JP5807878B2 - エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の製造法 - Google Patents
エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の製造法 Download PDFInfo
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Description
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。あるいは、
(a)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(d)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(d)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
前述の通り、本発明は、ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)[P(3HB−co−3HHx)]生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ(R−ヒドラターゼ)遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3−ヒドロキシヘキサン酸(3−HHx)の分率が5〜20mol%であり、及び形質転換体内蓄積率が50〜90重量%であるP(3HB−co−3HHx)を製造する方法を提供する。
本発明の製造方法に使用される微生物としては、P(3HB−co−3HHx)生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が好ましい。ここで、「P(3HB−co−3HHx)生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株」とは、P(3HB−co−3HHx)を生合成させることを目的として、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているPHAシンターゼを変異あるいは遺伝子破壊などにより欠損した株に、炭素数6の3HHx−CoAを基質とすることができる広基質特異性PHAシンターゼ(例えばアエロモナス・キャビエ株由来PHAシンターゼやその変異酵素の遺伝子)を導入された菌株、あるいは、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているPHAシンターゼ遺伝子が広基質特異性PHAシンターゼやその変異酵素の遺伝子に染色体上で置換された菌株を意味し、広基質特異性PHAシンターゼの作用によってクプリアヴィダス・ネカトール野生株が生合成できないP(3HB−co−3HHx)を合成する能力を有することを特徴とする。このような遺伝子の操作は、一般的な遺伝子工学的手法により容易に実行することができる。上記のP(3HB−co−3HHx)生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株には、例えば、限定されないが、NSDG株、NSDGΔA株、MF01株が挙げられる。ここで、「NSDG株」とは、水素細菌クプリアヴィダス・ネカトールの一種であるH16株の染色体にPHAシンターゼ変異酵素の遺伝子であるphaCNSDGが導入された形質転換体をいう。「phaCNSDG」とは、クプリアヴィダス・ネカトールにおいてPHA合成酵素をコードするphaC遺伝子であって、phaCのアミノ酸配列(配列番号4)において、149位のアスパラギン(N)がセリン(S)に置換され、171位のアスパラギン酸(D)がグリシン(G)に置換された変異遺伝子をいう。また、「NSDGΔA株」とは、前記のNSDG株において、β−ケトチオラーゼ遺伝子であるphaACnを欠失させた形質転換体をいう。一方、「MF01株」とは、前記NSDG株のphaACnを広基質特異性β−ケトチオラーゼ遺伝子bktBCnに置換した形質転換体である。上記3種のH16変異株は、クプリアヴィダス・ネカトールのPHAシンターゼ酵素をコードする遺伝子の配列情報を基にして、一般的な遺伝子工学的手法を用いて作製することができる(例えば、特許文献4を参照されたい)。
本発明の製造方法に使用される「R−ヒドラターゼ」とは、脂肪酸β−酸化系中間体(例えば、エノイル−CoA)をポリヒドロキシアルカン酸(PHA)モノマーである(R)−3−ヒドロキシアシル−CoA[R−3HA−CoA](例えば、(R)−3−ヒドロキシブタン酸[(R)−3HB]、(R)−3−ヒドロキシヘキサン酸[(R)−3HHx])に変換する酵素をいう。なお、本発明の製造方法に使用されるR−ヒドラターゼをコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型DNA、及びそのRNA相補体も含む。DNAには、例えば、天然由来のDNA、組換えDNA、化学合成したDNA、PCRによって増幅されたDNA、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはDNAが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、1つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、R−ヒドラターゼをコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなるか、あるいは
(a)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号2で表される塩基配列からなる核酸;又は
(b)配列番号2で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなるか、あるいは
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は
(b)配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(d)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記R−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸(a又はb)と核酸(c又はd)を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号2で表される塩基配列からなる核酸;又は
(d)配列番号2で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記R−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸(a又はb)と核酸(c又はd)を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(d)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記R−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸(a又はb)と核酸(c又はd)を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は
