JP4590519B2 - 腸管吸収制御性リポソーム - Google Patents
腸管吸収制御性リポソーム Download PDFInfo
- Publication number
- JP4590519B2 JP4590519B2 JP2006257432A JP2006257432A JP4590519B2 JP 4590519 B2 JP4590519 B2 JP 4590519B2 JP 2006257432 A JP2006257432 A JP 2006257432A JP 2006257432 A JP2006257432 A JP 2006257432A JP 4590519 B2 JP4590519 B2 JP 4590519B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- bound
- liposomes
- chain
- sugar chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
さらに新しいタイプのDDS材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なDDS材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのDDS材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある(Lehr, C.-M. (2000) J. Controlled Release 65, 19-29)。しかしながら、これらのリガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームの研究は未だ報告されていない。
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(8)に係るものである。
(1) 糖鎖が結合したリポソームであって、リポソーム表面が親水性化されていることを特徴とする、リポソーム。
(2) 糖鎖が、ラクトース2糖鎖、2’-フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および3-フコシルラクトース三糖鎖から選ばれたものである、上記(1)に記載のリポソーム。
(3) リポソームが腸管吸収機能を有するものである上記(1)または(2)に記載のリポソーム。
(4) リポソーム膜上の糖鎖結合量を調整したものである上記(1)〜(3)のいずれかに記載のリポソーム。
(5) トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンにより親水性化されたものである上記(1)〜(4)のいずれかに記載のリポソーム。
(6) 上記(1)〜(5)のいずれかに記載のリポソームに薬剤または遺伝子を封入したものであるリポソーム製剤。
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明におけるリポソームは、 ラクトース二糖鎖(Gal.beta.1-4Glc)、2’-フコシルラクトース三糖鎖(Fuc.alpha.1-2Gal.beta.1-4Glc)、ジフコシルラクトース四糖鎖(Fuc.alpha.1-2Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)Glc)および3-フコシルラクトース三糖鎖(Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)Glc)から選ばれた糖鎖により修飾されたものである。なお、これらの糖鎖は市販されている。
本発明においては、これら糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソーム表面に結合していることが好ましい。この場合のリポソームの構造をこれら糖鎖の化学構造とともに図1〜4に示す。なお、これらの図は模式図であり、糖鎖−リンカー蛋白質は、実際にはリポソーム表面に多数結合している。
リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等をを挙げることができる。
本発明のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン(糖鎖認識蛋白質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。
リポソームは既報の手法(Yamazaki, N., Kodama, M. and Gabius, H.-J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合の合計脂質量45.6mgにコール酸ナトリウムを46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
実施例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3; Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和親水性化された。
既報の手法(Yamazaki, N., Kodama, M. and Gabius, H.-J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
ラクトース二糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)((1)50μg、又は、(2)200μg、又は、(3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、(実施例3)で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにラクトース二糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図1で示されるラクトース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称: (1)LAC−1、(2)LAC−2,(3)LAC−3 )各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
2’-フコシルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)((1)50μg、又は、(2)200μg、又は、(3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して2’-フコシルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、(実施例3)で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSA に結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の2’-フコシルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに2’-フコシルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図2で示される2’-フコシルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称: (1)2FL−1、(2)2FL−2,(3)2FL−3 )各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
ジフコシルラクトース四糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)((1)50μg、又は、(2)200μg、又は、(3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してジフコシルラクトース四糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、(実施例3)で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のジフコシルラクトース四糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにジフコシルラクトース四糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図3で示されるジフコシルラクトース四糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称: (1)DFL−1、(2)DFL−2,(3)DFL−3 )各 2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
3-フコシルラクトース三糖鎖(Wako Pure Chemical Co.,Japan)((1)50μg、又は、(2)200μg、又は、(3)1mg)を0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3-フコシルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、(実施例3)で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3-フコシルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3-フコシルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの3種類の図4で示される3-フコシルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム(略称: (1)3FL−1、(2)3FL−2,(3)3FL−3 )各 2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。この工程で既に大過剰である13mgのtris(hydroxymethyl)aminomethaneが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。その結果、最終産物である親水性化処理された図5で示されるtris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS ) 2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
実施例4〜7の手段により調整された各12種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA 蛋白質表面の親水性化処理を行った。12種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された12種類の糖鎖結合リポソーム複合体(略称: LAC−1、 LAC−2、 LAC−3、 2FL−1、 2FL−2、 2FL−3、 DFL−1、 DFL−2、 DFL−3、 3FL−1、 3FL−2、 3FL−3)各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
