JP2002505085A - 精製ａａｖベクターの生産方法 - Google Patents
精製ａａｖベクターの生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、生産細胞系およびヘルパーアデノウイルスを含む精製され組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規なシステムに向けられている。これらのシステムは、ヘルパーウイルスが混入していないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入しているｒＡＡＶベクターストックの高レベル生産を提供する。本発明は、また、本発明のシステムを用いて高収量の精製ｒＡＡＶベクターストックを生産する方法に向けられている。
Description
【０００１】 序文 本発明は、生産細胞系およびヘルパーアデノウイルスを含む精製された組換え
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なシステムに向けられている。これらのシステムは、ヘルパーウイルスが混入し
ていないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入しているｒＡＡＶベク
ターストックの高レベル生産を提供する。本発明は、また、本発明のシステムを
用いて高収量の精製ｒＡＡＶベクターストックを生産するための方法に向けられ
ている。
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なシステムに向けられている。これらのシステムは、ヘルパーウイルスが混入し
ていないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入しているｒＡＡＶベク
ターストックの高レベル生産を提供する。本発明は、また、本発明のシステムを
用いて高収量の精製ｒＡＡＶベクターストックを生産するための方法に向けられ
ている。
【０００２】 発明の背景 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．６ｋｂの大きさのゲノムを有する１
本鎖ヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは２個の主要な遺伝子：ｒ
ｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）をコ
ードするｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ構造タンパク質（ＶＰ−１、ＶＰ−２および
ＶＰ−３）をコードするｃａｐ遺伝子を含有する。ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ
複製、レスキュー、転写および組み込みに関与し、一方、ｃａｐタンパク質はＡ
ＡＶウイルス粒子を形成する。ＡＡＶは、ＡＡＶを増殖的感染させる、すなわち
、宿主細胞中でそれ自体を複製させる本質的な遺伝子産物を供給するための、ア
デノウイルスまたは他のヘルパーウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）に対す
るその依存性からその名称が由来する。ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶ
は、ヘルパーウイルス、通常はアデノウイルスを宿主細胞に重複感染させること
によってレスキューされるまで、プロウイルスとして宿主細胞の染色体中に組み
込まれる（Muzyczka, Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97-127, 1992）。
本鎖ヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは２個の主要な遺伝子：ｒ
ｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）をコ
ードするｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ構造タンパク質（ＶＰ−１、ＶＰ−２および
ＶＰ−３）をコードするｃａｐ遺伝子を含有する。ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ
複製、レスキュー、転写および組み込みに関与し、一方、ｃａｐタンパク質はＡ
ＡＶウイルス粒子を形成する。ＡＡＶは、ＡＡＶを増殖的感染させる、すなわち
、宿主細胞中でそれ自体を複製させる本質的な遺伝子産物を供給するための、ア
デノウイルスまたは他のヘルパーウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）に対す
るその依存性からその名称が由来する。ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶ
は、ヘルパーウイルス、通常はアデノウイルスを宿主細胞に重複感染させること
によってレスキューされるまで、プロウイルスとして宿主細胞の染色体中に組み
込まれる（Muzyczka, Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97-127, 1992）。
【０００３】 遺伝子移入ベクターとしてのＡＡＶ（組換えＡＡＶ、ｒＡＡＶ）に対する関心
は、その生物学におけるいくつかの独特の特徴に起因する。ＡＡＶゲノムの両端
に、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）として知られるヌクレオチド配列があり、そ
れは、ウイルス複製、レスキュー、パッケージングおよび組み込みに必要なシス
作用性ヌクレオチド配列を含有する。ＡＡＶｒｅｐタンパク質によってトランス
で（in trans）媒介されるＩＴＲの組み込み機能は、ヘルパーウイルス不在下で
、ＡＡＶゲノムが感染後に細胞染色体中に組み込まれることを可能にする。ウイ
ルスのこの独特の特性は、外来性核酸（トランスジーン）を含有する組換えＡＡ
Ｖを細胞のゲノム中に組み込むことを可能にするので、遺伝子移入におけるｒＡ
ＡＶの使用に関連する。したがって、遺伝子移入の主要な目標である安定な遺伝
子形質転換は、ｒＡＡＶベクターの使用によって達成されうる。さらに、ＡＡＶ
の組み込み部位はよく確立されており、ヒトの１９番染色体に局在した（Kotin ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2211-2215, 1990）。組み込み部位のこの
予測は、宿主遺伝子を活性または不活性化するか、またはコーディング配列を中
断し、その結果、その組み込みがランダムなベクター、例えば、レトロウイルス
の使用を制限するかもしれない細胞ゲノム中へのランダムな挿入事象の危険性を
減少させる。しかしながら、ｒｅｐタンパク質はＡＡＶの組み込みを媒介するの
で、ｒＡＡＶベクターの設計におけるｒｅｐ遺伝子の除去は、ｒＡＡＶベクター
を用いて観察された改変された細胞組み込みパターンを生じるかもしれない（Po
nnazhaganら、Hum. Gene Ther. 8: 275-284, 1997）。
は、その生物学におけるいくつかの独特の特徴に起因する。ＡＡＶゲノムの両端
に、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）として知られるヌクレオチド配列があり、そ
れは、ウイルス複製、レスキュー、パッケージングおよび組み込みに必要なシス
作用性ヌクレオチド配列を含有する。ＡＡＶｒｅｐタンパク質によってトランス
で（in trans）媒介されるＩＴＲの組み込み機能は、ヘルパーウイルス不在下で
、ＡＡＶゲノムが感染後に細胞染色体中に組み込まれることを可能にする。ウイ
ルスのこの独特の特性は、外来性核酸（トランスジーン）を含有する組換えＡＡ
Ｖを細胞のゲノム中に組み込むことを可能にするので、遺伝子移入におけるｒＡ
ＡＶの使用に関連する。したがって、遺伝子移入の主要な目標である安定な遺伝
子形質転換は、ｒＡＡＶベクターの使用によって達成されうる。さらに、ＡＡＶ
の組み込み部位はよく確立されており、ヒトの１９番染色体に局在した（Kotin ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2211-2215, 1990）。組み込み部位のこの
予測は、宿主遺伝子を活性または不活性化するか、またはコーディング配列を中
断し、その結果、その組み込みがランダムなベクター、例えば、レトロウイルス
の使用を制限するかもしれない細胞ゲノム中へのランダムな挿入事象の危険性を
減少させる。しかしながら、ｒｅｐタンパク質はＡＡＶの組み込みを媒介するの
で、ｒＡＡＶベクターの設計におけるｒｅｐ遺伝子の除去は、ｒＡＡＶベクター
を用いて観察された改変された細胞組み込みパターンを生じるかもしれない（Po
nnazhaganら、Hum. Gene Ther. 8: 275-284, 1997）。
【０００４】 遺伝子移入のためのＡＡＶの使用にはさらに有利なことがある。ＡＡＶの宿主
範囲は幅広い。さらに、レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは休止細胞および分
化細胞の両方に感染できる。さらに、ＡＡＶはヒトの疾患に関連せず、レトロウ
イルス由来の遺伝子移入ベクターに関する心配事の多くをうまく回避する。
範囲は幅広い。さらに、レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは休止細胞および分
化細胞の両方に感染できる。さらに、ＡＡＶはヒトの疾患に関連せず、レトロウ
イルス由来の遺伝子移入ベクターに関する心配事の多くをうまく回避する。
【０００５】 しかしながら、遺伝子移入ベクターとしてのＡＡＶの開発における進歩は、高
力価のｒＡＡＶストックを生産できないことによって制限されてきた。ｒＡＡＶ
ベクターの生成への標準的なアプローチは、一連の細胞内事象：ＡＡＶ ＩＴＲ 配列に隣接する目的のトランスジーンを含有するｒＡＡＶベクターゲノムでの宿
主細胞のトランスフェクション、そのタンパク質産物がトランスで必要とされる
ＡＡＶｒｅｐ遺伝子をコードしているプラスミドによる宿主細胞のトランスフェ
クション、およびトランスで必要とされる非ＡＡＶヘルパー機能を供給するため
のヘルパーウイルスでのトランスフェクト細胞の感染の調整が必要であった（Mu
zyczka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97-129, 1992）。アデノウイル
ス（または他のヘルパーウイルス）タンパク質はＡＡＶｒｅｐ遺伝子の転写を活
性化し、次いで、そのｒｅｐタンパク質産物がＡＡＶｃａｐ遺伝子の転写を活性
化する。次いで、ｃａｐタンパク質はＩＴＲ配列を利用して、ｒＡＡＶゲノムを
ウイルス粒子中にパッケージする。パッケージングの効率は、一部、十分な量の
構造タンパク質（ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３）の有効性、ならびにｒＡＡＶ
ベクターゲノムにおいて必要とされるいずれかのシス作用性パッケージング配列
の利用性によって決定される。
力価のｒＡＡＶストックを生産できないことによって制限されてきた。ｒＡＡＶ
ベクターの生成への標準的なアプローチは、一連の細胞内事象：ＡＡＶ ＩＴＲ 配列に隣接する目的のトランスジーンを含有するｒＡＡＶベクターゲノムでの宿
主細胞のトランスフェクション、そのタンパク質産物がトランスで必要とされる
ＡＡＶｒｅｐ遺伝子をコードしているプラスミドによる宿主細胞のトランスフェ
クション、およびトランスで必要とされる非ＡＡＶヘルパー機能を供給するため
のヘルパーウイルスでのトランスフェクト細胞の感染の調整が必要であった（Mu
zyczka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97-129, 1992）。アデノウイル
ス（または他のヘルパーウイルス）タンパク質はＡＡＶｒｅｐ遺伝子の転写を活
性化し、次いで、そのｒｅｐタンパク質産物がＡＡＶｃａｐ遺伝子の転写を活性
化する。次いで、ｃａｐタンパク質はＩＴＲ配列を利用して、ｒＡＡＶゲノムを
ウイルス粒子中にパッケージする。パッケージングの効率は、一部、十分な量の
構造タンパク質（ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３）の有効性、ならびにｒＡＡＶ
ベクターゲノムにおいて必要とされるいずれかのシス作用性パッケージング配列
の利用性によって決定される。
【０００６】 高レベルｒＡＡＶ生産に対する潜在的な制限の１つは、ｒＡＡＶゲノムの複製
およびパッケージングのためにトランスで必要とされるＡＡＶヘルパータンパク
質（ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によってコードされる）の量を制限するこ
とに由来する。これらのタンパク質のレベルを増加するための種々のアプローチ
は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下にＡＡＶｒｅｐ遺伝子を置いて、生産 されるｒｅｐタンパク質のレベルを増加させること（Flotte, F.R.ら、Gene The
rapy 2: 29-37, 1995）；他の異種プロモーターを使用してＡＡＶヘルパータン パク質、特にｃａｐタンパク質の生産を増加させること（Vincentら、J. Virol.
71: 1897-1905, 1997）およびｒｅｐタンパク質を特異的に生産するＡＡＶｒｅ
ｐ遺伝子を含有する細胞系の開発（Yang, Q.ら、J. Virol. 68: 4847-4856, 199
4）を包含した。
およびパッケージングのためにトランスで必要とされるＡＡＶヘルパータンパク
質（ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によってコードされる）の量を制限するこ
とに由来する。これらのタンパク質のレベルを増加するための種々のアプローチ
は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下にＡＡＶｒｅｐ遺伝子を置いて、生産 されるｒｅｐタンパク質のレベルを増加させること（Flotte, F.R.ら、Gene The
rapy 2: 29-37, 1995）；他の異種プロモーターを使用してＡＡＶヘルパータン パク質、特にｃａｐタンパク質の生産を増加させること（Vincentら、J. Virol.
71: 1897-1905, 1997）およびｒｅｐタンパク質を特異的に生産するＡＡＶｒｅ
ｐ遺伝子を含有する細胞系の開発（Yang, Q.ら、J. Virol. 68: 4847-4856, 199
4）を包含した。
【０００７】 ｒＡＡＶベクターの生産を改善するための他のアプローチは、ＡＡＶヘルパー
タンパク質のヘルパーウイルス誘導の使用（Clarkら、Gene Therapy 3: 1124-11
32, 1996）およびヘルパーウイルスによる感染がｒＡＡＶ生産を開始するような
、ｒＡＡＶベクターの組み込まれたコピーおよびＡＡＶヘルパー遺伝子を含有す
る細胞系の生成（Clarkら、Human Gene Therapy 6: 1329-1341, 1995）を包含す
る。
タンパク質のヘルパーウイルス誘導の使用（Clarkら、Gene Therapy 3: 1124-11
32, 1996）およびヘルパーウイルスによる感染がｒＡＡＶ生産を開始するような
、ｒＡＡＶベクターの組み込まれたコピーおよびＡＡＶヘルパー遺伝子を含有す
る細胞系の生成（Clarkら、Human Gene Therapy 6: 1329-1341, 1995）を包含す
る。
【０００８】 また、ｒＡＡＶベクターは、ゲノムヌクレオチド内にｒＡＡＶベクターゲノム
をコードしている配列を含有する複製欠損ヘルパーアデノウイルス（１９９９年
１月５日に発行された米国特許第５，８５６，１５２号）またはそのゲノムがＡ
ＡＶヘルパータンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含有するヘルパー
アデノウイルス（ＰＣＴ国際公報ＷＯ９５／０６７４３号、１９９５年３月９日
公開）のいずれかを用いて生産されてきた。ＡＡＶヘルパー遺伝子の高レベル発
現とｒＡＡＶベクターゲノム中に挿入されたシス作用性ヌクレオチド配列の最適
な選択を組み合わせる生産戦略が記載された（ＰＣＴ国際公報ＷＯ９７／０９４
４１号、１９９７年３月１３日公開）。
をコードしている配列を含有する複製欠損ヘルパーアデノウイルス（１９９９年
１月５日に発行された米国特許第５，８５６，１５２号）またはそのゲノムがＡ
ＡＶヘルパータンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含有するヘルパー
アデノウイルス（ＰＣＴ国際公報ＷＯ９５／０６７４３号、１９９５年３月９日
公開）のいずれかを用いて生産されてきた。ＡＡＶヘルパー遺伝子の高レベル発
現とｒＡＡＶベクターゲノム中に挿入されたシス作用性ヌクレオチド配列の最適
な選択を組み合わせる生産戦略が記載された（ＰＣＴ国際公報ＷＯ９７／０９４
４１号、１９９７年３月１３日公開）。
【０００９】 高力価の精製ｒＡＡＶストックの生産をさらに制限するものは、非ＡＡＶヘル
パーウイルスの存在に対する必要性がベクターストック調製物におけるヘルパー
ウイルスによる混入を導くことである。ヘルパーウイルスは、それ自体、ｒＡＡ
Ｖ生産の間に複製することができ、それにより、ｒＡＡＶベクターの精製ストッ
クを生産するために、細胞ライゼートのさらなる技術的操作が必要である。かか
る精製技術における非能率に加えて、ヘルパーウイルスによる混入は、最終的に
、遺伝子移入ベクターとしてのｒＡＡＶの治療的応用に望ましくない。ｒＡＡＶ
ベクターストックにおけるヘルパーウイルスによる混入を減少させるための近年
のアプローチは、とりわけ、ｒＡＡＶストックを生産するために使用される複製
を許容しない温度で不活化される温度感受性ヘルパーアデノウイルスの使用（En
singerら、J. Virol. 10: 328-339, 1972）を包含する。別法では、非ＡＡＶヘ ルパー遺伝子を、ｒＡＡＶベクター生産の間に細胞中にトランスフェクトされる
ＤＮＡプラスミド中にサブクローニングすることができる（Salvettiら、Hum. G
ene. Ther. 9: 695-706, 1998; Grimmら、Hum. Gene. Ther. 9: 2745-2760, 199
8）。
パーウイルスの存在に対する必要性がベクターストック調製物におけるヘルパー
ウイルスによる混入を導くことである。ヘルパーウイルスは、それ自体、ｒＡＡ
Ｖ生産の間に複製することができ、それにより、ｒＡＡＶベクターの精製ストッ
クを生産するために、細胞ライゼートのさらなる技術的操作が必要である。かか
る精製技術における非能率に加えて、ヘルパーウイルスによる混入は、最終的に
、遺伝子移入ベクターとしてのｒＡＡＶの治療的応用に望ましくない。ｒＡＡＶ
ベクターストックにおけるヘルパーウイルスによる混入を減少させるための近年
のアプローチは、とりわけ、ｒＡＡＶストックを生産するために使用される複製
を許容しない温度で不活化される温度感受性ヘルパーアデノウイルスの使用（En
singerら、J. Virol. 10: 328-339, 1972）を包含する。別法では、非ＡＡＶヘ ルパー遺伝子を、ｒＡＡＶベクター生産の間に細胞中にトランスフェクトされる
ＤＮＡプラスミド中にサブクローニングすることができる（Salvettiら、Hum. G
ene. Ther. 9: 695-706, 1998; Grimmら、Hum. Gene. Ther. 9: 2745-2760, 199
8）。
【００１０】 ベクターストックの生産においてヘルパーウイルスの複製を排除するかまたは
減少させ、精製ベクター調製物の生成を可能にするさらなるｒＡＡＶ生産方法の
開発は、遺伝子移入のためにｒＡＡＶを使用する可能性を増加させる。本発明は
かかる方法を提供する。
減少させ、精製ベクター調製物の生成を可能にするさらなるｒＡＡＶ生産方法の
開発は、遺伝子移入のためにｒＡＡＶを使用する可能性を増加させる。本発明は
かかる方法を提供する。
【００１１】 発明の概要 本発明は、生産細胞系およびヘルパーアデノウイルスを含む精製された組換え
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なシステムに向けられている。これらのシステムは、ヘルパーウイルスが混入し
ていないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入しているｒＡＡＶベク
ターストックの高レベル生産を提供する。本発明は、また、本発明のシステムを
用いて高収量の精製ｒＡＡＶベクターストックを生産する方法に向けられている
。
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なシステムに向けられている。これらのシステムは、ヘルパーウイルスが混入し
ていないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入しているｒＡＡＶベク
ターストックの高レベル生産を提供する。本発明は、また、本発明のシステムを
用いて高収量の精製ｒＡＡＶベクターストックを生産する方法に向けられている
。
【００１２】 発明の詳細な記載 本発明は、生産細胞系およびヘルパーアデノウイルスを含む精製された組換え
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なＡＡＶベクター生産システムに向けられている。本発明のシステムは、ヘルパ
ーウイルスが混入していないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入し
ているｒＡＡＶベクターの高レベル生産を支持する。本発明のヘルパーアデノウ
イルスは、生産細胞系において増殖的感染を引き起こすことができないことを特
徴とする。本発明の生産細胞系は、ヒトヘルパーアデノウイルスによる増殖的感
染を支持できないことを特徴とし、該特徴は精製ｒＡＡＶベクターストックの高
レベル生産を可能にする。
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターストックの高レベル生産のための新規
なＡＡＶベクター生産システムに向けられている。本発明のシステムは、ヘルパ
ーウイルスが混入していないか、またはヘルパーウイルスがごくわずかに混入し
ているｒＡＡＶベクターの高レベル生産を支持する。本発明のヘルパーアデノウ
イルスは、生産細胞系において増殖的感染を引き起こすことができないことを特
徴とする。本発明の生産細胞系は、ヒトヘルパーアデノウイルスによる増殖的感
染を支持できないことを特徴とし、該特徴は精製ｒＡＡＶベクターストックの高
レベル生産を可能にする。
【００１３】 ヘルパーウイルスは、トランスでＡＡＶのウイルス粒子中への複製およびアッ
センブリーに必要とされる遺伝子産物、例えば、タンパク質を提供するいずれか
の非ＡＡＶウイルスである。ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶウイルスゲ
ノムをレスキューし、感染の生産サイクルを開始するヘルパーウイルスによって
宿主細胞が重感染するまで、宿主細胞中に導入されたＡＡＶゲノムは組み込まれ
、潜伏しつづける。トランスでｒＡＡＶ生産に必要とされる非ＡＡＶ遺伝子産物
、例えば、タンパク質を提供するが、本発明の細胞系において増殖的感染が不可
能ないずれかのヘルパーウイルスの使用は、本発明の範囲内である。本発明の最
も好ましい具体例において、ヘルパーウイルスは、野生型または組換え体のいず
れかのアデノウイルスである。本発明のヘルパーウイルスは、生産細胞系におい
て増殖的感染を引き起こさないが、生産細胞の表面の内在性ウイルスレセプター
または外因的に操作されたレセプターを用いる感染によって生産細胞に侵入する
ものである。
センブリーに必要とされる遺伝子産物、例えば、タンパク質を提供するいずれか
の非ＡＡＶウイルスである。ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶウイルスゲ
ノムをレスキューし、感染の生産サイクルを開始するヘルパーウイルスによって
宿主細胞が重感染するまで、宿主細胞中に導入されたＡＡＶゲノムは組み込まれ
、潜伏しつづける。トランスでｒＡＡＶ生産に必要とされる非ＡＡＶ遺伝子産物
、例えば、タンパク質を提供するが、本発明の細胞系において増殖的感染が不可
能ないずれかのヘルパーウイルスの使用は、本発明の範囲内である。本発明の最
も好ましい具体例において、ヘルパーウイルスは、野生型または組換え体のいず
れかのアデノウイルスである。本発明のヘルパーウイルスは、生産細胞系におい
て増殖的感染を引き起こさないが、生産細胞の表面の内在性ウイルスレセプター
または外因的に操作されたレセプターを用いる感染によって生産細胞に侵入する
ものである。
【００１４】 本発明の生産細胞系は、（１）感染するヘルパーウイルスの宿主範囲内に天然
に存在せず、その増殖的感染を支持しないが、トランスでｒＡＡＶ生産に必要と
される遺伝子産物、例えば、タンパク質を供給するために、細胞に侵入できるよ
うにヘルパーウイルスの結合および侵入を可能にするレセプターをコードしてい
る核酸を発現するように操作することができるもの、または（２）天然にヘルパ
ーウイルスによる結合および侵入を受けやすいが、かかるウイルスによる増殖的
感染を支持しないものを包含する。
に存在せず、その増殖的感染を支持しないが、トランスでｒＡＡＶ生産に必要と
される遺伝子産物、例えば、タンパク質を供給するために、細胞に侵入できるよ
うにヘルパーウイルスの結合および侵入を可能にするレセプターをコードしてい
る核酸を発現するように操作することができるもの、または（２）天然にヘルパ
ーウイルスによる結合および侵入を受けやすいが、かかるウイルスによる増殖的
感染を支持しないものを包含する。
【００１５】 上記（１）に従う本発明の新規な生産細胞系は、ｒＡＡＶベクターの生産に必
要なヘルパーウイルスの結合および侵入を受けやすいが、ヘルパーウイルスによ
る増殖的感染を支持できないように適応している。上記（１）または（２）の細
胞系のいずれかの種類を用いて、ヘルパーウイルスの混入が最小限であるかまた
は混入していないｒＡＡＶベクターストックの生産を引き起こし、それにより、
精製ベクターストックの調製を容易にする。本発明の好ましい具体例において、
ヘルパーウイルスはヒトアデノウイルスであり、生産細胞系はヒト以外の起源の
ものである。
要なヘルパーウイルスの結合および侵入を受けやすいが、ヘルパーウイルスによ
る増殖的感染を支持できないように適応している。上記（１）または（２）の細
胞系のいずれかの種類を用いて、ヘルパーウイルスの混入が最小限であるかまた
は混入していないｒＡＡＶベクターストックの生産を引き起こし、それにより、
精製ベクターストックの調製を容易にする。本発明の好ましい具体例において、
ヘルパーウイルスはヒトアデノウイルスであり、生産細胞系はヒト以外の起源の
ものである。
【００１６】 好ましくは、ｒＡＡＶ生産のための本発明の生産細胞系は、マウス、ハムスタ
ー、ラットまたはサル組織由来であり、それらは、天然にはヒトアデノウイルス
による増殖的感染を受けにくいが、ヒトヘルパーアデノウイルスによる結合およ
び侵入を受けやすいように適応している。かかる非ヒト細胞系は、それらが発現
時に、かかる細胞に対するヒトアデノウイルス結合および侵入を受けやすくさせ
るヒトアデノウイルスに対するレセプターをコードしている核酸を含む場合、「
適応している」として定義される。しかしながら、生産細胞の表面特徴のかかる
適応は、ヘルパーアデノウイルスによる増殖的感染に対する障壁を除去せず、そ
こでは複製できない。
ー、ラットまたはサル組織由来であり、それらは、天然にはヒトアデノウイルス
による増殖的感染を受けにくいが、ヒトヘルパーアデノウイルスによる結合およ
び侵入を受けやすいように適応している。かかる非ヒト細胞系は、それらが発現
時に、かかる細胞に対するヒトアデノウイルス結合および侵入を受けやすくさせ
るヒトアデノウイルスに対するレセプターをコードしている核酸を含む場合、「
適応している」として定義される。しかしながら、生産細胞の表面特徴のかかる
適応は、ヘルパーアデノウイルスによる増殖的感染に対する障壁を除去せず、そ
こでは複製できない。
【００１７】 細胞をヘルパーウイルスの結合および侵入に対して適応させ、それにより、本
発明の生産細胞系を作製するために、所望のヘルパーウイルス、例えば、アデノ
ウイルスに特異的なレセプターをコードしている核酸を安定に、かかるレセプタ
ーを欠損している細胞系に導入することができる。ヒトアデノウイルスレセプタ
ーは、特徴付けられ、コクサッキー（coxsackie）およびアデノウイルスレセプ ター（ＣＡＲ）として同定された。ＣＡＲをコードしている遺伝子（核酸）が配
列決定され（Bergelsonら、Science 275: 1320-1323, 1997、出典明示により本 明細書の一部とする）、ヒト２１番染色体に局在していた（Mayrら、J. Virol.
71: 412-418, 1997）。ＣＡＲをコードしている核酸を発現する非ヒト生産細胞 系は、分子生物学の標準的技法を用いて構築でき、本発明の範囲内である。マウ
スＡ９細胞のヒトアデノウイルス−結合能力に対する成功した適応は、ヒトアデ
ノウイルスに対するかかるレセプターを欠くこれらの細胞にヒト２１番染色体を
提供することによって示された（Mayrら、J. Virol. 71: 412-418, 1997）。
発明の生産細胞系を作製するために、所望のヘルパーウイルス、例えば、アデノ
ウイルスに特異的なレセプターをコードしている核酸を安定に、かかるレセプタ
ーを欠損している細胞系に導入することができる。ヒトアデノウイルスレセプタ
ーは、特徴付けられ、コクサッキー（coxsackie）およびアデノウイルスレセプ ター（ＣＡＲ）として同定された。ＣＡＲをコードしている遺伝子（核酸）が配
列決定され（Bergelsonら、Science 275: 1320-1323, 1997、出典明示により本 明細書の一部とする）、ヒト２１番染色体に局在していた（Mayrら、J. Virol.
71: 412-418, 1997）。ＣＡＲをコードしている核酸を発現する非ヒト生産細胞 系は、分子生物学の標準的技法を用いて構築でき、本発明の範囲内である。マウ
スＡ９細胞のヒトアデノウイルス−結合能力に対する成功した適応は、ヒトアデ
ノウイルスに対するかかるレセプターを欠くこれらの細胞にヒト２１番染色体を
提供することによって示された（Mayrら、J. Virol. 71: 412-418, 1997）。
【００１８】 ヒトアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）は、該レセプターをコードしている
核酸での細胞のトランスフェクションによって、またはヒト２１番染色体の大き
なセグメントでのトランスフェクションによって該レセプターをコードしている
核酸を含むプラスミドでのトランスフェクションによって、かかるレセプターを
欠損しているかまたはかかるレセプターに欠陥のある細胞系に提供される。かか
るプラスミドまたは核酸は、また、選択マーカー、例えば、ハイグロマイシンＢ
の存在下でのトランスフェクトされた細胞の選択を可能にするハイグロマイシン
耐性遺伝子をコードしている核酸を含むこともできる。かかるプラスミド、核酸
または染色体セグメントは、また、限定するものではないが、トランスフェクシ
ョン、リポフェクション、エレクトロポレーションを包含する核酸移入のいずれ
かの手段によって、例えば、またはベクター介在デリバリーによって、細胞中に
導入できる。別法では、ＣＡＲ（Bergelsonら、Science 275: 1320-1323, 1997 ）をコードしている核酸を細菌性人工染色体（ＢＡＣ）上で細胞に供給すること
もできる。例えば、ゲノム・システムス（Genome Systems（St. Louis, MO）） またはリサーチ・ジェネティックス（Research Genetics（Huntsville, AL）） は、ＢＡＣを用いてＣＡＲをコードしている核酸のような所望の核酸をレシピエ
ント細胞中に挿入することができる。ＣＡＲをコードしている核酸がＢＡＣを用
いてレシピエント細胞に提供される場合、ＣＡＲ遺伝子は、それ自体のプロモー
ターから発現される。ＣＡＲをコードしている核酸がｃＤＮＡまたは定義される
ゲノムフラグメントとして提供される場合、好ましくはホスホグリセレートキナ
ーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを用いてその発現を行う（Armentanoら、Hum. Gene
Ther. 6: 1343-1353, 1995）。かかる発現制御配列に作動可能に連結されたヒ トアデノウイルスレセプターをコードしている核酸をレシピエント細胞に提供す
ることは、かかる細胞をヒトアデノウイルスの結合および侵入を受けやすくする
。
核酸での細胞のトランスフェクションによって、またはヒト２１番染色体の大き
なセグメントでのトランスフェクションによって該レセプターをコードしている
核酸を含むプラスミドでのトランスフェクションによって、かかるレセプターを
欠損しているかまたはかかるレセプターに欠陥のある細胞系に提供される。かか
るプラスミドまたは核酸は、また、選択マーカー、例えば、ハイグロマイシンＢ
の存在下でのトランスフェクトされた細胞の選択を可能にするハイグロマイシン
耐性遺伝子をコードしている核酸を含むこともできる。かかるプラスミド、核酸
または染色体セグメントは、また、限定するものではないが、トランスフェクシ
ョン、リポフェクション、エレクトロポレーションを包含する核酸移入のいずれ
かの手段によって、例えば、またはベクター介在デリバリーによって、細胞中に
導入できる。別法では、ＣＡＲ（Bergelsonら、Science 275: 1320-1323, 1997 ）をコードしている核酸を細菌性人工染色体（ＢＡＣ）上で細胞に供給すること
もできる。例えば、ゲノム・システムス（Genome Systems（St. Louis, MO）） またはリサーチ・ジェネティックス（Research Genetics（Huntsville, AL）） は、ＢＡＣを用いてＣＡＲをコードしている核酸のような所望の核酸をレシピエ
ント細胞中に挿入することができる。ＣＡＲをコードしている核酸がＢＡＣを用
いてレシピエント細胞に提供される場合、ＣＡＲ遺伝子は、それ自体のプロモー
ターから発現される。ＣＡＲをコードしている核酸がｃＤＮＡまたは定義される
ゲノムフラグメントとして提供される場合、好ましくはホスホグリセレートキナ
ーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを用いてその発現を行う（Armentanoら、Hum. Gene
Ther. 6: 1343-1353, 1995）。かかる発現制御配列に作動可能に連結されたヒ トアデノウイルスレセプターをコードしている核酸をレシピエント細胞に提供す
ることは、かかる細胞をヒトアデノウイルスの結合および侵入を受けやすくする
。
【００１９】 ヒトアデノウイルスレセプターをコードしている核酸を発現する（および、そ
れにより、ヒトアデノウイルス結合および侵入を受けやすくなる）ように適応で
き、ヘルパーヒトアデノウイルス由来の混入が最小限のｒＡＡＶストックを生産
するために使用できる特定の細胞系は、とりわけ、マウスＡ９、マウスＬ９２９
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を包含し、その全てが当業者に既知の
細胞系である。
れにより、ヒトアデノウイルス結合および侵入を受けやすくなる）ように適応で
き、ヘルパーヒトアデノウイルス由来の混入が最小限のｒＡＡＶストックを生産
するために使用できる特定の細胞系は、とりわけ、マウスＡ９、マウスＬ９２９
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を包含し、その全てが当業者に既知の
細胞系である。
【００２０】 本発明の細胞系におけるｒＡＡＶベクター生産に必要な非ＡＡＶヘルパーウイ
ルスは、ＡＡＶ複製およびパッケージングのためにトランスで必要とされる非Ａ
ＡＶウイルスタンパク質をコードしている遺伝子の発現を提供するいずれかの非
ＡＡＶヘルパーウイルスであることができる。ヘルパーウイルスは、生産細胞系
に結合および侵入できるが、増殖的感染を引き起こすことができない。かかるヘ
ルパーウイルスは、限定するものではないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルスＩおよびＩＩ、ワクシニア、サイトメガロウイルスおよび偽狂犬病ウイル
スを包含する（Berns, K., "Parvoviridae: The Viruses and Their Replicatio
n" in Virology, Fieldsら編、Lippincott-Raven, New York 1996）。１以上の ウイルスまたは１以上のウイルス血清型から必要なタンパク質をトランスで供給
するキメラヘルパーウイルスもまた、本発明の範囲内である。ヘルパーウイルス
の結合および侵入に適応した本発明の生産細胞系は、所望のヘルパーウイルスの
侵入を特異的に可能にするレセプタータンパク質（例えば、アデノウイルス−Ｃ
ＡＲ）の選択によって、本発明にしたがって作製することができる。
ルスは、ＡＡＶ複製およびパッケージングのためにトランスで必要とされる非Ａ
ＡＶウイルスタンパク質をコードしている遺伝子の発現を提供するいずれかの非
ＡＡＶヘルパーウイルスであることができる。ヘルパーウイルスは、生産細胞系
に結合および侵入できるが、増殖的感染を引き起こすことができない。かかるヘ
ルパーウイルスは、限定するものではないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルスＩおよびＩＩ、ワクシニア、サイトメガロウイルスおよび偽狂犬病ウイル
スを包含する（Berns, K., "Parvoviridae: The Viruses and Their Replicatio
n" in Virology, Fieldsら編、Lippincott-Raven, New York 1996）。１以上の ウイルスまたは１以上のウイルス血清型から必要なタンパク質をトランスで供給
するキメラヘルパーウイルスもまた、本発明の範囲内である。ヘルパーウイルス
の結合および侵入に適応した本発明の生産細胞系は、所望のヘルパーウイルスの
侵入を特異的に可能にするレセプタータンパク質（例えば、アデノウイルス−Ｃ
ＡＲ）の選択によって、本発明にしたがって作製することができる。
【００２１】 好ましくは、ヘルパーウイルスは、かかるウイルスによる増殖的感染を支持で
きない生産細胞系において使用されるヒトアデノウイルスである。ｒＡＡＶベク
ターストックを製造するために使用されるアデノウイルスヘルパーウイルスまた
はアデノウイルス遺伝子は、いずれかのアデノウイルス血清型由来であり、限定
するものではないが、Ｃ群、好ましくは血清型２および５由来である。ヘルパー
機能に必要なアデノウイルス遺伝子は、とりわけ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ
４ＯＲＦ６およびＶＡ ＲＮＡを包含する（Muzycka, N., Curr. Top. Micro. Im
munol. 158: 97-129, 1992）。本発明の細胞系におけるｒＡＡＶベクター生産に
使用できるアデノウイルスは、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質をコードしている
アデノウイルス遺伝子の発現を提供するいずれかの野生型または組換えウイルス
であることができる。別法では、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質をコードしてい
るアデノウイルス遺伝子は、いずれかの変異型または末端切断型アデノウイルス
において本発明の細胞系に提供されることができ、またはネイクドＤＮＡ（nake
d ＤＮＡ）によってプラスミド上に提供されることができる。
きない生産細胞系において使用されるヒトアデノウイルスである。ｒＡＡＶベク
ターストックを製造するために使用されるアデノウイルスヘルパーウイルスまた
はアデノウイルス遺伝子は、いずれかのアデノウイルス血清型由来であり、限定
するものではないが、Ｃ群、好ましくは血清型２および５由来である。ヘルパー
機能に必要なアデノウイルス遺伝子は、とりわけ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ
４ＯＲＦ６およびＶＡ ＲＮＡを包含する（Muzycka, N., Curr. Top. Micro. Im
munol. 158: 97-129, 1992）。本発明の細胞系におけるｒＡＡＶベクター生産に
使用できるアデノウイルスは、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質をコードしている
アデノウイルス遺伝子の発現を提供するいずれかの野生型または組換えウイルス
であることができる。別法では、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質をコードしてい
るアデノウイルス遺伝子は、いずれかの変異型または末端切断型アデノウイルス
において本発明の細胞系に提供されることができ、またはネイクドＤＮＡ（nake
d ＤＮＡ）によってプラスミド上に提供されることができる。
【００２２】 ヘルパーウイルスがヒトアデノウイルスである場合、適当なレセプターをコー
ドしている核酸でのトランスフェクションによってヒトアデノウイルスに結合す
るように上記のように適応させた非ヒト細胞系を、放射能標識化ヒトアデノウイ
ルスの結合によって、標準的シグナル検出によって検出できるレセプターに特異
的な抗体を使用することによって、またはヒトアデノウイルス繊維タンパク質を
結合するトランスフェクト細胞の能力によって、レセプター機能についてアッセ
イでき、その全てが当業者に既知の技法である。かかる技法もまた、単純ヘルペ
スなどの他のヘルパーウイルスの侵入に適応させた細胞に適用できる。
ドしている核酸でのトランスフェクションによってヒトアデノウイルスに結合す
るように上記のように適応させた非ヒト細胞系を、放射能標識化ヒトアデノウイ
ルスの結合によって、標準的シグナル検出によって検出できるレセプターに特異
的な抗体を使用することによって、またはヒトアデノウイルス繊維タンパク質を
結合するトランスフェクト細胞の能力によって、レセプター機能についてアッセ
イでき、その全てが当業者に既知の技法である。かかる技法もまた、単純ヘルペ
スなどの他のヘルパーウイルスの侵入に適応させた細胞に適用できる。
【００２３】 本発明の好ましい具体例において、本発明の適応した生産細胞系は、ｒＡＡＶ
ベクター（およびトランスジーン）をコードしている核酸ならびにそのゲノム中
に安定に組み込まれたＡＡＶヘルパー遺伝子を含む。ヘルパーウイルスによる細
胞系の感染において、ｒＡＡＶゲノムはレスキューおよびパッケージされるので
ｒＡＡＶ生産が起きるが、ヘルパーウイルスは増殖的感染を引き起こさない。該
方法は、ｒＡＡＶストックを生産するために、適応した生産細胞系のヘルパーウ
イルスによる感染のみを必要とする。
ベクター（およびトランスジーン）をコードしている核酸ならびにそのゲノム中
に安定に組み込まれたＡＡＶヘルパー遺伝子を含む。ヘルパーウイルスによる細
胞系の感染において、ｒＡＡＶゲノムはレスキューおよびパッケージされるので
ｒＡＡＶ生産が起きるが、ヘルパーウイルスは増殖的感染を引き起こさない。該
方法は、ｒＡＡＶストックを生産するために、適応した生産細胞系のヘルパーウ
イルスによる感染のみを必要とする。
【００２４】 別法では、ｒＡＡＶベクター配列をコードしている核酸を安定に生産細胞ゲノ
ム中に組み込み、ＡＡＶヘルパー遺伝子を外来的に細胞にデリバリーしてもよく
、またはＡＡＶヘルパー遺伝子を安定に生産細胞ゲノム中に組み込み、ｒＡＡＶ
ベクターをコードしている核酸を外来的に細胞へデリバリーしてもよい。本発明
のさらなる具体例は、プラスミドの形態におけるｒＡＡＶベクターをコードして
いる核酸またはＡＡＶヘルパー遺伝子の外来性デリバリー、あるいはまずベクタ
ーおよび／またはヘルパー遺伝子を、組換えアデノウイルス（ｒＡＡＶゲノムを
含む異種核酸を含有する）またはヘルペスウイルスのごときヘルパーウイルス中
に挿入し、次いで生産細胞のかかるウイルスでの感染による外来性デリバリーを
包含する。
ム中に組み込み、ＡＡＶヘルパー遺伝子を外来的に細胞にデリバリーしてもよく
、またはＡＡＶヘルパー遺伝子を安定に生産細胞ゲノム中に組み込み、ｒＡＡＶ
ベクターをコードしている核酸を外来的に細胞へデリバリーしてもよい。本発明
のさらなる具体例は、プラスミドの形態におけるｒＡＡＶベクターをコードして
