JP2002514766A - ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のイムノアッセイ、このアッセイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキット - Google Patents
ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のイムノアッセイ、このアッセイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
ヒトＣｇＡのＮ末端からアミノ酸１４５位からアミノ酸２３４位に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対するイムノアッセイ法の提供。
Description
【０００１】
本発明の主題は、ヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイのための方法であり
、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグ
ラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグ
ラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
【０００２】 上記アッセイは、例えばクロム親和性細胞腫及び腸カルチノイドのような、病
理の診断及び治療のために得に使用できる。
理の診断及び治療のために得に使用できる。
【０００３】
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）は、４８ｋＤａの分子量、４．９のｐＩを有する
タンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に
記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通
性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に
、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神
経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の
主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミン
のような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
タンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に
記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通
性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に
、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神
経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の
主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミン
のような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
【０００４】 ＣｇＡはまた、小球内及びマトリックス外タンパク質溶解性分解に引き続き、
活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
【０００５】 添付した図１において、配列番号１は、ヒトクロモグラニンＡに相当する、Ko
necki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
necki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
【０００６】 図２は、単純な様式でこの配列を示し、この図において、ヒトにおいて放出さ
れ得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パン
クレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は
、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配
列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は
、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それ
は組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示
されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び
尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
れ得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パン
クレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は
、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配
列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は
、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それ
は組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示
されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び
尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
【０００７】 参考文献[2]のCorti等による最近の研究により、クロム親和性細胞腫に罹患し
ている患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在
することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14
ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織
において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
ている患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在
することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14
ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織
において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
【０００８】 正常組織及び相当する腫瘍組織における検出に加えて、数多くの研究により、
ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は
、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い
。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され
、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性
病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15
]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの
場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる
。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は
、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い
。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され
、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性
病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15
]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの
場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる
。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
【０００９】 文献US-A-4 758 522[3]は、ＣｇＡのイムノアッセイを記載し、その場合抗ヒ
トＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによ
って、ＣｇＡを測定する。
トＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによ
って、ＣｇＡを測定する。
【００１０】 参考文献[4]においてSyversen等は、アミノ酸２１０位から４３９位の配列に
相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法で
のクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッ
セイを記載している。
相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法で
のクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッ
セイを記載している。
【００１１】 参考文献[2]においてCorti等はまた、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列８１から９０
及び６８から７０位に対して向けられたモノクローナル抗体を使用するＣｇＡの
二つのアッセイを記載している。
及び６８から７０位に対して向けられたモノクローナル抗体を使用するＣｇＡの
二つのアッセイを記載している。
【００１２】 それ故これらのアッセイは、いくつかのＣｇＡ断片を考慮しているが、該アッ
セイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
セイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
【００１３】 実際に、分子のタンパク質溶解及び循環断片の多様性は、これらの分子の多様
性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
【００１４】
本発明の目的は正に、循環血液中で見出される完全なＣｇＡの濃度及び腫瘍断
片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
【００１５】
本発明に従って、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対
するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端からアミノ酸１４５位からアミノ
酸２３４位に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結合す
る少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む。
するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端からアミノ酸１４５位からアミノ
酸２３４位に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結合す
る少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む。
【００１６】 本発明に従って、用語、イムノアッセイは、例えば競合的アッセイ、サンドイ
ッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応
を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイ
プのイムノアッセイを包含する。
ッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応
を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイ
プのイムノアッセイを包含する。
【００１７】 本発明の第一の実施態様に従って、イムノアッセイは、上記抗体の部位に対す
る、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（
ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
る、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（
ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
【００１８】 このアッセイを実施するために、アッセイされるサンプルに対し、一定量のラ
ベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号２に位置するエピトープに対して特異的
に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションする。この態様において、競
合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡとラベル化ＣｇＡとの間で
規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素を使用する異種相で実施さ
れる場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形成される抗体−ｈＣｇＡ複
合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放射性活性を測定することに
よって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサンプルから得られた標準曲線
を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能である。
ベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号２に位置するエピトープに対して特異的
に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションする。この態様において、競
合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡとラベル化ＣｇＡとの間で
規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素を使用する異種相で実施さ
れる場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形成される抗体−ｈＣｇＡ複
合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放射性活性を測定することに
よって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサンプルから得られた標準曲線
を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能である。
【００１９】 例えばラベル化ｈＣｇＡ及び該ラベル化ｈＣｇＡによって放射されるシグナル
を調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能であ
る。
を調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能であ
る。
【００２０】 このアッセイにおいて、使用される抗体は有利には、ヒトＣｇＡのアミノ酸２
１９位からアミノ酸２３４位のアミノ酸配列番号３中に位置するエピトープに特
異的な抗体、またはヒトＣｇＡのアミノ酸１４５位からアミノ酸１９７位のアミ
ノ酸配列番号４中に位置するエピトープに特異的な抗体である。これらの抗体は
、好ましくはモノクローナル抗体である。
１９位からアミノ酸２３４位のアミノ酸配列番号３中に位置するエピトープに特
異的な抗体、またはヒトＣｇＡのアミノ酸１４５位からアミノ酸１９７位のアミ
ノ酸配列番号４中に位置するエピトープに特異的な抗体である。これらの抗体は
、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２１】 このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びラベル化ＣｇＡの
調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、また
は好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、また
は好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
【００２２】 本発明の第二の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡのアミノ酸
１４５−２３４位の配列番号２中に位置する第一のエピトープに特異的に結合す
る第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列
番号２中に位置する第一のものとは異なる第二のエピトープに特異的に結合する
第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル
されているものを使用するサンドイッチタイプのアッセイである。
１４５−２３４位の配列番号２中に位置する第一のエピトープに特異的に結合す
る第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列
番号２中に位置する第一のものとは異なる第二のエピトープに特異的に結合する
第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル
されているものを使用するサンドイッチタイプのアッセイである。
【００２３】 本発明のこの第二の実施態様において、ＣｇＡの配列番号２中に位置する異な
るエピトープに特異的な二つの抗体が使用される。このアッセイは、固相上に第
一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用することによって異種相で実施さ
れてもよい。
るエピトープに特異的な二つの抗体が使用される。このアッセイは、固相上に第
一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用することによって異種相で実施さ
れてもよい。
【００２４】 このアッセイはまた、第一のラベル抗体と、該抗体によって放射されるシグナ
ルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
ルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
【００２５】 例として、第一の抗体は、ＣｇＡのアミノ酸１４５位から１９７位の配列（配
列番号４）中に位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの
アミノ酸２１９位から２３４位の配列（配列番号３）中に位置するエピトープに
特異的であってもよい。
列番号４）中に位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの
アミノ酸２１９位から２３４位の配列（配列番号３）中に位置するエピトープに
特異的であってもよい。
【００２６】 このアッセイにおいて、ヒトＣｇＡのアミノ酸２１９位から２３４位の配列（
配列番号３）に位置するエピトープに特異的な第一の抗体と、ヒトＣｇＡのアミ
ノ酸１４５位から１９７位の配列（配列番号４）中に位置するエピトープに特異
的な第二の抗体とを使用することも可能である。
配列番号３）に位置するエピトープに特異的な第一の抗体と、ヒトＣｇＡのアミ
ノ酸１４５位から１９７位の配列（配列番号４）中に位置するエピトープに特異
的な第二の抗体とを使用することも可能である。
【００２７】 本発明の第三の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号
２中に位置するエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体と、アミノ酸２５０位で開始しアミノ酸３０１位で終結するヒト
ＣｇＡの配列番号５中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されて
いるものを使用するサンドイッチアッセイである。
２中に位置するエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体と、アミノ酸２５０位で開始しアミノ酸３０１位で終結するヒト
ＣｇＡの配列番号５中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されて
いるものを使用するサンドイッチアッセイである。
【００２８】 本発明のこの実施態様において、アッセイは、固相に固定した第一の抗体と、
第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されても
よい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な
第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施すること
も可能である。
第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されても
よい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な
第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施すること
も可能である。
【００２９】 第一の抗体として、有利にはヒトＣｇＡのアミノ酸１４５−１９４の配列（配
列番号４）に特異的な抗体が使用され、またはヒトＣｇＡのアミノ酸２１９から
２３４位の配列（配列番号３）に特異的な抗体が使用される。
列番号４）に特異的な抗体が使用され、またはヒトＣｇＡのアミノ酸２１９から
２３４位の配列（配列番号３）に特異的な抗体が使用される。
【００３０】 本発明の方法は、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍に罹患している
患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親
和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有
利である。
患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親
和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有
利である。
【００３１】 本発明の方法を実施するために、異種相における従来のイムノアッセイ法が使
用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である
。
用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である
。
