based on the above, AAV vectors are being clinically applied as vectors for gene therapy.
- AAV is a non-enveloped virus that grows in the presence of helper viruses such as adenovirus and herpes virus.
- helper viruses such as adenovirus and herpes virus.
- adenovirus was co-infected with host cells to effect AAV replication.
- a gene responsible for adenovirus helper action has been clarified, and a plasmid carrying this gene is also used.
- a plasmid containing the rep and cap genes, an adenoviral helper plasmid, and a plasmid containing the transgene can be co-transfected into HEK293 cells and packaged into recombinant AAV (rAAV).
- WO 2005/010000 discloses a nucleic acid molecule encoding a viral helper gene under control of a first derepressible promoter and a nucleic acid molecule encoding an AAV gene under control of a second derepressible promoter. , and nucleic acid molecules encoding repressor elements of the first and second derepressible promoters to produce AAV.
- Patent Document 2 discloses (a) a nucleotide sequence encoding an AAV REP protein, (b) a nucleotide sequence encoding an AAV capsid structural protein, and (c) a first AAV inverted terminal repeat (ITR).
- ITR AAV inverted terminal repeat
- nucleic acid molecule that includes a nucleotide sequence that includes the VA1 RNA region of adenovirus.
- Patent Document 3 discloses an adeno-associated virus (AAV) producer cell comprising nucleic acid sequences encoding AAV rep/cap genes, helper virus genes, and the DNA genome of an AAV vector particle, wherein the nucleic acid sequence is an AAV producer cell.
- AAV producer cells have been described that integrate all together at a single locus within the cell's genome.
- An object of the present invention is to provide a kit and an integrated vector for producing adeno-associated virus-producing cells capable of controlled production of adeno-associated virus.
- a further object of the present invention is to provide adeno-associated virus-producing cells capable of controlled production of adeno-associated virus, a method for producing the same, and a method for producing adeno-associated virus.
- the present inventors found that a first vector containing at least one viral helper gene under the control of an expression-regulatory promoter and a drug-mediated expression-regulatory promoter It has been found that by using a second vector containing at least one adeno-associated virus gene that is free of the gene, AAV-producing cells capable of controlled production of adeno-associated virus can be produced.
- the present invention has been completed based on the above findings.
- a kit according to ⁇ 1> wherein the promoter whose expression can be regulated in the first vector is a promoter whose expression can be regulated by a drug.
- ⁇ 3> The kit according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the viral helper gene contained in the first vector is derived from adenovirus.
- ⁇ 4> The kit according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein among the viral helper genes contained in the first vector, the E4 gene and the VA-RNA gene are under the control of a promoter whose expression can be regulated.
- ⁇ 5> The kit according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein all of the viral helper genes contained in the first vector are under the control of a promoter whose expression can be regulated.
- a first vector comprising one or more viral helper genes, wherein at least one of the viral helper genes is under the control of a promoter whose expression can be regulated, and one or more adeno and a second vector comprising an associated viral gene, wherein at least one of the adeno-associated viral genes is not under the control of an expression-regulatory promoter by a drug.
- a first vector comprising one or more viral helper genes, wherein at least one of the viral helper genes is under the control of a promoter whose expression can be regulated, and one or more adenoviruses a second vector comprising associated viral genes, wherein at least one of said adeno-associated viral genes is not under the control of an expression-regulated promoter by a drug; and, if necessary, the desired treatment.
- a method for producing an adeno-associated virus comprising: ⁇ 23> A first step of introducing a portion of the viral helper gene and a portion of the adeno-associated virus gene into the cell; A second step of culturing and growing the cells obtained in the first step; viral helper genes free from the cells obtained in the first step; adeno-associated virus genes free from the cells obtained in the first step; and, if necessary, the desired treatment or prevention
- a method for producing an adeno-associated virus comprising a third step of introducing a gene for use into the cells obtained in the second step; and a fourth step of culturing the cells obtained in the third step.
- a first step of introducing an adeno-associated virus gene into a cell A second step of culturing and growing the cells obtained in the first step; a third step of introducing a viral helper gene and, if necessary, a desired therapeutic or prophylactic gene into the cells obtained in the second step;
- a method for producing an adeno-associated virus comprising a fourth step of culturing.
- the adeno-associated virus genes introduced into the cells in the first step are the rep gene and the cap gene
- the viral helper genes introduced into the cells in the third step are the E2 gene, the E4 gene and the VA-RNA gene.
- adeno-associated virus-producing cells capable of controlled production of adeno-associated virus are provided. According to the present invention, adeno-associated virus can be produced in a controlled manner.
- FIG. 7 shows the results of introducing genes into HEK293 cells in a predetermined combination and evaluating the AAV titer.
- FIG. 8 shows the results of introducing genes into HEK293 cells in a predetermined combination and evaluating the AAV titer.
- FIG. 9 shows the results of introducing genes into HEK293 cells in a predetermined combination and evaluating the AAV titer.
- FIG. 10 shows the results of evaluating the AAV titer of AAV producer cell lines in which a predetermined combination of genes was introduced into HEK293 cells and the plasmid was inserted into the genome.
- Figure 11 shows the plasmid map of seq43.
- the present disclosure is by no means limited to the following embodiments, and can be implemented with appropriate modifications within the scope of the purpose of the present disclosure.
- the numerical range indicated using “to” means a range including the numerical values before and after "to" as the minimum and maximum values, respectively.
- the number of bases to be modified is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, It is more preferably 1 to 3.
- the base sequence of the modified gene preferably exhibits a sequence identity of 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95%, with the base sequence of the wild-type gene. It shows a sequence identity of 98% or more, and more preferably 98% or more.
- the kit of the present invention comprises a first vector comprising one or more viral helper genes, wherein at least one of the viral helper genes is under the control of a regulatable promoter; a second vector comprising one or more adeno-associated viral genes, wherein at least one of the adeno-associated viral genes is not under the control of an expression-regulatory promoter by a drug; including.
- the kit of the present invention is a first vector containing one or more viral helper genes, and among the viral helper genes contained in the first vector, only the E4 gene and the VA-RNA gene can regulate expression.
- a second vector comprising a first vector and one or more adeno-associated viral genes under the control of a promoter, wherein the expression regulation promoter of the adeno-associated viral gene contained in the second vector is controlled by a drug and a second vector in which the adeno-associated viral gene not underlying is the rep gene.
- the kit of the present invention is used for the production of AAV, and may contain a combination of vector sequences containing a first vector and a second vector, dissolved in a buffer composition, purified water, etc. It may be in a state or in a distributed state. It may be combined with a composition useful for practicing the invention, such as vector transducing reagents, and may comprise a suitable container such as a vial, tube, test tube or other container.
- sequences for controlling expression are artificially added to multiple positions of helper genes and adeno-associated virus genes. I had a token problem.
- the present invention solves the crosstalk problem described above by limiting the use of expression-regulatable promoters.
- cytotoxicity is avoided by controlling only helper gene expression. Turns out it can. That is, in the present invention, cytotoxicity that occurs during the establishment of AAV-producing cell lines can be avoided by adding minimal artificial sequences. Cytotoxicity can be evaluated by measuring cell viability by, for example, trypan blue staining of cells after gene transfer. In addition, in order to eliminate concerns such as crosstalk caused by increasing artificial sequences, natural sequences are used as much as possible in the present invention. built.
- AAV production methods require the introduction of AAV-producing genes each time production is performed, and have poor suitability for scale-up from the viewpoint of cost and process.
- AAV-producing cells of the present invention gene transfer costs and steps can be reduced, and large amounts of AAV required for therapy can be produced.
- promoter means a DNA regulatory region/sequence capable of binding RNA polymerase and involved in the initiation of transcription of a coding or non-coding sequence.
- a vector is a DNA or RNA molecule that is used to artificially transfer foreign genetic material to another cell.
- a vector containing a foreign genetic material to be introduced is introduced into a cell, the foreign genetic material is replicated and/or expressed in the cell.
- Vectors include episomal (eg, plasmid) vectors and non-episomal vectors. Vectors can be introduced into host cells by methods such as transfection, transduction, cell fusion and lipofection.
- the promoter that a gene naturally retains means a non-artificial promoter that is known to express the gene in its natural state.
- the first vector contains one or more viral helper genes, at least one of which is under the control of a regulatable promoter.
- a promoter whose expression can be regulated a promoter whose expression can be turned on and off depending on the presence or absence of stimulation can be used.
- Stimuli include chemical stimuli (endogenous hormone stress response, lactose, tetracycline or its derivatives (eg, doxycycline), cumic acid, proteins (rapamycin, FKCsA, abscisic acid (ABA), etc.), tamoxifen/Cre-loxP ( Examples include, but are not limited to, a system using a Cre promoter modified so that activation can be induced by tamoxifen), a riboswitch), physical stimuli (blue light, heat), and the like.
- the promoter whose expression can be regulated in the first vector is a promoter whose expression can be regulated by a drug.
- the drug is preferably tetracycline or a derivative thereof (eg, doxycycline).
- Expression-regulatable promoters include tetracycline-responsive promoters, RU486-inducible promoters, ecdysone-inducible promoters, rapamycin-inducible promoters, metallothionein promoters, and the like.
- a specific tetracycline-responsive promoter includes the Tet on/off system (manufactured by TET systems).
- the expression-regulatable promoter in the first vector is the Tet on/off system, which is a tetracycline-regulatable promoter, most preferably the Tet-on system.
- the promoter is not particularly limited, but includes a cytomegalovirus-derived promoter (optionally including an enhancer), SV40 early promoter, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoter, retroviral Rous sarcoma virus LTR promoter. , dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, H1 promoter (RNA Polymerase III promoter), U6 promoter (RNA Polymerase III promoter), and the like.
- the promoter used in the Tet-on system for VA-RNA gene expression regulation may be the H1 promoter (RNA Polymerase III promoter).
- the promoter additionally contains at least one Tet operon.
- the Tet operon tetracycline-regulated transcriptional activation
- the intracellular Tet repressor protein blocks expression by binding to the Tet operator sequences introduced into the promoter. Therefore, no gene expression is seen when the Tet repressor is bound to the Tet operator sequence.
- the Tet repressor is sequestered to allow promoter activity and gene expression is turned on.
- the Tet operon system is widely available, such as the Tet operon used in the pcDNATM4/TO mammalian expression vector available from Invitrogen.
- the Tet operator sequence can be upstream or downstream of the promoter whose expression you want to regulate. In terms of reducing expression leakage when expression is turned off, the Tet operator sequence is preferably downstream of the expression-regulatable promoter.
- Viral helper genes are non-adeno-associated viral genes that enable replication and packaging of adeno-associated viruses.
- virus helper genes genes derived from viruses other than adeno-associated viruses are used.
- Specific examples of viral helper genes include viral helper genes derived from adenovirus or herpesvirus, preferably the viral helper gene is derived from adenovirus.
- Adenovirus refers to a non-enveloped virus with an icosahedral nucleocapsid containing double-stranded DNA in the family Adenoviridae. More than 50 adenovirus subtypes have been isolated from humans, and many additional subtypes have been isolated from other mammals and birds. These subtypes belong to the family Adenoviridae and are divided into two genera, namely Mastadenovirus and Aviadenovirus. These adenoviruses are morphologically and structurally similar. However, in humans, adenoviruses exhibit different immunological properties, ie, are divided into serotypes. Two human serotypes of adenovirus, namely Ad2 and Ad5, have been intensively studied.
- Viral helper genes from adenovirus are genes involved in replication and packaging of adeno-associated virus.
- Viral helper genes derived from adenovirus include E1A gene, E1B gene, E2A gene, E4 gene, VA-RNA gene and the like.
- the viral helper genes contained in the first vector are the E2 gene, the E4 gene and the VA-RNA gene. More preferably, the viral helper genes contained in the first vector are the E4 gene and the VA-RNA gene.
- the E4 gene is preferably the E4ORF6 gene.
- the VA-RNA gene is preferably the VA-RNAI gene.
- Adenovirus-derived viral helper genes may be wild-type genes, but as long as they exhibit their inherent functions, wild-type A gene in which modifications such as base substitution, deletion, insertion or addition have been made may be used.
- the number of bases to be modified is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably. is 1 to 3.
- the modified viral helper gene base sequence preferably exhibits a sequence identity of 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably a sequence identity of 90% or more with the base sequence of the wild-type viral helper gene. exhibit greater than 95% sequence identity, and even more preferably greater than 98% sequence identity.
- the arrangement is not particularly limited, and the E4 gene may be located upstream of the VA-RNA gene or downstream of the VA-RNA gene. but preferably the E4 gene is located upstream of the VA-RNA gene.
- a viral helper gene contained in the first vector is under the control of a regulatable promoter.
- the E2 gene is not under the control of a promoter whose expression can be regulated.
- the E4 gene may be under the control of a promoter whose expression is regulatable.
- the VA-RNA gene may be under the control of a promoter whose expression is regulatable.
- the E4 gene and the VA-RNA gene are under the control of expression-regulatable promoters.