いる核酸またはＡＡＶヘルパー遺伝子の外来性デリバリー、あるいはまずベクタ
ーおよび／またはヘルパー遺伝子を、組換えアデノウイルス（ｒＡＡＶゲノムを
含む異種核酸を含有する）またはヘルペスウイルスのごときヘルパーウイルス中
に挿入し、次いで生産細胞のかかるウイルスでの感染による外来性デリバリーを
包含する。
【００２５】 本発明は、また、サル細胞由来の生産細胞系およびヘルパーヒトアデノウイル
スを含む新規なｒＡＡＶ生産システムにも向けられている。ヘルパーウイルスは
、生産細胞に結合し、侵入できるが、そこで増殖的感染を引き起こすことができ
ず、その結果、ヘルパーウイルスによるｒＡＡＶベクターストックの最小限の混
入をもたらす。該システムは、ヒトアデノウイルスがサル細胞において不完全な
感染を行うという知見を利用している（Andersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 81: 4034-4027, 1984; Rossら、J. Virol. 66: 3110-3117, 1992）。しかし ながら、ヘルパーアデノウイルスの初期遺伝子を発現し、それにより、ｒＡＡＶ
生産に必要な必須のアデノウイルスタンパク質を提供する。サル起源の細胞にお
けるアデノウイルス後期遺伝子の不十分な発現は、細胞ライゼート中のアデノウ
イルスタンパク質の数を減少させるのと同様にアデノウイルス子孫の収量を低下
させ、それにより、ｒＡＡＶベクターのその後の精製を容易にする。該生産シス
テムに好ましいサル細胞系は、限定するものではないが、ＣＶ−１、ＣＶ−Ｃ（
Riceら、J. Virol. 49: 35-49, 1984）、ＶｅｒｏおよびＢＳＣ−１を包含する 。
スを含む新規なｒＡＡＶ生産システムにも向けられている。ヘルパーウイルスは
、生産細胞に結合し、侵入できるが、そこで増殖的感染を引き起こすことができ
ず、その結果、ヘルパーウイルスによるｒＡＡＶベクターストックの最小限の混
入をもたらす。該システムは、ヒトアデノウイルスがサル細胞において不完全な
感染を行うという知見を利用している（Andersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 81: 4034-4027, 1984; Rossら、J. Virol. 66: 3110-3117, 1992）。しかし ながら、ヘルパーアデノウイルスの初期遺伝子を発現し、それにより、ｒＡＡＶ
生産に必要な必須のアデノウイルスタンパク質を提供する。サル起源の細胞にお
けるアデノウイルス後期遺伝子の不十分な発現は、細胞ライゼート中のアデノウ
イルスタンパク質の数を減少させるのと同様にアデノウイルス子孫の収量を低下
させ、それにより、ｒＡＡＶベクターのその後の精製を容易にする。該生産シス
テムに好ましいサル細胞系は、限定するものではないが、ＣＶ−１、ＣＶ−Ｃ（
Riceら、J. Virol. 49: 35-49, 1984）、ＶｅｒｏおよびＢＳＣ−１を包含する 。
【００２６】 好ましくは、サル生産細胞系は、天然プロモーター（ｐ５／ｒｅｐおよびｐ４
０／ｃａｐ）の制御下のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含み、これらの遺伝
子によりコードされるタンパク質は生産細胞によって直接提供される。これらの
プロモーターの制御下でｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有し、これらの生産細胞
を作製するために使用される構築物の概略図を図２に示す。
０／ｃａｐ）の制御下のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含み、これらの遺伝
子によりコードされるタンパク質は生産細胞によって直接提供される。これらの
プロモーターの制御下でｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有し、これらの生産細胞
を作製するために使用される構築物の概略図を図２に示す。
【００２７】 本発明は、さらに、ｒＡＡＶベクターストックを生産するために使用できる新
規なアデノウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクターに向けられている。ハイブ
リッドベクターは、全ての必須アデノウイルスコーディング配列を供給し、さら
に、発現制御エレメントに作動可能に連結され、ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接するト
ランスジーンを含むｒＡＡＶゲノムを含有する。かかるベクターの複製能力のあ
る具体例は、ｒＡＡＶゲノムを複製に必須ではないアデノウイルスゲノムの領域
、例えばＥ３領域中に取り込むことによって構築できる。複製欠損ハブリッドベ
クターの作製を所望の場合、かかるベクターは、例えば、アデノウイルスＥ１領
域内の欠失中にｒＡＡＶゲノムを含んでもよい。
規なアデノウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクターに向けられている。ハイブ
リッドベクターは、全ての必須アデノウイルスコーディング配列を供給し、さら
に、発現制御エレメントに作動可能に連結され、ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接するト
ランスジーンを含むｒＡＡＶゲノムを含有する。かかるベクターの複製能力のあ
る具体例は、ｒＡＡＶゲノムを複製に必須ではないアデノウイルスゲノムの領域
、例えばＥ３領域中に取り込むことによって構築できる。複製欠損ハブリッドベ
クターの作製を所望の場合、かかるベクターは、例えば、アデノウイルスＥ１領
域内の欠失中にｒＡＡＶゲノムを含んでもよい。
【００２８】 本発明の代表的アデノウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクターを図３に示し
、そこから、かかる設計のいくつかの有益な特徴を知ることができる。該ベクタ
ーは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ ＲＮＡおよびＥ４ＯＲＦ６を包含するｒ ＡＡＶ生産に必要な種々のアデノウイルスゲノム領域を含有する。アデノウイル
スゲノムの他の具体例が可能であり、例えば、ベクター中にＯＲＦ６だけを含ま
せるのではなくて、野生型Ｅ４領域を含ませることがある。発現制御配列に作動
可能に連結されたトランスジーンを含むｒＡＡＶベクターゲノムは、好ましくは
、アデノウイルスゲノムのＥ３領域における欠失中に挿入される。ハイブリッド
ベクターの利益は、それが複製能力を有し、例えば、Ａ５４９またはＨｅＬａ細
胞上での増殖によって商業的規模で製造できることである。さらに、ハイブリッ
ドベクターは、また、システムのサル生産細胞において複製でき、ベクター中に
含有されるｒＡＡＶベクターゲノムの付加的なコピーを提供する。ハイブリッド
ベクターがＥ４ ＯＲＦ６のみを含有する場合、かかるベクターはアデノウイル ス繊維タンパク質の合成の減少を示し、それにより、さらにウイルス子孫の生産
を制限する（Armentanoら、Hum. Gene Ther. 6: 1343-1353, 1995）。該具体例 において、アデノウイルスは、そのＥ３領域におけるヌクレオチド２７９７１〜
３０９３７の欠失を含有し、そこにトランスジーンを含むベクターゲノムおよび
関連の制御配列を挿入することができるので、該ハイブリッドベクターは、種々
のｒＡＡＶゲノム設計をデリバリーするために使用できる。
、そこから、かかる設計のいくつかの有益な特徴を知ることができる。該ベクタ
ーは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ ＲＮＡおよびＥ４ＯＲＦ６を包含するｒ ＡＡＶ生産に必要な種々のアデノウイルスゲノム領域を含有する。アデノウイル
スゲノムの他の具体例が可能であり、例えば、ベクター中にＯＲＦ６だけを含ま
せるのではなくて、野生型Ｅ４領域を含ませることがある。発現制御配列に作動
可能に連結されたトランスジーンを含むｒＡＡＶベクターゲノムは、好ましくは
、アデノウイルスゲノムのＥ３領域における欠失中に挿入される。ハイブリッド
ベクターの利益は、それが複製能力を有し、例えば、Ａ５４９またはＨｅＬａ細
胞上での増殖によって商業的規模で製造できることである。さらに、ハイブリッ
ドベクターは、また、システムのサル生産細胞において複製でき、ベクター中に
含有されるｒＡＡＶベクターゲノムの付加的なコピーを提供する。ハイブリッド
ベクターがＥ４ ＯＲＦ６のみを含有する場合、かかるベクターはアデノウイル ス繊維タンパク質の合成の減少を示し、それにより、さらにウイルス子孫の生産
を制限する（Armentanoら、Hum. Gene Ther. 6: 1343-1353, 1995）。該具体例 において、アデノウイルスは、そのＥ３領域におけるヌクレオチド２７９７１〜
３０９３７の欠失を含有し、そこにトランスジーンを含むベクターゲノムおよび
関連の制御配列を挿入することができるので、該ハイブリッドベクターは、種々
のｒＡＡＶゲノム設計をデリバリーするために使用できる。
【００２９】 本発明のさらに好ましい具体例は、ＡＡＶヘルパー遺伝子を含むサル細胞系お
よびアデノウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクターを含む生産システムである
。該組み合わせは、ｒＡＡＶ生産を開始するために、ハイブリッドベクターによ
る生産細胞の感染のみを必要とするという点で有利である。該システムのさらな
る利益は、ＡＡＶウイルスプロモーターのトランス活性化を引き起こし、ＡＡＶ
遺伝子発現を導くヘルパーアデノウイルスによって細胞が感染されるまで、生産
細胞中のＡＡＶ遺伝子は転写的にサイレントであることである。
よびアデノウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクターを含む生産システムである
。該組み合わせは、ｒＡＡＶ生産を開始するために、ハイブリッドベクターによ
る生産細胞の感染のみを必要とするという点で有利である。該システムのさらな
る利益は、ＡＡＶウイルスプロモーターのトランス活性化を引き起こし、ＡＡＶ
遺伝子発現を導くヘルパーアデノウイルスによって細胞が感染されるまで、生産
細胞中のＡＡＶ遺伝子は転写的にサイレントであることである。
【００３０】 好ましくは、ｐＩＭ４５またはｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐ（Vincentら、J. Vi
rol. 71: 1897-1905, 1997）によって提供されるＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝
子を生産細胞ゲノム中に組み込み、発現制御配列に作動可能に連結されたトラン
スジーンを含むｒＡＡＶベクターゲノムをＥ１、Ｅ２、ΔＥ３およびＥ４を含む
アデノウイルスゲノムまたはＥ１、Ｅ２、ΔＥ３およびＥ４ＯＲＦ６を含むアデ
ノウイルスゲノムのＥ３領域中にクローン化する（Armentanoら、Hum. Gene The
r. 6: 1343-1353, 1995）。生産細胞系は、本発明の適応した非ヒト細胞系（例 えば、ＣＡＲをコードしている核酸を含むげっ歯類細胞系）であり、またはサル
細胞系、特にＣＶ−１細胞であってもよい。
rol. 71: 1897-1905, 1997）によって提供されるＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝
子を生産細胞ゲノム中に組み込み、発現制御配列に作動可能に連結されたトラン
スジーンを含むｒＡＡＶベクターゲノムをＥ１、Ｅ２、ΔＥ３およびＥ４を含む
アデノウイルスゲノムまたはＥ１、Ｅ２、ΔＥ３およびＥ４ＯＲＦ６を含むアデ
ノウイルスゲノムのＥ３領域中にクローン化する（Armentanoら、Hum. Gene The
r. 6: 1343-1353, 1995）。生産細胞系は、本発明の適応した非ヒト細胞系（例 えば、ＣＡＲをコードしている核酸を含むげっ歯類細胞系）であり、またはサル
細胞系、特にＣＶ−１細胞であってもよい。
【００３１】 サル細胞系を生産細胞系として使用する本発明の他の態様において、アデノウ
イルスの増殖効率の操作を可能にする表現型を示すように、特異的な突然変異を
、ハイブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶベクターを作製するために使用される
ヒトアデノウイルス中に導入することができる。例えば、繊維タンパク質の温度
感受性生産を与える突然変異を含有するウイルスを使用して、アデノウイルス子
孫の形成を低下させ、それにより、ｒＡＡＶベクターストックの豊富な調製物を
導くように、限定的温度でｒＡＡＶを生産できる。アデノウイルス血清型２およ
び５の分子および遺伝子地図の知見を用いて、当業者は、標準的クローニング技
法により、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、かかる突然変異をアデノ
ウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクター中に導入することができる。好ましい
具体例において、ハイブリッドベクターを作製するために使用されるアデノウイ
ルスは、Ｈ５ｔｓ１４２であるか、または同様の表現型を与える特定の突然変異
を含有するように操作されたアデノウイルスである（Chee-Sheungら、J. Virol.
42: 932-950, 1982）。
イルスの増殖効率の操作を可能にする表現型を示すように、特異的な突然変異を
、ハイブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶベクターを作製するために使用される
ヒトアデノウイルス中に導入することができる。例えば、繊維タンパク質の温度
感受性生産を与える突然変異を含有するウイルスを使用して、アデノウイルス子
孫の形成を低下させ、それにより、ｒＡＡＶベクターストックの豊富な調製物を
導くように、限定的温度でｒＡＡＶを生産できる。アデノウイルス血清型２およ
び５の分子および遺伝子地図の知見を用いて、当業者は、標準的クローニング技
法により、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、かかる突然変異をアデノ
ウイルス／ｒＡＡＶハイブリッドベクター中に導入することができる。好ましい
具体例において、ハイブリッドベクターを作製するために使用されるアデノウイ
ルスは、Ｈ５ｔｓ１４２であるか、または同様の表現型を与える特定の突然変異
を含有するように操作されたアデノウイルスである（Chee-Sheungら、J. Virol.