実施例4〜7および実施例9の手段により調製した各12種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999) Drug Delivery System, 14, 498-505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E-selectin; R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo-NHS-biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon-30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表1に示す。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml 並びに5mg/ml となるように用事調製して用いた。 (実施例4)から(実施例9)により調製した13種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μl ずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I-NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl 加え反応させた。5 分ごとにクロラミンT溶液10μl を加え、この操作を2 回繰り返した後15 分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl 加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G-50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBS で溶出、標識体を精製した。最後に、非標識-リポソーム複合体を添加して比活性(4 x 106 Bq/mg protein)を調整して13種類の125I標識リポソーム液を得た。
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、(実施例11)により125I標識された13種の糖鎖結合並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G-50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を図6から図9に示す。
Claims (3)
- ラクトース2糖鎖、2’-フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および3-フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される糖鎖が結合したリポソームであって、リポソーム表面がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンにより親水性化されており、腸管吸収機能を有する、リポソーム。
- リポソーム膜上の糖鎖結合量を調整したものである請求項1記載のリポソーム。
- 請求項1または2に記載のリポソームに薬剤または遺伝子を封入したものであるリポソーム製剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006257432A JP4590519B2 (ja) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | 腸管吸収制御性リポソーム |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006257432A JP4590519B2 (ja) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | 腸管吸収制御性リポソーム |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002022576A Division JP3882034B2 (ja) | 2002-01-30 | 2002-01-30 | 腸管吸収制御性リポソーム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006335772A JP2006335772A (ja) | 2006-12-14 |
JP4590519B2 true JP4590519B2 (ja) | 2010-12-01 |
Family
ID=37556619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006257432A Expired - Lifetime JP4590519B2 (ja) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | 腸管吸収制御性リポソーム |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4590519B2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001055343A (ja) * | 1998-11-02 | 2001-02-27 | Terumo Corp | リポソーム |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1085857A2 (en) * | 1998-06-19 | 2001-03-28 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphile micellar complexes |
CA2270600A1 (en) * | 1999-05-03 | 2000-11-03 | Infectio Recherche Inc. | Method and formulations for the treatment of diseases, particularly those caused by human immunodeficiency virus and leishmania |
-
2006
- 2006-09-22 JP JP2006257432A patent/JP4590519B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001055343A (ja) * | 1998-11-02 | 2001-02-27 | Terumo Corp | リポソーム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2006335772A (ja) | 2006-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7070801B2 (en) | Sugar-modified liposome and products comprising the liposome | |
EP1980243A1 (en) | Liposome preparation | |
JP5364381B2 (ja) | アンミン白金錯体を高濃度で内包するリポソームおよびその製造方法 | |
WO1983002069A1 (en) | Thiol reactive liposomes | |
EP1655022A1 (en) | Remedy or diagnostic for inflammatory disease containing target-directing liposome | |
US20240108750A1 (en) | Polyoxazoline-lipid conjugates and lipid nanoparticles and pharmaceutical compositions including same | |
JP3924606B2 (ja) | 標的指向性リポソーム | |
JPWO2005011632A1 (ja) | 糖鎖を有する標的指向性および腸管吸収制御性リポソームならびにそれを含む癌治療薬および診断薬 | |
JPWO2007018273A1 (ja) | 糖鎖修飾リポソームを含有する診断薬送達組成物 | |
US20060193906A1 (en) | Sugar-modified liposome and products comprising the liposome | |
JPWO2007018275A1 (ja) | ローリングモデルに基づく、送達媒体の設計 | |
JP4500930B2 (ja) | 標的指向性リポソーム | |
JP3882034B2 (ja) | 腸管吸収制御性リポソーム | |
JP4590519B2 (ja) | 腸管吸収制御性リポソーム | |
EP1447081B1 (en) | Sugar-modified liposome and products comprising the liposome | |
JP3759759B2 (ja) | リポソームおよび薬物運搬体 | |
Vodovozova et al. | Saccharide‐assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells | |
WO2009148169A1 (ja) | アンミン白金錯体を高濃度に内包するリポソームを用いた腫瘍治療技術 | |
EP1568360A1 (en) | Liposome | |
US20170209605A1 (en) | Carbohydrate functionalized catanionic surfactant vesicles for drug delivery | |
CN103193976A (zh) | 一种心磷脂的合成与应用 | |
Gabius | Synthesis, lectin-binding affinity, and biodistribution of novel neoglycoprotein-liposome conjugates bearing 6'-sialyl-N-acetyllactosamines and Lewis x trisaccharides. | |
Pitha et al. | Biological activities and targeting of soluble macromolecules | |
Yamazaki et al. | Preparation of neoglycoprotein-bearing liposomes and their interaction with cells and tissues | |
Vodovozova et al. | MALIGNANT CELLS |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060925 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070628 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070628 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100119 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20100122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100319 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100720 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100809 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130924 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4590519 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |