JP2002508190A - 万能収集媒質 - Google Patents

万能収集媒質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞収集用の新規の万能収集媒質を提供する。媒質は、第一に、単一サンプル内に保存された細胞で細胞学的分析および直接分子分析を成し遂げる能力を持つ。また、本発明は、ヒトの状態を評価するための細胞分析用の新規の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】発明の分野 本発明は、一般的には、細胞学的アッセイおよび分子アッセイの分野、特に細
胞学的アッセイおよび分子アッセイを用いた状態評価についてのアッセイ領域に
関する。発明の背景 ヒトの状態の検出および診断は、疾病治療に明らかに重要である。数多くの疾
病の特徴が確認され、その多くはそれら疾病の治療に利用されている。多くの疾
病は、冒された細胞の状態変化が先行し、それを特徴としている。変化には、感
染細胞内でのウイルス遺伝子の発現、冒された細胞内の遺伝子発現パターンの変
化、および細胞形態の変化が含まれる。疾病の検出、診断およびモニターは、そ
のような細胞状態の評価に助けられうる。
【0002】 定期的に、一つ以上の感染症、例えばヒトパピローマウイルスまたは単純ヘル
ペスウイルス、を持つと予想される患者に関して、分析用に細胞サンプルを患者
から採取する。一般的に、そのようなサンプルは、疾病に冒された主な領域から
のスワイプ(swipe) または細胞切屑の形である。通常、これらのスワイプは、細
胞総数の非常に限られた正常細胞と病変細胞の混合物として、集められる。集め
られた細胞は、伝統的にさらなる分析用にスライド上に塗抹される。生化学分析
を試みる場合、細胞学的分析の費用を負担して行われ、原位置でのハイブリダイ
ゼーションのような定性的方法を通して行われた。
【0003】 定期的に、慣用の細胞診のために得た頸部サンプルを、形態学的分析用にスラ
イド上に塗抹した。もしこのサンプルが細胞診で疾病の可能性があると確認され
るなら、患者に再度コルポスコピーを行い、再度の細胞診および/または遺伝子
分析ならびにDNA、RNAあるいはタンパク質のようなそれ以外の分子試験を
行うために、第二のサンプルを収集しなければならない。最近、液体細胞媒質が
市場に現れ、形態の強化に提供されている。これらの媒質では、細胞を10−2
0mlの保存剤内に定期的に集めて、DNA、RNAおよびその他の分析可能な
生物分子を過度に希釈し、分子試験を典型より少なくしているが、HPV DN
Aのような分子試験に対しては修正の余地があることが分かった。さらに、現在
の保存剤は細胞形態を保持するが、これらの薬剤はDNAおよびRNAを分解さ
せ、保存時の定量分析が困難または不可能になる。
【0004】 このように、今日の分析では、細胞形態学的および定量的遺伝子分析を行うた
めに、患者から少なくとも2サンプルを得る必要がある。現在、細胞診には、D
NA、RNAおよびその他の分析可能生物分子を過度に希釈する大容量の保存剤
が用いられている。さらに、現在の保存剤は細胞形態を保持するが、これらの薬
剤は、DNA、RNAおよびタンパク質のような個々の生物分子を分解させ、定
量分析が不可能になる。
【0005】 形態学的分析および生化学的分析の両方で分析用に細胞または組織を保存する
ための方法および媒質の設計は、過去に問題の多さを示してきた。例えば、形態
学分析用に固定した細胞または組織は、生化学分析を行う能力を危うくした。細
胞RNAの保存は、DNAおよび形態学的分析を犠牲にして行われた。同様に、
細胞DNAの保存は、RNAおよび形態学的分析を犠牲にして行われた。
【0006】 本発明の目的は、疾病が検出されない限り、単一サンプルから、細胞形態を同
定し、そしてDNA、RNAおよびその他の生物分子を定量保存するための、一
般的な収集媒質を提供することにある。
【0007】 本発明のもう一つの目的は、制限数の細胞がサンプル内で調達できる細胞サン
プル内に、細胞形態および核酸、脂質、炭水化物またはタンパク質を保存するた
めの、万能細胞収集媒質を提供することにある。
【0008】 本発明のもう一つの目的は、興味ある生物分子の溶液を基本とした直接分析を
行うための組成物および方法を提供することにある。本発明の方法および組成物
は、原位置でのハイブリダイゼーションまたは分析前に他の細胞成分から興味あ
る生物分子を分離することが要求される間接法の様な、非溶液を基本とした方法
で遭遇する問題を解決する。発明の要約 本発明は、細胞性疾病の検出、分析およびモニターに関する。細胞サンプル内
で細胞形態および定量分析用細胞生物分子の両方を保存し、その結果、複数のア
ッセイを患者の単一サンプルから行うことができる、新規の細胞収集媒質を開示
する。小容量内に細胞サンプルを収集するための装置を用いて、細胞の状態を評
価できる。
【0009】 本発明の一つの実施態様は、細胞形態の試験、および特定のDNA配列の検出
、または一つの細胞状態内に含まれる遺伝子の発現レベルの測定、および細胞内
での疾病状態の指標としての特定の割合の対照標準遺伝子とのまたは互いのそれ
らの発現の比較、を含む。この方法を用いると、細胞形態または特定の生物分子
のレベルあるいは構造の変化の原因となる任意のヒトの状態の始まりまたは進行
を検出および/またはモニターすることができる。例えば、本発明を用いると、
特定の疾病にかかりやすい体質を評価できるか、または細胞の状態によって示さ
れるような疾病の段階あるいは危険性を評価できる。また、示された細胞状態に
基いて適当な治療法を同定することによって、または治療による細胞状態の任意
の変化を示すことによって、疾病の治療効果を管理する、または評価するために
、用いることができる。
【0010】 本発明のその他の実施態様では、万能細胞収集媒質を開示している。この媒質
は、細胞形態および生物分子の少量での同時保存を可能にする。また、本発明で
は、そのような細胞サンプルを収集する装置が具体化される。
【0011】 本発明のさらなる実施態様では、サンプルを溶液相内で細胞形態および生化学
分析に従って分析する方法および組成物が提供される。生化学分析は、定性また
は定量のいずれかであり、RNA、DNA、タンパク質、炭水化物または任意の
その組み合わせを直接分析する。発明の詳細な説明 本発明は、細胞を簡便に収集し保存することを可能にする万能細胞収集媒質、