【００３２】 本発明の方法において、上記分離を含まない異種相アッセイ法を使用すること
も可能である。
も可能である。
【００３３】 異種相アッセイ法は、抗体−抗原のペアまたは二つの抗体のペアの使用に基づ
き、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放
射する。
き、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放
射する。
【００３４】 この目的のために、発光性エネルギーアクセプター化合物に結合された抗体、
及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
【００３５】 例として、発光性エネルギーアクセプター化合物は、アロフィコシアニンであ
り得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもの
のようなユウロピウムクリプテートであり得る。
り得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもの
のようなユウロピウムクリプテートであり得る。
【００３６】 特に興味深い一つの同種相アッセイ法は、参考文献[4]に記載されたTRACE（登
録商標）法である。
録商標）法である。
【００３７】 異種相アッセイに関しては、アッセイで使用される非ラベル化抗体が固定され
ている固相を使用する。
ている固相を使用する。
【００３８】 使用可能な固相は、各種のタイプが存在し得る。例えば、ポリマーまたは他の
材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得
る。
材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得
る。
【００３９】 使用可能なポリマーは、例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、
ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
【００４０】 例えばポリマー、タンパク質または他の材料より成るパウダー及びアグリゲー
トといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
トといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
【００４１】 本発明の下で、本発明の第一の実施態様におけるＣｇＡ、及び第二の実施態様
における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗
体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍
光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量
的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメント
によって修飾されていることを意味する。
における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗
体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍
光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量
的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメント
によって修飾されていることを意味する。
【００４２】 本発明はまた、ヒトクロモグラニンのアミノ酸１４５から１９７位の配列番号
４若しくはアミノ酸２１９から２３４位の配列番号３のそれぞれに位置するエピ
トープに特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若し
くは固相に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
４若しくはアミノ酸２１９から２３４位の配列番号３のそれぞれに位置するエピ
トープに特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若し
くは固相に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
【００４３】 これらの抗体は、全てのタイプのアッセイに適しているため特に興味深い。そ
れらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、
一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニ
ンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
れらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、
一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニ
ンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
【００４４】 本発明はまた、上述のモノクローナル抗体を含むヒトＣｇＡのためにイムノア
ッセイキットに関する。
ッセイキットに関する。
【００４５】 それはまた、 − 第一の抗体、並びに − 第二の抗体 を含み、二つの抗体の少なくとも一つは、ヒトＣｇＡのＮ末端からアミノ酸１４
５から２３４位の配列番号２中に位置するエピトープに特異的な抗体であるもの
を含む、ヒトＣｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
５から２３４位の配列番号２中に位置するエピトープに特異的な抗体であるもの
を含む、ヒトＣｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
【００４６】 キットの第一の実施態様に従って、第一の抗体及び第二の抗体は、ヒトＣｇＡ
のアミノ酸配列１４５から１９７位（配列番号４）及び／または２１９から２３
４位（配列番号３）中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される
。
のアミノ酸配列１４５から１９７位（配列番号４）及び／または２１９から２３
４位（配列番号３）中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される
。
【００４７】 キットの第二の実施態様に従って、抗体の一つは、アミノ酸１４５から１９７
位の配列（配列番号４）またはアミノ酸配列２１９から２３４位（配列番号３）
中に位置するエピトープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡのアミノ酸２
５０から３０１位の配列（配列番号５）中に位置するエピトープに特異的である
。
位の配列（配列番号４）またはアミノ酸配列２１９から２３４位（配列番号３）
中に位置するエピトープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡのアミノ酸２
５０から３０１位の配列（配列番号５）中に位置するエピトープに特異的である
。
【００４８】 好ましくは、キットが異種相アッセイについて企図される場合、抗体の一つは
固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
【００４９】 検出可能なラベルは、例えばヨウ素１２５である。
【００５０】 好ましくは、キットが同種相で企図される場合、抗体の一つは発光性エネルギ
ードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に
結合される。
ードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に
結合される。
【００５１】 別法として、発光性エネルギードナー化合物はユウロピウムクリプテートであ
り、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
り、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
【００５２】 それはまた、ＣｇＡのアミノ酸１４５から２３４位の配列番号２中に位置する
エピトープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
エピトープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
【００５３】 このキットにおいて、抗体は好ましくは、ヒトＣｇＡのアミノ酸２１９から２
３４位の配列番号３、またはアミノ酸１４３から１９７位の配列番号４中に位置
するエピトープに特異的である。
３４位の配列番号３、またはアミノ酸１４３から１９７位の配列番号４中に位置
するエピトープに特異的である。
【００５４】 本発明に従って、アッセイのために使用される抗体は、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。
たはモノクローナル抗体であり得る。
【００５５】 ポリクローナル抗体は、ヒトＣｇＡのタンパク質溶解またはペプチド合成によ
って得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vi
tro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るため
に、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片
を結合することが必要である。
って得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vi
tro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るため
に、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片
を結合することが必要である。
【００５６】 モノクローナル抗体は、Nature, 1975, 256, 495-497頁に記載されたK, Kohle
r及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この
場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピ
トープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、
次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実
施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエ
ピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
r及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この
場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピ
トープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、
次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実
施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエ
ピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
【００５７】 好ましくは、本発明に従って、モノクローナル抗体が使用される。
【００５８】 本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載の実施態様の例を読むことでより明
確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的
で、非制限的な目的を有するものである。
確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的
で、非制限的な目的を有するものである。
【００５９】 以下の記載は、ヒトＣｇＡの各種の異なるエピトープに対して向けられたモノ
クローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した
抗体の選択を説明する。
クローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した
抗体の選択を説明する。
【００６０】
１）モノクローナル抗体の調製 １．ヒトＣｇＡの単離及び精製 参考文献[6]においてO'Connorによって記載された方法を、クロム親和性細胞
腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。
該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載された
ようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用し
て、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出
する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot
等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産され
る。
腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。
該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載された
ようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用し
て、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出
する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot
等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産され
る。
【００６１】 ２．精製ＣｇＡのラベリング（125Ｉ−ｈＣｇＡ） 天然及び組換えＣｇＡを、１５００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Hunter及び
GreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を
、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラ
ベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
GreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を
、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラ
ベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
【００６２】 ３．免疫化 ６から８週齢のBalb/cマウスを、フロイント完全アジュバント中で事前に得ら
れた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免
疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント
中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの
免疫沈降での血清滴定によって実施する。
れた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免
疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント
中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの
免疫沈降での血清滴定によって実施する。
【００６３】 ４．ハイブリドーマの生産及びスクリーニング マウスを引き続き、０．９％ＮａＣｌ溶液中に１０ｍｇのｈＣｇＡで、静脈内
経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３
７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミ
エローマ細胞と融合する。
経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３
７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミ
エローマ細胞と融合する。
【００６４】 陽性クローンを、125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降によって同定する。陽性クロ
ーンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテ
インＡゲルを使用して精製する。
ーンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテ
インＡゲルを使用して精製する。
【００６５】 ｈＣｇＡに対して免疫化されたマウスで、１１の融合物を生産した。二つのみ
が成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化
された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より
、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩ
ｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
が成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化
された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より
、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩ
ｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
【００６６】 ５．モノクローナル抗体の同定 各種のファミリーのＣｇＡエピトープを、製造者の説明書に従って、Biacore
（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した
。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌ
のＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの
割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡに
ついて使用した。
（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した
。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌ
のＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの
割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡに
ついて使用した。
【００６７】 Biocoreでのこの分析は、試験された２４の抗体を、表１に示されたような８
のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グ
ループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害
のため、さらにサブグループに分割され得る。
のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グ
ループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害
のため、さらにサブグループに分割され得る。
【００６８】 固定化抗体−ｒｈＣｇＡ反応の化学量論は、０．１５７から０．６２１抗原の
モル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
モル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
【００６９】 各グループまたはサブグループ中の抗体は、推測的に同じ配列の認識を示す。
【００７０】 ６．組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）から由来するペプチドでの抗体の同定 ２ｎｍｏｌのｒｈＣｇＡを、１００ｎｍｏｌｅ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ
８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエン
ドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエン
ドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
【００７１】 次いで生産されたｒｈＣｇＡから由来するペプチドを、Machereyゲルカラム、
NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４
ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用
し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペ
プチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から
７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回
収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４
ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用
し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペ
プチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から
７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回
収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
【００７２】 図３は、１から６まで数字を付された時間の関数としてのカラムから溶出され
回収された分画を説明する。
回収された分画を説明する。
【００７３】 精製ペプチドの配列を、Applied Biosystems社製の４７３Ａミクロシークエン
サーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブ
テンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−
フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)での
クロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、
参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
サーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブ
テンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−
フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)での
クロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、
参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
【００７４】 これらの分画を、事前に得られたモノクローナル抗体を同定するために使用す
る。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する
。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈され
たモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
る。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する
。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈され
たモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
【００７５】 第二の抗体は、アルカリホスファターゼを接合した抗マウスＩｇＧである。酵
素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍ
ｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏ
ｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０
ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍ
ｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏ
ｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０
ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
【００７６】 表１の各グループのモノクローナル抗体、即ち、事前に生産された抗体CSG04,
CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィ
ーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィ
ーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
【００７７】 表２は、各種の分画とこれらの分画を認識する抗体との間の相関関係を説明す
る。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡ
のＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、３３
９−３５５及び３５６−４００の領域に対して高い特異性を有するタンパク質の
Ｃ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエスタンブロットによって
直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域（３４０−３９４及び３
９５−４３９）に位置する。
る。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡ
のＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、３３
９−３５５及び３５６−４００の領域に対して高い特異性を有するタンパク質の
Ｃ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエスタンブロットによって
直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域（３４０−３９４及び３
９５−４３９）に位置する。
【００７８】 抗体CSG06, CSG20及びCSG30はタンパク質の配列番号２に特異的であり、、そ
れぞれ断片１９８−２４５，２４６−３０３及び１４５−１９７（配列番号４）
に相当する。最後に、抗体CSG32は、１０から４００に亘る主要な断片と強力に
反応することに注意すべきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合
するこの抗体の挙動を考慮すると、それは領域１４５−２３４（配列番号２）を
より特異的に認識するようである。
れぞれ断片１９８−２４５，２４６−３０３及び１４５−１９７（配列番号４）
に相当する。最後に、抗体CSG32は、１０から４００に亘る主要な断片と強力に
反応することに注意すべきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合
するこの抗体の挙動を考慮すると、それは領域１４５−２３４（配列番号２）を
より特異的に認識するようである。
【００７９】 平行して、抗体CSG06のエピトープの配列を、合成ペプチドによって特定した
。配列１９８−２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部分的に親水性で部
分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的なグルタミン酸（２
１０−２１８）の第一の領域を含み、とりわけ二つのプロリンによって隣接され
る３のグルタミン酸の配列（２２７−２３２）を含む。配列２０７−２３４及び
２１９−２４５に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合成
した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに固
定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、各
ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いでチ
ューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチド
のそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定を
示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号３，即ち領域２１９−２３４
に相当し、上述のポリグルタミン酸２２７−２３２部位を包含する。
。配列１９８−２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部分的に親水性で部
分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的なグルタミン酸（２
１０−２１８）の第一の領域を含み、とりわけ二つのプロリンによって隣接され
る３のグルタミン酸の配列（２２７−２３２）を含む。配列２０７−２３４及び
２１９−２４５に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合成
した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに固
定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、各
ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いでチ
ューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチド
のそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定を
示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号３，即ち領域２１９−２３４
に相当し、上述のポリグルタミン酸２２７−２３２部位を包含する。
【００８０】 同様な態様で、CSG20のエピトープを、パンクレアスタチンの配列に関して特
定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの
アミノ酸２５０−３０１の配列番号５）を、以下の免疫放射線アッセイの第二の
インキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/C
SG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列
２５０−３０１を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CSG20★の場合、加
えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チューブ当たり０．５
μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、パンクレアスタチ
ンに相当する配列である、ヒトＣｇＡのアミノ酸２５０−３０１の配列番号５を
よく認識する。
定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの
アミノ酸２５０−３０１の配列番号５）を、以下の免疫放射線アッセイの第二の
インキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/C
SG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列
２５０−３０１を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CSG20★の場合、加
えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チューブ当たり０．５
μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、パンクレアスタチ
ンに相当する配列である、ヒトＣｇＡのアミノ酸２５０−３０１の配列番号５を
よく認識する。
【００８１】 図２は、クロモグラニンＡの全分子に対するこれらの抗体の位置を示し、これ
らの抗体によって認識される配列も示す。
らの抗体によって認識される配列も示す。
【００８２】 本発明に従って、抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、再生産可能
で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。
抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう
。
で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。
抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう
。
【００８３】 抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、サンドイッチタイプのアッセ
イを実施するためにペアを形成できるであろう。
イを実施するためにペアを形成できるであろう。
【００８４】 以下の実施例は、このタイプのアッセイを説明する。
【００８５】
実施例１：ヒトクロモグラニンＡのラジオイムノアッセイ この実施例において、アッセイのために使用される抗体は、配列番号３，即ち
アミノ酸２１９からアミノ酸２３４に亘る領域に特異的なCSG06である。このア
ッセイを実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダ
ードサンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒ
ｈＣｇＡ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
アミノ酸２１９からアミノ酸２３４に亘る領域に特異的なCSG06である。このア
ッセイを実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダ
ードサンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒ
ｈＣｇＡ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８６】 さらに、ヨウ素１２５でラベルしたｒｈＣｇＡを、以前に記載されたように使
用する。
用する。
【００８７】 このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びアッセイされるサ
ンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラ
ベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体
の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しなが
ら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒ
ト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを
加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコ
ール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分
離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
ンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラ
ベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体
の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しなが
ら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒ
ト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを
加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコ
ール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分
離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
【００８８】 スタンダードサンプルから標準曲線が得られ、アッセイされたサンプルのクロ
モグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定す
る。
モグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定す
る。
【００８９】 スタンダード０での測定再現性によって決定された検出限界（１０回の測定当
たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ
／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプ
ルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平
行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製
された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す
。
たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ
／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプ
ルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平
行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製
された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す
。
【００９０】 このアッセイを、健康な患者から得た４６のＥＤＴＡ血漿と、クロム親和性細
胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで
試験した。
胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで
試験した。
【００９１】 図４は、試験された各種の血漿に対するこのアッセイで得られた結果を示す。
この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
【００９２】 正常な集団と各他の集団のペアを比較する分散分析により、各場合においてＣｇ
Ａ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、
各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較
すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬ
Ｃ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ
＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノ
イド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経
内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
Ａ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、
各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較
すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬ
Ｃ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ
＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノ
イド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経
内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
【００９３】 このアッセイにおいて、見出されたＣｇＡ濃度は、以下のものである： − 健康な患者から得た血漿のプール（ＮＰ）について４０ｎｇ／ｍｌ − クロム親和性細胞腫に罹患している患者から得た血漿のプール（ＰＰ）につ
いて６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに − 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）につ
いて１６００ｎｇ／ｍｌ。
いて６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに − 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）につ
いて１６００ｎｇ／ｍｌ。
【００９４】 実施例２：サンドイッチ法（ＴＲＭＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセ
イ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、アミノ
酸２１９−２３４の配列番号３に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、ア
ミノ酸１４５−１９７の配列番号４に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を
、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチュー
ブをこの抗体で皮膜する。
イ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、アミノ
酸２１９−２３４の配列番号３に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、ア
ミノ酸１４５−１９７の配列番号４に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を
、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチュー
ブをこの抗体で皮膜する。
【００９５】 第二の抗体を、ｒｈＣｇＡのラベリングについて上述したクロラミンＴ法を使
用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２
５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２
５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
【００９６】 アッセイで使用される緩衝液は、５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4／ＫＨ２Ｐ
Ｏ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．０より成る。
Ｏ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．０より成る。
【００９７】 各アッセイについて、１ｍｌのアッセイ緩衝液、及び５０μｌのスタンダード
サンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに
加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２
ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CS
G30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間イ
ンキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性を
ガンマカウンターで測定する。
サンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに
加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２
ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CS
G30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間イ
ンキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性を
ガンマカウンターで測定する。
【００９８】 実施例１と同様に、周知の濃度のスタンダードサンプルから較正曲線を得、ア
ッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にし
て測定する。
ッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にし
て測定する。
【００９９】 アッセイの特異性をチェックするために、正常のプール（ＮＰ）並びにクロム
親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそ
れぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそ
れぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
【０１００】 この特異性は、病的プールＰＰまたはＣＰと正常プールＮＰの間のＣｇＡ濃度
の比を測定することによって評価される。
の比を測定することによって評価される。
【０１０１】 この実施例の場合、ＣｇＡ濃度比ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰは以下のものであ