- the first vector is not limited as long as it contains a nucleic acid, for example, a plasmid vector, an artificial chromosome vector, a virus vector, a vector having an artificially designed nucleic acid, etc. can be used. , preferably a plasmid vector.
- the second vector contains one or more adeno-associated viral genes, wherein at least one of the adeno-associated viral genes is not under the control of a drug expression-regulatory promoter.
- Adeno-associated virus refers to a small, replication-defective, non-enveloped virus containing single-stranded DNA in the family Parvoviridae and Dependoparvovirus genus.
- AAV has more than 100 serotypes, and it is known that differences in serotypes result in different host ranges and viral characteristics.
- Serotype 2 is one of the serotypes that has been extensively studied for a long time and is known to have a very wide host range.
- Serotype 1 (AAV1), serotype 5 (AAV5) and serotype 6 (AAV6) are serotypes with higher tissue tropism.
- AAV1 is said to have high efficiency of gene transfer to muscle, liver, respiratory tract, central nervous system and the like, AAV5 to central nervous system, liver, retina and the like, and AAV6 to heart, muscle, liver and the like.
- the present invention is used with serotype 2 or serotype 5.
- Serotype 5 is particularly preferred.
- An adeno-associated virus gene refers to a gene composed of one or more nucleic acid sequences derived from one or more adeno-associated virus serotypes.
- the adeno-associated virus genes are preferably genes involved in AAV replication and packaging, and genes encoding AAV constituent proteins.
- any one of all adeno-associated viral genes is not under the control of an expression-regulated promoter by a drug.
- any one of the adeno-associated viral genes that are not under the control of a promoter for regulation of expression by a drug is under the control of a promoter, more preferably the promoter that the adeno-associated viral gene naturally retains.
- all adeno-associated viral genes are not under the control of an expression-regulatory promoter, more preferably all adeno-associated viral genes are under the control of a naturally-occurring promoter. Promoters that rep genes naturally retain include p5 and p19 promoters. A p40 promoter can be mentioned as a promoter that the cap gene naturally retains.
- the adeno-associated virus genes contained in the second vector are the rep gene and the cap gene.
- the adeno-associated virus gene may be a wild-type gene.
- a modified gene may be used.
- the rep gene is a viral replication protein collectively required for replication of the viral genome, known to those skilled in the art, or, for example, the human herpesvirus 6 (HHV-6) rep gene (which mediates AAV-2 DNA replication). known to do) that encodes a functional homologue thereof.
- the coding region of the rep gene includes at least the genes encoding AAV REP78 and REP68 (“long form REP proteins”) and REP52 and REP40 (“short form REP proteins”) or functional homologues thereof.
- the coding region of the rep gene used in the present invention may be derived from any AAV serotype, preferably from AAV2. Those derived from AAV2 include REP78 and REP68 and REP52 and REP40, ITRs.
- the rep gene is an adeno-associated viral gene that is not under the control of an expression regulation promoter by a drug.
- the present invention further provides a first vector comprising one or more viral helper genes, wherein at least one of the viral helper genes is under the control of a promoter whose expression is regulatable; wherein at least one of the adeno-associated viral genes is linked to the second vector that is not under the control of an expression-regulating promoter by a drug.
- a linked state refers to a state of being directly or indirectly linked by another sequence.
- the E4 gene and its upstream promoter and the VA-RNA gene and its upstream promoter correspond to the first vector
- the rep gene and cap gene and their upstream promoter correspond to the second vector
- the first vector and the second vector exist in a linked state.
- the integration vector is not limited as long as it contains a nucleic acid.
- a plasmid vector, an artificial chromosome vector, a virus vector and the like can be used, preferably a plasmid vector.
- the construction of the first vector and the second vector in the integration vector is as described in ⁇ Kit> above in this specification.
- the integration vector of the present invention may further have a third vector containing a desired therapeutic or prophylactic gene.
- the third vector When the third vector is circular, it can be linearized by cleaving part of the vector sequence and ligated to form an integration vector.
- a third vector is a vector containing a desired therapeutic or prophylactic gene.
- genes that are defective or missing in the genome of the target cell, or encode non-natural proteins that have the desired biological or therapeutic effect e.g., antiviral function.
- a gene or the like can be used, but is not particularly limited.
- Specific examples of therapeutic or prophylactic genes include inflammatory diseases, autoimmune diseases, chronic and infectious diseases (including disorders such as AIDS, cancer, neurological diseases, cardiovascular diseases, hypercholesteremia), anemia and blood Genes used for the treatment or prevention of various hematologic diseases such as communis, genetic deficiencies (eg, cystic fibrosis, Gaucher disease, adenosine deaminase (ADA) deficiency, emphysema, etc.).
- some antisense oligonucleotides e.g., short oligos complementary to the sequence around the translation start site (AUG codon) of mRNA, which are useful in antisense therapy against cancer and against viral diseases
- nucleotide e.g., short oligos complementary to the sequence around the translation start site (AUG codon) of mRNA, which are useful in antisense therapy against cancer and against viral diseases
- a third vector may contain a promoter for expressing a therapeutic or prophylactic gene.
- Promoters for expressing therapeutic or preventive genes are not particularly limited, but cytomegalovirus-derived promoter (optionally including enhancer), SV40 early promoter, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoters, retroviral Rous sarcoma virus LTR promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, and the like.
- the therapeutic or prophylactic gene and the promoter for expressing the gene are preferably flanked by ITR sequences.
- the third vector is not limited as long as it contains a nucleic acid.
- plasmids, artificial chromosomes, viruses, etc. can be used, preferably plasmids.
- the present invention relates to cells containing the first vector and the second vector described above.
- the present invention further relates to cells carrying the integration vectors described above.
- the invention further relates to cells with a first vector, a second vector and a third vector.
- the cells are preferably eukaryotic cells, more preferably mammalian cells.
- mammalian cells include, but are not limited to, human cells, mouse cells, rat cells, monkey cells, hamster cells, and the like.
- human cells can be used.
- examples of cells include mouse myeloma (NSO) cell line, Chinese hamster ovary (CHO) cell line, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (baby hamster kidney cells), VERO, SP2.
- NSO mouse myeloma
- CHO Chinese hamster ovary
- the cells of the invention preferably have a first vector and a second vector or an integration vector. Moreover, it preferably has the first vector, the second vector and the third vector on the chromosome. Having in the chromosome means that the vector is fully or partly integrated into the chromosome. The chromosomal integration can be confirmed by performing genome sequence analysis and confirming that the sequences in the vector are linked to the host genome. By integrating the vector into the chromosome, the genes necessary for adeno-associated virus production are constantly maintained in the cell, making it possible to produce adeno-associated virus at any timing.
- the configurations of the first vector, the second vector and the third vector are as described in ⁇ Kit> above in this specification.
- the first vector, the second vector and the third vector need only be introduced so as to be expressed, but permanent expression is more preferred.
- Permanent expression means that when a cell divides, the first vector, the second vector, and the third vector are also replicated, and the cells after division also express the first vector, the second vector, and the third vector. It means to have a vector. Permanent expression can be achieved by integrating the vector into the chromosome of the cell or by using a vector that has the ability to replicate in the cytoplasm.
- a first vector comprising one or more viral helper genes, wherein at least one of the viral helper genes is under the control of a promoter whose expression is regulatable; and one or more adeno-associated viral genes. wherein at least one of the adeno-associated viral genes is not under the control of an expression-regulated promoter by a drug; culturing cells containing a third vector containing the gene; a step of expressing a viral helper gene under the control of the expression-regulatable promoter by operating the expression-regulatable promoter; and a method comprising:
- the configurations of the first vector, the second vector, and the third vector are as described above in this specification. Cells are also as described above in this specification.
- Another example of the method for producing an adeno-associated virus according to the present invention is A first step of introducing a portion of the viral helper gene and a portion of the adeno-associated viral gene into the cell; A second step of culturing and growing the cells obtained in the first step; viral helper genes free from the cells obtained in the first step; adeno-associated virus genes free from the cells obtained in the first step; and, if necessary, the desired treatment or prevention and a fourth step of culturing the cells obtained in the third step.
- the method for introducing the nuclear gene into the cell is as described above in this specification.
- the viral helper gene introduced into the cells in the first step is the E2 gene
- the viral helper genes introduced into the cells in the third step are the E4 gene and the VA-RNA gene
- the third step The adeno-associated viral genes introduced into cells in are the rep and cap genes.
- the cell culture in the method for producing an adeno-associated virus according to the present invention can be carried out under normal conditions for cell culture.
- the medium and culture conditions to be used can be appropriately selected by those skilled in the art.
- Media include Expi29 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, A1435101), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% (vol/vol) fetal bovine serum (FBS), serum-free UltraCULTURETM medium (Lonza), etc. can be used, but is not particularly limited.
- the culture temperature is generally 25°C to 45°C, preferably 30°C to 42°C, more preferably 35°C to 40°C, and an example is 37°C.
- the CO 2 concentration is generally 3-10% CO 2 , preferably 5-10% CO 2 , an example being 8% CO 2 .
- the titer of adeno-associated virus produced can be measured by conventional methods known to those skilled in the art. For example, the cell culture solution after culturing is collected, the cells are disrupted by freezing and thawing, and then the supernatant is collected by centrifugation. gDNA (genomic DNA) and residual plasmids can be digested by adding MgCl 2 and benzonase to the recovered supernatant and performing a reaction.
- the adeno-associated virus-containing sample obtained above can be used as a ddPCR (Droplet Digital PCR) sample, and the AAV titer can be measured by performing ddPCR.
- ddPCR Droplet Digital PCR
- pRC5 Vector Plasmid containing AAV5 rep gene and AAV5 cap gene
- pHhelper Vector Plasmid containing adenovirus-derived E2A gene, E4 gene and VA-RNA gene
- E2, E4, VA-RNA pHHelper Vector contained in the AAVpro Helper Free System (AAV5) kit, plasmid seq2 (REP, CAP) containing E2A gene, E4 gene, VA-RNA gene derived from adenovirus: Plasmid seq3 ( ⁇ REP) containing pRC Vector in the AAVpro Helper Free System (AAV5) kit, AAV5 rep gene and AAV5 cap gene: Based on seq2, the rep gene coding region was removed by inverse PCR, and self-ligation was performed. , recircularized plasmid.
- AAV5 AAVpro Helper Free System
- seq13 E4ORF6: A plasmid obtained by amplifying the region of the E4ORF6 gene by PCR and inserting it into the ApaI/XbaI site of the pEBMulti-Neo vector (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation).
- seq14 A plasmid obtained by removing the VA-RNAIII gene coding region from seq1 by inverse PCR and recircularizing by self-ligation.
- VA-II A plasmid obtained by removing the VA-RNAI gene coding region from seq1 by inverse PCR and recircularizing by self-ligation.
- Switch1-VAI has a structure in which a Tet operator sequence is incorporated downstream of the RNA polymerase III promoter.
- seq22 (Switch2-VAI): A plasmid (GENEWIZ) in which a sequence connecting the U6 promoter (RNA polymerase III promoter) and the VA-RNAI (VAI) gene was synthesized and inserted into the EcoRV site of the pUC57 vector.
- Switch1-VAI has a structure in which a Tet operator sequence is incorporated upstream of the RNA polymerase III promoter.
- seq23(tTS) A plasmid in which a synthesized tetracycline-regulated transcriptional silencer (tTS) gene was inserted into the ClaI-XbaI site of the pLVSIN-CMV Hyg vector (GENEWIZ).
- Seq38 Switch-E4ORF6-Switch1-VAI-tTS: Switch1-VAI and tTS amplified by PCR were inserted into a plasmid (GENEWIZ) encoding the synthesized E4ORF6 gene sequence.
- the rep-cap fragment was exchanged between the Bsp14071/BglII sites of AAVS1 Safe Harbor cDNA/miRNA Donor Vector (pAAVS1D-PGK.MSC-Ef1 ⁇ .copGFPpuro) (SBI, GE603A-1), recircularized by ligation, and rep- Plasmid for cap knock-in.
- Seq40 p5RCp5: A plasmid with a synthetic p5 promoter sequence inserted into Seq39. It has p5 promoter sequences before and after the rep-cap gene.
- ⁇ Western blot> Cells were harvested by centrifugation and lysed with RIPA Buffer. A sample buffer (Nacalai, 09499-14) was added to the cell solution and heated at 100° C. for 5 minutes to prepare a sample. After size separation of proteins in the sample using a sodium dodecyl sulfate (SDS) gel electrophoresis apparatus (Ato, 2321670), they were transferred to a membrane using a semi-dry blotting apparatus (Ato, 2322490).
- SDS sodium dodecyl sulfate
- droplets were formed from the prepared solution in a droplet forming device, followed by incubation at 95°C for 10 minutes, 94°C for 30 seconds and 55°C for 40 cycles, followed by incubation at 98°C for 10 minutes. Measurements were taken by a droplet reader and AAV genome titers (vg/mL) were calculated.
