BR112017012210B1 - Método para conservar células, método para produzir uma solução conservante de célula, método para preparar células fixadas e método para analisar células - Google Patents

Método para conservar células, método para produzir uma solução conservante de célula, método para preparar células fixadas e método para analisar células Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a uma solução conservante de célula. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de conservação de células, um método de preparação de células fixadas e um método de análise de células usando uma solução conservante de célula. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma solução conservante de célula.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a uma solução conservante de células. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de conservação de células, um método de preparação de células fixadas e um método de análise de células usando uma solução conservante de células. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma solução conservante de células.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] Quando de análise de células, as células são armazenadas antes de serem submetidas à análise. Por exemplo, ao analisar células extraídas do corpo vivo, é necessário armazenar adequadamente as células durante o período desde a extração das células até o momento de análise das células porque as células separadas do corpo vivo começam a sofrer autólise.
[003] A Literatura de Patente 1 descreve que as células são armazenadas em uma solução conservante de células antes de análise. O Exemplo 5 da Literatura de Patente 1 descreve que a solução conservante de células contém acetato de magnésio a 1 mM, acetato de cálcio a 2 mM, cloreto de potássio a 10 mM, cloreto de sódio a 0,1% e metanol a 20%. LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA DE PATENTE Literatura de Patente 1: Patente dos Estados Unidos N° 5.256.571 SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS TÉCNICOS
[004] Os presentes inventores descobriram que, quando as células são armazenadas em uma solução conservante de células convencional durante um período predeterminado, os ácidos nucleicos nas células podem se tornar instáveis e degradados. Portanto, há uma demanda para o desenvolvimento de uma solução conservante de células em que as células podem ser armazenadas de forma mais estável in vitro por um período predeterminado.
SOLUÇÕES PARA OS PROBLEMAS
[005] A presente invenção fornece uma solução conservante de células que contém um álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, em que a concentração do íon de metal divalente é de cerca de 6 mmols/L a cerca de 82 mmols/L.
[006] A presente invenção fornece um método de conservação de células que compreende permitir que as células sejam imersas in vitro na solução conservante de células.
[007] A presente invenção fornece um método de produção de uma solução conservante de células que compreende mistura de um álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, em que a concentração do íon de metal divalente na solução conservante de células é de cerca de 6 mmols/L a cerca de 82 mmols/L.
[008] A presente invenção fornece um método de preparação de células fixadas que compreende contato das células in vitro com a solução conservante de células de modo a tornar as células fixadas.
[009] A presente invenção fornece um método de análise de células que compreende as etapas de: contato das células in vitro com a solução conservante de células de modo a tornar as células fixadas; e análise dos ácidos nucleicos nas células fixadas que são obtidas na etapa anterior.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0010] De acordo com a presente invenção, as células a serem analisadas podem ser armazenadas de forma estável in vitro durante um período predeterminado antes de serem submetidas à análise.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] A Figura 1 é uma fotografia de eletroforese em gel de agarose de DNA extraído de células HeLa armazenadas em uma solução conservante de células de uma modalidade da presente invenção ou uma solução conservante de células comercialmente disponível sob condições predeterminadas.
[0012] A Figura 2A é um gráfico que mostra os valores medidos obtidos por meio de armazenamento de células cervicais extraídas de indivíduos na solução conservante de células comercialmente disponível sob condições predeterminadas e detecção de ácidos nucleicos derivados do papiloma vírus humano (HPV) no DNA das células por meio de um método de captura híbrida (HybridCapture - HC).
[0013] A Figura 2B é um gráfico que mostra os valores medidos obtidos por meio de armazenamento de células cervicais extraídas de indivíduos na solução conservante de células comercialmente disponível sob condições predeterminadas e detecção de ácidos nucleicos derivados de HPV no DNA das células por meio do método HC.
[0014] A Figura 3A é um gráfico que mostra os valores medidos obtidos por meio de armazenamento de células cervicais extraídas de indivíduos na solução conservante de células da modalidade sob condições predeterminadas e detecção de ácidos nucleicos derivados de HPV no DNA das células por meio do método HC.
[0015] A Figura 3B é um gráfico que mostra os valores medidos obtidos por meio de armazenamento de células cervicais extraídas de indivíduos na solução conservante de células da modalidade sob condições predeterminadas e detecção de ácidos nucleicos derivados de HPV no DNA das células por meio do método HC.
[0016] A Figura 4 é uma fotografia tirada quando as células cervicais extraídas dos indivíduos foram armazenadas na solução conservante de células da modalidade ou na solução conservante de células comercialmente disponível durante 2 dias em temperatura ambiente e submetidas à coloração Papanicolaou.
[0017] A Figura 5 mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de íons de magnésio sob condições predeterminadas com um citômetro de fluxo.
[0018] A Figura 6 é um diagrama que mostra uma região em que aparece uma célula diploide em um histograma de área de fluorescência obtido através de análise de células HeLa armazenadas na solução conservante de célula da modalidade a 25 °C durante 4 horas com o citômetro de fluxo.
[0019] A Figura 7A é um gráfico que mostra coeficientes de variação (Coefficient of Variation - CV) da área de fluorescência de uma região em que aparece uma célula diploide conforme para as células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células tendo várias concentrações de íons de magnésio, a 25 °C durante 4 horas ou a 30 °C durante 24 horas.
[0020] A Figura 7B é um gráfico que mostra o coeficiente de variação (CV) da área de fluorescência de uma região em que aparece uma célula diploide conforme para as células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células tendo várias concentrações de íons de magnésio, a 30 °C durante 24 horas.
[0021] A Figura 8A mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células tendo várias concentrações de metanol sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0022] A Figura 8B mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de metanol sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0023] A Figura 8C mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de metanol sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0024] A Figura 9 mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em uma solução conservante de células com um pH de 6,4 ou 7,0 sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0025] A Figura 10 mostra os histogramas da área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de íons de cálcio sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0026] A Figura 11 são histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas na solução conservante de células comercialmente disponível sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0027] A Figura 12 é uma vista esquemática que mostra um exemplo da solução conservante de células alojada em um recipiente.
[0028] A Figura 13 mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de íons de cálcio sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0029] A Figura 14 mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas em uma solução conservante de células que contém um íon de magnésio e um íon de cálcio sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0030] A Figura 15 é um histograma de área de fluorescência obtido por meio de análise de células HeLa armazenadas em uma solução conservante de células que contém etanol sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0031] A Figura 16 mostra os histogramas da área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HeLa armazenadas na solução conservante de células do Exemplo 1 ou na solução conservante de células descrita na Patente dos Estados Unidos N° 5.256.571 sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
[0032] A Figura 17 mostra histogramas de área de fluorescência obtidos por meio de análise de células HUVEC armazenadas em soluções conservantes de células com várias concentrações de íons de magnésio sob condições predeterminadas com o citômetro de fluxo.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES 1. SOLUÇÃO CONSERVANTE DE CÉLULAS
[0033] A solução conservante de células da modalidade compreende um álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, em que a concentração do íon de metal divalente é de cerca de 6 mmol/L a cerca de 82 mmol/L.
[0034] O álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono (daqui em diante simplesmente dito como "álcool inferior") não está particularmente limitado, contanto que ele possa ser misturado com água em uma proporção opcional em temperatura normal (25 °C). Exemplos dos mesmos incluem metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, terc-butanol, álcool n- amílico, álcool isoamílico, álcool sec-amílico, álcool terc-amílico, 1-etil- 1-propanol, 2-metil-1-butanol, n-hexanol e ciclo-hexanol. Dentre eles, metanol ou etanol é preferido e metanol é particularmente preferido do ponto de vista dos efeitos envolvidos no armazenamento e fixação de células (desidratação e coagulação de proteína).
[0035] Na modalidade, apenas um tipo de álcool inferior ou dois ou mais tipos de álcool inferior podem ser usados. Dois ou mais tipos de álcool podem ser misturados em uma proporção opcional. Por exemplo, um álcool misto obtido por meio de mistura de metanol e etanol em uma proporção opcional pode ser usado como solução conservante de células.
[0036] A concentração do álcool inferior na solução conservante de células pode ser apropriadamente ajustada de acordo com o período de armazenamento de células, o método de análise de células ou similar. Uma concentração muito baixa (por exemplo, no caso onde a concentração é inferior a cerca de 20% em volume) torna difícil o armazenamento estável de células. Uma concentração muito alta (por exemplo, no caso onde a concentração é maior do que cerca de 60% em volume) pode causar fixação excessiva de células. Na modalidade, a concentração do álcool inferior usualmente é a partir de cerca de 20% em volume a cerca de 60% em volume, de preferência a partir de cerca de 30% em volume a cerca de 50% em volume e, particularmente de preferência, a partir de cerca de 40% em volume a cerca de 45% em volume. Na modalidade adicional, a concentração do álcool inferior é a partir de 20% em volume a 60% em volume, de preferência a partir de 30% em volume a 50% em volume e, particularmente de preferência, a partir de 40% em volume a 45% em volume. O álcool inferior está contido na concentração acima para que as células possam ser armazenadas de forma estável. Além disso, o efeito bacteriostático ou efeito bactericida também pode ser esperado. Deverá ser observado aqui que "% em volume" também é indicado por "v/v%" ou "vol%".
[0037] O íon de metal divalente não está particularmente limitado, contanto que ele não afete a manutenção da forma e constituição das células, e pode ser selecionado, por exemplo, a partir de íons de metal que são adicionados a um meio de cultura de células. Na modalidade, exemplos do íon de metal divalente incluem um íon de magnésio, um íon de cálcio, um íon de zinco, um íon de ferro (II), um íon de cobre, um íon de estrôncio e um íon de molibdênio. Dentre eles, os íons de metal de elementos do Grupo II são preferidos. Como íon de metal de elementos do Grupo II, um íon de magnésio e um íon cálcio são particularmente preferidos. Na modalidade, apenas um tipo de íon de metal divalente ou dois ou mais tipos de íons de metal divalentes podem ser usados.
[0038] Na modalidade, o íon de metal divalente na solução conservante de células é, de preferência, fornecido a partir de um composto de metal divalente solúvel em um solvente aquoso. Exemplos do composto incluem sais de ácidos inorgânicos ou orgânicos de metais divalentes. Exemplos de sais de ácidos inorgânicos de metais divalentes incluem sais de ácidos inorgânicos (tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido bromídrico e ácido hidriódico) com metais divalentes. Exemplos de sais de ácidos orgânicos de metais divalentes incluem sais de ácidos orgânicos (tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido ascórbico e ácido oxálico) com metais divalentes. Dentre eles, são preferidos os sais de ácidos inorgânicos de metais divalentes. Exemplos dos mesmos incluem cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Na modalidade, o composto de metal divalente pode ser um anidrido ou um hidrato.
[0039] Com referência à concentração do íon de metal divalente, os presentes inventores descobriram que, em uma solução conservante de células que contém um álcool inferior como componente principal, a concentração do íon de metal divalente é ajustada para uma faixa de cerca de 6 mmol/L a cerca de 82 mmol/L, pelo que células e ácidos nucleicos nas células podem ser armazenados de forma estável in vitro durante um período predeterminado. Na modalidade, a concentração do íon de metal divalente é, de preferência, a partir de cerca de 6 mmol/L a cerca de 80 mmol/Le, mais preferivelmente, a partir de cerca de 10 mmol/L a cerca de 60 mmol/L. Na modalidade adicional, a concentração do íon de metal divalente é a partir de 6 mmol/L a 82 mmol/L, de preferência a partir de 6 mmol/L a 80 mmol/L e, mais preferivelmente, a partir de 10 mmol/L a 60 mmol/L. Deverá ser observado aqui que "mmol/L" também é indicado por "mM". Na modalidade, no caso onde o composto de metal divalente solúvel em um solvente aquoso, particularmente um sal de ácido inorgânico de metal divalente, é dissolvido na solução conservante de células, a concentração do íon de metal divalente na solução conservante de células pode ser expressa pela concentração do composto.
[0040] O solvente aquoso pode ser misturado com um álcool inferior em uma proporção opcional em temperatura normal (25 °C) e não está particularmente limitado, contanto que ele não afete a manutenção da forma e constituição das células. Exemplos do solvente aquoso incluem água, solução salina fisiológica, uma solução tampão, uma solução de albumina, uma solução de dextrana, uma solução de soro humano ou de mamífero normal e qualquer combinação das mesmas.
[0041] A solução tampão é, de preferência, usada como solvente aquoso. A solução tampão não está particularmente limitada, contanto que ela seja uma solução tampão com uma ação de tamponamento em um pH de 6 a 8. Exemplos da mesma incluem uma boa solução tampão, uma solução tampão de fosfato (Phosphate Buffer Solution - PBS), uma solução tampão de imidazol e uma solução tampão de cloridrato de trietanolamina (TriEthanolAmine - TEA). Exemplos da boa solução tampão incluem soluções tampão aquosas, tais como PIPES, MES, Bis-Tris, ADA, Bis-Tris-Propano, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, HEPPS, Tricina, Tris, Bicina e TAPS. No caso do uso de outros solventes aquosos que não a solução tampão, quaisquer tampões usados nas soluções tampão acima podem ser adicionados à solução conservante de células.
