JP2002524036A - Anti-angiogenic plasmids and delivery systems and methods of making and using same - Google Patents

Anti-angiogenic plasmids and delivery systems and methods of making and using same

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メーレンス，ドロシー
ラルストン，ロバート
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ヴァレンティス，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 抗血管形成プラスミドを動物の体内へ送達することによって、腫瘍活性を低下させる。 【解決手段】本発明は遺伝子送達及び遺伝子治療に関し、動物における抗血管形成因子を発現させるための新規な核酸構成体、発現のための核酸構成体と合体させて送達するための調合物、およびそのような構成体および調合物の調製および使用方法を提供する。特に、この発明は治療用抗血管形成コード化核酸を細胞に送達して腫瘍活性を調節するためのプラスミド構成体、それらの構成体の使用方法（サイトカイン、好ましくは、ＩＬ−１２など、他の薬剤との併合治療を含む）、およびそのような構成体の調製方法に関する。 (57) Summary Reduce tumor activity by delivering anti-angiogenic plasmids into animals. The present invention relates to gene delivery and gene therapy, a novel nucleic acid construct for expressing an anti-angiogenic factor in an animal, a formulation for delivery in combination with a nucleic acid construct for expression, and Methods of preparing and using such compositions and formulations are provided. In particular, the present invention relates to plasmid constructs for delivering therapeutic anti-angiogenic encoding nucleic acids to cells to modulate tumor activity, methods of using those constructs (cytokines, preferably other cytokines such as IL-12, etc.). And methods for preparing such constructs.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

本発明は、遺伝子送達および遺伝子治療に関し、哺乳動物において抗血管形成
遺伝子産物を発現させるための新規な核酸コンストラクト、発現させるための核
酸コンストラクトが処方された送達用処方物、ならびにそのようなコンストラク
トおよび処方物の調製方法および使用方法を提供する。The present invention relates to gene delivery and gene therapy, a novel nucleic acid construct for expressing an anti-angiogenic gene product in mammals, a delivery formulation formulated with a nucleic acid construct for expression, and such constructs and Methods for preparing and using the formulations are provided.

【０００２】[0002]

【発明の背景】BACKGROUND OF THE INVENTION

本発明の背景についての以下の説明は、読者が本発明を理解することを助ける
ために単に提供されるだけであり、本発明の先行技術を記載または構成すること
を認めるものではない。The following description of the background of the invention is merely provided to assist the reader in understanding the invention and is not admitted to describe or constitute the prior art of the invention.

【０００３】 腫瘍を有する宿主において、効果的な免疫応答がないことは、腫瘍の弱い抗原
性または腫瘍の免疫抑制的な環境のためである。免疫療法は、腫瘍−宿主の相互
作用を腫瘍に特異的な抗原の導入によって強化することであり、あるいは局所的
なサイトカイン発現によって免疫機能を追加することである。ＩＬ−２、ＩＦＮ
−αおよびＩＬ−１２のようないくつかのサイトカイン遺伝子医薬品が開発され
ている。ポリマー系送達システムに処方された、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２またはＩ
Ｌ−１２をコード化する核酸を直接腫瘍内注射することによって、腫瘍を有する
マウスは、ネズミの同系腫瘍モデルにおける腫瘍成長の抑制をもたらす免疫応答
を発現させている。別の方法である抗血管形成遺伝子療法が、免疫原性腫瘍およ
び非免疫原性腫瘍の両方に対する治療方法として認識されている。[0003] In tumor bearing hosts, the lack of an effective immune response is due to the weak antigenicity of the tumor or the immunosuppressive environment of the tumor. Immunotherapy is to enhance the tumor-host interaction by introducing tumor-specific antigens, or to add immune function by local cytokine expression. IL-2, IFN
Several cytokine gene drugs such as -α and IL-12 have been developed. IFN-α, IL-2 or I formulated in a polymer-based delivery system
By direct intratumoral injection of nucleic acid encoding L-12, tumor-bearing mice have developed an immune response that results in suppression of tumor growth in a murine syngeneic tumor model. Another method, anti-angiogenic gene therapy, is recognized as a treatment for both immunogenic and non-immunogenic tumors.

【０００４】 腫瘍は、血管を介して酸素および養分を獲得する。血管の生成すなわち血管形
成は、腫瘍の成長および転移に必要である。さらに、腫瘍における微小血管密度
は、腫瘍の成長、転移の危険性、腫瘍の再発または死と明確な関係を示している
（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８２：４
〜６（１９９０）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１：２７〜
３１（１９９５））。腫瘍の血管形成の開始は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの
血管形成因子のアップレギュレーションによって、あるいはエンドスタチン、ア
ンギオスタチンおよびトロンボスポンジン−１などの抗血管形成因子のダウンレ
ギュレーションによって開始され得る（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．＆Ｆｏｌｋｍａｎ
，Ｊ．、Ｃｅｌｌ、８６：３５３〜６４（１９９６））。従って、血管形成イン
ヒビタを再構成することにより、癌治療の一応の対策が得られる（Ｈｏｒｉ，Ａ
．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：６１８０〜４（１９９１）；Ｋｉｍ，Ｋ．
Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ、３６２：８４１〜４（１９９３）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．
Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、７９：３１５〜２８（１９９４）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．
Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、８８：２７７〜８５（１９９７）；Ｃｌａｐｐ，Ｃ．他、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３３：１２９２〜９（１９９３）；Ｇｕｐｔａ，
Ｓ．Ｋ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、９２：７７９９〜７８０
３（１９９５））。[0004] Tumors obtain oxygen and nutrients through the blood vessels. The generation of blood vessels, or angiogenesis, is required for tumor growth and metastasis. In addition, microvessel density in tumors has been clearly linked to tumor growth, risk of metastasis, tumor recurrence or death (Folkman, J., J. Natl. Cancer Inst., 82: 4).
-6 (1990); Folkman, J. et al. J. Nat. Med. , 1: 27-
31 (1995)). Initiation of tumor angiogenesis may be initiated by up-regulation of angiogenic factors such as VEGF and bFGF, or by down-regulation of anti-angiogenic factors such as endostatin, angiostatin and thrombospondin-1 (Hanahan, D. . & Folkman
, J. et al. , Cell, 86: 353-64 (1996)). Therefore, by reconstituting an angiogenesis inhibitor, a prima facie measure for cancer treatment can be obtained (Hori, A
. , Cancer Res. 51: 6180-4 (1991);
J. Nature, 362: 841-4 (1993); O'Reilly, M .;
S. Cell, 79: 315-28 (1994); O'Reilly, M. et al.
S. Et al., Cell, 88: 277-85 (1997); Other, E
ndocrinology, 133: 129-2-9 (1993); Gupta,
S. K. Proc. Natl. Acad. USA, 92: 7799-780.
3 (1995)).

【０００５】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、血管形成インヒビタであるタンパ
ク質の拡大しつつあるファミリー(expanding family)の２つの構成成分である。
アンギオスタチンは、成熟型プラスミノーゲンの内部タンパク質分解フラグメン
トである。これは、クリングルドメイン（残基９８〜４４０）として知られてい
る三重環のジスルフィド結合した構造を４つ含有する。３個のクリングルドメイ
ンの形態（残基９８〜３３３）は、生体外（Ｃａｏ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１：２９４６１〜２
９４６７（１９９６））および生体内（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６３６７〜６３７２（１９９８））に
おいてより強力であることが明らかにされている。エンドスタチンは、コラーゲ
ン１８ａのＣ末端のタンパク質分解フラグメントである。その構造は、内皮細胞
（ＥＣ）表面の接着因子分子であるＥ−セレクチンの構造と類似している（Ｈｏ
ｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．他、ＥＭＢＯ Ｊ．、１７：１６５６〜６４（１９９８
））。[0005] Angiostatin and endostatin are two components of the expanding family of proteins that are angiogenesis inhibitors.
Angiostatin is an internal proteolytic fragment of mature plasminogen. It contains four tricyclic disulfide-bonded structures known as kringle domains (residues 98-440). The form of the three kringle domains (residues 98-333) was determined in vitro (Cao et al., The Journal).
of Biological Chemistry, 271: 29461-2
9467 (1996)) and in vivo (Griscelli et al., Proc. Na.
tl. Acad. Sci. USA, 95: 6367-6372 (1998)). Endostatin is a C-terminal proteolytic fragment of collagen 18a. Its structure is similar to that of E-selectin, an adhesion factor molecule on the surface of endothelial cells (EC) (Ho
henester, E .; EMBO J. et al. 17: 1656-64 (1998).
)).

【０００６】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンはともに、生体外で内皮細胞（ＥＣ）
の分化を抑制し、生体内で血管形成を抑制し得る。さらに、組換えタンパク質は
、大用量で注射されたときに、腫瘍の成長および転移をマウスモデルにおいて抑
制することが明らかにされている。最近、アンギオスタチンおよびエンドスタチ
ンの組合せは、腫瘍の成長および転移の抑制における相乗作用を有していること
が明らかにされている（Ｂａｃｈｅｌｏｔ，Ｔ．他、ＡＡＲＣの抄録、第３９巻
、１９９８年３月）。抗血管形成療法は、ネズミの腫瘍モデルでの放射線療法に
おける相乗作用を示し得ることもまた明らかにされている（Ｍａｕｃｅｒｉ他、
Ｎａｔｕｒｅ、３９４：２８７（１９９８））。[0006] Both angiostatin and endostatin are used in vitro for endothelial cells (EC).
Can suppress the differentiation of the cells and suppress angiogenesis in vivo. In addition, recombinant proteins have been shown to suppress tumor growth and metastasis in mouse models when injected at large doses. Recently, the combination of angiostatin and endostatin has been shown to have a synergistic effect in suppressing tumor growth and metastasis (Bachelot, T. et al., AARC Abstract, Vol. 39, 1998). March). It has also been shown that anti-angiogenic therapies may show synergy in radiation therapy in murine tumor models (Mauceri et al.,
Nature, 394: 287 (1998)).

【０００７】 抗血管形成療法は、腫瘍細胞ではなく、ＥＣを標的とする。ＥＣは、全身的に
送達された薬物に対してより大きな受容性を有し、従って、抗血管形成療法は、
散在性癌の処置において特に有用である。さらに、ＥＣは形質転換されず、癌の
実験モデルの抗血管形成療法は後天的な薬物耐性をもたらさない。抗血管形成療
法には生体内における治療的レベルの長期間の維持が必要とされるので、組換え
タンパク質の連続的な送達は費用がかかり、扱いにくい。[0007] Anti-angiogenic therapies target EC, not tumor cells. EC has greater receptivity to systemically delivered drugs, and thus anti-angiogenic therapies
It is particularly useful in treating disseminated cancer. In addition, EC is not transformed and anti-angiogenic therapy in experimental models of cancer does not result in acquired drug resistance. Because anti-angiogenic therapy requires long-term maintenance of therapeutic levels in vivo, continuous delivery of the recombinant protein is expensive and cumbersome.

【０００８】[0008]

【発明の概要】Summary of the Invention

本発明は、遺伝子送達および遺伝子治療に関し、抗血管形成コード化配列を生
物、好ましくは哺乳動物、において発現させるための新規な核酸コンストラクト
、発現させるための核酸コンストラクトが処方された送達用処方物、ならびにそ
のようなコンストラクトおよび組成物の調製方法および使用方法を提供する。特
に、本発明は、腫瘍活性を調節するために、治療遺伝子を細胞に送達するための
プラスミドコンストラクトに関する。本発明はまた、そのようなコンストラクト
の使用方法（放射線療法などの他の処置方法またはサイトカイン、好ましくは、
ＩＬ−１２、などの薬剤との混合療法を含む）、ならびにそのようなコンストラ
クトの調製方法に関する。本明細書中に示されている薬学的に受容可能で費用的
に有効な高効率の送達システムにより、従来技術に対して予期されない改善が示
される。The present invention relates to gene delivery and gene therapy. And methods of preparing and using such constructs and compositions. In particular, the invention relates to a plasmid construct for delivering a therapeutic gene to a cell to modulate tumor activity. The invention also relates to methods of using such constructs (other treatment methods such as radiation therapy or cytokines, preferably
Including combination therapy with agents such as IL-12), as well as methods of preparing such constructs. The pharmaceutically acceptable and cost effective high efficiency delivery systems presented herein represent unexpected improvements over the prior art.

【０００９】 プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をヌクレアーゼから保護し、かつ注射された組
織におけるｐＤＮＡの分散および保持を制御することによってタンパク質発現を
増大させる相互作用的同義遺伝子送達システムを利用する遺伝子治療法が用いら
れている。このような同義相互作用非縮合(polymeric interactive non-condens
ing)（ＰＩＮＣ）システムにより、未処方のプラスミドを生理食塩水において送
達することと比較して、組織からのより大きな量の遺伝子発現が日常的に得られ
る。ＰＶＰとの複合体として処方された、ネズミのＩＦＮα４またはＩＬ−１２
をコード化するプラスミド発現システムにより、抗腫瘍の免疫応答が、皮下のネ
ズミ腫瘍に直接注射した後でもたらされ得る。ヒトのインスリン様成長因子−１
（ｈＩＧＦ−Ｉ）をコード化し、ＰＩＮＣ複合体として処方されたプラスミドを
使用することによって、生物学的に活性なヒトＩＧＦ−Ｉの長期間の生成が筋肉
内注射の後の生体内において示されている。筋肉内送達された遺伝子により、循
環系における治療生成物の多くて持続的な発現が達成され得るので、筋肉内送達
癌遺伝子医薬品は、遺伝子治療の大きな限界である散在性疾患の処置において使
用することできると考えられる。[0009] Gene therapy methods that utilize an interactive synonymous gene delivery system that protects plasmid DNA (pDNA) from nucleases and increases protein expression by controlling the distribution and retention of pDNA in the injected tissue are used. Have been. Polymeric interactive non-condens
ing) (PINC) system routinely yields greater amounts of gene expression from tissues as compared to delivering unformulated plasmid in saline. Murine IFNα4 or IL-12 formulated as a complex with PVP
The anti-tumor immune response can be elicited after direct injection into subcutaneous murine tumors by a plasmid expression system encoding Human insulin-like growth factor-1
By using a plasmid encoding (hIGF-I) and formulated as a PINC complex, long-term production of biologically active human IGF-I is demonstrated in vivo after intramuscular injection. ing. Intramuscularly delivered oncogene pharmaceuticals are used in the treatment of disseminated diseases, a major limitation of gene therapy, as intramuscularly delivered genes can achieve large and sustained expression of therapeutic products in the circulatory system It is considered possible.

【００１０】 これに代えて、腫瘍転移を有する特定の臓器（例えば、肺）へ治療遺伝子を投
与することは、満たせない臨床的要求に対してより適し得る。遺伝子的欠陥の処
置のための肺への遺伝子送達が、実験的モデルならびに臨床試験で探究されてい
る。Ｎ−［１−（２−３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化ト
リメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）／コレステロール／プラスミドの３：１の
正荷電複合体を使用することによる、導入遺伝子の増強された肺発現が気管内投
与または静脈内注射の後で明らかにされた。[0010] Alternatively, administering a therapeutic gene to a particular organ having tumor metastasis (eg, the lungs) may be more suitable for unmet clinical needs. Lung gene delivery for the treatment of genetic defects is being explored in experimental models as well as in clinical trials. Transgene by using a 3: 1 positively charged complex of N- [1- (2-3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) / cholesterol / plasmid Pulmonary expression was demonstrated after intratracheal administration or intravenous injection.

【００１１】 脂質／ＤＮＡの尾静脈注射によって、血清における検出可能なレベルのヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）、血漿における検出可能なレベルのヒト第ＩＸ因子（ｈＦ
ＩＸ）、ならびに肺および肝臓における検出可能なレベルのクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase) （ＣＡＴ
）が、カチオン性脂質対共脂質の比が４：１ｍｏｌ／ｍｏｌである４００ｎｍの
押出リポソームから調製された正荷電の脂質／プラスミド複合体で認められた。
正荷電のプラスミド／カチオン性脂質複合体の肺気道への投与によって、Ｔｈ１
細胞表現型に類似するサイトカインパターンが誘導されるが、導入遺伝子の発現
がない場合でさえも、ＩＬ−１２プラスミド／脂質複合体を投与した後における
ネズミの肺におけるＩＬ−１２の導入遺伝子発現により、同系のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍の肺転移物の成長が抑制される。[0011] Tail vein injection of lipid / DNA results in detectable levels of human growth hormone (hGH) in serum and detectable levels of human factor IX (hFH) in plasma.
IX), and detectable levels of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) in lung and liver
) Was found in positively charged lipid / plasmid complexes prepared from 400 nm extruded liposomes with a ratio of cationic lipid to co-lipid of 4: 1 mol / mol.
Administration of a positively charged plasmid / cationic lipid complex to the lung airways results in Th1
A cytokine pattern similar to the cellular phenotype is induced, but transgene expression of IL-12 in murine lungs after administration of the IL-12 plasmid / lipid complex, even in the absence of transgene expression. Inhibits the growth of lung metastases of Renca tumors in syngeneic BALB / c mice.

【００１２】 抗血管形成因子を発現させるための腫瘍ＥＣ特異的プロモーターの使用をここ
で説明する。増殖しているＥＣに特異的なプロモーターを選択するために少なく
とも２つの方法が使用された。１つは、腫瘍ＥＣで特異的に発現している遺伝子
、例えばｆｌｋ−１およびａｖｂ３のインテグリン、のプロモーターをクローニ
ングすることである。もう１つは、エンドセリン−１エンハンサーのようなＥＣ
に特異的なエンハンサーおよびサイクリンＡのような細胞周期特異的プロモータ
ーのキメラなプロモーターをつくることである。[0012] The use of a tumor EC-specific promoter to express anti-angiogenic factors is now described. At least two methods were used to select promoters specific for growing ECs. One is to clone the promoters of genes specifically expressed in tumor EC, such as the integrin of flk-1 and avb3. The other is EC like endothelin-1 enhancer
Is to create a chimeric promoter of a cell cycle specific promoter such as cyclin A and an enhancer specific for cyclin A.

【００１３】 本発明は、プロトタイプの抗血管形成遺伝子とエンドスタチンおよびアンギオ
スタチンを使用することによって、抗血管形成遺伝子療法により、固形腫瘍の成
長を腫瘍内注射または筋肉内注射のいずれかによって抑制されることを明らかに
した。抗血管形成遺伝子療法によりまた、処方された抗血管形成遺伝子の筋肉内
送達または静脈内送達の後に肺転移腫瘍が抑制される。The present invention provides for the use of a prototype anti-angiogenic gene and endostatin and angiostatin to inhibit the growth of solid tumors by anti-angiogenic gene therapy, either by intratumoral or intramuscular injection. Revealed that. Antiangiogenic gene therapy also suppresses lung metastatic tumors following intramuscular or intravenous delivery of prescribed antiangiogenic genes.

【００１４】 従って、第１の側面において、本発明は、組織特異的エレメントおよび抗血管
形成コード化配列を有するプラスミドを特徴とする。好ましくは、組織特異的エ
レメントは、内皮細胞に特異的であり、かつ抗血管形成コード化配列に転写的に
連結されている。下記に詳しく説明するように、プラスミドは、１つまたは複数
のサイトメガロウイルスプロモーター配列などの転写制御配列を必要に応じて含
むことができる。Thus, in a first aspect, the invention features a plasmid having a tissue-specific element and an anti-angiogenic coding sequence. Preferably, the tissue-specific element is specific for endothelial cells and is transcriptionally linked to the anti-angiogenic coding sequence. As described in detail below, the plasmid may optionally include transcriptional control sequences, such as one or more cytomegalovirus promoter sequences.

【００１５】 “組織特異的エレメント”は、ＥＴ−１、ｆｌｋ−１、アルファ−Ｖ、ベータ
−３、ＩＣＡＭ−２、ｃｙｃＡ、Ｅ２Ｆ１およびｃｄｃ６からなる群から選択さ
れることが好ましいプロモーターを含むことができ、あるいはＣＭＶ、４コピー
のＥＴ−１、および７コピーのＥＴ−１からなる群から選択されることが好まし
いエンハンサーを含むことができる。ＥＣ組織特異的プロモーターの例を以下で
詳しく説明する。“Tissue-specific element” comprises a promoter preferably selected from the group consisting of ET-1, flk-1, alpha-V, beta-3, ICAM-2, cycA, E2F1 and cdc6. Or an enhancer, preferably selected from the group consisting of CMV, 4 copies of ET-1, and 7 copies of ET-1. Examples of EC tissue-specific promoters are described in detail below.

【００１６】 組織特異的エレメントは、好ましくは、抗血管形成コード化配列の発現が、関
係する組織または細胞において、好ましくは、優勢的（５０％を超える）レベル
、ほぼ全面的（約９０％以上）レベル、あるいは全面的（約１００％）レベルに
なるまで増強されるような方法で、抗血管形成コード化配列と結合または連結さ
れる。例えば、発現を約２倍増強させることができる。The tissue-specific element is preferably such that expression of the anti-angiogenic coding sequence is predominantly (greater than 50%), almost entirely (greater than about 90%) in the tissue or cell involved. )), Or linked to or linked to an anti-angiogenic coding sequence in such a way as to be enhanced to levels, or global (about 100%) levels. For example, expression can be enhanced about 2-fold.

【００１７】 ここで使用されている用語“プラスミド”は、遺伝物質（すなわち、核酸）で
構成されたコンストラクトをいう。これは、挿入されているコード化配列が真核
生物細胞に転写され得るように配置された遺伝子エレメントを含み、また、プラ
スミドはウイルス核酸に由来する配列を含むことができるが、そのようなウイル
ス配列は、ウイルス粒子へのプラスミドの取り込みを引き起こさず、従って、プ
ラスミドは非ウイルス性ベクターである。好ましくは、プラスミドは、閉環した
環状ＤＮＡ分子である。The term “plasmid” as used herein refers to a construct made up of genetic material (ie, nucleic acids). It contains genetic elements arranged so that the inserted coding sequence can be transcribed into eukaryotic cells, and plasmids can contain sequences derived from viral nucleic acids, although such viral The sequence does not cause incorporation of the plasmid into the viral particle, and thus the plasmid is a non-viral vector. Preferably, the plasmid is a closed circular DNA molecule.

【００１８】 “サイトメガロウイルスプロモーター”は、転写プロモーターおよび上流のエ
ンハンサー配列として真核生物細胞において機能し得るサイトメガロウイルス由
来の１つまたは複数の配列をいう。エンハンサー配列は、転写を、関連するプロ
モーターから、より高頻度で生じさせる。“Cytomegalovirus promoter” refers to one or more sequences from a cytomegalovirus that can function in eukaryotic cells as transcriptional promoters and upstream enhancer sequences. Enhancer sequences cause transcription to occur more frequently from an associated promoter.

【００１９】 これに関連して、“転写的に連結された”とは、転写に適したシステムにおい
て、転写が制御配列（複数を含む）の指揮下で開始され、そのような制御配列（
複数を含む）と転写的に連結されている配列によって進行することを意味する。
得られた転写物には、得られる翻訳生成物を変化させるような変異が生じないの
が好ましい。In this context, “transcriptionally linked” means that in a system suitable for transcription, transcription is initiated under the direction of control sequence (s), and such control sequences (
(Including more than one).
Preferably, the resulting transcript is free of mutations that alter the resulting translation product.

【００２０】 “コード化領域”または“コード化配列”の用語は、正常な塩基対形成とコド
ン使用の関係に従って、発現が所望される特定の遺伝子生成物をコード化する核
酸配列をいう。従って、コード化配列は、適正な長さの転写物が生成され、機能
的な所望の生成物を生成するのに適切な読み枠での翻訳をもたらすような関係で
転写制御配列（制御エレメントならびに翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンを
含み得る）に対して設置しなければならない。The term “coding region” or “coding sequence” refers to a nucleic acid sequence that codes for a particular gene product whose expression is desired according to the relationship between normal base pairing and codon usage. Thus, the coding sequence should be transcribed in a manner such that a transcript of the correct length is produced and provides translation in the appropriate reading frame to produce a functionally desired product. Translation start codon and translation stop codon).

【００２１】 好ましい実施形態において、“抗血管形成コード化配列”は、エンドスタチン
、アンギオスタチン、トロンボスポンジン−１、ｐ５３、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−
α、短縮型組織因子、インテグリンαｖβ３ブロッキング因子、ＶＨＬ遺伝子生
成物、細胞周期依存性キナーゼインヒビタ、ＶＥＧＦｒ、ｂＦＧＦｒおよびｂＦ
ＧＦ結合タンパク質からなる群から選択される生成物をコード化し、好ましくは
、（プラスミドを収容する生物、好ましくは、ヒト、に関して）最適なコドン使
用、または（プラスミドを収容する生物、好ましくは、ヒト、に関して）準最適
なコドン使用を有する合成された配列であり、あるいはここで記載されているプ
ラスミドのいずれか、より好ましくは、プラスミドｐＥＳ１２８１、ｐＩＰ１３
１６、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６、のヌクレオチド配列を有する。In a preferred embodiment, the “anti-angiogenic coding sequence” is endostatin, angiostatin, thrombospondin-1, p53, IL-12, IFN-
α, truncated tissue factor, integrin αvβ3 blocking factor, VHL gene product, cell cycle dependent kinase inhibitor, VEGFr, bFGFr and bF
Encoding a product selected from the group consisting of GF binding proteins, preferably with optimal codon usage (with respect to the organism harboring the plasmid, preferably human), or (organism harboring the plasmid, preferably human) Synthesized sequences with suboptimal codon usage, or any of the plasmids described herein, more preferably plasmids pES1281, pIP13
16, has the nucleotide sequence of pAS1095 or pAS1096.

【００２２】 抗血管形成コード化配列は、関係する生物における血管形成を、好ましくは著
しい程度（例えば、治療効果が得られる程度）に低下させるか、または生体外ア
ッセイで血管形成を低下させる生成物をコード化する。The anti-angiogenic coding sequence preferably reduces angiogenesis in the organism of interest to a significant extent (eg, a therapeutic effect) or reduces angiogenesis in an in vitro assay. Code.

【００２３】 本発明のプラスミドにおいて使用するに好適なコード化領域の１つの具体的な
例は、抗血管形成因子をコード化する天然の配列である。従って、好ましい実施
形態において、コード化領域は、そのような抗血管形成因子をコード化する天然
のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有する。しかし、合成されたコー
ド化配列である抗血管形成コード化配列を有することが好ましい場合がある。好
ましい実施形態において、抗血管形成コード化配列は、最適なコドン使用または
準最適なコドン使用を利用して合成された配列である。One specific example of a coding region suitable for use in a plasmid of the invention is a native sequence encoding an anti-angiogenic factor. Thus, in a preferred embodiment, the coding region has the same nucleotide sequence as the natural nucleotide sequence encoding such an anti-angiogenic factor. However, it may be preferable to have the anti-angiogenic coding sequence that is a synthesized coding sequence. In a preferred embodiment, the anti-angiogenic coding sequence is a sequence synthesized utilizing optimal or suboptimal codon usage.

【００２４】 従って、“ヒト抗血管形成因子をコード化する配列”または“ヒト抗血管形成
コード化配列”は、正常な塩基対形成および翻訳コドン使用の関係に基づいて、
ヒト抗血管形成因子のアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。コード化配
列は、天然のヒト抗血管形成因子の正確に完全なアミノ酸配列をコード化するこ
とが好ましいが、これは必須ではない。コード化されたポリペプチドは、そのポ
リペプチドが抗血管形成活性を保持している限り、好ましくは、そのポリペプチ
ドが、天然のヒト抗血管形成因子の、少なくとも５０％、７５％、９０％または
９７％の活性である限り、より好ましくは、天然のヒト抗血管形成因子と完全に
同じ活性である限り、天然のヒト抗血管形成因子と異なっていてもよい。つまり
、抗血管形成コード化配列によってコード化されたポリペプチドは、天然のヒト
抗血管形成因子と少し、好ましくは、１５％未満、１０％未満、５％未満または
１％未満の変化で異なっていても良い。このような変化は、１つまたは複数のア
ミノ酸の欠失、付加または置換などの１つまたは複数の種々のタイプのものであ
り得る。Thus, a “sequence encoding a human anti-angiogenic factor” or a “human anti-angiogenic coding sequence” is based on the relationship between normal base pairing and translation codon usage.
Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of human anti-angiogenic factor. Preferably, the coding sequence encodes the exact complete amino acid sequence of the native human anti-angiogenic factor, but this is not required. The encoded polypeptide preferably has at least 50%, 75%, 90% or 90% of the natural human anti-angiogenic factor, as long as the polypeptide retains anti-angiogenic activity. It may differ from native human anti-angiogenic factor as long as it has 97% activity, more preferably as long as it has exactly the same activity as native human anti-angiogenic factor. That is, the polypeptide encoded by the anti-angiogenic coding sequence differs from the native human anti-angiogenic factor by a small amount, preferably less than 15%, less than 10%, less than 5% or less than 1%. May be. Such changes can be of one or more of various types, such as deletion, addition or substitution of one or more amino acids.

【００２５】 用語“転写制御配列”は、転写的に連結されたコード化領域の転写速度を制御
する配列をいう。従って、この用語には、プロモーター、オペレーターおよびエ
ンハンサーが含み得る。特定の転写ユニットの場合、転写制御配列には、少なく
ともプロモーター配列が含まれる。The term “transcription control sequence” refers to a sequence that controls the rate of transcription of a transcriptionally linked coding region. Thus, the term may include promoters, operators and enhancers. For certain transcription units, the transcription control sequence includes at least a promoter sequence.

【００２６】 プラスミドはまた、好ましい実施形態において、好ましくは、ヒトの成長ホル
モン遺伝子から得られる成長ホルモンの３’非翻訳領域を含むことができる。The plasmid may also, in a preferred embodiment, contain a 3 ′ untranslated region of growth hormone, preferably obtained from the human growth hormone gene.

【００２７】 “成長ホルモンの３’非翻訳領域”は、実体的なポリペプチドをコード化する
領域の下流（すなわち、３’側）に位置する配列であって、成長ホルモン遺伝子
、好ましくは、ヒトの成長ホルモン遺伝子、に由来する天然の３’ＵＴＲ／ポリ
（ａ）シグナルの少なくとも一部を含む配列である。この領域は、一般には転写
されるが、翻訳されない。真核生物細胞における発現のためには、ポリＡテール
（poly-A-tail）の付加をシグナルする配列を含むことが一般には好ましい。他
の合成された遺伝子エレメントの場合、合成された３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグ
ナルは、天然に生じるＵＴＲエレメントと異なる配列を有する。この配列は、例
えば、ＡＬＵ反復配列を欠失させることによって改変することができる。そのよ
うなＡＬＵ反復配列の欠失は、トランスフェクションされた細胞における発現カ
セットとゲノム物質との相同的組換えの確率を低下させるように作用する。A “3 ′ untranslated region of growth hormone” is a sequence located downstream (ie, 3 ′) of a region encoding a substantial polypeptide and is a growth hormone gene, preferably human And a sequence containing at least a part of a natural 3′UTR / poly (a) signal derived from the growth hormone gene of the present invention. This region is generally transcribed but not translated. For expression in eukaryotic cells, it is generally preferred to include sequences that signal the addition of a poly-A-tail. For other synthetic genetic elements, the synthesized 3'UTR / poly (A) signal has a different sequence than the naturally occurring UTR element. This sequence can be modified, for example, by deleting the ALU repeat sequence. Deletion of such ALU repeats acts to reduce the probability of homologous recombination between the expression cassette and genomic material in transfected cells.

【００２８】 プラスミドは、好ましくは、コード化配列の発現に関して適切な関係にあるプ
ロモーター、ＴＡＴＡボックス、Ｃａｐサイト、ならびに第１のイントロンおよ
びイントロン／エキソン境界を含む。プラスミドはまた、プロモーターとコード
化配列との間に挿入された５’ｍＲＮＡリーダー配列、および／またはニワトリ
の骨格性α−アクチン遺伝子から得られるイントロン／５’ＵＴＲを含むことが
できる。また、プラスミドは、ここに記載されているプラスミドのいずれかのプ
ラスミドのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有することができる。[0028] The plasmid preferably contains a promoter, a TATA box, a Cap site, and a first intron and intron / exon boundaries that are in proper relationship for expression of the coding sequence. The plasmid can also include a 5 'mRNA leader sequence inserted between the promoter and the coding sequence, and / or an intron / 5' UTR derived from the chicken skeletal α-actin gene. Also, the plasmid can have the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence of any of the plasmids described herein.

【００２９】 プラスミドはまた、（ａ）第１の５‘非翻訳領域と転写的に連結された第１の
転写制御配列、第１のイントロン、第１のコード化配列、および第１の３’非翻
訳領域／ポリ（Ａ）シグナルを有する第１の転写ユニットであって、第１のイン
トロンが制御配列と第１のコード化配列との間に存在する第１の転写ユニット；
および（ｂ）第２の５‘非翻訳領域と転写的に連結された第２の転写制御配列、
第２のイントロン、第２のコード化配列、および第２の３’非翻訳領域／ポリ（
Ａ）シグナルを有する第２の転写ユニットであって、第２のイントロンが制御配
列と第２のコード化配列との間に存在する第２の転写ユニットを含有することが
でき、ここで第１および第２のコード化配列は、任意の２つの異なる抗血管形成
因子、好ましくは、アンギオスタチンおよびエンドスタチンをコード化する配列
を含有するが、ＩＰ−１０およびエンドスタチン、またはＩＰ−１０およびＴＳ
Ｐｆなどの他の組合せもまた可能である。The plasmid may also comprise (a) a first transcription control sequence, a first intron, a first coding sequence, and a first 3 ′ that are transcriptionally linked to the first 5 ′ untranslated region. A first transcription unit having an untranslated region / poly (A) signal, wherein the first intron is between the control sequence and the first coding sequence;
And (b) a second transcription control sequence transcriptionally linked to a second 5 'untranslated region;
A second intron, a second coding sequence, and a second 3 'untranslated region / poly (
A) A second transcription unit having a signal, wherein the second intron can contain a second transcription unit located between a control sequence and a second coding sequence, wherein the first transcription unit comprises And the second coding sequence contains any two different anti-angiogenic factors, preferably sequences encoding angiostatin and endostatin, but may include IP-10 and endostatin, or IP-10 and TS
Other combinations, such as Pf, are also possible.

【００３０】 本発明はまた、組織特異的エレメントおよび抗血管形成コード化配列を用いた
プラスミドおよび関連生成物ならびに方法を提供し、この場合、抗血管形成コー
ド化配列は、融合またはハイブリッドのペプチドまたはタンパク質をコード化す
る。この融合またはハイブリッドの因子は、例えば、アンギオスタチンおよびエ
ンドスタチンの融合物であり得る。融合物の各部分は、好ましくは、それ自身で
抗血管形成性であり、融合物またはハイブリッド物の一部として提供された場合
、高い抗血管形成作用を有している。The present invention also provides plasmids and related products and methods using the tissue-specific elements and the anti-angiogenic coding sequence, wherein the anti-angiogenic coding sequence comprises a fusion or hybrid peptide or Encode the protein. The fusion or hybrid agent can be, for example, a fusion of angiostatin and endostatin. Each portion of the fusion is preferably anti-angiogenic in itself and has a high anti-angiogenic effect when provided as part of a fusion or hybrid.

【００３１】 “転写ユニット”または“発現カセット”の用語は、転写の開始および停止を
指揮する配列エレメントとともに、少なくとも１つのコード化配列を含有するヌ
クレオチド配列をいう。しかし、転写ユニットは、転写後または翻訳後のプロセ
スに関与する配列を含み得るさらなる配列を含むことができる。好ましい実施形
態において、第１の転写制御配列または第２の転写制御配列は、１つまたは複数
のサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。第１および第２の転写制
御配列は同じであってもよく、異なっていてもよい。The term “transcription unit” or “expression cassette” refers to a nucleotide sequence that contains at least one coding sequence along with sequence elements that direct the initiation and termination of transcription. However, a transcription unit can include additional sequences that can include sequences involved in post-transcription or post-translation processes. In a preferred embodiment, the first transcription control sequence or the second transcription control sequence contains one or more cytomegalovirus promoter sequences. The first and second transcription control sequences may be the same or different.

【００３２】 “５‘非翻訳領域”または“５‘ＵＴＲ”は、プロモーター領域の３’、に位
置し、その下流にあるコード化領域の５’に位置する配列をいう。従って、その
ような配列は転写されるが、翻訳開始コドンの上流に存在し、従って、ポリペプ
チド生成物の部分には翻訳されない。“5 ′ untranslated region” or “5′UTR” refers to a sequence located 3 ′ of the promoter region and 5 ′ of the coding region downstream thereof. Thus, such sequences are transcribed, but located upstream of the translation initiation codon, and thus are not translated into portions of the polypeptide product.

【００３３】 ここで記載するプラスミドの場合、１つまたは複数のプロモーター、５‘非翻
訳領域（５‘ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナル、およびイントロンは
合成された配列であり得る。これに関連して、用語“合成”は、配列が、そのよ
うなタイプの天然に生じる遺伝子エレメントの配列によって直接提供されず、む
しろ、人為的に作製された配列である（すなわち、分子生物学的方法により人に
よってつくられる）ことを意味する。そのような合成された配列の１つまたは複
数の部分は、天然に生じる配列と同じであり得るが、特定の遺伝子エレメントの
配列全体は、そのようなタイプの天然に生じる遺伝子エレメントとは異なる。そ
のような合成された遺伝子エレメントの使用により、そのエレメントの機能的特
性を、所望する機能のために適切に設計することができる。For the plasmids described herein, one or more of the promoter, 5 ′ untranslated region (5 ′ UTR), 3 ′ UTR / poly (A) signal, and intron may be synthetic sequences. In this context, the term “synthetic” is a sequence in which the sequence is not directly provided by the sequence of such types of naturally occurring genetic elements, but rather is an artificially created sequence (ie, a molecular biology). Created by humans in a standard way). One or more portions of such a synthesized sequence can be the same as the naturally occurring sequence, but the entire sequence of a particular genetic element is different from such type of naturally occurring genetic element. Through the use of such synthesized genetic elements, the functional properties of the element can be appropriately designed for the desired function.

【００３４】 従って、“合成イントロン”は、天然に生じるイントロン配列ではなく、正常
な転写後プロセスのときにＲＮＡ転写物から除かれる配列をいう。そのようなイ
ントロンは、様々な異なる特性を有するように設計することができ、特に、その
ようなイントロンは、所望する強度のスプライシング部位を有するように設計す
ることができる。Thus, “synthetic intron” refers to a sequence that is not a naturally occurring intron sequence but is removed from an RNA transcript during normal post-transcriptional processes. Such introns can be designed to have a variety of different properties, and in particular, such introns can be designed to have splicing sites of a desired strength.

【００３５】 好ましい実施形態において、第１および第２のコード化領域は、５‘から３“
の方向での、アンギオスタチン、それに続くエンドスタチンのコード化領域であ
る。In a preferred embodiment, the first and second coding regions are 5 'to 3 "
, The coding region for angiostatin followed by endostatin.

【００３６】 ”アンギオスタチンのコード化配列“は、正常な塩基対形成および翻訳コドン
使用の関係に基づいて、上記に記載されているヒトアンギオスタチンをコード化
する核酸配列である。エンドスタチンのコード化配列も同様に定義される。“Angiostatin coding sequence” is a nucleic acid sequence encoding human angiostatin as described above, based on the relationship between normal base pairing and translation codon usage. The coding sequence for endostatin is similarly defined.

【００３７】 好ましい実施形態において、アンギオスタチンのコード化配列は、エンドスタ
チンのコード化配列の５‘に存在する。当業者は、２よりも多くの抗血管形成コ
ード化配列が用いられた場合、その抗血管形成コード化配列のすべてが単一の転
写ユニットに存在し得ること、あるいはすべてが別個の転写ユニットに存在し得
ること、あるいは（コード化配列が３つの場合）、任意の２つのコード化配列が
１つの転写ユニットに存在し、残りのコード化配列が別の転写ユニットに存在し
得ることが理解されるであろう。In a preferred embodiment, the coding sequence for angiostatin is 5 ′ to the coding sequence for endostatin. One of skill in the art will appreciate that if more than two anti-angiogenic coding sequences are used, all of the anti-angiogenic coding sequences may be present in a single transcription unit, or all may be in separate transcription units. It will be appreciated that, alternatively, (if there are three coding sequences) any two coding sequences may be present in one transcription unit and the remaining coding sequences may be present in another transcription unit. Will be.

【００３８】 プラスミドはまた、可変的スプライシングを有するイントロン、第１のコード
化配列、および第２のコード化配列を含有することができ、この場合、第１およ
び第２のコード化配列は、任意の２つの異なる抗血管形成因子、好ましくは、ア
ンギオスタチンおよびエンドスタチン、をコード化する配列を含む。The plasmid can also contain an intron with variable splicing, a first coding sequence, and a second coding sequence, wherein the first and second coding sequences are optional. Of two different anti-angiogenic factors, preferably angiostatin and endostatin.

【００３９】 好ましい実施形態において、プラスミドはまた、（ａ）第１のコード化配列お
よび第２のコード化配列と転写的に連結された転写制御配列と、（ｂ）５’非翻
訳領域と、（ｃ）第１のコード化配列の５’、に存在するイントロンと、（ｄ）
第１のコード化配列の３‘に存在し、かつ第２のコード化配列の５’に存在する
選択的スプライシングサイトと、（ｅ）３‘非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと
を有する。転写制御配列は、好ましくは、サイトメガロウイルスプロモーター配
列を含む。In a preferred embodiment, the plasmid also comprises: (a) a transcriptional control sequence transcriptionally linked to the first coding sequence and the second coding sequence; (b) a 5 ′ untranslated region; (C) an intron present 5 ′ of the first coding sequence;
It has an alternative splicing site 3 ′ to the first coding sequence and 5 ′ to the second coding sequence, and (e) a 3 ′ untranslated region / poly (A) signal. The transcription control sequence preferably comprises a cytomegalovirus promoter sequence.

【００４０】 好ましい実施形態において、プラスミドはまた、（ａ）第１のコード化配列、
ＩＲＥＳ配列、第２のコード化配列、および３‘非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナ
ルと転写的に連結された転写制御配列であって、ＩＲＥＳ配列が第１のコード化
配列と第２のコード化配列との間に存在する転写制御配列と、（ｂ）プロモータ
ーと第１のコード化配列との間に存在するイントロンとを有し、第１および第２
のコード化配列は、任意の２つの抗血管形成因子、好ましくは、アンギオスタチ
ンおよびエンドスタチン、をコード化する配列を含む。転写制御配列は、好まし
くは、サイトメガロウイルスプロモーター配列を含み、ＩＲＥＳ配列は、好まし
くは、脳心筋炎ウイルス(encephalomyocarditis virus)から得られる。In a preferred embodiment, the plasmid also comprises (a) a first coding sequence,
A transcription control sequence transcriptionally linked to an IRES sequence, a second coding sequence, and a 3 'untranslated region / poly (A) signal, wherein the IRES sequence is the first coding sequence and the second coding sequence. And (b) an intron present between the promoter and the first coding sequence, wherein the first and second
Comprises sequences encoding any two anti-angiogenic factors, preferably angiostatin and endostatin. The transcription control sequence preferably comprises a cytomegalovirus promoter sequence, and the IRES sequence is preferably obtained from encephalomyocarditis virus.

【００４１】 遺伝子発現のためにコード化配列が送達される場合、核酸配列に加えて、１つ
または複数の他の成分を含む送達組成物または送達システムを提供することは一
般に有用である。そのような組成物は、例えば、それ自身の免疫刺激作用を有す
る非ＤＮＡ成分などによって、ＤＮＡの完全性を維持すること、および／または
ＤＮＡの細胞取り込みを増強すること、および／または免疫原性増強剤として作
用することを助けることができる。When a coding sequence is delivered for gene expression, it is generally useful to provide a delivery composition or system that includes one or more other components in addition to the nucleic acid sequence. Such compositions maintain DNA integrity and / or enhance cellular uptake of DNA, such as by non-DNA components that have their own immunostimulatory effects, and / or immunogenicity. It can help act as an enhancer.

【００４２】 従って、別の局面において、本発明は、上記に記載したプラスミドと保護的な
相互作用性の非凝縮性化合物（ＰＩＮＣ）とを含有する組成物を特徴とする。Thus, in another aspect, the invention features a composition comprising a plasmid as described above and a protective interacting non-condensable compound (PINC).

【００４３】 ＰＩＮＣは、哺乳動物細胞への核酸分子の送達を生体内で増強する。好ましく
は、核酸分子は、細胞内で発現させられる遺伝子生成物のコード化配列を含む。
多くの場合、その適切な遺伝子生成物はポリペプチドまたはタンパク質である。
好ましくは、ＰＩＮＣは、ＰＩＮＣがゲルを形成しないような条件、またはゲル
形態が約３０℃〜４０℃での投与時に存在しないような条件のもとで使用される
。従って、このような組成物において、ＰＩＮＣは３０％（ｗ／ｖ）以下の濃度
で存在する。或る好ましい実施形態において、ＰＩＮＣ濃度はさらに低く、例え
ば、２０％以下、１０％以下、５％以下または１％以下である。従って、このよ
うな組成物は、例えば、植物プロトプラストのエチレングリコール媒介トランス
フェクションの際、あるいは薬物送達または核酸送達するためのゲル形成の際の
ように化合物がより大きな濃度で使用されるところの、このような化合物または
類似する化合物の使用とは化合物の濃度および機能的作用が異なる。一般に、Ｐ
ＩＮＣは、それらがＰＩＮＣとして使用される条件でゲル形態ではないが、その
ような化合物には、特定の条件のもとでゲルを形成し得るものがある。PINC enhances the delivery of nucleic acid molecules to mammalian cells in vivo. Preferably, the nucleic acid molecule comprises a coding sequence for a gene product that is expressed in a cell.
Often, the appropriate gene product is a polypeptide or protein.
Preferably, PINC is used under conditions such that PINC does not form a gel, or where no gel form is present upon administration at about 30 ° C to 40 ° C. Thus, in such compositions, PINC is present at a concentration of 30% (w / v) or less. In certain preferred embodiments, the PINC concentration is even lower, for example, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less. Thus, such compositions may be used where the compounds are used at higher concentrations, for example, during ethylene glycol-mediated transfection of plant protoplasts, or during gel formation for drug or nucleic acid delivery. The use of such or similar compounds differs in the concentration and functional effects of the compounds. In general, P
INCs are not in gel form under the conditions in which they are used as PINCs, but some such compounds may form gels under certain conditions.

【００４４】 本発明の化合物および組成物に関連して、“保護する”または“保護的な”の
用語は、核酸の分解速度が特定の環境で低下するような、このような化合物と核
酸との相互作用の効果である。そのような分解は、特にヌクレアーゼの酵素的作
用を含む様々な異なる要因のためであり得る。保護的な作用は、種々の方法で、
例えば、ヌクレアーゼ分子の排除によって、あるいは水の排除によって提供され
得る。In the context of the compounds and compositions of the present invention, the term “protecting” or “protective” refers to such compounds and nucleic acids such that the rate of nucleic acid degradation is reduced in certain circumstances. Is the effect of the interaction. Such degradation may be due to a variety of different factors including, inter alia, the enzymatic action of nucleases. The protective action can be achieved in various ways,
For example, it may be provided by exclusion of nuclease molecules or by exclusion of water.

【００４５】 核酸を保護し、かつ／または核酸の生物利用性を延ばすいくつかの化合物はま
た、ファンデルワールス力、イオン−双極子相互作用、イオン誘導双極子相互作
用、水素結合またはイオン結合などの分子間力および／または原子価結合によっ
て核酸と相互作用または会合し得る。これらの相互作用は下記の機能をもたらし
得る：（１）遮蔽によるヌクレアーゼからの核酸の立体選択的な保護；（２）“
相乗りエンドサイトーシス”による核酸の容易な細胞取り込み。相乗りエンドサ
イトーシスは、エンドサイトーシスによって取り込まれ得るキャリアと複合体を
形成した薬物または他の物質の細胞取り込みである。ＣＶ ＵｇｌｅａおよびＣ
Ｄｕｍｉｔｒｉｕ−Ｍｅｄｖｉｃｈｉ、合成オリゴマーの医学的適用、Ｐｏｌ ｙｍｅｒｉｃ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、 Ｓｅｖｅｒｉａｎ Ｄｕｍｉｔｒｉ
ｕ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９３年を参照のためにここ
に援用する。Some compounds that protect nucleic acids and / or extend the bioavailability of nucleic acids also include van der Waals forces, ion-dipole interactions, ion-induced dipole interactions, hydrogen bonds or ionic bonds, etc. Can interact or associate with nucleic acids through intermolecular forces and / or valence bonds. These interactions may result in the following functions: (1) stereoselective protection of nucleic acids from nucleases by shielding; (2) "
Facile cellular uptake of nucleic acids by "spooling endocytosis". Synergistic endocytosis is the cellular uptake of a drug or other substance in complex with a carrier that can be taken up by endocytosis. CV Uglea and C
Dumitriu-Medvichi, medical applications of synthetic oligomers, Pol ymeric Biomaterials, Severian Dumitri
u, Marcel Dekker, Inc. , 1993, incorporated herein by reference.

【００４６】 記載された所望の効果を達成するためには、核酸を保護し、かつ／または核酸
の生物利用性を延ばす化合物が両親媒性を有すること、すなわち、親水性領域お
よび疎水性領域の両方を有することが望ましい。しかし、これは必須ではない。
化合物の親水性領域は、核酸の主としてイオン性で親水性の領域と会合すること
ができ、一方、化合物の疎水性領域は、核酸の拡散を遅らせて、ヌクレアーゼか
ら核酸を保護するように作用し得る。In order to achieve the desired effects described, the compound that protects the nucleic acid and / or extends the bioavailability of the nucleic acid must be amphiphilic, that is to say, that the hydrophilic region and the hydrophobic region It is desirable to have both. However, this is not required.
The hydrophilic regions of the compound can associate with the predominantly ionic and hydrophilic regions of the nucleic acid, while the hydrophobic regions of the compound act to slow the diffusion of the nucleic acid and protect the nucleic acid from nucleases. obtain.

【００４７】 さらに、疎水性領域は細胞膜と特異的に相互作用し、これにより、化合物のエ
ンドサイトーシス、従って同様に、化合物と会合した核酸のエンドサイトーシス
を容易にし得る。このプロセスにより、核酸の細胞周辺濃度が上昇し得る。In addition, the hydrophobic region may interact specifically with the cell membrane, thereby facilitating endocytosis of the compound, and thus also of the nucleic acid associated with the compound. This process can increase the pericellular concentration of nucleic acids.

【００４８】 両親媒性を有し得る薬剤であって、薬学的に受容可能であると一般に見なされ
ている薬剤を下記に示す：ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルコール；ポリ
酢酸ビニル；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ポロキサマー（
プルロニクス(Pluronics)）；ポロキサミン（テトロニクス(Tetronics)）；エチ
レン酢酸ビニル；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース；ヘテロ多糖類（ペクチン類）；キトサン類；ホス
ファチジルコリン類（レシチン類）；ミグリオール；ポリ乳酸；ポリヒドロキシ
酪酸；キサンタンゴム。同様に、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸（ＰＥＧ−
ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール−ポリヒドロキシ酪酸（ＰＥＧ−ＰＨＢ）、
ポリビニルピロリドン−ポリビニルアルコール（ＰＶＰ−ＰＶＡ）などのコポリ
マー系、ならびにＮ−ビニルプリン（またはＮ−ビニルピリミジン）誘導体およ
びＮ−ビニルピロリドンのコポリマーなどの誘導体化コポリマーが有る。しかし
、上記化合物のすべては必ずしも、下記に記載されるような保護的な相互作用性
の非凝縮性化合物ではない。Drugs that may have amphipathic properties and are generally regarded as pharmaceutically acceptable are listed below: polyvinylpyrrolidone; polyvinyl alcohol; polyvinyl acetate; propylene glycol; Poloxamer (
Pluronics); Poloxamine (Tetronics); Ethylene vinyl acetate; Methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose; Heteropolysaccharides (pectins); Chitosans; Phosphatidylcholines (lecithins); Polyhydroxybutyric acid; xanthan gum. Similarly, polyethylene glycol-polylactic acid (PEG-
PLA), polyethylene glycol-polyhydroxybutyric acid (PEG-PHB),
There are copolymer systems such as polyvinylpyrrolidone-polyvinyl alcohol (PVP-PVA) and derivatized copolymers such as N-vinylpurine (or N-vinylpyrimidine) derivatives and copolymers of N-vinylpyrrolidone. However, not all of the above compounds are necessarily protective interacting non-condensable compounds as described below.

【００４９】 このような組成物に対する保護的な相互作用性の非凝縮性化合物に関連して、
用語“非凝縮性”は、会合した核酸が、組成物において使用されている濃度での
ＰＩＮＣとの相互作用により凝縮または崩壊しないことを意味する。従って、Ｐ
ＩＮＣは、タイプおよび／または使用濃度において、そのような凝縮性ポリマー
とは異なる。汎用される凝縮性ポリマーの例には、ポリリシンおよびカスケード
ポリマー（球状ポリカチオン）が含まれる。In connection with non-condensable compounds that have a protective interaction with such compositions,
The term "non-condensable" means that the associated nucleic acids do not condense or disintegrate due to interaction with PINC at the concentration used in the composition. Therefore, P
INC differs from such condensable polymers in type and / or concentration used. Examples of commonly used condensable polymers include polylysine and cascade polymers (spherical polycations).

【００５０】 さらに、そのような化合物および会合した核酸分子と関連して、用語“送達を
増強する”は、少なくとも、ＰＩＮＣおよび核酸の量が最適化されている条件に
おいて、核酸が生理食塩水で送達される場合よりも大きな生物学的効果が得られ
ることを意味する。従って、核酸によってコード化された遺伝子生成物の発現が
所望される場合、ＰＩＮＣ：核酸の組成物で得られる発現レベルは、特定のＰＩ
ＮＣ／コード化配列の組合せについての適切な方法による送達に関して、生理食
塩水における同じ量の核酸で得られる発現よりも大きい。Further, in connection with such compounds and associated nucleic acid molecules, the term “enhancing delivery” refers to the ability of nucleic acids to be administered in saline, at least in conditions where the amount of PINC and nucleic acid is optimized. It means that a greater biological effect is obtained than when delivered. Thus, if expression of the gene product encoded by the nucleic acid is desired, the level of expression obtained with the PINC: nucleic acid composition will depend on the particular PI
For delivery by the appropriate method for the NC / coding sequence combination, it is greater than the expression obtained with the same amount of nucleic acid in saline.

【００５１】 上記組成物の好ましい実施形態において、ＰＩＮＣは、ポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＰ−ＰＶＡコポリマー、Ｎ
−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）、エチレングリコールまたはプロピレン
グリコールである。ポロキサマー（プルロニクス）が使用される組成物の場合、
核酸は、好ましくは、ウイルスベクターではない。すなわち、核酸は非ウイルス
ベクターである。In a preferred embodiment of the above composition, the PINC is polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), PVP-PVA copolymer, N
-Methyl-2-pyrrolidone (NM2P), ethylene glycol or propylene glycol. For compositions where poloxamers (pluronics) are used,
The nucleic acid is preferably not a viral vector. That is, the nucleic acid is a non-viral vector.

【００５２】 他の好ましい実施形態において、ＰＩＮＣは、標的化リガンドと結合する。そ
のような標的化リガンドは様々な異なるタイプであり得る。そのような標的化リ
ガンドには、ガラクトシル残基、フコサル（ｆｕｃｏｓａｌ）残基、マンノシル
残基、カルンチチン（ｃａｒｎｔｉｔｉｎｅ）誘導体、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体、ペプチドリガンド、およびＤＮＡ結合タンパク質が含まれる
が、これらに限定されない。これらの標的化リガンドは、抗原提示細胞、肝細胞
、筋細胞、上皮細胞、内皮細胞および癌細胞などの細胞に存在するレセプターと
結合し得る。[0052] In another preferred embodiment, the PINC binds a targeting ligand. Such targeting ligands can be of various different types. Such targeting ligands include, but are not limited to, galactosyl residues, fucosal residues, mannosyl residues, carnitine derivatives, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, peptide ligands, and DNA binding proteins. Not limited. These targeting ligands can bind to receptors present on cells such as antigen presenting cells, hepatocytes, muscle cells, epithelial cells, endothelial cells and cancer cells.

【００５３】 標的化リガンドおよびＰＩＮＣの会合に関連して、用語“と結合する”は、物
理的な会合が熱力学的に有利であるように、それらの一部が互いに相互作用を有
することを意味する。このことは、少なくとも、その会合に関する自由エネルギ
ーファンクションが局所的に最小であることを表している。そのような相互作用
には、共有結合、または非共有結合的相互作用、例えば、イオン結合、水素結合
、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、およびこれらの相互作用の組
合せを含みう得る。In connection with the association of the targeting ligand and PINC, the term “binds to” means that some of them interact with each other so that the physical association is thermodynamically favorable. means. This at least indicates that the free energy function for the association is locally minimal. Such interactions may include covalent or non-covalent interactions, such as ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals interactions, hydrophobic interactions, and combinations of these interactions.

【００５４】 標的化リガンドは様々なタイプであり得るが、１つの実施形態において、リガ
ンドは抗体である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を用い
ることができる。Although the targeting ligand can be of various types, in one embodiment, the ligand is an antibody. Both monoclonal and polyclonal antibodies can be used.

【００５５】 核酸はまた、様々な形態で存在し得る。好ましくは、核酸は、物理的形態を変
化させる化合物（１つまたは複数）と会合しないが、他の実施形態においては、
核酸は（凝縮性ポリマーなどにより）凝縮し、カチオン性脂質と処方され、ペプ
チドと処方され、あるいはカチオン性ポリマーと処方される。[0055] Nucleic acids can also exist in various forms. Preferably, the nucleic acid does not associate with the compound (s) that changes its physical form, but in other embodiments,
The nucleic acid is condensed (eg, with a condensable polymer) and formulated with a cationic lipid, formulated with a peptide, or formulated with a cationic polymer.

【００５６】 好ましい実施形態において、保護的な相互作用を成し得る非凝縮性化合物はポ
リビニルピロリドンであり、かつ／またはプラスミドは、０．５％〜５０％の間
のＰＶＰを有する溶液中に、より好ましくは約５％のＰＶＰを有する溶液中に存
在する。ＤＮＡは、好ましくは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であり、
より好ましくは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であり、最も好ましくは
少なくとも約９５％がスーパーコイル状である。In a preferred embodiment, the non-condensable compound capable of forming a protective interaction is polyvinylpyrrolidone and / or the plasmid is in a solution with between 0.5% and 50% PVP, More preferably, it is in a solution having about 5% PVP. The DNA is preferably at least about 80% supercoiled;
More preferably, at least about 90% is supercoiled, and most preferably, at least about 95% is supercoiled.

【００５７】 別の側面において、本発明は、保護的な相互作用を成し得る非凝縮性化合物と
、抗血管形成コード化配列を含有するプラスミドとを含有する組成物を特徴とす
る。In another aspect, the invention features a composition that includes a non-condensable compound that can form a protective interaction and a plasmid that includes an anti-angiogenic coding sequence.

【００５８】 さらに別の側面において、本発明は、本発明のプラスミド（または、抗血管形
成コード化配列を含有するプラスミド）およびカチオン性脂質を、好ましくは、
中性の共脂質とともに含有する組成物を特徴とする。In yet another aspect, the present invention provides a method for preparing a plasmid of the present invention (or a plasmid containing an anti-angiogenic coding sequence) and a cationic lipid, preferably
It features a composition that is contained with a neutral co-lipid.

【００５９】 好ましくは、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質はコレステロ
ール（ｃｈｏｌ）である。ＤＯＴＭＡは１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−
トリメチルアンモニウムプロパンであり、これは参照のためにここに援用するＥ
ｐｐｓｔｅｉｎ他の米国特許第４，８９７，３５５号、１９９０年１月３０日発
行、において記載されまた論じられている。しかし、他の脂質および脂質の組合
せを他の実施形態において使用することができる。様々なそのような脂質が、Ｇ
ａｏ＆Ｈｕａｎｇ、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７１０〜７２２
に記載されており、これは参照のためにここに援用する。他のカチオン性脂質送
達技術が、Ｂｒｉｇｈａｍの米国特許第５，６７６，９５４号、１９９７年１０
月１４日発行、に記載されており、これは参照のためにすべての図面を含むその
全体をここに援用する。[0059] Preferably, the cationic lipid is DOTMA and the neutral co-lipid is cholesterol (chol). DOTMA is 1,2-di-O-octadecenyl-3-
Trimethylammonium propane, which is incorporated herein by reference
No. 4,897,355 issued to Pppstein et al., issued on Jan. 30, 1990, and is discussed and discussed. However, other lipids and combinations of lipids can be used in other embodiments. A variety of such lipids are G
ao & Huang, 1995, Gene Therapy, 2: 710-722.
Which is incorporated herein by reference. Another cationic lipid delivery technology is described by Briham in US Pat. No. 5,676,954, Oct. 1997.
, Issued on March 14, which is incorporated herein by reference in its entirety, including all drawings.

【００６０】 カチオン性脂質とＤＮＡとの電荷比もまた重要な要因であり、好ましい実施形
態においては、ＤＮＡおよびカチオン性脂質は、負電荷対正電荷の比が１：０．
１〜１：１０の間であるような量で、好ましくは１：０．３〜１：６の間である
ような量で、より好ましくは約１：３であるような量で存在する。好ましくはあ
るが、比が１：３であることは必ずしも必要ではない。従って、好ましくは、組
成物に必要な電荷比は約１：０．１〜１：１０の間であり、より好ましくは約１
：０．３〜１：６の間である。The charge ratio of cationic lipid to DNA is also an important factor; in a preferred embodiment, the DNA and cationic lipid have a negative to positive charge ratio of 1: 0.
It is present in an amount such that it is between 1 and 1:10, preferably in an amount that is between 1: 0.3 and 1: 6, more preferably in an amount that is about 1: 3. Although preferred, it is not necessary that the ratio be 1: 3. Thus, preferably, the charge ratio required for the composition is between about 1: 0.1 to 1:10, more preferably about 1: 1.
: 0.3 to 1: 6.

【００６１】 用語“カチオン性脂質”は、生理学的なｐＨにおいて正味の正電荷を有する脂
質、好ましくは、そのようなｐＨにおいて負の電荷を有さない脂質をいう。その
ような脂質の例がＤＯＴＭＡである。同様に、“中性の共脂質”は、生理学的な
ｐＨにおいて通常は非荷電である脂質をいう。そのような脂質の例がコレステロ
ールである。The term “cationic lipid” refers to a lipid that has a net positive charge at physiological pH, preferably a lipid that has no negative charge at such pH. An example of such a lipid is DOTMA. Similarly, "neutral co-lipid" refers to a lipid that is normally uncharged at physiological pH. An example of such a lipid is cholesterol.

【００６２】 従って、ＤＮＡおよびカチオン性脂質に関する“負電荷対正電荷の比”は、カ
チオン性脂質における正味の正電荷と比較したＤＮＡにおける正味の負電荷の比
をいう。Thus, the “negative charge to positive charge ratio” for DNA and cationic lipids refers to the ratio of the net negative charge on DNA as compared to the net positive charge on cationic lipids.

【００６３】 ＤＮＡの形態は発現効率に影響を及ぼすので、ＤＮＡは、好ましくは少なくと
約８０％がスーパーコイル状であり、より好ましくは少なくとも約９０％がスー
パーコイル状であり、最も好ましくは少なくとも約９５％がスーパーコイル状で
ある。組成物は、好ましくは、本質的に約１０％のラクトースからなる等張性の
炭水化物溶液のような等張性の炭水化物溶液を含む。好ましい実施形態において
、組成物、カチオン性脂質および中性の共脂質は、１００ナノメートル〜１，０
００ナノメートルの間、好ましくは２００ナノメートル〜９００ナノメートルの
間、より好ましくは約８００ナノメートルの押出しサイズを有するリポソームと
して調製される。好ましくは、リポソームは、約２０ｎｍ〜８００ｎｍの間、よ
り好ましくは約５０ｎｍ〜４００ｎｍの間、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜
２００ｎｍの間、最も好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有するように調製さ
れる。マイクロ流動化が、そのようなリポソームの好ましい調製方法である。Since the form of the DNA affects expression efficiency, the DNA is preferably at least about 80% supercoiled, more preferably at least about 90% supercoiled, and most preferably at least about 90% supercoiled. About 95% are supercoiled. The composition preferably comprises an isotonic carbohydrate solution, such as an isotonic carbohydrate solution consisting essentially of about 10% lactose. In a preferred embodiment, the composition, the cationic lipid and the neutral co-lipid are between 100 nanometers and 1.0
It is prepared as a liposome having an extruded size between 00 nanometers, preferably between 200 nanometers and 900 nanometers, more preferably about 800 nanometers. Preferably, the liposome is between about 20 nm and 800 nm, more preferably between about 50 nm and 400 nm, even more preferably between about 75 nm and
It is prepared to have an average diameter between 200 nm, most preferably about 100 nm. Microfluidization is a preferred method of preparing such liposomes.

【００６４】 別の側面において、本発明は、（ａ）抗血管形成コード化配列を含むプラスミ
ドおよびカチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに有する第１の成分
であって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質がコレステロール
であり、かつプラスミド中のＤＮＡおよびカチオン性脂質は、負電荷対正電荷の
比が１：０．１〜１：１０の間、好ましくは、１：０．３〜１：６の間、より好
ましくは約１：３、であるような量で存在する第１の成分と、（ｂ）保護的な相
互作用性の非凝縮性化合物を含み、第１の成分がその内部に存在する第２の成分
とを含有する組成物を特徴とする。In another aspect, the invention relates to a first component comprising (a) a plasmid comprising an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid, preferably with a neutral co-lipid, Is DOTMA, the neutral colipid is cholesterol, and the DNA and cationic lipid in the plasmid have a negative to positive ratio of between 1: 0.1 and 1:10, preferably 1: 1. A first component present in an amount that is between: 0.3 to 1: 6, more preferably about 1: 3, and (b) a protective interacting non-condensable compound; A composition comprising a first component and a second component present therein is featured.

【００６５】 別の側面において、本発明は、保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、第１
の抗血管形成コード化配列、好ましくは、アンギオスタチンコード化配列、を含
む第１のプラスミドと、第２の抗血管形成サブユニットコード化配列、好ましく
は、エンドスタチンコード化配列、を独立して有する１つまたは複数の他のプラ
スミドとを有する組成物を提供する。In another aspect, the present invention provides a non-condensable compound of protective interaction with a first compound.
Independently comprise a first plasmid comprising an anti-angiogenic coding sequence, preferably an angiostatin coding sequence, and a second anti-angiogenic subunit coding sequence, preferably an endostatin coding sequence Compositions with one or more other plasmids are provided.

【００６６】 他の側面において、本発明は、保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、アン
ギオスタチンコード化配列を有する第１のプラスミドと、エンドスタチンコード
化配列を有する１つまたは複数の他のプラスミドとを含む組成物を特徴とする。In another aspect, the invention provides a protective interacting non-condensable compound, a first plasmid having an angiostatin coding sequence, and one or more plasmids having an endostatin coding sequence. And a composition comprising another plasmid.

【００６７】 本発明により、抗血管形成コード化配列を有するプラスミドおよびカチオン性
脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに含有する組成物もまた提供される。The invention also provides a composition comprising a plasmid having an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid, preferably with a neutral co-lipid.

【００６８】 他の側面において、本発明は、組織特異的エレメントおよび抗血管形成コード
化配列をプラスミドに挿入することによって、上記に記載されるプラスミドのい
ずれかを作製するための方法を特徴とする。In another aspect, the invention features a method for making any of the plasmids described above by inserting a tissue-specific element and an anti-angiogenic coding sequence into the plasmid. .

【００６９】 本発明はまた、上記に記載される組成物の作製方法を提供する。この方法は、
（ａ）抗血管形成コード化配列を含有する転写ユニットを有するＤＮＡ分子を調
製すること；（ｂ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製すること；およ
び（ｃ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を、ＤＮＡと、治療的有効量の抗
血管形成コード化配列を哺乳動物に送達し得る組成物が形成されるような条件で
組み合わせることを含むことができる。The present invention also provides a method for making the composition described above. This method
(A) preparing a DNA molecule having a transcription unit containing an anti-angiogenic coding sequence; (b) preparing a protective interacting non-condensable compound; and (c) protecting a mutual interaction. An active non-condensable compound can be combined with the DNA under conditions such that a composition is formed that can deliver a therapeutically effective amount of the anti-angiogenic coding sequence to the mammal.

【００７０】 好ましくは、ＤＮＡ分子はプラスミドである。この場合、プラスミドは抗血管
形成コード化配列を含み、より好ましくは、ヒト成長ホルモン３‘非翻訳領域／
ポリ（Ａ）シグナルをも含む。[0070] Preferably, the DNA molecule is a plasmid. In this case, the plasmid contains the anti-angiogenic coding sequence, and more preferably the human growth hormone 3 'untranslated region /
Also includes poly (A) signal.

【００７１】 この方法は、（ａ）抗血管形成コード化配列を有するＤＮＡを調製する工程；
（ｂ）カチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質との混合物で調製する工程で
あって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質がコレステロールで
ある工程；および（ｃ）カチオン性脂質を、ＤＮＡと、カチオン性脂質およびＤ
ＮＡが１：０．１〜１：１０の間、好ましくは１：０．３〜１：６の間、より好
ましくは約１：３、の負電荷対正電荷の比で存在するような量で組み合わせる工
程を含むことができる。The method comprises: (a) preparing a DNA having an anti-angiogenic coding sequence;
(B) preparing a cationic lipid, preferably in a mixture with a neutral co-lipid, wherein the cationic lipid is DOTMA and the neutral co-lipid is cholesterol; and (c) a cation DNA, cationic lipid and D
An amount such that the NA is present in a negative to positive charge ratio of between 1: 0.1 and 1:10, preferably between 1: 0.3 and 1: 6, more preferably about 1: 3. Can be included.

【００７２】 別の実施形態において、この方法は、（ａ）抗血管形成コード化配列を含有す
るプラスミドおよびカチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに有する
第１の成分を調製する工程であって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性
の共脂質がコレステロールであり、かつプラスミド中のＤＮＡおよびカチオン性
脂質は、負電荷対正電荷の比が１：０．１〜１：１０の間、好ましくは１：０．
３〜１：６の間、より好ましくは約１：３、であるような量で存在する工程；（
ｂ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を有する第２の成分を調製する工程；
および（ｃ）第１および第２の成分を、得られた組成物が第２の成分の内部に第
１の成分を含むように組み合わせる工程を含む。In another embodiment, the method comprises the steps of (a) preparing a first component having a plasmid containing an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid, preferably with a neutral co-lipid. Thus, the cationic lipid is DOTMA, the neutral co-lipid is cholesterol, and the DNA and cationic lipid in the plasmid have a negative to positive charge ratio of 1: 0.1 to 1:10. Between, preferably 1: 0.
Being present in an amount such that it is between 3: 1 and 1: 6, more preferably about 1: 3;
b) preparing a second component having a protective interacting non-condensable compound;
And (c) combining the first and second components such that the resulting composition includes the first component within the second component.

【００７３】 別の実施形態において、この方法は、（ａ）保護的な相互作用性の非凝縮性化
合物を調製する工程、（ｂ）第１の抗血管形成コード化配列、好ましくは、アン
ギオスタチンコード化配列、を有する第１のプラスミドを調製する工程、（ｃ）
他の抗血管形成コード化配列、好ましくは、エンドスタチンコード化配列、を独
自に有する１つまたは複数の他のプラスミドを調製する工程、および（ｄ）保護
的な相互作用性の非凝縮性化合物と、第１の抗血管形成コード化配列を有するプ
ラスミドと、他のプラスミドとを組み合わせる工程を含む。In another embodiment, the method comprises: (a) preparing a protective interacting non-condensable compound; (b) a first anti-angiogenic coding sequence, preferably an angiostatin Preparing a first plasmid having a coding sequence; (c)
Preparing one or more other plasmids uniquely having another anti-angiogenic coding sequence, preferably an endostatin coding sequence, and (d) a protective interacting non-condensable compound And combining a plasmid having the first anti-angiogenic coding sequence with another plasmid.

【００７４】 本発明の組成物を作製する方法はまた、プラスミドを、抗血管形成コード化配
列およびカチオン性脂質と、そして好ましくは、同様に、中性の共脂質とも組み
合わせることを含むことができる。[0074] The method of making the compositions of the invention can also include combining the plasmid with an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid, and preferably also with a neutral co-lipid. .

【００７５】 別の側面において、本発明は、哺乳動物の異常または疾患を、そのような異常
または疾患を罹っている哺乳動物に、以下に記載する治療的有効量のプラスミド
を投与することによって処置するための方法を提供する。In another aspect, the invention provides a method for treating a disorder or disease in a mammal by administering to a mammal suffering from such a disorder or disease a therapeutically effective amount of a plasmid as described below. Provide a way to

【００７６】 組成物の“治療的有効量”は、疾患または異常の症状または徴候の少なくとも
一時的な軽減または改善をもたらすのに十分な量である。従って、そのような量
はまた、薬理学的効果をもたらすのに十分である。組成物のそのような量は、永
続的な改善あるいはすべての症状または徴候の改善をもたらす必要はない。癌治
療剤の治療的有効量は、転移疾患の場合における全体的な腫瘍領域（すなわち、
転移物の数またはそれらのサイズ）を減少させる量であり、あるいは、限局性癌
における腫瘍塊を小さくさせる量である。A “therapeutically effective amount” of the composition is an amount sufficient to effect at least a temporary reduction or amelioration of the symptoms or signs of the disease or disorder. Thus, such an amount is also sufficient to produce a pharmacological effect. Such an amount of the composition need not result in a permanent improvement or improvement of all symptoms or signs. A therapeutically effective amount of a cancer therapeutic is the total tumor area (ie,
(The number of metastases or their size), or an amount that reduces the size of the tumor mass in localized cancer.

【００７７】 上記の異常または疾患は、好ましくは癌であり、例えば、腺腫および腺癌を含
む上皮腺癌；ポリープ、乳頭腫、扁平上皮細胞癌および移行上皮細胞癌を含む扁
平癌および移行性癌；ポジティブ型組織タイプ、肉腫および他（の腫）を含む結
合組織癌；リンパ腫、白血病およびホジキンス病を含む造血癌およびリンパ細網
癌；神経腫、肉腫、神経線維腫および芽細胞腫を含む神経組織癌；奇形腫および
奇形癌を含む混合組織起源の癌である。処置に適用され得る他の癌性異常には、
下記のいずれかの癌が含まれる：副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍；成
人の癌、乳癌、原発部位が不明な癌、胃腸管の類癌腫、頸部癌、小児癌、結腸癌
および直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌および頸部癌、小島細胞癌および他の膵
臓腺癌、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌
、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンス病リンパ腫、非ホジキンス病リンパ腫、メ
ラノーマ、中皮腫、転移癌、多発性筋炎、卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、膵臓癌、
副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、骨および柔組織の肉腫、皮膚癌、小
腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜疾患、子宮：子宮内膜癌、子宮
：子宮肉腫、膣癌、または外陰部癌。本発明の組成物は、好ましくは注射により
投与される。しかし、本発明の方法はまた、半ビボで行うことができる。The above-mentioned abnormality or disease is preferably cancer, for example, adenoma and epithelial adenocarcinoma including adenocarcinoma; polyps, papilloma, squamous cell carcinoma including squamous cell carcinoma and transitional cell carcinoma Connective tissue carcinomas including positive tissue types, sarcomas and others; hematopoietic carcinomas including lymphoma, leukemia and Hodgkin's disease; and nerves including neuromas, sarcomas, neurofibromas and blastomas Tissue cancer; cancer of mixed tissue origin, including teratomas and teratocarcinomas. Other cancerous abnormalities that can be applied to treatment include:
Includes any of the following cancers: adrenal gland cancer, anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, brain tumor; adult cancer, breast cancer, cancer of unknown primary location, carcinoma of the gastrointestinal tract, cervical cancer, childhood cancer, Colon and rectal, esophageal, gallbladder, head and neck, islet cell and other pancreatic adenocarcinoma, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, leukemia, liver cancer, non-small cell lung cancer, small cell Lung cancer, AIDS-related lymphoma, Hodgkin's disease lymphoma, non-Hodgkin's disease lymphoma, melanoma, mesothelioma, metastatic cancer, polymyositis, ovarian cancer, ovarian germ cell tumor, pancreatic cancer,
Parathyroid, penile, pituitary, prostate, sarcoma of bone and soft tissue, skin, small intestine, stomach, testis, thymus, thyroid, trophoblast, uterus: endometrial, uterus : Uterine sarcoma, vaginal cancer, or vulvar cancer. The compositions of the present invention are preferably administered by injection. However, the method of the present invention can also be performed ex vivo.

【００７８】 別の側面において、本発明は、細胞をトランスフェクションするのに十分な時
間にわたって細胞をここに記載されているプラスミドと接触させることによって
細胞をその場でトランスフェクションするための方法（すなわち、遺伝子を細胞
に送達して発現させるための方法）を提供する。細胞のトランスフェクションは
、好ましくは生体内で行われ、そのような接触は、好ましくは約５％のＰＶＰ溶
液の存在下で行われる。In another aspect, the invention relates to a method for transfecting a cell in situ by contacting the cell with a plasmid described herein for a time sufficient to transfect the cell (ie, , A method for delivering and expressing a gene in a cell). Transfection of the cells is preferably performed in vivo, and such contacting is preferably performed in the presence of about 5% PVP solution.

【００７９】 別の側面において、本発明は、（ａ）多数の細胞を本発明のプラスミドまたは
組成物でトランスフェクションすること；および（ｂ）その多数の細胞を、ベク
ター内の核酸配列（この核酸配列は抗血管形成因子をコード化する）の発現を可
能にする条件下で培養することによって、多数の細胞における抗血管形成遺伝子
の送達および発現を行うための方法を特徴とする。In another aspect, the invention relates to (a) transfecting a number of cells with a plasmid or composition of the invention; and (b) converting the number of cells to a nucleic acid sequence (such as a nucleic acid) in a vector. The sequence encodes an anti-angiogenic factor) and features a method for delivering and expressing an anti-angiogenic gene in a large number of cells by culturing under conditions that allow expression of the gene.

【００８０】 好ましい実施形態において、抗血管形成因子はヒトの抗血管形成因子であり、
細胞はヒト細胞であり、かつ／またはその接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で
行われる。In a preferred embodiment, the anti-angiogenic factor is a human anti-angiogenic factor,
The cells are human cells and / or the contacting is performed in the presence of about 5% PVP solution.

【００８１】 別の側面において、本発明は、本発明のプラスミドまたは組成物で細胞をその
場でトランスフェクションすることによって疾患または異常を処置するための方
法を特徴とする。“その場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）”は、細胞によっては生体内ま
たは生体外であり得る細胞の本来の発生位置におけることを意味する。従って、
ここで求められているように、例えば、その場でのトランスフェクションは、半
ビボトランスフェクションと区別するために主として使用される用語である。上
記の疾患または異常は、限局性の疾患または異常（例えば、固形腫瘍）、あるい
は全身的な疾患または異常（例えば、転移癌）であり得る。In another aspect, the invention features a method for treating a disease or condition by transfecting cells in situ with a plasmid or composition of the invention. "In situ" means at the original location of the cell, which may be in vivo or in vitro for some cells. Therefore,
As sought here, for example, in situ transfection is a term primarily used to distinguish it from ex vivo transfection. The disease or condition described above can be a localized disease or condition (eg, a solid tumor) or a systemic disease or condition (eg, a metastatic cancer).

【００８２】 別の側面において、本発明は、本発明のプラスミドまたは組成物でトランスフ
ェクションされた細胞を特徴とする。In another aspect, the invention features a cell transfected with a plasmid or composition of the invention.

【００８３】 さらに別の側面において、本発明は、哺乳動物の異常または疾患を、そのよう
な異常または疾患を罹っている哺乳動物に、ここに記載する組成物の治療的有効
量を投与することによって処置するための方法を特徴とする。In yet another aspect, the invention relates to administering a disorder or disease in a mammal, to a mammal suffering from such disorder or disease, administering a therapeutically effective amount of a composition described herein. And a method for treating by

【００８４】 哺乳動物の異常または疾患を処置するための方法はまた、そのような異常また
は疾患に罹っている哺乳動物に、アンギオスタチンコード化配列を有する第１の
プラスミドとエンドスタチンコード化配列を有する第２のプラスミドとの組成物
の治療的有効量を投与することを特徴とし、そのような投与を含む。The method for treating a mammalian disorder or disease also comprises providing a mammal afflicted with such a disorder or disease with a first plasmid having an angiostatin coding sequence and an endostatin coding sequence. Administering a therapeutically effective amount of a composition with a second plasmid having such an administration.

【００８５】 これらの組成物は生体内における細胞への核酸分子の送達に有用であるので、
関連した側面において、本発明により、組成物が投与の生体内部位において提供
される。特に、これには、哺乳動物における生体内部位が含まれる。Because these compositions are useful for delivering nucleic acid molecules to cells in vivo,
In a related aspect, the invention provides a composition at an in vivo site of administration. In particular, this includes in vivo sites in mammals.

【００８６】 好ましい実施形態において、核酸分子は、遺伝子産物をコード化する配列を含
む。好ましい実施形態においてもまた、投与部位は、動物、特に哺乳動物、の間
質空間または間質組織においてである。[0086] In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule comprises a sequence encoding a gene product. Also in preferred embodiments, the site of administration is in an animal, especially a mammal, interstitial space or interstitial tissue.

【００８７】 本発明はまた、上記組成物の使用方法を提供する。従って、さらなる関連する
側面において、組成物が、哺乳動物に、好ましくは、組織または間質空間に導入
される組成物の投与方法が提供される。The present invention also provides a method of using the above composition. Thus, in a further related aspect, there is provided a method of administering a composition wherein the composition is introduced into a mammal, preferably into a tissue or interstitial space.

【００８８】 この分野で知られているような様々な送達方法を利用することができるが、好
ましい実施形態においては、組成物は注射によって組織または間質空間に導入さ
れる。組成物はまた、様々な異なる組織に送達され得るが、好ましい実施形態に
おいては、そのような組織は筋肉または腫瘍である。Although various delivery methods are known as known in the art, in a preferred embodiment, the composition is introduced into the tissue or interstitial space by injection. The composition can also be delivered to a variety of different tissues, but in preferred embodiments, such tissues are muscles or tumors.

【００８９】 別の関連する側面において、本発明は、上記に記載されている組成物の治療的
有効量を投与することによって哺乳動物の異常または疾患を処置するための方法
を提供する。好ましい実施形態において、そのような異常または疾患は癌である
。In another related aspect, the invention provides a method for treating a disorder or disease in a mammal by administering a therapeutically effective amount of a composition described above. In a preferred embodiment, such an abnormality or disease is cancer.

【００９０】 上記に記載した本発明の要約は非限定的なものであり、本発明の他の特徴およ
び利点は、下記の好適な実施形態の詳細な説明、ならびに請求項から明らかとな
るであろう。The summary of the invention described above is non-limiting and other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description of the preferred embodiments, and from the claims. Would.

【００９１】 好ましい具体例の詳細な説明 本発明のプラスミド、関連産物および方法は、以下に詳細に記述される。 Ｉ．一般原理 本発明は、哺乳類細胞中の抗血管形成コーディング配列の送達および発現につ
いての発現系、および哺乳類に対するそのような発現系または他の発現系を送達
する処方および方法に関する。 したがって、抗血管形成剤、好ましくはヒト・エンドスタチンまたはアンギオ
スタチンをコードするヌクレオチド配列を含む、特定の遺伝子コンストラクトが
、記述されている。このようなコンストラクトは、ここに記述されるとおり有益
に処方され、そして投与され、それにより本発明の発現系を利用しうる。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The plasmids, related products and methods of the present invention are described in detail below. I. General Principles The present invention relates to expression systems for the delivery and expression of anti-angiogenic coding sequences in mammalian cells, and to formulations and methods for delivering such or other expression systems to mammals. Accordingly, certain gene constructs have been described that include nucleotide sequences encoding an anti-angiogenic agent, preferably human endostatin or angiostatin. Such constructs may be beneficially formulated and administered as described herein, thereby utilizing the expression system of the invention.

【００９２】 このようなプラスミドの具合のよい産生をさせるために、プラスミドが、高い
コピー数まで細胞での複製をする能力があることが一般的に好ましい。一般に、
このような産生は、原核生物の細胞、特にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ
．ｃｏｌｉ））細胞で行われる。したがって、プラスミドは、原核生物の細胞中
で機能性のある複製起点を含むのが好ましく、そして好ましくは、複製起点が、
高いコピー数に複製を指示するものである。 プラスミドコンストラクト中で合成遺伝子要素を利用することも可能である。 以下に記述されるとおり、これらの要素は、真核生物系での転写後プロセシン
グに影響を及ぼす。したがって、合成配列の使用は、特定の用途のために所望さ
れるとおりプロセシング特性の設計を可能にする。一般に、その要素は迅速で、
そして正確なプロセシングを提供するように設計される。 哺乳類系に対する所望の発現産物をコードするＤＮＡを送達するために、送達
システムを利用することが通常好ましい。このような系は、複数の利益を提供で
き、特に、ＤＮＡの完全性を保護する安定化する他、細胞への取込を促進する。For successful production of such plasmids, it is generally preferred that the plasmid be capable of replicating in cells to high copy numbers. In general,
Such production has been accomplished in prokaryotic cells, particularly Escherichia coli (E.
. E. coli)). Thus, the plasmid preferably contains an origin of replication functional in prokaryotic cells, and preferably the origin of replication is
The copy is instructed to a high copy number. It is also possible to utilize synthetic genetic elements in plasmid constructs. As described below, these elements affect post-transcriptional processing in eukaryotic systems. Thus, the use of synthetic sequences allows for the design of processing characteristics as desired for a particular application. Generally, the elements are quick,
And designed to provide accurate processing. It is usually preferred to utilize a delivery system to deliver DNA encoding the desired expression product to a mammalian system. Such a system can offer multiple benefits, in particular stabilizing the integrity of the DNA, as well as promoting its uptake into cells.

【００９３】 さらに、その処方の非ＤＮＡ成分は、免疫系増強または活性化に寄与しうる。
結果として、送達システムの成分は、免疫刺激効果を増強または最小限にする特
定の遺伝子産物と関連して選択されうる。 プラスミドは、サイトカイン、例えばＩＬ−１２またはその１つまたはそれ以
上のサブユニットのような抗癌または抗腫瘍剤の発現のための要素をも包含しう
る。 治療用分子の「サブユニット」は、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子であり、１
つまたはそれ以上の他の分子と合せて、関連する製剤上の活性を示す複合体を形
成する。このような複合体の例としては、ホモ二量体およびヘテロ二量体の他、
より多くのサブユニットを有する複合体が挙げられる。ヘテロ二量体の特定の例
は、ｐ４０およびｐ３５のサブユニットを有するＩＬ−１２である。 同様に、治療は、単独のプラスミドまたは別々のプラスミドのいずれかにおけ
る抗血管形成性コーディング配列、および１つまたはそれ以上のサイトカインま
たは他の抗癌または抗腫瘍コーディング配列の投与に関与しうる。このようなプ
ラスミドは、保護的、相互作用性の非縮合化合物である、カチオン性脂質および
中性共脂質、またはこれらの双方とともに、送達のための組成物に組込まれうる
。Further, the non-DNA components of the formulation can contribute to immune system enhancement or activation.
As a result, the components of the delivery system can be selected in connection with a particular gene product that enhances or minimizes the immunostimulatory effect. A plasmid may also include elements for expression of an anti-cancer or anti-tumor agent, such as a cytokine, eg, IL-12 or one or more subunits thereof. A “subunit” of a therapeutic molecule is a polypeptide or RNA molecule,
Together with one or more other molecules, they form a complex that exhibits the relevant pharmaceutical activity. Examples of such complexes include homodimers and heterodimers,
Complexes having more subunits are included. A particular example of a heterodimer is IL-12, which has p40 and p35 subunits. Similarly, treatment may involve the administration of anti-angiogenic coding sequences, either on a single plasmid or on separate plasmids, and one or more cytokines or other anti-cancer or anti-tumor coding sequences. Such a plasmid may be incorporated into a composition for delivery, together with cationic lipids and neutral co-lipids, or both, that are protective, interacting non-condensing compounds.

【００９４】 これらが、特に有効な例である一方で、その他の成分が、本発明の抗血管形成
発現ベクターを含む処方で利用されて、抗血管形成剤の有効な送達および発現を
提供し、あるいは免疫系成分の活性化の操作が望みうる他のコーディング配列を
提供する。 コーディング配列の選択と関連して、送達システムの成分および製造方法の選
択により、コード化された遺伝子産物の特定の効果と送達システム組成物全体の
免疫系効果の均衡を取ることができる。送達システム処方の投与の生物学的効果
を制御するかかる能力は、抗血管形成剤をコードするコンストラクトと送達シス
テムの特定の処方に加えて、本発明の一つの態様を表す。コード化遺伝子産物と
、送達システム成分及びそのパラメーターとの同時選択は、高いレベルの遺伝子
発現をただ提供するよりむしろ所望の効果の増強を提供する。特に、そのような
増強は、典型的なＰＶＰ含有組成物の抗腫瘍効果として、以下に記述される。While these are particularly effective examples, other components may be utilized in formulations containing the anti-angiogenic expression vectors of the present invention to provide for effective delivery and expression of anti-angiogenic agents, Alternatively, other coding sequences are provided for which manipulation of activation of immune system components may be desired. In connection with the choice of coding sequence, the choice of components of the delivery system and method of manufacture can balance the specific effects of the encoded gene product with the immune system effects of the overall delivery system composition. Such ability to control the biological effects of administration of the delivery system formulation represents one embodiment of the present invention, in addition to the particular formulation of the delivery system and the construct encoding the anti-angiogenic agent. Co-selection of the encoded gene product with the delivery system components and their parameters provides the desired effect enhancement, rather than merely providing high levels of gene expression. In particular, such enhancement is described below as the anti-tumor effect of a typical PVP-containing composition.

【００９５】 ＩＬ−１２も投与される系について、抗腫瘍効果は、単に添加したというより
も大きい（すなわち、単に、抗血管形成剤単独およびＩＬ−１２単独の抗腫瘍効
果の総計より大きい）可能性がある。免疫刺激効果の増強は、例えば、ワクチン
用途についての他の関連においても好ましい。 対照的に、ある種の用途については、免疫系効果を最小限にする送達系を選択
することが好ましい。例えば、肺組織の腫れを最小限にするために、免疫系活性
化が、肺に送達されるべき組成ついて最小限にされるのがしばしば好ましい。 特定のコーディング配列についての送達システム成分および調製技術を選択す
るための有用なアプローチ法は、以下のとおり進行しうるが、しかしこれらの工
程及びその順序に限定されるものではない。For systems in which IL-12 is also administered, the antitumor effect can be greater than simply added (ie, simply greater than the sum of the antitumor effects of the antiangiogenic agent alone and IL-12 alone). There is. Enhanced immunostimulatory effects are also preferred in other contexts, for example, for vaccine applications. In contrast, for certain applications, it is preferable to select a delivery system that minimizes the effects of the immune system. For example, to minimize swelling of lung tissue, it is often preferred that immune system activation be minimized for the composition to be delivered to the lung. Useful approaches for selecting delivery system components and preparation techniques for a particular coding sequence may proceed as follows, but are not limited to these steps and their order.

【００９６】 １．インビトロでの適切な発現を提供する特定の遺伝子コンストラクトを選択
する。 ２．望ましい免疫刺激効果および／または生体内の生理学的効果に基づいて送
達システムの成分を選択する。このような効果は生体内のモデル系で試験され確
認される。 ３．望ましい免疫刺激効果と調和し、および／または望ましい生体内での生理
学上の効果の増強と調和する、他の送達システムのパラメーターを選択する。例
えば、このようなパラメーターとしては、１つまたはそれ以上の他の組成物成分
に対するＤＮＡの量および比率、非ＤＮＡ組成物成分の相対量、送達システム処
方粒子のサイズ、環状ｄｓＤＮＡベクターについてのスーパーコイルＤＮＡの含
有率、および送達システム処方粒子の調製のための特定の方法が挙げられる。特
定のタイプの処方に関連する特定のパラメーターは、明らかであるか、あるいは
試験によって容易に決定される。1. Select a particular gene construct that provides for proper expression in vitro. 2. The components of the delivery system are selected based on the desired immunostimulatory and / or in vivo physiological effects. Such effects are tested and confirmed in an in vivo model system. 3. Other delivery system parameters are selected that are consistent with the desired immunostimulatory effect and / or with the desired enhanced in vivo physiological effects. For example, such parameters include the amount and ratio of DNA to one or more other composition components, the relative amounts of non-DNA composition components, the size of delivery system formulation particles, the supercoil for circular dsDNA vectors. Specific methods for DNA content and preparation of delivery system formulation particles are included. The particular parameters associated with a particular type of formulation are obvious or are readily determined by testing.

【００９７】 以下の説明は、抗血管形成剤コードコンストラクトに関する、成分およびパラ
メーターの選択を例示する。しかし、そのアプローチ法は、多様な他のコーディ
ング配列を含むコンストラクトに使用可能であることが認識されるべきである。 ＩＩ．プラスミドコンストラクト発現系 Ａ．プラスミド設計および構築 本発明の方法およびコンストラクトについて、抗血管形成剤をコードする配列
の送達および発現について有用である多数の異なるプラスミドが構築された。し
たがって、これらのプラスミドは、抗血管形成剤のためのコーディング領域を、
それらのコーディング領域の発現に必要であるか、または有用である遺伝的要素
と一緒に含む。The following description illustrates the selection of components and parameters for the anti-angiogenic agent code construct. However, it should be recognized that the approach can be used for constructs containing a variety of other coding sequences. II. Plasmid construct expression system Plasmid Design and Construction For the methods and constructs of the present invention, a number of different plasmids have been constructed that are useful for the delivery and expression of sequences encoding anti-angiogenic agents. Thus, these plasmids contain coding regions for anti-angiogenic agents,
Include along with genetic elements that are necessary or useful for the expression of those coding regions.

【００９８】 これらの具体例が、特定の出所から得られるｃＤＮＡクローンまたは部分的ゲ
ノム配列を利用した一方で、当業者は、他の出所から抗血管形成コーディング配
列を容易に得るか、または公表された抗血管形成コーディングおよび／またはフ
ランキング配列に基づくプローブ（類）を用いてライブラリー中のｃＤＮＡクロ
ーンを同定することによってコーディング配列を得ることができた。 抗血管形成剤についてのコーディング配列は、真核生物および細菌の遺伝的要
素を含む発現プラスミドに組込まれた。真核生物の遺伝的要素としては、ＣＭＶ
即時型プロモーター及び５’ＵＴＲ、および、ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ／ポ
リ（ａ）シグナルが挙げられる。これらは、ＲＮＡプロセシングの正確性および
効率、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳を制御することによって遺伝子発現に影響を
及ぼす。While these embodiments have utilized cDNA clones or partial genomic sequences obtained from a particular source, those skilled in the art will readily obtain or publish anti-angiogenic coding sequences from other sources. The coding sequence could be obtained by identifying the cDNA clones in the library using probe (s) based on the anti-angiogenic coding and / or flanking sequences. The coding sequence for the anti-angiogenic agent was incorporated into an expression plasmid containing eukaryotic and bacterial genetic elements. Eukaryotic genetic elements include CMV
Immediate promoter and 5'UTR, and human growth hormone 3'UTR / poly (a) signal. They affect gene expression by controlling the accuracy and efficiency of RNA processing, mRNA stability, and translation.

【００９９】 ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲは、ヒト成長ホルモン遺伝子から得られ、そして
好ましくは、ポリ（ａ）シグナルを含む。この配列は、ｃＤＮＡ配列、ゲノム配
列、修飾されたゲノム配列、あるいは抗血管形成剤をコードする合成配列につい
ての自然の翻訳終止コドンに続いて直ぐに連結されうる。 ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ／ポリ（ａ）シグナルの例は、下のヒト成長ホル
モン３’ＵＴＲ（ヌクレオチド１−１００）および３’フランキング配列（ヌク
レオチド１０１−１９１；ジーンバンクアクセス番号Ｊ０３０７１、ＨＵＭＧＨ
ＣＳＡ）によって示される。 1 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGT ポリ（ａ）シグナル 51 TGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCA 101 TTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTG 151 GTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCThe human growth hormone 3′UTR is derived from the human growth hormone gene and preferably contains a poly (a) signal. This sequence can be ligated immediately following the natural translational stop codon for the cDNA sequence, genomic sequence, modified genomic sequence, or synthetic sequence encoding the anti-angiogenic agent. Examples of human growth hormone 3'UTR / poly (a) signals include the following human growth hormone 3'UTR (nucleotides 1-100) and 3 'flanking sequences (nucleotides 101-191; Genebank accession number J03071, HUMGH).
CSA). 1 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGT poly (a) signal 51 TGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCT AATAAA ATTAAGTTGCATCA 101 TTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTG 151 GTATGGAGCAAGGGAGAAGG

【０１００】 ５’および３’ＵＴＲおよびフランキング領域は、さらに、より正確に、通常
の方法論、例えば欠失または突然変異分析や、あるいは同等の方法によって同定
することができ、適切な転写及び翻訳機能を示す他の配列を提供するように修飾
されうる。プラスミド、プラスミド骨格、ヒト抗血管形成ｃＤＮＡ、および最終
コンストラクトの構築は、実施例で以下に記述される。 以下に検討される数種のＥＣ−特異的プロモーターは、文献に記述されている
。The 5 ′ and 3 ′ UTRs and flanking regions can be more accurately identified by conventional methodologies, such as deletion or mutation analysis, or equivalent methods, and appropriate transcription and translation It can be modified to provide other sequences that exhibit function. The construction of the plasmid, plasmid backbone, human anti-angiogenic cDNA, and final construct is described below in the Examples. Several EC-specific promoters discussed below have been described in the literature.

【０１０１】 インビトロで高濃度およびＥＣ−特異的発現を支持することが示されたヒトの
バン・ウイルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子フランキング領域および最初のエク
ソンは、インビボでのＥＣの副集団のみでｌａｃＺを発現し、そして実験された
種々の臓器の血管床では発現しなかった（Ａｉｒｄら、ＰＮＡＳ、９２巻：４５
６７−４５７１頁（１９９５年））。それは、非特異的コアプロモーター（−９
０から＋２２まで）、全ての細胞型でその活性を阻害する陰性要素（−４７８か
ら−３００まで）、およびＥＣ中でのみ抑制を解除する陽性要素から構成され、
そしてＥＣ特異的発現（＋１５０から＋２４７まで）を生じる。この陽性要素が
、ウシのｖＷＦプロモーターに現れないことが示された。The human Van Willebrand factor (vWF) gene flanking region and the first exon, which have been shown to support high concentrations and EC-specific expression in vitro, are only present in a sub-population of ECs in vivo. lacZ was expressed and was not expressed in the vascular beds of various organs studied (Aird et al., PNAS, 92:45).
67-4571 (1995)). It is a non-specific core promoter (-9
0 to +22), a negative element that inhibits its activity in all cell types (from -478 to -300), and a positive element that releases suppression only in EC;
And produces EC-specific expression (from +150 to +247). This positive element was shown not to appear in the bovine vWF promoter.

【０１０２】 プレプロエンドセリン（ＥＴ−１）遺伝子プロモーターは、ヒトのエンドセリ
ン遺伝子プロモーター（−２４０から−８６まで）の１１９塩基対（「ｂｐ」）
断片であり、最小のＳＶ４０プロモーターに融合した場合にＣＡＴのＥＣ特異的
発現を指示する。ネズミのＥＴ−１プロモーターは、トランスジェニックマウス
中のＬＵＣまたは脂質過酸化酵素のいずれかの発現を指示する（Ｈａｒａｔｓら
、ＪＣＩ ９５巻：１３３５−４４頁、１９９５年）。しかし、移入遺伝子の発
現は、血管のＥＣに制限されなかったが、しかし動脈平滑筋肉でも存在し、洗濯
された上皮に存在した。さらに、その発現のレベルは、動脈で高い、から静脈お
よび毛細血管で低い、までの範囲にあり、そして臓器の間およびその臓器内の両
方で発現において明らかな多様性があった。The preproendothelin (ET-1) gene promoter is 119 base pairs (“bp”) of the human endothelin gene promoter (from −240 to −86).
A fragment that directs EC-specific expression of CAT when fused to the minimal SV40 promoter. The murine ET-1 promoter directs the expression of either LUC or lipid peroxidase in transgenic mice (Harats et al., JCI 95: 1335-44, 1995). However, transgene expression was not restricted to vascular ECs, but was also present in arterial smooth muscle and was present in the washed epithelium. In addition, the levels of its expression ranged from high in arteries to low in veins and capillaries, and there was clear diversity in expression both within and within organs.

【０１０３】 細胞内接着分子−２（ＩＣＡＭ−２）遺伝子プロモーターのＳｔｙＩ（−３３
６から＋２３まで）断片が、トランスジェニックマウスでの腎臓および肺の血管
形成に対する異種遺伝子（ＣＤ５９）発現を指示することが示された。それは、
ＴＡＴＡ欠乏プロモーターであり、そしてＳｐ１、ＧＡＴＡおよびＥＴＳ結合部
位を含む。 アルファｖベータ３インテグリンは、腫瘍上皮で優先的に発現される。アルフ
ァｖベータ３インテグリン（フィブロネクチン受容体）と対照的に、アルファｖ
ベータ３インテグリン（ビトロネクチン受容体）は、ある種の成長因子と協同す
る。その発現の阻害は、ヒトが治癒する間じゅう新たな血管形成を遮断する。 ヒトアルファｖ遺伝子の５’フランキング領域、第１エキソン、および第１イ
ントロンの一部を含む１５．５ｋｂのＤＮＡ断片が同定され、そしてヒトアルフ
ァｖ遺伝子プロモーターと名付けられた。転写開始部位は、ＡＴＧ部位の１６９
ｂｐ上流にマッピングされた。５’フランキング領域は、ＴＡＴＡボックスまた
は開始要素を含まないが、４つのＳｐ１，２つのＥｔｓおよび１つのＧＡＴＡ結
合部位を含む。アルファｖ遺伝子プロモーターの２２２ｐｂ領域は、アルファｖ
プロモーター活性に強力な正の効果を発揮することが示された。The Styl (-33) of the intracellular adhesion molecule-2 (ICAM-2) gene promoter
6 to +23) fragment was shown to direct heterologous gene (CD59) expression on kidney and lung angiogenesis in transgenic mice. that is,
It is a TATA deficient promoter and contains Sp1, GATA and ETS binding sites. Alphavbeta3 integrin is preferentially expressed in tumor epithelium. In contrast to alphavbeta3 integrin (fibronectin receptor), alphav
Beta-3 integrins (vitronectin receptors) cooperate with certain growth factors. Inhibition of its expression blocks new blood vessel formation throughout human healing. A 15.5 kb DNA fragment containing the 5 'flanking region, the first exon, and part of the first intron of the human alphav gene was identified and named the human alphav gene promoter. The transcription start site is 169 of the ATG site.
bp upstream. The 5 'flanking region does not contain a TATA box or initiation element, but contains four Sp1, two Ets and one GATA binding site. The 222pb region of the alphav gene promoter
It has been shown to exert a strong positive effect on promoter activity.

【０１０４】 ５’からスタートコドンまでの２．０ｋｂの配列を含む６ｋｂのヒトゲノムＤ
ＮＡ断片は、ヒトのベータ３遺伝子プロモーターとして定義される。５’からス
タートコドンまでの５８４ｂｐ断片は、プロモーター欠乏の対照ＣＡＴコンスト
ラクトより５倍までＣＡＴレポーター遺伝子の発現を促進する。このベータ３プ
ロモーターは、ＴＡＴＡおよびＣＡＡＴシス作用要素を欠くが、しかし、転写開
始部位に隣接して２つのＳｐ１部位がある。ベータ３プロモーターが、ＰＭＡお
よびレチノイン酸によって上向きに調節されうるが、しかし、ＴＮＦ／ＩＦＮガ
ンマのような前炎症サイトカインによっては上向きに調節されないことが示され
た。 血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）およびその２つのＥＣ特異的受容体チ
ロシンキナーゼ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲおよびＦｌｔ−１は、生理学的および病理
学的血管形成で主要な役割を果す。マウスのＦｌｔ遺伝子プロモーターの−３１
１８から＋２０９までの断片、およびマウスのＦｌｋ−１遺伝子プロモーターの
−１８２９から＋１４８までの断片がクローン化された。低酸素症は、生体内で
のＶＥＧＦおよびその受容体の上向き調節についての主要な機構であることが示
された。一過性形質移入アッセイで、低酸素症は、Ｆｌｔ−１プロモーターの強
力な転写活性化に至るのに対して、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ転写は、実質的に変化し
ていなかった。Ｆｌｔ−１プロモーターの４３０ｂｐ領域は、低酸素症に応答し
て転写のために必要とされ、そしてこの領域は、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）
共通配列を含む。6 kb human genome D containing 2.0 kb sequence from 5 ′ to start codon
The NA fragment is defined as the human beta3 gene promoter. The 584 bp fragment from the 5 'to the start codon promotes expression of the CAT reporter gene up to 5-fold over the promoter-deficient control CAT construct. This beta3 promoter lacks the TATA and CAAT cis-acting elements, but has two Sp1 sites adjacent to the transcription start site. The beta3 promoter has been shown to be upregulated by PMA and retinoic acid, but not by proinflammatory cytokines such as TNF / IFN gamma. Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) and its two EC-specific receptor tyrosine kinases, Flk-1 / KDR and Flt-1, play major roles in physiological and pathological angiogenesis. -31 of the mouse Flt gene promoter
A fragment from 18 to +209 and a fragment from -1829 to +148 of the mouse Flk-1 gene promoter were cloned. Hypoxia has been shown to be a major mechanism for the upregulation of VEGF and its receptor in vivo. In a transient transfection assay, hypoxia led to strong transcriptional activation of the Flt-1 promoter, whereas Flk-1 / KDR transcription was virtually unchanged. The 430 bp region of the Flt-1 promoter is required for transcription in response to hypoxia, and this region contains the hypoxia-inducible factor (HIF)
Includes common sequence.

【０１０５】 エンドセリン−１エンハンサー、マウスのエンドセリン−１遺伝子の転写開始
部位の３２０から３６４ｂｐ上流の間に配置された内皮細胞特異的調節領域は、
ＢｕおよびＱｕａｒｔｅｒｍｏｕｓによって同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２７２巻：３２６１３−３２６２２頁（１９９７年））。このエンハンサ
ー配列の３個のコピーは、ＥＴ−１プロモーターおよび異種プロモーターの両方
を活性化することが示された。 細胞サイクル特異的プロモーターサイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１、またはｃｄｃ６に
よって駆動される遺伝子発現は、細胞サイクル依存形態で調節され、そしてこの
調節は、本質的に転写レベルにある。これらの遺伝子のプロモーターは、共通Ｅ
２Ｆ部位を含み、この部位は、休止Ｇ０（ゼロ）相での抑制に、そしてある種の
場合には細胞を周期変化させる上で活性化に起因する。（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｂ
．、Ｘ．Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅｉｃｋ、およびＣ．Ｂｒ
ｅｃｈｏｔ．１９９４年）。ヒトのサイクリンＡ遺伝子の構造および細胞サイク
ルで調節された転写は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１
巻：５４９０−５４９４頁で記述される。細胞サイクル進行の正および負のレギ
ュレーターに応答したＥ２Ｆ１発現の自動調節制御は、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ
．８巻：１５１４−１５２５頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．、Ｒ．Ｖ．Ｓｈｏ
ｈｅｔ、およびＢ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ １９９７年に記述される。酵母Ｃｄｃ６
ｐ発現に関連したヒトタンパク質は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９４巻：１４２−１４７頁；Ｙａｎ，Ｚ．、Ｊ．ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ、
Ｒ．Ｓｈｏｈｅｔ、Ｇ．Ｌｅｏｎｅ、Ｂ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉ
ｎｓ、およびＲ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９８年に記述される。Ｃｄｃ６は
、Ｅ２Ｆによって調節され、そして哺乳類細胞中でＤＮＡ複製に必須である。The endothelin-1 enhancer, an endothelial cell-specific regulatory region located between 320 and 364 bp upstream of the transcription start site of the mouse endothelin-1 gene,
Bu and Quartermouse (J. Biol. Che.
m. 272: 32613-32622 (1997)). Three copies of this enhancer sequence have been shown to activate both the ET-1 promoter and the heterologous promoter. Gene expression driven by the cell cycle-specific promoters cyclin A, E2F1, or cdc6 is regulated in a cell cycle-dependent manner, and this regulation is essentially at the transcriptional level. The promoters of these genes share a common E
It contains a 2F site, which results from suppression in the resting G0 (zero) phase and, in some cases, activation in cycling cells. (Henglein, B
. , X. Chenivesse, J. et al. Wang, D .; Eick, and C.I. Br
echot. 1994). The structure and cell cycle regulated transcription of the human cyclin A gene is described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91
Volume: 5490-5494. Autoregulatory control of E2F1 expression in response to positive and negative regulators of cell cycle progression is described in Genes & Dev
. 8: 1514-1525; Williams, R .; S. , R.A. V. Sho
het, and B.H. Stillman 1997. Yeast Cdc6
Human proteins related to p expression are described in Proc. Natl. Acad. Sci.
ScL USA 94: 142-147; J. DeGregori,
R. Shohet, G .; Leone, B.A. Stillman, J.A. R. Nevi
ns, and R.S. S. Williams, 1998. Cdc6 is regulated by E2F and is essential for DNA replication in mammalian cells.

【０１０６】 Ｂ．合成の遺伝的要素 ある種の具体例では、一部または全ての遺伝的要素は、合成でありえて、合成
オリゴヌクレオチドに由来することができ、そしてそれゆえ自然の遺伝配列から
直接的には得られない。これらの合成要素は、多くの異なる発現ベクターに使用
するのに適切である。 ＲＮＡスプライシングが正確でそして有効であることを確実にするスプライス
部位を有する合成イントロンが設計される。ｍＲＮＡ３’末端形成およびｍＲＮ
Ａ安定性を促進する合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルが設計される。合成５
’ＵＴＲは、翻訳の開始を促進するように設計される。典型的な合成要素の設計
は、以下にさらに詳細に記述される。B. Synthetic Genetic Elements In certain embodiments, some or all of the genetic elements can be synthetic, can be derived from synthetic oligonucleotides, and are therefore directly obtained from the natural genetic sequence. I can't. These synthetic elements are suitable for use in many different expression vectors. Synthetic introns are designed with splice sites to ensure that RNA splicing is accurate and effective. mRNA 3 'end formation and mRN
A synthetic 3'UTR / poly (A) signal is designed that promotes A stability. Synthetic 5
The 'UTR is designed to facilitate translation initiation. The design of a typical composite element is described in further detail below.

【０１０７】 合成要素の特性の要約 典型的な合成５’ＵＴＲ、イントロン、および３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナ
ルは、以下に示される一般的特性を示す： ５’ＵＴＲ 短い 二次構造の欠如 コザック配列 イントロン挿入のための部位 イントロン ５’スプライス部位配列は、共通に適合する。 ５’スプライス部位配列は、Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端に正確に相補性である
。 分岐点配列は、共通に適合する。 分岐点配列は、Ｕ２ｓｎＲＮＡに相補性である。 ３’スプライス部位は、共通に適合する。 ポリピリミジン束は、長さ１６塩基であり、そして７個の逐次Ｔを含む。（束
は、少なくとも５個の逐次Ｔを含むのが好ましい。） 内部制限酵素部位を含む。 ＢｂｓＩは５’ｓｓで切断し、ＥａｒＩは３’ｓｓで切断する。 ３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ） ウサギのβ−グロブリン３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルに基づく。 タンデムに２個のポリ（Ａ）シグナルから構成される。Summary of Properties of Synthetic Elements Typical synthetic 5′UTRs, introns, and 3′UTR / poly (A) signals exhibit the following general properties: 5′UTR short Lack of secondary structure Kozak Sequence Site for Intron Insertion The intron 5 'splice site sequences are commonly matched. The 5 'splice site sequence is exactly complementary to the 5' end of the U1 snRNA. The bifurcation arrangements fit in common. The branch point sequence is complementary to the U2 snRNA. The 3 'splice sites are commonly matched. The polypyrimidine bundle is 16 bases in length and contains 7 consecutive T's. (Preferably, the bundle contains at least 5 sequential T's.) It contains internal restriction enzyme sites. BbsI cuts at 5'ss, EarI cuts at 3'ss. 3′UTR / poly (A) Based on rabbit β-globulin 3′UTR / poly (A) signal. It is composed of two poly (A) signals in tandem.

【０１０８】 合成５’ＵＴＲ（ＵＴ６）の特性 ５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡの翻訳効率に影響を
及ぼし、したがって、真核生物の遺伝子発現の重要な決定因子である。治療目的
の遺伝子を発現するベクターによってコードされたｍＲＮＡの翻訳効率を最大限
にする合成５’ＵＴＲ配列（ＵＴ６）が設計された。 合成５’ＵＴＲ（ＵＴ６）の配列は、以下に示される。コザック配列は、太字
であり、そしてスタートコドンは、二重下線が付けられる。イントロンの位置（
残基４８と４９の間）は、三角形で示され、そして共通スプライス部位のエキソ
ン部位を形成する配列は、一重下線が付けられる。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏ
Ｉについての制限部位は、上線が付けられている。HindIII ▽ NcoI AAGCTTACTCAACACAATAACAAACTTACTTACAATCTTAATTAACAGGCCACCATGG ｃａｐ部位およびスタートコドンの間に配置された５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ
）は、ｍＲＮＡ翻訳の効率に影響することが知られている。開始因子に対する５
’ｃａｐ構造の接近可能性、４３Ｓ前開始複合体の結合とそれに続く移動、また
は開始コドンの認識に影響する任意の特性は、ｍＲＮＡ翻訳能力に影響する。効
果的な５’ＵＴＲは、長さが中程度であり、二次構造を欠き、上流開始コドンを
欠き、そして最適な位置の状況内でＡＵＧを有するものであることが予想される
（Ｋｏｚａｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６巻：８１５−８２１頁（１９９４年）
；Ｊａｎｓｅｎら、１９９４年）。これらの特徴を示す５’ＵＴＲは、５’ｃａ
ｐ構造の効果的な認識、続いてリボソームによる高速で妨害されないリボソーム
走査を可能にし、それにより翻訳開始プロセスを促進するに違いない。 合成５’ＵＴＲの配列は、長さ中程度（５４ヌクレオチド（ｎｔｓ））であり
、Ｇが欠乏しているが、ＣおよびＡ残基が豊富であり、上流ＡＴＧを欠き、最適
なコザック配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）の状況内に意図されるＡＴＧを置き、そ
して潜在的二次構造を欠くように設計された。合成５’ＵＴＲ配列は、また、ｍ
ＲＮＡを標的にするＡＵ豊富な配列を欠いて、細胞質で迅速に分解されるように
設計された。Properties of Synthetic 5 ′ UTR (UT6) The 5 ′ untranslated region (5 ′ UTR) affects the translation efficiency of messenger RNA.
And thus are important determinants of eukaryotic gene expression. The purpose of treatment
Maximizes translation efficiency of mRNA encoded by vectors expressing different genes
A synthetic 5'UTR sequence (UT6) was designed. The sequence of the synthetic 5'UTR (UT6) is shown below. Kozak layout is bold
And the start codon is double underlined. Intron location (
Residues 48 and 49) are shown as triangles and the exo of the common splice site
The sequences that form the binding sites are single underlined. HindIII and Nco
Restriction sites for I are overlined.HindIII ▽NcoI  AAGCTTACTCAACACAATAACAAACTTACTTACAATCTTAATTAACAGGCCACCATGThe 5 'untranslated region (5' UTR) located between the G cap site and the start codon
) Is known to affect the efficiency of mRNA translation. 5 for the initiation factor
'Cap structure accessibility, 43S pre-initiation complex binding and subsequent migration,
Any property that affects the recognition of the initiation codon affects the ability to translate mRNA. Effect
The consequent 5'UTR is medium in length, lacks secondary structure, and has an upstream initiation codon.
Missing, and expected to have AUG in optimal location context
(Kozak, Biochimie 76: 815-821 (1994)).
Jansen et al., 1994). The 5 'UTR exhibiting these characteristics is the 5' ca
Efficient recognition of p-structure, followed by fast, unhindered ribosomes by ribosomes
It must allow scanning, thereby expediting the translation initiation process. The sequence of the synthetic 5'UTR is medium in length (54 nucleotides (nts)).
, Lacking G but rich in C and A residues, lacking upstream ATG, optimal
Place the intended ATG within the context of a unique Kozak sequence (CCACCCATGG) and
And was designed to lack potential secondary structure. The synthetic 5'UTR sequence also
Lack of AU-rich sequences that target RNA so that it is rapidly degraded in the cytoplasm
Designed.