- PEI Polyethylenemine
- Cytotoxicity rate (Hereinafter, the cytotoxicity rate on Day 4, Day 7, and Day 11 is shown from the left) Type: 38.0%, 66.6%, 69.6% Mock: 11.0%, 8.3%, 6.9% PEI only: 12.4%, 7.1%, 6.3% ⁇ REP: 39.1%, 69.2%, 60.4% ⁇ CAP: 37.0%, 61.2%, 54.3% ⁇ E2: 24.7%, 30.6%, 13.3% ⁇ E4: 14.0%, 14.8%, 7.4% ⁇ VA-RNA: 13.1%, 10.2%, 5.2% From the results of FIG. 1, on Day 11, cytotoxicity was reduced by removing the E2 gene, E4 gene, and VA-RNA gene. Further, from the results of FIG. 1, it was confirmed that the absence of E4 gene and VA-RNA gene can avoid cell damage.
- Viral load (vg/mL) Type 5.5 ⁇ 10 8 ⁇ E4: 2.1 ⁇ 10 8 +E4: 5.5 ⁇ 10 8 +E4ORF6: 4.7 ⁇ 10 8 From the results of FIG. 4, it was confirmed that the E4ORF6 gene alone produced virus to the same extent as when the E4 gene was introduced, and could replace the function of the E4 gene.
- Viral load (vg/mL) Type 1.4 ⁇ 10 9 ⁇ VA-RNA: 4.3 ⁇ 10 9 +VA-RNAI: 1.3 ⁇ 10 9 +VA-RNA II: 4.3 x 10 9
- VA-RNAI VAI
- HEK293 cells were introduced into HEK293 cells in the following combinations, and the results of evaluating the AAV titer are shown in FIG.
- doxycycline (DOX) at a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL was added to the "Switch1-VAI+DOX" and "Switch2-VAI+DOX” samples after gene introduction.
- HEK293 cells cultured for 72 hours after DOX addition were evaluated for AAV genomic titers.
- Seq43 alone or seq43 and seq42 were co-introduced to establish cell lines, respectively.
- a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL of doxycycline (DOX) was added to the "+DOX" sample for the strain 1.5 months after establishment.
- Cells cultured for 72 hours after DOX addition were evaluated for AAV genomic titer. The results are shown in FIG.
Abstract
本発明の課題は、アデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なアデノ随伴ウイルス産生細胞を作製するためのキットおよび統合ベクターを提供すること、及びアデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なアデノ随伴ウイルス産生細胞、その製造方法、およびアデノ随伴ウイルスの製造方法を提供することである。本発明によれば、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、前記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、とを含むキットが提供される。
Description
本発明は、アデノ随伴ウイルス産生細胞を作製するためのキットおよび統合ベクターに関する。さらに本発明は、アデノ随伴ウイルス産生細胞、その製造方法、およびアデノ随伴ウイルスの製造方法に関する。
アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶともいう）は、パルボウイルス科に属する直鎖一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶゲノムは、複製の調節遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）とカプシドの構造遺伝子（ｃａｐ遺伝子）を含み、ウイルスの複製とパッケージングのために逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ＡＡＶベクターは増殖又は非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非***細胞においては長期間の発現が可能である。また、ＡＡＶは、非病原性であると考えられており、免疫原性が低い。上記のことから、ＡＡＶベクターは、遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進んでいる。
ＡＡＶは、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。遺伝子治療もしくは核酸導入に用いるＡＡＶを作製する際には、古典的にはアデノウイルスを宿主細胞に共感染させて、ＡＡＶ複製が行なわれていた。また、アデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子が明らかにされ、この遺伝子を搭載したプラスミドも使用されている。例えば、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、および導入遺伝子を含むプラスミドを同時にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションすることで組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）へとパッケージングすることができる。
特許文献１には、第１の抑制解除可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子と、第２の抑制解除可能なプロモーターの制御下にあるＡＡＶ遺伝子をコードする核酸分子と、第１および第２の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサー要素をコードする核酸分子とを含む哺乳動物細胞をＡＡＶを産生するために使用することが記載されている。
特許文献２には、（ａ）ＡＡＶのＲＥＰタンパク質をコードする塩基配列、（ｂ）ＡＡＶのカプシドの構造タンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）第一のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列、（ｄ）第二のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列、（ｅ）第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する、外来のタンパク質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来のタンパク質をコードする塩基配列，（ｆ）アデノウイルスのＥ２Ａ領域を含む塩基配列、（ｇ）アデノウイルスのＥ４領域を含む塩基配列，及び（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域を含む塩基配列を含む核酸分子が記載されている。
特許文献３には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プロデューサー細胞であって、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子、ヘルパーウイルス遺伝子、及びＡＡＶベクター粒子のＤＮＡゲノムをコードする核酸配列を含み、上記核酸配列が、ＡＡＶプロデューサー細胞のゲノム内の単一の遺伝子座にすべて一緒に組み込まれる、ＡＡＶプロデューサー細胞が記載されている。
特許文献１に記載のＡＡＶ産生細胞においては、ＡＡＶ産生細胞株の樹立時に起こる細胞障害が、遺伝子に対する人工的な配列付加によって回避されていると考えられる。しかし、特許文献１に記載のＡＡＶ産生細胞においては、ウイルスヘルパー遺伝子、および、ＡＡＶ遺伝子のそれぞれに人工的な制御配列が付加されていることから、制御配列間でのクロストーク（制御配列間の相互干渉によって、対象遺伝子ごとに発現量を制御することが困難になる）が生じる可能性があり、ＡＡＶ産生を十分に制御できない可能性がある。特許文献２及び３に記載のＡＡＶ産生細胞においては、ウイルスヘルパー遺伝子の発現を発現調節可能なプロモーターにより制御することについては具体的な記載はない。
本発明は、アデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なアデノ随伴ウイルス産生細胞を作製するためのキットおよび統合ベクターを提供することを課題とする。本発明はさらに、アデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なアデノ随伴ウイルス産生細胞、その製造方法、およびアデノ随伴ウイルスの製造方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、発現調節可能なプロモーターの制御下にある少なくとも一つのウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターと、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない少なくとも一つのアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターとを用いることにより、アデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なＡＡＶ産生細胞を製造できることを見いだした。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、
とを含むキット。
＜２＞ 第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターが、薬剤による発現調節可能なプロモーターである、＜１＞に記載のキット。
＜３＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子がアデノウイルス由来である、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
＜４＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にある、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
＜５＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子の全てが、発現調節可能なプロモーターの制御下にある、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載のキット。
＜６＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載のキット。
＜７＞ Ｅ４遺伝子が、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子である、＜６＞に記載のキット。
＜８＞ ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である、＜６＞または＜７＞に記載のキット。
＜９＞ 第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載のキット。
＜１０＞ 第二のベクターにおいて、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子のいずれか一つが、アデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載のキット。
＜１１＞ 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載のキット。
＜１２＞ 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である、＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載のキット。
＜１３＞ ＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載のキットに含まれる第一のベクターと第二のベクターとを有する細胞。
＜１４＞ 細胞がヒト細胞である、＜１３＞に記載の細胞。
＜１５＞ 上記第一のベクターと上記第二のベクターとを染色体中に有する、＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞。
＜１６＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター
とを連結した状態で有する、統合ベクター。
＜１７＞ 所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターを更に有する、＜１６＞に記載の統合ベクター。
＜１８＞ ＜１６＞又は＜１７＞に記載の統合ベクターを有する細胞。
＜１９＞ 細胞がヒト細胞である、＜１８＞に記載の細胞。
＜２０＞ 上記統合ベクターを染色体中に有する、＜１８＞又は＜１９＞に記載の細胞。
＜２１＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法。
＜２２＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターと、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターとを含む細胞を培養する工程と、
上記発現調節可能なプロモーターを作動させることによって、発現調節可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子を発現させる工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２３＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子の一部を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子、上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないアデノ随伴ウイルス遺伝子、及び、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２４＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｃａｐ遺伝子である、＜２３＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２５＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２６＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜２５＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２７＞ アデノ随伴ウイルス遺伝子を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
ウイルスヘルパー遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２８＞ 第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜２７＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２９＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子と、アデノ随伴ウイルス遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜３０＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、＜２９＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜１＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、
とを含むキット。
＜２＞ 第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターが、薬剤による発現調節可能なプロモーターである、＜１＞に記載のキット。
＜３＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子がアデノウイルス由来である、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
＜４＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にある、＜１＞または＜２＞に記載のキット。
＜５＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子の全てが、発現調節可能なプロモーターの制御下にある、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載のキット。
＜６＞ 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載のキット。
＜７＞ Ｅ４遺伝子が、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子である、＜６＞に記載のキット。
＜８＞ ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である、＜６＞または＜７＞に記載のキット。
＜９＞ 第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載のキット。
＜１０＞ 第二のベクターにおいて、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子のいずれか一つが、アデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載のキット。
＜１１＞ 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載のキット。
＜１２＞ 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である、＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載のキット。
＜１３＞ ＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載のキットに含まれる第一のベクターと第二のベクターとを有する細胞。
＜１４＞ 細胞がヒト細胞である、＜１３＞に記載の細胞。
＜１５＞ 上記第一のベクターと上記第二のベクターとを染色体中に有する、＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞。
＜１６＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター
とを連結した状態で有する、統合ベクター。
＜１７＞ 所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターを更に有する、＜１６＞に記載の統合ベクター。
＜１８＞ ＜１６＞又は＜１７＞に記載の統合ベクターを有する細胞。
＜１９＞ 細胞がヒト細胞である、＜１８＞に記載の細胞。
＜２０＞ 上記統合ベクターを染色体中に有する、＜１８＞又は＜１９＞に記載の細胞。
＜２１＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法。
＜２２＞ １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターと、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターとを含む細胞を培養する工程と、
上記発現調節可能なプロモーターを作動させることによって、発現調節可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子を発現させる工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２３＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子の一部を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子、上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないアデノ随伴ウイルス遺伝子、及び、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２４＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｃａｐ遺伝子である、＜２３＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２５＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２６＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜２５＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２７＞ アデノ随伴ウイルス遺伝子を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