および細胞診アッセイ、分子アッセイ、またはその両方を用いて、単一少量の患
者サンプルから単離された疾病の存在または進行を評価するための内容、に関す
る。
【0012】 この万能細胞収集媒質は、細胞形態を保存し、定性分析または定量分析のいず
れかのために細胞サンプル内の巨大分子を保存する。開示された細胞収集媒質の
一つの有用な形は、細胞内の核酸を保存する。そのような保存を、凍結サンプル
に限定することができる。代わりに、保存されたサンプルを周囲温度に保つこと
もできる。異なる型の万能収集媒質は、サンプルを何日間かまたは何週間かまた
はそれ以上の期間、保存する。細胞サンプルを任意の目的で収集するために、万
能細胞収集媒質を用いることができ、任意の特定のアッセイ方法での使用に限定
されるわけではない。万能収集媒質のいくつかの型は、緩衝塩類等張溶液、また
はメタノール、エタノールあるいは類似のアルコールのようなアルコール性溶液
、RNasinのようなRNアーゼインヒビター、およびペプスタシンのような
プロテアーゼインヒビターを含む。例えば、バナジン酸複合体、キレート剤およ
び界面活性剤を基本とした成分、ならびにRNasinのような特定のインヒビ
ターを含む、多くの別のヌクレアーゼインヒビターがこの技術分野では知られて
いる。任意の既知のヌクレアーゼおよび/またはプロテアーゼインヒビターを、
サンプル内の興味ある特定の分子を保存するための万能収集媒質の一成分として
、本発明内で用いることができる。
【0013】 本発明の調合物は、単一サンプル内に含まれる細胞の細胞診および分子分析を
成し遂げる第一次手段を提供する。細胞を患者から得、本発明のUCM内に保存
する。この単一のサンプルから、細胞を抽出して、細胞学的試験を行うか、細胞
DNAを定性的または定量的に試験するか、細胞RNAを定性的または定量的に
試験するか、または分析を任意に組み合わせて行う。この異なる分析を、同時に
、または例えば、細胞学的分析の結果が得られた後、細胞を分子分析に、何日か
、何週間かまたは何ヶ月か後にかける。反対に、例えば自動スクリーニングによ
って、UCM内に含まれる細胞の分子分析を行った後、サンプルを細胞学的分析
に、何日か、何週間か、または何ヶ月か後に検索する。
【0014】 本発明の一つの実施態様では、本発明の万能収集媒質(UCM)(universal c
ollection medium) 調合物は、一つ以上のアルコール混合物のような保存剤、架
橋剤、ならびにRNA、DNAおよびタンパク質の分解を阻害する薬剤を含む、
緩衝化された水を基本とした溶液である。UCM調合物の使用は、抗微生物薬剤
の添加によりさらに強化される。
【0015】 任意の非粘性に近いアルコールを用いてUCMを調合することができ、例えば
任意のC1−C10アルコールまたはその混合物を用いることができる。好まし
いアルコールには、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およ
びペンタノールが含まれる。エタノールおよびn−ブタノールが最も好ましい。
アルコールは、調合物中に有意の%で含まれることができる。例えば、アルコー
ル成分は、UCM調合物の約1%から約75%で含まれることができる。UCM
調製物中、約1%−約50%のアルコールの%範囲がより好ましく、約5%−約
30%が最も好ましい。
【0016】 UCM調合物のpH範囲は、細胞生化学的および細胞形態学的完全性の維持に
重要である。約2.5−約6のpH範囲が、本発明のUCMを調合するために用
いられる。約3−約5のpH範囲がより好ましく、約3.5−約4.5のpH範
囲が最も好ましい。バッファーは、UCMのpHを定常値に維持するために、用
いられる。指示されたpH範囲の緩衝能力を持つ任意のバッファーを、本発明の
UCM内で用いることができる。バッファー成分の例としては、制限するわけで
はないが、グリシン、マレイン酸、リン酸、酒石酸、クエン酸、ギ酸または酢酸
およびその類似物が含まれる。
【0017】 本発明の架橋剤は、UCM調合物の約1%−約25%、含まれる。好ましくは
、架橋剤は、約1%−約15%または約1%−約10%、含まれる。最も好まし
くは、架橋剤は、UCM調合物中約1%−約5%含まれる。架橋剤(固定化剤と
しても知られている)は、この技術分野で周知であり(例えば、Stedman
’s Medical Dictionary、第25版、Williams
& Wilkins、Baltimore MD 1990、592頁を参照の
こと)、UCM調合物内にそれらを用いることは、本発明の知識で当業者らには
今すぐ明らかになる。UCM調合物中に用いられる架橋剤の例としては、制限す
るつもりはないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびその類似物の
ようなアルデヒドが含まれる。好ましい架橋剤は、グルタルアルデヒド−重亜硫
酸塩である。
【0018】 RNA、DNAおよび/またはタンパク質の分解を阻害することのできる薬剤
は、この技術分野では周知である。それらは、酵素を阻害するか、または金属イ
オンを隔離するか、またはその両方によって、働くことができる。RNasin
またはペプスタチンまたはキレート剤のような、ヌクレアーゼまたはプロテアー
ゼインヒビターを、本発明に従って用いることができる。RNA、DNAおよび
/またはタンパク質の分解を阻害する好ましい薬剤は、キレート剤である。キレ
ート剤は、この技術分野では周知であり(例えば、Data For Bioc
hemical Research、第3版、Rex M.C.Dawsonら
、 Oxford University Press、1986、第17章を参照
のこと)、バイオポリマーの金属イオン誘導分解および酵素分解の両方を弱める
ことが、知られている。本発明に用いられるキレート剤の例としては、制限する
わけではないが、ムレキシド、クロモトロブ酸、1−(1−ヒドロキシ−2−ナ
フチチラゾ−2−ヒドロキシ−5−ニトロナフタレン−4−スルホン酸,EDT
A(エチレンジアミンテトラ酢酸)、ο−フェナンスロリン、チオ尿素およびそ
の類似物を含む。好ましいキレート剤は、EDTAである。
【0019】 本発明に用いられる抗微生物薬剤は、この技術分野では既知である。抗微生物
薬剤の例は、制限するわけではないが、アミノグリコシド、β−ラクタム、セフ
ァロスポリン、マクロリド、ペニシリン、アジドおよびその類似物である。好ま
しい抗微生物薬剤は、アジ化ナトリウムである。