【０１０９】 実験は、イントロンが、ｃＤＮＡベクターからの遺伝子発現を増加すること、
そして５’ＵＴＲに配置されるイントロンが、３’ＵＴＲに配置されるものより
いっそう有効であることを例示した（ＨｕａｎｇおよびＧｏｒｍａｎ、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０巻：１８０５−１８１０頁（１９９０年）；Ｅｖａ
ｎｓおよびＳｃａｒｐｕｌｌａ、Ｇｅｎｅ ８４巻：１３５−１４２頁（１９８
９年）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５巻：８３６−８４０頁（１９８８年）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：４７８−４８２頁（１９９１年
）；Ｃｈｏｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １１巻：３０７０−３０７４
頁（１９９１年））。したがって、合成５’ＵＴＲ配列は、共通スプライス部位
配列をイントロンに合わせるように設計された。例えば、イントロンは、残基４
８と４９の間に配置されうる（以下のイントロン配列構造を参照）。位置４６−
４８にあるＣＡＧは、共通５’スプライス部位のエキソン部分である。位置４９
にあるＧは、共通３’スプライス部位のエキソン部分である。 クローニング操作を促進するために、合成５’ＵＴＲ配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ
部位で始まり、そしてＮｃｏＩ部位で終止するように設計された。Experiments have shown that introns increase gene expression from cDNA vectors,
And it has been shown that introns located in the 5′UTR are more effective than those located in the 3′UTR (Huang and Gorman, Mol.
Cell. Biol. 10: 1805-1810 (1990); Eva
ns and Scarpula, Gene 84: 135-142 (198
9)); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. ScL USA 88: 478-482 (1991); Choi et al., Mol. Cell. Biol. Volume 11: 3070-3074
P. (1991)). Therefore, the synthetic 5'UTR sequence was designed to match the consensus splice site sequence to the intron. For example, the intron is at residue 4
8 and 49 (see intron sequence structure below). Position 46-
The CAG at 48 is the exon part of the common 5 'splice site. Position 49
G is the exon part of the common 3 'splice site. To facilitate the cloning operation, the synthetic 5'UTR sequence was
It was designed to start at the site and end at the NcoI site.

【０１１０】 合成イントロンの特性 ＲＮＡスプライシングは、ほとんどの真核生物の遺伝子の発現に必要とされる
。最適な遺伝子発現については、ＲＮＡスプライシングは、非常に高効率でそし
て正確でなければならない。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂと称される合成イントロンは、最
大限に効率的でそして正確であるように設計された。 典型的な合成イントロン、ＯＰＴＩＶＳ８の構造は、以下に示される。５’ス
プライス部位（５’ｓｓ）、分岐点（ｂｐ）、および３‘’スプライス部位（３
’ｓｓ）についての配列は、二重下線が付されている。制限酵素ＢｂｓＩおよび
ＥａｒＩについての認識配列は、上線が付されている。ＢｂｓＩについての切断
部位は、５’ｓｓに対応し、そしてＥａｒＩについての切断部位は、３’ｓｓに
対応する。 5'ss bp 3'ss | BbsI | EarI | 5'CAG GTAAGTGTCTTC---(77)---TACTAACGGTTCTTTTTTTCTCTTCACAG G 3' ５’スプライス部位（５’ｓｓ）配列は、樹立された共通配列、ＭＡＧ↓ＧＴ
ＲＡＧＴ（ここで、Ｍ＝ＣまたはＡ、およびＲ＝ＧまたはＡである）に適合する
。スプライシングの機構は、前ｍＲＮＡおよびＵ１ｓｎＲＮＡの５’ｓｓの間の
相互作用に関与し、そしてＯＰＴＩＶＳ８Ｂの５’ｓｓ配列は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ
の５’末端に正確に相補性であるように選択された。 5'ss 5' CAGGUAAGU 3' ||||||||| U1 RNA 3' GUCCAUUCA 5' 哺乳類では、分岐点についての共通配列（ＹＮＹＴＲＡＹ、ここでＹ＝Ｃまた
はＴ，Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝任意の塩基、そして下線付きＡ残基は、実際の分岐
点である）は、非常にあいまいである。スプライシングの機構が、前ｍＲＮＡの
分岐点（ｂｐ）とＵ２ｓｎＲＮＡの間の相互作用に関与するので、ＯＰＴＩＶＳ
８Ｂの分岐点配列は、この相互作用を最大限にするために選択された。（分岐点
自身が膨れ上がることに注目されたい。）。選択配列も、酵母での前ｍＲＮＡス
プライシングについて必須であることが知られている分岐点配列に適合する。分
岐点は、特に、３’スプライス部位の１８−３８ヌクレオチド（ｎｔｓ）上流に
配置される。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂで、分岐点は、３’スプライス部位から２４ｎｔ
ｓ上流に配置される。 BP 5' UACUAAC 3' ||||| | U2 RNA 3' AUGAU G 5' ３’スプライス部位（３’ｓｓ）の配列は、樹立した共通配列、Ｙ11ＮＹＡＧ
↓Ｇ（ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ、およびＮ＝任意の塩基である）に適合する。３
’スプライス部位では、ポリピリミジン束（Ｙ11）は、スプライス部位強度の主
要な決定因子である。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂでの最適なスプライス部位機能について
は、ポリピリミジン束の長さは、１６塩基に延長され、そしてその配列は、７個
の逐次Ｔ残基を含むように調節された。この特性は、最適なスプライシングが、
ポリピリミジン束で少なくとも５個の逐次Ｔ残基の存在を必要とするために含ま
れる。Properties of Synthetic Introns RNA splicing is required for the expression of most eukaryotic genes. For optimal gene expression, RNA splicing must be very efficient and accurate. The synthetic intron, designated OPTIVS8B, was designed to be as efficient and accurate as possible. The structure of a typical synthetic intron, OPTIVS8, is shown below. A 5 'splice site (5'ss), a branch point (bp), and a 3 "splice site (3
The sequence for 'ss) is double underlined. The recognition sequences for the restriction enzymes BbsI and EarI are underlined. The cleavage site for BbsI corresponds to 5'ss and the cleavage site for EarI corresponds to 3'ss. 5'ss bp 3'ss | BbsI | EarI | 5'CAG GTAAGTGTCTTC --- (77) --- TACTAACGGTTCTTTTTTTCTCTTCACAG G 3 'The 5' splice site (5'ss) sequence is an established common sequence, MAG ↓ GT
Conforms to RAGT, where M = C or A, and R = G or A. The mechanism of splicing involves the interaction between the pre-mRNA and the 5'ss of U1snRNA, and the 5'ss sequence of OPTIVS8B
Was selected to be exactly complementary to the 5 'end of In 5'ss 5 'CAGGUAAGU 3' ||||||||| U1 RNA 3 'GUCCAUUCA 5' mammals, consensus sequence (YNYTR A Y for the branch point, where Y = C or T, R = A or G, N = any base and the underlined A residue is the actual branch point) is very ambiguous. Since the splicing mechanism is involved in the interaction between the pre-mRNA branch point (bp) and the U2 snRNA, OPTIVS
The branch point sequence of 8B was chosen to maximize this interaction. (Note that the junction itself swells.) The selection sequence also matches a branch point sequence known to be essential for pre-mRNA splicing in yeast. The branch point is particularly located 18-38 nucleotides (nts) upstream of the 3 'splice site. In OPTIVS8B, the branch point is 24 nt from the 3 'splice site
s upstream. BP 5 'UACUA A C 3' ||||| | U2 RNA 3 'AUGAU G 5' 3 ' sequence of the splice site (3'SS) is the established consensus sequence, Y 11 NYAG
↓ G (where Y = C or T, and N = any base). 3
At the 'splice site, the polypyrimidine bundle (Y 11 ) is the major determinant of splice site strength. For optimal splice site function in OPTIVS8B, the length of the polypyrimidine bundle was extended to 16 bases, and the sequence was adjusted to include seven consecutive T residues. This property allows optimal splicing
Included to require the presence of at least 5 consecutive T residues in the polypyrimidine bundle.

【０１１１】 インビトロでのスプライシングは、一般的に、イントロンが長さ＞８０ｎｔｓ
である場合最適である（Ｗｉｅｒｉｎｇａら、１９８４年；Ｕｌｆｅｎｄａｈｌ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３巻：６２９９−６３１５頁（１９８
５年））。多くのイントロンが、長さ数千の塩基でありうるが、ほとんどの自然
に生じるイントロンは、長さ９０−２００ｎｔである（Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６巻：９８９３−９９０８頁（１９８８年））。
合成イントロンの長さ（１１８ｎｔｓ）は、この後者の範囲内に入る。 ３個の内部制限酵素部位、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩおよびＥａｒＩを有するＯＰＴ
ＩＶＳ８Ｂが、設計された。これらの制限部位は、合成イントロン配列を含む遺
伝子のスクリーニングおよび同定を促進する。加えて、ＢｂｓＩおよびＥａｒＩ
部位が、それらの切断部位は、５’ｓｓ（ＢｂｓＩ）または３’ｓｓ（ＥａｒＩ
）に正確に対応するように配置された。ＥａｒＩ制限部位を供給するポリピリミ
ジン束の配列が、特に設計された。これらの配置でのＢｂｓＩおよびＥａｒＩ部
位の封入は、それらが、イントロンを、遺伝子から正確に欠失させるので有用で
ある。それらは、遺伝子内の他の配置に挿入されえた「イントロン・カセット」
の生成をも可能にする。 ＢｂｓＩ部位と分岐点配列との間の７７個の塩基は、ＮｈｅＩ制限部位を封入
する以外は配列中では任意である。In vitro splicing generally requires that introns be> 80 nts in length.
Is optimal (Wieringa et al., 1984; Ulfendahl
Et al., Nucl. Acids Res. 13: 6299-6315 (198
5 years)). Although many introns can be thousands of bases in length, most naturally occurring introns are 90-200 nt in length (Hawkins, Nuc
l. Acids Res. 16: 9893-9908 (1988)).
The length of the synthetic intron (118 nts) falls within this latter range. OPT with three internal restriction sites, BbsI, NheI and EarI
IVS8B was designed. These restriction sites facilitate screening and identification of genes containing synthetic intron sequences. In addition, BbsI and EarI
Sites, their cleavage sites were 5'ss (BbsI) or 3'ss (EarI
) Was arranged to correspond exactly. The sequence of the polypyrimidine bundle supplying the EarI restriction site has been specifically designed. The inclusion of BbsI and EarI sites in these configurations is useful because they precisely delete the intron from the gene. They are "intron cassettes" that can be inserted into other locations in the gene.
Also enables the generation of The 77 bases between the BbsI site and the branch point sequence are optional in the sequence except for enclosing a NheI restriction site.

【０１１２】 （合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルの特性） 真核生物のｍＲＮＡの３’末端は、ポリアデニル化の過程によって形成される
。この過程は、部位特異的部位ＲＮＡ切断、続いてポリ（Ａ）尾部を添加するこ
とに関与する。ポリ（Ａ）尾部を欠くＲＮＡは、非常に不安定である。したがっ
て、切断／ポリアデニル化の効率は、ｍＲＮＡレベル、そしてそれにより、遺伝
子発現レベルの主要な決定因子である。２ＸＰＡ１は、合成配列であり、２個の
有効なポリ（Ａ）シグナルを含み、ポリアデニル化で最大限に有効であるように
設計されている。 ポリ（Ａ）シグナルは、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡの３’末端の形成に必
要とされる。シグナルは、２つのＲＮＡプロセシング反応：ＲＮＡ転写産物の部
位特異的エンドヌクレオチド切断、および、ポリ（Ａ）尾部形成のために、新た
に産生された３’末端へのアデニレート（およそ２５０）の段階添加を指示する
。ポリ（Ａ）シグナルは、３つの部分：ヘキサヌクレオチド、切断部位、および
下流要素を有する。ヘキサヌクレオチドは、典型的には、ＡＡＵＡＡＡであり、
そして切断部位は、最も頻繁にはジヌクレオチドＣＡに対応する３’側である（
Ｓｈｅｅｔｓら、１９８７年）。下流要素は、最適なポリ（Ａ）シグナル機能に
必要とされ、そして切断部位の下流に配置される。下流要素についての配列必要
性は、まだ十分に樹立されていないが、一般に、ＵＧ−またはＵ−豊富な配列と
して見られる（Ｗｉｃｋｅｎｓ、１９９０年；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、
６４巻：６７１−６７４頁、１９９１年；Ｗａｈｌｅ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１
４巻：１１３−１１８頁、１９９２年；ＣｈｅｎおよびＮｏｒｄｓｔｒｏｍ、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻：２５６５−２５７２頁、１９９２年）Properties of Synthetic 3 ′ UTR / Poly (A) Signal The 3 ′ end of eukaryotic mRNA is formed by the process of polyadenylation. This process involves site-specific site RNA cleavage followed by the addition of a poly (A) tail. RNA lacking a poly (A) tail is very unstable. Thus, the efficiency of cleavage / polyadenylation is a major determinant of mRNA levels, and thereby gene expression levels. 2XPA1 is a synthetic sequence, contains two efficient poly (A) signals, and is designed to be maximally effective in polyadenylation. The poly (A) signal is required for the formation of the 3 'end of most eukaryotic mRNAs. The signal is a stepwise addition of adenylate (approximately 250) to the newly generated 3 'end for two RNA processing reactions: site-specific endonucleolytic cleavage of the RNA transcript, and poly (A) tail formation. Instruct. The poly (A) signal has three parts: a hexanucleotide, a cleavage site, and a downstream element. The hexanucleotide is typically AAUAAAA,
And the cleavage site is most often 3 'corresponding to dinucleotide CA (
Sheets et al., 1987). Downstream elements are required for optimal poly (A) signal function and are located downstream of the cleavage site. Sequence needs for downstream elements are not yet well established, but are commonly found as UG- or U-rich sequences (Wickens, 1990; Proudfoot, Cell,
64: 671-674, 1991; Wahl, Bioessays, 1
4: 113-118, 1992; Chen and Nordstrom, N.
ucl. Acids Res. 20: 2565-2572, 1992)

【０１１３】 自然に生じるポリ（Ａ）シグナルは、それらの効率は非常に多様である（Ｐｅ
ｔｅｒｓｏｎ、１９９２年）。特定のポリ（Ａ）シグナルの効果は、下流要素の
品質によって主に決定される（Ｗａｈｌｅ、１９９２年）。治療目的の遺伝子を
発現するように設計された発現ベクターで、可能な限り効率的であるポリ（Ａ）
シグナルを有することが重要である。 ポリ（Ａ）効率は、切断およびポリアデニル化されそこなった転写産物は、核
画分で迅速に分解されるので、遺伝子発現に重要である。実際に、非ポリアデニ
ル化ＲＮＡが、非常に不安定であるので、生きた細胞でのポリアデニル化の効率
は、測定するのが困難である。ｍＲＮＡ安定性について必要とされるべきである
のに加えて、ポリ（Ａ）尾部は、ｍＲＮＡの翻訳能力に寄与し、そしてスプライ
シングまたはＲＮＡ輸送のような他のＲＮＡプロセシング反応に影響しうる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎおよびＳｔａｎｄａｒｔ、Ｃｅｌｌ、６２巻：１５−２４頁、１９
９０年；Ｗａｈｌｅ、１９９２年）。 ある種の真核生物の遺伝子は、１つ以上のポリ（Ａ）部位を有し、それにより
切断／ポリアデニル化反応が、最初の部位で生じることに失敗すると、後半部位
の内の１つで生じることが暗示される。ＣＯＳ細胞形質導入実験で、２個の強力
なポリ（Ａ）部位を有する遺伝子は、単独の強力なポリ（Ａ）部位を有するもの
よりおよそ２倍多くのｍＲＮＡを生じた（Ｂｏｒｄｏｎａｒｏ、１９９５年）。
これらのデータは、転写産物の際立った画分が、単独の「効率的な」ポリ（Ａ）
シグナルを有する場合でさえ未プロセス化のままであることを示唆する。したが
って、１つ以上のポリ（Ａ）部位を含むことが望ましい可能性がある。The naturally occurring poly (A) signals are very diverse in their efficiency (Pe
terson, 1992). The effect of a particular poly (A) signal is mainly determined by the quality of downstream elements (Wahle, 1992). The most efficient poly (A) expression vector designed to express therapeutic genes
It is important to have a signal. Poly (A) efficiency is important for gene expression because truncated and polyadenylated transcripts are rapidly degraded in the nuclear fraction. In fact, the efficiency of polyadenylation in living cells is difficult to measure because non-polyadenylated RNA is very unstable. In addition to being required for mRNA stability, poly (A) tails contribute to the translational ability of mRNA and may influence other RNA processing reactions such as splicing or RNA transport (J
ackson and Standard, Cell, 62: 15-24, 19
1990; Wahl, 1992). Certain eukaryotic genes have one or more poly (A) sites, so that if the cleavage / polyadenylation reaction fails to occur at the first site, one of the later sites It is implied that it will happen. In COS cell transduction experiments, genes with two strong poly (A) sites yielded approximately twice as many mRNAs as those with a single strong poly (A) site (Bordonaro, 1995). .
These data indicate that a distinct fraction of the transcripts is a single "efficient" poly (A)
It suggests that it remains unprocessed even with a signal. Thus, it may be desirable to include one or more poly (A) sites.

【０１１４】 典型的な合成ポリ（Ａ）シグナルの配列は、下に示される。配列は、２ＸＰＡ
と名付けられる。ヘキサヌクレオチド配列および下流要素配列は、二重下線を付
けられ、そして２つのポリ（Ａ）部位は、ｐＡ番号１およびｐＡ番号２として標
識される。具合のよい制限部位は、上線が付けられている。全体の２ＸＰＡ単位
は、ＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片としてクローニング実験で移行されうる。内部のＢ
ｓｐＨＩ断片の欠失が、１ＸＰＡ単位の形成を生じる。The sequence of a typical synthetic poly (A) signal is shown below. The sequence is 2XPA
It is named. The hexanucleotide sequence and the downstream element sequence are double underlined, and the two poly (A) sites are labeled as pA # 1 and pA # 2. Good restriction sites are overlined. The entire 2XPA unit can be transferred in a cloning experiment as an XbaI-KpnI fragment. B inside
Deletion of the spHI fragment results in the formation of 1XPA units.

【０１１５】XbaI BspHI TCTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGAC G pA#1 Hex | Downstream element TCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCAC T BspHI CGGTACTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATC T pA#2 Hex | Downstream element GACGTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTC T KpnI CACTCGGTACC[0115] XbaI BspHI TCTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGAC G pA # 1 Hex | Downstream element TCTGGCT AATAAA GGAAATTTATTTTCATTGCAATA GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT CTCTCAC T BspHI CGGTACTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATC T pA # 2 Hex | Downstream element GACGTCTGGCT AATAAA GGAAATTTATTTTCATTGCAATA GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT CTC T KpnI CACTCGGTACC

【０１１６】 上に示される合成ポリ（Ａ）部位の配列は、ウサギのβ−グロビンポリ（Ａ）
シグナルの配列、強力であると文献で特徴づけられたシグナルに基づいている（
ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、４９巻：３９９−４０６頁、１９
８７年：ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：４７３−
４７４頁、１９８４年）。この主要な特性の内の１つは、その下流要素の構造で
あり、そしてそれは、ＵＧ−およびＵ−豊富ドメインを含む。 １ＸＰＡ配列に対応する二本鎖ＤＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドから構
築された。その後、１ＸＰＡ配列の２つのコピーが、結合して２ＸＰＡ配列を形
成した。その配列は、第１のポリ（Ａ）シグナル含有断片の５’末端に特徴的な
ＸｂａＩ部位を有し、第二のポリ（Ａ）シグナル含有断片の３’末端に特徴的な
ＫｐｎＩ部位を有するように結合された。The sequence of the synthetic poly (A) site shown above is from rabbit β-globin poly (A)
The sequence of the signal is based on the signal characterized in the literature as being strong (
Gil and Proudfoot, Cell, 49: 399-406, 19
1987: Gil and Proudfoot, Nature, 312: 473.
474, 1984). One of the key properties is the structure of its downstream element, which contains UG- and U-rich domains. A double-stranded DNA sequence corresponding to the 1XPA sequence was constructed from synthetic oligonucleotides. Thereafter, the two copies of the 1XPA sequence joined to form a 2XPA sequence. The sequence has a characteristic XbaI site at the 5 'end of the first poly (A) signal containing fragment and a characteristic KpnI site at the 3' end of the second poly (A) signal containing fragment. And so on.

【０１１７】 Ｃ．コーディング配列 数種の天然のヒト抗血管形成コーディング配列のヌクレオチド配列が知られて
おり、そして以下に、抗血管形成剤もコードする合成配列とともに提供される。 ある場合には、目的の抗血管形成剤をコードする天然の配列の代わりに、抗血
管形成剤をコードする合成配列を利用することは有効である。このような合成配
列は、天然配列とは異なるコドンを利用し、それゆえ、天然の配列とは劇的に異
なるヌクレオチド配列を有している。特に、ヒトでの発現のために少なくとも部
分的に最適化されたコドン用法を示す合成配列が使用されうる。天然配列は、こ
のような最適なコドン用法を示さない。好ましくは、実質的に全てのコドンが最
適化される。 ヒトにおける最適なコドン用法は、図１６に示すように、高発現されるヒト遺
伝子におけるコドン使用頻度によって示される。コドン用法チャート図は、ウイ
スコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループの、ウイ
スコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ、バージョン８．１から得ら
れるプログラム「Ｈｕｍａｎ＿Ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」から得られる。高度に発現さ
れたヒト遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンは、ヒト宿主細胞における発現に
ついての最適なコドンであることが推定され、それゆえ、合成コーディング配列
を構築する根拠となる。合成抗血管形成コーディング配列の例は、以下の表で底
部の配列として示される。C. Coding Sequences The nucleotide sequences of several natural human anti-angiogenic coding sequences are known, and are provided below with synthetic sequences that also encode anti-angiogenic agents. In some cases, it may be advantageous to utilize a synthetic sequence encoding an anti-angiogenic agent instead of the native sequence encoding the anti-angiogenic agent of interest. Such synthetic sequences utilize codons that differ from the native sequence and, therefore, have nucleotide sequences that differ dramatically from the native sequence. In particular, synthetic sequences can be used that exhibit codon usage that is at least partially optimized for human expression. Native sequences do not show such optimal codon usage. Preferably, substantially all codons are optimized. Optimal codon usage in humans is indicated by codon usage in highly expressed human genes, as shown in FIG. The codon usage chart is obtained from the program "Human_High.cod" obtained from the Genetics Computer Group of Madison, Wisconsin, version 8.1 of the Wisconsin Sequence Analysis Package. The most frequently used codons in highly expressed human genes are presumed to be the optimal codons for expression in human host cells, and are therefore the basis for constructing a synthetic coding sequence. Examples of synthetic anti-angiogenic coding sequences are shown in the table below as the bottom sequence.

【０１１８】 しかし、十分に最適化されたコドン用法を示す配列を使用するよりも、同じア
ミノ酸が、あまり一緒に密着するか、または豊富であるので適切に一様なコドン
用法を行うことができない領域以外で最適化したコドン用法を備える配列を使用
することが好ましい。 さらに、実質的にコドン用法が最適化された実質的部分を備える合成配列を使
用できる。例えば、天然のコーディング配列と比較して、少なくとも５０％、７
０％、８０％または９０％の最適化コドンを有する合成配列を使用できる。他の
特定の合成配列は、図１６中のコドン用法チャート図を参照して選択できる。配
列は、ポリペプチド配列のアミノ酸の各々についてのコドンを選択することによ
って選定される。その後、ポリペプチドの各々に対応するＤＮＡ分子は、通常の
化学的合成方法によって構築されうる。例えば、短いオリゴヌクレオチドが合成
され、そしてその後、適切な関係で連結されて、全長のコーディング配列を構築
する。 当業者は、最適化コドン用法を用いた種々の核酸配列を構築できることを認識
するであろう。 ヒトＩＰ−１０、エンドスタチンおよびアンギオスタチンについての好ましい
コドン用法は、以下に規定される。However, rather than using sequences exhibiting well-optimized codon usage, the same amino acids are too closely cohesive or abundant to provide adequately uniform codon usage. It is preferred to use sequences with codon usage optimized outside the region. In addition, synthetic sequences can be used that have substantial portions with substantially optimized codon usage. For example, at least 50%, 7%, as compared to the native coding sequence.
Synthetic sequences with 0%, 80% or 90% optimized codons can be used. Other specific synthetic sequences can be selected with reference to the codon usage chart diagram in FIG. The sequence is selected by choosing a codon for each of the amino acids in the polypeptide sequence. Thereafter, DNA molecules corresponding to each of the polypeptides can be constructed by conventional chemical synthesis methods. For example, short oligonucleotides are synthesized and then ligated in the appropriate relationship to construct a full-length coding sequence. One skilled in the art will recognize that a variety of nucleic acid sequences can be constructed using optimized codon usage. Preferred codon usage for human IP-10, endostatin and angiostatin are defined below.

【０１１９】 ヒトＩＰ−１０についての好ましいコドン配列 1 aagcttacca tgaaccagac cgccatcctg atctgctgcc tgatcttcct gaccctgagc 61 ggcatccagg gcgtgcccct gagccgcacc gtgcgctgca cctgcatcag catcagcaac 121 cagcccgtga acccccgcag cctggagaag ctggagatca tccccgccag ccagttctgc 181 ccccgcgtgg agatcatcgc caccatgaag aagaagggcg agaagcgctg cctgaacccc 241 gagagcaagg ccatcaagaa cctgctgaag gccgtgagca aggagatgag caagcgcagc 301 ccgggcggag gtggcagcgg cggaggtggc agcggcggag gtggcagcgg atcctctaga[0119] Preferred codon sequences for human IP-10 1 aagcttacca tgaaccagac cgccatcctg atctgctgcc tgatcttcct gaccctgagc 61 ggcatccagg gcgtgcccct gagccgcacc gtgcgctgca cctgcatcag catcagcaac 121 cagcccgtga acccccgcag cctggagaag ctggagatca tccccgccag ccagttctgc 181 ccccgcgtgg agatcatcgc caccatgaag aagaagggcg agaagcgctg cctgaacccc 241 gagagcaagg ccatcaagaa cctgctgaag gccgtgagca aggagatgag caagcgcagc 301 ccgggcggag gtggcagcgg cggaggtggc agcggcggag gtggcagcgg atcctctaga

【０１２０】 ヒトエンドスタチンについての好ましいコドン配列 1 CACAGCCACC GCGACTTCCA GCCCGTGCTG CACCTGGTGG CCCTGAACAG 51 CCCCCTGAGC GGCGGCATGC GCGGCATCCG CGGCGCCGAC TTCCAGTGCT 101 TCCAGCAGGC CCGCGCCGTG GGCCTGGCCG GCACCTTCCG CGCCTTCCTG 151 AGCAGCCGCC TGCAGGACCT GTACAGCATC GTGCGCCGCG CCGACCGCGC 201 CGCCGTGCCC ATCGTGAACC TGAAGGACGA GCTGCTGTTC CCCAGCTGGG 251 AGGCCCTGTT CAGCGGCAGC GAGGGCCCCC TGAAGCCCGG CGCCCGCATC 301 TTCAGCTTCG ACGGCAAGGA CGTGCTGCGC CACCCCACCT GGCCCCAGAA 351 GAGCGTGTGG CACGGCAGCG ACCCCAACGG CCGCCGCCTG ACCGAGAGCT 401 ACTGCGAGAC CTGGCGCACC GAGGCCCCCA GCGCCACCGG CCAGGCCAGC 451 AGCCTGCTGG GCGGCCGCCT GCTGGGCCAG AGCGCCGCCA GCTGCCACCA 501 CGCCTACATC GTGCTGTGCA TCGAGAACAG CTTCATGACC GCCAGCAAGT 551 GA[0120] Preferred codon sequences for human endostatin 1 CACAGCCACC GCGACTTCCA GCCCGTGCTG CACCTGGTGG CCCTGAACAG 51 CCCCCTGAGC GGCGGCATGC GCGGCATCCG CGGCGCCGAC TTCCAGTGCT 101 TCCAGCAGGC CCGCGCCGTG GGCCTGGCCG GCACCTTCCG CGCCTTCCTG 151 AGCAGCCGCC TGCAGGACCT GTACAGCATC GTGCGCCGCG CCGACCGCGC 201 CGCCGTGCCC ATCGTGAACC TGAAGGACGA GCTGCTGTTC CCCAGCTGGG 251 AGGCCCTGTT CAGCGGCAGC GAGGGCCCCC TGAAGCCCGG CGCCCGCATC 301 TTCAGCTTCG ACGGCAAGGA CGTGCTGCGC CACCCCACCT GGCCCCAGAA 351 GAGCGTGTGG CACGGCAGCG ACCCCAACGG CCGCCGCCTG ACCGAGAGCT 401 ACTGCGAGAC CTGGCGCACC GAGGCCCCCA GCGCCACCGG CCAGGCCAGC 451 AGCCTGCTGG GCGGCCGCCT GCTGGGCCAG AGCGCCGCCA GCTGCCACCA 501 CGCCTACATC GTGCTGTGCA TCGAGAACAG CTTCATGACC GCCAGCAAGT 551 GA

【０１２１】 ヒトアンギオスタチンについての好ましいコドン配列 1 ATGGAGCACA AGGAGGTGGT GCTGCTGCTG CTGCTGTTCC TGAAGAGCGG 51 CCAGGGCGAG CCCCTGGACG ACTACGTGAA CACCCAGGGC GCCAGCCTGT 101 TCAGCGTGAC CAAGAAGCAG CTGGGCGCCG GCAGCATCGA GGAGTGCGCC 151 GCCAAGTGCG AGGAGGACGA GGAGTTCACC TGCCGCGCCT TCCAGTACCA 201 CAGCAAGGAG CAGCAGTGCG TGATCATGGC CGAGAACCGC AAGAGCAGCA 251 TCATCATCCG CATGCGCGAC GTGGTGCTGT TCGAGAAGAA GGTGTACCTG 301 AGCGAGTGCA AGACCGGCAA CGGCAAGAAC TACCGCGGCA CCATGAGCAA 351 GACCAAGAAC GGCATCACCT GCCAGAAGTG GAGCAGCACC AGCCCCCACC 401 GCCCCCGCTT CAGCCCCGCC ACCCACCCCA GCGAGGGCCT GGAGGAGAAC 451 TACTGCCGCA ACCCCGACAA CGACCCCCAG GGCCCCTGGT GCTACACCAC 501 CGACCCCGAG AAGCGCTACG ACTACTGCGA CATCCTGGAG TGCGAGGAGG 551 AGTGCATGCA CTGCAGCGGC GAGAACTACG ACGGCAAGAT CAGCAAGACC 601 ATGAGCGGCC TGGAGTGCCA GGCCTGGGAC AGCCAGAGCC CCCACGCCCA 651 CGGCTACATC CCCAGCAAGT TCCCCAACAA GAACCTGAAG AAGAACTACT 701 GCCGCAACCC CGACCGCGAG CTGCGCCCCT GGTGCTTCAC CACCGACCCC 751 AACAAGCGCT GGGAGCTGTG CGACATCCCC CGCTGCACCA CCCCCCCCCC 801 CAGCAGCGGC CCCACCTACC AGTGCCTGAA GGGCACCGGC GAGAACTACC 851 GCGGCAACGT GGCCGTGACC GTGAGCGGCC ACACCTGCCA GCACTGGAGC 901 GCCCAGACCC CCCACACCCA CAACCGCACC CCCGAGAACT TCCCCTGCAA 951 GAACCTGGAC GAGAACTACT GCCGCAACCC CGACGGCAAG CGCGCCCCCT 1001 GGTGCCACAC CACCAACAGC CAGGTGCGCT GGGAGTACTG CAAGATCCCC 1051 AGCTGCGACA GCAGCCCCGT GAGCACCGAG CAGCTGGCCC CCACCGCCCC 1101 CCCCGAGCTG ACCCCCGTGG TGCAGGACTG CTACCACGGC GACGGCCAGA 1151 GCTACCGCGG CACCAGCAGC ACCACCACCA CCGGCAAGAA GTGCCAGAGC 1201 TGGAGCAGCA TGACCCCCCA CCGCCACCAG AAGACCCCCG AGAACTACCC 1251 CAACGCCGGC CTGACCATGA ACTACTGCCG CAACCCCGAC GCCGACAAGG 1301 GCCCCTGGTG CTTCACCACC GACCCCAGCG TGCGCTGGGA GTACTGCAAC 1351 CTGAAGAAGT GC[0121] Preferred codon sequences for human angiostatin 1 ATGGAGCACA AGGAGGTGGT GCTGCTGCTG CTGCTGTTCC TGAAGAGCGG 51 CCAGGGCGAG CCCCTGGACG ACTACGTGAA CACCCAGGGC GCCAGCCTGT 101 TCAGCGTGAC CAAGAAGCAG CTGGGCGCCG GCAGCATCGA GGAGTGCGCC 151 GCCAAGTGCG AGGAGGACGA GGAGTTCACC TGCCGCGCCT TCCAGTACCA 201 CAGCAAGGAG CAGCAGTGCG TGATCATGGC CGAGAACCGC AAGAGCAGCA 251 TCATCATCCG CATGCGCGAC GTGGTGCTGT TCGAGAAGAA GGTGTACCTG 301 AGCGAGTGCA AGACCGGCAA CGGCAAGAAC TACCGCGGCA CCATGAGCAA 351 GACCAAGAAC GGCATCACCT GCCAGAAGTG GAGCAGCACC AGCCCCCACC 401 GCCCCCGCTT CAGCCCCGCC ACCCACCCCA GCGAGGGCCT GGAGGAGAAC 451 TACTGCCGCA ACCCCGACAA CGACCCCCAG GGCCCCTGGT GCTACACCAC 501 CGACCCCGAG AAGCGCTACG ACTACTGCGA CATCCTGGAG TGCGAGGAGG 551 AGTGCATGCA CTGCAGCGGC GAGAACTACG ACGGCAAGAT CAGCAAGACC 601 ATGAGCGGCC TGGAGTGCCA GGCCTGGGAC AGCCAGAGCC CCCACGCCCA 651 CGGCTACATC CCCAGCAAGT TCCCCAACAA GAACCTGAAG AAGAACTACT 701 GCCGCAACCC CGACCGCGAG CTGCGCCCCT GGTGCTTCAC CACCGACCCC 751 AACAAGCGCT GGGAGCTGTG CGACATCCCC CGCTGCACCA CCCCCCCCCC 801 CAGCAGCGGC CCCACCTACC AGTGCCTGAA GGGCACCGGC GAGAACTACC 851 GCGGCAACGT GGCCGTGACC GTGAGCGGCC ACACCTGCCA GCACTGGAGC 901 GCCCAGACCC CCCACACCCA CAACCGCACC CCCGAGAACT TCCCCTGCAA 951 GAACCTGGAC GAGAACTACT GCCGCAACCC CGACGGCAAG CGCGCCCCCT 1001 GGTGCCACAC CACCAACAGC CAGGTGCGCT GGGAGTACTG CAAGATCCCC 1051 AGCTGCGACA GCAGCCCCGT GAGCACCGAG CAGCTGGCCC CCACCGCCCC 1101 CCCCGAGCTG ACCCCCGTGG TGCAGGACTG CTACCACGGC GACGGCCAGA 1151 GCTACCGCGG CACCAGCAGC ACCACCACCA CCGGCAAGAA GTGCCAGAGC 1201 TGGAGCAGCA TGACCCCCCA CCGCCACCAG AAGACCCCCG AGAACTACCC 1251 CAACGCCGGC CTGACCATGA ACTACTGCCG CAACCCCGAC GCCGACAAGG 1301 GCCCCTGGTG CTTCACCACC GACCCCAGCG TGCGCTGGGA GTACTGCAAC 1351 CTGAAGAAGT GC

【０１２２】 本発明のプラスミドによってコードされうる種々の抗血管形成因子の例が、以
下に記述される。別の例は、１９９８年１月２１に公表されたＭｉｘｓｏｎの欧
州特許公報ＥＰ０８１９ ７５８ Ａ２に記述され、あらゆる図面を含めて全体
に参照してここに組込まれる。 １．エンドスタチンおよびアンギオスタチン： エンドスタチンは、拡大しつつある血管形成阻害剤のタンパク質ファミリーの
一員である。それは、コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ＫＤａのＣ末端断片（１８４
ａ．ａ．）であり、そしてインビトロで内皮細胞増殖を、生体内で血管形成を選
択的に阻害する（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、８８巻、２７７−
２８５頁、１９９７年）。アンギオスタチンは、成熟プラスミノーゲン（３８Ｋ
ｄａおよび３６２ａ．ａ．）の内部タンパク質分解断片である（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌ
ｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、７９巻、３１５−３２８頁、１９９４年）。それは
、クリングル・ドメインとして知られる４つの三重ループジスルフィド結合構造
を含む。３つのクリングル・ドメイン形態が、いっそう強力であることが示され
た（Ｃａｏ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２９４６１−７頁
、１９９６年）。前臨床研究において、Ｅ．ｃｏｌｉで発現したｒエンドスタチ
ンまたはアンギオスタチンは、高い用量（１５−１６日間の１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ
）で注入されて、腫瘍成長有効性の９７％阻害を達成した。アンギオスタチンは
、血中で２日の半減期を示すことが主張されている。Examples of various anti-angiogenic factors that can be encoded by the plasmids of the present invention are described below. Another example is described in Mixson's European Patent Publication EP 0819 758 A2, published January 21, 1998, which is hereby incorporated by reference in its entirety, including any drawings. 1. Endostatin and Angiostatin: Endostatin is a member of the growing protein family of angiogenesis inhibitors. It is a 20 KDa C-terminal fragment of collagen XVIII (184
a. a. ) And selectively inhibit endothelial cell proliferation in vitro and angiogenesis in vivo (O'Reilly, MS et al., Cell, 88, 277-).
285, 1997). Angiostatin is a mature plasminogen (38K
da and 362a. a. ) Is an internal proteolytic fragment (O'Reill)
y, M. S. Cell, 79, 315-328, 1994). It contains four triple loop disulfide bond structures known as kringle domains. Three kringle domain forms have been shown to be more potent (Cao, Y. et al., J. Biol. Chem., 271, 29461-7, 1996). In preclinical studies, r endostatin or angiostatin expressed in E. coli at higher doses (10 mg / kg / d for 15-16 days)
) To achieve a 97% inhibition of tumor growth efficacy. Angiostatin is claimed to exhibit a two-day half-life in blood.

【０１２３】 ２．腫瘍抑制遺伝子： ｐ５３およびその誘導抗血管形成タンパク質トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ
−１）：ｐ５３は、ヒト腫瘍の半分で突然変異されている。野生型ｐ５３は、ｐ
２１（サイクリン依存性の阻害剤）およびｐＲＢ（別の腫瘍抑制剤）を介するこ
とによって細胞サイクルを調節する。さらに、ｐ５３は、ジスルフィド結合によ
って結合された３つの同一の１８０ｋｄサブユニットから構成される大型三量体
糖タンパク質である抗血管形成因子ＴＳＰ−１の合成を誘導する。ＴＳＰ−１遺
伝子の１０１３−１６５０によってコードされるＴＳＰ−１の断片であるＴＳＰ
ｆは、いっそう強力な抗血管形成活性を示す。陽イオンリポソームに複合された
α−アクチン駆動ｐ５３遺伝子の全身的静脈投与は、ヌードマウスにおける悪性
のヒト胸部癌の成長および転移を減少することが分かった（Ｌｅｓｏｏｎ−Ｗｏ
ｏｄら、ＰＮＡＳ、３６巻：４２１頁、１９９５年）。その一次標的は、腫瘍の
血管構造系であると考えられる。ＴＳＰｆと組合わせたｐ５３が、マウスの腫瘍
モデルにおける遺伝子治療において、ｐ５３単独より効果的に腫瘍を減少させる
ことが示された。ｐＲＢ、ｐ２１、ｐ１６および細胞サイクル依存性キナーゼの
他の阻害剤は、内皮の細胞増殖を阻害して、それにより生体内で血管形成を遮断
することも示される。バン・ヒッペル・リンダウ遺伝子（ＶＨＬ）突然変異は、
腎臓癌で最も特徴とされる。ＶＨＬの突然変異（Ｍｕｔｉｏｎ）は、ＶＥＧＦの
高い発現と非常に血管形成性を導く。野生型ＶＨＬ遺伝子の送達は、ＶＥＧＦの
発現を減少させ、そして血管形成を遮断する。[0124] 2. Tumor suppressor gene: p53 and its induced anti-angiogenic protein thrombospondin-1 (TSP
-1): p53 is mutated in half of human tumors. Wild-type p53 is p
Regulates the cell cycle by way of 21 (a cyclin-dependent inhibitor) and pRB (another tumor suppressor). In addition, p53 induces the synthesis of the anti-angiogenic factor TSP-1, a large trimeric glycoprotein composed of three identical 180 kd subunits linked by disulfide bonds. TSP, a fragment of TSP-1 encoded by 1013-1650 of the TSP-1 gene
f shows more potent anti-angiogenic activity. Systemic intravenous administration of the α-actin-driven p53 gene complexed to cationic liposomes was found to reduce the growth and metastasis of malignant human breast cancer in nude mice (Lesoon-Wo).
Od et al., PNAS, 36: 421, 1995). The primary target is thought to be the vasculature of the tumor. P53 in combination with TSPf has been shown to reduce tumors more efficiently than p53 alone in gene therapy in a mouse tumor model. It has also been shown that pRB, p21, p16 and other inhibitors of cell cycle-dependent kinases inhibit endothelial cell proliferation, thereby blocking angiogenesis in vivo. The Van Hippel Lindau gene (VHL) mutation
Most characterized in kidney cancer. VHL mutations (Mution) leads to high expression and highly angiogenic resistant VEGF. Delivery of the wild-type VHL gene reduces VEGF expression and blocks angiogenesis.

【０１２４】 ３．インテグリンαｖβ３遮断 インテグリンαｖβ３は、血管形成性血管の表面に機能的に関連する。インテ
グリンαｖβ３についてのＲＧＤ含有ペプチド・リガンドは、腫瘍を負うマウス
に静脈で注射されたときに腫瘍に戻ることができる。このリガンドは、最近、マ
ウスモデルにおける癌治療において、化学療法剤が腫瘍血管構造を標的とするの
に使用された（Ａｒａｐ，Ｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９巻：３７７頁、１９９
８年）。切断されたＭＭＰ−２（ＰＥＸ）によるインテグリンαｖβ３とマトリ
ックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）との間の相互関係の崩壊は、血管
形成を遮断することが示された。[0124] 3. Integrin αvβ3 blockade Integrin αvβ3 is functionally associated with the surface of angiogenic blood vessels. The RGD-containing peptide ligand for integrin αvβ3 can return to tumors when injected intravenously into mice bearing the tumor. This ligand was recently used in cancer treatment in a mouse model to target chemotherapeutic agents to tumor vasculature (Arap, W et al., Science, 279: 377, 199).
8 years). Disruption of the interaction between integrin αvβ3 and matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) by truncated MMP-2 (PEX) has been shown to block angiogenesis.

【０１２５】 ４．血管形成因子受容体遮断： ＶＥＧＦ（ｆｌｔおよびｆｌｋ）についての、およびｂＦＧＦ（ｂＦＧＦ受容
体およびｂＦＧＦ結合タンパク質）についての受容体は、成長因子の血管形成シ
グナル発生を調節する。血管形成因子に対する抗体を中和することは、血管形成
および腫瘍の成長を遮断しえた。選択的に、可溶性受容体は、成長因子の結合に
おいて野生型受容体と競合して、それにより血管形成を遮断できる。 ５．サイトカインおよびキモカイン： ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのようなサイトカイン、およびＩＰ−１０のよう
なキモカインは、それらの免疫調節効果に加えて、血管形成の強力な阻害剤であ
ることが示された。 ６．血栓症因子（血液凝固の刺激剤）： 組織因子（ＴＦ）は、トロンボゲン形成のカスケードについての主要な開始受
容体である。切断されたＴＦ（ｔＴＦ）は、二重特異性抗体によって腫瘍血管構
造の標的とされ、そしてマウスにおける腫瘍梗塞を引き起した（Ｈｕａｎｇ，Ｘ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻：５４７頁、１９９７年）。[0125] 4. Angiogenic factor receptor blockade: The receptors for VEGF (flt and flk) and for bFGF (bFGF receptor and bFGF binding protein) regulate growth factor angiogenic signaling. Neutralizing antibodies to angiogenic factors could block angiogenesis and tumor growth. Alternatively, the soluble receptor can compete with the wild-type receptor for growth factor binding, thereby blocking angiogenesis. 5. Cytokines and chemokines: Cytokines such as IL-12 and IFN-α and chemokines such as IP-10 have been shown to be potent inhibitors of angiogenesis in addition to their immunomodulatory effects. 6. Thrombosis factors (stimulators of blood clotting): Tissue factor (TF) is the major initiating receptor for the cascade of thrombogenesis. Truncated TF (tTF) is targeted by the bispecific antibody to tumor vasculature and caused tumor infarction in mice (Huang, X
. Et al., Science, 275: 547, 1997).

【０１２６】 Ｄ．処方 多くの処方における核酸の送達および発現は、ヌクレアーゼのような生物の成
分による核酸の分解により限定される。したがって、インビボで送達されるとき
の核酸の保護は、生じる発現をおおいに増強し、それにより所望の製薬学上また
は治療上の効果が増強される。溶液中で核酸（例えば、ＤＮＡ）と相互作用する
が、しかし核酸を凝縮しないある種の型の化合物は、核酸にインビボでの保護を
提供し、そしてそれに応じてコード化された遺伝子産物の発現を増強することが
分かった。 プラスミドと相互作用し、および迅速な細胞外ヌクレアーゼ分解からプラスミ
ドを保護するように設計された送達システムの使用が記述された［Ｍｕｍｐｅｒ
，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． １３巻：７０１−７０９頁、１９９６年
；Ｍｕｍｐｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９７年。遺伝子療法に対する提起］。ＰＩＮ
Ｃシステムの特徴は、それらが、プラスミドに柔軟性を維持させ、そしてヌクレ
アーゼ分解から保護されながら筋肉を通して自由に拡散させる非凝縮システムで
あることである。ＰＩＮＣシステムが、以下に最初に検討されるが、カチオン性
脂質に基づいたシステムおよびＰＩＮＣＳとカチオン性脂質の両方を利用するシ
ステムが、本発明の範囲内でもあることが理解されるであろう。D. Formulations Delivery and expression of nucleic acids in many formulations is limited by the degradation of nucleic acids by biological components such as nucleases. Thus, protection of the nucleic acid when delivered in vivo greatly enhances the resulting expression, thereby enhancing the desired pharmaceutical or therapeutic effect. Certain types of compounds that interact with a nucleic acid (eg, DNA) in solution, but do not condense the nucleic acid, provide protection of the nucleic acid in vivo and the expression of the encoded gene product accordingly. Was found to enhance. The use of a delivery system designed to interact with the plasmid and protect the plasmid from rapid extracellular nuclease degradation has been described [Mumper
, R .; J. Et al., Pharm. Res. 13: 701-709, 1996; Mumper, R.M. J. Et al., 1997. Proposal for gene therapy]. PIN
A feature of the C systems is that they are non-condensing systems that allow the plasmid to remain flexible and diffuse freely through muscle while being protected from nuclease degradation. Although the PINC system is first discussed below, it will be understood that systems based on cationic lipids and systems utilizing both PINCS and cationic lipids are also within the scope of the present invention.

【０１２７】 ＰＩＮＣシステムの共通の構造的成分は、それらが、親水性および疎水性部分
の両方を有する両親媒性分子であることである。ＰＩＮＣの親水性部分は、水素
結合（水素結合アクセプターまたは供与群を介して）、ファンデルワールス相互
作用、および／またはイオン性相互作用によってプラスミドと相互作用すること
が意味される。例えば、ＰＶＰおよびＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）
は、水素結合アクセプターである一方で、ＰＶＡおよびＰＧは、水素結合供与体
である。 ４つ全ての分子は、種々の（ポリ）アニオン性分子と複合体を形成することが
報告された［Ｂｕｈｌｅｒ Ｖ．、ＢＡＳＦアクチエンゲゼルシャフト・ファイ
ンケミア、ルドウィグシャフェン、３９−４２頁；Ｇａｌａｅｖ Ｙら、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍ．Ａ． ６８４巻：４５−５４頁（１９９４年）；Ｔａｒａｎｔｉｎｏ
Ｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ． ８３巻：１２１３−１２１６頁（１９９４
年）；Ｚｉａ，Ｈ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ８巻：５０２−５０４頁（１９
９１年）；］。ＰＩＮＣシステムの疎水性部分は、プラスミドをコーティングを
形成して、その表面をいっそう疎水性にさせるように設計される。Ｋａｂａｎｏ
ｖらは、先に、プラスミドの疎水性を増加させ、プラスミドをヌクレアーゼ分解
から保護し、そして生物学的膜に対するその親和性を増加させるように設計され
たプラスミド凝縮のためのカチオン性ポリビニル誘導体の使用を記述した［Ｋａ
ｂａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．およびＫａｂａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈ
ｅｍ． ６巻：７−２０頁、１９９５年；Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．ら、Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３１巻：１４３７−１４４３頁、１９９１年；Ｙａｒｏｓｌ
ａｖｏｖ，Ａ．Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８４巻：１７７−１８０
頁、１９９６年］。A common structural component of the PINC system is that they are amphiphilic molecules that have both hydrophilic and hydrophobic moieties. The hydrophilic portion of PINC is meant to interact with the plasmid by hydrogen bonding (via a hydrogen bond acceptor or donor group), Van der Waals interactions, and / or ionic interactions. For example, PVP and N-methyl-2-pyrrolidone (NM2P)
Is a hydrogen bond acceptor, while PVA and PG are hydrogen bond donors. All four molecules have been reported to form complexes with various (poly) anionic molecules [Buhler V. et al. , BASF Actiengezelshaft Fine Chemia, Ludwigshafen, pp. 39-42; Galaev Y et al. C
rom. A. 684: 45-54 (1994); Tarantino.
R et al. Pharm. Sci. 83: 1213-1216 (1994)
Year); Zia, H .; Et al., Pharm. Res. 8: 502-504 (19
1991);]. The hydrophobic part of the PINC system is designed to form a coating on the plasmid, making its surface more hydrophobic. Kabano
have previously described cationic polyvinyl derivatives for plasmid condensation designed to increase the hydrophobicity of the plasmid, protect the plasmid from nuclease degradation, and increase its affinity for biological membranes. Described use [Ka
Banov, A .; V. And Kabanov, V .; A. , Bioconj. Ch
em. 6: 7-20, 1995; Kabanov, V .; A. Et al., Bio
Polymers 31: 1437-1443, 1991; Yarosl.
avov, A .; A. FEBS Letters 384: 177-180
, 1996].

【０１２８】 実質的保護効果が観察される；ラットの筋肉における遺伝子発現の少なくとも
１までの対数の増強が、生理食塩水で処方されるプラスミドに関してこれらの典
型的なＰＩＮＣシステムで示された。ＰＩＮＣシステムと複合したプラスミドを
用いた筋肉内でのレポーター遺伝子の発現は、プラスミドが生理食塩水中で処方
された場合より、いっそう再現性がよかった。例えば、生理食塩水中で処方され
たプラスミドを用いて筋肉内でのレポーター遺伝子発現についての変動の係数は
、９６±３５％（ｎ＝２０例；８−１２筋肉／例）であったのに対して、ＰＩＮ
Ｃシステムで複合されたプラスミドとの変動の係数は、４０±１９％（ｎ＝３０
例；８−１２筋肉／例）であった。生理食塩水中で処方されたプラスミドを用い
たレポーター遺伝子発現についての変動の係数が高いのは、先に記述された［Ｄ
ａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：１５１−９頁、
１９９３年］。さらに、ＤＮＡ：生理食塩水についての結果と対照的に、異なる
形態を示すプラスミドが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と複合した場合にお
いて、筋肉内での遺伝子発現で有為な差異はなかった。これは、ＰＶＰが全ての
形態のプラスミドを、高速ヌクレアーゼ分解から保護できることを示唆する。A substantial protective effect is observed; log enhancement of gene expression in rat muscle by at least one was demonstrated with these typical PINC systems for saline formulated plasmids. Expression of the reporter gene in muscle using the plasmid complexed with the PINC system was more reproducible than when the plasmid was formulated in saline. For example, the coefficient of variation for reporter gene expression in muscle using plasmid formulated in saline was 96 ± 35% (n = 20 cases; 8-12 muscles / example). And PIN
The coefficient of variation with the plasmid complexed with the C system was 40 ± 19% (n = 30
Example: 8-12 muscles / example). The high coefficient of variation for reporter gene expression using plasmids formulated in saline was described previously [D
avis, H .; L. Hum. Gene Ther. 4: 151-9,
1993]. Furthermore, in contrast to the results for DNA: saline, there was no significant difference in gene expression in muscle when plasmids showing different morphologies were conjugated with polyvinylpyrrolidone (PVP). This suggests that PVP can protect all forms of plasmid from fast nuclease degradation.

【０１２９】 １．ＰＩＮＣ高分子（ＰＶＰ）とプラスミドとの間の相互作用の要約 分子モデリングを用いて、典型的なＰＩＮＣ高分子であるＰＶＰは、プラスミ
ドの塩基対とその主たる溝内で水素結合を形成し、そしてＰＶＰのビニル骨格に
よりプラスミド上に疎水性表面を生じることが示された。これらの相互作用は、
複合プラスミドへの臭化エチジウム挿入の阻害によるのと同様に、ＰＶＰによる
プラスミド・ゼータ電位の調節によって支持される。ＰＶＰとプラスミドとの間
の見かけの結合は、ｐＨと塩濃度に相関し、そしてプラスミド／ＰＶＰ複合体の
筋肉内注射後のβ−ｇａｌ発現においてこれらのパラメーターの効果が例示され
た（Ｍｕｍｐｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９７年。遺伝子療法に対する提起）。プラ
スミド／ＰＶＰ複合体の物理化学的特性の要約は、下の表Ｉに列記される。[0129] 1. Summary of the Interaction between PINC Macromolecules (PVP) and Plasmids Using molecular modeling, a typical PINC macromolecule, PVP, forms hydrogen bonds within plasmid base pairs and its major groove, and The vinyl backbone of PVP was shown to create a hydrophobic surface on the plasmid. These interactions are
Supported by the regulation of plasmid zeta potential by PVP, as well as by inhibition of ethidium bromide insertion into the composite plasmid. The apparent binding between PVP and the plasmid correlated with pH and salt concentration, and exemplified the effect of these parameters on β-gal expression following intramuscular injection of the plasmid / PVP complex (Mumper, R. J. et al., 1997. Proposal for gene therapy). A summary of the physicochemical properties of the plasmid / PVP complex is listed in Table I below.

【０１３０】[0130]

【表１】 表Ｉ：プラスミド／ＰＶＰ複合体の物理化学的特性の要約方法 結果 分子モデリング 水素結合および疎水性プラスミド表面が観察された フーリエ変換赤外 水素結合が示された ＤＮエースＩ検証 ＰＶＰの存在下でプラスミド分解の速度が減じられる 微量滴定熱量測定 吸熱プロセスを示す正の熱の反応 電位差滴定 プラスミドおよびＰＶＰが複合化されるとき、１単位ｐＨ
低下 動的透析 ＰＶＰの拡散の速度がプラスミドの存在下で減少した ゼータ電位調節 ＰＶＰによってプラスミドの表面荷電が減少した 臭化エチジウム挿入 プラスミド／ＰＶＰ複合化によって臭化エチジウム挿入が
減少した 浸透圧 超浸透処方（すなわち、３４０ｍｏｓｍ／ｋｇＨ2Ｏ） 蛍光分光計 プラスミド／ＰＶＰ結合が、塩中で、および／またはｐＨ
７で減少したTable I: Summary of physicochemical properties of plasmid / PVP complexMethod result  Molecular modeling Hydrogen bonds and hydrophobic plasmid surface observed Fourier transform infrared Hydrogen bonds shown DN ace I validation Reduced rate of plasmid degradation in the presence of PVP Microtitration calorimetry Positive heat indicating endothermic process Potentiometric titration When plasmid and PVP are complexed, 1 unit pH
Decrease Dynamic dialysis Reduced rate of PVP diffusion in the presence of plasmid Zeta potential regulation Reduced surface charge of plasmid by PVP Ethidium bromide insertion Ethidium bromide insertion by plasmid / PVP complexation
Reduced osmotic pressure hyperosmotic formulation (ie, 340 mosm / kg HTwoO) Fluorescence spectroscopy Plasmid / PVP binding in salt and / or pH
Decreased by 7

【０１３１】 ２．筋肉内での発現の組織学 スライド走査技術を用いたβ−ｇａｌについての免疫組織化学は、ラットの脛骨
筋の全断面にわたってβ−ｇａｌ発現部位の一様な分布を示した。非常に局在化
した領域が、ＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドが生理食塩水中で処方されたときに
、β−ｇａｌに関して陽性に染色された。β−ｇａｌ陽性細胞は、プラスミドが
生理食塩水中で注射されるときには、針管の周囲にもっぱら観察された。これは
、先に公表された結果と一致している［Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７巻：１４６５−６８頁、１９９０年；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：１５１−９頁、１９９３年；Ｄａｖｉｓ，Ｈ
．Ｌ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：７３３−４０頁、１９９３年
］。 対照的に、β−ｇａｌについての免疫反応性は、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＣ
ＭＶ−β−ｇａｌプラスミド／ＰＶＰ複合体（１：１７ｗ／ｗ）の筋肉内注射の
後、筋肉組織の広範な領域で観察された。陽性筋肉繊維の大半は、筋肉束のエッ
ジに配置されるらしかった。したがって、ラットの筋肉中のβ−ｇａｌについて
の染色は、プラスミド／ＰＶＰ複合体を使用すると、β−ｇａｌについて陽性に
染色された筋肉繊維の数が、生理食塩水処方を使用して見られたよりおよそ８倍
多いことを示した。陽性に染色された筋肉繊維は、プラスミド／ＰＶＰ複合体を
使用した筋肉組織中においてより非常の多くの領域にわたって観察されもし、そ
れにより注射されたプラスミドが、筋肉内注射後、広範に分散された証拠を供し
た。[0131] 2. Histology of Intramuscular Expression Immunohistochemistry for β-gal using the slide scanning technique showed a uniform distribution of β-gal expression sites across all sections of the rat tibialis muscle. A highly localized region stained positive for β-gal when the CMV-β-gal plasmid was formulated in saline. β-gal positive cells were observed exclusively around the needle tube when the plasmid was injected in saline. This is in agreement with previously published results [Wolff, J. et al. A. Et al., Sciencec
e 247: 1465-68, 1990; Davis, H. et al. L. Hu
m. Gene Ther. 4: 151-9, 1993; Davis, H.
. L. Hum. Gene Ther. 4: 733-40, 1993]. In contrast, the immunoreactivity for β-gal was determined by C in 150 mM NaCl.
Following intramuscular injection of the MV-β-gal plasmid / PVP complex (1:17 w / w), it was observed in a large area of muscle tissue. The majority of the positive muscle fibers appeared to be located at the edges of the muscle bundle. Thus, staining for β-gal in rat muscle was greater when using the plasmid / PVP complex than when the number of muscle fibers stained positive for β-gal was seen using the saline formulation. About eight times more. Positively stained muscle fibers could also be observed over much more area in muscle tissue using the plasmid / PVP complex, whereby the injected plasmid was widely dispersed after intramuscular injection Provided evidence.

【０１３２】 ラットの骨格筋での増強されたプラスミド分布および発現は、複合化による細
胞外ヌクレアーゼ分解からの保護、およびプラスミド／ＰＶＰ複合体の高浸透圧
効果の両方の結果であった。しかし、ＤｏｗｔｙおよびＷｏｌｆｆらは、生理学
的浸透圧の２倍までの浸透圧が、筋肉内での遺伝子発現に明らかには影響しない
ことを示した［Ｄｏｗｔｙ，Ｍ．Ｅ．およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．遺伝子療法：
直接的遺伝子移行の方法および用途、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ（編）、１９９４年。
ビルクハウザー、ボストン、８２−９８頁］。これは、ＰＶＰ複合化によってプ
ラスミドの発現が増強されるのは、もっともヌクレアーゼ保護によるようであり
、そして浸透圧効果によることは少ないことを示唆する。さらに、ＰＶＰによる
プラスミドの表面修飾（例えば、疎水性が増加し、そして負の表面荷電が減少す
ること）は、筋肉細胞によるプラスミドの取込をも促進しうる。The enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle was the result of both protection from extracellular nuclease degradation by conjugation and the hyperosmolar effect of the plasmid / PVP complex. However, Dowty and Wolfff et al. Have shown that osmotic pressures up to twice physiological osmotic pressure have no apparent effect on gene expression in muscle [Dowty, M .; E. FIG. And Wolff, J .; A. Gene therapy:
Methods and uses for direct gene transfer; A. Wolff (eds.), 1994.
Birkhauser, Boston, pp. 82-98]. This suggests that PVP conjugation enhances plasmid expression most likely due to nuclease protection and is less likely due to osmotic effects. In addition, surface modification of the plasmid with PVP (eg, increased hydrophobicity and reduced negative surface charge) may also facilitate uptake of the plasmid by muscle cells.

【０１３３】 ３．ＰＩＮＣ高分子の構造−活性の関係 一連のビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体の構造と、ラットの筋肉内で
の遺伝子発現のレベルとの間に線状の関係がある。ある種のビニルピロリドンモ
ノマーをＰＶＰ中の酢酸ビニルに置換することが、プラスミドとの水素結合を形
成する能力の減少した共重合体を生じた。相互作用が減少して、順次、筋肉内注
射後にラット筋肉内での遺伝子発現のレベルを減少させた。共重合体中のビニル
ピロリドンモノマー（ＶＰＭ）含量範囲が減少するのに伴い、β−ｇａｌの発現
が、線状に（Ｒ＝０．９７）減少した。 ｐＨおよび粘性が全ての複合体において等価であったので、上記データは、こ
れらの数値が、筋肉細胞へのプラスミドの送達に影響する最も重要なパラメータ
ーではないことを示す。これらのデータは、プラスミドへのＰＩＮＣ高分子の結
合が増加して、筋肉内のプラスミドの保護および生物的利用性が増加することを
示唆する。[0133] 3.Structure-activity relationship of PINC polymer  Structure of a series of vinylpyrrolidone and vinyl acetate copolymers
There is a linear relationship between the level of gene expression and Certain types of vinylpyrrolidone
Replacing the nomer with vinyl acetate in PVP creates a hydrogen bond with the plasmid.
This resulted in a copolymer with reduced ability to form. Interactions decrease, intramuscular injection sequentially
After firing, the level of gene expression in rat muscle was reduced. Vinyl in copolymer
Β-gal expression with decreasing pyrrolidone monomer (VPM) content range
Decreased linearly (R = 0.97). Since the pH and viscosity were equivalent for all complexes, the above data
These are the most important parameters that affect the delivery of plasmid to muscle cells
It is not. These data indicate that the PINC macromolecule was bound to the plasmid.
Increase the protection and bioavailability of the plasmid in muscle.
Suggest.

【０１３４】 ４．別のＰＩＮＣシステム 上に記述される構造−活性の関係は、プラスミドとの相互作用を増強もするで
あろう新規共重合体を設計するのに使用できる。増強されたＰＩＮＣシステムの
結合親和が、ヌクレアーゼ分解からのプラスミドのいっそう集約的な保護により
、結果として、それらの筋肉内注射後に遺伝子発現のさらなる増強を生じるよう
な、「機会を有する相互に作用するウィンドウ」（ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖ
ｅ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）があることが予想される。
プラスミドの凝縮の発生、または「三重鎖」型形成−これらはいずれもが、筋肉
における生物的利用性を低下させ、そして、結果的に遺伝子発現を減少させる−
のいずれをも超えたところに最適な相互作用があることが予想される。 上に示されるとおり、ＰＩＮＣ化合物は、一般に、疎水性部分と親水性部分と
の両方を有する両親媒性化合物である。多くの場合に、親水性部分は、極性基に
よって提供される。そのような極性基は、それに限定されないが、ピロリドン、
アルコール、アセテート、アミン、またはピロール、ピラゾール、イミダゾール
、トリアゾール、ジチオール、オキサゾール、（イソ）チアゾール、オキサジア
ゾール、オキサトリアゾール、ジアオキサゾール、オキサチオール、ピロン、ジ
オキシン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、（イソ
）オキサジン、インドール、インダゾール、カルパゾール、およびプリンおよび
これらの基の誘導体を含めた、化学および物理学のＣＲＣハンドブック（７２版
）、編集者Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｌｉｄｅの２−７３頁および２−７４頁に示される
もののような複素環式基のような基によって提供されうることは当業界で認識さ
れており、参照してここに組込まれる。[0134] 4.Another PINC system  The structure-activity relationship described above also enhances interaction with the plasmid.
It can be used to design new copolymers that may be. Of the enhanced PINC system
Binding affinity is due to more intensive protection of the plasmid from nuclease degradation
, Resulting in further enhancement of gene expression after their intramuscular injection
"Interactive window with opportunity" (an interactive)
It is expected that there will be an e window of opportunity.
Occurrence of plasmid condensation, or “triple-stranded” type formation—both of which are muscle
Reduces bioavailability and, consequently, reduces gene expression in
It is expected that there is an optimal interaction beyond any of the above. As indicated above, PINC compounds generally comprise a hydrophobic moiety and a hydrophilic moiety.
Is an amphiphilic compound having both. In many cases, the hydrophilic moiety is attached to a polar group
Provided by: Such polar groups include, but are not limited to, pyrrolidone,
Alcohol, acetate, amine or pyrrole, pyrazole, imidazole
, Triazole, dithiol, oxazole, (iso) thiazole, oxadia
Sol, oxatriazole, dioxazole, oxathiol, pyrone, di
Oxine, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, piperazine, (iso
) Oxazine, indole, indazole, carpazole, and purine and
CRC Handbook on Chemistry and Physics (72nd edition, including derivatives of these groups)
), Editor David R. Shown on pages 2-73 and 2-74 of Lide
It is recognized in the art that it can be provided by a group such as a heterocyclic group.
And incorporated herein by reference.

【０１３５】 化合物は、また、疎水性基を含み、高分子の場合には、典型的には分子の骨格
に含まれるが、しかし非重合性分子の部分でもありうる疎水性基も含有する。こ
のような疎水性骨格基の例としては、しかしこれらに限定されるものではないが
、ビニル、エチル、アクリレート、アクリルアミド、エステル、セルロース、ア
ミド、ヒドライド、エーテル、カルボネート、ホスファゼン、スルホン、プロピ
レン、およびこれらの基の誘導体が挙げられる。種々の基の極性上の特徴は、例
えば、任意の入門の有機化学の教科書における極性についての考察によって例示
されるとおり当業者にまったくよく知られている。 核酸と相互作用するこのような分子の能力は、当業者にも知られ、そしてその
ような分子間相互作用をモデル化するコンピュータ・プログラムの使用によって
予測されうる。選択的に、またはそのようなモデル化に加えて、有効な化合物は
、１）ヌクレアーゼの消化速度の阻害の決定、２）ＤＮＡのコーティングを示す
ＤＮＡのゼータ電位の改変、または３）ＤＮＡを挿入する臭化エチジウムのよう
な挿入剤の能力の阻害、のような１つまたはそれ以上の試験を使用して容易に同
定できる。The compounds also contain hydrophobic groups and, in the case of macromolecules, typically also contain hydrophobic groups that are included in the backbone of the molecule, but can also be part of a non-polymerizable molecule. Examples of such hydrophobic backbone groups include, but are not limited to, vinyl, ethyl, acrylate, acrylamide, ester, cellulose, amide, hydride, ether, carbonate, phosphazene, sulfone, propylene, and Derivatives of these groups are mentioned. The polar nature of the various groups is quite well known to those skilled in the art, for example, as exemplified by the consideration of polarity in any introductory organic chemistry textbook. The ability of such molecules to interact with nucleic acids is known to those of skill in the art, and can be predicted through the use of computer programs to model such intermolecular interactions. Alternatively or in addition to such modeling, useful compounds may be 1) determination of inhibition of nuclease digestion rate, 2) alteration of the zeta potential of the DNA indicative of coating of the DNA, or 3) insertion of the DNA One or more tests, such as inhibiting the ability of an intercalating agent, such as ethidium bromide, to be identified.

【０１３６】 ５．標的リガンド 核酸配列の送達および発現について上述された核酸／ＰＩＮＣ複合体に加えて
、特定の具体例では、特定の組織、細胞、または細胞の領域または区画での発現
を優先的に得るために、標的リガンドを提供するのも有用である。 このような標的ＰＩＮＣ複合体としては、プラスミド（または他の核酸分子）
に複合されたＰＩＮＣシステム（モノマーまたはポリマー性ＰＩＮＣ化合物）が
挙げられる。ＰＩＮＣシステムは、リガンドに親和性を示す受容体に結合する標
的リガンド（ＴＬ）に共有結合で、または非共有結合で付着（または結合）され
る。このような受容体は、細胞の表面に、または区画内にありうる。このような
ターゲッティングは、核酸の取込みまたは細胞内輸送の増強を提供する。 標的リガンドとしては、これらに限定されないが、ガラクトシル基、フコサル
基、マンノシル基、カルニチン誘導体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、ペプチドリガンド、およびＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。有用に標的
にされうる細胞の例は、これらに限定されないが、抗原提示細胞、肝細胞、ミオ
サイト、上皮細胞、内皮細胞、および癌細胞が挙げられる。[0136] 5.Target ligand  In addition to the nucleic acid / PINC complex described above for delivery and expression of nucleic acid sequences
In certain embodiments, expression in a particular tissue, cell, or region or compartment of a cell
It is also useful to provide a targeting ligand to preferentially obtain Such target PINC complexes include plasmids (or other nucleic acid molecules)
PINC system (monomeric or polymeric PINC compound)
No. The PINC system is a marker that binds to a receptor that has an affinity for the ligand.
Attached (or bound) covalently or non-covalently to a specific ligand (TL)
You. Such a receptor can be on the surface of a cell or within a compartment. like this
Targeting provides for enhanced uptake or intracellular transport of nucleic acids. Targeting ligands include, but are not limited to, galactosyl groups, fucosal
Group, mannosyl group, carnitine derivative, monoclonal antibody, polyclonal antibody
Body, peptide ligands, and DNA binding proteins. Useful target
Examples of cells that can be modified include, but are not limited to, antigen presenting cells, hepatocytes,
Sites, epithelial cells, endothelial cells, and cancer cells.

【０１３７】 このような標的複合体の形成は、ＰＩＮＣシステムに共有結合で付着された標
的リガンド（ＴＬ）の以下の例によって例示される： ＴＬ−ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＴＬ−ＰＩＮＣ::::::プラスミド このような標的化複合体の形成も、ＰＩＮＣシステムに非共有結合で付着した
標的リガンド（ＴＬ）の以下の例によって例示される： ＴＬ::::::ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＴＬ::::::ＰＩＮＣ::::::プラスミ
ド または、代替的に、 ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＰＩＮＣ::::::プラスミド＋ＴＬ→ ＴＬ::::
::ＰＩＮＣ::::::プラスミド これらの例で、::::::は、イオン性、水素結合、ファンデルワールス相互作用
、疎水性相互作用、またはこのような相互作用の組合せのような非共有結合の相
互作用である。 細胞障害剤についてのターゲッティング方法は、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８８５２号、国際公開番号ＷＯ９６／３９１
２４号で記述され、全ての図面を含め全体で参照してここに組込まれる。この出
願では、細胞障害材料のターゲッティングのための高分子親和性システムの使用
であって、ｚｉｐ高分子、すなわち相互作用する高分子の対を使用する２段階の
ターゲッティング方法を用いることが記載されている。相互作用高分子の１つに
付着した抗体は、細胞標的に結合する。その後、その高分子は、細胞障害剤に付
着した第二の高分子についての標的として作用する。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら
で参照されるとおり、毒性剤の送達のための他の二段階（または多段）システム
も、記述される。The formation of such a target complex is exemplified by the following example of a target ligand (TL) covalently attached to the PINC system: TL-PINC + plasmid → TL-PINC :::::: : Plasmids The formation of such targeting complexes is also exemplified by the following example of a target ligand (TL) non-covalently attached to the PINC system: TL :::::: PINC + plasmid → TL :: :::: PINC :::::: plasmid or alternatively, PINC + plasmid → PINC :::::: plasmid + TL → TL ::::
:: PINC :::::: Plasmid In these examples, :::::: may be an ionic, hydrogen bond, van der Waals interaction, hydrophobic interaction, or a combination of such interactions. Non-covalent interactions. Targeting methods for cytotoxic agents are described by Subramanian et al.
International application number PCT / US96 / 08852, International publication number WO96 / 391
No. 24, incorporated herein by reference in its entirety, including all drawings. In this application, the use of a polymer affinity system for targeting of cytotoxic materials is described using a two-step targeting method using a zip polymer, a pair of interacting polymers. I have. Antibodies attached to one of the interacting macromolecules bind to cellular targets. The polymer then acts as a target for a second polymer attached to the cytotoxic agent. Other two-stage (or multi-stage) systems for the delivery of toxic agents are also described, as referenced in Subramanian et al.

【０１３８】 別の態様では、核酸コーディング配列を、ＰＩＮＣシステムまたはＰＩＮＣ標
的リガンド複合体についての非天然の標的を使用する二段階標的アプローチ法を
使用して送達し、発現させることができる。したがって、例えば、ＰＩＮＣ−プ
ラスミド複合体は、細胞性標的（例えば、ＭＡＢ）に結合するリガンドにそれ自
身付着される結合対の構成成分を標的にできる。ある種の化合物についての結合
対は、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎらで参照されるとおりＰＩＮＣ化合物としてここ
で同定された。代替的に、ＰＩＮＣは、抗体のような標的リガンドに複合化され
うる。その抗体は、例えば第二の抗体に結合する非天然の標的にターゲッティン
グされうる。In another aspect, the nucleic acid coding sequence can be delivered and expressed using a two-step targeting approach using a PINC system or a non-natural target for the PINC targeting ligand complex. Thus, for example, a PINC-plasmid complex can target a component of a binding pair that is itself attached to a ligand that binds to a cellular target (eg, MAB). The binding pair for certain compounds has now been identified as PINC compounds as referenced in Subramanian et al. Alternatively, PINC can be conjugated to a target ligand, such as an antibody. The antibody can be targeted, for example, to a non-natural target that binds to a second antibody.

【０１３９】 III．抗血管形成コンストラクトおよび処方の評価についてのモデルシステム 抗癌治療での抗血管形成性の発現プラスミドコンストラクト及び処方を用いる
概念にしたがって、ネズミのモデルシステムが、ネズミの腫瘍細胞系列に基づい
て利用された。最初に使用される細胞系列は、ネズミの鱗状細胞癌（Ｓ．Ｃ．）
から由来した細胞系列であるＳ．Ｃ． ＶＩＩ／ＳＦであった。 頭部および頚部の鱗状細胞癌は、経口および喉頭腔をつなぐ細胞で始まる。臨
床的疾患は、浸潤を介して進行し、そして内在する組織およびリンパ管に広がる
。未分化のインビボ継代腫瘍細胞系列Ｓ．Ｃ． ＶＩＩ／ＳＦは、この典型的な
成長パターンを示す。さらに、その迅速な成長速度は、個々の実験について比較
的短い試験期間を提供する。他のネズミの腫瘍細胞系列としては、別のＳＣＣ系
列ＫＬＮ−２０５、ケラチノサイトラインＩ−７、および結腸腺癌系列ＭＣ−３
８が挙げられる。III.A model system for evaluation of anti-angiogenic constructs and formulations  Using anti-angiogenic expression plasmid constructs and formulations in anti-cancer therapy
According to the concept, the murine model system is based on a murine tumor cell line
Was used. The first cell line used is murine squamous cell carcinoma (SC).
Is a cell line derived from S. C. VII / SF. Squamous cell carcinoma of the head and neck begins with cells that connect the oral and laryngeal cavities. Coming
Bed disorders progress through invasion and spread to underlying tissues and lymphatic vessels
. An undifferentiated in vivo passage tumor cell line C. VII / SF has this typical
3 shows a growth pattern. Furthermore, its rapid growth rate is comparable for individual experiments
Provide a short test period. Another murine tumor cell line includes another SCC line.
Row KLN-205, keratinocyte line I-7, and colon adenocarcinoma line MC-3.
8 are mentioned.

【０１４０】 最適なモデルシステムは、臨床的疾患に観察されるものと類似のインビボで腫
瘍成長速度（すなわち、腫瘍は、移殖の４−１０日後に治療の準備ができる）、
侵入および局所拡大を示すこと、そして実験的治療についての利用しやすさを提
供することに基づいた条件を満足するのが好ましい。記述したように、ＳＣＣ
ＶＩＩ／ＳＦ細胞系列は、一次モデルシステム細胞系列として利用された。この
細胞系列は、典型的に迅速に成長し、それにより腫瘍細胞移殖の１４−１７日後
に未治療の同遺伝子型のマウスの死亡を起す。 この細胞系列は、多様な方法で使用されて、多様な異なる試験に適切なモデル
システムを提供する。そのような４つの可能性は、以下に記述される。 第一に、ＳＣＣＶＩＩ細胞は、細胞培養に利用されて、発現レベルおよび細胞
毒性のような抗血管形成剤発現コンストラクトおよび処方上の特徴のインビトロ
評価を提供する。 第二に、その細胞は、マウスの皮下に移殖されうる。この系は、移植部位の利
用性が有益である試験に利用されうる。例として、この方法は、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現に基づいた発現効率の評価
に利用された。 第三に、その細胞は、経皮で顎二腹筋の筋膜に移植されうる。 第四に、その細胞は、経皮で顎二腹筋／顎舌骨筋に移植されうる。モデル３お
よび４の重要な特性は、以下の表に示される。The optimal model system is a tumor growth rate in vivo similar to that observed in clinical disease (ie, tumors are ready for treatment 4-10 days after implantation),
It is preferable to satisfy the conditions based on showing invasion and local enlargement and providing accessibility for experimental treatment. As described, SCC
The VII / SF cell line was used as the primary model system cell line. This cell line typically grows rapidly, resulting in death of untreated mice of the same genotype 14-17 days after tumor cell implantation. This cell line is used in a variety of ways to provide a model system suitable for a variety of different tests. Four such possibilities are described below. First, SCCVII cells have been utilized in cell culture to provide in vitro assessment of anti-angiogenic agent expression constructs and formulation characteristics such as expression levels and cytotoxicity. Second, the cells can be implanted subcutaneously in mice. This system can be used in studies where the availability of the implantation site is beneficial. As an example, this method was used to evaluate expression efficiency based on the expression of chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Third, the cells can be implanted transdermally into the fascia of the digastric muscle. Fourth, the cells can be implanted percutaneously into the digastric / hyoid muscle. Important properties of Models 3 and 4 are shown in the table below.

【０１４１】[0141]

【表２】 [Table 2]

【０１４２】 マウスモデルで処置した腫瘍サイズは、一般に、２０−５０ｍｍ3である。５
０ｍｍ3のマウスの腫瘍は、約６．６ｃｍの平均直径を有する１５０ｃｃ3のヒト
腫瘍とおおよそ等価である。この腫瘍サイズは、第Ｉ相臨床治験で処置されるこ
とが提案されるサイズよりおおよそ１０倍大きい。このことは、このマウスモデ
ルが、ヒト患者で予測される腫瘍負荷を評価することについて強く指向している
ことを示す。[0142] tumor size treated with mouse model is generally a 20-50mm 3. 5
Mouse tumors of 0 mm 3 is approximately equivalent to human tumors 150 cc 3 having an average diameter of about 6.6 cm. This tumor size is approximately 10 times larger than the size proposed to be treated in a Phase I clinical trial. This indicates that this mouse model is strongly directed to assessing the expected tumor burden in human patients.