42: 932-950, 1982）。
【００３２】 サル細胞系生産システムに有用な他のハイブリッドベクターは、とりわけ、Ｃ
Ｖ−１またはＨｅＬａ細胞中、複製を許容しない温度でウイルス子孫の形成を制
限するアデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質において突然変異を含有するアデノ
ウイルス変異体Ａｄｔｓ４００由来のハイブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶベ
クターを包含する（Riceら、J. Virol. 49: 35-49, 1984）。本発明に有用なウ イルス収量を低下させる他の温度感受性アデノウイルス変異体は、とりわけ、ア
デノウイルス５型の繊維遺伝子中のｔｓ突然変異（Chee-Sheungら、J. Virol. 4
2: 932-950, 1982; ts mutations in a non-structural protein, p100, with t
he phenotype of reduced capsid assembly (Carstens ら、J. Gen. Virol. 37:
453-474, 1997; Oosterom-Dragonら、J. Virol. 40: 491-500, 1981）およびア
デノウイルス２型のＩＩＩａ遺伝子中のｔｓ突然変異を後期遺伝子発現欠損の表
現型および検出用ウイルスパッケージングと共に包含する（Chroboczekら、Gene
49: 157-160, 1986）。ハイブリッドベクターを温度感受性突然変異を有するア
デノウイルスから作製する場合、全ｒＡＡＶ生産過程を複製を３９．５℃という
非許容温度で行う。
Ｖ−１またはＨｅＬａ細胞中、複製を許容しない温度でウイルス子孫の形成を制
限するアデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質において突然変異を含有するアデノ
ウイルス変異体Ａｄｔｓ４００由来のハイブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶベ
クターを包含する（Riceら、J. Virol. 49: 35-49, 1984）。本発明に有用なウ イルス収量を低下させる他の温度感受性アデノウイルス変異体は、とりわけ、ア
デノウイルス５型の繊維遺伝子中のｔｓ突然変異（Chee-Sheungら、J. Virol. 4
2: 932-950, 1982; ts mutations in a non-structural protein, p100, with t
he phenotype of reduced capsid assembly (Carstens ら、J. Gen. Virol. 37:
453-474, 1997; Oosterom-Dragonら、J. Virol. 40: 491-500, 1981）およびア
デノウイルス２型のＩＩＩａ遺伝子中のｔｓ突然変異を後期遺伝子発現欠損の表
現型および検出用ウイルスパッケージングと共に包含する（Chroboczekら、Gene
49: 157-160, 1986）。ハイブリッドベクターを温度感受性突然変異を有するア
デノウイルスから作製する場合、全ｒＡＡＶ生産過程を複製を３９．５℃という
非許容温度で行う。
【００３３】 ｒＡＡＶベクターの生産において使用されるｒＡＡＶベクターゲノムを含む核
酸は、好ましくは、シス作用性逆方向末端反復エレメント（ＩＴＲ）および発現
制御配列に作動可能に連結された１以上の目的の核酸（トランスジーン）を含有
する。かかる発現制御配列は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル
化エレメントを包含する。ウイルス性または非ウイルス性プロモーターは、ｒＡ
ＡＶベクターにおいてトランスジーンに作動可能に連結でき、ＣＭＶプロモータ
ーまたはその機能的変種、またはＰＧＫプロモーター、またはトランスジーンの
発現に有用であることが知られているいずれか他のプロモーターを包含する。発
現制御配列は、細胞または組織特異的発現をもたらしてもよく、あるいは外来性
物質または刺激によって、例えば、ＲＵ４８６または遺伝子発現を誘導できる他
の小型分子によって誘導可能であってもよい。
酸は、好ましくは、シス作用性逆方向末端反復エレメント（ＩＴＲ）および発現
制御配列に作動可能に連結された１以上の目的の核酸（トランスジーン）を含有
する。かかる発現制御配列は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル
化エレメントを包含する。ウイルス性または非ウイルス性プロモーターは、ｒＡ
ＡＶベクターにおいてトランスジーンに作動可能に連結でき、ＣＭＶプロモータ
ーまたはその機能的変種、またはＰＧＫプロモーター、またはトランスジーンの
発現に有用であることが知られているいずれか他のプロモーターを包含する。発
現制御配列は、細胞または組織特異的発現をもたらしてもよく、あるいは外来性
物質または刺激によって、例えば、ＲＵ４８６または遺伝子発現を誘導できる他
の小型分子によって誘導可能であってもよい。
【００３４】 ｒＡＡＶベクターはトランスジーンを含む。トランスジーンは、いずれかの遺
伝子移入方法によって、外来的に細胞に提供される核酸として同定される。本発
明のｒＡＡＶベクターからデリバリーされ、発現できるトランスジーンは、限定
するものではないが、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、例えば、イ
ンターロイキンおよびインターフェロン、凝固薬、成長因子、神経伝達物質、腫
瘍サプレッサー、アポリポタンパク質、抗原、および抗体、および他の生物学的
に活性なタンパク質をコードするものを包含する。ｒＡＡＶベクターによってコ
ードされうる特定のトランスジーンは、限定するものではないが、嚢胞性繊維症
膜貫通調節物質（ＣＦＴＲ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、β−グルコセレ
ブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、腫瘍壊死因子、ｐ５３、ｐ２１、因子Ｖ
ＩＩＩ、因子ＩＸ、単純ヘルペスチミジンキナーゼおよびガンシクロビル（ganc
yclovir）、網膜芽腫（Ｒｂ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコ ードしている核酸を包含する。アンチセンス分子またはリボザイムをコードして
いるトランスジーンもまた、本発明の範囲内である。そのように構築されたｒＡ
ＡＶベクターは、標的細胞に侵入し、核酸を標的細胞ゲノム中に組み込み、かか
る細胞中でトランスジーンを安定に発現できるので、トランスジーンの遺伝子移
入のために使用できる。
伝子移入方法によって、外来的に細胞に提供される核酸として同定される。本発
明のｒＡＡＶベクターからデリバリーされ、発現できるトランスジーンは、限定
するものではないが、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、例えば、イ
ンターロイキンおよびインターフェロン、凝固薬、成長因子、神経伝達物質、腫
瘍サプレッサー、アポリポタンパク質、抗原、および抗体、および他の生物学的
に活性なタンパク質をコードするものを包含する。ｒＡＡＶベクターによってコ
ードされうる特定のトランスジーンは、限定するものではないが、嚢胞性繊維症
膜貫通調節物質（ＣＦＴＲ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、β−グルコセレ
ブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、腫瘍壊死因子、ｐ５３、ｐ２１、因子Ｖ
ＩＩＩ、因子ＩＸ、単純ヘルペスチミジンキナーゼおよびガンシクロビル（ganc
yclovir）、網膜芽腫（Ｒｂ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコ ードしている核酸を包含する。アンチセンス分子またはリボザイムをコードして
いるトランスジーンもまた、本発明の範囲内である。そのように構築されたｒＡ
ＡＶベクターは、標的細胞に侵入し、核酸を標的細胞ゲノム中に組み込み、かか
る細胞中でトランスジーンを安定に発現できるので、トランスジーンの遺伝子移
入のために使用できる。
【００３５】 ｒＡＡＶベクターの核酸が本発明の細胞系中に安定に組み込まれる本発明の好ま
しい具体例において、例えば、トランスフェクション、リポフェクションまたは
エレクトロポレーションによって、プラスミド上のかかる配列の導入後に、かか
る組み込みが達成できる。ｒＡＡＶゲノムおよび選択マーカーをコードしている
核酸を含有するプラスミドの使用により、ｒＡＡＶゲノムの安定な組み込みを有
する細胞を同定できる。ＡＡＶヘルパータンパク質の十分な供給およびヘルパー
ウイルスによる感染によって、かかる核酸をｒＡＡＶベクター粒子中への複製お
よびパッケージングに関して、細胞ゲノムからレスキューすることができる。
しい具体例において、例えば、トランスフェクション、リポフェクションまたは
エレクトロポレーションによって、プラスミド上のかかる配列の導入後に、かか
る組み込みが達成できる。ｒＡＡＶゲノムおよび選択マーカーをコードしている
核酸を含有するプラスミドの使用により、ｒＡＡＶゲノムの安定な組み込みを有
する細胞を同定できる。ＡＡＶヘルパータンパク質の十分な供給およびヘルパー
ウイルスによる感染によって、かかる核酸をｒＡＡＶベクター粒子中への複製お
よびパッケージングに関して、細胞ゲノムからレスキューすることができる。
【００３６】 本発明の１の具体例において、ｒＡＡＶベクターゲノム（ｔトランスジーン）
をそこに安定に組み込むための細胞系にデリバリーするために使用されるプラス
ミドは、ｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌであり、該プラスミドは、標準的組換え技法
により構築され、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたマーカートランス
ジーン（β−ガラクトシダーゼをコードしているｌａｃＺ）がＡＡＶ ＩＴＲ配 列に隣接している。このプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムにおける相補的
なヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションによって、またはＸ−ｇａ
ｌ染色を用いる生産されたマーカータンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の検出
によって、本発明の細胞系におけるベクター生産の定量を可能にする。
をそこに安定に組み込むための細胞系にデリバリーするために使用されるプラス
ミドは、ｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌであり、該プラスミドは、標準的組換え技法
により構築され、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたマーカートランス
ジーン（β−ガラクトシダーゼをコードしているｌａｃＺ）がＡＡＶ ＩＴＲ配 列に隣接している。このプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムにおける相補的
なヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションによって、またはＸ−ｇａ
ｌ染色を用いる生産されたマーカータンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の検出
によって、本発明の細胞系におけるベクター生産の定量を可能にする。
【００３７】 ｒＡＡＶベクターの生産は、外来性デリバリーによって、またはそこでの安定
な組み込みによって本発明の生産細胞系に提供されるｒＡＡＶベクター核酸のほ
かに、ベクター生産にトランスで必要とされるＡＡＶヘルパータンパク質の供給
を必要とする。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、プラスミド中または非ＡＡ
Ｖヘルパーウイルス中において生産細胞系に供給されることができる。ヘルパー
プラスミドは、ｒＡＡＶベクターの生産に必要なｒｅｐおよびｃａｐタンパク質
を生じるために、遺伝子からの発現を可能にする１以上の調節エレメントに作動
可能に連結されたＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する。ＡＡＶ遺伝子は
、それらの天然のウイルス性プロモーターから発現でき、または限定するもので
はないが、ＣＭＶプロモーターまたはその機能的変種を包含する発現を増加させ
る異種プロモーターに作動可能に連結されることができる。ｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子は、必要なレベルのタンパク質の発現の選択的最適化を可能にする別々の
調節エレメントから発現できる。ｐ５プロモーターは、トランス活性化のために
アデノウイルスＥ１Ａタンパク質を必要とするので、ｒｅｐ遺伝子がその天然プ
ロモーターの制御下にある場合、該遺伝子の生産細胞系への安定な組み込みは、
ｒｅｐタンパク質の構成的生産に由来する潜在的な細胞毒性を減少させ、これは
、ｒＡＡＶベクター生産サイクルの開始におけるヘルパーアデノウイルスによる
感染時においてのみ起こるであろう。
な組み込みによって本発明の生産細胞系に提供されるｒＡＡＶベクター核酸のほ
かに、ベクター生産にトランスで必要とされるＡＡＶヘルパータンパク質の供給
を必要とする。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、プラスミド中または非ＡＡ
Ｖヘルパーウイルス中において生産細胞系に供給されることができる。ヘルパー
プラスミドは、ｒＡＡＶベクターの生産に必要なｒｅｐおよびｃａｐタンパク質
を生じるために、遺伝子からの発現を可能にする１以上の調節エレメントに作動
可能に連結されたＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する。ＡＡＶ遺伝子は