る： ＰＰ／ＮＰ＝９．９ ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
る： ＰＰ／ＮＰ＝９．９ ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
【０１０２】 実施例１のアッセイについて、比は以下のものであった： ＰＰ／ＮＰ＝１６．９ ＣＰ／ＮＰ＝４０
【０１０３】 比較のために、１２００ｎｇ／ｍｌでのスタンダードサンプルについて得られ
た結合パーセンテージは６５．５１である。
た結合パーセンテージは６５．５１である。
【０１０４】 それ故この抗体の組み合わせは、高いシグナルを得ることを可能にし、二つの
病的プールの間を識別可能である。
病的プールの間を識別可能である。
【０１０５】 添付された表３において、各種の抗体のペアで同じサンドイッチアッセイを実
施することによって得られた結果が示される。
施することによって得られた結果が示される。
【０１０６】 これらの結果は、共に関連するまたは抗体CSG20と関連する二つの抗体CSG06及
びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であるこ
とを示す。
びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であるこ
とを示す。
【０１０７】 比較のために、同じアッセイを表2の他の抗体を使用して実施したが、これら
は満足な結果を生じなかった。
は満足な結果を生じなかった。
【０１０８】 それ故、もしCSG21またはCSG10を第二のラベル化抗体として使用するのであれ
ば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰ
とプールＮＰの間を識別することは不可能である。
ば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰ
とプールＮＰの間を識別することは不可能である。
【０１０９】 CSG21/CSG06★、CSG21/CSG30★またはCSG32/CSG03★のような他の組み合わせ
は、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するた
めに、興味深くはない。
は、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するた
めに、興味深くはない。
【０１１０】 図５は、本発明に従った実施例１及び２のイムノアッセイ、並びにCSG06/ラベ
ル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、
実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29
及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピ
トープを共有する。
ル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、
実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29
及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピ
トープを共有する。
【０１１１】 この図において、結果は、病的な血漿の濃度と正常集団の９５％の値（ｎ＝２
０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平
均値を示す。
０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平
均値を示す。
【０１１２】 この図は、同様な結果が実施例１及び２で得られることを示す。一方で、CSG0
6/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度
が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさら
に強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５
０％で検出不可能である。
6/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度
が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさら
に強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５
０％で検出不可能である。
【０１１３】 それ故、最適な結果は、本発明に従ったＣｇＡのアミノ酸１４５−２３４の配
列番号2の抗体で得られる。
列番号2の抗体で得られる。
【０１１４】 実施例３：同種相サンドイッチ法及び蛍光（ＦＩＡ法）を使用したクロモグラニ
ンＡのアッセイ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、アミノ
酸２１９−２３４の配列番号３に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、ア
ミノ酸１４５−１９７の配列番号４に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である
。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテー
トで接合した。
ンＡのアッセイ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、アミノ
酸２１９−２３４の配列番号３に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、ア
ミノ酸１４５−１９７の配列番号４に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である
。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテー
トで接合した。
【０１１５】 第二の抗体CSG30（またはCSG33)を、エネルギーアクセプター化合物であるア
ロフィコシアニンで接合した。
ロフィコシアニンで接合した。
【０１１６】 使用されるユウロピウムクリプテートは、クリプテートＥｕトリスビピリジン
ジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[I
I]に記載され、以下の式を有する：
ジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[I
I]に記載され、以下の式を有する：
【化１】
【０１１７】 CSG06-クリプテート接合体を、Clin. Chem., 39, 1993, 196-201頁[12]中のLo
pez等によって記載された方法を使用して調製する。
pez等によって記載された方法を使用して調製する。
【０１１８】 CSG30（またはCSG33)-アロフィコシアニン（ＡＰＣ）接合体を、WO92/01225[1
3]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用
する： − 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１
％Kachon、 − インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１
．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
3]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用
する： − 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１
％Kachon、 − インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１
．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
【０１１９】 黒色の９６穴ウェルマルチディッシュの各ウェルに、以下の順序で加える： − ０．５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG06-
クリプテート接合体 − ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（ま
たはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに − インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターま
たはアッセイされるサンプル。
クリプテート接合体 − ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（ま
たはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに − インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターま
たはアッセイされるサンプル。
【０１２０】 それらを３７℃で１時間インキュベーションし、次いで各ウェルの蛍光を、Cl
in. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測
定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
in. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測
定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
【０１２１】 得られた結果が図６に示され、検出されたシグナルに対するＣｇＡ濃度（ｎｇ
／ｍｌ）を示す。
／ｍｌ）を示す。
【０１２２】 かくして抗体CSG06及びCSG30（またはCSG33)を使用して実施されたアッセイの
感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍ
ｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、
５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセ
イ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセ
イ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍ
ｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、
５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセ
イ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセ
イ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
【０１２３】 混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの所定量を有する周知のＣｇＡ濃度
の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー
試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃
度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の
結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６
％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる
一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能で
あることを示す。
の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー
試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃
度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の
結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６
％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる
一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能で
あることを示す。
【０１２４】 １００の正常サンプルと、神経内分泌型の腫瘍の病理に罹患している患者から
得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載さ
れたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。そ
の結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．
０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載さ
れたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。そ
の結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．
０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
【０１２５】 １００の正常サンプルと９５の病的サンプルの比較研究の結果が図８及び表５
に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、十し
れ３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(
CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号３（２１９−２
３４）に対して向けられたCSG06と関連した配列番号４（配列１４５−１９７）
に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、十し
れ３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(
CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号３（２１９−２
３４）に対して向けられたCSG06と関連した配列番号４（配列１４５−１９７）
に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
【０１２６】
【参考文献】
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
【表２】 １）Ｘａａ＝未決定のアミノ酸 ２）配列を合成ペプチドを使用して特定した。認識された配列が実際に領域２１
９−２３４に制限されることを示すことができた。 ３）また、抗体CSG20が配列２５０−３０１（ヒトパンクレアスタチン）に相当
するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
９−２３４に制限されることを示すことができた。 ３）また、抗体CSG20が配列２５０−３０１（ヒトパンクレアスタチン）に相当
するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
【０１２９】
【表３】
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
【表５】
【図１】 図１は、成熟ヒトＣｇＡの４３９アミノ酸の配列番号１を説明
する。
する。
【図２】 図２は、タンパク質溶解によって得られる断片、及びヒトＣｇ
Ａのタンパク質上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列を単純化して説
明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示す。いくつかの
エピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
Ａのタンパク質上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列を単純化して説
明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示す。いくつかの
エピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
【図３】 図３は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによるタンパク質溶解
の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクト
ルを示す。
の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクト
ルを示す。
【図４】 図４は、本発明に従った競合的アッセイ（ＲＩＡ）によって試
験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセ
イグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示
す。
験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセ
イグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示
す。
【図５】 図５は、各種の抗体を使用した競合的アッセイと比較した、３
種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正
常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態
で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正
常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態
で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
【図６】 図６は、本発明に従った同種相を使用した、検出された蛍光（
Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を
示す。
Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を
示す。
【図７】 図７は、ＣｇＡのＦＩＡ及びＩＲＭＡアッセイで得られた結果
（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
【図８】 図８は、図２及び３のＩＲＭＡ及びＦＩＡを使用した正常サン
プル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
プル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月１６日（２００１．８．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のイムノアッセイ、このアッ
セイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキット
セイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキット
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明の主題は、ヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイのための方法であり
、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグ
ラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグ
ラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
【０００２】 上記アッセイは、例えばクロム親和性細胞腫及び腸カルチノイドのような、病
理の診断及び治療のために得に使用できる。
理の診断及び治療のために得に使用できる。
【０００３】
【従来の技術】 クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）は、４８ｋＤａの分子量、４．９のｐＩを有する
タンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に
記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通
性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に
、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神
経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の
主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミン
のような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
タンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に
記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通
性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に
、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神
経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の
主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミン
のような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
【０００４】 ＣｇＡはまた、小球内及びマトリックス外タンパク質溶解性分解に引き続き、
活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
【０００５】 添付した図１において、配列番号１は、ヒトクロモグラニンＡに相当する、Ko
necki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
necki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
【０００６】 図２は、単純な様式でこの配列を示し、この図において、ヒトにおいて放出さ
れ得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パン
クレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は
、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配
列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は
、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それ
は組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示
されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び
尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
れ得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パン
クレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は
、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配
列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は
、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それ
は組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示
されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び
尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
【０００７】 参考文献[2]のCorti等による最近の研究により、クロム親和性細胞腫に罹患し
ている患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在
することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14
ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織
において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
ている患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在
することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14
ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織
において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
【０００８】 正常組織及び相当する腫瘍組織における検出に加えて、数多くの研究により、
ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は
、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い
。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され
、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性
病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15
]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの
場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる
。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は
、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い
。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され
、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性
病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15
]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの
場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる
。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
【０００９】 文献US-A-4 758 522[3]は、ＣｇＡのイムノアッセイを記載し、その場合抗ヒ
トＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによ
って、ＣｇＡを測定する。
トＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによ
って、ＣｇＡを測定する。
【００１０】 参考文献[4]においてSyversen等は、配列番号１アミノ酸２１０から４３９に
相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法で
のクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッ
セイを記載している。
相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法で
のクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッ
セイを記載している。
【００１１】 参考文献[2]においてCorti等はまた、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸８１か ら９０及び配列番号１アミノ酸６８から７０ に対して向けられたモノクローナル
抗体を使用するＣｇＡの二つのアッセイを記載している。
抗体を使用するＣｇＡの二つのアッセイを記載している。
【００１２】 それ故これらのアッセイは、いくつかのＣｇＡ断片を考慮しているが、該アッ
セイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
セイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
【００１３】 実際に、分子のタンパク質溶解及び循環断片の多様性は、これらの分子の多様
性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は正に、循環血液中で見出される完全なＣｇＡの濃度及び腫瘍断
片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】 本発明に従って、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対
するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端から（配列番号１）アミノ酸１４ ５から２８４位 に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結
合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む
。
するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端から（配列番号１）アミノ酸１４ ５から２８４位 に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結
合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む
。
【００１６】 本発明に従って、用語、イムノアッセイは、例えば競合的アッセイ、サンドイ
ッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応
を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイ
プのイムノアッセイを包含する。
ッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応
を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイ
プのイムノアッセイを包含する。
【００１７】 本発明の第一の実施態様に従って、イムノアッセイは、上記抗体の部位に対す
る、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（
ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
る、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（
ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
【００１８】 このアッセイを実施するために、アッセイされるサンプルに対し、一定量のラ
ベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４に位置する
エピトープに対して特異的に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションす
る。この態様において、競合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡ
とラベル化ＣｇＡとの間で規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素
を使用する異種相で実施される場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形
成される抗体−ｈＣｇＡ複合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放
射性活性を測定することによって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサン
プルから得られた標準曲線を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能であ
る。
ベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４に位置する
エピトープに対して特異的に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションす
る。この態様において、競合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡ
とラベル化ＣｇＡとの間で規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素
を使用する異種相で実施される場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形
成される抗体−ｈＣｇＡ複合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放
射性活性を測定することによって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサン
プルから得られた標準曲線を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能であ
る。
【００１９】 例えばラベル化ｈＣｇＡ及び該ラベル化ｈＣｇＡによって放射されるシグナル
を調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能であ
る。
を調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能であ
る。
【００２０】 このアッセイにおいて、使用される抗体は有利には、ヒトＣｇＡの配列番号１ アミノ酸２１９から２３４ 中に位置するエピトープに特異的な抗体、またはヒト
ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的
な抗体である。これらの抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的
な抗体である。これらの抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２１】 このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びラベル化ＣｇＡの
調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、また
は好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、また
は好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
【００２２】 本発明の第二の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号 １アミノ酸１４５から２３４ 中に位置する第一のエピトープに特異的に結合する
第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列番 号１アミノ酸１４５から２３４ 中に位置する第一のものとは異なる第二のエピト
ープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二
つの抗体の一方がラベルされているものを使用するサンドイッチタイプのアッセ
イである。
第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列番 号１アミノ酸１４５から２３４ 中に位置する第一のものとは異なる第二のエピト
ープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二
つの抗体の一方がラベルされているものを使用するサンドイッチタイプのアッセ
イである。
【００２３】 本発明のこの第二の実施態様において、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５か ら１９７ 中に位置する異なるエピトープに特異的な二つの抗体が使用される。こ
のアッセイは、固相上に第一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用するこ
とによって異種相で実施されてもよい。
のアッセイは、固相上に第一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用するこ
とによって異種相で実施されてもよい。
【００２４】 このアッセイはまた、第一のラベル抗体と、該抗体によって放射されるシグナ
ルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
ルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
【００２５】 例として、第一の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に
位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミ ノ酸２１９から２３４ 中に位置するエピトープに特異的であってもよい。
位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミ ノ酸２１９から２３４ 中に位置するエピトープに特異的であってもよい。
【００２６】 このアッセイにおいて、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中 に位置するエピトープに特異的な第一の抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ 酸１４５から１９７ 中に位置するエピトープに特異的な第二の抗体とを使用する
ことも可能である。
ことも可能である。
【００２７】 本発明の第三の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号 １アミノ酸１４５から２３４ 中に位置するエピトープに特異的に結合する第一の
モノクローナルまたはポリクローナル抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸 ２５０から３０１ 中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されてい
るものを使用するサンドイッチアッセイである。
モノクローナルまたはポリクローナル抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸 ２５０から３０１ 中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されてい
るものを使用するサンドイッチアッセイである。
【００２８】 本発明のこの実施態様において、アッセイは、固相に固定した第一の抗体と、
第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されても
よい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な
第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施すること
も可能である。
第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されても
よい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な
第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施すること
も可能である。
【００２９】 第一の抗体として、有利にはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９ ４ に特異的な抗体が使用され、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９か ら２３４ に特異的な抗体が使用される。
【００３０】 本発明の方法は、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍に罹患している
患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親
和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有
利である。
患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親
和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有
利である。
【００３１】 本発明の方法を実施するために、異種相における従来のイムノアッセイ法が使
用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である
。
用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である
。
【００３２】 本発明の方法において、上記分離を含まない異種相アッセイ法を使用すること
も可能である。
も可能である。
【００３３】 異種相アッセイ法は、抗体−抗原のペアまたは二つの抗体のペアの使用に基づ
き、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放
射する。
き、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放
射する。
【００３４】 この目的のために、発光性エネルギーアクセプター化合物に結合された抗体、
及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
【００３５】 例として、発光性エネルギーアクセプター化合物は、アロフィコシアニンであ
り得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもの
のようなユウロピウムクリプテートであり得る。
り得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもの
のようなユウロピウムクリプテートであり得る。
【００３６】 特に興味深い一つの同種相アッセイ法は、参考文献[4]に記載されたTRACE（登
録商標）法である。
録商標）法である。
【００３７】 異種相アッセイに関しては、アッセイで使用される非ラベル化抗体が固定され
ている固相を使用する。
ている固相を使用する。
【００３８】 使用可能な固相は、各種のタイプが存在し得る。例えば、ポリマーまたは他の
材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得
る。
材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得
る。
【００３９】 使用可能なポリマーは、例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、
ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
【００４０】 例えばポリマー、タンパク質または他の材料より成るパウダー及びアグリゲー
トといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
トといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
【００４１】 本発明の下で、本発明の第一の実施態様におけるＣｇＡ、及び第二の実施態様
における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗
体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍
光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量
的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメント
によって修飾されていることを意味する。
における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗
体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍
光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量
的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメント
によって修飾されていることを意味する。
【００４２】 本発明はまた、ヒトクロモグラニンの配列番号１アミノ酸１４５から１９７若
しくは配列番号１アミノ酸２１９から２３４のそれぞれに位置するエピトープに
特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若しくは固相
に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
しくは配列番号１アミノ酸２１９から２３４のそれぞれに位置するエピトープに
特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若しくは固相
に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
【００４３】 これらの抗体は、全てのタイプのアッセイに適しているため特に興味深い。そ
れらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、
一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニ
ンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
れらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、
一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニ
ンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
【００４４】 本発明はまた、上述のモノクローナル抗体を含むヒトＣｇＡのためにイムノア
ッセイキットに関する。
ッセイキットに関する。
【００４５】 それはまた、 − 第一の抗体、並びに − 第二の抗体 を含み、二つの抗体の少なくとも一つは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４ ５から２３４ 中に位置するエピトープに特異的な抗体であるものを含む、ヒトＣ
ｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
ｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
【００４６】 キットの第一の実施態様に従って、第一の抗体及び第二の抗体は、ヒトＣｇＡ
の配列番号１アミノ酸配列１４５から１９７及び／または配列番号１アミノ酸２ １９から２３４ 中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される。
の配列番号１アミノ酸配列１４５から１９７及び／または配列番号１アミノ酸２ １９から２３４ 中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される。
【００４７】 キットの第二の実施態様に従って、抗体の一つは、配列番号１アミノ酸１４５ から１９７ または配列番号１アミノ酸配列２１９から２３４中に位置するエピト
ープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から ３０１ 中に位置するエピトープに特異的である。
ープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から ３０１ 中に位置するエピトープに特異的である。
【００４８】 好ましくは、キットが異種相アッセイについて企図される場合、抗体の一つは
固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
【００４９】 検出可能なラベルは、例えばヨウ素１２５である。
【００５０】 好ましくは、キットが同種相で企図される場合、抗体の一つは発光性エネルギ
ードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に
結合される。
ードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に
結合される。
【００５１】 別法として、発光性エネルギードナー化合物はユウロピウムクリプテートであ
り、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
り、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
【００５２】 それはまた、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピ
トープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
トープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
【００５３】 このキットにおいて、抗体は好ましくは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２ １９から２３４ 、または配列番号１アミノ酸１４３から１９７中に位置するエピ
トープに特異的である。
トープに特異的である。
【００５４】 本発明に従って、アッセイのために使用される抗体は、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。
たはモノクローナル抗体であり得る。
【００５５】 ポリクローナル抗体は、ヒトＣｇＡのタンパク質溶解またはペプチド合成によ
って得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vi
tro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るため
に、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片
を結合することが必要である。
って得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vi
tro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るため
に、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片
を結合することが必要である。
【００５６】 モノクローナル抗体は、Nature, 1975, 256, 495-497頁に記載されたK, Kohle
r及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この
場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピ
トープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、
次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実
施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエ
ピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
r及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この
場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピ
トープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、
次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実
施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエ
ピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
【００５７】 好ましくは、本発明に従って、モノクローナル抗体が使用される。
【００５８】 本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載の実施態様の例を読むことでより明
確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的
で、非制限的な目的を有するものである。
確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的
で、非制限的な目的を有するものである。
【００５９】 以下の記載は、ヒトＣｇＡの各種の異なるエピトープに対して向けられたモノ
クローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した
抗体の選択を説明する。
クローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した
抗体の選択を説明する。
【００６０】
【発明の実施の形態】 １）モノクローナル抗体の調製 １．ヒトＣｇＡの単離及び精製 参考文献[6]においてO'Connorによって記載された方法を、クロム親和性細胞
腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。
該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載された
ようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用し
て、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出
する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot
等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産され
る。
腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。
該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載された
ようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用し
て、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出
する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot
等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産され
る。
【００６１】 ２．精製ＣｇＡのラベリング（125Ｉ−ｈＣｇＡ） 天然及び組換えＣｇＡを、１５００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Hunter及び
GreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を
、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラ
ベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
GreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を
、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラ
ベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
【００６２】 ３．免疫化 ６から８週齢のBalb/cマウスを、フロイント完全アジュバント中で事前に得ら
れた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免
疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント
中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの
免疫沈降での血清滴定によって実施する。
れた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免
疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント
中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの
免疫沈降での血清滴定によって実施する。
【００６３】 ４．ハイブリドーマの生産及びスクリーニング マウスを引き続き、０．９％ＮａＣｌ溶液中に１０ｍｇのｈＣｇＡで、静脈内
経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３
７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミ
エローマ細胞と融合する。
経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３
７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミ
エローマ細胞と融合する。
【００６４】 陽性クローンを、125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降によって同定する。陽性クロ
ーンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテ
インＡゲルを使用して精製する。
ーンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテ
インＡゲルを使用して精製する。
【００６５】 ｈＣｇＡに対して免疫化されたマウスで、１１の融合物を生産した。二つのみ
が成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化
された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より
、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩ
ｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
が成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化
された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より
、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩ
ｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
【００６６】 ５．モノクローナル抗体の同定 各種のファミリーのＣｇＡエピトープを、製造者の説明書に従って、Biacore
（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した
。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌ
のＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの
割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡに
ついて使用した。
（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した
。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌ
のＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの
割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡに
ついて使用した。
【００６７】 Biocoreでのこの分析は、試験された２４の抗体を、表１に示されたような８
のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グ
ループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害
のため、さらにサブグループに分割され得る。
のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グ
ループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害
のため、さらにサブグループに分割され得る。
【００６８】 固定化抗体−ｒｈＣｇＡ反応の化学量論は、０．１５７から０．６２１抗原の
モル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
モル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
【００６９】 各グループまたはサブグループ中の抗体は、推測的に同じ配列の認識を示す。
【００７０】 ６．組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）から由来するペプチドでの抗体の同定 ２ｎｍｏｌのｒｈＣｇＡを、１００ｎｍｏｌｅ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ
８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエン
ドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエン
ドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
【００７１】 次いで生産されたｒｈＣｇＡから由来するペプチドを、Machereyゲルカラム、
NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４
ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用
し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペ
プチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から
７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回
収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４
ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用
し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペ
プチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から
７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回
収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
【００７２】 図３は、１から６まで数字を付された時間の関数としてのカラムから溶出され
回収された分画を説明する。
回収された分画を説明する。
【００７３】 精製ペプチドの配列を、Applied Biosystems社製の４７３Ａミクロシークエン
サーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブ
テンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−
フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)での
クロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、
参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
サーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブ
テンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−
フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)での
クロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、
参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
【００７４】 これらの分画を、事前に得られたモノクローナル抗体を同定するために使用す
る。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する
。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈され
たモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
る。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する
。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈され
たモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
【００７５】 第二の抗体は、アルカリホスファターゼを接合した抗マウスＩｇＧである。酵
素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍ
ｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏ
ｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０
ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍ
ｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏ
ｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０
ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
【００７６】 表１の各グループのモノクローナル抗体、即ち、事前に生産された抗体CSG04,
CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィ
ーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィ
ーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
【００７７】 表２は、各種の分画とこれらの分画を認識する抗体との間の相関関係を説明す
る。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡ
のＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、配列 番号１アミノ酸３３９から３５５及び３５６から４００ の領域に対して高い特異
性を有するタンパク質のＣ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエ
スタンブロットによって直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域
（配列番号１アミノ酸３４０から３９４及び３９５から４３９）に位置する。
る。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡ
のＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、配列 番号１アミノ酸３３９から３５５及び３５６から４００ の領域に対して高い特異
性を有するタンパク質のＣ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエ
スタンブロットによって直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域
（配列番号１アミノ酸３４０から３９４及び３９５から４３９）に位置する。
【００７８】 抗体CSG06, CSG20及びCSG30はタンパク質の配列番号１アミノ酸１４５から２
３４に特異的であり、それぞれ配列番号１の断片アミノ酸１９８から２４５，２ ４６から３０３及び１４５から１９７ に相当する。最後に、抗体CSG32は、配列
番号１アミノ酸１０から４００に亘る主要な断片と強力に反応することに注意す
べきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合するこの抗体の挙動を
考慮すると、それは配列番号１アミノ酸１４５から２３４をより特異的に認識す
るようである。
３４に特異的であり、それぞれ配列番号１の断片アミノ酸１９８から２４５，２ ４６から３０３及び１４５から１９７ に相当する。最後に、抗体CSG32は、配列
番号１アミノ酸１０から４００に亘る主要な断片と強力に反応することに注意す
べきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合するこの抗体の挙動を
考慮すると、それは配列番号１アミノ酸１４５から２３４をより特異的に認識す
るようである。
【００７９】 平行して、抗体CSG06のエピトープの配列を、合成ペプチドによって特定した
。配列番号１アミノ酸１９８から２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部
分的に親水性で部分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的な
グルタミン酸（配列番号１アミノ酸２１０から２１８）の第一の領域を含み、と
りわけ二つのプロリンによって隣接される３のグルタミン酸の配列（配列番号１ アミノ酸２２７から２３２ ）を含む。配列番号１アミノ酸２０７から２３４及び ２１９から２４５ に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合
成した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに
固定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、
各ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いで
チューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチ
ドのそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定
を示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号１アミノ酸２１９から２３ ４ に相当し、上述のポリグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２２７から２３２） 部位を包含する。
。配列番号１アミノ酸１９８から２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部
分的に親水性で部分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的な
グルタミン酸（配列番号１アミノ酸２１０から２１８）の第一の領域を含み、と
りわけ二つのプロリンによって隣接される３のグルタミン酸の配列（配列番号１ アミノ酸２２７から２３２ ）を含む。配列番号１アミノ酸２０７から２３４及び ２１９から２４５ に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合
成した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに
固定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、
各ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いで
チューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチ
ドのそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定
を示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号１アミノ酸２１９から２３ ４ に相当し、上述のポリグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２２７から２３２） 部位を包含する。
【００８０】 同様な態様で、CSG20のエピトープを、パンクレアスタチンの配列に関して特
定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの 配列番号１アミノ酸２５０から３０１ ）を、以下の免疫放射線アッセイの第二の
インキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/C
SG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列 番号１アミノ酸２５０から３０１ を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CS
G20★の場合、加えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チュ
ーブ当たり０．５μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、
パンクレアスタチンに相当する配列である、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２ ５０から３０１ をよく認識する。
定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの 配列番号１アミノ酸２５０から３０１ ）を、以下の免疫放射線アッセイの第二の
インキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/C
SG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列 番号１アミノ酸２５０から３０１ を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CS
G20★の場合、加えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チュ
ーブ当たり０．５μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、
パンクレアスタチンに相当する配列である、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２ ５０から３０１ をよく認識する。
【００８１】 図２は、クロモグラニンＡの全分子に対するこれらの抗体の位置を示し、これ
らの抗体によって認識される配列も示す。
らの抗体によって認識される配列も示す。
【００８２】 本発明に従って、抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、再生産可能
で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。
抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう
。
で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。
抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう
。
【００８３】 抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、サンドイッチタイプのアッセ
イを実施するためにペアを形成できるであろう。
イを実施するためにペアを形成できるであろう。
【００８４】 以下の実施例は、このタイプのアッセイを説明する。
【００８５】
【実施例】 実施例１：ヒトクロモグラニンＡのラジオイムノアッセイ この実施例において、アッセイのために使用される抗体は、クロモグラニンＡ の配列番号１アミノ酸２１９から２３４ に特異的なCSG06である。このアッセイ
を実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダードサ
ンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒｈＣｇ
Ａ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
を実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダードサ
ンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒｈＣｇ
Ａ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８６】 さらに、ヨウ素１２５でラベルしたｒｈＣｇＡを、以前に記載されたように使
用する。
用する。
【００８７】 このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びアッセイされるサ
ンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラ
ベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体
の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しなが
ら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒ
ト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを
加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコ
ール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分
離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
ンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラ
ベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体
の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しなが
ら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒ
ト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを
加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコ
ール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分
離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
【００８８】 スタンダードサンプルから標準曲線が得られ、アッセイされたサンプルのクロ
モグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定す
る。
モグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定す
る。
【００８９】 スタンダード０での測定再現性によって決定された検出限界（１０回の測定当
たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ
／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプ
ルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平
行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製
された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す
。
たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ
／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプ
ルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平
行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製
された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す
。
【００９０】 このアッセイを、健康な患者から得た４６のＥＤＴＡ血漿と、クロム親和性細
胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで
試験した。
胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで
試験した。
【００９１】 図４は、試験された各種の血漿に対するこのアッセイで得られた結果を示す。
この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
【００９２】 正常な集団と各他の集団のペアを比較する分散分析により、各場合においてＣｇ
Ａ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、
各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較
すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬ
Ｃ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ
＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノ
イド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経
内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
Ａ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、
各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較
すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬ
Ｃ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ
＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノ
イド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経
内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
【００９３】 このアッセイにおいて、見出されたＣｇＡ濃度は、以下のものである： − 健康な患者から得た血漿のプール（ＮＰ）について４０ｎｇ／ｍｌ − クロム親和性細胞腫に罹患している患者から得た血漿のプール（ＰＰ）につ
いて６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに − 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）につ
いて１６００ｎｇ／ｍｌ。
いて６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに − 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）につ
いて１６００ｎｇ／ｍｌ。
【００９４】 実施例２：サンドイッチ法（ＴＲＭＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセ
イ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番 号１アミノ酸２１９から２３４ に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配
列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を
、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチュー
ブをこの抗体で皮膜する。
イ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番 号１アミノ酸２１９から２３４ に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配
列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を
、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチュー
ブをこの抗体で皮膜する。
【００９５】 第二の抗体を、ｒｈＣｇＡのラベリングについて上述したクロラミンＴ法を使
用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２
５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２
５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
【００９６】 アッセイで使用される緩衝液は、５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4／ＫＨ２Ｐ
Ｏ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．０より成る。
Ｏ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐ
Ｈ７．０より成る。
【００９７】 各アッセイについて、１ｍｌのアッセイ緩衝液、及び５０μｌのスタンダード
サンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに
加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２
ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CS
G30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間イ
ンキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性を
ガンマカウンターで測定する。
サンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに
加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２
ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CS
G30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間イ
ンキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性を
ガンマカウンターで測定する。
【００９８】 実施例１と同様に、周知の濃度のスタンダードサンプルから較正曲線を得、ア
ッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にし
て測定する。
ッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にし
て測定する。
【００９９】 アッセイの特異性をチェックするために、正常のプール（ＮＰ）並びにクロム
親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそ
れぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそ
れぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
【０１００】 この特異性は、病的プールＰＰまたはＣＰと正常プールＮＰの間のＣｇＡ濃度
の比を測定することによって評価される。
の比を測定することによって評価される。
【０１０１】 この実施例の場合、ＣｇＡ濃度比ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰは以下のものであ
る： ＰＰ／ＮＰ＝９．９ ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
る： ＰＰ／ＮＰ＝９．９ ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
【０１０２】 実施例１のアッセイについて、比は以下のものであった： ＰＰ／ＮＰ＝１６．９ ＣＰ／ＮＰ＝４０
【０１０３】 比較のために、１２００ｎｇ／ｍｌでのスタンダードサンプルについて得られ
た結合パーセンテージは６５．５１である。
た結合パーセンテージは６５．５１である。
【０１０４】 それ故この抗体の組み合わせは、高いシグナルを得ることを可能にし、二つの
病的プールの間を識別可能である。
病的プールの間を識別可能である。
【０１０５】 添付された表３において、各種の抗体のペアで同じサンドイッチアッセイを実
施することによって得られた結果が示される。
施することによって得られた結果が示される。
【０１０６】 これらの結果は、共に関連するまたは抗体CSG20と関連する二つの抗体CSG06及
びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であるこ
とを示す。
びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であるこ
とを示す。
【０１０７】 比較のために、同じアッセイを表2の他の抗体を使用して実施したが、これら
は満足な結果を生じなかった。
は満足な結果を生じなかった。
【０１０８】 それ故、もしCSG21またはCSG10を第二のラベル化抗体として使用するのであれ
ば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰ
とプールＮＰの間を識別することは不可能である。
ば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰ
とプールＮＰの間を識別することは不可能である。
【０１０９】 CSG21/CSG06★、CSG21/CSG30★またはCSG32/CSG03★のような他の組み合わせ
は、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するた
めに、興味深くはない。
は、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するた
めに、興味深くはない。
【０１１０】 図５は、本発明に従った実施例１及び２のイムノアッセイ、並びにCSG06/ラベ
ル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、
実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29
及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピ
トープを共有する。
ル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、
実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29
及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピ
トープを共有する。
【０１１１】 この図において、結果は、病的な血漿の濃度と正常集団の９５％の値（ｎ＝２
０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平
均値を示す。
０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平
均値を示す。
【０１１２】 この図は、同様な結果が実施例１及び２で得られることを示す。一方で、CSG0
6/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度
が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさら
に強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５
０％で検出不可能である。
6/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度
が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさら
に強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５
０％で検出不可能である。
【０１１３】 それ故、最適な結果は、本発明に従ったＣｇＡのアミノ酸１４５−２３４の配
列番号2の抗体で得られる。
列番号2の抗体で得られる。
【０１１４】 実施例３：同種相サンドイッチ法及び蛍光（ＦＩＡ法）を使用したクロモグラニ
ンＡのアッセイ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番 号１アミノ酸２１９から２３４ に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配
列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である
。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテー
トで接合した。
ンＡのアッセイ このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番 号１アミノ酸２１９から２３４ に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配
列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である
。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテー
トで接合した。
【０１１５】 第二の抗体CSG30（またはCSG33)を、エネルギーアクセプター化合物であるア
ロフィコシアニンで接合した。
ロフィコシアニンで接合した。
【０１１６】 使用されるユウロピウムクリプテートは、クリプテートＥｕトリスビピリジン
ジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[I
I]に記載され、以下の式を有する：
ジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[I
I]に記載され、以下の式を有する：
【化１】
【０１１７】 CSG06-クリプテート接合体を、Clin. Chem., 39, 1993, 196-201頁[12]中のLo
pez等によって記載された方法を使用して調製する。
pez等によって記載された方法を使用して調製する。
【０１１８】 CSG30（またはCSG33)-アロフィコシアニン（ＡＰＣ）接合体を、WO92/01225[1
3]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用
する： − 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１
％Kachon、 − インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１
．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
3]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用
する： − 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１
％Kachon、 − インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１
．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
【０１１９】 黒色の９６穴ウェルマルチディッシュの各ウェルに、以下の順序で加える： − ０．５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG06-
クリプテート接合体 − ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（ま
たはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに − インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターま
たはアッセイされるサンプル。
クリプテート接合体 − ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（ま
たはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに − インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターま
たはアッセイされるサンプル。
【０１２０】 それらを３７℃で１時間インキュベーションし、次いで各ウェルの蛍光を、Cl
in. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測
定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
in. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測
定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
【０１２１】 得られた結果が図６に示され、検出されたシグナルに対するＣｇＡ濃度（ｎｇ
／ｍｌ）を示す。
／ｍｌ）を示す。
【０１２２】 かくして抗体CSG06及びCSG30（またはCSG33)を使用して実施されたアッセイの
感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍ
ｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、
５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセ
イ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセ
イ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍ
ｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、
５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセ
イ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセ
イ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
【０１２３】 混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの所定量を有する周知のＣｇＡ濃度
の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー
試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃
度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の
結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６
％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる
一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能で
あることを示す。
の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー
試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃
度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の
結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６
％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる
一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能で
あることを示す。
【０１２４】 １００の正常サンプルと、神経内分泌型の腫瘍の病理に罹患している患者から
得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載さ
れたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。そ
の結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．
０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載さ
れたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。そ
の結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．
０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
【０１２５】 １００の正常サンプルと９５の病的サンプルの比較研究の結果が図８及び表５
に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、実施 例 ３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(
CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号１アミノ酸２１ ９から２３４ に対して向けられたCSG06と関連した配列番号１アミノ酸１４５か
ら１９７に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、実施 例 ３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(
CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号１アミノ酸２１ ９から２３４ に対して向けられたCSG06と関連した配列番号１アミノ酸１４５か
ら１９７に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
【０１２６】
【参考文献】
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
【表２】 １）Ｘａａ＝未決定のアミノ酸 ２）配列を合成ペプチドを使用して特定した。認識された配列が実際に配列番号 １アミノ酸２１９から２３４ に制限されることを示すことができた。 ３）また、抗体CSG20が配列番号１アミノ酸２５０から３０１（ヒトパンクレア
スタチン）に相当するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
スタチン）に相当するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
【０１２９】
【表３】
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、成熟ヒトＣｇＡの４３９アミノ酸の配列番号１を説明
する。
する。
【図２】 図２は、タンパク質溶解によって得られる断片、及びヒトＣｇ
Ａのタンパク質（配列番号１）上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列
を単純化して説明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示
す。いくつかのエピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
Ａのタンパク質（配列番号１）上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列
を単純化して説明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示
す。いくつかのエピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
【図３】 図３は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによるタンパク質溶解
の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクト
ルを示す。
の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクト
ルを示す。
【図４】 図４は、本発明に従った競合的アッセイ（ＲＩＡ）によって試
験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセ
イグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示
す。
験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセ
イグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示
す。
【図５】 図５は、各種の抗体を使用した競合的アッセイと比較した、３
種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正
常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態
で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正
常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態
で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
【図６】 図６は、本発明に従った同種相を使用した、検出された蛍光（
Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を
示す。
Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を
示す。
【図７】 図７は、ＣｇＡのＦＩＡ及びＩＲＭＡアッセイで得られた結果
（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
【図８】 図８は、図２及び３のＩＲＭＡ及びＦＩＡを使用した正常サン
プル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
プル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/74 33/74 // Ｃ０７Ｋ 14/575 Ｃ０７Ｋ 14/575 (72)発明者 ドミニク・アーニス フランス・Ｆ−67100・ストラスブール・ リュ・サン・テルハール・13 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA16 AA34 CA25 CB01 CB03 DA36 DA54 FB01 FB03 FB07 FB08 FB12 FB13 GC12 GC15 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA14 4H045 AA11 AA30 BA10 BA70 BA71 CA41 DA75 DA76 EA51 FA72
Claims (21)
- 【請求項１】 ヒトＣｇＡのＮ末端から数えてアミノ酸１４５位からアミノ
酸２３４位に亘るアミノ酸の配列番号２中に位置するエピトープに特異的に結合
する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用する、サ
ンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対するイムノアッセイ。 - 【請求項２】 該アッセイが、同種相または異種相で実施される、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 該イムノアッセイが、上記抗体の部位に対する、サンプルの
クロモグラニンＡと所定量のラベル化クロモグラニンＡとの間の競合的イムノア
ッセイである、請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸２１９から２３４位の配列番
号３、またはヒトＣｇＡのアミノ酸１４５から１９７位の配列番号４中に位置す
るエピトープに特異的である、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 ラベル化クロモグラニンＡが、放射性同位元素、発光性エレ
メント、酵素、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、及び直接的または
間接的定量的測定が可能なあらゆる他のリガンドでラベルされる、請求項３また
は４記載の方法。 - 【請求項６】 該イムノアッセイが、ヒトＣｇＡの第一のエピトープに特異
的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、第一のものと
は異なるヒトＣｇＡの第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体を使用し、少なくとも一つのエピトープが、ヒトＣ
ｇＡのアミノ酸１４５−２３４位の配列番号２中に位置し、二つの抗体の一方が
ラベルされているサンドイッチ型のイムノアッセイである、請求項１または２記
載の方法。 - 【請求項７】 第一及び第二の抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸１４５から１
９７位の配列番号４，及び／またはアミノ酸２１９から２３４位の配列番号３中
に位置するエピトープに特異的な抗体から選択される、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 第一の抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸１４５位からアミノ酸
１９７位に亘る配列番号４，またはヒトＣｇＡのアミノ酸２１９位からアミノ酸
２３４位に亘る配列番号３中に位置するエピトープに特異的であり、並びに第二
の抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸２５０位からアミノ酸３０１位に亘る配列番号
５中に位置するエピトープに特異的である、請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 ラベル化抗体が、放射性同位元素、発光性エレメント、酵素
、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、及び直接的または間接的定量的
測定が可能なあらゆる他のリガンドでラベルされる、請求項６から８のいずれか
一項記載の方法。 - 【請求項１０】 ラベル化抗体が、エネルギードナー発光性化合物でラベル
され、他方の抗体が、エネルギーアクセプター発光性化合物に接合されている、
請求項６から８のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１１】 エネルギードナー発光性化合物がユウロピウムクリプテー
トであり、エネルギーアクセプター発光性化合物がアロフィコシアニンである、
請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 ヒトクロモグラニンＡのＮ末端から数えてアミノ酸２１９
から２３４位の配列番号３中に位置するエピトープに特異的にそれ自体結合する
ことが可能なモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 ヒトクロモグラニンＡのＮ末端から数えてアミノ酸１４５
から１９７位の配列番号４中に位置するエピトープに特異的にそれ自体結合する
ことが可能なモノクローナル抗体。 - 【請求項１４】 放射性同位元素、エネルギードナー発光性化合物、エネル
ギーアクセプター発光性化合物、及び直接的または間接的定量的測定が可能なあ
らゆる他のリガンドから選択される検出可能なラベルに接合された、請求項１２
または１３のモノクローナル抗体を含む免疫学的試薬。 - 【請求項１５】 − 第一の抗体、並びに − 第二の抗体 を含み、二つの抗体の少なくとも一方が、ヒトＣｇＡのｎ末端から数えてアミノ
酸１４５から２３４位の配列番号２中に位置するエピトープに特異的な抗体であ
る、ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のためのイムノアッセイキット。 - 【請求項１６】 第一の抗体及び第二の抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸１４
５から１９７の配列番号４，及び／またはアミノ酸２１９から２３４位の配列番
号３中に位置するエピトープに特異的な抗体から選択される、請求項１５記載の
キット。 - 【請求項１７】 抗体の一方が、ヒトＣｇＡのアミノ酸１４５から１９７位
の配列番号４，またはアミノ酸２１９から２３４位の配列番号３中に位置するエ
ピトープに特異的であり、並びに他方の抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸２５０か
ら３０１位の配列番号５中に位置するエピトープに特異的である、請求項１５記
載のキット。 - 【請求項１８】 抗体の一方が、エネルギードナー発光性化合物に接合され
、他方の抗体が、エネルギーアクセプター発光性化合物に接合される、請求項１
５から１７のいずれか一項記載のキット。 - 【請求項１９】 エネルギードナー発光性化合物がユウロピウムクリプテー
トであり、エネルギーアクセプター発光性化合物がアロフィコシアニンである、
請求項１８記載のキット。 - 【請求項２０】 ＣｇＡのアミノ酸１４５から２３４位の配列番号２中に位
置するエピトープに特異的な抗体を含む、競合的イムノアッセイキット。 - 【請求項２１】 抗体が、ヒトＣｇＡのアミノ酸２１９から２３４位の配列
番号３，またはアミノ酸１４５から１９７位の配列番号４中に位置するエピトー
プに特異的である、請求項２０記載のアッセイキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9806101A FR2778744B1 (fr) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | Dosage immunologique de la chromogranine a humaine (cga) anticorps, reactifs et trousses utilisables pour ce dosage |
| FR98/06101 | 1998-05-14 | ||
| PCT/FR1999/001141 WO1999058980A1 (fr) | 1998-05-14 | 1999-05-12 | DOSAGE IMMUNOLOGIQUE DE LA CHROMOGRANINE A HUMAINE (CgA), ANTICORPS, REACTIFS ET TROUSSES UTILISABLES POUR CE DOSAGE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002514766A true JP2002514766A (ja) | 2002-05-21 |
| JP4317325B2 JP4317325B2 (ja) | 2009-08-19 |
Family
ID=9526363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000548732A Expired - Lifetime JP4317325B2 (ja) | 1998-05-14 | 1999-05-12 | ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のイムノアッセイ、このアッセイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキット |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1078266B1 (ja) |
| JP (1) | JP4317325B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69921987T2 (ja) |
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| FR (1) | FR2778744B1 (ja) |
| PT (1) | PT1078266E (ja) |
| WO (1) | WO1999058980A1 (ja) |
Cited By (2)
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