ウイルスヘルパー遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２８＞ 第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、＜２７＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜２９＞ ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子と、アデノ随伴ウイルス遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。
＜３０＞ 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、＜２９＞に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
本発明によれば、アデノ随伴ウイルスの制御された製造が可能なアデノ随伴ウイルス産生細胞が提供される。本発明によれば、アデノ随伴ウイルスを制御された方式で製造することができる。
以下、本開示の実施形態の一例について説明する。但し、本開示は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本開示の目的の範囲内において、適宜、変更を加えて実施することができる。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
本発明において、野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～３個である。改変を加えた遺伝子の塩基配列は、野生型の遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し、更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。
本発明において、野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～３個である。改変を加えた遺伝子の塩基配列は、野生型の遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し、更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。
＜キット＞
本発明のキットは、
１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、
とを含む。
例えば、本発明のキットは、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である第二のベクター、とを含む。
本発明のキットは、ＡＡＶの製造に用いるものであって、第一のベクターと第二のベクターとを含むベクター配列の組み合わせを含んでいればよく、緩衝液組成物や精製水などに溶解した状態や分散した状態であってもよい。ベクターを導入する試薬などの本発明を実施するのに有用な組成物と組み合わせてもよいし、適切な容器、例えば、バイアル、チューブ、試験管またはほかの容器を含んでいてもよい。
本発明のキットは、
１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、
とを含む。
例えば、本発明のキットは、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である第二のベクター、とを含む。
本発明のキットは、ＡＡＶの製造に用いるものであって、第一のベクターと第二のベクターとを含むベクター配列の組み合わせを含んでいればよく、緩衝液組成物や精製水などに溶解した状態や分散した状態であってもよい。ベクターを導入する試薬などの本発明を実施するのに有用な組成物と組み合わせてもよいし、適切な容器、例えば、バイアル、チューブ、試験管またはほかの容器を含んでいてもよい。
特許文献１に記載の方法においては、ヘルパー遺伝子およびアデノ随伴ウイルス遺伝子の複数の位置に発現を制御するための配列を人工的に付加しているが、複数個の人工配列を使用することによりクロストークの問題があった。本発明では、発現調節可能なプロモーターの使用を制限することにより、上記したクロストークの問題を解消している。
本発明においては、細胞障害を有することが知られているＡＡＶ遺伝子の発現が、ヘルパー遺伝子に依存することが明らかになったことにより、ヘルパー遺伝子の発現のみを制御することにより、細胞障害を回避できることが判明した。即ち、本発明においては、ＡＡＶ産生細胞株の樹立時に起こる細胞障害を、最小限の人工的配列の付加によって回避することができる。なお、細胞障害は、遺伝子導入後の細胞について、例えば、ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色により細胞の生存率を測定することによって評価することができる。また、人工的な配列を増やすことで生じるクロストーク等の懸念を解消するために、本発明においては、天然の配列をなるべく使用しており、これにより、自然界のＡＡＶ産生機構を模倣した産生系を構築した。
さらに、従来のＡＡＶ製造方法は、ＡＡＶ産生遺伝子を製造のたびに導入することが必要であり、コストや工程の観点からスケールアップ適性が乏しかった。本発明のＡＡＶ産生細胞を用いることによって、遺伝子導入のコストや工程を抑えることができ、治療に必要とされる大量のＡＡＶを作製することが可能になる。
本明細書において、プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させることができ、コード配列又は非コード配列の転写開始に関与するＤＮＡ制御領域／配列を意味する。
本明細書において、ベクターとは、外来遺伝物質を別の細胞に人為的に運ぶために利用されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。導入したい外来遺伝物質を含むベクターが細胞内に導入されると、細胞内において外来遺伝物質の複製及び／又は発現が行われる。ベクターとしては、エピソーム性（例えばプラスミド）ベクター、及び非エピソーム性ベクターが挙げられる。ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、細胞融合及びリポフェクションなどの方法により、宿主細胞に導入することができる。
本明細書において、ある遺伝子が天然に保持するプロモーターとは、人工的ではなく、天然状態においてその遺伝子を発現させることが知られているプロモーターを意味する。
本明細書において、ある遺伝子が天然に保持するプロモーターとは、人工的ではなく、天然状態においてその遺伝子を発現させることが知られているプロモーターを意味する。
（第一のベクター）
第一のベクターは、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含み、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある。
第一のベクターは、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含み、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある。
発現調節可能なプロモーターとしては、刺激の有無により発現のオンとオフを調節できるプロモーターを使用することができる。刺激としては、化学的刺激(内在性ホルモン・ストレス応答、ラクトース、テトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）、クミン酸、タンパク質（ラパマイシン、ＦＫＣｓＡ、アブシシン酸（ＡＢＡ）など）、タモキシフェン／Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ（タモキシフェンにより活性化を誘導できるように改変したＣｒｅプロモーターを使用する系）、リボスイッチ)、物理的刺激(青色光、熱)などを挙げることができるが、特に限定されない。
好ましくは、第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターが、薬剤により発現調節可能なプロモーターである。薬剤としては、好ましくはテトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）である。
発現調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン応答性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。具体的なテトラサイクリン応答性プロモーターには、Ｔｅｔオン／オフシステム（ＴＥＴ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）が挙げられる。
特に好ましくは、第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンにより発現調節可能なプロモーターであるＴｅｔオン／オフシステムであって、最も好ましくは、Ｔｅｔオンシステムである。プロモーターは特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｈ１プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）、Ｕ６プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）などを挙げることができる。
ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子発現調節用のＴｅｔオンシステムに用いるプロモーターとしてはＨ１プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）であってもよい。
特に好ましくは、第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンにより発現調節可能なプロモーターであるＴｅｔオン／オフシステムであって、最も好ましくは、Ｔｅｔオンシステムである。プロモーターは特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｈ１プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）、Ｕ６プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）などを挙げることができる。
ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子発現調節用のＴｅｔオンシステムに用いるプロモーターとしてはＨ１プロモーター（ＲＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅIIIプロモーター）であってもよい。
Ｔｅｔオンシステムにおいては、プロモーターは、少なくとも一つのＴｅｔオペロンを付加的に含む。Ｔｅｔオペロン（テトラサイクリン制御転写活性化）を使用することにより、抗生物質であるテトラサイクリン又はその誘導体のうちの一つ（例えば、ドキシサイクリン）の存在下において転写のオン又はオフを可逆的に切り替えることができる。細胞内に存在するＴｅｔリプレッサータンパク質は、プロモーターへと導入されるＴｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列に結合することによって発現を遮断する。したがって、ＴｅｔリプレッサーがＴｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列と結合している場合には、遺伝子発現は見られない。テトラサイクリン又はドキシサイクリンを添加すると、Ｔｅｔリプレッサーは隔離されてプロモーター活性を可能とし、遺伝子発現がオンにされる。Ｔｅｔオペロン系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ（商標）４／ＴＯ哺乳動物発現ベクターにおいて使用されるＴｅｔオペロンなど、広く入手可能である。
Ｔｅｔオンシステムにおいて、Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現を調節したいプロモーターの上流にあっても下流にあってもよい。発現をオフにしたときの発現漏れを減らすという点において、Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現調節可能なプロモーターの下流にあることが好ましい。
Ｔｅｔオンシステムにおいて、Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現を調節したいプロモーターの上流にあっても下流にあってもよい。発現をオフにしたときの発現漏れを減らすという点において、Ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現調節可能なプロモーターの下流にあることが好ましい。
ウイルスヘルパー遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングを可能にするための非アデノ随伴ウイルス遺伝子である。ウイルスヘルパー遺伝子としては、アデノ随伴ウイルス以外の他種ウイルスに由来する遺伝子が使用される。ウイルスヘルパー遺伝子の具体例としては、アデノウイルス又はヘルペスウイルスに由来するウイルスヘルパー遺伝子を挙げることができ、好ましくは、ウイルスヘルパー遺伝子は、アデノウイルス由来である。
アデノウイルスとは、アデノウイルス科のファミリーの、二本鎖ＤＮＡを含む二十面体ヌクレオカプシドを有する非エンベロープ型ウイルスを指す。５０超のアデノウイルスのサブタイプがヒトから単離され、多くの更なるサブタイプが他の哺乳動物及び鳥類から単離されている。これらのサブタイプは、アデノウイルス科のファミリーに属し、２つの属（すなわちマストアデノウイルス属及びアビアデノウイルス属）に分類されている。これらのアデノウイルスは、形態学的及び構造的に類似している。しかしながら、ヒトにおいて、アデノウイルスは、異なる免疫学的特性を示し、すなわち血清型に分類される。アデノウイルスの２つのヒト血清型（すなわちＡｄ２及びＡｄ５）が重点的に研究されている。
アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングに関与する遺伝子である。アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子としては、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子などを挙げることができる。
好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
より好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
Ｅ４遺伝子は、好ましくは、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子である。
ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は、好ましくは、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である。
好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
より好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
Ｅ４遺伝子は、好ましくは、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子である。
ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は、好ましくは、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である。
アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子など）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り，野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。
野生型のウイルスヘルパー遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～３個である。改変を加えたウイルスヘルパー遺伝子の塩基配列は、野生型のウイルスヘルパー遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し、更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。
第一のベクターが、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を含む場合、その配置は特に限定されず、Ｅ４遺伝子は、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子の上流に位置してもよいし、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子の下流に位置してもよいが、好ましくは、Ｅ４遺伝子は、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子の上流に位置する。
第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、発現調節可能なプロモーターの制御下にある。
第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ２遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にないことが好ましい。
第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にある。
第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ２遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にないことが好ましい。
第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子のみが発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にある。
第一のベクターとしては核酸を含むものであれば限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、ウイルスベクター、人工的に設計した核酸を有するベクターなどどを使用することができ、好ましくは、プラスミドベクターである。
（第二のベクター）
第二のベクターは、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含み、上記のアデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない。
第二のベクターは、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含み、上記のアデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科及びディペンドパルボウイルス属のファミリーの、一本鎖ＤＮＡを含む、小型の、複製能の不完全な、非エンベロープ型ウイルスを指す。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型２（ＡＡＶ２）は古くから広く研究されてきた血清型の一つであり、宿主域が非常に広いことが知られている。血清型１（ＡＡＶ１）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）は、より高い組織指向性を持った血清型である。ＡＡＶ１は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、ＡＡＶ５は中枢神経系、肝臓、網膜等、ＡＡＶ６は心臓、筋肉、肝臓等への遺伝子導入効率が高いと言われている。本発明は血清型２または血清型５で用いることが好ましい。特に好ましくは血清型５である。
アデノ随伴ウイルス遺伝子とは、一つ又は複数のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する一つ又は複数の核酸配列から構成される遺伝子を指す。アデノ随伴ウイルス遺伝子は、好ましくは、ＡＡＶの複製及びパッケージングに関与する遺伝子、及びＡＡＶ構成タンパク質をコードする遺伝子である。
好ましくは、第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子のうちのいずれか一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない。
好ましくは、第二のベクターにおいて、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子のいずれか一つが、プロモーターの制御下にあり、より好ましくはアデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある。
好ましくは、第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が発現調節プロモーターの制御下になく、より好ましくは、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある。
ｒｅｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ５及びｐ１９プロモーターを挙げることができる。ｃａｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ４０プロモーターを挙げることができる。
好ましくは、第二のベクターにおいて、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子のいずれか一つが、プロモーターの制御下にあり、より好ましくはアデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある。
好ましくは、第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が発現調節プロモーターの制御下になく、より好ましくは、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある。
ｒｅｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ５及びｐ１９プロモーターを挙げることができる。ｃａｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ４０プロモーターを挙げることができる。
好ましくは、第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である。
アデノ随伴ウイルス遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子など）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り，野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。
野生型のアデノ随伴ウイルス遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子など）に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。改変を加えたアデノ随伴ウイルス遺伝子の塩基配列は、野生型のアデノ随伴ウイルス遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し，更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。
第二のベクターが、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む場合、その配置は特に限定されず、ｒｅｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子の上流に位置してもよいし、ｃａｐ遺伝子の下流に位置してもよいが、好ましくは、ｒｅｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子の上流に位置する。
ｒｅｐ遺伝子は、当業者に公知の、ウイルスゲノムの複製に集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質、又は、例えばヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）ｒｅｐ遺伝子など（ＡＡＶ－２ ＤＮＡ複製を媒介することが公知）の、その機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。したがって、ｒｅｐ遺伝子のコード領域は少なくとも、ＡＡＶのＲＥＰ７８及びＲＥＰ６８（「長い形態のＲＥＰタンパク質」）並びにＲＥＰ５２及びＲＥＰ４０（「短い形態のＲＥＰタンパク質」）をコードする遺伝子又はその機能的ホモログを含む。本発明で用いられるｒｅｐ遺伝子のコード領域は、いかなるＡＡＶ血清型に由来するものでもよいが、ＡＡＶ２に由来するものが好ましい。ＡＡＶ２に由来するものとしては、ＲＥＰ７８及びＲＥＰ６８並びにＲＥＰ５２及びＲＥＰ４０、ＩＴＲが挙げられる。
ｃａｐ遺伝子は、当業者に公知のウイルスのカプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノム中の領域を意味する。これらのカプシドタンパク質の例は、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３である。本発明において使用するｃａｐ遺伝子は、いかなるＡＡＶ血清型に由来するものでもよいが、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ５に由来するものが好ましい。特に好ましくはＡＡＶ５である。
好ましくは、第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である。
第二のベクターとしては核酸を含むものであれば限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、ウイルスベクター、人工的に設計した核酸を有するベクターなどどを使用することができ、好ましくは、プラスミドベクターである。
＜統合ベクター＞
本発明はさらに、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを連結した状態で有する、統合ベクターに関する。連結した状態とは、直接もしくは別の配列で間接的につながっている状態を指す。第一のベクターまたは第二のベクターが環状であるときには、ベクターの配列の一部を切断することで、直鎖状にし、連結したものを統合ベクターとすることができる。
本発明の統合ベクターとしては、実施例で使用した図１１に構造を示すＳｅｑ４３のように全塩基配列を合成したものでもよい。図１１に示すベクターにおいてはＥ４遺伝子とその上流のプロモータ及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子とその上流のプロモーターが第一のベクターに対応し、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子とその上流のプロモーター第二ベクターに対応し、図１１に示す統合ベクターにおいては、第一のベクターと第二ベクターとが連結した状態で存在している。
本発明はさらに、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを連結した状態で有する、統合ベクターに関する。連結した状態とは、直接もしくは別の配列で間接的につながっている状態を指す。第一のベクターまたは第二のベクターが環状であるときには、ベクターの配列の一部を切断することで、直鎖状にし、連結したものを統合ベクターとすることができる。
本発明の統合ベクターとしては、実施例で使用した図１１に構造を示すＳｅｑ４３のように全塩基配列を合成したものでもよい。図１１に示すベクターにおいてはＥ４遺伝子とその上流のプロモータ及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子とその上流のプロモーターが第一のベクターに対応し、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子とその上流のプロモーター第二ベクターに対応し、図１１に示す統合ベクターにおいては、第一のベクターと第二ベクターとが連結した状態で存在している。
統合ベクターとしては核酸を含むものであれば限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、ウイルスベクターなどを使用することができ、好ましくは、プラスミドベクターである。
統合ベクターにおける第一のベクター及び第二のベクターの構成は、本明細書中において上記の＜キット＞において説明した通りである。
統合ベクターにおける第一のベクター及び第二のベクターの構成は、本明細書中において上記の＜キット＞において説明した通りである。
本発明の統合ベクターは、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターを更に有していてもよい。第三のベクターが環状であるときには、ベクターの配列の一部を切断することで、直鎖状にし、連結したものを統合ベクターとすることができる。
第三のベクターは、所望の治療又は予防用遺伝子を含むベクターである。
第三のベクターは、所望の治療又は予防用遺伝子を含むベクターである。
治療又は予防用遺伝子としては、標的細胞のゲノムにおいては不完全であるか又は失われている遺伝子、または、所望の生物学的又は治療的効果（例えば抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする遺伝子などを使用することができるが、特に限定されない。治療又は予防用遺伝子の具体例としては、炎症性疾患、自己免疫、慢性及び伝染性疾患（ＡＩＤＳ、癌、神経系疾患、心血管疾患、過剰コレスタ血症などの障害を含む）、貧血及び血友病などの各種の血液疾患、遺伝子欠損（例えば嚢胞性線維形成、ゴーシェ疾患、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、気腫など）の治療又は予防のために使用される遺伝子が挙げられる。
治療又は予防用遺伝子としては、がんに対する、及びウイルス疾患に対するアンチセンス療法において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）周辺の配列に対する相補的短鎖オリゴヌクレオチド）でもよい。
第三のベクターは、治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターを含んでいてもよい。治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどを挙げることができる。治療又は予防用遺伝子および遺伝子を発現させるためのプロモーターはＩＴＲ配列に挟まれていることが好ましい。
第三のベクターとしては核酸を含むものであれば限定されるものではないが、例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスなどを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。
第三のベクターとしては核酸を含むものであれば限定されるものではないが、例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスなどを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。
＜細胞＞
本発明は、上記した第一のベクターと第二のベクターとを有する細胞に関する。本発明はさらに、上記した統合ベクターを有する細胞に関する。本発明はさらに、第一のベクターと第二のベクターと第三のベクターを有する細胞に関する。
本発明は、上記した第一のベクターと第二のベクターとを有する細胞に関する。本発明はさらに、上記した統合ベクターを有する細胞に関する。本発明はさらに、第一のベクターと第二のベクターと第三のベクターを有する細胞に関する。
細胞は、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。好ましくはヒト細胞を使用することができる。細胞の例としては、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞であって、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞である。
本発明の細胞は、好ましくは、第一のベクターと第二のベクターとを、又は統合ベクターを有している。また、好ましくは第一のベクターと第二のベクターと第三のベクターを染色体に有している。染色体中に有するとは、ベクターの全長もしくは一部が染色体に組み込まれていることを意味する。染色体に組み込まれていることは、ゲノムシークエンス解析を行い、ベクター中の配列がホストゲノムと結合していることによって確認できる。ベクターが染色体に組み込まれていることにより、アデノ随伴ウイルスの産生に必要な遺伝子は細胞内に恒常的に維持されることになり、アデノ随伴ウイルスを任意のタイミングで産生することが可能となる。
本発明の細胞は、第一のベクターと第二のベクター、統合ベクター、または第一のベクターと第二のベクターと第三のベクターとを細胞内に取り込んだ後、１週間以上、前記導入されたベクターのうちのアデノ随伴ウイルスの産生に必要な遺伝子を細胞内に保持することができる。そのため、前記ベクターを導入した細胞を１週間以上培養した後、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能となる。好ましくは、２週間以上培養した後に、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能であり、更に好ましくは１か月以上培養した後に、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能である。
本発明の細胞は、第一のベクターと第二のベクター、統合ベクター、または第一のベクターと第二のベクターと第三のベクターとを細胞内に取り込んだ後、１週間以上、前記導入されたベクターのうちのアデノ随伴ウイルスの産生に必要な遺伝子を細胞内に保持することができる。そのため、前記ベクターを導入した細胞を１週間以上培養した後、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能となる。好ましくは、２週間以上培養した後に、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能であり、更に好ましくは１か月以上培養した後に、アデノ随伴ベクターを産生させることが可能である。
＜アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法＞
本発明によれば、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法が提供される。更に第三のベクターを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法が提供される。第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターの構成は、本明細書中において上記の＜キット＞において説明した通りである。第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターが、発現されるように導入されていればよいが、永続的な発現となることがより好ましい。永続的な発現とは、細胞が***した場合に、第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターも複製され、***後の細胞も第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターを有することになることをいう。永続的な発現は、ベクターが細胞の染色体の中に組み込まれることや細胞質内で複製する能力をもつベクターを用いることによって行うことができる。
本発明によれば、１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法が提供される。更に第三のベクターを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法が提供される。第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターの構成は、本明細書中において上記の＜キット＞において説明した通りである。第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターが、発現されるように導入されていればよいが、永続的な発現となることがより好ましい。永続的な発現とは、細胞が***した場合に、第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターも複製され、***後の細胞も第一のベクター、第二のベクター及び第三のベクターを有することになることをいう。永続的な発現は、ベクターが細胞の染色体の中に組み込まれることや細胞質内で複製する能力をもつベクターを用いることによって行うことができる。
第一のベクター及び第二のベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、リポフェクションなどの方法により、細胞に導入することができる。
トランスフェクションとは、化学的手段（例えば、リン酸カルシウム仲介沈殿）、機械的手段（例えば、エレクトロポレーション）または物理的手段（例えば、生体弾（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）による送達）によって真核細胞の膜を横断して核酸を細胞に導入することをいう。
トランスダクションとは、ウイルス由来のベクターを介して、真核細胞の膜を横断して、核酸を細胞に導入することをいう。
リポフェクションとは、電気的な相互作用によりベクターと陽性荷電脂質などとの複合体を形成させ、エンドサイトーシスや膜融合により、核酸を細胞に導入することをいう。
トランスフェクションとは、化学的手段（例えば、リン酸カルシウム仲介沈殿）、機械的手段（例えば、エレクトロポレーション）または物理的手段（例えば、生体弾（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）による送達）によって真核細胞の膜を横断して核酸を細胞に導入することをいう。
トランスダクションとは、ウイルス由来のベクターを介して、真核細胞の膜を横断して、核酸を細胞に導入することをいう。
リポフェクションとは、電気的な相互作用によりベクターと陽性荷電脂質などとの複合体を形成させ、エンドサイトーシスや膜融合により、核酸を細胞に導入することをいう。
＜アデノ随伴ウイルスの製造方法＞
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法の一例としては、
１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターと、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターとを含む細胞を培養する工程と、
上記発現調節可能なプロモーターを作動させることによって、発現調節可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子を発現させる工程と、
を含む方法が挙げられる。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法の一例としては、
１以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、上記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、上記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターと、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターとを含む細胞を培養する工程と、
上記発現調節可能なプロモーターを作動させることによって、発現調節可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子を発現させる工程と、
を含む方法が挙げられる。
第一のベクター、第二のベクター、及び第三のベクターの構成については、本明細書中において上記した通りである。細胞についても、本明細書中において上記した通りである。
発現調節可能なプロモーターを作動させるためには、例えば、刺激により発現のオン及びオフを調節することが可能なプロモーターを使用する場合には、刺激を付与すること、又は刺激を除外することにより、発現をオン及びオフに調節することができる。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法の別の例としては、
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子の一部を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子、上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないアデノ随伴ウイルス遺伝子、及び、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子の一部を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子、上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないアデノ随伴ウイルス遺伝子、及び、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子、アデノ随伴ウイルス遺伝子、及び治療又は予防用遺伝子の詳細については本明細書中において上記した通りである。また、遺伝子を細胞に導入する方法についても 本明細書中において上記した通りである。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｃａｐ遺伝子であって、より好ましくは、第三の工程で更に治療又は予防用遺伝子が導入される。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法のさらに別の例としては、
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子を、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子、アデノ随伴ウイルス遺伝子、及び治療又は予防用遺伝子の詳細については本明細書中において上記した通りである。また、核遺伝子を細胞に導入する方法についても 本明細書中において上記した通りである。
第二の工程では細胞の倍化時間は、２００時間以内であればよく、１００時間以内であれば好ましく、５０時間以内であればより好ましく、３０時間以内であれば特に好ましい。
第二の工程では細胞生存率は６５％以上であればよく、８０％以上が好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
第二の工程では細胞の倍化時間は、２００時間以内であればよく、１００時間以内であれば好ましく、５０時間以内であればより好ましく、３０時間以内であれば特に好ましい。
第二の工程では細胞生存率は６５％以上であればよく、８０％以上が好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法のさらに別の例としては、
アデノ随伴ウイルス遺伝子を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
ウイルスヘルパー遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
アデノ随伴ウイルス遺伝子を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
ウイルスヘルパー遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子、アデノ随伴ウイルス遺伝子、及び治療又は予防用遺伝子の詳細については本明細書中において上記した通りである。また、核遺伝子を細胞に導入する方法についても 本明細書中において上記した通りである。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法のさらに別の例としては、
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子と、アデノ随伴ウイルス遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