、それらの天然のウイルス性プロモーターから発現でき、または限定するもので
はないが、ＣＭＶプロモーターまたはその機能的変種を包含する発現を増加させ
る異種プロモーターに作動可能に連結されることができる。ｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子は、必要なレベルのタンパク質の発現の選択的最適化を可能にする別々の
調節エレメントから発現できる。ｐ５プロモーターは、トランス活性化のために
アデノウイルスＥ１Ａタンパク質を必要とするので、ｒｅｐ遺伝子がその天然プ
ロモーターの制御下にある場合、該遺伝子の生産細胞系への安定な組み込みは、
ｒｅｐタンパク質の構成的生産に由来する潜在的な細胞毒性を減少させ、これは
、ｒＡＡＶベクター生産サイクルの開始におけるヘルパーアデノウイルスによる
感染時においてのみ起こるであろう。
【００３８】 ＡＡＶヘルパー遺伝子およびそれらの作動可能に連結した調節エレメントが本
発明の細胞系に安定に組み込まれる場合、ＡＡＶヘルパー遺伝子のかかる組み込
みは、トランスフェクションまたは当業者に既知の他の核酸移入方法を用いて、
かかる遺伝子を含むプラスミドの本発明の細胞系への導入によって達成できる。
ＡＡＶヘルパープラスミドは、好ましくは、発現において、生産細胞系のゲノム
中に組み込まれたヘルパー遺伝子を含有する細胞の同定を可能にする選択マーカ
ーまたはリポーター遺伝子を含有する。安定に組み込まれたＡＡＶヘルパー遺伝
子を有する生産細胞系の作製に使用されるヘルパープラスミドは、まず、一過性
トランスフェクション実験においてｒＡＡＶ生産を支持するそれらの能力につい
て試験される。
発明の細胞系に安定に組み込まれる場合、ＡＡＶヘルパー遺伝子のかかる組み込
みは、トランスフェクションまたは当業者に既知の他の核酸移入方法を用いて、
かかる遺伝子を含むプラスミドの本発明の細胞系への導入によって達成できる。
ＡＡＶヘルパープラスミドは、好ましくは、発現において、生産細胞系のゲノム
中に組み込まれたヘルパー遺伝子を含有する細胞の同定を可能にする選択マーカ
ーまたはリポーター遺伝子を含有する。安定に組み込まれたＡＡＶヘルパー遺伝
子を有する生産細胞系の作製に使用されるヘルパープラスミドは、まず、一過性
トランスフェクション実験においてｒＡＡＶ生産を支持するそれらの能力につい
て試験される。
【００３９】 ｒＡＡＶベクター生産のための安定な細胞系は、一過性トランスフェクション
法に優る多くの利益を有する。最初に、トランスフェクション法はｒＡＡＶベク
ターの商業的製造に必要な量まで拡大するのが困難である。第二に、ｒＡＡＶベ
クターを製造するために使用される場合、げっ歯類およびサル細胞系は低いトラ
ンスフェクション能率を有する。したがって、安定な細胞系を用いた場合のヘル
パーアデノウイルスに対するｒＡＡＶベクターの比率は、一過性の方法において
得られるよりもはるかに大きい。
法に優る多くの利益を有する。最初に、トランスフェクション法はｒＡＡＶベク
ターの商業的製造に必要な量まで拡大するのが困難である。第二に、ｒＡＡＶベ
クターを製造するために使用される場合、げっ歯類およびサル細胞系は低いトラ
ンスフェクション能率を有する。したがって、安定な細胞系を用いた場合のヘル
パーアデノウイルスに対するｒＡＡＶベクターの比率は、一過性の方法において
得られるよりもはるかに大きい。
【００４０】 ＡＡＶヘルパータンパク質を提供するために本発明のいずれかの生産細胞系に
おいて使用される好ましいＡＡＶヘルパープラスミドは、とりわけ、天然ｐ５お
よびｐ４０プロモーターの制御下のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する
ｐＩＭ４５（McCarty, D.M.ら、J. Virol. 65: 2936-2945, 1991）およびｐ５ｒ
ｅｐΔＣＭＶｃａｐ（in Vincentら、J. Virol. 71: 1897-1905, 1997）を包含 する。好ましくは、ｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐを生産細胞系を確立するために使
用する。プラスミドｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐにおいて、ｒｅｐ遺伝子は、天然
ｐ５プロモーターの制御下にあり、一方、ｃａｐ遺伝子は、構造タンパク質の高
レベル発現のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に
連結される。
おいて使用される好ましいＡＡＶヘルパープラスミドは、とりわけ、天然ｐ５お
よびｐ４０プロモーターの制御下のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する
ｐＩＭ４５（McCarty, D.M.ら、J. Virol. 65: 2936-2945, 1991）およびｐ５ｒ
ｅｐΔＣＭＶｃａｐ（in Vincentら、J. Virol. 71: 1897-1905, 1997）を包含 する。好ましくは、ｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐを生産細胞系を確立するために使
用する。プラスミドｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐにおいて、ｒｅｐ遺伝子は、天然
ｐ５プロモーターの制御下にあり、一方、ｃａｐ遺伝子は、構造タンパク質の高
レベル発現のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に
連結される。
【００４１】 ｒＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶヘルパー遺伝子が１つのプラスミド上で
一緒に生産細胞系に提供される場合、プラスミドは、少なくともｒＡＡＶベクタ
ー（ＩＴＲが目的のトランスジーンに隣接している）およびＡＡＶヘルパー（所
望の調節エレメントの制御下のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）のための最少配列を
含有するように構築され、さらに、安定にトランスフェクトされた細胞の同定を
可能にする選択マーカーを含有する。かかるプラスミドの例、ｐＶＨ−１６＋ｎ
ｅｏ（図１）は、生産細胞系をトランスフェクトするために使用される。ｐＶＨ
−１６＋ｎｅｏプラスミドは、ＡＡＶ逆方向末端反復配列に隣接するＣＭＶ−ｌ
ａｃＺ発現カセット（ｒＡＡＶベクター）、およびＣＭＶプロモーターに作動可
能に連結されたｃａｐ遺伝子およびｐ５プロモーターに作動可能に連結されたｒ
ｅｐ遺伝子を含むＡＡＶヘルパー遺伝子を含有する。さらに、それは、ＳＶ４０
プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を含む
。生産細胞系は、増殖的感染を引き起こさないが、トランスで必要なヘルパータ
ンパク質を提供する非ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）
の結合および侵入を可能にするように適応される。別法では、生産細胞系は、天
然にかかるヘルパーウイルスによって侵入を受けやすいが、増殖的感染を支持で
きない。ｐＶＨ−１６＋ｎｅｏを用いることによって行われる生産細胞ゲノム中
へのｒＡＡＶベクターおよびＡＡＶヘルパー遺伝子の安定な組み込みにおいて、
ｒＡＡＶ生産を引き起こすために、生産細胞系は単に、非ＡＡＶヘルパーウイル
スによる感染を必要とするだけである。該生産システムの利益は、ｒＡＡＶ生産
を開始するために、ヘルパーアデノウイルスによる感染を必要とするだけである
ことにある。
一緒に生産細胞系に提供される場合、プラスミドは、少なくともｒＡＡＶベクタ
ー（ＩＴＲが目的のトランスジーンに隣接している）およびＡＡＶヘルパー（所
望の調節エレメントの制御下のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）のための最少配列を
含有するように構築され、さらに、安定にトランスフェクトされた細胞の同定を
可能にする選択マーカーを含有する。かかるプラスミドの例、ｐＶＨ−１６＋ｎ
ｅｏ（図１）は、生産細胞系をトランスフェクトするために使用される。ｐＶＨ
−１６＋ｎｅｏプラスミドは、ＡＡＶ逆方向末端反復配列に隣接するＣＭＶ−ｌ
ａｃＺ発現カセット（ｒＡＡＶベクター）、およびＣＭＶプロモーターに作動可
能に連結されたｃａｐ遺伝子およびｐ５プロモーターに作動可能に連結されたｒ
ｅｐ遺伝子を含むＡＡＶヘルパー遺伝子を含有する。さらに、それは、ＳＶ４０
プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を含む
。生産細胞系は、増殖的感染を引き起こさないが、トランスで必要なヘルパータ
ンパク質を提供する非ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）
の結合および侵入を可能にするように適応される。別法では、生産細胞系は、天
然にかかるヘルパーウイルスによって侵入を受けやすいが、増殖的感染を支持で
きない。ｐＶＨ−１６＋ｎｅｏを用いることによって行われる生産細胞ゲノム中
へのｒＡＡＶベクターおよびＡＡＶヘルパー遺伝子の安定な組み込みにおいて、
ｒＡＡＶ生産を引き起こすために、生産細胞系は単に、非ＡＡＶヘルパーウイル
スによる感染を必要とするだけである。該生産システムの利益は、ｒＡＡＶ生産
を開始するために、ヘルパーアデノウイルスによる感染を必要とするだけである
ことにある。
【００４２】 本発明は、また、本発明の生産細胞系を用いるｒＡＡＶベクターの生産方法に
向けられる。好ましい方法において、生産細胞系は、細胞に結合し、侵入できる
が、増殖的感染を引き起こすことができない非ＡＡＶヘルパーウイルス、例えば
、アデノウイルスに対するレセプターをコードしている核酸を含み、発現する。
また、生産細胞系は、ｒＡＡＶベクターゲノムおよびそのゲノム中に安定に組み
込まれたＡＡＶヘルパー遺伝子を含む。したがって、ｒＡＡＶベクターの生産は
、ヘルパーウイルスによる生産細胞系の感染のみを必要とする。かかる感染にお
いて、ｒＡＡＶベクターゲノムを切り出し、複製し、遺伝子移入に使用できるウ
イルス粒子のキャプシド中に入れる。好ましくは、かかる生産細胞を感染多重度
（ＭＯＩ）５から１００にて、非ＡＡＶヘルパーウイルスで感染させる。
向けられる。好ましい方法において、生産細胞系は、細胞に結合し、侵入できる
が、増殖的感染を引き起こすことができない非ＡＡＶヘルパーウイルス、例えば
、アデノウイルスに対するレセプターをコードしている核酸を含み、発現する。
また、生産細胞系は、ｒＡＡＶベクターゲノムおよびそのゲノム中に安定に組み
込まれたＡＡＶヘルパー遺伝子を含む。したがって、ｒＡＡＶベクターの生産は
、ヘルパーウイルスによる生産細胞系の感染のみを必要とする。かかる感染にお
いて、ｒＡＡＶベクターゲノムを切り出し、複製し、遺伝子移入に使用できるウ
イルス粒子のキャプシド中に入れる。好ましくは、かかる生産細胞を感染多重度
（ＭＯＩ）５から１００にて、非ＡＡＶヘルパーウイルスで感染させる。
【００４３】 ｒＡＡＶベクターの回収は、本発明の生産細胞由来の細胞ライゼートを用いて
行う。ライゼートは、標準的な密度勾配遠心分離、例えば、ＣｓＣｌ勾配を用い
て分画できる。かかる勾配精製は、いずれかの混入している非ＡＡＶヘルパーウ
イルスを除去する。別法では、いずれかの非ＡＡＶヘルパーウイルスを細胞ライ
ゼートの加熱不活化によって除去できる。しかしながら、本発明の生産細胞系、
ヘルパーウイルスおよび方法は、本質的に非ＡＡＶヘルパーウイルスを含有しな
いｒＡＡＶベクターストックの生産をもたらす。 別法では、例えば、出典明示により本明細書の一部とするＷＯ９７／０８２９
８号に示されるようなクロマトグラフィー技法を用いて、ｒＡＡＶ精製を行うこ
とができる。
行う。ライゼートは、標準的な密度勾配遠心分離、例えば、ＣｓＣｌ勾配を用い
て分画できる。かかる勾配精製は、いずれかの混入している非ＡＡＶヘルパーウ
イルスを除去する。別法では、いずれかの非ＡＡＶヘルパーウイルスを細胞ライ
ゼートの加熱不活化によって除去できる。しかしながら、本発明の生産細胞系、
ヘルパーウイルスおよび方法は、本質的に非ＡＡＶヘルパーウイルスを含有しな
いｒＡＡＶベクターストックの生産をもたらす。 別法では、例えば、出典明示により本明細書の一部とするＷＯ９７／０８２９
８号に示されるようなクロマトグラフィー技法を用いて、ｒＡＡＶ精製を行うこ
とができる。
【００４４】 本発明の細胞系および方法を用いるｒＡＡＶベクターの定量は、ウイルス収量
の決定によって測定できる。ウイルス収量を決定するために、標準ＡＡＶ感染中
心アッセイを用いて、感染性子孫の生産についてアッセイできる。試験すべきベ
クター試料を用いて２９３細胞を感染させ、２９３細胞は、例えば、ヘルパーア
デノウイルスおよび野生型ヘルパーＡＡＶでも感染される。ベクター複製を可能
にするためのインキュベーション期間後、細胞を回収し、フィルター上で溶解し
、次いで、ベクターＤＮＡにハイブリダイズすることが知られている核酸にハイ
ブリダイズさせる。陽性ハイブリダイゼーションは、感染中心を同定する。出発
物質の力価は、試験試料の調製において使用されるいずれかの希釈によって感染
中心の数を増加することによって決定する。生産におけるｒＡＡＶベクターがト
ランスジーンとしてリポーター遺伝子を含有する場合、ｒＡＡＶベクターを決定
するための別の方法を使用できる。例えば、ｌａｃＺトランスジーンを使用する
場合、感染細胞は、Ｘ−ｇａｌ染色を用いて遺伝子生産物、β−ガラクトシダー
ゼの生産について染色できる。例えば、プレートウェル中で青く染色された細胞
を数えることによって、力価を決定できる。ｒＡＡＶベクター生産を決定するた
めの他の方法は、生存能力のあるキャプシドに対する試料の電子顕微鏡またはＡ
ＡＶキャプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いる感染細胞の免疫
蛍光を包含する。
の決定によって測定できる。ウイルス収量を決定するために、標準ＡＡＶ感染中
心アッセイを用いて、感染性子孫の生産についてアッセイできる。試験すべきベ
クター試料を用いて２９３細胞を感染させ、２９３細胞は、例えば、ヘルパーア
デノウイルスおよび野生型ヘルパーＡＡＶでも感染される。ベクター複製を可能