(d)配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記R−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸(a又はb)と核酸(c又はd)を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
本発明によれば、R−ヒドラターゼをコードする遺伝子を相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクター、又は該遺伝子を自律複製ベクターに組み込んだ発現ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Sambrook,J.ら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,1.1(2001)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、トーヨーボー社製等)を用いることもできる。
ポリエステル合成は、上述したP(3HB−co−3HHx)生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株(例えば、H16CAc株、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株)を植物油を含む所定の培地で培養し、培養細胞(例えば、菌体)内又は培養物(例えば、培地)中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる:培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
以下の実施例では、遺伝子組換え用の宿主としてクプリアヴィダス・ネカトールH16株(野生株、DSM428)、H16株の染色体上のPHAシンターゼ遺伝子phaCCnを削除したH16ΔC株(Mifune,J.ら、Can.J.Chem.(2008),86:621)、及びH16株の染色体上のPHAシンターゼ遺伝子phaCCnを土壌細菌アエロモナス・キャビエ由来のPHAシンターゼ遺伝子phaCAcに置換したH16CAc株(Mifune,J.ら、上述)を用いた。
アエロモナス・キャビエ由来のPHAシンターゼに二重アミノ酸変異を導入した変異型酵素が報告されている(Tsuge,T.ら,FEMS Microbiol.Lett(2007),277:217−222;Kichiseら,Appl.Environ.Microbiol.(2002),68:2411−2419;特開2008−29218)。本明細書では、本変異型PHAシンターゼ遺伝子を「phaCNSDG」と称する。phaCNSDGがクローニングされたpBBREE32−NSDG(Tsuge,T.ら,上述)を鋳型とし、下記の配列1及び配列2のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaCNSDGを増幅した。PCRはKODプラス(トーヨーボー社製)を用い、98℃で20秒、61℃で15秒、68℃で2分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。
配列1:GGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAATCATGAGCCAACCATCTTATGGC(配列番号5)(下線部はCsp45I制限酵素サイト)
配列2:AACCTGCAGGCCTGCCGGCGCCGTGCATATGCAAGCGTCATGCGGCGTCCTCCTCTG(配列番号6)(下線部はSbfI制限酵素サイト)
pTA2NSDGをCsp45IとSbfIで切断し、phaCNSDGを含む遺伝子断片を単離した。次いで、組換えphaオペロン(プロモーター領域−phaCAc−phaACn−phaB1Cn)を含むpTA2C’AB(Mifune,J.ら、上述)をCsp45I及びSbfIで切断し、アルカリホスファターゼ(トーヨーボー社製)で5’−末端を脱リン酸化し、次いで先に得られたphaCNSDG断片を挿入することによりpTA2NSDG−ABを得た。ここで、phaB1Cnはクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体上のアセトアセチル−CoA還元酵素遺伝子である。pTA2NSDG−ABをBamHIで切断し、プロモーター領域−phaCNSDG−phaACn−phaB1Cnを含む5.0kbpの遺伝子領域を単離した。また、pK18mobsacB(Schaferら,Gene(1994),147:198)をBamHIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’−を脱リン酸化した。Ligation highにより2つの断片を連結し、pK18msNSDG−ABを作製した。
得られた組換えプラスミドpK18msNSDG−ABを用いて、クプリアヴィダス・ネカトールH16ΔC株を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、pK18msNSDG−ABを大腸菌S17−1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地(1%トリプトン、1%塩化ナトリウム、0.5%イーストエキス、pH7.2)3.0ml中で37℃終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダス・ネカトールH16ΔC株をNR培地(1%魚肉エキス、1%ポリペプトン、0.2%イーストエキス)3.0ml中で30℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液0.2mlに対して、クプリアヴィダス・ネカトールH16ΔC株の培養液0.1mlを混合し、30℃で6時間培養した。この菌体混合液を0.2mg/mlカナマイシンを添加したSimmons Citrate寒天培地(ディフコ社製)に塗布し、30℃で3日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドが、クプリアヴィダス・ネカトールに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmons Citrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からpK18msNSDG−ABが染色体に取り込まれたクプリアヴィダス・ネカトール形質転換体(ポップイン株)である。さらに、ポップイン株をNR培地で30℃終夜培養した後、10%スクロースを添加したNR培地に塗布し、30℃で3日間培養した。pK18mobsacB上のsacBにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、10%スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株(ポップアウト株)のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上にphaCNSDGが挿入されたクローンをPCR法によって選抜し、これをクプリアヴィダス・ネカトールNSDG株とした。NSDG株は、以下の遺伝子組換えにおいて適宜、宿主として使用した。