【0020】 万能収集媒質を、興味ある細胞状態と関連する性質の異なる2つ以上のアッセ
イの組み合わせに用いることができる。ここで用いられるように、アッセイまた
はアッセイ(群)とは、特定の性質の検出または測定を指し、その結果、その他の
性質のその他のそのような測定と結びつけると、一つ以上の病気の感染を示唆す
る細胞の全体的評価を提供することができる。これらのアッセイには、例えば、
形態分析および特定のRNAまたはDNAまたはタンパク質または炭水化物構造
の定量が含まれ、その存在またはレベルは、疾病の存在または進行の特異的指標
を提供する。
【0021】 万能収集媒質を用いて、任意の所望の細胞サンプルを収集することができる。
細胞サンプルを、切屑、生検、または洗浄を含む任意の適当な様式で、任意の適
当な源から、収集する。多数の細胞収集技術が知られており、どの技術も本発明
で用いることができる。一般的に、細胞サンプル用の細胞源を、興味ある細胞の
状態によって影響を受ける既知のあるいは適当な組織を基に選択する。
【0022】 本発明で用いられる細胞サンプルを、液体媒質内に収集保存することができる
。有用な細胞収集媒質の例は、PreservCytR (Cytyc)およびC
ytoRichTM(Autocyte)である。これらの媒質は、細胞診サンプ
ルの収集に開発されたが、本発明に記載の方法に従って修飾した場合、分子アッ
セイでの使用にも適合させることができる。
【0023】 一般的に、核酸の検出は、アッセイをサンプル収集後すぐに行わないのであれ
ば、アッセイを行う前に核酸の分解を防ぐ能力を持つ薬剤を用いることにより、
恩恵を受ける。有用な媒質は、核酸(RNAおよびDNAの両方)およびタンパ
ク質への安定剤であり、そして細胞形態を保存する、本発明の万能収集媒質のよ
うな、保存を基本とした収集媒質である。
【0024】 本発明に有用な一つの方法には、疾病状態に含まれる遺伝子の発現レベルを測
定すること、および、互いの、または細胞の状態の指標のような対照標準遺伝子
に対するそれらの発現の比較、が含まれる。そのような測定を、その他のアッセ
イと組み合わせると、病状評価の正確さおよび信頼性が増す。本発明を用いて、
細胞状態によって示唆されるような疾病の段階を評価することができる。また、
この実施態様を用いると、指摘された病状に基づいた適当な治療法を同定するこ
とによって、または治療を受けた細胞の状態の任意の変化を示すことによって、
疾病への治療効果を管理または評価することができる。また、細胞サンプル中の
細胞形態および細胞生物分子を保存し、その結果複数のアッセイを同一サンプル
で行うことのできる、細胞収集媒質を開示する。
【0025】 数多く疾病およびその他のヒトの状態は、特定の細胞表現型および遺伝子発現
パターンによって特徴づけられる。特定の細胞形態または特定の生物分子のレベ
ルあるいは構造を評価することによって、そのような疾病および状態を同定およ
び/またはモニターすることができる。例えば、新形成細胞および癌性細胞は、
一般的に、ある独特の形態および増殖特徴を示す。遺伝子変異および遺伝子発現
パターンのような、分子特性もまた、疾病進行の良い指標である。ウイルス感染
細胞は、異なる形態およびウイルス遺伝子の発現を含む異なる遺伝子発現パター
ンを示す。本発明を用いると、細胞形態および/または遺伝子発現の変化のよう
な、細胞状態の特徴を、患者サンプルから決定できる。
【0026】 検出される特性は、興味ある細胞の状態および細胞サンプル内に存在すると予
想される疾病に特異的である。一般的に、そのような特性は、2つの型、細胞学
的特性および分子的特性、に分けることができる。ここに用いられている様に、
細胞学的特性とは、例えば、全体の細胞の姿ならびに細胞およびそのオルガネラ
の出現の様な、特性である。多くの新形成細胞および癌性細胞の最初の同定およ
び分類は、伝統的には、細胞学的特徴を用いて成し遂げられる。一般的に、細胞
学的特性の同定は時間がかかり、比較的高レベルのトレーニングを必要とし、一
般的には、簡単に自動化できない。ここで用いられている、分子的特性とは、タ
ンパク質、核酸、炭水化物および代謝物のような、特定の分子種の存在および/
または不在ならびに状態である。一般的には、興味ある特定の分子の検出および
/または定量によって、そのような分子特性を同定する。
【0027】 本発明は、少量の患者サンプルから、細胞学的特性および分子的特性を分析す
ることを可能にする。アッセイされた特性には、直接原因または病気の結果では
ないが、ある種の疾病および細胞の状態と関連する、さらなるまたは代理のマー
カー特性を含むことができる。そのようなさらなるマーカーの例としては、多型
性マーカー、頸部癌に女性を罹りやすくするB7の様なであるヒト白血病抗原(
HLA)、オンコジーン、p53変異、BRCA1/2変異、他の癌マーカー、
オンコサプレッサー、サイトカイン、成長因子レセプターおよびホルモン、が含
まれる。そのようなマーカーは、状態特異的または疾病特異的特性を示す細胞内
に存在する場合もあり、細胞内には存在しない場合もあるが、そのような存在す
るか存在しないかは、例えば、より重いか、あまり重くはない疾病状態の指標で
あることもできる。これらのマーカーを、開示された方法と結びつけて用いて、
異常な値の数または定量マーカーでの変化の大きさに依存して、新形成疾病の危
険性がより高いかまたはより低いかを推定することができる。
【0028】 本発明を用いて評価される疾病状態の例としては、限定するつもりはないが、
自己免疫病、新形成、および癌が含まれる。興味あるその他の疾病状態には、H
PV感染を含むHPVに基づく疾病、頸部上皮内癌(CIN)(cervical intrae
pithelial neoplasia) 、および癌、有意性の決定できない非定型落屑性細胞( ASCUS)(atypical squanous cells of undetermined significance)、いぼ
、ゆうぜい状表皮発達異常症(epidermo dysplasia verruciformis)およびその
他の皮膚疾病、咽頭乳頭腫、口乳頭腫、結膜乳頭腫、ならびに前立腺肥大および
前立腺癌を含む前立腺疾病、クラミジア、ならびにHIVおよびヘルペスのよう
なウイルス感染症が含まれる。
【0029】 ここに用いられている用語としての細胞サンプルは、主に、患者からの細胞収
集物である。細胞を得る一つの方法は、非侵略手段による方法であり、ここでは
患者を刺すことなく得られると定義される。非侵略手段の例としては、例えば、
尿から得られた細胞サンプル、または鼻、上皮、頸部あるいはその他の細胞表面
切屑、が含まれる。細胞サンプルを得るためのその他の方法は、針生検または組
織生検による方法である。細胞は、10mlより少ない容量内に収集される。よ
り好ましくは、細胞を約5mlより少ない容量内に収集し、最も好ましくは細胞
を約2mlより少ない容量内に収集する。
【0030】 複数のアッセイを組み合わせを、本発明の媒質および装置と共に用いて良く、
単一サンプルを収集し用いることにより、実行することができる。アッセイの組
み合わせの重要な態様は、要求されるアッセイ特異的処置段階を最少にし、単一
細胞サンプルを異なる型の複数のアッセイに用いることを可能にする、万能細胞
収集媒質を用いることである。例えば、細胞学的特徴アッセイ用細胞は、典型的
には、大多数の分子特性アッセイ用には希釈しすぎである細胞サンプルを後に残
す、大容量の細胞サンプル用液体内に収集される。先行技術の方法は、細胞学的
分析および分子分析の両方への直接方法を提供していない。先行技術の方法は、
不都合で、多くの細胞分子成分を分解させる結果となるであろう、別々の濃縮段
階のような、いくつかの余分な段階を必要としている。細胞診用細胞サンプルは
、細胞形態の保存に最適であるが、一般的には核酸を充分には保存せず、それ故
、サンプルは多くの分子アッセイには使用できない。
【0031】 本発明の方法で用いられる細胞サンプルは、行われるアッセイと調和した任意
の方法で、固定または処理することができる。例えば、細胞学的アッセイおよび
分子アッセイの両方を、スライドのような固体物質上に固定した細胞を用いて成
し遂げることができる。しかしながら、好ましくは、分子アッセイは溶液内で行
われる。一般には、アッセイ遂行に必要な条件から、用いられるサンプルの処理
法が決定されるであろう。
【0032】 上記の比較型もまた、多くの異なる遺伝子および疾病状態で用いることができ
る。即ち、測定された興味ある遺伝子の発現レベルを、例えば、(同一源からの
より早い時期の細胞サンプルまたは適当な対照標準細胞のような)異なる細胞サ
ンプル内の同一型遺伝子の発現レベルと、または同一細胞サンプルあるいは異な
る細胞サンプル内の異なる型の遺伝子の発現レベルと、同一細胞サンプル内の対
照標準遺伝子の発現レベルと、または、対照標準細胞内の対照標準遺伝子の発現
レベルと、比較することができる。
【0033】 興味ある遺伝子発現を、任意の適当な方法を用いて評価することができる。例
えば、RNAは、ハイブリダイゼーション、増幅、またはシークエンシング技術
を用いて、検出することができ、そしてタンパク質は、炭水化物と同様に、特異
的抗体を用いて検出することができる。発現生成物を検出することによって遺伝
子発現を特異的検出するための数多くの技術が知られており、開示されたUCM
と共に用いることができる。興味ある遺伝子の発現レベルを検出および測定する
ための一つの技術は、興味ある遺伝子から転写されたRNAの検出である。最も
確実に比較するために、比較されるべき発現レベルは、同一の技術を用いて測定
されるべきであり、同様の様式で成し遂げられるべきである。
【0034】 細胞サンプル内の興味ある遺伝子の発現レベルを測定する有用な技術には、W
O93/10263(Digene)に記載のハイブリッド捕獲技術、Nuov
o(1997)に記載の原位置でのPCRハイブリダイゼーション技術、枝分か
れDNAアッセイ(Chernoff、1997)、転写仲介増幅(TMA)(t
ranscription mediated ampification) (Stoflet,1988)、および
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(polymerase chain reaction) 、リガーゼ鎖反応
(LCR)(ligase chain reaction)、自己保持配列複製(3SR)(self-susta
ined sequence replication)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)(nucleic a
cid sequence based amplification) 、鎖置換増幅(SDA)(strand displace
ment amplification) 、およびQβレプリカーゼでの増幅(Birkenmey
erおよびMushahwar、1991;Landegren、1993)が
含まれる。遺伝子発現生成物を検出および測定するための数多くのアッセイが知
られており、UCM−収集サンプルを用いた興味ある遺伝子の発現レベルの定量
に適合させることができる。
【0035】 本発明は、以前には使えなかった細胞分析方法を提供する。例えば、癌細胞お
よび癌でない細胞の混合物をこの発明による万能収集媒質内に置いた。細胞の形
態を、4゜Cまたは室温に、12時間、10日間、3週間および6週間の期間保
存した後試験した。この技術分野で周知の方法、例えば、パパニコラウ染色およ
びHematoxyrin and Eosin(H&E)、を用いて染色する
ことによって、スライドを調製した。スライドを光学顕微鏡下で試験すると、癌
細胞に特徴的な姿はすべて認められ、すべての場合でよく保存されていた。スラ
イドは、通常は楕円型で、不定型で顆粒状のクロマチンを持つ、大きく濃色され
た核、不充分な細胞質、多核細胞、核小体の存在、および***形の存在を示した
。さらに、スライドは、細胞分散が良好であること、および細胞凝塊がないこと
を示した。両方の型の細胞(正常および癌性)は、核および細胞質の両方が、異
なるはっきりした形を持っていた。核は良く染色され、正常細胞では、細胞の成
熟度に依存して細胞質の色が異なっていた。
【0036】 本発明の一つの実施態様では、RNAを、溶液を基本として方法に従って、直
接分析した。最初に、ミクロタイタープレートの穴に含まれる細胞にタンパク質
分解酵素を加えることによって、細胞を溶解した。本発明に用いられる酵素の例
としては、限定するわけではないが、プロテイナーゼKまたはプロナーゼが含ま
れる。また、細胞を界面活性剤溶解、浸透圧溶解またはフレンチプレスにかける
こともできる。インキュベーションの後、ビオチニル化DNAプローブをそれぞ
れの穴に加えた。RNA:DNAハイブリッドをストレプトアビジンでコートし
たミクロプレートにトランスファーすることによって、固相状に捕獲した。RN
A:DNAハイブリッドに対するアルカリホスファターゼ−結合抗体をハイブリ
ダイゼーションミクロプレート内のそれぞれの穴に加え、さらに、それぞれの穴
へ、Emerald II(Tropix)を共にCDP−StarTMのような蛍
光試薬を加えることによって、シグナルを作り出した。シグナルをミクロプレー
トから読んだ。溶液を基本としたDNA分析を、RNA分析と類似の方法に従っ
て行ったが、ミクロプレートは、抗−RNA:DNAハイブリッド抗体でコート
し、プローブは非標識のRNAプローブであった。
【0037】 本発明は、薬剤およびサンプル収集物および取り扱い物質のような、方法に必
要とされる一つ以上の物質を含むキットを用いて、成し遂げることができる。例
えば、キットは、細胞保存剤を含む細胞収集媒質、DNA配列、RNA配列およ
び/または一つ以上のDNA配列の発現生成物(mRNAまたはタンパク質)を
特異的に検出するための試薬、ならびにサンプル取り扱い容器を含むことができ
る。DNA配列および/またはRNA配列検出用の有用試薬は、それらの配列に
関する核酸プローブまたはタンパク質核酸プローブである。DNA配列発現生成
物(タンパク質)検出用の有用試薬は、抗体である。癌細胞に関連する異常な炭
水化物抗原もまた、抗体によって検出することができる。また、キットは、対照
のサンプルあるいは試薬、または、開示されたアッセイと結びつけて別のアッセ
イを行うための試薬および物質を含むこともできる。
【0038】 本発明は、方法に適合した装置を用いて成し遂げることができる。類似のアッ
セイを行うための多数の容器が知られており、開示されたUCM調合物での使用
、アッセイおよび方法に適合させることができる。例えば、装置は、サンプルア
ッセイの全体または一部およびアッセイでのサンプル取り扱いを自動化すること
が知られている。
【0039】 開示された方法の全体または部分を、特定の目的のコンピュータープログラム
を用いて制御または操縦する。開示された方法から集められたデータ、および組
み合わせて用いられた任意のその他のアッセイからのデータを、様々な形で、そ
して特定目的のコンピュータープログラムを用いて様々な目的で、まとめ、分析
し、そして出力することができる。そのようなプラグラムを、別の患者またはデ
ータ処理コンピュータープログラムと共に、またはそれと組み合わせて、用いる
こともできる。そのようなプログラムの有用性は、組み合わせる測定または評価
の数、および全体的評価へのそれぞれの型の測定の相対的重要性に伴って、増加
する。開示された方法と共に用いられるコンピュータープログラムは、一般目的
のコンピューター上で用いることができるか、または、特定目的のコンピュータ
ー、あるいは開示された方法を制御し、開示された方法からのデータを取り扱い
分析するためのコンピューター化された装置、またはその両方に取り入れること
ができる。実施例 本明細書中の実施例は、本発明の遂行する様々な態様を例示することを意図し
ており、如何なる場合も本発明の制限を意図するものではない。 調合物調合物127 20% エタノール 0.05% NaN3 5mM EDTA 2.5% グルタルアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム(G−S−B) (Glutaraldehyde-SodiumBisulfite) 0.2M NaOAc−HOAc pH 3.7調合物128 20% エタノール 0.05% NaN3 5mM EDTA 2.5%グルタルアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム(G−S−B) 0.2M NaOAc−HOAc pH 4.1調合物130 7% ブタノール 0.05% NaN3 5mM EDTA 2.5% グルタルアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム(G−S−B) 0.2M NaOAc−HOAc pH 3.7調合物134 PreservCytR(Cytyc Corporation) 緩衝化メタノールを含む 保存は細胞診サンプルに限定する:4゜C−37゜Cで3週間調合物135 CytoRichTM(AutoCyte Corporation) 24%より少ないアルコールを含む 15゜C−30゜Cで保存調合物141 20% エタノール 0.05% NaN3 5mM EDTA 2.5% グルタルアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム(G−S−B) 0.2M NaOAc−HOAc pH 4.4調合物149 10% ブタノール 0.05% NaN3 5mM EDTA 2.5% グルタルアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム(G−S−B) 0.2M NaOAc−HOAc pH 4.4実施例1:核酸分析の一般的方法 核酸アッセイは、一般原則としては、WO93/10263(Digene)
に記載のDigene Hybrid Capture HIV Testによ
ってHIV RNAを検出する方法に従う。簡単に言えば、細胞溶解後、50μ
lのプローブ混合物(DNAビオチニル化プローブを含む)を、個々の穴に加え
た。プレートをシールし、ハイブリダイゼーションを起こすために65゜Cで1
.5時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、サンプルを、ストレ
プトアビジンでコートしたミクロプレートに移し、25μlの抗ハイブリッド抗
体をそれぞれの穴に加えた。プレートを、室温で約1時間、1100RPMで掻
き回した。穴を65゜Cの洗浄バッファーで6X回洗浄し、蒸留水を用いて1回
洗浄した。100μlの蛍光物質を個々の穴に加え、プレートを室温で30分間
インキュベートした。次いで、プレートをDML2000ルミノメーターで読ん
だ。次いで、データをシグナル対ノイズとして表した。校正曲線を用いて、個々
の試料で生成する蛍光シグナルを、穴当たりのmRNAコピー数に換算した。実施例2:形態分析の一般的方法 HPV16癌陽性細胞(CaSki)をUCM127、128、141、13
0、149内、および、2つの市販されている固定化剤PreservCyt(
Cytyc Corp.)およびCytoRich(AutoCyte)に置い
た。次いで、サンプルを周囲温で保存した。標準スライドを保存12時間後に調
製した。次いで、3週間および6週間後に、スライドを調製した。さらに、UC
M141および149から室温で6週間後にスライドを調製した。スライドを、
ポリカーボネートフィルター上に200μlの細胞懸濁液をスポットすることに
よって、調製した。次いで、フィルターをガラススライド上に置き、ブロットし
た。次いで、フィルターを除き、スライドを95%エタノールで5分間固定した
。スライドを、お決まりのパパニコラウ染色およびヘマトキシリンとエオシン(
H&E)を用いて染色した。スライドを光学顕微鏡下で異なる拡大率を用いて評
価し、そしてカラー写真の形で文書にした。さらに、より小規模の研究を、正常
なヒト頸部細胞細胞およびCaSki細胞の混合物を用いて、行った。この混合
物を、2つのUCM調合物141および149内に、そしてPreservCy
tおよびCytoRich対照内に置いた。それぞれのサンプルを2本のチュー
ブ内に移し、RTおよび4゜Cに置いた。12時間(基準線)、10日および3
週間の保存の後、スライドを調製し、パパニコラウ染色で染色した。以下の特徴
を形態学的研究で評価した:細胞分散、細胞の形、核の形、クロマチンのパター
ンおよび染色強度、核/細胞質の比率、核小体の存在、細胞質の形、および染色
の色彩。図1−24は、異なるUCM内、PreservCytおよびCyto
Rich対照内、RTで12時間、3週間および6週間保存したCaSki細胞
の形態を示している。CaSki細胞(癌細胞)に特徴的な以下に記載するすべ
ての形が認められ、3週間および6週間の後の試験したすべての固定化物で良く
保存されていた:通常は楕円形で不定型の顆粒状クロマチンを持つ大きいクロマ
チン増加性の核、十分でない細胞質、多核細胞、核小体の存在、***形の存在。
さらに、スライドは、細胞分散が良好であること、試験したすべての媒質内で細
胞の凝集が認められなかったことを示した。
【0040】 図25−72は、CaSki細胞と混合し、UCM141、149およびPr
eservCytおよびCytoRich対照内に、12時間、10日間および
3週間、室温および4゜Cで保存した、正常なヒト頸部細胞の形態を示している
。これらのスライドの評価から、形態は、UCM内およびPreservCyt
およびCytoRich対照内で良く保存されていることが分かった。4゜Cお
よび室温で3週間後、両方の型の細胞(正常な頸部細胞およびCaSki細胞)
は、(核および細胞質の両方共)異なるはっきりとした形を持っていた。核は、
良く染色され、正常細胞は、成熟度に依存して細胞質の色が異なっていた。
【0041】 図73−75は、 定期的に成し遂げられたパパニコラウ(Pap)スミアか ら撮影し、比較としてスライドに保存固定したサンプルの形態および染色を示し
た。実施例3:HC II HPV DNAのアッセイ結果 UCM調合物127、128、130およびSTMTM(Digene)対照を
、Hybrid Capture II HPV DNA Testを用いて試験
した。標準のHC II HPV Testキット(Digeneカタログ番号5
101−1096)を用いた。個々の収集媒質(1ml)に、0.8x108
aSki細胞(〜500コピー/細胞)をスパイクした。このCaSki細胞の
濃度は、適当な臨床検体が、通常、約1x106 細胞を含むことから、選択され
た。次いで、同一ストックのCaSki細胞を用いて、形態研究ならびにDNA
およびRNA試験を行った。パッケージ挿入書に記載の通り、アッセイ当たり標
準容量として50μlを用い、如何なるサンプルの調製も修飾しなかった。同様
にSTMサンプルは、同数のCaSki細胞を1mlのDigene Samp
le Transport Medium(STM−この媒質は、HPV試験に
現在用いられている媒質である。それはDNAおよびRNAを保存し、細胞形態
を保存しない)内にスパイクすることによって、調製した。HC II HPV試
験は、0日(基準線)ならびに室温で1週間および6週間保存して行われた。表
1は、基準線、1週間後および6週間後にそれぞれの媒質で得られた結果を、S
/N比として表している。
【0042】 UCM調合物127および128は、基準線であるSTM対照S/N比と比べ
て最も高いS/N比を持ち、これらの値は、RTで6週間保存後も保持されてい
た。基準線として得られたUM130についてのS/N比は、UCM127およ
び128と比べた場合僅かに低かった。UCM130は、6週間後もそのシグナ
ルが保持されていた。
【0043】
【表1】 小規模細胞研究に用いられる、調合物UCM141および149を、基準線、
次いで、室温で1、2および4週間保存後、HC II HPV DNAアッセイ
で試験した。CaSki細胞(1.5x106 )を、これらの媒質内にスパイク
し、アッセイ当たり50μlを用いた。表2は、S/N比を示している。両媒質
共、室温で4週間保存の後、最初のシグナルの100%近く(UCM141、9
8.4%およびUCM149、97.3%)を保持していた。
【0044】
【表2】 さらに、PreservCytおよびCytoRIch内で保存したサンプル
を、本実施例のプロトコールに従って試験した。PreservCytおよびC
ytoRichの両媒質共、DNAを満足な分析に提供する能力に欠けてことが
分かった。実施例4: HC II RNAアッセイ結果 全調合物のアリコート(CaSki細胞0.8x106 )を室温の代わりに4
゜Cで保存し、HC II RNAアッセイで試験した。この研究に用いられた原
型のRNAアッセイでは、HPV16 E6/E7 RNAに特異的なビオチニ
ル化一本鎖DNAプローブが用いられた。UCM媒質127、128および13
0を、基準線ならびに4゜Cで1週間および6週間保存の後、試験した。UCM
調合物141および149を、基準線ならびに4゜Cで1、2および4週間保存
の後、試験した。表3および表4に結果を示す。
【0045】
【表3】 試験した全UCM調合物は、基準線で試験した場合、比較しうるS/N比を持
っていた。UCM127、128および130は、基準線の結果と比較して、4
゜Cで6週間保存の後も、100%のシグナルを保持していた。UCM141お
よび149の両調合物内の細胞内RNAは、基準線の結果に近いS/N比を示し
たため、4゜Cで4週間安定であるらしい(UCM141、108%およびUC
M149、89%)。
【0046】
【表4】 さらに、PreservCytおよびCytoRIch内に保存したサンプル
を、本実施例のプロトコールに従って、試験した。PreservCytおよび
CytoRich媒質は両方共、満足に分析できるRNAを提供する能力に欠け
ていることが分かった。
【0047】 ここに列挙した文献および列挙された材料を、特別に参照として採用する。
【0048】 当業者らは、日常的実験以上を用いることなく、本明細書中に記載の本発明の
特定の実施態様との多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。そ
のような等価物は、以下のクレイムに包含するつもりである。
【0049】 文献
【0050】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1】 UCM127、基準線(室温で12時間)。CaSki細胞。拡
大率x200。パパニコラウ染色。
【図2】 UCM127、室温で3週間。CaSki細胞。拡大率x200
。パパニコラウ染色。
【図3】 UCM127、室温で6週間。CaSki細胞。拡大率x200
。H&E染色。
【図4】 UCM128、室温で12時間。CaSki細胞。拡大率x20
0。パパニコラウ染色。
【図5】 UCM128、室温で3週間。CaSki細胞。拡大率x200
。パパニコラウ染色。
【図6】 UCM128、室温で6週間。CaSki細胞。拡大率x200
。H&E染色。
【図7】 UCM130、基準線(室温で12時間)。CaSki細胞。拡
大率x200。H&E染色。
【図8】 UCM130、室温で3週間。CaSki細胞。拡大率x200
。パパニコラウ染色。
【図9】 UCM130、室温で6週間。CaSki細胞。拡大率x200
。H&E染色。
【図10】PreservCyt(134)、基準線(室温で12時間)。
CaSki細胞。拡大率x200。H&E染色。
【図11】PreservCyt(134)、室温で3週間。CaSki細
胞。拡大率x200。H&E染色。
【図12】PreservCyt(134)、室温で6週間。CaSki細
胞。拡大率x400。H&E染色。
【図13】CytoRich(135)、基準線(室温で12時間)。Ca
Ski細胞。拡大率x200。パパニコラウ染色。
【図14】CytoRich(135)、室温で3週間。CaSki細胞。
拡大率x200。パパニコラウ染色。
【図15】CytoRich(135)、室温で6週間。CaSki細胞。
拡大率x400。H&E染色。
【図16】UCM141、室温で6週間。CaSki細胞。拡大率x400
。H&E染色。
【図17】UCM149、室温で6週間。CaSki細胞。拡大率x400
。H&E染色。
【図18】UCM141、基準線(室温)。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図19】UCM141、基準線(4゜C)。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図20】UCM141、室温で10日間。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図21】UCM141、4゜Cで10日間。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図22】UCM141、室温で10日間。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図23】UCM141、4゜Cで10日間。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図24】UCM149、基準線(室温)。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図25】UCM149、基準線(4゜C)。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図26】UCM149、室温で10日間。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図27】UCM149、4゜Cで10日間。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図28】UCM149、室温で3週間。正常上皮細胞およびCaSki細
胞。拡大率x200。
【図29】UCM149、4゜Cで3週間。正常上皮細胞およびCaSki
細胞。拡大率x200。
【図30】PreservCyt、基準線(室温)。正常上皮細胞およびC
aSki細胞。拡大率x200。
【図31】PreservCyt、基準線(4゜C)。正常上皮細胞および
CaSki細胞。拡大率x200。
【図32】PreservCyt、室温で10日間。正常上皮細胞およびC
aSki細胞。拡大率x200。
【図33】PreservCyt、4゜Cで10日間。正常上皮細胞および
CaSki細胞。拡大率x200。
【図34】PreservCyt、室温で3週間。正常上皮細胞およびCa
Ski細胞。拡大率x200。
【図35】PreservCyt、4゜Cで3週間。正常上皮細胞およびC
aSki細胞。拡大率x200。
【図36】CytoRich、基準線(室温)。正常上皮細胞およびCaS
ki細胞。拡大率x200。
【図37】CytoRich、基準線(4゜C)。正常上皮細胞およびCa
Ski細胞。拡大率x200。
【図38】CytoRich、室温で10日間。正常上皮細胞およびCaS
ki細胞。拡大率x200。
【図39】CytoRich、4゜Cで10日間。正常上皮細胞およびCa
Ski細胞。拡大率x200。
【図40】CytoRich、室温で3週間。正常上皮細胞およびCaSk
i細胞。拡大率x200。
【図41】CytoRich、4゜Cで3週間。正常上皮細胞およびCaS
ki細胞。拡大率x200。
【図42】慣用のPap塗抹(保存)。拡大率x200。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 60/082,167 (32)優先日 平成10年4月17日(1998.4.17) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),AU,BR,C A,JP,NO,SG,US Fターム(参考) 2G045 AA24 AA25 AA40 BA01 BB32 BB52 BB60 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 4B029 AA09 BB11 BB15 HA10 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ08 QQ42 QQ52 QQ67 QQ79 QR41 QR51 QR54 QR67 QS10 QS34 QS39 QX01

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 細胞または組織を収集するための媒質(万能収集媒質)であ
    って、媒質内に含まれる細胞または組織を細胞学的方法および分子方法の両方で
    直接分析することができ、分子の分析方法が、RNAあるいはDNAあるいはタ
    ンパク質分析のいずれか、またはRNAおよびDNAの両方の分析を含み、そし
    て媒質が水を基本としており、保存剤、架橋剤および抗分解剤を含む、上記の万
    能収集媒質。
  2. 【請求項2】 媒質が10mlより少ない容量からなる、請求項1記載の万
    能収集媒質。
  3. 【請求項3】 媒質が約5mlより少ない容量からなる、請求項1記載の万
    能収集媒質。
  4. 【請求項4】 媒質が約2mlより少ない容量からなる、請求項1記載の万
    能収集媒質。
  5. 【請求項5】 万能収集媒質が、バッファー成分、少なくとも一つのアルコ
    ール成分、架橋剤ならびにRNA、DNAおよびタンパク質からなる群の少なく
    とも1つの分解を防ぐ薬剤を含む、請求項1記載の万能収集媒質。
  6. 【請求項6】 バッファー成分がpH範囲約2.5−約6の緩衝能力を持つ
    、請求項5記載の万能収集媒質。
  7. 【請求項7】 バッファー成分がpH範囲約3−約5の緩衝能力を持つ、請
    求項5記載の万能収集媒質。
  8. 【請求項8】 バッファー成分がpH範囲約3.5−約4.5の緩衝能力を
    持つ、請求項5記載の万能収集媒質。
  9. 【請求項9】 アルコール成分がC1−C10のアルコールを含む、請求項
    5記載の万能収集媒質。
  10. 【請求項10】 アルコール成分が、メタノール、エタノール、プロパノー
    ル、ブタノールおよびペンタノールからなる群より選択される、請求項9記載の
    万能収集媒質。
  11. 【請求項11】 アルコール成分がエタノールかまたはn−ブタノールを含
    む、請求項10記載の万能収集媒質。
  12. 【請求項12】 架橋剤がアルデヒドを含む、請求項5記載の万能収集媒質
  13. 【請求項13】 架橋剤がホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドから
    なる群より選択される、請求項12記載の万能収集媒質。
  14. 【請求項14】 架橋剤がグルタルアルデヒド−重亜硫酸塩を含む、請求項
    12記載の万能収集媒質。
  15. 【請求項15】 RNA、DNAおよびタンパク質からなる群の少なくとも
    一つの分解を阻害する薬剤が、ヌクレアーゼインヒビター、プロテアーゼインヒ
    ビターおよびキレート剤からなる群から選択された少なくとも一つの薬剤を含む
    、請求項5記載の万能収集媒質。
  16. 【請求項16】 RNA、DNAおよびタンパク質からなる群の少なくとも
    一つの分解を阻害する薬剤が、キレート剤を含む、請求項15記載の万能収集媒
    質。
  17. 【請求項17】 キレート剤が、ムレキシド、クロモトロブ酸、1−(1−
    ヒドロキシ−1−ナフチチラゾ−2−ヒドロキシ−5−ニトロナフタレン−4−
    スルホン酸、EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)、ο−フェナンスロリン
    およびチオ尿素からなる群より選択される、請求項15記載の万能収集媒質。
  18. 【請求項18】 キレート剤がEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を
    含む、請求項12記載の万能収集媒質。
  19. 【請求項19】 細胞または組織の形態学的および生化学的分析を成し遂げ
    る方法であって: 患者から細胞または組織を得; 保存剤、架橋剤および抗分解剤を含む水を基本とした媒質内に細胞または組織
    を保存し; 媒質内に保存された細胞または組織の形態を直接分析し;そして、 媒質内に保存された細胞または組織内に含まれるRNAまたはDNAまたはタ
    ンパク質のいずれかを直接分析する: ことを含む、前記の方法。
  20. 【請求項20】 水、保存剤、バッファー、架橋剤、ならびにRNA、DN
    Aおよびタンパク質からなる群の少なくとも一つの分解を阻害する能力を持つ薬
    剤、を含む万能収集媒質。
  21. 【請求項21】 2mlより少ない請求項20記載の媒質を保持する容器;
    および 上記容器に適合するフタ: を含む、限定細胞数の細胞サンプル保存用製造品。
  22. 【請求項22】 さらに、伸長部分を持つ細胞収集装置であって、前記伸長
    部分の末端が非吸収性の拡大表面領域を持つ、請求項21記載の製造品。
  23. 【請求項23】 伸長部分の末端がブラシである、請求項22記載の製造品
  24. 【請求項24】 単一のサンプルから、細胞形態の検出、ならびにRNA、
    DNAおよびタンパク質からなる群の少なくとも一つの定量分析を可能にする、
    細胞サンプル収集方法であって: サイズの限定された細胞サンプル内に細胞を患者から収集し; 請求項20記載の媒質内で収集した細胞を保存し; 細胞形態分析用に媒質内の細胞のアリコートを取り出し;そして、 DNA分析、RNA分析、タンパク質分析および炭水化物分析からなる群より
    選択した定量分析用に、媒質内の第二の細胞アリコートを取り出す: ことを含む、前記の収集方法。
  25. 【請求項25】 細胞を10mlより少ないサンプル内で保存する、請求項
    24記載の方法。
  26. 【請求項26】 細胞を約5mlより少ないサンプル内で保存する、請求項
    24記載の方法。
  27. 【請求項27】 細胞を約2mlより少ないサンプル内で保存する、請求項
    24記載の方法。
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