にするためのインキュベーション期間後、細胞を回収し、フィルター上で溶解し
、次いで、ベクターＤＮＡにハイブリダイズすることが知られている核酸にハイ
ブリダイズさせる。陽性ハイブリダイゼーションは、感染中心を同定する。出発
物質の力価は、試験試料の調製において使用されるいずれかの希釈によって感染
中心の数を増加することによって決定する。生産におけるｒＡＡＶベクターがト
ランスジーンとしてリポーター遺伝子を含有する場合、ｒＡＡＶベクターを決定
するための別の方法を使用できる。例えば、ｌａｃＺトランスジーンを使用する
場合、感染細胞は、Ｘ−ｇａｌ染色を用いて遺伝子生産物、β−ガラクトシダー
ゼの生産について染色できる。例えば、プレートウェル中で青く染色された細胞
を数えることによって、力価を決定できる。ｒＡＡＶベクター生産を決定するた
めの他の方法は、生存能力のあるキャプシドに対する試料の電子顕微鏡またはＡ
ＡＶキャプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いる感染細胞の免疫
蛍光を包含する。
【００４５】 いずれかの混入しているヘルパーウイルスの力価は、ヘルパーウイルスの供給
源に適当なアッセイによって得ることができる。例えば、アデノウイルスをヘル
パーウイルスとして用いる場合、いずれかの混入を２９３またはＨｅＬａ細胞に
おけるプラーク形成のような標準的技法によって定量できる。
源に適当なアッセイによって得ることができる。例えば、アデノウイルスをヘル
パーウイルスとして用いる場合、いずれかの混入を２９３またはＨｅＬａ細胞に
おけるプラーク形成のような標準的技法によって定量できる。
【００４６】 本発明の生産細胞系、ヘルパーアデノウイルスおよび方法は、本質的に非ＡＡ
Ｖヘルパーウイルスを含有しないｒＡＡＶベクターストックを生じ；好ましくは
、かかるヘルパーウイルスは、１０10個のｒＡＡＶベクター粒子あたり１個未満
のヘルパーウイルスで検出される。本発明の反応物および方法は、幅広い種々の
応用において遺伝子移入に使用できるｒＡＡＶベクターの精製ストックの生産に
対する有用性を有する。
Ｖヘルパーウイルスを含有しないｒＡＡＶベクターストックを生じ；好ましくは
、かかるヘルパーウイルスは、１０10個のｒＡＡＶベクター粒子あたり１個未満
のヘルパーウイルスで検出される。本発明の反応物および方法は、幅広い種々の
応用において遺伝子移入に使用できるｒＡＡＶベクターの精製ストックの生産に
対する有用性を有する。
【００４７】 本発明の実施は、別記しないかぎり、当該分野の範囲内にあるタンパク質化学
、分子ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および製薬学の従来の技法を用
いる。かかる技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocol
s in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc., New York,
1995およびRemington's Pharmaceutical Science,第１７版、Mack Publishing C
o., Easton, PA, 1985を参照のこと。 本発明は、さらに、以下の特定の実施例によって説明され、それらは、いかな
る方法によっても、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
、分子ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および製薬学の従来の技法を用
いる。かかる技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocol
s in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc., New York,
1995およびRemington's Pharmaceutical Science,第１７版、Mack Publishing C
o., Easton, PA, 1985を参照のこと。 本発明は、さらに、以下の特定の実施例によって説明され、それらは、いかな
る方法によっても、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００４８】 実施例１：ＣＡＲをコードしている核酸を発現するげっ歯類細胞におけるＡＡ
Ｖの一過性トランスフェクションパッケージング 安定な細胞系の構築に使用されるべきヘルパープラスミド構築物の活性を確認
するために、一過性トランスフェクションパッケージング実験を２９３細胞（陽
性対照）、マウスＡ９−Ｔ１４細胞（ＣＡＲ遺伝子の単一コピー）、マウスＡ９
−２４９８．１およびＡ９−２４９８．６細胞（各々、ＣＡＲ遺伝子をコードし
ている多コピーのＢＡＣクローンを有する）、およびマウスＡ９−Ｍａｍ１Ｒ＋
またはＡ９−Ｍａｍ２Ｒ＋細胞（ＣＡＲ遺伝子を欠損している）に対して行った
。ＡＡＶベクタープラスミドはｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌ（１．５μｇ／１０6 細胞）であり、ＡＡＶヘルパープラスミドはｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐ（１５μ
ｇ／１０6細胞）であり、野生型ヘルパーアデノウイルスは５．６ＩＵ／１０9細
胞で使用した。細胞をアデノウイルスで１時間感染させた後、リン酸カルシウム
−媒介トランスフェクションによるプラスミドのトランスフェクションをさらに
４時間、細胞に対して行った。
Ｖの一過性トランスフェクションパッケージング 安定な細胞系の構築に使用されるべきヘルパープラスミド構築物の活性を確認
するために、一過性トランスフェクションパッケージング実験を２９３細胞（陽
性対照）、マウスＡ９−Ｔ１４細胞（ＣＡＲ遺伝子の単一コピー）、マウスＡ９
−２４９８．１およびＡ９−２４９８．６細胞（各々、ＣＡＲ遺伝子をコードし
ている多コピーのＢＡＣクローンを有する）、およびマウスＡ９−Ｍａｍ１Ｒ＋
またはＡ９−Ｍａｍ２Ｒ＋細胞（ＣＡＲ遺伝子を欠損している）に対して行った
。ＡＡＶベクタープラスミドはｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌ（１．５μｇ／１０6 細胞）であり、ＡＡＶヘルパープラスミドはｐ５ｒｅｐΔＣＭＶｃａｐ（１５μ
ｇ／１０6細胞）であり、野生型ヘルパーアデノウイルスは５．６ＩＵ／１０9細
胞で使用した。細胞をアデノウイルスで１時間感染させた後、リン酸カルシウム
−媒介トランスフェクションによるプラスミドのトランスフェクションをさらに
４時間、細胞に対して行った。
【００４９】 トランスフェクト／感染細胞を３７℃で２日間インキュベートした。インキュ
ベーション後、細胞を収集し、次いで、ベンゾナーゼ（banzonase）（American
International Chemical）の存在下で３サイクルの凍結および解凍によって溶解
させた。次いで、１％デオキシクロレートおよび０．２５％トリプシンをライゼ
ートに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞ライ
ゼート（２ローラーボトル／勾配）をＳＷ２８ローター中のＣｓＣｌ段階勾配（
１．５ｇ／ｍｌ−１．３６ｇ／ｍｌ）に付し、４℃で６時間、２６Ｋで遠心分離
した。ＮＶＴ６５ローターを用いて、フラクションを得、次いで、２つの平衡勾
配上で精製し、４℃で２０時間、６０Ｋにて遠心分離した。平衡勾配由来のフラ
クションを屈折率測定器上でスクリーンし、プールした。プールしたフラクショ
ンを１％スクロースを含有するＰＢＳ中で４℃で２時間、３回透析した。
ベーション後、細胞を収集し、次いで、ベンゾナーゼ（banzonase）（American
International Chemical）の存在下で３サイクルの凍結および解凍によって溶解
させた。次いで、１％デオキシクロレートおよび０．２５％トリプシンをライゼ
ートに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞ライ
ゼート（２ローラーボトル／勾配）をＳＷ２８ローター中のＣｓＣｌ段階勾配（
１．５ｇ／ｍｌ−１．３６ｇ／ｍｌ）に付し、４℃で６時間、２６Ｋで遠心分離
した。ＮＶＴ６５ローターを用いて、フラクションを得、次いで、２つの平衡勾
配上で精製し、４℃で２０時間、６０Ｋにて遠心分離した。平衡勾配由来のフラ
クションを屈折率測定器上でスクリーンし、プールした。プールしたフラクショ
ンを１％スクロースを含有するＰＢＳ中で４℃で２時間、３回透析した。
【００５０】 トランスで必要とされるタンパク質の供給源としてのヘルパープラスミドの有
効性をＡＡＶベクターストックの収量から決定した。ウイルス収量を決定するた
めに、感染ＡＡＶ子孫が生産プロトコールにおいて生産されるかどうかを示すＡ
ＡＶ感染中心アッセイを用いた。上記の精製プロトコールを用いて生産後に、組
換えＡＡＶベクターを回収した。
効性をＡＡＶベクターストックの収量から決定した。ウイルス収量を決定するた
めに、感染ＡＡＶ子孫が生産プロトコールにおいて生産されるかどうかを示すＡ
ＡＶ感染中心アッセイを用いた。上記の精製プロトコールを用いて生産後に、組
換えＡＡＶベクターを回収した。
【００５１】 １０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミンを補足した
ＤＭＥ培地中０．１ｍｌ／ウェル中、ウェルあたり１ｘ１０5個の細胞密度で１ 日培養した２９３細胞を用いて、アッセイを行った。約２４時間後、細胞をＭＯ
Ｉ２０にてアデノウイルスおよびＭＯＩ２にて野生型ＡＡＶで感染させた。ウイ
ルスを同一培地中に懸濁し、０．１ｍｌを各ウェルに加え、感染を開始させた。
ＡＡＶベクター試料をウェルに加え（２５−１００マイクロリットルのライゼー
トまたは希釈液）、プレートを３７℃で２４−３０時間インキュベートした。感
染後１日で、培地を注意深く細胞から除去した。次いで、細胞を固定し、Ｘ−ｇ
ａｌ染色に付し、青色細胞の数を記録した。
ＤＭＥ培地中０．１ｍｌ／ウェル中、ウェルあたり１ｘ１０5個の細胞密度で１ 日培養した２９３細胞を用いて、アッセイを行った。約２４時間後、細胞をＭＯ
Ｉ２０にてアデノウイルスおよびＭＯＩ２にて野生型ＡＡＶで感染させた。ウイ
ルスを同一培地中に懸濁し、０．１ｍｌを各ウェルに加え、感染を開始させた。
ＡＡＶベクター試料をウェルに加え（２５−１００マイクロリットルのライゼー
トまたは希釈液）、プレートを３７℃で２４−３０時間インキュベートした。感
染後１日で、培地を注意深く細胞から除去した。次いで、細胞を固定し、Ｘ−ｇ
ａｌ染色に付し、青色細胞の数を記録した。
【００５２】 表１に示した結果は、ＣＡＲをコードしている核酸を発現するマウス細胞が適
当なＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能を提供されるとき、ｒＡＡＶベク
ターに有効な生産細胞として機能することを示す。重要なことには、Ａ９−２４
９８．１およびＡ９−２４９８．６細胞からの、混入Ａｄウイルス収量に対する
ＡＡＶベクター収量の比率は２８０であり、一方、２９３細胞において該比率は
約０．０３であった。ＡＡＶベクターのアデノウイルスに対する比率のこのよう
な増加は、ＡＡＶベクターの混入アデノウイルスからのその後の精製を大いに容
易にする。
当なＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能を提供されるとき、ｒＡＡＶベク
ターに有効な生産細胞として機能することを示す。重要なことには、Ａ９−２４
９８．１およびＡ９−２４９８．６細胞からの、混入Ａｄウイルス収量に対する
ＡＡＶベクター収量の比率は２８０であり、一方、２９３細胞において該比率は
約０．０３であった。ＡＡＶベクターのアデノウイルスに対する比率のこのよう
な増加は、ＡＡＶベクターの混入アデノウイルスからのその後の精製を大いに容
易にする。
【００５３】 表１Ａｄ力価 細胞系 力価 （＋）対照 3.4x1010 Ｔ１４（ＣＡＲの単一コピー） 5.3x106 ２４９８．１（ＣＡＲ多コピーのＢＡＣクローン） 5.6x106 ２４９８．６（ＣＡＲ多コピーのＢＡＣクローン） 7.9x105 Ｍａｍ１Ｒ＋（空のベクター） 3.1x106 Ｍａｍ２Ｒ＋（空のベクター） 3.8x106 ＡＡＶ力価 細胞系 力価 （＋）対照 1.0x109 Ｔ１４ 3.1x107 ２４９８．１ 2.7x108 ２４９８．６ 1.1x108 Ｍａｍ１Ｒ＋ 3.0x106 Ｍａｍ２Ｒ＋ 2.8x106
【００５４】 実施例２：安定なｒＡＡＶ生産細胞系の確立 ｒＡＡＶ生産のための安定なげっ歯類細胞系を作製するために、ＡＡＶヘルパ
ー機能およびクローン選択のための選択マーカーを提供するプラスミドｐＩＭ４
５／ｎｅｏまたはｐ５ｒｅｐｄｅｌｔａＣＭＶｃａｐ／ｎｅｏをＡ９−２４９８
．１およびＡ９−２４９８．６細胞中に導入する。細胞を１０ｃｍ皿あたり２．
５ｘ１０6細胞で培養する。翌日、リン酸カルシウム−媒介トランスフェクショ ンを用いてプラスミド構築物を細胞中に導入する。翌日、各皿を５個の１０ｃｍ
皿中に分配し、翌日、Ｇ４１８（１００〜５００μｇ／ｍｌ）を含有する選択培
地を加える。クローンは１０〜１４日後に現れ、それらを９６ウェル皿中に取り
上げ、ほぼ集密になるまで生育させる。 細胞をクローンを維持するための９６ウェルプレートおよびｒＡＡＶ生産につ
いてスクリーニングするための別の９６ウェルプレート中に分配する。スクリー
ニングの場合、細胞をｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌでトランスフェクトし、ＭＯＩ
２０にてアデノウイルスで感染させる。４８時間後、プレートを４回、凍結−解
凍させ、ｒＡＡＶベクターを遊離させる。ｒＡＡＶベクターの生産は、実施例１
に上記したように、ライゼートの力価を決定することによって測定する。
ー機能およびクローン選択のための選択マーカーを提供するプラスミドｐＩＭ４
５／ｎｅｏまたはｐ５ｒｅｐｄｅｌｔａＣＭＶｃａｐ／ｎｅｏをＡ９−２４９８
．１およびＡ９−２４９８．６細胞中に導入する。細胞を１０ｃｍ皿あたり２．
５ｘ１０6細胞で培養する。翌日、リン酸カルシウム−媒介トランスフェクショ ンを用いてプラスミド構築物を細胞中に導入する。翌日、各皿を５個の１０ｃｍ
皿中に分配し、翌日、Ｇ４１８（１００〜５００μｇ／ｍｌ）を含有する選択培
地を加える。クローンは１０〜１４日後に現れ、それらを９６ウェル皿中に取り
上げ、ほぼ集密になるまで生育させる。 細胞をクローンを維持するための９６ウェルプレートおよびｒＡＡＶ生産につ
いてスクリーニングするための別の９６ウェルプレート中に分配する。スクリー
ニングの場合、細胞をｐＮＴＣ３ＣＭＶβｇａｌでトランスフェクトし、ＭＯＩ
２０にてアデノウイルスで感染させる。４８時間後、プレートを４回、凍結−解
凍させ、ｒＡＡＶベクターを遊離させる。ｒＡＡＶベクターの生産は、実施例１
に上記したように、ライゼートの力価を決定することによって測定する。
【００５５】 実施例３：ＡＡＶ製造のための複製欠損Ａｄ／ＡＡＶハイブリッド 標準的な分子方法を用いて、ｒＡＡＶベクターゲノムをＡｄ２のＥ１領域中、
ヌクレオチド位置３５８〜３３２８間に挿入する。ｒＡＡＶゲノムのための十分
なスペースを確保するために、ベクターのＥ４領域を全Ｅ４配列の欠失（ヌクレ
オチド３２８０２１９５〜３５５７７の欠失）およびＯＲＦ６コーディング配列
の挿入（ヌクレオチド３３１９５〜３４０７７）によって修飾する（Armentano ら、1995, Human Gene Therapy, vol6, 1343-1353）。別法でＡｄ／ｒＡＡＶベ クターは、配列において野生型である。ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ左およ
び右ＩＴＲ（１４５〜１７３塩基対の長さ）、トランスジーン（例えば、リポー
ターとして応用するためのイー・コリ（E.coli)ガラクトシダーゼ、ＥＰＯトラ ンスジーン）に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターよりなる（図３）。ｒ
ＡＡＶベクターのパッケージングは、複製欠損Ａｄ／ＡＡＶハイブリッドよび野
生型Ａｄウイルス（Ｅ１機能を提供するために）による実施例２の安定な生産細
胞系の感染によって成し遂げられる。感染後４８〜９６時間後、細胞を溶解して
パッケージされたＡＡＶベクターを遊離し、生産された少量のＡｄウイルスおよ
び細胞タンパク質のような混入生産物から精製する。
ヌクレオチド位置３５８〜３３２８間に挿入する。ｒＡＡＶゲノムのための十分
なスペースを確保するために、ベクターのＥ４領域を全Ｅ４配列の欠失（ヌクレ
オチド３２８０２１９５〜３５５７７の欠失）およびＯＲＦ６コーディング配列
の挿入（ヌクレオチド３３１９５〜３４０７７）によって修飾する（Armentano ら、1995, Human Gene Therapy, vol6, 1343-1353）。別法でＡｄ／ｒＡＡＶベ クターは、配列において野生型である。ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ左およ
び右ＩＴＲ（１４５〜１７３塩基対の長さ）、トランスジーン（例えば、リポー
ターとして応用するためのイー・コリ（E.coli)ガラクトシダーゼ、ＥＰＯトラ ンスジーン）に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターよりなる（図３）。ｒ
ＡＡＶベクターのパッケージングは、複製欠損Ａｄ／ＡＡＶハイブリッドよび野
生型Ａｄウイルス（Ｅ１機能を提供するために）による実施例２の安定な生産細
胞系の感染によって成し遂げられる。感染後４８〜９６時間後、細胞を溶解して
パッケージされたＡＡＶベクターを遊離し、生産された少量のＡｄウイルスおよ
び細胞タンパク質のような混入生産物から精製する。
【００５６】 実施例４：ＡＡＶ製造のための複製能力のあるＡｄ／ＡＡＶハイブリッドの構
築 標準的な分子方法を用いて、ＡＡＶベクターゲノムをＡｄ２のＥ３領域中、ヌ
クレオチド位置２７９７１〜３０９３７間に挿入する。ＡＡＶゲノムのための十
分なスペースを確保するために、ベクターのＥ４領域を全Ｅ４配列の欠失（ヌク
レオチド３２８０２〜３５５７７間の欠失）およびＯＲＦ６コーディング配列の
挿入（ヌクレオチド３３１９５〜３４０７７）によって修飾する（Armentanoら 、1995, Human Gene Therapy, vol6, 1343-1353）。別法でＡｄ／ＡＡＶベクタ ーは、配列において野生型である。ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ左および右
ＩＴＲ（１４５〜１７３塩基対の長さ）、トランスジーン（例えば、リポーター
として応用するためのイー・コリベータ−ガラクトシダーゼ、ＥＰＯトランスジ
ーン）に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターよりなる（図４）。ＡＡＶベ
クターのパッケージングは、実施例２の安定な生産細胞系の複製能力のあるＡｄ
／ＡＡＶハイブリッドでの感染によって成し遂げられる。感染後４８〜９６時間
後、細胞を溶解してパッケージされたＡＡＶベクターを遊離し、少量の生産され
たＡｄウイルスおよび細胞タンパク質のような混入生産物から精製する。
築 標準的な分子方法を用いて、ＡＡＶベクターゲノムをＡｄ２のＥ３領域中、ヌ
クレオチド位置２７９７１〜３０９３７間に挿入する。ＡＡＶゲノムのための十
分なスペースを確保するために、ベクターのＥ４領域を全Ｅ４配列の欠失（ヌク
レオチド３２８０２〜３５５７７間の欠失）およびＯＲＦ６コーディング配列の
挿入（ヌクレオチド３３１９５〜３４０７７）によって修飾する（Armentanoら 、1995, Human Gene Therapy, vol6, 1343-1353）。別法でＡｄ／ＡＡＶベクタ ーは、配列において野生型である。ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ左および右
ＩＴＲ（１４５〜１７３塩基対の長さ）、トランスジーン（例えば、リポーター
として応用するためのイー・コリベータ−ガラクトシダーゼ、ＥＰＯトランスジ
ーン）に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターよりなる（図４）。ＡＡＶベ
クターのパッケージングは、実施例２の安定な生産細胞系の複製能力のあるＡｄ
／ＡＡＶハイブリッドでの感染によって成し遂げられる。感染後４８〜９６時間
後、細胞を溶解してパッケージされたＡＡＶベクターを遊離し、少量の生産され
たＡｄウイルスおよび細胞タンパク質のような混入生産物から精製する。
【図１】 プラスミドｐＶＨ−１６＋ｎｅｏの概略図を示す。
【図２】 生産細胞系に挿入するためのＡＡＶヘルパー遺伝子の概略図を示
す。
す。
【図３】 ハブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶヘルパーアデノウイルスの
概略図を示す。
概略図を示す。
【図４】 ハイブリッドアデノウイルス／ｒＡＡＶヘルパーアデノウイルス
の概略図を示す。
の概略図を示す。
Claims (20)
- 【請求項１】 生産細胞系およびヘルパーアデノウイルス（該アデノウイル
スは生産細胞系において増殖的感染を引き起こすことができない）を含む組換え
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの高レベル生産のためのシステム。 - 【請求項２】 ヘルパーヒトアデノウイルス（該アデノウイルスは生産細胞
系において増殖的感染を引き起こすことができない）に対するレセプターをコー
ドしている安定に組み込まれた核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター生
産のための非ヒト生産細胞系。 - 【請求項３】 核酸がコクサッキーおよびアデノウイルスレセプター（ＣＡ
Ｒ）をコードする請求項２記載の細胞系。 - 【請求項４】 さらに、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ
ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸を含む請求項２記載の細胞系。 - 【請求項５】 さらにｒＡＡＶベクターゲノムを含む請求項４記載の細胞系
であって、ＡＡＶゲノムがＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に 連結されたトランスジーンを含む細胞系。 - 【請求項６】 ＣＡＲをコードしている核酸を含み、さらにＡＡＶｒｅｐお
よびｃａｐタンパク質をコードしている核酸およびｒＡＡＶベクターゲノムを含
む非ヒト生産細胞系（該ＡＡＶゲノムはＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列 に作動可能に連結されたトランスジーンを含む）を生産細胞系において増殖的感
染を引き起こすことができないヘルパーヒトアデノウイルスで感染させ、次いで
、該細胞系において生産されたｒＡＡＶベクターを単離することを特徴とするｒ
ＡＡＶ生産の方法。 - 【請求項７】 ａ）ＣＡＲをコードしている核酸を含み、さらにＡＡＶｒｅ
ｐおよびｃａｐタンパク質をコードしている核酸を含む非ヒト生産細胞系を、生
産細胞系において増殖的感染を引き起こすことができないヘルパーヒトアデノウ
イルスで感染させ； ｂ）該細胞系をｒＡＡＶゲノムを含む核酸でトランスフェクトし（該ＡＡＶゲ
ノムはＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に連結されたトランス ジーンを含む）、次いで; ｃ）該細胞系において生産されたｒＡＡＶベクターを単離する ことを含むｒＡＡＶ生産の方法。 - 【請求項８】 さらに、発現制御配列に作動可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ
およびｃａｐタンパク質をコードしている核酸を含む請求項２記載のサル細胞系
。 - 【請求項９】 ＣＶ−１細胞由来である請求項８記載の生産細胞系。
- 【請求項１０】 さらに、ｒＡＡＶゲノムを含む請求項８記載の生産細胞系
（該ＡＡＶゲノムはＡＡＶＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に連結され
たトランスジーンを含む）。 - 【請求項１１】 ａ）ヒトアデノウイルスに対するレセプターをコードして
いる安定に組み込まれた核酸を含むサル細胞系を、細胞系において増殖的感染を
引き起こすことができないヘルパーヒトアデノウイルスで感染させ； ｂ）該細胞系をｒＡＡＶゲノムでトランスフェクトし（該ＡＡＶゲノムはＡＡ
Ｖ ＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に連結されたトランスジーンを含 む）； ｃ）さらに、該細胞系をＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードしてい
る核酸でトランスフェクトし；次いで、 ｄ）該細胞において生産されたｒＡＡＶベクターを単離する ことを含むｒＡＡＶベクター生産の方法。 - 【請求項１２】 ａ）ヒトアデノウイルスに対するレセプターをコードして
いる安定に組み込まれた核酸を含むＣＶ−１細胞を、細胞系において増殖的感染
を引き起こすことができないヘルパーヒトアデノウイルスで感染させ； ｂ）該細胞をｒＡＡＶゲノムでトランスフェクトし（該ＡＡＶゲノムはＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に連結されたトランスジーンを含む ）； ｃ）該細胞系をＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードしている核酸で
トランスフェクトし；次いで ｄ）該細胞において生産されたｒＡＡＶベクターを単離する ことを含むｒＡＡＶベクター生産の方法。 - 【請求項１３】 ａ）ヒトアデノウイルスに対するレセプターをコードして
いる安定に組み込まれた核酸を含むサル細胞系を、細胞系において増殖的感染を
引き起こすことができないヘルパーヒトアデノウイルスおよび安定に組み込まれ
たｒＡＡＶゲノムで感染させ（該ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列および発 現制御配列に作動可能に連結されたトランスジーンを含む）； ｂ）該細胞系をＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードしている核酸で
トランスフェクトし；次いで ｃ）該細胞系で生産されたｒＡＡＶベクターを単離する ことを含むｒＡＡＶベクター生産の方法。 - 【請求項１４】 ヘルパーアデノウイルスが温度感受性変異アデノウイルス
である請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 ヘルパーアデノウイルスが温度感受性変異アデノウイルス
である請求項１２記載の方法。 - 【請求項１６】 ヘルパーアデノウイルスが温度感受性変異アデノウイルス
である請求項１３記載の方法。 - 【請求項１７】 Ｅ３領域中に欠失を有するアデノウイルスゲノムを含み、
アデノウイルスゲノム中のＥ３欠失中に挿入されたｒＡＡＶベクターゲノム（Ａ
ＡＶゲノムはＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列に作動可能に連結されたト ランスジーンを含む）をさらに含むヘルパーヒトアデノウイルス。 - 【請求項１８】 アデノウイルスが温度感受性変異アデノウイルスである請
求項１７記載のヘルパーアデノウイルス。 - 【請求項１９】 ａ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードしてい
る核酸および作動可能に連結された発現制御エレメントを含むサル細胞系を、Ｅ
３領域中に欠失を有するアデノウイルスゲノムを含み、アデノウイルスゲノムの
該Ｅ３欠失中に挿入されたｒＡＡＶベクターゲノムをさらに含むヘルパーアデノ
ウイルスで感染させ（該ＡＡＶゲノムはＡＡＶ ＩＴＲ配列および発現制御配列 に作動可能に連結されたトランスジーンを含む）；次いで ｂ）該細胞系において生産されたｒＡＡＶベクターを単離する ことを含むｒＡＡＶ生産の方法。 - 【請求項２０】 ヘルパーアデノウイルスが温度感受性変異アデノウイルス
である請求項１９記載の方法。
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