【０１４３】 IV．インビボ送達についての処方 Ａ．一般原理 上に記述されたもののような発現系が、適切な部位に送達される場合に発現に
ついてのポテンシャルを提供するとき、コンストラクトの送達および細胞取込み
の双方を助けることができる送達系で発現系コンストラクト（類）を提供するこ
とは有益である。したがって、本発明は、１つまたはそれ以上の発現系コンスト
ラクト（例えば、上に記述されるとおりＤＮＡプラスミド）、および保護的で相
互作用性の非凝縮性の化合物を含む特定の処方も提供する。 プラスミドコンストラクトに関連する他の一つの際立った因子は、開環状（Ｏ
Ｃ）形態よりむしろスーパーコイル（ＳＣ）形態にあるプラスミドの含有率であ
る。 Ｂ．送達および発現 多様な送達方法を、上述のコンストラクトおよび処方を用いて使用でき、特に
、腫瘍部位に注射することによる送達を使用できる。下顎下腫瘍モデルは、治療
されるべき腫瘍の４つの四分円への注射を利用した。 Ｃ．ヒト抗血管形成処方の抗癌効果 上に記述される抗血管形成処方の投与の効果は、Ｓ．Ｃ．ＶＩＩマウスの腫瘍
モデルを用いて評価された。上述されるプラスミドコンストラクトが、送達処方
に組込まれた。その処方は、注射によって送達された。マウス腫瘍の進行中にあ
る腫瘍細胞中のヒト抗血管形成プラスミドの発現の効果は、このような抗血管形
成発現が、そのような腫瘍に対して有効であることを示した。 Ｄ．典型的な処方の毒性評価 典型的な処方は、試験された濃度で高い細胞毒性を示さず、それによりその処
方は、インビボで直接的毒性作用によって細胞を有意に死滅させはしないことが
示唆された。IV.Formulation for in vivo delivery  A.General principle  Expression systems, such as those described above, can be expressed when delivered to the appropriate site.
Delivery and cell uptake when providing the potential for
Providing expression system construct (s) in a delivery system that can assist both
And is informative. Accordingly, the present invention relates to one or more expression system constructs.
Lacto (eg, a DNA plasmid as described above), and
Certain formulations containing interacting non-condensable compounds are also provided. Another prominent factor associated with the plasmid construct is the open circle (O
C) The content of the plasmid in supercoiled (SC) form rather than in form
You. B.Delivery and expression  A variety of delivery methods can be used with the above-described constructs and formulations, particularly
Delivery by injection at the site of a tumor can be used. Submandibular tumor model for treatment
Injections into four quadrants of the tumor to be performed were utilized. C.Anticancer effect of human antiangiogenic formulation  The effects of the administration of the anti-angiogenic formulation described above are described in C. Tumor of VII mouse
It was evaluated using the model. The plasmid construct described above is
Was incorporated into The formulation was delivered by injection. During mouse tumor progression
The effect of human anti-angiogenic plasmid expression in tumor cells
Expression has been shown to be effective against such tumors. D.Toxicity assessment of typical formulations  Typical formulations do not show high cytotoxicity at the concentrations tested, and
Do not significantly kill cells by direct toxic effects in vivo.
It was suggested.

【０１４４】 Ｖ．投与 ここに使用される場合、投与とは、体へのＤＮＡのプラスミドまたは担体の導
入の経路をいう。上述された送達の方法に加えて、発現系コンストラクトおよび
送達システム処方を、多様な異なる方法によって投与できる。 投与は、標的組織に直接的、または全身投与後の標的組織への標的送達によっ
て行われうる。特に、本発明は、遺伝子療法に有用である特定のレベルで、組織
内で任意の特異的核酸配列の制御された発現を樹立するために、体への発現シス
テムの投与または処方によって疾病を治療するのに使用できる。 ベクター（プラスミド）の投与のための好ましい手段、および送達のための処
方の使用は、上に記述される。好ましい具体例は、針注射を用いる直接注射によ
る。 任意に選択されたベクターコンストラクトの投与経路は、発現ベクターのため
の特定の用途に依存する。一般に、使用された各ベクターコンストラクトについ
ての特定の処方は、特定の標的組織に関してのベクターの取り込み、に焦点をあ
てるであろう。取り込みは後に引き続き有効性の提示を生じる。取込みに関する
調査は、ベクターの細胞取込み、および選択したＤＮＡの発現を評価する取込ア
ッセイを含む。このようなアッセイは、取込み後の標的ＤＮＡの局在部位をも決
定し、そして発現タンパク質の定常状態濃度維持のための要件を確立する。その
後、有効性および細胞毒性が試験されうる。毒性には、細胞活性のみならず、細
胞機能も含む。 筋肉細胞は、溶液、懸濁液、またはコロイドとしてＤＮＡ粒子を筋肉に単回注
射した後、ＤＮＡを細胞外空間から取り込む特徴的な能力を示す。この方法によ
るＤＮＡの発現は、数ヶ月間保持されうる。V.Administration  As used herein, administration refers to introducing a plasmid or carrier of DNA into the body.
The entry route. In addition to the delivery methods described above, expression system constructs and
The delivery system formulation can be administered by a variety of different methods. Administration can be by direct delivery to the target tissue or by targeted delivery to the target tissue following systemic administration.
Can be performed. In particular, the present invention relates to the use of tissue at certain levels that are useful for gene therapy.
Expression system in the body to establish controlled expression of any specific nucleic acid sequence within
It can be used to treat a disease by administration or prescription of a system. Preferred means for administration of vectors (plasmids) and procedures for delivery
Its use is described above. A preferred embodiment is by direct injection using needle injection.
You. The administration route of the arbitrarily selected vector construct depends on the expression vector.
Depends on the specific application. In general, for each vector construct used,
All specific formulations focus on vector uptake for a particular target tissue.
Would be. Incorporation subsequently results in a presentation of efficacy. About ingestion
The survey included cellular uptake of the vector and an uptake assay to assess expression of the selected DNA.
Including essay. Such assays also determine the location of the target DNA after incorporation.
And establish requirements for maintaining steady state concentrations of the expressed protein. That
Later, efficacy and cytotoxicity can be tested. Toxicity includes not only cell activity but also
Including cell function. Muscle cells are a single injection of DNA particles into muscle as a solution, suspension, or colloid
Shows the characteristic ability to take up DNA from the extracellular space after shot. By this method
Expression of the DNA can be maintained for several months.

【０１４５】 処方されたＤＮＡベクターの送達は、標的細胞によりエンドサイトーシスを受
ける巨大分子複合体にＤＮＡを取込むことを伴う。このような複合体としては、
脂質、タンパク質、炭化水素、合成有機化合物または無機化合物が挙げられうる
。好ましくは、複合体は、特定の比率でＤＮＡ、カチオン性脂質、および中性脂
質を含む。ベクターで形成された複合体の特徴（サイズ、荷電、表面特徴、組成
）は、体の中でベクターの生物的利用性を決定する。処方の他の要素は、リガン
ドとして機能し、細胞の表面または内側で特異的受容体と相互作用する。その所
要の他の要素は、細胞への侵入、エンドソームからの開放、そして核への侵入を
促進するように機能する。Delivery of formulated DNA vectors involves incorporating DNA into macromolecular complexes that are endocytosed by target cells. As such a complex,
Lipids, proteins, hydrocarbons, synthetic organic or inorganic compounds may be mentioned. Preferably, the complex comprises DNA, cationic lipids, and neutral lipids in certain ratios. The characteristics (size, charge, surface characteristics, composition) of the complex formed by the vector determine the bioavailability of the vector in the body. Other elements of the formulation function as ligands and interact with specific receptors on or inside the cell. Other elements of that requirement function to facilitate entry into cells, release from endosomes, and entry into the nucleus.

【０１４６】 送達は、ＤＮＡ輸送媒体の使用を介しても通してもできる。ＤＮＡ輸送媒体と
は、ＤＮＡベクターに結合し、そして上皮細胞によって取込まれる能力がある分
子をいう。ＤＮＡ輸送媒体は、ＤＮＡに非共有結合で結合し、そして細胞膜を介
してＤＮＡを有効に輸送する能力のある分子複合体を含む。その輸送媒体は、ま
た、核膜を介してＤＮＡを輸送することが好ましい。例えば、その全て（図面を
含めて）が、ここで参照してここに組込まれる以下の出願を参照：（１）１９９
２年３月２０日に提出された、「ＤＮＡ輸送媒体系および使用方法」と題される
Ｗｏｏらによる、米国特許出願番号第０７／８５５，３８９号、現在放棄されて
いる；（２）１９９３年３月１９日に提出された、「ＤＮＡ輸送媒体系および使
用方法」（米国および他の国々を意味する）と題されるＷｏｏらによる、ＰＣＴ
／ＵＳ９３／０２７２５、国際公開番号ＷＯ９３／１８７５９号；（３）Ｗｏｏ
らによる、１９９３年１２月１４日に提出された米国特許出願番号第０８／１６
７，６４１号、「核酸輸送媒体系および使用方法」と題されるＷｏｏによる一部
継続出願；（４）Ｓｚｏｋａらによる、１９９２年７月１４日に提出された、米
国特許出願番号第０７／９１３，６６９号、「自己集合ポリヌクレオチド送達系
」と題される一部継続出願および（５）１９９３年４月５日に提出された、「自
己集合ポリヌクレオチド送達系」（米国および他の国々を意味する）と題される
Ｓｚｏｋａらによる、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４０６号、国際公開番号ＷＯ９３
／１９７６８号。Delivery can be through or through the use of a DNA transport vehicle. DNA transport vehicle refers to a molecule that is capable of binding to a DNA vector and being taken up by epithelial cells. DNA transport vehicles include molecular complexes that bind non-covalently to DNA and are capable of effectively transporting DNA across cell membranes. Preferably, the transport medium also transports DNA through the nuclear membrane. See, for example, the following applications, all of which (including the drawings) are incorporated herein by reference: (1) 199
U.S. Patent Application Serial No. 07 / 855,389, filed March 20, 2009, entitled "DNA Transport Vehicle Systems and Methods of Use", now abandoned; (2) 1993. PCT by Woo et al., Entitled "DNA Transport Vehicle Systems and Methods of Use" (meaning the United States and other countries), filed March 19, 1998.
/ US93 / 02725, International Publication No. WO93 / 18759; (3) Woo
Et al., US Patent Application Serial No. 08/16, filed December 14, 1993.
7,641, Partial Continuation Application by Woo entitled "Nucleic Acid Transporting Media Systems and Methods of Use"; (4) U.S. Patent Application No. 07/07, filed July 14, 1992, by Szoka et al. No. 913,669, entitled "Self-Assembled Polynucleotide Delivery System" and (5) "Self-Assembled Polynucleotide Delivery System" filed April 5, 1993 (US and other countries). Et al., PCT / US93 / 03406, International Publication No. WO93 by Szoka et al.
/ 19768.

【０１４７】 ＤＮＡ輸送媒体系は、独立にかつ非共有結合でＤＮＡに結合する数種の要素を
含む粒子から構成されうる。各要素は、ＤＮＡに結合するカチオン性基と複合化
されたタンパク質のような特異的受容体または他の官能基を認識するリガンドか
ら構成される。使用されうるカチオンの例は、スペルミン、スペルミン誘導体、
ヒストン、カチオン性ペプチドおよび／またはポリリジンである。１つの要素は
、ＤＮＡベクターおよび標的細胞上の細胞表層受容体の両方に結合する能力があ
る。このような要素の例は、アシアログリコタンパク質受容体、葉酸受容体、マ
ンノース−６−ホスフェート受容体、またはカルニチン受容体と相互作用する有
機化合物である。第二の要素は、ＤＮＡベクターおよび核膜上の受容体の両方に
結合する能力がある。核リガンドは、核膜を介して輸送媒体系を認識および輸送
する能力がある。このようなリガンドの例は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原またはヒスト
ンから得られる核標的配列である。第三の要素は、ＤＮＡベクターおよび上皮溶
解を誘導する要素の両方に結合する能力がある。例としては、アデノウイルス、
インフルエンザウイルスヘマグルチニンに関連したペプチド、または上に引用さ
れるＳｚｏｋａ特許に記述されたＧＡＬＡペプチドのような不活性化ウイルス粒
子が挙げられる。[0147] DNA transport vehicle systems can be composed of particles that include several elements that independently and non-covalently bind to DNA. Each element is composed of a ligand that recognizes a specific receptor or other functional group, such as a protein, complexed with a cationic group that binds to DNA. Examples of cations that can be used are spermine, spermine derivatives,
Histones, cationic peptides and / or polylysine. One element is capable of binding both the DNA vector and the cell surface receptor on the target cell. Examples of such elements are organic compounds that interact with the asialoglycoprotein receptor, the folate receptor, the mannose-6-phosphate receptor, or the carnitine receptor. The second element is capable of binding both the DNA vector and the receptor on the nuclear envelope. Nuclear ligands are capable of recognizing and transporting transport media systems through the nuclear membrane. Examples of such ligands are SV40 large T antigens or nuclear targeting sequences obtained from histones. The third element is capable of binding both the DNA vector and the element that induces epithelial lysis. Examples are adenovirus,
Peptides related to influenza virus hemagglutinin or inactivated virus particles such as the GALA peptide described in the Szoka patent cited above.

【０１４８】 腫瘍に直接的に遺伝子を移動させることは、非常に有効であった。実験は、Ｄ
ＮＡの腫瘍細胞への直接注射による投与で、注射の領域内で遺伝子の発現を生じ
ることを示す。注射されたＤＮＡは、染色体に取り込まれない染色体外状態で保
持されることが好ましい。導入のためのこの手段は、好ましい具体例である。 投与は、上の好ましい具体例で記述されたとおりの脂質をも含みうる。脂質は
、単層、二層、または多層形態に配列された脂質と、およびＤＮＡのような水溶
性化合物を捕捉する内部水溶性空間とからなる、直径０．０５から数ミクロンま
での範囲にある中空球形小胞であるリポソームを形成しうる。脂質は、リポソー
ムを形成しなくても有用でありうる。特定の例としては、ＤＮＡと標的細胞の膜
とに相互作用して、ＤＮＡが細胞に入ることを促進するＤＯＰＥを含むカチオン
性脂質および複合体の使用が挙げられる。Transferring the gene directly to the tumor was very effective. The experiment is D
Figure 4 shows that administration of NA by direct injection into tumor cells results in expression of the gene within the area of injection. Preferably, the injected DNA is maintained in an extrachromosomal state that does not integrate into the chromosome. This means for introduction is a preferred embodiment. Administration can also include lipids as described in the preferred embodiments above. Lipids range from 0.05 to several microns in diameter, consisting of lipids arranged in monolayer, bilayer, or multilayer form, and internal water-soluble spaces that trap water-soluble compounds such as DNA. It can form liposomes that are hollow spherical vesicles. Lipids can be useful without forming liposomes. Particular examples include the use of cationic lipids and complexes, including DOPE, that interact with the DNA and the membrane of the target cell to facilitate the entry of the DNA into the cell.

【０１４９】 遺伝子送達は、遺伝子操作された細胞を移殖することによっても行われうる。
例えば、筋芽細胞と称される未熟な筋肉細胞は、筋肉繊維に遺伝子を運ぶのに使
用されうる。組換えヒト成長因子を発現するように遺伝子操作された筋芽細胞は
、成長ホルモンを動物の血液に分泌できる。組込まれた遺伝子の分泌は、３ヶ月
までの期間、常に保持されうる。 筋芽細胞は、最終的に分化し、そして存在する筋肉組織に融合する。細胞が、
存在する構造に組込まれるので、それは、耐性があるのみならず、育成される。
筋芽細胞は、遺伝子治療を必要とする個人から筋肉組織を取ることによって容易
に得ることができ、そして一般に操作された細胞は、患者の筋肉に損傷を起すこ
となしに容易に戻すこともできる。同様に、ケラチノサイトが、遺伝子を組織に
送達するのに使用しうる。多数のケラチノサイトは、小さな生検の培養によって
生成されうる。培養は、層形成シートとして作製され、そしてヒトに移殖したと
き、長年かけて組織特異的品質で改善し続ける上皮を生じることができる。ケラ
チノサイトは、培養中で適切なベクターをケラチノサイトに形質導入することに
よって、遺伝子操作される。ケラチノサイトは、上皮を皮膚から分画する基底膜
によって循環から分離されているが、ヒトのケラチノサイトは、産生したタンパ
ク質を循環内に分泌する。 送達の選択された方法は、適切な生物学的効果を発揮するレベルで、核酸カセ
ット内にコードされる遺伝子産物の発現を生じるに違いない。発現の程度は、疾
病、ベクターおよび遺伝子産物の薬物動態学、および投与の経路に依存するが、
しかし、０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、そして好ましくは０．０１−
１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にあるべきである。このレベルは、標準の方法に
よって容易に決定しうる。それは、多かれ少なかれ、最適な投与に依存しえた。
治療の期間は、疾病徴候が経過する間は、できれば連続して、延長される。投与
の回数は、疾病、送達媒体、および治験からの有効性データに依存する。[0149] Gene delivery can also be achieved by transferring genetically engineered cells.
For example, immature muscle cells, called myoblasts, can be used to carry genes to muscle fibers. Myoblasts engineered to express recombinant human growth factor can secrete growth hormone into the blood of animals. Secretion of the integrated gene can be maintained at all times for up to three months. Myoblasts eventually differentiate and fuse to existing muscle tissue. Cells
As it is incorporated into existing structures, it is not only resistant, but also nurtured.
Myoblasts can be easily obtained by taking muscle tissue from individuals in need of gene therapy, and generally engineered cells can also be easily returned without causing damage to the patient's muscles . Similarly, keratinocytes can be used to deliver genes to tissues. Large numbers of keratinocytes can be produced by culturing small biopsies. Cultures can produce epithelia that are made as stratified sheets and, when transferred to humans, continue to improve over time with tissue-specific quality. Keratinocytes are engineered by transducing keratinocytes with an appropriate vector in culture. Keratinocytes are separated from the circulation by a basement membrane that separates the epithelium from the skin, whereas human keratinocytes secrete produced proteins into the circulation. The chosen method of delivery must result in the expression of the gene product encoded in the nucleic acid cassette at a level that exerts the appropriate biological effect. The degree of expression depends on the disease, the pharmacokinetics of the vector and gene product, and the route of administration,
However, 0.001-100 mg / kg body weight / day, and preferably 0.01-
It should be in the range of 10 mg / kg body weight / day. This level can be easily determined by standard methods. It could more or less depend on optimal dosing.
The duration of treatment is extended, preferably continuously, during the course of the disease symptoms. The number of doses will depend on disease, delivery vehicle, and efficacy data from the trial.

【０１５０】実施例 本発明は、以下の特定の実施例に関連していっそう十分に記述される。ただし
、これらの実施例は本発明の範囲を限定するように解釈されるべきものではない
。[0150]Example  The present invention is more fully described with reference to the following specific examples. However
These examples are not to be construed as limiting the scope of the invention.
.

【０１５１】実施例１ ＥＣ特異的エンハンサーおよびプロモーターをクローニングする。 プロモーター：２組のレポーターベクター − ＣＡＴ（ｐＣＴ１１３２およ
びｐＣＴ１１３３）またはＬＵＣ（レポーター遺伝子としてｐＬＣ１１３７およ
びｐＬＣ１１３８）のいずれかを有するＣＭＶｅｎｈ+／ｐｒｏ-およびＣＭＶｅ
ｎｈ-／ｐｒｏ+が構築された。ＳａｃＩ部位はこれらのベクター内の特徴的な部
位である。プロモーター配列は２つのプライマー（５’プライマー、ＳａｃＩ部
位を有する３’プライマー）を用いたＰＣＲ、およびそれに続くＴＡベクターへ
のクローニングによってヒトゲノムＤＮＡから増幅される。右配向を示すコンス
トラクト（３’は、ＴＡベクター上のＳａｃＩ部位から離れており、その結果Ｓ
ａｃＩ消化はＰＣＲ挿入産物を付与する）。ＳａｃＩ断片は上のベクターのＳａ
ｃＩ部位に挿入される。[0151]Example 1  Clone the EC specific enhancer and promoter.promoter: Two sets of reporter vector-CAT (pCT1132 and
And pCT1133) or LUC (pLC1137 and
And pLC1138).+/ Pro-And CMVe
nh-/ Pro+Was built. The SacI site is a characteristic part of these vectors.
Rank. The promoter sequence consists of two primers (5 'primer, SacI part).
3 'primer having a 3' position) and subsequent TA vector
Amplified from human genomic DNA. Cons showing right orientation
The tract (3 'is away from the SacI site on the TA vector, so
The acI digestion gives the PCR insert). The SacI fragment was obtained from the above vector Sa
Inserted at the cI site.

【０１５２】 多量体化エンドセリンエンハンサー：エンドセリンエンハンサー（ＥＴｅ）が
オーバーハングで合成され、下に示されるようなＢgｌ ＩＩおよびＢａｍ Ｈ
Ｉ部位が形成された。 gatctGTACTTCATACTTTTCATTCCAATGGGGTGACTTTGCTTCTGGAG aCATGAAGTATGAAAAGTAAGGTTACCCCACTGAAACGAAGACCTCctag このＤＮＡ断片は高濃度での連結することによって多量体化され、そしてＢｇ
ｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、逆方向および裏返し反復が排除された。４
個および７個のタンデムコピーを有するＤＮＡ種がゲル精製され、そして種々の
内皮特異的または増殖特異的プロモーターを含むプラスミドに挿入された。Multimerizing endothelin enhancer : The endothelin enhancer (ETe) is synthesized with overhangs and Bgl II and Bam H as shown below.
An I site was formed. gatctGTACTTCATACTTTTCATTCCAATGGGGTGACTTTGCTTCTGGAG aCATGAAGTATGAAAAGTAAGGTTACCCCACTGAAACGAAGACCTCctag This DNA fragment is multimerized by ligation at high concentration and Bg
Digestion with II and BamHI eliminated the inverted and inverted flips. 4
DNA species with one and seven tandem copies were gel purified and inserted into plasmids containing various endothelial-specific or growth-specific promoters.

【０１５３】 材料および方法 ＥＣ特異的プロモーター駆動レポーターコンストラクトの構築：内皮特異的プ
ロモーターを含むプラスミドが以下のとおり構築された。エンドセリン−１（Ｅ
Ｔ−１）、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１、ＩＣＡＭ−２、β３およびαＶの最小プロモー
ター配列、および細胞サイクル依存性遺伝子（サイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１、または
ｃｄｃ６）がヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって直接的に増幅された。その後
、増幅プロモーター配列をｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にサブクローン化さ
せた。その後、プロモーター配列を、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片として、ルシフェ
ラーゼ・レポーター遺伝子、合成イントロンおよびヒト成長ホルモン３’未翻訳
領域／ポリ（Ａ）シグナルを含む発現プラスミドｐＬＣ１１３６にサブクローン
化させて、プロモーター特異的発現コンストラクトを作成した。プラスミドをイ
ー・コリ宿主株(E. coli host strains)ＤＨ５α中でカナマイシン選択下で育成
させ、そしてアルカリ性溶解およびクロマトグラム法を用いて精製した。注射の
ために利用された精製プラスミドは以下の特異性を示した：＜５０Ｅｕ／ｍｇ内
毒素。[0153]Materials and methods  Construction of EC-specific promoter-driven reporter construct： Endothelial specific plate
A plasmid containing the promoter was constructed as follows. Endothelin-1 (E
T-1), the minimum promoter of KDR / flk-1, ICAM-2, β3 and αV
And a cell cycle dependent gene (cyclin A, E2F1, or
cdc6) was directly amplified from human genomic DNA by PCR. afterwards
The amplification promoter sequence was subcloned into pCR2.1 (Invitrogen).
I let you. Then, the promoter sequence was converted into a SacI-SacI fragment by luciferase.
Rase reporter gene, synthetic intron and human growth hormone 3 'untranslated
Subclone in expression plasmid pLC1136 containing region / poly (A) signal
To create a promoter-specific expression construct. Insert plasmid
Grown in kanamycin selection in E. coli host strains DH5α
And purified using alkaline lysis and chromatographic methods. Injection
The purified plasmid used for this showed the following specificities: <50 Eu / mg
toxin.

【０１５４】 内皮細胞培養および形質移入 ヒト臍帯の大動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が内皮細胞成長因子の補足を伴う５
％仔ウシ血清で補足したＥＢＭ−１培地（クロンテック・インコーポレーテッド
）中の６穴プレートで育成された。２−４継代にあるＨＵＶＥＣを形質移入に使
用した。ＨｅＬａ細胞も１０％仔ウシ血清、１％グルタミンおよび１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシンで補足したダルベッコの修飾イーグル培地中の６穴プレ
ートで育成された。培養細胞がＤＥＡＥ−デキストランによって２μｇのレポー
ターコンストラクトを用いて形質移入された。形質移入効率を修正するために、
サイトメガロウイルス即時型プロモーターによって起動されるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含む０．５μｇのプラスミドｐＢＧ０９６５も各形質移入に含まれ
た。形質移入の４８時間後、細胞抽出物を作成し、ルシフェラーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼアッセイを行った。相対的ルシフェラーゼ活性がβ−ガラクトシ
ダーゼ単位に対する光単位の比として計算された。ＨＵＶＥＣについての修正さ
れた光単位がＨｅＬａ細胞についての修正された光単位に分割され、畳込まれた
内皮特異性が得られた。Endothelial Cell Culture and Transfection Human umbilical cord aortic endothelial cells (HUVEC) with endothelial cell growth factor supplementation5
Growing in 6-well plates in EBM-1 medium (Clontech, Inc.) supplemented with 5% calf serum. HUVECs at passages 2-4 were used for transfection. HeLa cells were also grown on 6-well plates in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% calf serum, 1% glutamine and 1% penicillin / streptomycin. Cultures were transfected with DEAE-dextran using 2 μg of the reporter construct. To correct transfection efficiency,
0.5 μg of plasmid pBG0965 containing the β-galactosidase gene driven by the cytomegalovirus immediate-early promoter was also included in each transfection. 48 hours after transfection, cell extracts were made and luciferase and β-galactosidase assays were performed. Relative luciferase activity was calculated as the ratio of light units to β-galactosidase units. The modified light units for HUVEC were split into modified light units for HeLa cells, resulting in convoluted endothelial specificity.

【０１５５】 細胞特異的プロモーターを増殖する分析：生じるレポータープラスミドは２つ
の異なる内皮セルラインＨＵＶＥＣおよびＢＡＥＣにＥＣ−エンハンサーおよび
細胞サイクル特異的プロモーターを含み、そしてその活性が非内皮セルラインＮ
ＩＨ３Ｔ３中のものと比較された。レポーター活性をこれらのサンプルでアッセ
イした。 Assay for Propagating Cell-Specific Promoters : The resulting reporter plasmid contains an EC-enhancer and a cell cycle-specific promoter in two different endothelial cell lines, HUVEC and BAEC, and its activity is determined to be non-endothelial cell line N
Compared to those in IH3T3. Reporter activity was assayed in these samples.

【０１５６】 結果 プラスミドの構築：生じるレポーターコンストラクトは代表的コンストラクト
ＥＴ−エンハンサー／ＥＴ−プロモーター、ｐＬＣ１２６４およびｐＬＣ１２６
５であるような図面に列記される。 ＥＣ−特異的活性分析：ＨＵＶＥＣおよびＨｅＬａ細胞中のＥＴｅ／ＥＴｐの
活性および特異性（ＥＣ対ＨｅＬａ）が図面に示される。データはＥＴｅが１０
倍までＥＣ中で特異的にＥＴｐ発現を増強することを示した。 サイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１またはｃｄｃ６プロモーターの上流に挿入された４個
または７個のコピーのＥＴｅは内皮細胞で特異的に数倍発現を増大する。増殖特
異的プロモーターおよび内皮特異的エンハンサーから構成されるこれらのキメラ
調節要素は生体内で内皮細胞を分割する上で特異的に強い発現を達成する手段を
提供しうる。[0156]result  Plasmid construction: The resulting reporter construct is a representative construct
ET-enhancer / ET-promoter, pLC1264 and pLC126
5 are listed in the drawing.EC-specific activity assay: Of ETe / ETp in HUVEC and HeLa cells
Activity and specificity (EC vs. HeLa) are shown in the figures. Data is ETe 10
It was shown to specifically enhance ETp expression in EC up to 2-fold. 4 inserted upstream of cyclin A, E2F1 or cdc6 promoter
Alternatively, 7 copies of ETe specifically increase expression several times in endothelial cells. Proliferation
These chimeras composed of heterologous promoters and endothelium-specific enhancers
Regulatory elements provide a means to achieve specifically strong expression in dividing endothelial cells in vivo.
Can be provided.

【０１５７】 抗血管形成遺伝子のＥＣ−特異的発現：エンドスタチンまたはアンギオスタチ
ンについてのコーディング配列がベクターｐＬＣ１２６５に挿入され、ｐＥＳ１
３５８およびｐＡＳ１３５９が生成された。したがって、エンドスタチンおよび
アンギオスタチンの発現はＥＴｅ／ＥＴｐによって起動された。エンドスタチン
およびアンギオスタチン発現の特異性が決定される。 EC-specific expression of anti-angiogenic genes : The coding sequence for endostatin or angiostatin was inserted into vector pLC1265 and pES1
358 and pAS1359 were generated. Thus, endostatin and angiostatin expression were driven by ETe / ETp. The specificity of endostatin and angiostatin expression is determined.

【０１５８】実施例２：癌治療のための抗血管形成遺伝子薬 材料および方法 プラスミド構築：エンドスタチンまたはアンギオスタチンについての発現カセ
ットを含むプラスミドが以下のとおり構築された。エンドスタチンのコーディン
グ配列はコラーゲン１８ａｌの１８４ａａのＣ末端である。（ヒトコラーゲン型
ＸＶＩＩＩアルファ１ 受託番号Ｌ２２５４８号；Ｏｈ，Ｓ．Ｐ．、Ｗａｒｍａ
ｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｓｅｌｄｉｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｄ．、Ｋｎｏｌｌ，
Ｊ．Ｈ．、Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｓ．およびＯｌｓｅｎ，Ｂ．Ｒ．） ヒトＸＶＩＩ
Ｉ型コラーゲンをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニングおよび
マウス染色体１０およびヒト染色体２１へのアルファ１（ＸＶＩＩＩ）コラーゲ
ン遺伝子の局在化。Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９（３）巻、４９４−４９９頁（１９
９４年）。アンギオスタチンはヒトプラスミノーゲン（受託番号Ｍ７４２２０号
；Ｂｒｏｗｎｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｏｄｄ，Ｉ．、Ｃａ
ｒｅｙ，Ｊ．Ｅ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｇ．Ｍ．Ｐ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｄ．
およびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．）の内部断片（９７−４４０ａａ）である。
ＨｅＬａ細胞中の組換えヒトプラスミノーゲンおよびアグリコプラスミノーゲン
の発現。Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ（１９９１年）。エンドスタチンおよびアン
ギオスタチンのコーディング配列が、５’末端にＢａｍＨＩ部位を加えるととも
に３’末端にＸｂａＩ部位を加えるオリゴヌクレオチドプライマー（下に示され
た）を用いてヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック）からＰＣＲによって直接的に増
幅された。 ヒト・アンギオスタチン５’プライマー ATg gAA CAT AAg gAA gTg gTT CTT ヒト・アンギオスタチン３’プライマー（ＸｈｏＩ部位を有する） gC CTCgAg gCA TTT TTT CAg gTT gCA gTA CTC ヒト・アンギオスタチン３’プライマー（内部プライマー）Ｋ３ gC ggATcc AAA gTg TAT CTC TCA gAg TgC AAg マウス・アンギオスタチン５’プライマー ATg gAC CAT AAg gAA gTA ATC CTT マウス・アンギオスタチン３’プライマー（付加されたＸｈｏＩ部位を有する） gC CTCgAg gCA CCg CTT CAg gTT gCA gTA TTC マウス・アンギオスタチン３’プライマー（内部プライマー）Ｋ３？ gC ggATCC gTg TAT CTg TCA gAA TgT AAg ACC マウス・エンドスタチン５’プライマー（付加されたＢａｍＨＩを有する） gCggATCC CAT ACT CAT CAg gAC TTT CAg CCA マウス・エンドスタチン３’プライマー（付加されたＸｈｏＩを有する） gCCTCgAg CAT TTT ggA gAA AgA ggT CAT gAA ヒト・エンドスタチン５’プライマー gAATTC CAC AgC CAC CgC gAC TTC CAg CCg ヒト・エンドスタチン３’プライマー CTCgAg CTA CTT ggA ggC AgT CAT gAA gCT[0158]Example 2: Anti-angiogenic drug for cancer treatment  Materials and methods  Plasmid construction: Expression cassette for endostatin or angiostatin
A plasmid containing the kit was constructed as follows. Endostatin cordin
The tag sequence is the C-terminal of 184aa of collagen 18al. (Human collagen type
XVIIIalpha1 accession number L22548; Oh, S .; P. , Warma
n, M. L. Seldin, M .; F. Cheng, S .; D. , Knoll,
J. H. Timmons, S .; And Olsen, B .; R. ) Human XVII
Cloning of cDNA and genomic DNA encoding type I collagen and
Alpha 1 (XVIII) collagen to mouse chromosome 10 and human chromosome 21
Gene localization.Genomics 19 (3), pages 494-499 (19
1994). Angiostatin is human plasminogen (Accession No. M74220)
Browne, M .; J. Chapman, C .; G. FIG. Dodd, I .; , Ca
rey, J .; E. FIG. Lawrence, G .; M. P. Mitchell, D .;
And Robinson, J .; H. ) Is the internal fragment (97-440aa).
Recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa cells
Expression.Fibrinolysis(1991). Endostatin and Ann
Giostatin coding sequence adds a BamHI site at the 5 'end
Oligonucleotide primers that add an XbaI site at the 3 'end (shown below)
Directly from human liver cDNA (Clontech) using PCR
It was width. Human angiostatin 5 ′ primer ATg gAA CAT AAg gAA gTg gTT CTT Human angiostatin 3 ′ primer (having XhoI site) gC CTCgAg gCA TTT TTT CAg gTT gCA gTA CTC Human angiostatin 3 ′ primer (internal primer) K3 gC ggATcc AAA gTg TAT CTC TCA gAg TgC AAg mouse angiostatin 5 ′ primer ATg gAC CAT AAg gAA gTA ATC CTT mouse angiostatin 3 ′ primer (with added XhoI site) gC CTCgAg gCA CCg CTT CAg gTT gCA gTA TTC mouse angiostatin 3 'primer (internal primer) K3? gC ggATCC gTg TAT CTg TCA gAA TgT AAg ACC mouse endostatin 5 ′ primer (with added BamHI) gCggATCC CAT ACT CAT CAg gAC TTT CAg CCA mouse endostatin 3 ′ primer (with added XhoI) gCCTCgAg CAT TTT ggA gAA AgA ggT CAT gAA Human endostatin 5 ′ primer gAATTC CAC AgC CAC CgC gAC TTC CAg CCg Human endostatin 3 ′ primer CTCgAg CTA CTT ggA ggC AgT CAT gAA gCT

【０１５９】 その後、増幅したエンドスタチンまたはアンギオスタチン配列がｐＣＲ２．１
（インビトロゲン）にサブクローニングされた。その後、エンドスタチンまたは
アンギオスタチンについてのコーディング配列がＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とし
て中間体ベクターｐＨｏｏｋ１（インビトロゲン）のＳｆｉＩ−ＸｂａＩ部位に
サブクローニングされた。したがって、インフルエンザウイルスから得られるＩ
ｇｋシグナルペプチドおよびＨＡエピトープについてのコーディング配列はエン
ドスタチンまたはアンギオスタチンのものの上流であった。その後、Ｉｇｋ−Ｈ
Ａ−エンドスタチンまたは−アンギオスタチンについてのコーディング配列が、
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として、サイトメガロウイルス即時型プライマー、合
成イントロンおよびウシ成長ホルモン３’未翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルを含
む発現プラスミドにサブクローニングされ、エンドスタチンまたはアンギオスタ
チン発現系ｐＥＳ１１００（ネズミ・エンドスタチン、ｍＥ）、ｐＥＳ１２８１
（ヒト・エンドスタチン、ｈＥ）、ｐＡＳ１０９５（ヒト・アンギオスタチンｋ
１−ｋ４、ｈＡｋ４）またはｐＡＳ１０９６（ヒト・アンギオスタチンｋ１−ｋ
３、ｈＡｋ３）が形成された。ＨＡ−エピトープが組換えＰＣＲによってｐＥＳ
１１００から欠失され、ＨＡを含まないマウス・エンドスタチン（ｐＥＳ１０６
２、ｍＥ−ＨＡ−）（図１）についての発現プラスミドが生成された。プラスミ
ドｐＶＣ０６１２（空のプラスミド、ＥＰ）はサイトメガロウイルス即時型プロ
モーターおよびＡｌｉｌａ外、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８巻：
１７８５−１７９５頁（１９９７年）に記載されているｐＶＣ０２８９骨格中の
ウシ成長遺伝子から得られる３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルを含む発現要素を
含有する。プラスミドｐＶＣ０６１２が生体内実験で対照プラスミドとして使用
された。腫瘍内注射のためのプラスミドがイー・コリ宿主株ＤＨ５α中でカナマ
イシン選択下で育成され、そしてアルカリ性溶解およびクロマトグラム法を用い
て精製された。腫瘍内注射のために利用された精製プラスミドは以下の特性を示
した：＜５０Ｅｕ／ｍｇ内毒素；＜１％タンパク質；および＜２０％染色体ＤＮ
Ａ。Subsequently, the amplified endostatin or angiostatin sequence was replaced with pCR2.1
(Invitrogen). Subsequently, the coding sequence for endostatin or angiostatin was subcloned as a BamHI-XbaI fragment into the SfiI-XbaI site of the intermediate vector pHook1 (Invitrogen). Therefore, I derived from influenza virus
The coding sequences for the gk signal peptide and the HA epitope were upstream of those of endostatin or angiostatin. Then, Igk-H
The coding sequence for A-endostatin or -angiostatin is
As a BamHI-XbaI fragment, it was subcloned into an expression plasmid containing a cytomegalovirus immediate-early primer, a synthetic intron and a bovine growth hormone 3 ′ untranslated region / poly (A) signal. Statins, mE), pES1281
(Human endostatin, hE), pAS1095 (human angiostatin k)
1-k4, hAk4) or pAS1096 (human angiostatin k1-k)
3, hAk3) was formed. The HA-epitope is pES by recombinant PCR
HA-free mouse endostatin (pES106
2, an expression plasmid for mE-HA-) (FIG. 1) was generated. Plasmid pVC0612 (empty plasmid, EP) is a cytomegalovirus immediate-early promoter and excluding Alila, Human Gene Therapy, vol.
1785-1795 (1997) contains an expression element containing a 3'UTR / poly (A) signal derived from the bovine growth gene in the pVC0289 scaffold. Plasmid pVC0612 was used as a control plasmid in in vivo experiments. Plasmids for intratumoral injection were grown in kanamycin selection in the E. coli host strain DH5α and purified using alkaline lysis and chromatographic methods. The purified plasmid utilized for intratumoral injection showed the following properties: <50 Eu / mg endotoxin; <1% protein; and <20% chromosomal DN
A.

【０１６０】 プラスミド調製： ＤＮＡ／ＰＶＰ複合体：先の文献（Ｍｕｍｐｅｒ外、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ、１３巻、５号（１９９６年）、およびＭｕｍｐｅｒ外
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、５２巻：１
９１−２０３頁（１９９８年））に記載されているように、精製発現プラスミド
および対照プラスミドがＰＩＮＣ送達系中に３ｍｇＤＮＡ／ｍｌの濃度で調製さ
れた。 リポソームおよびＤＮＡ／脂質複合体の製造：４：１モル比の陽イオン性脂質
ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２−３−ジオレイルオキシ）プロピル）−ｎ−ｎ−ｎ
−トリメチルアンモニウムクロライド）およびコレステロールから構成される小
型臍帯小胞（ＳＵＶ）が押し出し（４００ｎｍ）によって作製された。正に荷電
したプラスミド／脂質複合体が、対照条件（Ｆｒｅｉｍａｒｋ外、Ｔｈｅ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６０巻：４５８０−４５８６頁（
１９９８年））の下、リポソームとプラスミドを混合することによって、１０％
（ｗ／ｖ）ラクトース中において１：３−／＋荷電比で調製された。複合体の平
均直径およびゼータ電位が動的光走査およびドップラー電気泳動性光走査を用い
て特徴付けられた。複合化効率はアガロースゲル電気泳動によって測定された。 Plasmid preparation : DNA / PVP complex : supra (Mumper et al., Pharmaceuti).
cal Research, Vol. 13, No. 5, (1996), and Mumper et al., Journal of Controlled Release, 52: 1
Purified expression plasmids and control plasmids were prepared in PINC delivery systems at a concentration of 3 mg DNA / ml, as described on pages 91-203 (1998). Preparation of liposomes and DNA / lipid complexes : 4: 1 molar ratio of cationic lipid DOTMA (N- (1- (2-3-dioleyloxy) propyl) -nnnn
Small umbilical cord vesicles (SUVs) composed of (trimethylammonium chloride) and cholesterol were made by extrusion (400 nm). Positively charged plasmid / lipid complexes were obtained under control conditions (Freimark et al., The Jo
urnal of Immunology, 160: 4580-4586 (
1998)), by mixing the liposome and the plasmid, 10%
(W / v) Prepared in lactose at a 1: 3-/ + charge ratio. The average diameter and zeta potential of the complex were characterized using dynamic light scanning and Doppler electrophoretic light scanning. Conjugation efficiency was measured by agarose gel electrophoresis.

【０１６１】 細胞培養：Ｃｏｓ−１細胞がＤＭＥＭ中で培養された。内皮細胞（ＨＵＶＥＣ
、ＨＬＭＥＣおよびＢＡＥＣ）がクロンテックスから得られ、そして製造業者に
よって提供された特定の培地で培養された。ＴＳ／ＡはＢＡＬＢ／ｃマウスから
自発的に生じた中程度に分化した哺乳類の腺癌の最初の生体内移殖片からの腫瘍
セルラインであり、イタリア国ボローニャ大学、Ｐ．Ｎａｎｎｉ博士によって確
立されたものである（Ｎａｎｎｉ外、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
、１巻：３７３−３７６頁（１９８３年））。多数の前免疫化検証試験によって
、ＴＳ／Ａが長期継続抗腫瘍免疫性Ｒｅｎｃａを引出さないことが示され、自発
的に生じるネズミの腎細胞癌、ＣＴ２６、結腸腺癌もルイス肺癌（ＬＬＣ、ＡＴ
ＣＣから得られる転移性変異体）とともに使用された。腫瘍細胞培養が、加湿さ
れた５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で、コーニング（コーニング、ニューヨーク）
製の無菌の使い捨てフラスコ内で維持された。その際、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｅ
ｎｃａ、ＴＳ／Ａ）、または１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００
Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全てライフ
・テクノロジーズから入手されたもの）で補助されたＤＭＥＭ（ＬＬＣ）のいず
れかが使用された。 ヒト・エンドスタチンおよびアンギオスタチンに対するマウス抗体の産生：
生理食塩水中で調製された７５μμｇのｐＥＳ１２８１またはｐＡＳ１０９６
が筋肉内に注射され、そして１４および２８日目に追加免疫した。抗体はウエス
タンブロッティングによって決定された。[0161]Cell culture: Cos-1 cells were cultured in DMEM. Endothelial cells (HUVEC
, HLMEC and BAEC) were obtained from Clontex and provided to the manufacturer
Therefore, the cells were cultured in the specific medium provided. TS / A is from BALB / c mouse
Tumors from the first in vivo explant of spontaneously occurring moderately differentiated mammalian adenocarcinoma
Cell Line, University of Bologna, Italy; Confirmed by Dr. Nanni
(Nani et al., Clin. Exp. Metastasis).
1: 373-376 (1983)). Numerous pre-immunization validation studies
Shows that TS / A does not elicit long-lasting antitumor immunity Renca, spontaneous
Murine renal cell carcinoma, CT26 and colon adenocarcinoma are also Lewis lung carcinoma (LLC, AT
(A metastatic variant obtained from CC). Tumor cell culture is humidified
5% COTwoCorning at 37 ° C in an atmosphere (Corning, New York)
Maintained in sterile, disposable flasks made from the company. At that time, RPMI 1640 (Re
nca, TS / A), or 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100
U / ml streptomycin and 50 μg / ml gentamicin (all life
• DMEM (LLC) assisted by Technologies)
This was used.Production of mouse antibodies to human endostatin and angiostatin:
 75 μg of pES1281 or pAS1096 prepared in saline
Was injected intramuscularly and boosted on days 14 and 28. Antibody is waste
Determined by tan blotting.

【０１６２】 エンドスタチンおよびアンギオスタチンのウエスタンブロット分析：Ｃｏｓ細
胞、Ｅｃｓまたは腫瘍細胞が２．５×１０5細胞／ウエルで６穴プレートに載せ
られ、そして血清を含まないＤＭＥＭ中の２μｇのプラスミドｐＥＳ１１００、
ｐＥＳ１０６２、ｐＥＳ１２８１、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６および
３μｇのリポフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、
メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して形質移入された。上清が２４時間
後に回収され、そしてエンドスタチンまたはアンギオスタチンがマウスのモノク
ローナル抗−ＨＡおよびプロテインＡおよびＧアガロース（ベーリンガー・マン
ハイム、インディアナ州インディアナポリス）を用いて免疫沈降させられた。サ
ンプルは１２％トリス−グリシンゲルにかけられ、そしてミリポアのＰＶＤＦ膜
でエレクトロブロッティングにかけられた。モノクローナル抗−ＨＡ（ベーリン
ガー・マンハイム）、抗アンギオスタチン（ＩｇＧ（エンザイム・リサーチ・ラ
ボラトリーズ・インコーポレーテッド）または抗エンドスタチンが１：１０００
で使用され、続いて抗マウス（またはウサギ）Ｉｇ ＨＲＰ（アマシャム・ライ
フ・サイエンス）が１：１０００で使用された。レインボー分子量マーカー（ア
マシャム・ライフ・サイエンス）を使用して、タンパク質のサイズが決定された
。検出はアマシャムＥＣＬキットを用いて行なわれた。 Western blot analysis of endostatin and angiostatin : Cos cells, Ecs or tumor cells were plated at 2.5 × 10 5 cells / well in 6-well plates and 2 μg of plasmid pES1100 in serum-free DMEM. ,
pES1062, pES1281, pAS1095 or pAS1096 and 3 μg of Lipofectamine (Life Technologies, Inc.
(Gaithersburg, Md.). Supernatants were collected after 24 hours and endostatin or angiostatin was immunoprecipitated using mouse monoclonal anti-HA and protein A and G agarose (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Samples were run on a 12% Tris-glycine gel and electroblotted on a Millipore PVDF membrane. Monoclonal anti-HA (Boehringer Mannheim), anti-angiostatin (IgG (Enzyme Research Laboratories, Inc.) or anti-endostatin 1: 1000
Followed by anti-mouse (or rabbit) Ig HRP (Amersham Life Science) at 1: 1000. Protein size was determined using rainbow molecular weight markers (Amersham Life Sciences). Detection was performed using the Amersham ECL kit.

【０１６３】 アンギオスタチン／エンドスタチンＥＬＩＳＡ：上清（１ｍｌ／ウエル）が上
の形質移入細胞から採取され、そしてエンドスタチンまたはアンギオスタチンの
濃度が酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。４℃で一
晩５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（１／５００希釈）中でアフィニティー精製されたヤギ
の抗−ＰＧ（プラスミノーゲン）ＩｇＧ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッド）または抗−エンドスタチン（フォークマン・ラボ）
がＥＬＩＳＡプレート（ファルコンの柔軟性ＰＶＣ番号３９１２号）にコーティ
ングされ、そして室温で４時間、ＰＢＳ中の１５０μｌ／ウエルの２％ＢＳＡで
遮断された。上清（１００μｌ／ウエル）が添加され、そして３７℃で１時間、
インキュベートされた。ＨＢＳ−ツイーン−ＢＳＡ緩衝液（２３．８ＭのＨＥＰ
ＥＳ、５．８４ＭのＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ツイーン；ｐＨ７．２
）中で１／５００に希釈されたマウスのモノクローナル抗−ＨＡ（ベーリンガー
・マンハイム）が添加（１００μｌ／ウエル）され、そして３７℃で１時間イン
キュベートされた。ＨＢＳ−ツイーン−ＢＳＡ緩衝液で１／５００に希釈された
ペルオキシダーゼ接合抗−マウスＩｇＧ（アマシャム・ライフ・サイエンス）が
添加（１００μｌ／ウエル）され、そして３７℃で１時間インキュベートされた
。０．１％Ｈ2Ｏ2でクエン酸−リン酸緩衝液（５．２Ｍクエン酸、１３．８Ｍの
Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ５）中で希釈された１００μｌ／ウエルのＯＰＤ基質（ｏ−
フェニレンジアミン（シグマ５ｍｇ錠剤））を使用し、２〜５分間発色させた。
５０μｌ／ウエルの２．５ＭのＨ2ＳＯ4を添加することによって、反応が停止さ
れた。ＥＬ３４０マイクロプレート・リーダー（バイオ−テク・インストルメン
ツ）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。一連の２倍希釈のプラス
ミノーゲン−リシン結合部位Ｉ（シグマ）、形質移入された細胞から得られるＨ
Ａ−アンギオスタチンまたはＨＡ−エンドスタチンが標準として使用された。 動物：正常な８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂ１マウスをテキサス州ヒュ
ーストンのハーラン・ラボラトリーズから購入した。マウスは、２３℃、湿度４
０％および１２時間／１２時間の明暗サイクルで、任意のげっ歯類用飼料および
水で維持した。動物は調査の開始前の少なくとも４日間順化させた。 Angiostatin / endostatin ELISA : Supernatants (1 ml / well) were collected from the upper transfected cells and the concentrations of endostatin or angiostatin were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Goat anti-PG (plasminogen) IgG (Enzyme Research Laboratories, Inc.) or anti-endostatin (fork) affinity purified in 50 mM carbonate buffer (1/500 dilution) overnight at 4 ° C. Man Lab)
Were coated on ELISA plates (Falcon flexible PVC No. 3912) and blocked with 150 μl / well 2% BSA in PBS for 4 hours at room temperature. Supernatant (100 μl / well) is added and 1 hour at 37 ° C.
Incubated. HBS-Tween-BSA buffer (23.8 M HEP
ES, 5.84 M NaCl, 1.0% BSA, 0.1% Tween; pH 7.2
) Mouse monoclonal anti-HA (Boehringer Mannheim) diluted 1/500 in was added (100 μl / well) and incubated for 1 hour at 37 ° C. Peroxidase-conjugated anti-mouse IgG (Amersham Life Sciences) diluted 1/500 in HBS-Tween-BSA buffer was added (100 μl / well) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. 100 μl / well OPD substrate (o-diluted) in 0.1% H 2 O 2 diluted in citrate-phosphate buffer (5.2 M citric acid, 13.8 M Na 2 HPO 4 ; pH 5)
Using phenylenediamine (Sigma 5 mg tablet)), color was developed for 2-5 minutes.
The reaction was stopped by adding 50 μl / well of 2.5 M H 2 SO 4 . The absorbance at 450 nm was determined using an EL340 microplate reader (Bio-Tech Instruments). Serial two-fold dilutions of plasminogen-lysine binding site I (Sigma), H from transfected cells
A-angiostatin or HA-endostatin was used as a standard. Animals: Normal 8-week-old female BALB / c or C57b1 mice were purchased from Harlan Laboratories, Houston, Texas. The mouse is 23 ° C, humidity 4
Maintained on any rodent diet and water at 0% and a 12 hour / 12 hour light / dark cycle. Animals were acclimated for at least 4 days before the start of the study.

【０１６４】 腫瘍成長および治療の生体内での評価： ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂ１マウスは、特定数の細胞を含んだ３０μμｌの
単独細胞懸濁液を用いて、左わき腹中央部の皮下でテストされた。腫瘍サイズが
およそ１０ｍｍ3に達してから７日後、エンドスタチン／ＰＶＰまたはＥＰ／Ｐ
ＶＰでの処置が開始され、１〜２日間隔で２週間（総数８回処置：４／週）繰返
された。腫瘍体積は２つの垂直径および深さについて電気カリパスで測定された
。腫瘍マス（ｍｍ3）の測定は週二回で４０〜５０日間実施された。１ｃｍ3の体
積を越える腫瘍マスを有する全てのマウスは動物愛護の観点から安楽死させた。
腫瘍成長に対するエンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子療法の効果につ
いてのデータは繰返し測定分析によって分析された。主要な効果が明らかである
場合、個々の治療手段がダンカンの多重範囲試験を用いて比較された。腫瘍拒絶
におけるエンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子療法の効果についてのデ
ータがＡＮＯＶＡによって分析した。全ての場合に、０．０５未満のｐ値は統計
的に有為であると考えられた。In vivo evaluation of tumor growth and treatment : BALB / c or C57b1 mice were tested subcutaneously in the middle left flank with 30 μl of a single cell suspension containing a specific number of cells. . Seven days after the tumor size reaches approximately 10 mm 3 , endostatin / PVP or EP / P
Treatment with VP was started and repeated at 1-2 day intervals for 2 weeks (total of 8 treatments: 4 / week). Tumor volume was measured with electric calipers for two perpendicular diameters and depths. Tumor measurements trout (mm 3) was performed in twice a week 40-50 days. All mice with tumor masses exceeding a volume of 1 cm 3 were euthanized for animal welfare.
Data on the effects of endostatin or angiostatin gene therapy on tumor growth were analyzed by repeated measures analysis. Where main effects were evident, individual treatment modalities were compared using Duncan's multiple range test. Data on the effects of endostatin or angiostatin gene therapy on tumor rejection were analyzed by ANOVA. In all cases, p-values less than 0.05 were considered statistically significant.

【０１６５】 肺転移および治療の生体内での評価： １００μＬのＨＢＳＳ（ハンクスの均衡塩溶液、Ｃａ++またはＭｇ++、ライフ
・テクノロジーズ）中の３×１０5Ｒｅｎｃａ細胞を尾部静脈に注射することに
よって、肺転移がマウスで樹立された。動物は１５０ワットのランプを用いて暖
められ、そして尾部静脈注射前にマウス抑制器に入れられた。腫瘍注射の４また
は７日後、週一回、２〜３週間にわたって、エンドスタチン／ＤＣ、アンギオス
タチン／ＤＣまたはＥＰ／Ｄコンスがマウスに静脈注射された。肺は、２２ゲー
ジの強制栄養供給針を用いて、１〜２ｍＬの墨汁溶液（１５０ｍＬの滅菌Ｈ2Ｏ
、３０ｍＬ墨汁、４滴の水酸化アンモニウム）が噴霧され、その後、少なくとも
２４時間、フェケテの溶液（９０ｍＬホルムアルデヒド、３７％溶液、９００ｍ
Ｌの７０％ＥｔＯＨ、４５ｍＬ氷酢酸）で固定された。解剖用顕微鏡下で転移が
計数された。生存データがカプラン−ミールの対数段階試験を用いて分析された
。全ての他のデータはウインドウズ・ソフトウエア（データモスト・コーポレー
ション、ユタ州サンディ）用のスタットモスト（StatMost）におけるニューマン
−キール試験を使用して分析された。データはｐ値が＜０．０５である場合に統
計的に有為であると考えられた。In Vivo Evaluation of Lung Metastasis and Treatment : 3 × 10 5 Renca cells in 100 μL of HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Ca ++ or Mg ++ , Life Technologies) are injected into the tail vein. Thereby, lung metastases were established in mice. Animals were warmed using a 150 watt lamp and placed in a mouse suppressor prior to tail vein injection. Mice were injected intravenously with endostatin / DC, angiostatin / DC or EP / D cons, once or twice a week for 4 or 7 days after tumor injection. Lungs were prepared using a 22 gauge gavage needle and 1-2 mL of ink solution (150 mL of sterile H 2 O).
, 30 mL of ink, 4 drops of ammonium hydroxide) and then sprayed with a solution of Fekete (90 mL formaldehyde, 37% solution, 900 ml) for at least 24 hours.
L 70% EtOH, 45 mL glacial acetic acid). Metastases were counted under a dissecting microscope. Survival data were analyzed using a Kaplan-Mir log scale test. All other data was analyzed using the Newman-Keel test on StatMost for Windows Software (DataMost Corporation, Sandy, UT). Data was considered statistically significant when p-value was <0.05.

【０１６６】 ＬＬＣモデル：皮下腫瘍（直径８−１２ｍｍ）が無菌で切除された。全ての壊
死ゾーンが除去され、そして生育可能な組織が微塵切りにされ、そしてコラーゲ
ン（Ｉ型、２００Ｕ／ｍｌ）およびデオキシリボヌクレアーゼ（２７０Ｕ／ｍｌ
）（シグマ・ケミカル・カンパニ、ミズーリー州セントルイス）で分離された。
細胞は助剤でＤＭＥＤに懸濁され、そして５−１０×１０6の生育可能な細胞／
Ｔ１７５フラスコに載せられた。３時間接着後、培養物は洗浄され、そして新た
な培地が付与された。４８時間後、接着性腫瘍細胞を簡潔なトリプシン分解によ
って回収し、培地で一回洗浄し、そしてＨＢＳＳに再懸濁させた。０．１ｍｌの
ＨＢＳＳ中のアリコート量の１０６細胞が皮下に注射された。腫瘍が直径１２〜
１５であるとき、マウスはメトキシフルランで麻酔された。１群のマウス中の腫
瘍が手術で削り取られ、そしてその部分が金属で閉じられた。他の群のマウスは
擬似手術が施され、ｓｃ腫瘍がそのまま残された。マウスを、毎日監視し、そし
て手術の１０〜１４日後に殺された。肺が計量され、そして上記のように染色さ
れた。 筋肉注射および電気穿刺：２００〜３００μｇのＤＮＡ／ＰＶＰ（３ｍｇ／ｍ
ｌ）が１匹のマウスの脚の脛側（２５μｌ）および排腹筋（５０μｌ）に注射さ
れ、注射の２分後に、その注射された脚に電気穿刺（５００Ｖ／ｃｍ、４パルス
で９６ｕｓｅｃ）が行われた。 LLC model : subcutaneous tumors (8-12 mm diameter) were aseptically excised. All necrotic zones were removed, and viable tissue was minced and collagen (Type I, 200 U / ml) and DNase (270 U / ml)
) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
The cells are suspended in DMED with the aid of 5-10 × 10 6 viable cells /
Placed in a T175 flask. After 3 hours of attachment, the culture was washed and fresh medium was applied. Forty-eight hours later, adherent tumor cells were harvested by brief trypsin digestion, washed once with medium and resuspended in HBSS. An aliquot of 106 cells in 0.1 ml HBSS was injected subcutaneously. Tumor is 12 ~
At 15, mice were anesthetized with methoxyflurane. The tumor in one group of mice was surgically scraped off and the area was closed with metal. The other group of mice underwent sham operation, leaving the sc tumor intact. Mice were monitored daily and sacrificed 10-14 days after surgery. Lungs were weighed and stained as described above. Intramuscular injection and electropuncture : 200-300 μg DNA / PVP (3 mg / m
l) was injected into the shin side (25 μl) and degastric muscle (50 μl) of the leg of one mouse, and two minutes after injection, the injected leg was electropunctured (500 V / cm, 96 usec with 4 pulses). It was conducted.

【０１６７】 組織学的分析：ＣＤ−３１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＭＡＣ−１免疫染色について：
凍結切片が５μＭで切断され、そしてその後、続いて室温で１０分間にわたって
アセトンで固定された。免疫組織化学がアビジン・ビオチン法を利用して達成さ
れた。室温で１０分間にわたって１％Ｈ2Ｏ2溶液で切片をインキュベートするこ
とによって、内因性ペルオキシダーゼを急冷した。非特異的結合はパワーブロッ
ク（PowerBlock）（カタログ番号ＨＫ０８５−５Ｋ、バイオジェネックス（Biog
enex）、米国カリフォルニア州サンラモン）を用いて室温で５分間インキュベー
ションすることによって遮断された。その後、切片は一次抗体の適切な希釈を用
いて室温で１時間にわたってインキュベートされた。ＰＢＳでの洗浄に続いて、
二次抗体、ビオチニル化抗−ラット（カタログ番号ＢＡ−４００１、ベクター・
ラボラトリーズ（Vector Laboratories）、米国カリフォルニア州バーリンゲー
ム）が１：４００の割合で添加され、そして切片が室温で１時間インキュベート
された。ＰＢＳでの洗浄に続いて、ベクタスタイン試薬（カタログ番号ｐｋ−６
００１、ベクター・ラボラトリーズ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）が
１：８０の希釈で添加し、そして切片が室温で１時間インキュベートされた。３
，３−ジアミノベンズイジン（安定なＤＡＢ、カタログ番号７５０１１８号、リ
サーチ・ジェネティックス（Research Genetics）、米国アラバマ州ハンツビル
）をクロマゲンとして使用した。使用した一次抗体は全てのラットの抗マウスモ
ノクローナル抗体であった。抗体および希釈は、ＣＤ３（カタログ番号１９９１
４−Ｄ１９、ジブコ、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）１：２５０、ＣＤ
４（カタログ番号３８０２２０号、セイカガク・アメリカ・インコーポレーテッ
ド、米国メリーランド州ジャムスビル）１：１０，０００、ＭＡＣ−１（カタロ
グ番号ＣＬ８９４１ＡＰ、シーダー・レーン・ラボラトリーズ・リミテッド（Ce
dar Lane Laboratories, LTD）、米国ニューヨーク州ウエストベリー）１：１０
０、ＣＤ３１（カタログ番号０９５１Ｄ号、ファルミンゲン（Pharmingen）、米
国カリフォルニア州サンディエゴ）１：８００であった。 アポトーシスの細胞がアポップタグ・インサイチュー（apopTag inSitu）アポ
トーシス検出キット（カタログ番号Ｓ７１００−ＫＩＴ、オンカー（Oncor）、
米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）を利用して検出された。ジゴキシゲニン
−ヌクレオチドの残渣が末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによ
って触媒としてＤＮＡに添加された。 ＰＣＮＡ免疫染色がマウス・ツー・マウスＨＲＰキット（カタログ番号ＭＴＭ
００１号、サイテック（Scytek）、米国ユタ州ローガン）およびそれに続く製造
業者の指示を利用して達成された。１：１０，０００の希釈でのＰＣＮＡ抗体（
カタログ番号３２２５１号、ファルミンゲン、米国カリフォルニア州サンディエ
ゴ）。 Histological analysis : For CD-31, CD3, CD4, MAC-1 immunostaining:
Frozen sections were cut at 5 μM and then subsequently fixed with acetone for 10 minutes at room temperature. Immunohistochemistry was achieved utilizing the avidin-biotin method. Endogenous peroxidase was quenched by incubating the sections with a 1% H 2 O 2 solution at room temperature for 10 minutes. Non-specific binding was performed using PowerBlock (Cat. No. HK085-5K, Biogenex (Biog
enex), San Ramon, Calif.) for 5 minutes at room temperature. The sections were then incubated for 1 hour at room temperature with the appropriate dilution of the primary antibody. Following washing with PBS,
Secondary antibody, biotinylated anti-rat (catalog number BA-4001, vector
Laboratories (Vector Laboratories, Burlingame, CA) were added at a ratio of 1: 400, and the sections were incubated for 1 hour at room temperature. Following washing with PBS, the Vectorstein reagent (catalog number pk-6)
001, Vector Laboratories, Burlingame, CA) was added at a dilution of 1:80 and sections were incubated for 1 hour at room temperature. 3
, 3-Diaminobenzidin (stable DAB, catalog no. 750118, Research Genetics, Huntsville, Ala., USA) was used as the chromagen. The primary antibodies used were all rat anti-mouse monoclonal antibodies. Antibodies and dilutions were CD3 (catalog number 1991).
4-D19, Jibco, Gaithersburg, MD) 1: 250, CD
4 (Cat. No. 380220, Seikagaku America, Inc., Jamsville, MD, USA) 1: 10,000, MAC-1 (Cat. No. CL8941AP, Cedar Lane Laboratories Limited (Ce)
dar Lane Laboratories, LTD), Westbury, NY, USA 1:10
0, CD31 (catalog number 0951D, Pharmingen, San Diego, CA, USA) at 1: 800. Apoptotic cells are apopTag in Situ apoptosis detection kit (catalog number S7100-KIT, Oncor,
(Gaithersburg, Maryland, USA). The residue of digoxigenin-nucleotide was added to the DNA as a catalyst by terminal deoxynucleotidyl transferase. PCNA immunostaining is mouse-to-mouse HRP kit (Cat.
001 (Scytek, Logan, Utah, USA) and subsequent manufacturer's instructions. PCNA antibody at a dilution of 1: 10,000 (
Catalog No. 32251, Pharmingen, San Diego, California, USA).

【０１６８】 抗血管形成アッセイ：ＥＣ増殖アッセイの生体外での阻害は以下のとおり行わ
れた。５，０００細胞のヒト肺微細血管の内皮細胞（ＨＬＭＥＣ）がゼラチン化
した９６穴培養プレートに載せられ、そして成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する１
００ｕｌ ＨＬＭＥＣ培地中で２４時間、インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2
）された。培地は形質移入細胞から８０ｕｌのエンドスタチン含有またはアンギ
オスタチン含有の上清に交換された。２０分のインキュベート後、２０ｕｌのＨ
ＬＭＥＣ培地が添加された。７２時間後、ＷＳＴ−１アッセイ（ベーリンガー）
によって細胞数が分析された。 生体内での新生血管形成がマウス角膜で分析された。＜１ｕｌ（アルミニウム
ショ糖硫酸塩；シグマ）のヒドロンペレット（ヒドロン（Hydoron）；インター
フェロン・サイエンス（Interferon Science））が１μｇ／ｍｌでｂＦＧＦを含
有するように調製され、そしてＣ５７ｂ１マウスの０．３〜０．５ｍｍの角膜に
縁郭から移殖された。翌日、ＤＮＡ／ＰＶＰが筋肉内へ注射されるか、またはＤ
ＮＡ／ＤＣが静脈へ注射された。移殖の３、４および５日後に、スリット−ラン
プ顕微鏡で血管形成が評価された。５日目に、最大限の血管形成が達成された。
エンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子薬による血管形成の阻害が対照ベ
クターと比較することによって試験された。 Anti-angiogenic assay : In vitro inhibition of the EC proliferation assay was performed as follows. 5,000 human lung microvascular endothelial cells (HLMEC) are plated on a gelatinized 96-well culture plate and contain growth factor (bFGF) 1
Incubate at 37 ° C., 5% CO 2 in 00ul HLMEC medium
) Was. The medium was replaced with 80 ul of endostatin-containing or angiostatin-containing supernatant from transfected cells. After 20 minutes incubation, 20 ul of H
LMEC medium was added. After 72 hours, WST-1 assay (Boehringer)
Was analyzed for cell number. In vivo neovascularization was analyzed in the mouse cornea. <1 ul (aluminum sucrose sulfate; sigma) hydron pellet (Hydoron; Interferon Science) was prepared to contain bFGF at 1 μg / ml and 0.3 of C57b1 mice. Transplanted from the limbus to a ０．５0.5 mm cornea. The next day, DNA / PVP is injected intramuscularly or D
NA / DC was injected intravenously. Angiogenesis was evaluated at 3, 4 and 5 days after transfer by slit-lamp microscopy. On day 5, maximal angiogenesis was achieved.
The inhibition of angiogenesis by endostatin or angiostatin gene drugs was tested by comparing to control vectors.

【０１６９】 結果 エンドスタチンおよびアンギオスタチンについての発現プラスミドの構築：エ
ンドスタチンまたはアンギオスタチン（ｋ１〜ｋ３）についてのコーディング配
列がコラーゲン１８ａ（エンドスタチン前駆体）およびプラスミノーゲン（アン
ギオスタチン前駆体は肝臓に豊富である）から肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＰ
ＣＲ増幅された。アンギオスタチンおよびエンドスタチンがそれらの自然の分泌
配列を欠く内部断片であり、そしてアンギオスタチンまたはエンドスタチンに対
する入手可能な市販の抗体がないという事情により、インフルエンザ・ヘマグル
チニンタンパク質から得られる９ａａであるＨＡエピトープをアンギオスタチン
またはエンドスタチンのＮ末端にタグ付けすることによって、このペプチドに対
する抗体を検出用に使用することができる。Ｉｇ−カッパ・シグナルペプチドは
、融合タンパク質の分泌を指示するために、ＨＡ−アンギオスタチンまたはエン
ドスタチンの上流に添加される。ＨＡ−タグ付マウスエンドスタチン（ｍＥ、ｐ
ＥＳ１１００）、ＨＡ−不含マウスのエンドスタチン（ｍＥ−ＨＡ―、ｐＥＳ１
０６２）、ＨＡ−ヒト・エンドスタチン（ｈＥ、ｐＥＳ１２８１）、ＨＡ−ヒト
・アンギオスタチンｋ１−ｋ４（ｈＡｋ４）、ＨＡ−アンギオスタチンｋ１〜ｋ
３（ｈＡｋ３、ｐＡＳ１０９６）についての発現プラスミドが構築された。そし
て、その地図が図１に示された。[0169]result  Construction of expression plasmids for endostatin and angiostatin: D
Coding scheme for ndostatin or angiostatin (k1-k3)
Rows show collagen 18a (endostatin precursor) and plasminogen (anne).
Gyostatin precursor is abundant in the liver) from liver cDNA library to P
CR amplified. Angiostatin and endostatin are their natural secretions
An internal fragment lacking the sequence, and is not compatible with angiostatin or endostatin.
Due to the lack of commercially available antibodies available
An angiostatin, a 9aa HA epitope derived from the ninin protein
Alternatively, tagging this peptide by tagging the N-terminus of endostatin
Antibodies can be used for detection. The Ig-kappa signal peptide is
HA-angiostatin or enzyme to direct secretion of the fusion protein
It is added upstream of dostatin. HA-tagged mouse endostatin (mE, p
ES1100), HA-free mouse endostatin (mE-HA―, PES1
062), HA-human endostatin (hE, pES1281), HA-human
-Angiostatin k1-k4 (hAk4), HA-angiostatin k1-k
An expression plasmid for 3 (hAk3, pAS1096) was constructed. Soshi
The map is shown in FIG.

【０１７０】 生物活性エンドスタチンおよびアンギオスタチンの発現：それらの発現を評価
するために、発現プラスミドがｃｏｓ−１細胞、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ま
たはＲｅｎｃａ腫瘍細胞に形質移入される。移入遺伝子の発現が、ＲＴ−ＰＣＲ
によって細胞内のｍＲＮＡについて試験され、また、ウエスタンブロッティング
によって培地中のタンパク質について試験された（図２）。結果は、エンドスタ
チンおよびアンギオスタチンが示された通りの正しいサイズで転写されたこと、
および分断しそこなった産物が検出されなかったことを示した。組換えタンパク
質が、２２ＫＤ（ＨＡ−ｍＥ）、２１ＫＤ（ｍＥ）、２０ＫＤ（ＨＡ−ｈＥ）ま
たは３０ＫＤ（ＨＡ−ｈＡｋ３）のおよその分子量を有する単一バンドとして存
在した。タンパク質発現が−エンドスタチンまたはプラスミノーゲン抗体および
抗−ＨＡエピトープ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡで定量的に評価された。結果は、
ｍＥおよびｈＡｋ３が培養培地中で約４ｎｇ／ｍｌであることを示した。ｈＡｋ
３はｈＡｋ４より高いレベルで発現された。抗−エンドスタチン抗体を用いたウ
エスタンブロッティングによって、ｍＥ−ＨＡ―発現が測定された。エンドスタ
チンおよびアンギオスタチンを含む調整培地は内皮細胞増殖に対して強力な阻害
効果を示した。 Expression of bioactive endostatin and angiostatin : To evaluate their expression, expression plasmids are transfected into cos-1 cells, human endothelial cells (HUVEC) or Renca tumor cells. Expression of the transferred gene is determined by RT-PCR
Was tested for intracellular mRNA and for proteins in the medium by Western blotting (FIG. 2). The result was that endostatin and angiostatin were transcribed at the correct size as shown,
And no missed product was detected. The recombinant protein was present as a single band with an approximate molecular weight of 22 KD (HA-mE), 21 KD (mE), 20 KD (HA-hE) or 30 KD (HA-hAk3). Protein expression was quantitatively assessed by ELISA using -endostatin or plasminogen antibodies and anti-HA epitope antibodies. Result is,
mE and hAk3 were shown to be about 4 ng / ml in the culture medium. hAk
3 was expressed at a higher level than hAk4. ME-HA - expression was measured by Western blotting with an anti-endostatin antibody. Conditioned media containing endostatin and angiostatin showed a strong inhibitory effect on endothelial cell proliferation.

【０１７１】 生体内発現 腫瘍内注射：２４ｕｇのＤＮＡ／ＰＶＰが腫瘍内で注射され、そして腫瘍を２
４時間で回収された。エンドスタチンまたはアンギオスタチンのタンパク質発現
がＥＬＩＳＡによって測定された。腫瘍培養用培地もエンドスタチンおよびアン
ギオスタチンの生物活性について試験された。 筋肉内送達：４００−４２０μｇのＤＮＡ／ＰＶＰが筋肉内に注射され、続い
て電気穿刺が行われた（材料および方法参照）。血清が２、５および１０日に収
集された。データは、血清中の３〜５ｎｇ／ｍｌのエンドスタチンまたは１０−
１５ｎｇ／ｍｌのアンギオスタチンが５日目に産生され、そして電気穿刺によっ
て移入遺伝子のレベルが３〜５倍まで増大することを示した。発現は１０日目に
減少した。 血管内送達：ＤＯＴＭＡ：ｃｈｏｌ調製されたエンドスタチンまたはアンギオ
スタチン発現プラスミドが正常マウスに静脈注射された。エンドスタチンおよび
アンギオスタチンの発現が肺中のｍＲＮＡについてはＲＴ−ＰＣＲによって測定
され、そして血清中のタンパク質発現についてはＥＬＩＳＡによって測定された
。４００ｎｍサイズの粒子は高率で発現を生じ、また、ＳＵＶ調製よりさらに多
い二次サイトカイン効果を示しうる（生体内の有効性参照）。In Vivo Intratumoral Injection : 24 ug DNA / PVP is injected intratumorally and the tumor
Collected in 4 hours. Endostatin or angiostatin protein expression was measured by ELISA. Tumor culture media was also tested for the biological activity of endostatin and angiostatin. Intramuscular delivery : 400-420 μg DNA / PVP was injected intramuscularly, followed by electropuncture (see Materials and Methods). Serum was collected on days 2, 5 and 10. Data are from 3-5 ng / ml endostatin or 10-ng in serum.
15 ng / ml angiostatin was produced on day 5 and showed that electropuncture increased transgene levels by a factor of 3-5. Expression decreased on day 10. Intravascular delivery : DOTMA: chol prepared endostatin or angiostatin expression plasmid was injected intravenously into normal mice. Endostatin and angiostatin expression was measured by RT-PCR for mRNA in the lung and protein expression in serum by ELISA. 400 nm sized particles give rise to high rates of expression and may also show more secondary cytokine effects than SUV preparations (see in vivo efficacy).

【０１７２】 生体内での有効性：エンドスタチンの生体内での抗腫瘍活性を評価する３つの
アプローチは、以下に記載されるとおり、腫瘍内注射によるｓｃ腫瘍、筋肉内注
射によるｓｃ腫瘍および全身送達（静脈内および筋肉内）による肺腫瘍モデルで
ある。これらの３つのモデルから得られるデータが以下に要約されている。 腫瘍内注射でのＲｅｎｃａのｓ．ｃ．腫瘍モデル：４回／週の割合で二週間（
総計７回の処置）にわたって２４μｇのエンドスタチン遺伝子／ＰＶＰを腫瘍内
投与することによって、１４匹のネズミのうち７匹で完全な抑制が誘導された（
５０％抑制率、ｐ＜０．０５）。生存率は、２１日目で、ベクター／ＰＶＰ群に
おける２１％（３／１４）からエンドスタチン／ＰＶＰ群における７８％（１１
／１４）へと増大した。ＨＡ−タグを有するヒト・エンドスタチンが構築された
。ヒト・エンドスタチン／ＰＶＰの腫瘍内注射によって、Ｒｅｎｃａのｓｃ腫瘍
モデルにおける５１％腫瘍成長阻害が得られた。 エンドスタチン遺伝子薬によって抑制された腫瘍は２９日までに顕微鏡的潜伏
状況のままであるが、腫瘍潜伏性を維持するためには、組換えタンパク質を用い
た６サイクルの治療（各サイクル２７日間について４００μｇ／マウス／日）が
必要とされる（Ｂｏｅｈｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０巻、４０４−７頁）。ここ
に表されるデータは、エンドスタチン遺伝子薬がマウスの腫瘍モデルで強力な抗
腫瘍活性を示すこと、および組換えタンパク質に比べてさらに多くの利点を示す
ことを明らかに示している。エンドスタチン／ＰＶＰ処置による抑制中の腫瘍の
組織学的分析は、血管形成（ＣＤ３１染色）が３〜５倍減少されること、腫瘍ア
ポトーシス（ＴｄＴ免疫染色）が３倍増加されることを示した。腫瘍増殖（ＰＣ
ＮＡ染色）および腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ３、ＣＤ４およびＭａｃ−１染色）に
は変化はない。In Vivo Efficacy : Three approaches to evaluate the in vivo antitumor activity of endostatin, as described below, sc tumors by intratumoral injection, sc tumors by intramuscular injection, and systemic Lung tumor model by delivery (intravenous and intramuscular). The data obtained from these three models is summarized below. Renca s. In intratumoral injection. c. Tumor model : 4 times / week for 2 weeks (
Intratumoral administration of 24 μg of the endostatin gene / PVP over a total of 7 treatments induced complete suppression in 7 of 14 rats (
50% inhibition, p <0.05). Survival rates range from 21% (3/14) in the vector / PVP group to 78% (11/11) in the endostatin / PVP group at day 21.
/ 14). Human endostatin with an HA-tag has been constructed. Intratumoral injection of human endostatin / PVP resulted in 51% tumor growth inhibition in Renca sc tumor model. Tumors suppressed by the endostatin gene drug remain microscopically latent by day 29, but to maintain tumor latency, six cycles of treatment with recombinant protein (27 days each cycle) 400 μg / mouse / day) are required (Boehm et al., Nature 390, 404-7). The data presented here clearly demonstrate that endostatin gene drugs show potent anti-tumor activity in mouse tumor models and show even more advantages over recombinant proteins. Histological analysis of tumors during suppression by endostatin / PVP treatment showed a 3- to 5-fold decrease in angiogenesis (CD31 staining) and a 3-fold increase in tumor apoptosis (TdT immunostaining). . Tumor growth (PC
NA staining) and tumor infiltrating lymphocytes (CD3, CD4 and Mac-1 staining) remain unchanged.

【０１７３】 全身送達でのＲｅｎｃａのｓ．ｃ．腫瘍：１２０μｇのエンドスタチン／ＰＶ
Ｐの筋肉内注射に続いて電気穿刺（週２×、脚を換える）によって、４０％のＲ
ｅｎｃａ腫瘍注入が誘起された。退縮している腫瘍は血管形成を減少させた。反
復実験により、３４％の腫瘍成長阻害および延命効果が示された。 しかし、全体として腫瘍成長が５０〜６０％減少することが観察されたが、ベ
クターまたはエンドスタチン／ＤｏCｍａ：ｃｈｏｌ（ＳＵＶ、３０μｇ／週２
×）の血管内送達によっては遺伝子特異的効果は示されなかった。他の脂質を使
用することによって、結果の改善が予想される。 Renca's s. c. Tumor : 120 μg endostatin / PV
Intramuscular injection of P followed by electropuncture (2x week, changing legs) to 40% R
Enca tumor injection was induced. Regressing tumors reduced angiogenesis. Repeat experiments have shown a 34% tumor growth inhibition and survival benefit. However, an overall 50-60% reduction in tumor growth was observed, but with vector or endostatin / DoCma: chol (SUV, 30 μg / week 2).
No gene-specific effects were shown by intravascular delivery of ×). The use of other lipids is expected to improve results.

【０１７４】 全身送達での肺転移モデル：４００ｎｍ粒子中の１５μｇＤＮＡでのＩＬ−１
２は延命効果を誘起することが示された。エンドスタチン、アンギオスタチンが
遺伝子薬の静脈内送達または筋肉内送達によって延命効果を発揮できるかどうか
について、現在を調査されている。 ＬＬＣはｓｃ原発性腫瘍が切除されるときに肺に転移しうる。この肺転移モデ
ルは抗血管形成性遺伝子薬によって肺転移の阻害効果を評価するために樹立され
る。 マウスの角膜アッセイ：マウスの角膜血管形成がｂＦＧＦペレットを移植する
ことによって誘導された。翌日、エンドスタチン遺伝子薬がＤＮＡ／ＤＣまたは
ＤＮＡ／ＰＶＰのいずれかが静脈注射によって送達された（材料および方法参照
）。結果は、静脈注射によるエンドスタチンは５日目までにｂＦＧＦで誘導され
た角膜血管形成を強力に阻害することを示した。 Lung metastasis model for systemic delivery : IL-1 at 15 μg DNA in 400 nm particles
2 was shown to induce a life extension effect. It is currently being investigated whether endostatin, angiostatin, can exert a life-prolonging effect by intravenous or intramuscular delivery of gene drugs. LLC can metastasize to the lung when the sc primary tumor is resected. This lung metastasis model is established to evaluate the inhibitory effect of lung metastases by anti-angiogenic drugs. Mouse corneal assay : Mouse corneal angiogenesis was induced by implanting bFGF pellets. The next day, the endostatin gene drug was delivered by intravenous injection of either DNA / DC or DNA / PVP (see Materials and Methods). The results showed that endostatin by intravenous injection potently inhibited bFGF-induced corneal angiogenesis by day 5.

【０１７５】 新たな抗血管形成遺伝子：エンドスタチンおよびアンギオスタチンが別々の転
写単位によって起動されるエンドスタチン−アンギオスタチンについての二重防
壁の発現プラスミド（ｐＡＳ１２５４）も構築された。 ＩＰ−１０、インターフェロン誘導因子１０は強力なキモカインであるととも
に抗血管形成因子である。トロンボスポジン−１（ＴＳＰ−１）、ＥＣ表面上の
ｐ５３で誘導される糖タンパク質はアンギオスタチンの強力な阻害剤である。内
部断片（ＴＳＰｆ）はその活性のために必須である。ＩＰ−１０ｃＤＮＡが最適
なヒト化コドンを有する公表されたタンパク質配列から逆転写された。ｃＤＮＡ
がオペロンによって合成され、ＩＰ−１０（ｐＩＰ−１３１６）についての発現
プラスミド、ＩＰ−１０／エンドスタチン融合タンパク質（ｐＩＰ１３１１）お
よびＩＰ−１０／ＴＳＰｆ融合タンパク質が構築された。ＩＰ−１０の発現プラ
スミド、ＩＰ−１０／ｈＥ融合タンパク質およびＩＰ−１０／ＴＳＰｆ融合タン
パク質がｍＲＮＡについてはＲＴ−ＰＣＲによって測定され、タンパク質につい
てはウエスタンブロッティングで測定された。約１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌタン
パク質が培養用培地で発現された。これらのコンストラクトは、同遺伝子型の抗
腫瘍有効性が達成され得るかどうかを知るために、Ｒｅｎｃａのｓｃモデルで試
験される。A new anti-angiogenic gene : a double barrier expression plasmid (pAS1254) for endostatin-angiostatin in which endostatin and angiostatin are activated by separate transcription units was also constructed. IP-10, an interferon-inducing factor 10, is both a potent chemokine and an anti-angiogenic factor. Thrombosporin-1 (TSP-1), a p53-induced glycoprotein on the EC surface, is a potent inhibitor of angiostatin. The internal fragment (TSPf) is essential for its activity. IP-10 cDNA was reverse transcribed from the published protein sequence with optimal humanized codons. cDNA
Was synthesized by the operon to construct an expression plasmid for IP-10 (pIP-1316), an IP-10 / endostatin fusion protein (pIP1311) and an IP-10 / TSPf fusion protein. The expression plasmid of IP-10, the IP-10 / hE fusion protein and the IP-10 / TSPf fusion protein were measured by RT-PCR for mRNA and by Western blotting for the protein. Approximately 150-250 ng / ml protein was expressed in the culture medium. These constructs are tested in the Renca sc model to see if the antitumor efficacy of the genotype can be achieved.

【０１７６】 当業者であれは、本発明がその目的を達成して記載された結果および利点を得
るとともにそこで固有のものを獲得するのに極めて適していることを容易に理解
できよう。ここに記載されている分子複合体および方法、手段、処置、分子、特
定化合物は現時点における代表的な好ましい実施の形態であり、発明の範囲を制
限するものと解されるべきものではない。当業者によって行われるであろう変更
および他の使用形態は特許請求項の範囲によって限定される本発明の範囲に包含
されるものである。 当業者にとっては明らかなことであるが、ここに開示されている発明に対して
は、発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々に変更および修正を加える
ことが可能である。 明細書に開示している全ての特許および公開公報は、本発明に関係する当業者
のレベルを示すものである。全ての特許および公開公報はここにおいてそのまま
文献援用されており、それらの開示内容はそれぞれ本質的にここに開示されてい
るものとして扱われる。Those skilled in the art will readily appreciate that the present invention is well suited to achieve its objects and achieve the described results and advantages, as well as gain uniqueness therein. The molecular complexes and methods, means, treatments, molecules, and specific compounds described herein are presently preferred embodiments and should not be construed as limiting the scope of the invention. Modifications and other uses that will be made by those skilled in the art are intended to be within the scope of the invention as defined by the appended claims. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the invention. All patents and publications disclosed in the specification are indicative of the levels of those skilled in the art to which the invention pertains. All patents and publications are herein incorporated by reference in their entirety, and the disclosures of each are treated as if essentially disclosed herein.

【０１７７】 ここに例示的に記載されている発明は、任意の単一または複数の要素やここに
開示されていない単一又は複数の限定のない態様において適宜に実施可能である
。したがって、例えば、ここにおけるそれぞぞれの場合において、「有する」、
「実質的に〜から成る」および「〜から成る」という用語はそれぞれ他の２つの
用語のいずれかと置換可能である。使用されている用語および表現は、限定を伴
わない記述用語として使用され、これらの用語および表現の使用は記載された特
性と同等の特性またはその一部を排除することを意図するものではなく、種々の
変更は主張された発明の範囲に包含され得るもの認識される。したがって、本発
明は好ましい実施の形態および選択的な特性によってその本質が開示されたが、
理解されるべき点は、ここに開示された内容の変更および修正が当業者によって
追求され得るものであり、そのような修正および変更は添付の請求の範囲におい
て限定された発明の範囲内に包含されるということである。 さらに、発明の特性または特徴がマーカッシュ形式で記載されている場合、当
業者であれば、その発明はマーカッシュグループに含まれる個々の要素またはそ
のサブグループによっても記載されることを認識するであろう。例えば、Ｘが臭
素、塩素およびヨウ素から成る群から選択されると記載されている場合、Ｘが臭
素である請求項およびＸが臭素および塩素である請求項も包含される。 他の実施の形態は以下の請求項に包含される。The invention exemplarily described herein may be suitably practiced in any single or multiple elements, and in one or more non-limiting aspects not disclosed herein. Thus, for example, in each case herein, "having",
The terms "consisting essentially of" and "consisting of" can each be replaced with either of the other two terms. The terms and expressions used are used as open ended descriptive terms, and the use of these terms and expressions is not intended to exclude an equivalent feature or a portion thereof as described. It is recognized that various modifications may be included within the scope of the claimed invention. Thus, while the present invention has been disclosed in terms of its preferred embodiments and optional features,
It is to be understood that changes and modifications in the content disclosed herein may be pursued by those skilled in the art, and such modifications and changes fall within the scope of the invention as defined in the appended claims. That is to be done. Further, where features or characteristics of the invention are described in Markush format, those of ordinary skill in the art will recognize that the invention is also described by individual elements or subgroups thereof that are included in the Markush group. . For example, if X is stated to be selected from the group consisting of bromine, chlorine and iodine, it also includes the claims where X is bromine and the claims where X is bromine and chlorine. Other embodiments are within the following claims.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ｐＥＳ１１００、ｐＥＳ１０６２およびｐＥＳ１２８１のプラスミドマップを
示す。FIG. 1 shows the plasmid maps of pES1100, pES1062 and pES1281.

【図２】 ｐＡＳ１０９５およびｐＡＳ１０９６のプラスミドマップを示す。FIG. 2 shows plasmid maps of pAS1095 and pAS1096.

【図３】 様々な内皮細胞特異的コンストラクトに関するプラスミド情報を示す。FIG. 3 shows plasmid information for various endothelial cell-specific constructs.

【図４】 ｐＬＣ１２６４のプラスミドマップを示す。FIG. 4 shows a plasmid map of pLC1264.

【図５】 本発明のプラスミドのルシフェラーゼ活性および内皮細胞特異性を示す。FIG. 5 shows luciferase activity and endothelial cell specificity of the plasmid of the present invention.

【図６】 内皮細胞性エンハンサーの多重体化手順を示す。FIG. 6 shows the procedure for multiplexing endothelial cell enhancers.

【図７】 ｐＡＳ１３５９およびｐＥＳ１３５８のプラスミドマップを示す。FIG. 7 shows plasmid maps of pAS1359 and pES1358.

【図８】 生物活性エンドスタチンの生体内発現を示す。FIG. 8 shows in vivo expression of bioactive endostatin.

【図９】 エンドスタチン／ＰＶＰがＲｅｎｃａ腫瘍を抑制することを示す。FIG. 9 shows that endostatin / PVP suppresses Renca tumors.

【図１０】 エンドスタチン／ＰＶＰがＥＣのアポトーシスを誘導することを示す。FIG. 10 shows that endostatin / PVP induces EC apoptosis.

【図１１】 筋肉内送達後の血清中におけるエンドスタチンおよびアンギオスタチンの発現
を示す。FIG. 11 shows expression of endostatin and angiostatin in serum after intramuscular delivery.

【図１２】 エンドスタチン／ＰＶＰが、筋肉内送達の後で皮下Ｒｅｎｃａ腫瘍を抑制する
ことを示す。FIG. 12 shows that endostatin / PVP suppresses subcutaneous Renca tumors after intramuscular delivery.

【図１３】 エンドスタチン／ＰＶＰが、筋肉内送達の後で皮下Ｒｅｎｃａ腫瘍を抑制する
ことを示す。FIG. 13 shows that endostatin / PVP suppresses subcutaneous Renca tumors after intramuscular delivery.

【図１４】 肺におけるエンドスタチン導入遺伝子のｍＲＮＡを示す。FIG. 14 shows mRNA of endostatin transgene in lung.

【図１５】 マウス角膜での血管形成アッセイを示す。FIG. 15 shows an angiogenesis assay in mouse cornea.

【図１６】 好ましいコドン使用表を示す。FIG. 16 shows a preferred codon usage table.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 35/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 メーレンス，ドロシー アメリカ合衆国 77386 テキサス，スプ リング，ハブロック ドライヴ 1711 (72)発明者 ラルストン，ロバート アメリカ合衆国 77381 テキサス，ザ ウッドランズ，レイク リーフ プレイス ６ (72)発明者 サリヴァン，シーン アメリカ合衆国 77381 テキサス，ザ ウッドランズ，サウス フラグストン パ ス・サークル 99 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 BA21 BA22 BA26 BA80 CA04 CA12 DA02 EA04 FA01 FA02 GA13 HA17 4B065 AA90X AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 CA44 4C076 BB11 CC27 DD48 DD70 EE16 EE51 FF11 FF68 FF70 4C084 AA02 AA13 BA01 BA22 CA17 CA18 CA25 DA27 MA05 MA16 MA66 NA13 NA14 ZB262──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 48/00 C12N 15/00 ZNAA A61P 35/00 5/00 B C12N 5/10 A61K 37/02 (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Merens, Dorothy United States 77386 Texas, Spring, Havelock Drive 1711 (72) Inventor Ralston, Robert United States 77381 Texas, The Woodlands, Lake Reef Place 6 (72) Inventor Sullivan, Scene United States 77381 Texas, The Woodlands, South Flags Compass circle 99 F term (reference) 4B024 AA01 AA10 BA21 BA22 BA26 BA80 CA04 CA12 DA02 EA04 FA01 FA02 GA13 HA17 4B065 AA90X AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 CA44 4C076 BB11 CC27 DD48 DD70 EE16 EE51 FF11 AFF18A70 BA02A CA18 CA25 DA27 MA05 MA16 MA66 NA13 NA14 ZB262

Claims (83)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 抗血管形成コード配列に転写可能に連結された組織特異的エ
レメントを有するプラスミド。1. A plasmid having a tissue-specific element transcribeably linked to an anti-angiogenic coding sequence. 【請求項２】 前記組織特異的エレメントは内皮細胞に特異的である請求項
１に記載のプラスミド。2. The plasmid according to claim 1, wherein said tissue-specific element is specific for endothelial cells. 【請求項３】 前記組織特異的エレメントはプロモーターを有する請求項１
に記載のプラスミド。3. The tissue-specific element has a promoter.
The plasmid according to 1. 【請求項４】 前記プロモーターはＥＴ−１、ｆｌｋ−１、アルファ−Ｖ、
ベータ−３、ＩＣＡＭ−２、ｃｙｃＡ、Ｅ２Ｆ１およびｃｄｃ６から成る群から
選択される請求項３に記載のプラスミド。4. The promoter of claim 1, wherein said promoter is ET-1, flk-1, alpha-V,
The plasmid of claim 3, wherein the plasmid is selected from the group consisting of beta-3, ICAM-2, cycA, E2F1 and cdc6. 【請求項５】 前記組織特異的エレメントはエンハンサーを有する請求項１
に記載のプラスミド。5. The tissue specific element has an enhancer.
The plasmid according to 1. 【請求項６】 前記エンハンサーはＣＭＶ、４コピーのＥＴ−１および７コ
ピーのＥＴ−１から成る群から選択される請求項５に記載のプラスミド。6. The plasmid of claim 5, wherein said enhancer is selected from the group consisting of CMV, 4 copies of ET-1 and 7 copies of ET-1. 【請求項７】 前記コード配列はエンドスタチン、アンギオスタチン、トロ
ンボスポンジン−１、ｐ５３、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、短縮型組織因子、イン
テグリンαｖβ３ブロッキング因子、ＶＨＬ遺伝子産物、細胞周期依存性キナー
ゼ阻害剤、ＶＥＧＦｒ、ｂＦＧＦｒ及びｂＦＧＦ結合タンパク質から成る群から
選択される産物をコードする請求項１に記載のプラスミド。7. The coding sequence comprises endostatin, angiostatin, thrombospondin-1, p53, IL-12, IFN-α, truncated tissue factor, integrin αvβ3 blocking factor, VHL gene product, cell cycle dependent kinase The plasmid of claim 1, wherein the plasmid encodes a product selected from the group consisting of an inhibitor, VEGFr, bFGFr and a bFGF binding protein. 【請求項８】 コード配列は最適なコドン使用を有する合成された配列であ
る請求項７に記載のプラスミド。8. The plasmid according to claim 7, wherein the coding sequence is a synthesized sequence having optimal codon usage. 【請求項９】 前記コード配列はプラスミドｐＥＳ１２８１、ｐＩＰ１３１
６、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６のヌクレオチド配列を有する請求項１
に記載のプラスミド。9. The coding sequence comprises the plasmids pES1281, pIP131.
6, having the nucleotide sequence of pAS1095 or pAS1096.
The plasmid according to 1. 【請求項１０】 成長ホルモンの３’非翻訳領域をさらに有する請求項１に
記載のプラスミド。10. The plasmid according to claim 1, further comprising a growth hormone 3 'untranslated region. 【請求項１１】 前記成長ホルモンの３’非翻訳領域はヒトの成長ホルモン
遺伝子からのものである請求項１０に記載のプラスミド。11. The plasmid of claim 10, wherein the 3 ′ untranslated region of growth hormone is from a human growth hormone gene. 【請求項１２】 ＡＬＵ反復配列またはＡＬＵ反復様配列が前記３’非翻訳
領域から除かれている請求項１０に記載のプラスミド。12. The plasmid of claim 10, wherein the ALU repeat or ALU repeat-like sequence has been removed from said 3 'untranslated region. 【請求項１３】 前記プラスミドは前記コード配列の発現に関して適切な関
係にあるプロモーター、ＴＡＴＡボックス、Ｃａｐ部位ならびに第１のイントロ
ンおよびイントロン／エキソン境界を含む請求項１に記載のプラスミド。13. The plasmid of claim 1, wherein said plasmid comprises a promoter, a TATA box, a Cap site and a first intron and an intron / exon boundary in proper relation for expression of said coding sequence. 【請求項１４】 前記プラスミドは前記プロモーターと前記コード配列との
間に挿入された５’ｍＲＮＡリーダー配列をさらに有する請求項１３に記載のプ
ラスミド。14. The plasmid of claim 13, wherein said plasmid further comprises a 5 'mRNA leader sequence inserted between said promoter and said coding sequence. 【請求項１５】 前記プラスミドはニワトリの骨格性α−アクチン遺伝子か
らのイントロン／５’ＵＴＲをさらに有する請求項１に記載のプラスミド。15. The plasmid of claim 1, wherein said plasmid further comprises an intron / 5'UTR from a chicken skeletal α-actin gene. 【請求項１６】 第１の転写ユニットと、第２の転写ユニットとをさらに有
し、 第１の転写ユニットが第１の５’非翻訳領域と転写可能に連結された第１の転
写制御配列、第１のイントロン、第１のコード配列および第１の３’非翻訳領域
／ポリ（Ａ）シグナルを有し、前記第１のイントロンは前記制御配列と前記第１
のコード配列との間に存在し、 第２の転写ユニットが第２の５’非翻訳領域と転写可能に連結された第２の転
写制御配列、第２のイントロン、第２のコード配列および第２の３’非翻訳領域
／ポリ（Ａ）シグナルを有し、前記第２のイントロンは前記制御配列と前記第２
のコード配列との間に存在し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列およびエン
ドスタチンのコード配列を有している請求項１に記載のプラスミド。16. A first transcription control sequence further comprising a first transcription unit and a second transcription unit, wherein the first transcription unit is transcribeably linked to a first 5 ′ untranslated region. , A first intron, a first coding sequence and a first 3 ′ untranslated region / poly (A) signal, said first intron comprising said control sequence and said first
A second transcription control sequence, a second intron, a second coding sequence and a second transcription unit, wherein the second transcription unit is transcribeably linked to the second 5 ′ untranslated region. Two 3 'untranslated regions / poly (A) signal, wherein the second intron is comprised of the control sequence and the second
The plasmid according to claim 1, wherein the first and second coding sequences have an angiostatin coding sequence and an endostatin coding sequence. 【請求項１７】 前記第１の転写制御配列または前記第２の転写制御配列は
１つまたは複数のサイトメガロウイルスプロモーター配列を有する請求項１６に
記載のプラスミド。17. The plasmid according to claim 16, wherein said first transcription control sequence or said second transcription control sequence has one or more cytomegalovirus promoter sequences. 【請求項１８】 前記第１および第２の転写制御配列は同じである請求項１
６に記載のプラスミド。18. The method of claim 1, wherein said first and second transcription control sequences are the same.
7. The plasmid according to 6. 【請求項１９】 前記第１および第２の転写制御配列は異なっている請求項
１６に記載のプラスミド。19. The plasmid of claim 16, wherein said first and second transcription control sequences are different. 【請求項２０】 前記アンギオスタチンのコード配列は前記エンドスタチン
のコード配列の５’側に存在している請求項１９に記載のプラスミド。20. The plasmid according to claim 19, wherein the coding sequence for angiostatin is 5 ′ to the coding sequence for endostatin. 【請求項２１】 可変的スプラシングを有するイントロンと、第１のコード
配列と、第２のコード配列とをさらに有し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列と、エンド
スタチンのコード配列を有する配列とを有している請求項１に記載のプラスミド
。21. An intron with variable splicing, a first coding sequence and a second coding sequence, wherein said first and second coding sequences are angiostatin coding sequence and endostatin. And a sequence having the following coding sequence: 【請求項２２】 第１のコード配列および第２のコード配列と転写可能に連
結された転写制御配列と、 ５’非翻訳領域と、 前記第１のコード配列の５’側に存在するイントロンと、 前記第１のコード配列の３’側に存在するとともに前記第２のコード配列の５
’側に存在する選択的スプラシング部位と、 ３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと、 をさらに有する請求項２１に記載のプラスミド。22. A transcription control sequence transcribeably linked to the first coding sequence and the second coding sequence, a 5 ′ untranslated region, and an intron present on the 5 ′ side of the first coding sequence. Which is 3 'of the first coding sequence and 5' of the second coding sequence
22. The plasmid of claim 21 further comprising a 'splicing site on the' side and a 3 'untranslated region / poly (A) signal. 【請求項２３】 前記転写制御配列はサイトメガロウイルスプロモーター配
列を有する請求項２２に記載のプラスミド。23. The plasmid according to claim 22, wherein the transcription control sequence has a cytomegalovirus promoter sequence. 【請求項２４】 第１のコード配列、ＩＲＥＳ配列、第２のコード配列およ
び３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと転写可能に連結された転写制御配列と
、 プロモーターと前記第１のコード配列との間に存在するイントロンと、 をさらに有し、前記ＩＲＥＳ配列は前記第１のコード配列と前記第２のコード
配列の間に存在し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列およびエン
ドスタチンのコード配列を有する請求項１に記載のプラスミド。24. A transcription control sequence transcribeably linked to a first coding sequence, an IRES sequence, a second coding sequence and a 3 ′ untranslated region / poly (A) signal, a promoter and the first coding sequence. And an intron present between the first and second coding sequences, wherein the IRES sequence is between the first coding sequence and the second coding sequence, and wherein the first and second coding sequences are angiostatin. The plasmid according to claim 1, which has a coding sequence of (1) and a coding sequence of endostatin. 【請求項２５】 前記転写制御配列はサイトメガロウイルスプロモーター配
列を有する請求項２４に記載のプラスミド。25. The plasmid according to claim 24, wherein the transcription control sequence has a cytomegalovirus promoter sequence. 【請求項２６】 前記ＩＲＥＳ配列は脳心筋炎ウイルスから得られる請求項
２４に記載のプラスミド。26. The plasmid according to claim 24, wherein said IRES sequence is obtained from encephalomyocarditis virus. 【請求項２７】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドと、保護的
な相互作用性の非凝縮性化合物とを含む組成物。27. A composition comprising the plasmid according to any one of claims 1 to 26 and a protective interacting non-condensable compound. 【請求項２８】 前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物はポリビニルピ
ロリドンである請求項２７に記載の組成物。28. The composition according to claim 27, wherein said protective interactive non-condensable compound is polyvinylpyrrolidone. 【請求項２９】 前記プラスミドは０．５％〜５０％の間のＰＶＰを有する
溶液中に存在している請求項２７に記載の組成物。29. The composition of claim 27, wherein said plasmid is in a solution having between 0.5% and 50% PVP. 【請求項３０】 前記溶液は約５％のＰＶＰを含んでいる請求項２９に記載
の組成物。30. The composition of claim 29, wherein said solution comprises about 5% PVP. 【請求項３１】 前記ＤＮＡは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であ
る請求項２７に記載の組成物。31. The composition of claim 27, wherein said DNA is at least about 80% supercoiled. 【請求項３２】 前記ＤＮＡは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であ
る請求項３１に記載の組成物。32. The composition of claim 31, wherein said DNA is at least about 90% supercoiled. 【請求項３３】 前記ＤＮＡは少なくとも約９５％がスーパーコイル状であ
る請求項３２に記載の組成物。33. The composition of claim 32, wherein said DNA is at least about 95% supercoiled. 【請求項３４】 保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、抗血管形成コー
ド配列を有するプラスミドとを有している組成物。34. A composition comprising a protective interacting non-condensable compound and a plasmid having an anti-angiogenic coding sequence. 【請求項３５】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドと、カチオ
ン性脂質とを有する組成物。35. A composition comprising the plasmid according to claim 1 and a cationic lipid. 【請求項３６】 中性の共脂質をさらに有する請求項３５に記載の組成物。36. The composition of claim 35, further comprising a neutral co-lipid. 【請求項３７】 前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである請求項３５に記載
の組成物。37. The composition according to claim 35, wherein said cationic lipid is DOTMA. 【請求項３８】 前記中性の共脂質はコレステロールである請求項３６に記
載の組成物。38. The composition of claim 36, wherein said neutral co-lipid is cholesterol. 【請求項３９】 前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチオン性脂質は負
電荷対正電荷の比が１：０．１〜１：１０の間にあるような量で存在している請
求項３５に記載の組成物。39. The method according to claim 35, wherein the DNA and the cationic lipid in the plasmid are present in an amount such that the ratio of the negative charge to the positive charge is between 1: 0.1 and 1:10. Composition. 【請求項４０】 前記比は１：０．３〜１：６の間である請求項３９に記載
の組成物。40. The composition of claim 39, wherein said ratio is between 1: 0.3 and 1: 6. 【請求項４１】 前記比は約１：３である請求項４０に記載の組成物。41. The composition of claim 40, wherein said ratio is about 1: 3. 【請求項４２】 前記ＤＮＡは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であ
る請求項３５に記載の組成物。42. The composition of claim 35, wherein said DNA is at least about 80% supercoiled. 【請求項４３】 前記ＤＮＡは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であ
る請求項４２に記載の組成物。43. The composition of claim 42, wherein said DNA is at least about 90% supercoiled. 【請求項４４】 前記ＤＮＡは少なくとも約９５％がスーパーコイル状であ
る請求項４３に記載の組成物。44. The composition of claim 43, wherein said DNA is at least about 95% supercoiled. 【請求項４５】 等張性の炭水化物溶液をさらに有する請求項３５に記載の
組成物。45. The composition of claim 35, further comprising an isotonic carbohydrate solution. 【請求項４６】 前記等張性の炭水化物溶液は実質的には約１０％のラクト
ースから成る請求項４５に記載の組成物。46. The composition of claim 45, wherein said isotonic carbohydrate solution consists essentially of about 10% lactose. 【請求項４７】 前記カチオン性脂質および前記中性の共脂質は１００ナノ
メートル〜１，０００ナノメートルの間の押出しサイズを有するリポソームとし
て調製される請求項３６に記載の組成物。47. The composition of claim 36, wherein said cationic lipid and said neutral co-lipid are prepared as liposomes having an extruded size between 100 nanometers and 1,000 nanometers. 【請求項４８】 前記サイズは２００ナノメートル〜９００ナノメートルの
間である請求項４７に記載の組成物。48. The composition of claim 47, wherein said size is between 200 nanometers and 900 nanometers. 【請求項４９】 前記サイズは約４００ナノメートルである請求項４８に記
載の組成物。49. The composition of claim 48, wherein said size is about 400 nanometers. 【請求項５０】 第１の成分と、第２の成分とを有する組成物であって、 第１の成分が抗血管形成コード配列を含むプラスミドおよびカチオン性脂質を
中性の共脂質とともに含有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中
性の共脂質はコレステロールであり、前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチ
オン性脂質は負電荷対正電荷の比が約１：３であるような量で存在し、 第２の成分が保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を含有し、前記第１の成分
が第２の成分内に存在している組成物。50. A composition comprising a first component and a second component, wherein the first component comprises a plasmid containing an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid with a neutral co-lipid. The cationic lipid is DOTMA, the neutral co-lipid is cholesterol, and the DNA and the cationic lipid in the plasmid are in an amount such that the ratio of negative to positive charge is about 1: 3. A composition, wherein the second component comprises a protective interactive non-condensable compound, wherein the first component is present in the second component. 【請求項５１】 保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、アンギオスタチ
ンのコード配列を有する第１のプラスミドと、エンドスタチンのコード配列を独
立に有する１つまたは複数の他のプラスミドとを有する組成物。51. A protective interacting non-condensable compound comprising: a first plasmid having an angiostatin coding sequence; and one or more other plasmids independently having an endostatin coding sequence. Composition having. 【請求項５２】 抗血管形成コード配列およびカチオン性脂質を中性の共脂
質とともに含有する含む組成物。52. A composition comprising an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid together with a neutral co-lipid. 【請求項５３】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドを作製する
方法であって、抗血管形成コード配列および組織特異的エレメントをプラスミド
に挿入する段階を有する方法。53. A method for preparing a plasmid according to any of claims 1-26, comprising the step of inserting an anti-angiogenic coding sequence and a tissue-specific element into the plasmid. 【請求項５４】 前記抗血管形成コード配列および前記組織特異的エレメン
トを転写可能に連結する段階をさらに有する請求項５３に記載の方法。54. The method of claim 53, further comprising the step of transcribably linking said anti-angiogenic coding sequence and said tissue-specific element. 【請求項５５】 請求項３４に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有する転写ユニットを有するＤＮＡ分子を調製す
る段階と、 ｂ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製する段階と、 ｃ．治療的有効量の抗血管形成コード配列を哺乳動物に送達可能な組成物が形
成されるような条件下において、前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と前
記ＤＮＡとを結合させる段階と、 を有する方法。55. A method of making the composition of claim 34, comprising: a. Preparing a DNA molecule having a transcription unit having an anti-angiogenic coding sequence; b. Preparing a protective interacting non-condensable compound; c. Binding the protective interacting non-condensable compound to the DNA under conditions such that a composition capable of delivering a therapeutically effective amount of the anti-angiogenic coding sequence to the mammal is formed; A method comprising: 【請求項５６】 前記ＤＮＡ分子はプラスミドであり、前記プラスミドは抗
血管形成コード配列およびヒトの成長ホルモン３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグ
ナルを有している請求項５５に記載の方法。56. The method of claim 55, wherein said DNA molecule is a plasmid, said plasmid having an anti-angiogenic coding sequence and a human growth hormone 3 'untranslated region / poly (A) signal. 【請求項５７】 請求項３６に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有するＤＮＡを調製する段階と、 ｂ．カチオン性脂質および中性の共脂質の混合物を調製する段階と、 ｃ．前記混合物と前記ＤＮＡとを、前記カチオン性脂質および前記ＤＮＡが約
１：３の負電荷対正電荷の比で存在するような量で組み合わせる段階と、 を有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中性の共脂質はコレス
テロールである方法。57. A method of making the composition of claim 36, comprising: a. Preparing a DNA having an anti-angiogenic coding sequence; b. Preparing a mixture of a cationic lipid and a neutral co-lipid; c. Combining the mixture and the DNA in an amount such that the cationic lipid and the DNA are present in a ratio of negative to positive charges of about 1: 3, wherein the cationic lipid is DOTMA. And wherein the neutral co-lipid is cholesterol. 【請求項５８】 請求項５０に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有するプラスミドおよびカチオン性脂質を中性の
共脂質とともに有する第１の成分を調製する段階と、 ｂ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を有する第２の成分を調製する段階
と、 ｃ．前記第１および第２の成分を、得られる組成物が前記第２の成分内に前記
第１の成分を有するように組み合わせるする段階と、 を有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中性の共脂質はコレス
テロールであり、前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチオン性脂質は負電荷
対正電荷の比が約１：３であるような量で存在している方法。58. A method of making the composition of claim 50, comprising: a. Preparing a first component having a plasmid having an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid with a neutral co-lipid; b. Preparing a second component having a protective interacting non-condensable compound; c. Combining the first and second components such that the resulting composition has the first component within the second component, wherein the cationic lipid is DOTMA; The method wherein the neutral colipid is cholesterol and the DNA in the plasmid and the cationic lipid are present in an amount such that the ratio of negative to positive charge is about 1: 3. 【請求項５９】 請求項５１に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製する段階と、 ｂ．アンギオスタチンのコード配列を含む第１のプラスミドを調製する段階と
、 ｃ．エンドスタチンのコード配列を独立に有する１つまたは複数の他のプラス
ミドを調製する段階と、 ｄ．前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、前記アンギオスタチンのコ
ード配列を含む前記プラスミドと、前記他のプラスミドとを組み合わせる段階と
、 を有する方法。59. A method of making the composition of claim 51, comprising: a. Preparing a protective interacting non-condensable compound; b. Preparing a first plasmid containing the coding sequence for angiostatin; c. Preparing one or more other plasmids independently having a coding sequence for endostatin; d. Combining the protective interacting non-condensable compound, the plasmid containing the coding sequence for angiostatin, and the other plasmid. 【請求項６０】 抗血管形成コード配列を含むプラスミドおよびカチオン性
脂質を中性の共脂質とともに組み合わせる段階を有する請求項５２に記載される
組成物を作製する方法。60. A method of making a composition according to claim 52 comprising combining a plasmid containing an anti-angiogenic coding sequence and a cationic lipid with a neutral co-lipid. 【請求項６１】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項１〜２６のいずれ
かに記載のプラスミドを投与する段階を有する方法。61. A method for treating a mammal abnormality or disease, comprising administering to the mammal suffering from the abnormality or disease a therapeutically effective amount of the plasmid of any one of claims 1-26. A method with steps. 【請求項６２】 前記プラスミドを一時的に発現させる段階をさらに有する
請求項６１に記載の方法。62. The method of claim 61, further comprising the step of transiently expressing said plasmid. 【請求項６３】 前記異常または疾患はガンである請求項６１に記載の方法
。63. The method of claim 61, wherein said abnormality or disease is cancer. 【請求項６４】 前記組成物は注射により投与される請求項６３に記載の方
法。64. The method of claim 63, wherein said composition is administered by injection. 【請求項６５】 細胞をその場で形質移入する方法であって、前記細胞を形
質移入するのに十分な時間にわたって、前記細胞を請求項１〜２６のいずれかに
記載のプラスミドと接触させる段階を含む方法。65. A method of transfecting a cell in situ, wherein the cell is contacted with the plasmid of any of claims 1-26 for a time sufficient to transfect the cell. A method that includes 【請求項６６】 前記細胞の形質移入はインビボで行われる請求項６５に記
載の方法。66. The method of claim 65, wherein the transfection of the cells is performed in vivo. 【請求項６７】 前記接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で行われる請求項
６５に記載の方法。67. The method of claim 65, wherein said contacting is performed in the presence of about 5% PVP solution. 【請求項６８】 多数の細胞における抗血管形成遺伝子の送達および発現を
行うための方法であって、 （ａ）前記多数の細胞を請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質
移入する段階と、 （ｂ）抗血管形成因子をコードする核酸配列をベクター内に発現させ得る条件
下で前記多数の細胞をインキュベーションする段階と、 を有する方法。68. A method for delivering and expressing an anti-angiogenic gene in a number of cells, comprising: (a) transfecting said number of cells with a plasmid according to any of claims 1-26. And (b) incubating the large number of cells under conditions that allow expression of the nucleic acid sequence encoding the anti-angiogenic factor in the vector. 【請求項６９】 前記抗血管形成因子はアンギオスタチンまたはエンドスタ
チンであり、前記細胞がヒト細胞である請求項６８に記載の方法。69. The method of claim 68, wherein said anti-angiogenic factor is angiostatin or endostatin and said cells are human cells. 【請求項７０】 前記接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で行われる請求項
６８に記載の方法。70. The method of claim 68, wherein said contacting is performed in the presence of about 5% PVP solution. 【請求項７１】 疾患または異常を処置する方法であって、細胞をその場で
請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質移入する段階を有する方法
。71. A method for treating a disease or condition, comprising the step of transfecting a cell in situ with a plasmid according to any of claims 1-26. 【請求項７２】 前記疾患または異常は局在化した疾患または異常である請
求項７１に記載の方法。72. The method of claim 71, wherein said disease or condition is a localized disease or condition. 【請求項７３】 前記疾患または異常は固形腫瘍である請求項７２に記載の
方法。73. The method of claim 72, wherein said disease or condition is a solid tumor. 【請求項７４】 前記疾患または異常は全身性の疾患または異常である請求
項７１に記載の方法。74. The method of claim 71, wherein said disease or condition is a systemic disease or condition. 【請求項７５】 前記疾患または異常は転移ガンである請求項７４に記載の
方法。75. The method of claim 74, wherein said disease or condition is a metastatic cancer. 【請求項７６】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質移入
された細胞。76. A cell transfected with the plasmid according to any one of claims 1 to 26. 【請求項７７】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項２７に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。77. A method of treating a disorder or disease in a mammal comprising administering to the mammal suffering from the disorder or disease a therapeutically effective amount of the composition of claim 27. . 【請求項７８】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項３４に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。78. A method of treating a mammal condition or disease comprising administering to the mammal suffering from the condition or disease a therapeutically effective amount of the composition of claim 34. . 【請求項７９】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項３５に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。79. A method of treating a mammal condition or disease comprising administering to the mammal suffering from the condition or disease a therapeutically effective amount of the composition of claim 35. . 【請求項８０】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５０に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。80. A method of treating a mammal condition or disease comprising administering to the mammal suffering from the condition or disease a therapeutically effective amount of the composition of claim 50. . 【請求項８１】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５１に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。81. A method of treating a disorder or disease in a mammal, comprising administering a therapeutically effective amount of the composition of claim 51 to the mammal suffering from the disorder or disease. . 【請求項８２】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５２に記載の組成
物を投与する段階を有する方法。82. A method of treating a disorder or disease in a mammal, comprising administering a therapeutically effective amount of the composition of claim 52 to the mammal suffering from the disorder or disease. . 【請求項８３】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
異常または疾患に罹っている哺乳動物にアンギオスタチンのコード配列を有する
第１のプラスミドとエンドスタチンのコード配列を有する第２のプラスミドとの
組成物の治療的有効量を投与する段階を有する方法。83. A method of treating a mammal abnormality or disease, wherein the mammal having the abnormality or disease has a first plasmid having an angiostatin coding sequence and a first plasmid having an endostatin coding sequence. Administering a therapeutically effective amount of a composition with the two plasmids.
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