クプリアヴィダス・ネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型に、下記の配列3及び配列4のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaB1Cn下流の転写制御因子遺伝子(phaR)を含む1041bpの遺伝子領域を増幅した。
配列3:TCGACCGGCGCCGACTTCTC(配列番号7)
配列4:GCATGCCAGTGTCTTACTTCT(配列番号8)(下線部はSphI制限酵素サイト)
pK18NSDG−ABをNdeIとSphIで切断し、上述のphaB1Cn下流を含む遺伝子領域を連結することでプロモーター領域−phaCNSDG−phaRを含むpK18msNSDG−Rを得た。さらに、pK18msNSDG−RをEcoRI及びCsp45Iで切断し、次いで、Blunting Highにより末端を平滑化した後、Ligation Highによるセルフライゲーションを行うことで、プロモーター領域とphaCAcの一部を除去することでphaACn−phaB1Cnを挟む2つの相同領域の長さを調節したpK18msNSDGRΔPを得た。
pTA2NSDG−ABを鋳型とし、下記の配列5及び配列6のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaACnを含む遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98℃で20秒、65℃で15秒、68℃で1分20分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。
配列5:CGCCGCATGACGCTTGCATA(配列番号9)
配列6:CCATATGCGGCCCCGGAAAACCCC(配列番号10)(下線はNdeI制限酵素サイト)
pTA2NSDG−ABを鋳型とし、下記の配列7及び配列8のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaB1Cnを含む遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98℃で20秒、65℃で15秒、68℃で1分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。
配列7:CGCATATGGTTGGCGCGGA(配列番号11)(下線はNdeI制限酵素サイト)
配列8:GCCCGGATCCTATGCCCAACAAGGCACTAAG(配列番号12)(下線はBamHI制限酵素サイト)
pK18msNSDG−R(実施例6)をNdeIにより切断し、上述(実施例8)で得たphaB1断片を連結することでプロモーター領域−phaCNSDG−phaB1Cn−phaRを有するpK18msNSDG−BRを得た。
クプリアヴィダス・ネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型にし、下記の配列9及び配列10のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaACnの上流(phaCNSDGの一部を含む)1kbpの遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98℃で20秒、65℃で15秒、68℃で1分10秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。また、配列11及び配列12のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、phaB1Cnを含むphaACnの下流約1kbpの遺伝子領域を上記と同様のPCR条件で増幅した。得られた2つ遺伝子断片をDNA精製キットで精製し、それぞれ100ngずつ混合した溶液を鋳型としたフュージョンPCRを行った。2つの断片は末端が配列10及び配列11に設計した26bpの相補的配列によって相補的になっている。プライマーを添加しないPCR反応(98℃で20秒、65℃で15秒、68℃で2分10秒の反応を1サイクルとしてこれを10サイクル)を行った後、配列9及び配列12に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして加え、さらにKODプラスを0.5μlを追加した後、98℃で20秒、65℃で15秒、68℃で2分10秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。
配列10:CGTCGGATCCTCTAGATTCGAAGCGTCATGCGGCGTCCTCCTCTG(配列番号14)(下線部はBamHI−XbaI−Csp45I、ヌクレオチド1−26は配列11との相補的配列)
配列11:ACGCTTCGAATCTAGAGGATCCGACGATAACGAAGCCAATCAAGG(配列番号15)(下線部はCsp45I−XbaI−BamHI、ヌクレオチド1−26は配列10との相補的配列)
配列12:TGCGCAAGCTTTATGCCCAACAAGGCACTAAGAAAAG(配列番号16)(下線部はHindIII制限酵素サイト)
配列13:CATCTCCTGCAGGTTCGAAGAGGAGGACGCCGCATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAGGCCAGA(配列番号17)(下線部はSbfI、ヌクレオチド14−19はCsp45I制限酵素サイト)
配列14:CGCCACCTGCAGGCTCTAGATTAAGGCAGCTTGACCACGGCTT(配列番号18)(下線部はSbfI、ヌクレオチド15−20はXbaI制限酵素サイト)
実施例10で得られたphaJAc断片をCsp45IとXbaIで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。この断片をCsp45IとXbaIで切断したpK18msNSDG−BとLigation Highにより連結することで、phaCNSDGの一部とphaJAc及びphaB1Cnが連結した遺伝子断片を持つpK18msNSDG−JBを得た。
クプリアヴィダス・ネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型に、下記の配列15及び配列16のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってbktBCn遺伝子領域を増幅した。
配列15:TACATTCTAGAAAGGAGGCAAAGTCATGACGCGTGAAGTGGTAGTGGTA(配列番号19)(下線部はXbaI制限酵素サイト)
配列16:GCTCAGGATCCACCCCTTCCTCAGATACGCTCGAAGATGGCGG(配列番号20)(下線部はBamHI制限酵素サイト)