[0042] Na modalidade, o pH da solução conservante de células pode estar em uma faixa adequada para o armazenamento de células e está, usualmente, em uma faixa a partir de cerca de 6 a cerca de 8 e, de preferência, em uma faixa a partir de cerca de 6,4 a cerca de 7. Em uma modalidade adicional, o pH da solução conservante de células está em uma faixa a partir de 6 a 8 e, de preferência, em uma faixa a partir de 6,4 a 7. A pressão osmótica da solução conservante de células não está particularmente limitada, contanto que ela não iniba o armazenamento de células, e pode ser fisiologicamente isotônica.
[0043] Se necessário, a solução conservante de células da modalidade pode conter um aditivo no solvente aquoso, além do álcool inferior e do íon de metal divalente. O aditivo não está particularmente limitado, contanto que ele não iniba a fixação, armazenamento e análise de células. Exemplos do mesmo incluem substâncias conhecidas, tais como sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio), sacarídeos (por exemplo, glicose, trealose), conservantes (por exemplo, azida de sódio, fluoreto de fenilmetanossulfonila), estabilizantes de proteínas (por exemplo, albumina de soro bovino), agentes antiespumantes (por exemplo, etileno glicol), antibióticos (por exemplo, penicilina, estreptomicina) e agentes antifúngicos (por exemplo, anfotericina B).
[0044] As células a serem armazenadas na solução conservante de células da modalidade não estão particularmente limitadas e podem ser, por exemplo, células de organismos multicelulares, células de organismos unicelulares ou linhagens de células cultivadas. As células de organismos multicelulares podem ser células extraídas do corpo vivo ou podem ser células extraídas do corpo morto. Exemplos de células de organismos multicelulares incluem células extraídas de mamíferos, tais como seres humanos. Exemplos específicos incluem células cervicais, células do corpo uterino, células orais, células de glândulas mamárias, células da tiroide, células na urina, células no escarro, células de escovação brônquica, células na lavagem peritoneal e células no fluido colômico. Além disso, as células podem ser células contidas nos tecidos extraídos de mamíferos, tais como seres humanos. Os tecidos extraídos podem ser tecidos normais ou tecidos que incluem locais de lesão. Exemplos das células contidas nos tecidos extraídos incluem células primárias cultivadas, células endoteliais da veia umbilical no cordão umbilical e células tumorais contidas em tecidos tumorais extraídos por meio de cirurgia ou biópsia. As células podem ser protozoários, tal como Trichomonas, ou fungos, tal como Candida. As células podem ser células preparadas artificialmente in vitro, tais como células-tronco ou células iPS. As propriedades das células não estão particularmente limitadas e as células podem ser células normais, células imortais, células cancerosas ou similar.
[0045] A Figura 12 mostra um exemplo da aparência da solução conservante de células da modalidade. Na Figura, 11 denota um recipiente que aloja a solução conservante de células. O recipiente que aloja a solução conservante de células da modalidade pode ser alojado em uma caixa e depois fornecido para um usuário. Esta caixa pode incluir uma bula de embalagem que descreve o método de uso da solução conservante de células. Além disso, quando a solução conservante de células da modalidade é considerada para armazenamento de células cervicais, a caixa pode incluir um coletor de amostras de células para extração de células do colo do útero (por exemplo, um cotonete, um pincel).
2. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE SOLUÇÃO CONSERVANTE DE CÉLULA
[0046] Daqui em diante, o método de produção de uma solução conservante de células da modalidade (daqui em diante, também simplesmente dito como "método de produção") será descrito. O método de produção da modalidade é o método de produção de uma solução conservante de células que compreende mistura de um álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, de modo que a concentração do íon de metal divalente seja a partir de cerca de 6 mmol/L a cerca de 82 mmol/L. Deverá ser observado que as concentrações e os tipos do álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e os íons de metal divalentes são os mesmos conforme aqueles descritos sobre a solução conservante de células.
[0047] Na modalidade, o composto de metal divalente solúvel em um solvente aquoso (daqui em diante também simplesmente dito como "composto de metal") é, de preferência, usado como o íon de metal divalente. Deverá ser observado que este composto é o mesmo conforme aquele descrito sobre a solução conservante de células. O composto de metal usado para o método de produção da modalidade pode estar na forma de uma solução ou pode ter uma forma sólida (por exemplo, um pó ou um cristal).