上記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子と、アデノ随伴ウイルス遺伝子とを、上記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む方法が挙げられる。
ウイルスヘルパー遺伝子、アデノ随伴ウイルス遺伝子、及び治療又は予防用遺伝子の詳細については本明細書中において上記した通りである。また、核遺伝子を細胞に導入する方法についても 本明細書中において上記した通りである。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である。
好ましくは、第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である。
本発明によるアデノ随伴ウイルスの製造方法における細胞の培養は、細胞の培養のための通常の条件において行うことができる。使用する培地、及び培養条件は、当業者であれば適宜選択することができる。培地としては、Ｅｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）などを使用することができるが、特に限定されない。
培養温度は、一般的には２５℃～４５℃であり、好ましくは３０℃～４２℃であり、より好ましくは３５℃～４０℃であり、一例としては３７℃である。
ＣＯ２濃度は、一般的には３～１０％ＣＯ２であり、好ましくは５～１０％ＣＯ２であり、一例としては８％ＣＯ２である。
ＣＯ２濃度は、一般的には３～１０％ＣＯ２であり、好ましくは５～１０％ＣＯ２であり、一例としては８％ＣＯ２である。
細胞は、任意の体積の培地において培養することができ、例えば、１ｍＬから２０００Ｌの培地において細胞を培養することができ、好ましくは１Ｌ～２０００Ｌであり、５０Ｌ～２０００Ｌがより好ましく、５００Ｌ～２０００Ｌが特に好ましい。
培養は振盪攪拌しながら行ってもよい。振盪攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。
攪拌培養は、リアクター内のプロペラ等による回転攪拌培養であっても良い。回転攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。また、波型振盪撹拌や、撹拌翼の上下動によって撹拌してもよいが、特に限定されない。
各工程における培養時間は、特に限定されないが、一般的には６時間～１４日間であり、好ましくは１２時間～７日間であり、より好ましくは２４時間～１４４時間であり、さらに好ましくは２４時間～９６時間である。
培養は振盪攪拌しながら行ってもよい。振盪攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。
攪拌培養は、リアクター内のプロペラ等による回転攪拌培養であっても良い。回転攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。また、波型振盪撹拌や、撹拌翼の上下動によって撹拌してもよいが、特に限定されない。
各工程における培養時間は、特に限定されないが、一般的には６時間～１４日間であり、好ましくは１２時間～７日間であり、より好ましくは２４時間～１４４時間であり、さらに好ましくは２４時間～９６時間である。
製造されたアデノ随伴ウイルスの力価は、当業者に公知の通常の方法により測定することができる。例えば、培養後の細胞培養液を回収し、凍結融解にて細胞を破砕した後、遠心分離によって上清を回収する。回収した上清にＭｇＣｌ２及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加して反応を行うことにより、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化することができる。上記により得られたアデノ随伴ウイルスを含むサンプルを、ｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）サンプルとして使用し、ｄｄＰＣＲを行うことによりＡＡＶの力価を測定することが可能である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
[材料及び方法]
＜細胞培養＞
浮遊化ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒ７９００７）を１２ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、１２５ｍＬ振とうフラスコで２４時間培養した。培養液は１２０ｒｐｍで一定に攪拌しながら、３７℃、８％ＣＯ２ 条件下でインキュベートを行った。
＜細胞培養＞
浮遊化ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒ７９００７）を１２ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、１２５ｍＬ振とうフラスコで２４時間培養した。培養液は１２０ｒｐｍで一定に攪拌しながら、３７℃、８％ＣＯ２ 条件下でインキュベートを行った。
＜プラスミド＞
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＡＶ５）（タカラバイオ，６６５０）を使用した（Ｓｅｑ１、Ｓｅｑ２、Ｓｅｑ１６）。
使用したプラスミド（Ｓｅｑ１～Ｓｅｑ１６、Ｓｅｑ２０～Ｓｅｑ２３）の全体配列を、配列表の配列番号１～１６、２０～２３に示す。
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＡＶ５）（タカラバイオ，６６５０）を使用した（Ｓｅｑ１、Ｓｅｑ２、Ｓｅｑ１６）。
使用したプラスミド（Ｓｅｑ１～Ｓｅｑ１６、Ｓｅｑ２０～Ｓｅｑ２３）の全体配列を、配列表の配列番号１～１６、２０～２３に示す。
ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）には、ベクター配列として、ｐＡＡＶ-ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒ（ｓｅｑ１６）とｐＲＣ５ Ｖｅｃｔｏｒ（ｓｅｑ２）とｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（ｓｅｑ１）を含んでいる。
ｐＲＣ５ Ｖｅｃｔｏｒ：ＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子を含むプラスミド
ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ：アデノウイルス由来のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド
ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ：アデノウイルス由来のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド
ｓｅｑ１（Ｅ２、Ｅ４、ＶＡ－ＲＮＡ）：ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キットに入っているｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ、アデノウイルス由来のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド
ｓｅｑ２（ＲＥＰ、ＣＡＰ）：ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キットに入っているｐＲＣ Ｖｅｃｔｏｒ、ＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子を含むプラスミド
ｓｅｑ３（ΔＲＥＰ）：ｓｅｑ２を元にｒｅｐ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ４（ΔＣＡＰ）：ｓｅｑ２を元にｃａｐ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ５（ΔＥ２）：ｓｅｑ１を元にＥ２遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ６（ΔＥ４）：ｓｅｑ１を元にＥ４遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ７（ΔＶＡ－ＲＮＡ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ８（ＲＥＰ）：ｓｅｑ４と同一の配列である。
ｓｅｑ９（ＣＡＰ）：ｓｅｑ３と同一の配列である。
ｓｅｑ１０（Ｅ２）：Ｅ２遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１１（Ｅ４）：Ｅ４遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１２（ＶＡ－ＲＮＡ）：ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１３（Ｅ４ＯＲＦ６）：ＰＣＲによりＥ４ＯＲＦ６遺伝子の領域を増幅し、ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｎｅｏベクター（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＡｐａＩ／ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミド。
ｓｅｑ１４（ＶＡ－Ｉ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡIII遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ１５（ＶＡ－ＩＩ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ１６：ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キットに入っているｐＡＡＶ-ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＭＶプロモーターとその下流に目的遺伝子を挿入するためのＭＣＳ、および２つのＩＴＲを含むベクタープラスミド。
ｓｅｑ２０（ｅｍｐｔｙ）：ｓｅｑ１を元にＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ２１（Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ）：Ｈ１プロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター）とＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子をつないだ配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩは、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター下流にＴｅｔオペレーター配列を組み込んだ構造になっている。
ｓｅｑ２２（Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ）：Ｕ６プロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター）とＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子をつないだ配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩは、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター上流にＴｅｔオペレーター配列を組み込んだ構造になっている。
ｓｅｑ２３（ｔＴＳ）：合成したテトラサイクリン調節性の転写サイレンサー（ｔＴＳ）遺伝子をｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ ＨｙｇベクターのＣｌａＩ－ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ３８（Ｓｗｉｔｃｈ―Ｅ４ＯＲＦ６―Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ―ｔＴＳ）：合成したＥ４ＯＲＦ６遺伝子配列をコードしたプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）に対して、ＰＣＲで増幅したＳｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ、ｔＴＳを挿入した。
Ｓｅｑ３９（ｎＲＣｐ５）：ｐＲＣ５ Ｖｅｃｔｏｒ（ｓｅｑ２）をＢｓｐ１４０７１/ＢｇｌIIで制限酵素処理し、ｒｅｐ－ｃａｐ断片を作製した。ｒｅｐ－ｃａｐ断片をＡＡＶＳ１ Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ ｃＤＮＡ/ｍｉＲＮＡ Ｄｏｎｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ （ｐＡＡＶＳ１Ｄ－ＰＧＫ.ＭＳＣ－Ｅｆ１α.ｃｏｐＧＦＰｐｕｒｏ）（ＳＢＩ社、ＧＥ６０３Ａ－１）のＢｓｐ１４０７１/ＢｇｌIIサイト間に交換し、ライゲーションにより再環状化し、ｒｅｐ－ｃａｐノックイン用プラスミド。
Ｓｅｑ４０（ｐ５ＲＣｐ５）：合成したp5プロモーター配列をＳｅｑ３９に挿入したプラスミド。ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の前後にｐ５プロモーター配列を有する。
Ｓｅｑ４１（Ｅ２－ＧＯＩ）：Ｅ２遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれたGFP遺伝子およびｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列を持つ遺伝子配列を合成しｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ４２：ｐｉｇｇｙＢａｃ トランスポザーゼ遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ４３（ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ）：合成によって作製したＲＥＰ遺伝子、ＣＡＰ遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｓｗｉｔｃｈ―Ｅ４ＯＲＦ６、Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ、ｔＴＳを組み込んだプラスミド。ｓｅｑ４３のプラスミドマップを図１１に示す。
ｓｅｑ２（ＲＥＰ、ＣＡＰ）：ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キットに入っているｐＲＣ Ｖｅｃｔｏｒ、ＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子を含むプラスミド
ｓｅｑ３（ΔＲＥＰ）：ｓｅｑ２を元にｒｅｐ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ４（ΔＣＡＰ）：ｓｅｑ２を元にｃａｐ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ５（ΔＥ２）：ｓｅｑ１を元にＥ２遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ６（ΔＥ４）：ｓｅｑ１を元にＥ４遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ７（ΔＶＡ－ＲＮＡ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ８（ＲＥＰ）：ｓｅｑ４と同一の配列である。
ｓｅｑ９（ＣＡＰ）：ｓｅｑ３と同一の配列である。
ｓｅｑ１０（Ｅ２）：Ｅ２遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１１（Ｅ４）：Ｅ４遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１２（ＶＡ－ＲＮＡ）：ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
ｓｅｑ１３（Ｅ４ＯＲＦ６）：ＰＣＲによりＥ４ＯＲＦ６遺伝子の領域を増幅し、ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｎｅｏベクター（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＡｐａＩ／ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミド。
ｓｅｑ１４（ＶＡ－Ｉ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡIII遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ１５（ＶＡ－ＩＩ）：ｓｅｑ１を元にＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ１６：ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キットに入っているｐＡＡＶ-ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＭＶプロモーターとその下流に目的遺伝子を挿入するためのＭＣＳ、および２つのＩＴＲを含むベクタープラスミド。
ｓｅｑ２０（ｅｍｐｔｙ）：ｓｅｑ１を元にＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子コード領域をインバースＰＣＲによって除去し、セルフライゲーションにより、再環状化したプラスミド。
ｓｅｑ２１（Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ）：Ｈ１プロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター）とＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子をつないだ配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩは、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター下流にＴｅｔオペレーター配列を組み込んだ構造になっている。
ｓｅｑ２２（Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ）：Ｕ６プロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター）とＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子をつないだ配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩは、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ IIIプロモーター上流にＴｅｔオペレーター配列を組み込んだ構造になっている。
ｓｅｑ２３（ｔＴＳ）：合成したテトラサイクリン調節性の転写サイレンサー（ｔＴＳ）遺伝子をｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ ＨｙｇベクターのＣｌａＩ－ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ３８（Ｓｗｉｔｃｈ―Ｅ４ＯＲＦ６―Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ―ｔＴＳ）：合成したＥ４ＯＲＦ６遺伝子配列をコードしたプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）に対して、ＰＣＲで増幅したＳｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ、ｔＴＳを挿入した。
Ｓｅｑ３９（ｎＲＣｐ５）：ｐＲＣ５ Ｖｅｃｔｏｒ（ｓｅｑ２）をＢｓｐ１４０７１/ＢｇｌIIで制限酵素処理し、ｒｅｐ－ｃａｐ断片を作製した。ｒｅｐ－ｃａｐ断片をＡＡＶＳ１ Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ ｃＤＮＡ/ｍｉＲＮＡ Ｄｏｎｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ （ｐＡＡＶＳ１Ｄ－ＰＧＫ.ＭＳＣ－Ｅｆ１α.ｃｏｐＧＦＰｐｕｒｏ）（ＳＢＩ社、ＧＥ６０３Ａ－１）のＢｓｐ１４０７１/ＢｇｌIIサイト間に交換し、ライゲーションにより再環状化し、ｒｅｐ－ｃａｐノックイン用プラスミド。
Ｓｅｑ４０（ｐ５ＲＣｐ５）：合成したp5プロモーター配列をＳｅｑ３９に挿入したプラスミド。ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の前後にｐ５プロモーター配列を有する。
Ｓｅｑ４１（Ｅ２－ＧＯＩ）：Ｅ２遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれたGFP遺伝子およびｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列を持つ遺伝子配列を合成しｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ４２：ｐｉｇｇｙＢａｃ トランスポザーゼ遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。
Ｓｅｑ４３（ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ）：合成によって作製したＲＥＰ遺伝子、ＣＡＰ遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｓｗｉｔｃｈ―Ｅ４ＯＲＦ６、Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ、ｔＴＳを組み込んだプラスミド。ｓｅｑ４３のプラスミドマップを図１１に示す。
＜ＰＣＲ反応によるプラスミド作製＞
鋳型１０ｐｇ ＤＮＡに対して、終濃度０．２μｍｏｌ／Ｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ２、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（１×）を混合し、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）で総量５０μＬに調製した。前述のプラスミド作製に使用したｐｒｉｍｅｒ１およびｐｒｉｍｅｒ２を以下に示す。ｓｅｑ２４～ｓｅｑ３７の塩基配列を、配列表の配列番号２４～３７に示す。
ｓｅｑ３とｓｅｑ４をインバースＰＣＲで作成するのには、鋳型としてｓｅｑ２のプラスミドを用い、ｓｅｑ５～７、ｓｅｑ１４、ｓｅｑ１５、ｓｅｑ２０をインバースＰＣＲで作成するのには鋳型として、ｓｅｑ１を用いた。以下に（作成したプラスミド）：（インバースＰＣＲで用いたプライマーセット）を示す。
ｓｅｑ３：ｓｅｑ２４およびｓｅｑ２５
ｓｅｑ４：ｓｅｑ２６およびｓｅｑ２７
ｓｅｑ５：ｓｅｑ２８およびｓｅｑ２９
ｓｅｑ６：ｓｅｑ３０およびｓｅｑ３１
ｓｅｑ７：ｓｅｑ３２およびｓｅｑ３３
ｓｅｑ１４：ｓｅｑ３４およびｓｅｑ３５
ｓｅｑ１５：ｓｅｑ３６およびｓｅｑ３７
ｓｅｑ２０：ｓｅｑ２９およびｓｅｑ３２
鋳型１０ｐｇ ＤＮＡに対して、終濃度０．２μｍｏｌ／Ｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ２、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（１×）を混合し、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）で総量５０μＬに調製した。前述のプラスミド作製に使用したｐｒｉｍｅｒ１およびｐｒｉｍｅｒ２を以下に示す。ｓｅｑ２４～ｓｅｑ３７の塩基配列を、配列表の配列番号２４～３７に示す。
ｓｅｑ３とｓｅｑ４をインバースＰＣＲで作成するのには、鋳型としてｓｅｑ２のプラスミドを用い、ｓｅｑ５～７、ｓｅｑ１４、ｓｅｑ１５、ｓｅｑ２０をインバースＰＣＲで作成するのには鋳型として、ｓｅｑ１を用いた。以下に（作成したプラスミド）：（インバースＰＣＲで用いたプライマーセット）を示す。
ｓｅｑ３：ｓｅｑ２４およびｓｅｑ２５
ｓｅｑ４：ｓｅｑ２６およびｓｅｑ２７
ｓｅｑ５：ｓｅｑ２８およびｓｅｑ２９
ｓｅｑ６：ｓｅｑ３０およびｓｅｑ３１
ｓｅｑ７：ｓｅｑ３２およびｓｅｑ３３
ｓｅｑ１４：ｓｅｑ３４およびｓｅｑ３５
ｓｅｑ１５：ｓｅｑ３６およびｓｅｑ３７
ｓｅｑ２０：ｓｅｑ２９およびｓｅｑ３２
調製したサンプルを、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、 ７２℃で５秒／ｋｂｐで３０サイクル反応させた。反応物を制限酵素ＮｏｔＩ（東洋紡, ＮＯＴ－１１１Ｘ）で切断後、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ, ２０１１Ａ）によって環状化したプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ（タカラバイオ, ９１２８）によって増幅した。
＜遺伝子導入方法および細胞障害評価＞
１．８ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡＳ， １１５－００１５）３６μＬと、後記する組み合わせのプラスミドを等量混合し総量１８μｇを懸濁し、１５分間静置した。その後、前日に細胞濃度１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した培養細胞（培養液量は１２ｍＬ）に、上記試薬を添加し、３７℃、８％ＣＯ２条件下でインキュベートを行った。
導入細胞の障害性は、遺伝子導入後ｄａｙ４、ｄａｙ７、ｄａｙ１１においてｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色による細胞の生存率によって評価を実施した。障害細胞率（％）＝１００－（細胞の生存率）で算出を行った。
１．８ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡＳ， １１５－００１５）３６μＬと、後記する組み合わせのプラスミドを等量混合し総量１８μｇを懸濁し、１５分間静置した。その後、前日に細胞濃度１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した培養細胞（培養液量は１２ｍＬ）に、上記試薬を添加し、３７℃、８％ＣＯ２条件下でインキュベートを行った。
導入細胞の障害性は、遺伝子導入後ｄａｙ４、ｄａｙ７、ｄａｙ１１においてｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色による細胞の生存率によって評価を実施した。障害細胞率（％）＝１００－（細胞の生存率）で算出を行った。
＜Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ＞
細胞を遠心分離により回収し、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒで溶解した。細胞溶液にＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ナカライ，０９４９９－１４）を添加し、１００℃で５分間加熱してサンプルを調製した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動装置（アトー，２３２１６７０）を用いてサンプル中のタンパク質をサイズ分離後、セミドライブロッティング装置（アトー，２３２２４９０）を用いてメンブレンに転写を行った。転写後のメンブレンはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク，０３９５３－９５）を用いて３０分間ブロッキング後、ブロッキング溶液で７０倍に希釈した抗ＲＥＰ抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カプシドの構造タンパク質に反応する抗ＶＰ抗体（ＰＲＯＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）、抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ）で常温、３時間反応させた。次に、二次抗体としてブロッキング溶液で１０,０００倍に希釈したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｃｙｔｉｖａ）を常温、２時間反応後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３４０９５）によりＲＥＰタンパク質およびカプシドの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を検出した。撮影にはＷＳＥ－６１００ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈＩ（アトー，２００６１００）を用いた。取得画像の解析にはＩｍａｇｅＪを用いて定量評価を実施した。
細胞を遠心分離により回収し、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒで溶解した。細胞溶液にＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ナカライ，０９４９９－１４）を添加し、１００℃で５分間加熱してサンプルを調製した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動装置（アトー，２３２１６７０）を用いてサンプル中のタンパク質をサイズ分離後、セミドライブロッティング装置（アトー，２３２２４９０）を用いてメンブレンに転写を行った。転写後のメンブレンはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク，０３９５３－９５）を用いて３０分間ブロッキング後、ブロッキング溶液で７０倍に希釈した抗ＲＥＰ抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カプシドの構造タンパク質に反応する抗ＶＰ抗体（ＰＲＯＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）、抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ）で常温、３時間反応させた。次に、二次抗体としてブロッキング溶液で１０,０００倍に希釈したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｃｙｔｉｖａ）を常温、２時間反応後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３４０９５）によりＲＥＰタンパク質およびカプシドの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を検出した。撮影にはＷＳＥ－６１００ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈＩ（アトー，２００６１００）を用いた。取得画像の解析にはＩｍａｇｅＪを用いて定量評価を実施した。
＜ＡＡＶ力価測定＞
遺伝子導入後７２時間、３７℃、８％ＣＯ２条件下で培養を行ったＨＥＫ細胞培養液を回収し、－８０℃での凍結融解にて細胞を破砕した。その後、１３,８００×ｇの遠心分離によって上清を回収し、終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、３７℃で２時間反応を行い、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化した。反応後のサンプルは、９５℃で１５分、７０℃で３分、４０℃で３分、２０℃で３分の順にインキュベーションし、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを失活させ、これをｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）サンプルとした。ｄｄＰＣＲサンプルはＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０，０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８ および１０μｇ／ｍＬウシ胸腺ＤＮＡ含有）で５０倍に希釈した。氷上でチューブにｄｄＰＣＲｔｍ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ ｄＵＴＰ）（ＢＩＯＲＡＤ社） １０μＬ、希釈済みのｄｄＰＣＲサンプル２μＬ、プライマー（ｓｅｑ１７、ｓｅｑ１８、最終濃度９００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびプローブ（ｓｅｑ１９、最終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）を混合して、総液量２２μＬに調整し、ｄｄＰＣＲを行った。ｓｅｑ１７、ｓｅｑ１８及びｓｅｑ１９の配列を、配列表の配列番号１７～１９に示す。
遺伝子導入後７２時間、３７℃、８％ＣＯ２条件下で培養を行ったＨＥＫ細胞培養液を回収し、－８０℃での凍結融解にて細胞を破砕した。その後、１３,８００×ｇの遠心分離によって上清を回収し、終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、３７℃で２時間反応を行い、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化した。反応後のサンプルは、９５℃で１５分、７０℃で３分、４０℃で３分、２０℃で３分の順にインキュベーションし、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを失活させ、これをｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）サンプルとした。ｄｄＰＣＲサンプルはＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０，０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８ および１０μｇ／ｍＬウシ胸腺ＤＮＡ含有）で５０倍に希釈した。氷上でチューブにｄｄＰＣＲｔｍ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ ｄＵＴＰ）（ＢＩＯＲＡＤ社） １０μＬ、希釈済みのｄｄＰＣＲサンプル２μＬ、プライマー（ｓｅｑ１７、ｓｅｑ１８、最終濃度９００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびプローブ（ｓｅｑ１９、最終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）を混合して、総液量２２μＬに調整し、ｄｄＰＣＲを行った。ｓｅｑ１７、ｓｅｑ１８及びｓｅｑ１９の配列を、配列表の配列番号１７～１９に示す。
ｄｄＰＣＲにおいては、ドロップレット形成機器にて調製液からドロップレット形成し、続いて９５℃で１０分、９４℃で３０秒および５５℃を４０サイクル、９８℃で１０分の順でインキュベーションした。ドロップレットリーダーにより測定を行い、ＡＡＶゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）を算出した。
＜細胞株樹立＞
１．８ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡＳ，１１５－００１５）３６μＬと、後記する組み合わせのプラスミドを等量混合し総量１８μｇを懸濁し、１５分間静置した。その後、前日に細胞濃度１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した培養細胞（培養液量は１２ｍＬ）に、上記試薬を添加し、３７℃、８％ＣＯ２条件下でインキュベートを行った。遺伝子導入した細胞を３週間維持培養し、フローサイトメトリーを用いてＲＦＰもしくはＧＦＰ蛍光陽性細胞をシングルセルで単離した。単離した細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭに懸濁し、６ウェルプレート上で３７℃、８％ＣＯ２ 条件下で1ヵ月培養し、細胞株を樹立した。
１．８ｍＬのＥｘｐｉ２９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡＳ，１１５－００１５）３６μＬと、後記する組み合わせのプラスミドを等量混合し総量１８μｇを懸濁し、１５分間静置した。その後、前日に細胞濃度１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した培養細胞（培養液量は１２ｍＬ）に、上記試薬を添加し、３７℃、８％ＣＯ２条件下でインキュベートを行った。遺伝子導入した細胞を３週間維持培養し、フローサイトメトリーを用いてＲＦＰもしくはＧＦＰ蛍光陽性細胞をシングルセルで単離した。単離した細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭに懸濁し、６ウェルプレート上で３７℃、８％ＣＯ２ 条件下で1ヵ月培養し、細胞株を樹立した。
［結果］
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、細胞障害性を評価した結果を図１に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
Ｍｏｃｋ：ｓｅｑ２０
ＰＥＩのみ：遺伝子なし
ΔＲＥＰ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ３
ΔＣＡＰ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ４
ΔＥ２：ｓｅｑ２、ｓｅｑ５
ΔＥ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、細胞障害性を評価した結果を図１に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
Ｍｏｃｋ：ｓｅｑ２０
ＰＥＩのみ：遺伝子なし
ΔＲＥＰ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ３
ΔＣＡＰ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ４
ΔＥ２：ｓｅｑ２、ｓｅｑ５
ΔＥ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７
細胞障害率（以下、左からＤａｙ４、Ｄａｙ７、Ｄａｙ１１の細胞障害率を示す）
Ｔｙｐｅ：３８．０％、 ６６．６ ％、６９．６％
Ｍｏｃｋ： １１．０％、８．３％、６．９％
ＰＥＩのみ： １２．４ ％、７．１％、６．３％
ΔＲＥＰ：３９．１ ％、６９．２％６０．４％
ΔＣＡＰ：３７．０％、６１．２％、５４．３ ％
ΔＥ２：２４．７％、３０．６％、１３．３ ％
ΔＥ４：１４．０％、１４.８％、７．４ ％
ΔＶＡ－ＲＮＡ： １３．１％、１０.２％、５．２％
図１の結果から、Ｄａｙ１１においては、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を除くことで細胞障害が低減されていた。
さらに図１の結果から、Ｅ４遺伝子，ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が無いことで細胞の障害を回避できることが確認された。
Ｔｙｐｅ：３８．０％、 ６６．６ ％、６９．６％
Ｍｏｃｋ： １１．０％、８．３％、６．９％
ＰＥＩのみ： １２．４ ％、７．１％、６．３％
ΔＲＥＰ：３９．１ ％、６９．２％６０．４％
ΔＣＡＰ：３７．０％、６１．２％、５４．３ ％
ΔＥ２：２４．７％、３０．６％、１３．３ ％
ΔＥ４：１４．０％、１４.８％、７．４ ％
ΔＶＡ－ＲＮＡ： １３．１％、１０.２％、５．２％
図１の結果から、Ｄａｙ１１においては、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を除くことで細胞障害が低減されていた。
さらに図１の結果から、Ｅ４遺伝子，ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が無いことで細胞の障害を回避できることが確認された。
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、タンパク質発現を評価した結果を図２に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
ΔＨｅｌｐｅｒ：ｓｅｑ２
ΔＥ２：ｓｅｑ２、ｓｅｑ５
ΔＥ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
ΔＨｅｌｐｅｒ：ｓｅｑ２
ΔＥ２：ｓｅｑ２、ｓｅｑ５
ΔＥ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７
図２および図２のバンドを定量した表１の結果から、ヘルパー遺伝子を除くことでＲＥＰタンパク質及びカプシド構造タンパク質の発現が抑制されることが確認された。ヘルパー遺伝子の中でもＥ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子依存的に、ＲＥＰ（細胞障害有）の発現を制御可能であることが確認された。
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、細胞障害性を評価した結果を図３に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
Ｍｏｃｋ：ｓｅｑ２０
ＲＥＰ：ｓｅｑ８
ＣＡＰ：ｓｅｑ９
Ｅ２：ｓｅｑ１０
Ｅ４：ｓｅｑ１１
ＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ１２
ＲＥＰ＋ＣＡＰ：ｓｅｑ２
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２
Ｍｏｃｋ：ｓｅｑ２０
ＲＥＰ：ｓｅｑ８
ＣＡＰ：ｓｅｑ９
Ｅ２：ｓｅｑ１０
Ｅ４：ｓｅｑ１１
ＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ１２
ＲＥＰ＋ＣＡＰ：ｓｅｑ２
障害細胞率（以下、左からＤａｙ４、Ｄａｙ７の細胞障害率を示す）
Ｔｙｐｅ： ３６．０％、６２.１％
Ｍｏｃｋ： ５．２％、６.７％
ＲＥＰ： ９．７％、７.９％
ＣＡＰ： １０．４％、６.１％
Ｅ２： １１．６％、１２.９％
Ｅ４： ３６．９％、６０.１％
ＶＡ－ＲＮＡ： ９．９％、５２.７％
ＲＥＰ＋ＣＡＰ：１５．６％、８．８％
図３の結果から、Ｅ４遺伝子，ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は単独の導入でも細胞傷害性があり、その発現を制御する必要があることが確認された。
Ｔｙｐｅ： ３６．０％、６２.１％
Ｍｏｃｋ： ５．２％、６.７％
ＲＥＰ： ９．７％、７.９％
ＣＡＰ： １０．４％、６.１％
Ｅ２： １１．６％、１２.９％
Ｅ４： ３６．９％、６０.１％
ＶＡ－ＲＮＡ： ９．９％、５２.７％
ＲＥＰ＋ＣＡＰ：１５．６％、８．８％
図３の結果から、Ｅ４遺伝子，ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は単独の導入でも細胞傷害性があり、その発現を制御する必要があることが確認された。
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図４に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
－Ｅ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１６
＋Ｅ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１１、ｓｅｑ１６
＋Ｅ４ＯＲＦ６：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１３、ｓｅｑ１６
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
－Ｅ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１６
＋Ｅ４：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１１、ｓｅｑ１６
＋Ｅ４ＯＲＦ６：ｓｅｑ２、ｓｅｑ６、ｓｅｑ１３、ｓｅｑ１６
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
Ｔｙｐｅ：５．５×１０８
ΔＥ４： ２．１×１０８
＋Ｅ４： ５．５×１０８
＋Ｅ４ＯＲＦ６：４．７×１０８
図４の結果から、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子のみでもＥ４遺伝子を導入したときと同程度ウイルスを産生し、Ｅ４遺伝子の機能を代替可能であることが確認された。
Ｔｙｐｅ：５．５×１０８
ΔＥ４： ２．１×１０８
＋Ｅ４： ５．５×１０８
＋Ｅ４ＯＲＦ６：４．７×１０８