pK18msNSDG−JB(実施例11)をXbaIとHindIIIで切断し、phaJAc−phaB1Cnを含む遺伝子断片を単離した。また、pK18msNSDG−bB(実施例12)をXbaIとHindIIIで切断し、ベクター領域を含む遺伝子断片をアガロースゲルから切り出し、精製した。2つの断片をLigation Highにより連結し、phaCNSDGの一部−phaJAc−bktBCn−phaB1Cnを持つpK18msNSDG−JbBを得た。
実施例13で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例4と同様の手法によりクプリアヴィダス・ネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをPCR法によって選抜した。すなわち、H16CAc株を宿主とし、pK18msC’BR(実施例8)、pK18AR(実施例7)、pK18msC’RΔP(実施例5)を用いてphaACn、phaB1Cn、phaACn−phaB1Cnを破壊したH16CAcΔA株、H16CAcΔB株、H16CAcΔAB株を作製した。また、NSDG株を宿主とし、pK18msNSDG−BR(実施例9)、pK18msAR(実施例7)、pK18msNSDG−RΔP(実施例6)を用いてphaACn、phaB1Cn、phaACn−phaB1Cnを破壊したNSDGΔA株、NSDGΔB株、NSDGΔAB株を作製した。またpK18msNSDG−bB(実施例12)を用いてphaACnをbktBCnに置換したMF01株、pK18msNSDG−JABを用いてphaCNSDGとphaACnの間にphaJAcを挿入したMF02株(実施例10)、pK18msNSDG−JBを用いてphaACnをphaJAcに置換したMF03株(実施例11)、pK18msNSDG−JbB(実施例13)を用いてphaACnをphaJAc−bktBCnに置換したMF04株を作製した(図2参照)。
クプリアヴィダス・ネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型にし、下記の配列17及び配列18のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってPHA顆粒結合タンパク質遺伝子(phaPCn)の上流領域0.5kbpの遺伝子領域(PhaPプロモーター領域)を増幅した。
配列17:AAAGATCTAATATTGTTCTGTTCACGTCTTTGTTAGTTCC(配列番号21)(下線部はBglII−SspI制限酵素サイト)
配列18:GAGGATCCCCGGGTACCTATGAATTCATATGTATATACCTCCCAGGCGTGTGGGTGGGTCAAG(配列番号22)(下線部はBamHI制限酵素サイト)
既知のR体特異的−エノイル−CoAヒドラターゼとの相同性検索から、クプリアヴィダス・ネカトールにおける推定R体特異的−エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子としてphaJ1(配列番号2)、phaJ2(配列番号3)、phaJ3を同定した。次にクプリアヴィダス・ネカトールのゲノムDNAを鋳型とし、下記の配列19及び配列20のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ1を増幅した。また同様に配列21、配列22のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ2を増幅した。さらに同様に配列23、配列24のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ3を増幅した。PCRはKODプラス(トーヨーボー社製)を用い、98℃で20秒、61℃で15秒、68℃で2分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。
配列20:CGCTCGAGTCACCCGTAGCGGCGCGTGA(配列番号24)(下線部はXhoI制限酵素サイト)
配列21:CACATATGAAGACCTACGAGAACATC(配列番号25)(下線部はNdeI制限酵素サイト)
配列22:CTCGAGTCAGGGAAAGCGCCGCAGGA(配列番号26)(下線部はXhoI制限酵素サイト)
配列23:CACATATGCCAAGAATCTTCCGTTCT(配列番号27)(下線部はNdeI制限酵素サイト)
配列24:ATCTCGAGTCAGAAGTAATAGCGGCTG(配列番号28)(下線部はXhoI制限酵素サイト)
上述の(R)−エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターをクプリアヴィダス用いて、クプリアヴィダス・ネカトールH16CAc株又はNSDGΔ株(実施例14)を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、pBBR−phaJ1、pBBR−phaJ2、あるいはpBBR−phaJ3を大腸菌S17−1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地(1%トリプトン、1%塩化ナトリウム、0.5%イーストエキス、pH7.2)3.0ml中で37℃終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダス・ネカトール株をNR培地(1%魚肉エキス、1%ポリペプトン、0.2%イーストエキス)3.0ml中で30℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液0.2mlに対して、クプリアヴィダス・ネカトール株の培養液0.1mlを混合し、30℃で6時間培養した。この菌体混合液を0.2mg/mlカナマイシンを添加したSimmons Citrate寒天培地(ディフコ社製)に塗布し、30℃で3日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドがクプリアヴィダス・ネカトールに伝達され、保持される該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmons Citrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーはクプリアヴィダス・ネカトール形質転換体である。PCRによるベクターの保持を確認することでH16CAc/pBBR−phaJ1株、H16CAc/pBBR−phaJ2株、H16CAc/pBBR−phaJ3株、NSDGΔA/pBBR−phaJ1株、NSDGΔA/pBBR−phaJ2株、NSDGΔA/pBBR−phaJ3株をそれぞれ単離した。
NR培地(前述)で前培養したクプリアヴィダス・ネカトール組換え株を100mlのMB培地(0.9%リン酸水素二ナトリウム12水和物、0.15%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化アンモニウム、1%微量金属溶液)に植菌し、坂口フラスコ中、30℃で72時間振とう培養した。炭素源として1%大豆油を用いた。発現ベクターpBBR−phaJ1、pBBR−phaJ2、あるいはpBBR−phaJ3を保持する組換え株においては、培地中に0.1mg/mlカナマイシンを添加した。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、付着した油分を除くために70%エタノールで洗浄したのち、蒸留水で洗浄した。得られた菌体は凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
pBBR−phaJ1(実施例16)を鋳型に、配列25及び配列26のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ1断片を増幅した。また、pBBR−phaJ2(実施例16)を鋳型に、配列27及び配列28のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ2断片を増幅した。
配列26:GCCAAGCGGCCGCTTCGAAACTAGTTGCAGCTCGACTCACCCGTAG(配列番号30)(下線部はSpeI制限酵素サイト)
配列27:GACCCACTAGTTCTAGAAGGAGGAATATACATATGAAGACCTACGAGAACAT(配列番号31)(下線部はXbaI制限酵素サイト)
配列28:CAAGCGCGGCCGCTTCGAAACTAGTTCAGGGAAAGCGCCGCAGGAT(配列番号32)(下線部はSpeI制限酵素サイト)
上述の実施例で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例4と同様の手法によりクプリアヴィダス・ネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをPCR法によって選抜した。すなわち、NSDG株を宿主とし、pK18msNSDG−J1B(実施例19)を用いてphaAをphaJ1に置換したNSDGΔA−J1株、pK18msNSDG−JAcJ1B(実施例19)を用いてphaAをphaJAc−phaJ1に置換したMF03−J1株、pK18msNSDG−J2B(実施例19)を用いてphaAをphaJ2に置換したNSDGΔA−J2株を、pK18msNSDG−JAcJ2B(実施例19)を用いてphaAをphaJAc−phaJ2に置換したMF03−J2株を作製した。各株の遺伝子配置構造を図3に示す。
実施例20で作製したクプリアヴィダス・ネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成を実施例18と同様の方法により行った。結果を表3に示す。NSDGΔA−J1株、NSDGΔA−J2株では、コントロールであるNSDGΔA株と比較してPHA生産量を低下することなく3HHx分率が3.2mol%から7.3〜8.0mol%に向上した。この3HHx分率は、アエロモナス・キャビエ由来の(R)−エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子phaJAcを相同性組換えにより導入したMF03株(実施例14)での分率と比較すると、やや低かった。一方、phaJをphaJ1又はphaJ2とをタンデムに配置したMF03−J1株、MF03−J2株(図3参照)では、高いPHA生産量を維持しつつ3HHx分率が10.2〜10.5mol%に改善された。
実施例16において増幅し、NdeI及びXhoIで切断したphaJ1、phaJ2、phaJ3の各断片を、それぞれNdeI及びXhoIで切断した発現プラスミドpCOLDII(タカラバイオ社製)に挿入した。得られたプラスミドをpCOLD−J1、pCOLD−J2、pCOLD−J3とした。これらの発現プラスミドは、アミノ末端側にヒスチジン6残基からなるタグ配列(以下、Hisタグとする)が付加された組換え型タンパク質が生産されるように構築されている。pCOLD−J1、pCOLD−J2、pCOLD−J3を用いて大腸菌BL21(DE3)株(ノバジェン社製)を形質転換した。得られたそれぞれの形質転換体を100mgのアンピシリンを含む100mLのLB培地で37℃、4時間培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.5mMとなるように添加して発現を誘導し、さらに15℃で24時間、培養した。菌体を遠心分離によって回収した後、30mMイミダゾールと500mMNaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で再懸濁し、超音波破砕、遠心分離によって可溶性タンパク画分を得た。
Claims (6)
- ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール(Cupriavidus necator)株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3−ヒドロキシヘキサン酸の分率が5〜20モル%であり、及び形質転換体内蓄積率が50〜90重量%であるポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法であって、前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、アエロモナス・キャビエ(Aeromonas caviae)株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる上記方法。 - 前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3−ヒドロキシヘキサン酸の分率が5〜20モル%であり、及び形質転換体内蓄積率が50〜90重量%であるポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法であって、前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(a)配列番号2又配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号2又配列番号3で表される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる上記方法。 - 前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3−ヒドロキシヘキサン酸の分率が5〜20モル%であり、及び形質転換体内蓄積率が50〜90重量%であるポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法であって、前記R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、
− アエロモナス・キャビエ株由来であり、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び
− クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
(c)配列番号2又配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(d)配列番号2又配列番号3で表される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる上記方法。 - 前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
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