[0048] O álcool inferior usado para o método de produção da modalidade pode ser um álcool absoluto. Alternativamente, contanto que o álcool inferior possa ser controlado para ter a concentração acima, ele pode ser um álcool aquoso.
[0049] Na modalidade, não há uma limitação particular quanto à ordem de adição do álcool inferior e do composto de metal como o íon de metal divalente ao solvente aquoso. Por exemplo, o composto de metal pode ser misturado após misturar o álcool inferior e o solvente aquoso ou o álcool inferior pode ser adicionado após misturar o composto de metal e o solvente aquoso. Além disso, o álcool inferior e o íon de metal divalente podem ser misturados no solvente aquoso substancialmente ao mesmo tempo. As condições de mistura não estão particularmente limitadas e a mistura pode ser realizada, por exemplo, em temperatura normal sob pressão normal (por exemplo, a 25 °C sob uma pressão de 1 atm).
[0050] Na modalidade, o pH da mistura obtida conforme descrito acima é, de preferência, ajustado para uma faixa a partir de cerca de 6 a cerca de 8, particularmente uma faixa a partir de cerca de 6,4 a cerca de 7, usando um álcali, tal como hidróxido de sódio, ou um ácido, tal como ácido clorídrico. Na modalidade adicional, é preferível que o pH da mistura seja ajustado para uma faixa a partir de 6 a 8, particularmente uma faixa a partir de 6,4 a 7.
[0051] Na modalidade, além do álcool inferior e do íon de metal divalente, um aditivo pode ser adicionado, se necessário. Deverá ser observado que o aditivo é o mesmo conforme aquele descrito sobre a solução conservante de células.
3. MÉTODO PARA CONSERVAR CÉLULAS USANDO A SOLUÇÃO CONSERVANTE DE CÉLULA
[0052] O método de conservação de células (daqui em diante, simplesmente dito como "método de conservação") da modalidade será descrito a seguir. O método de conservação da modalidade inclui permitir que as células sejam imersas in vitro na solução conservante de células da modalidade.
[0053] As células usadas no método de conservação da modalidade são as mesmas conforme aquelas descritas acima.
[0054] Na modalidade, as células são imersas in vitro em uma quantidade suficiente (por exemplo, uma quantidade que é de 100 a 1000 vezes o volume de células) da solução conservante de células, deste modo, permitindo que as células sejam fixadas. Posteriormente, as células podem ser armazenadas durante um período predeterminado. Se necessário, as células, após serem imersas na solução conservante de células, podem ser agitadas até o ponto em que as células não sejam danificadas, de modo a fornecer uma suspensão. Antes de serem imersas na solução conservante de células, as células podem ser enxaguadas com PBS ou similar. Quando as células são extraídas do corpo vivo, as células começam a sofrer autólise imediatamente, resultando em deformação das células e estruturas nucleares e degradação e modificação de conteúdos celulares, tais como ácido nucleico e proteína. Assim, as células são, de preferência, imersas na solução conservante de células dentro de no máximo 1 minuto após a extração. O recipiente de conservação não está particularmente limitado, contanto que ele seja um recipiente que possa ser selado com uma tampa, um lacre ou similar. Exemplos do mesmo incluem um frasco para injetáveis, um tubo de ensaio, um microtubo, uma microplaca, uma placa e uma garrafa.
[0055] A temperatura, quando de imersão das células na solução conservante de células (temperatura quando de contato das células com a solução conservante de células) é, de preferência, 35 °C ou menor, mais preferivelmente 32 °C ou menor e, ainda mais preferivelmente, 30 °C ou menor. O limite mínimo da temperatura quando de imersão das células na solução conservante de células não está particularmente limitado, contanto que a análise subsequente não seja afetada pelo congelamento da solução conservante de células e das células. Por exemplo, o limite mínimo da temperatura pode ser de 1 °C ou maior ou 2 °C ou maior. O método de conservação da modalidade pode incluir uma etapa de contato das células com a solução conservante de células na temperatura acima, de modo a tornar as células fixadas.
[0056] A temperatura de armazenamento das células é, de preferência 35 °C ou menor, mais preferivelmente 32 °C ou menor e, ainda mais preferivelmente, 30 °C ou menor. No caso onde as células são armazenadas na solução conservante de células da modalidade, os ácidos nucleicos das células podem ser mantidos de forma estável nos casos não apenas de armazenamento refrigerado, mas também armazenamento em temperatura ambiente. O limite mínimo da temperatura de armazenamento não está particularmente limitado, contanto que a análise subsequente não seja afetada pelo congelamento da solução conservante de células e das células. Por exemplo, o limite mínimo da temperatura de armazenamento pode ser de 1 °C ou maior ou 2 °C ou maior. O método de conservação da modalidade pode incluir uma etapa de armazenamento de células em uma solução conservante de células na temperatura acima durante um período predeterminado. Deverá ser observado que a temperatura no momento de contato das células com a solução conservante de células e a temperatura de armazenamento das células podem ser iguais ou diferentes uma da outra.
[0057] A solução conservante de células pode ser reabastecida durante o período de armazenamento. Embora a frequência de reabastecimento da solução conservante de células não esteja particularmente limitado, a solução conservante de célula pode ser reabastecida, por exemplo, uma vez a cada 90 dia.
4. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE CÉLULAS FIXADAS USANDO A SOLUÇÃO CONSERVANTE DE CÉLULA
[0058] O método de preparação de células fixadas da modalidade (daqui em diante, também simplesmente dito como "método de preparação") será descrito a seguir. O método de preparação da modalidade inclui contato das células in vitro com a solução conservante de células da modalidade de modo a tornar as células fixadas. Deverá ser observado que as células usadas no método de preparação da modalidade são as mesmas conforme descrito no método de conservação de células da modalidade.
[0059] Na modalidade, o contato das células com a solução conservante de células pode ser realizado por meio de imersão das células em uma quantidade suficiente (por exemplo, uma quantidade que é de 100 a 1000 vezes o volume de células) da solução conservante de células. Alternativamente, o contato das células com a solução conservante de células pode ser realizado colocando as células em um recipiente vazio e adicionando uma quantidade suficiente da solução de conservante de células ao mesmo. Antes de serem contatadas com a solução conservante de células, as células podem ser enxaguadas com PBS ou similar. As células começam a sofrer autólise imediatamente, resultando em deformação das células e estruturas nucleares e degradação e modificação do conteúdo celular, tal como ácido nucleico e proteína. Assim, as células são, de preferência, contatadas com a solução conservante de células dentro de no máximo 1 minuto após a extração. O recipiente usado para o contato não está particularmente limitado e exemplos do mesmo incluem um frasco para injetáveis, um tubo de ensaio, um microtubo, uma microplaca, uma placa e uma garrafa. Se necessário, o recipiente pode ser selado com uma tampa, um lacre ou similar.
[0060] No método de preparação da modalidade, as células contatadas com a solução conservante de células são fixadas pelos efeitos do álcool inferior contido na solução conservante de células (desidratação e coagulação da proteína). Na modalidade, o tempo de contato das células com a solução conservante de células não está particularmente limitado, contanto que as células sejam suficientemente fixadas. As condições de temperatura no momento de contato são as mesmas conforme descrito no método de conservação da modalidade.
[0061] Na modalidade, as células fixadas resultantes podem ser usadas diretamente ou após serem enxaguadas com PBS ou similar, como espécimes para a análise desejada. Alternativamente, as células e a solução conservante de células podem ser armazenadas em um estado de estarem em contato entre si antes de serem submetidas à análise. As condições de armazenamento das células são as mesmas conforme aquelas descritas sobre o método de conservação da modalidade.
5. MÉTODO DE ANÁLISE DE CÉLULAS USANDO A SOLUÇÃO CONSERVANTE DE CÉLULA
[0062] O método de análise de células (daqui em diante, simplesmente dito como "método analítico") da modalidade será descrito a seguir. No método analítico da modalidade, as células são primeiro contatadas in vitro com a solução conservante de células da modalidade de modo a tornar as células fixadas. As células, a solução conservante de células e a fixação das células são as mesmas conforme descrito acima.
[0063] Posteriormente, os ácidos nucleicos nas células fixadas resultantes são analisados. Na modalidade, é preferível obter informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos na análise de ácido nucleico. A forma da informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos não está particularmente limitada e pode ser apropriadamente determinada de acordo com o método de obtenção da informação. A informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos pode ser informação numérica (por exemplo, um valor medido), pode ser um diagrama (por exemplo, um gráfico obtido com base na informação numérica) ou pode ser informação de imagem (por exemplo, uma imagem corada, uma fotografia de eletroforese em gel).
[0064] Os ácidos nucleicos nas células fixadas podem ser ácidos nucleicos originalmente presentes nas células ou ácidos nucleicos introduzidos externamente por meio de introdução gênica, infecção viral ou similar. O tipo de ácidos nucleicos pode ser DNA ou RNA. Na modalidade, os ácidos nucleicos nas células fixadas podem ser cDNA ou cRNA sintetizado a partir dos ácidos nucleicos extraídos das células fixadas.
[0065] Na modalidade, o método de análise dos ácidos nucleicos nas células fixadas pode ser selecionado a partir de métodos conhecidos na técnica. Exemplos do método incluem observação microscópica, citometria de fluxo, ensaios de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, um ensaio PCR, um ensaio RT-PCR, um ensaio PCR em tempo real), ensaios de hibridização (por exemplo, um ensaio de hibridação Southern, um ensaio de hibridização Northern), um método de microarranjo e um método de captura híbrida (HC) (vide Clavel C. et al., J. Clin. Pathol, vol. 51, páginas 737-740 (1998)) (Clavel C. et al., J. Clin. Pathol, vol. 51, páginas 737-740 (1998), o qual é aqui incorporado por referência).
[0066] Na modalidade, é preferível que uma amostra de medição seja preparada a partir das células fixadas e, então, a amostra é analisada. A amostra de medição pode ser preparada rompendo as células fixadas ou sem rompimento das células fixadas. O procedimento de preparação para rompimento das células fixadas é, por exemplo, um procedimento para extração de ácidos nucleicos a partir das células fixadas. O procedimento de preparação sem rompimento das células fixadas é, por exemplo, um procedimento para coloração de ácidos nucleicos em um estado onde a forma das células fixadas é mantida.
[0067] O método de extração de ácidos nucleicos das células como tal é conhecido na técnica. Ao extrair DNA, por exemplo, as células fixadas são misturadas com um lisato que contém um tensoativo (por exemplo, colato de sódio, dodecilsulfato de sódio). Ao extrair RNA, por exemplo, as células fixadas são misturadas com um lisato que contém tiocianato de guanidina e um tensoativo. Então, a mistura resultante é submetida a um processo físico (por exemplo, agitação, homogeneização, fragmentação ultrassônica) de modo a permitir que os ácidos nucleicos contidos em uma amostra biológica fiquem livres na mistura, deste modo, obtendo a extração dos ácidos nucleicos. Neste caso, é preferível que a mistura seja centrifugada de modo a precipitar os detritos celulares e, então, o sobrenadante que contém os ácidos nucleicos livres é usado para análise. Alternativamente, o sobrenadante resultante pode ser purificado por meio de qualquer método conhecido na técnica. A extração e purificação dos ácidos nucleicos a partir de células também podem ser realizadas usando um kit comercialmente disponível.
[0068] O método de coloração de ácidos nucleicos ao mesmo tempo em que se mantém a forma celular como tal é conhecido na técnica. Por exemplo, as células fixadas são primeiro contatadas com uma solução de tratamento que contém um tensoativo (por exemplo, Nonidet (marca registrada) P-40), Triton (marca registrada) X-100), de modo que um determinado nível de dano através do qual um corante de coloração de ácido nucleico pode passar é fornecido a uma membrana celular. Então, as células fixadas após o tratamento são contatadas com uma solução do corante, de modo que os ácidos nucleicos possam ser corados ao mesmo tempo em que a forma das células fixadas é mantida.
[0069] O corante para a coloração de ácido nucleico pode ser adequadamente selecionado a partir de corantes de coloração de ácido nucleico conhecidos, de acordo com o método de análise de ácidos nucleicos. Por exemplo, quando um microscópio luminoso é usado para obter informação, exemplos do corante de coloração de ácido nucleico incluem hematoxilina, pironina Y (pironina G) e verde de metila. Além disso, quando um microscópio de fluorescência, citometria de fluxo ou similar é usado para obter informação, é preferível usar um corante fluorescente capaz de corar o ácido nucleico, tal como o corante de coloração de ácido nucleico. Exemplos do corante fluorescente incluem iodeto de propídio, brometo de etídio, heterodímero de etídio-acridina, diazida de etídio, homodímero-1 de etídio, homodímero-2 de etídio, monoazida de etídio, Hoechst33342, Hoechst33258, dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), trimetileno bis[[3-[[4-[[(3- metilbenzotiazol-3-ío)-2-il] metileno]-1,4-di- hidroquinolina]-1-il] propil]dimetil amínioptetraiodeto (TOTO-1), di- iodeto de 4-[(3-metilbenzotiazol-2(3H)-ilideno)metil]-1-[3- (trimetilamínio)propil] quinolínio (TO-PRO-1), tetraiodeto de N,N,N’,N’- tetrametil-N,N’-bis[3-[4-[3-[(3-metilbenzotiazol-3-ío)-2-il]-2- propenilideno]-1,4-di-hidroquinolin-1-il] propil]-1,3-propano diamínio (TOTO-3) e di-iodeto de 2-[3-[[1-[3-(trimetilaminio)propil]-1,4-di- hidroquinolina]-4-ilideno]-1-propenil]-3-metilbenzotiazol-3-ío (TO-PRO- 3).