図４の結果から、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子のみでもＥ４遺伝子を導入したときと同程度ウイルスを産生し、Ｅ４遺伝子の機能を代替可能であることが確認された。
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図５に示す。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
－ＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６
＋ＶＡ－ＲＮＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ１４、ｓｅｑ１６
＋ＶＡ－ＲＮＡＩＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ１５、ｓｅｑ１６
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
－ＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６
＋ＶＡ－ＲＮＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ１４、ｓｅｑ１６
＋ＶＡ－ＲＮＡＩＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ１５、ｓｅｑ１６
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
Ｔｙｐｅ： １．４×１０９
ΔＶＡ－ＲＮＡ： ４．３×１０９
＋ＶＡ－ＲＮＡＩ： １．３×１０９
＋ＶＡ－ＲＮＡＩＩ：４．３×１０９
図５の結果から、ＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子のみでも、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を導入したときと同程度発現し、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子の機能を代替可能であることが確認された。
Ｔｙｐｅ： １．４×１０９
ΔＶＡ－ＲＮＡ： ４．３×１０９
＋ＶＡ－ＲＮＡＩ： １．３×１０９
＋ＶＡ－ＲＮＡＩＩ：４．３×１０９
図５の結果から、ＶＡ－ＲＮＡＩ（ＶＡＩ）遺伝子のみでも、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を導入したときと同程度発現し、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子の機能を代替可能であることが確認された。
ＨＥＫ２９３細胞に、以下の組合せで遺伝子を導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図６に示す。また、“Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ＋ＤＯＸ”および“Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ＋ＤＯＸ”サンプルには遺伝子導入後に、終濃度０．５μｇ／ｍＬのｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ）を添加した。ＤＯＸ添加後、７２時間培養したＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶゲノム力価を評価した。
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６、ｓｅｑ２１、ｓｅｑ２３
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６、ｓｅｑ２２、ｓｅｑ２３
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
Ｔｙｐｅ： ６．７×１０８
－ＶＡ－ＲＮＡ：５．６×１０７
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ＋ＤＯＸ：８．２×１０７
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ－ＤＯＸ：３．２×１０８
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ＋ＤＯＸ：３．５×１０８
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ－ＤＯＸ：９．９×１０８
Ｔｙｐｅ：ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１６
ΔＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６、ｓｅｑ２１、ｓｅｑ２３
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ：ｓｅｑ２、ｓｅｑ７、ｓｅｑ１６、ｓｅｑ２２、ｓｅｑ２３
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
Ｔｙｐｅ： ６．７×１０８
－ＶＡ－ＲＮＡ：５．６×１０７
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ＋ＤＯＸ：８．２×１０７
Ｓｗｉｔｃｈ１―ＶＡＩ－ＤＯＸ：３．２×１０８
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ＋ＤＯＸ：３．５×１０８
Ｓｗｉｔｃｈ２―ＶＡＩ－ＤＯＸ：９．９×１０８
図６の結果から、ＤＯＸ添加によって、ＡＡＶ産生量が向上することが確認された。Ｓｗｉｔｃｈ１を用いることでＳｗｉｔｃｈ２と比較して、ＤＯＸ非添加時にＡＡＶ産生を抑制できることが確認された。またＳｗｉｔｃｈ１と比較してＳｗｉｔｃｈ２を用いることで、ＡＡＶの産生は増加させられることが確認された。Ｓｗｉｔｃｈ２を用いたＶＡ－１を用いることでＳｗｉｔｃｈをいれていないＴｙｐｅと比べてもＤＯＸを添加することで発現が増加することがわかった。ＤＯＸ非添加時にＡＡＶ産生を抑制できる観点から、Ｓｗｉｔｃｈ１がより好ましい。
ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｅｑ２、ｓｅｑ１０、ｓｅｑ１６、ｓｅｑ３８の組合せで遺伝子を導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図７に示す。また、“＋ＤＯＸ”サンプルには遺伝子導入後に、終濃度０．５μｇ／ｍＬのｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ）を添加した。ＤＯＸ添加後、７２時間培養したＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶゲノム力価を評価した。
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
－ＤＯＸ： ７．４×１０７
＋ＤＯＸ： ３．２×１０８
－ＤＯＸ： ７．４×１０７
＋ＤＯＸ： ３．２×１０８
ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｅｑ３９もしくはｓｅｑ４０と、Ｃａｓ９ ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ ＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＢＩ社、ＣＡＳ６０１Ａ－１）を導入して、安定発現株を樹立した。樹立細胞に対して、以下の組み合わせでプラスミドを導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図８に示す。
ｎＲＣｐ５：ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子挿入細胞、ｓｅｑ１、ｓｅｑ２０、ｓｅｑ１６
ｐ５ＲＣｐ５： ｐ５前後付加ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子挿入細胞、ｓｅｑ１、ｓｅｑ２０、ｓｅｑ１６
上記で樹立したｒｅｐ－ｃａｐ株について、１か月培養を行った。その後、ベクター配列存在時のみ増幅されるように設計したプライマーおよびプローブを用いたドロップレットデジタルＰＣＲ法によって、細胞から抽出した染色体をテンプレートとした場合にＰＣＲ増幅されることを確認することで、導入した配列が細胞の染色体中に組込まれていることを確認した。
ｎＲＣｐ５：ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子挿入細胞、ｓｅｑ１、ｓｅｑ２０、ｓｅｑ１６
ｐ５ＲＣｐ５： ｐ５前後付加ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子挿入細胞、ｓｅｑ１、ｓｅｑ２０、ｓｅｑ１６
上記で樹立したｒｅｐ－ｃａｐ株について、１か月培養を行った。その後、ベクター配列存在時のみ増幅されるように設計したプライマーおよびプローブを用いたドロップレットデジタルＰＣＲ法によって、細胞から抽出した染色体をテンプレートとした場合にＰＣＲ増幅されることを確認することで、導入した配列が細胞の染色体中に組込まれていることを確認した。
ウイルス量（ｖｇ／cell）
ｎＲＣｐ５： ９．９×１０１
ｐ５ＲＣｐ５：１．６×１０２
図８の結果から、発現制御をしていないｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を挿入した細胞株が樹立でき、さらに、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子、ＧＯＩ遺伝子を後から導入することでＡＡＶを産生できることを確認した。
ｐ５ＲＣｐ５について、ＮＧＳ解析を実施し、細胞のシークエンスを読み込むことで、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が染色体中に組み込まれていることを確認した。
ｎＲＣｐ５： ９．９×１０１
ｐ５ＲＣｐ５：１．６×１０２
図８の結果から、発現制御をしていないｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を挿入した細胞株が樹立でき、さらに、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子、ＧＯＩ遺伝子を後から導入することでＡＡＶを産生できることを確認した。
ｐ５ＲＣｐ５について、ＮＧＳ解析を実施し、細胞のシークエンスを読み込むことで、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が染色体中に組み込まれていることを確認した。
ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｅｑ４１とｓｅｑ４２を導入して、安定発現株を２株樹立した（Ｅ２－ＧＯＩ＃１、＃２）。樹立細胞に対して、ｓｅｑ２とｓｅｑ５の組み合わせでプラスミドを導入し、ＡＡＶ力価を評価した結果を図９に示す。
上記で樹立した２株のＥ２－ＧＯＩ株について、１か月培養を行った。その後、ベクター配列存在時のみ増幅されるように設計したプライマーおよびプローブを用いたドロップレットデジタルＰＣＲ法によって、細胞から抽出した染色体をテンプレートとした場合にＰＣＲ増幅されることを確認することで、導入した配列が細胞の染色体中に組込まれていることを確認した。
上記で樹立した２株のＥ２－ＧＯＩ株について、１か月培養を行った。その後、ベクター配列存在時のみ増幅されるように設計したプライマーおよびプローブを用いたドロップレットデジタルＰＣＲ法によって、細胞から抽出した染色体をテンプレートとした場合にＰＣＲ増幅されることを確認することで、導入した配列が細胞の染色体中に組込まれていることを確認した。
ウイルス量（ｖｇ／cell）
Ｅ２－ＧＯＩ＃１：２．１×１０３
Ｅ２－ＧＯＩ＃２：１．９×１０３
図９の結果から、Ｅ２遺伝子－ＧＯＩ遺伝子を挿入した細胞株が樹立でき、さらに、ＲＥＰ遺伝子、ＣＡＰ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を後から導入することでＡＡＶを産生できることを確認した。
Ｅ２－ＧＯＩ＃１：２．１×１０３
Ｅ２－ＧＯＩ＃２：１．９×１０３
図９の結果から、Ｅ２遺伝子－ＧＯＩ遺伝子を挿入した細胞株が樹立でき、さらに、ＲＥＰ遺伝子、ＣＡＰ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子を後から導入することでＡＡＶを産生できることを確認した。
ｓｅｑ４３単独もしくは、ｓｅｑ４３とｓｅｑ４２を共導入して細胞株をそれぞれ樹立した。樹立後１．５か月経過した株に対して、“＋ＤＯＸ”サンプルには終濃度０．５μｇ／ｍＬのｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ）を添加した。ＤＯＸ添加後、７２時間培養した細胞のＡＡＶゲノム力価を評価した。結果を図１０に示す。
ウイルス量（ｖｇ／ｍＬ）
ｓｅｑ４３株
＃１ －ＤＯＸ： １．８×１０６
＃１ ＋ＤＯＸ： ５．０×１０６
ｓｅｑ４３＋ｓｅｑ４２株
＃１ －ＤＯＸ： ８．７×１０５
＃１ ＋ＤＯＸ： ７．１×１０６
＃２ －ＤＯＸ： ３．５×１０６
＃２ ＋ＤＯＸ： １．８×１０７
＃３ －ＤＯＸ： ２．１×１０５
＃３ ＋ＤＯＸ： ５．９×１０６
ｓｅｑ４３株
＃１ －ＤＯＸ： １．８×１０６
＃１ ＋ＤＯＸ： ５．０×１０６
ｓｅｑ４３＋ｓｅｑ４２株
＃１ －ＤＯＸ： ８．７×１０５
＃１ ＋ＤＯＸ： ７．１×１０６
＃２ －ＤＯＸ： ３．５×１０６
＃２ ＋ＤＯＸ： １．８×１０７
＃３ －ＤＯＸ： ２．１×１０５
＃３ ＋ＤＯＸ： ５．９×１０６
Claims (30)
- １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、前記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター、
とを含むキット。 - 第一のベクターにおける発現調節可能なプロモーターが、薬剤による発現調節可能なプロモーターである、請求項１に記載のキット。
- 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、アデノウイルス由来である請求項１または２に記載のキット。
- 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子のうち、Ｅ４遺伝子およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が発現調節可能なプロモーターの制御下にある、請求項１から３のいずれか一項に記載のキット。
- 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子の全てが、発現調節可能なプロモーターの制御下にある、請求項１から４のいずれか一項にに記載のキット。
- 第一のベクターに含まれるウイルスヘルパー遺伝子が、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、請求項１から５のいずれか一項に記載のキット。
- Ｅ４遺伝子が、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子である、請求項６に記載のキット。
- ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子が、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である、請求項６または７に記載のキット。
- 第二のベクターにおいて、全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、請求項１から８の何れか一項に記載のキット。
- 第二のベクターにおいて、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子のいずれか一つが、アデノ随伴ウイルス遺伝子が天然に保持するプロモーターの制御下にある、請求項１から９の何れか一項に記載のキット。
- 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキット。
- 第二のベクターに含まれるアデノ随伴ウイルス遺伝子のうち、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にないアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキット。
- 請求項１から１２の何れか一項に記載のキットに含まれる第一のベクターと第二のベクターとを有する細胞。
- 細胞がヒト細胞である、請求項１３に記載の細胞。
- 前記第一のベクターと前記第二のベクターとを染色体中に有する、請求項１３又は１４に記載の細胞。
- １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、前記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、
１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクター
とを連結した状態で有する、統合ベクター。 - 所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターを更に有する、請求項１６に記載の統合ベクター。
- 請求項１６又は１７に記載の統合ベクターを有する細胞。
- 細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の細胞。
- 前記統合ベクターを染色体中に有する、請求項１８又は１９に記載の細胞。
- １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、前記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターとを細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルスを産生するための細胞の製造方法。
- １以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第一のベクターであって、前記ウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも一つが発現調節可能なプロモーターの制御下にある、第一のベクターと、１以上のアデノ随伴ウイルス遺伝子を含む第二のベクターであって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子の少なくとも一つが、薬剤による発現調節プロモーターの制御下にはない、第二のベクターと、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を含む第三のベクターとを含む細胞を培養する工程と、
前記発現調節可能なプロモーターを作動させることによって、発現調節可能なプロモーターの制御下にあるウイルスヘルパー遺伝子を発現させる工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。 - ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子の一部を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
前記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子、前記第一の工程で得られた細胞が含んでいないアデノ随伴ウイルス遺伝子、及び必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子を、前記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。 - 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｃａｐ遺伝子である、請求項２３に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
- ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、アデノ随伴ウイルス遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
前記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子を、前記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。 - 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、請求項２５に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
- アデノ随伴ウイルス遺伝子を細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
ウイルスヘルパー遺伝子と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを、前記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。 - 第一の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である、請求項２７に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
- ウイルスヘルパー遺伝子の一部と、必要な場合には、所望の治療又は予防用遺伝子とを細胞に導入する第一の工程；
第一の工程で得られた細胞を培養して増殖させる第二の工程；
前記第一の工程で得られた細胞が含んでいないウイルスヘルパー遺伝子と、アデノ随伴ウイルス遺伝子とを、前記第二の工程で得られた細胞に導入する第三の工程；及び
第三の工程で得られた細胞を培養する第四の工程
を含む、アデノ随伴ウイルスの製造方法。 - 第一の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ２遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるウイルスヘルパー遺伝子がＥ４遺伝子及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子であり、第三の工程で細胞に導入されるアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子である、請求項２９に記載のアデノ随伴ウイルスの製造方法。
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