[0070] Uma amostra de medição que contém ácidos nucleicos extraídos de células fixadas é adequada para um método de análise de detecção de um ácido nucleico predeterminado nas células fixadas (por exemplo, um método de amplificação de ácido nucleico, um método de hibridização, um método de microarranjo, um método de HC). Uma amostra de medição que contém células fixadas cujos ácidos nucleicos são corados ao mesmo tempo em que a forma das células fixadas é mantida é adequada para um método analítico para obter informação sobre os ácidos nucleicos nas respectivas células (por exemplo, observação microscópica, citometria de fluxo). Na modalidade, uma amostra de medição apropriada é preparada a partir de células fixadas de acordo com a finalidade de análise e a análise pode ser realizada.
[0071] Quando os ácidos nucleicos nas células fixadas são analisados por citometria de fluxo, é preferível realizar a etapa de coloração dos ácidos nucleicos nas células fixadas entre a etapa de fixação de células e a etapa de obtenção de informação. A coloração dos ácidos nucleicos nas células fixadas é conforme descrito acima. Os ácidos nucleicos nas células coradas e fixadas são adequadamente analisados usando um microscópio, citometria de fluxo ou similar. A intensidade de coloração das células pelo corante de coloração de ácido nucleico é primariamente dependente da quantidade de ácidos nucleicos intracelulares. Deverá ser observado que a estrutura da cromatina está envolvida na intensidade de coloração (facilidade de ser corada) e a intensidade de coloração é assumida como sendo mais dependente da quantidade de ácidos nucleicos. Portanto, a intensidade de coloração das células é medida com um microscópio, citometria de fluxo ou similar, de modo que seja possível obter informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos. Especificamente, quando se usa citometria de fluxo, as células coradas e fixadas são introduzidas em um citômetro de fluxo e os sinais de fluorescência a partir das células são obtidos. Com base nos sinais de fluorescência, pode ser obtida informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos.
[0072] Na modalidade, como o método analítico com base em citometria de fluxo, por exemplo, o analisador de células ou o método de análise de células descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2009/0091746 pode ser usado (a Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2009/0091746 é aqui incorporada por referência). Especificamente, uma pluralidade de células, incluindo "uma célula alvo de medição" na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2009/0091746 são fixadas na solução conservante de células da modalidade e as células fixadas podem ser analisadas com o analisador de células ou analisadas por meio do método de análise de células.
[0073] Na medição com um citômetro de fluxo, uma amostra de medição que contém as células coradas e fixadas é introduzida em uma célula de fluxo do citômetro de fluxo e as células que passam através da célula de fluxo são irradiadas com luz, deste modo, obtendo a informação óptica emitida a partir das respectivas células (informação de fluorescência e informação de luz dispersa).
[0074] Na modalidade, a informação é informação de fluorescência (por exemplo, forma de onda, intensidade de fluorescência) obtida por meio de emissão de luz de excitação com um comprimento de onda apropriado para as respectivas células coradas com o corante fluorescente e medição da fluorescência excitada. A fluorescência é emitida a partir dos ácidos nucleicos nas células coradas com o corante fluorescente. Consequentemente, a informação de fluorescência reflete a quantidade de ácidos nucleicos nas células fixadas. Deverá ser observado que um comprimento de onda de recepção de luz pode ser apropriadamente selecionado dependendo do corante fluorescente usado.
[0075] Na modalidade, a informação de luz dispersa não está particularmente limitada, contanto que a luz dispersa seja uma luz que possa ser medida com um citômetro de fluxo comercialmente disponível. Por exemplo, uma largura de pulso de luz dispersa e uma intensidade de luz dispersa da luz dispersa, tal como para luz dispersa direta (por exemplo, o ângulo de recepção de luz em torno de 0 a 20 graus) e luz dispersa lateral (ângulo de recepção de luz de cerca de 90 graus) podem ser usadas como informação de luz dispersa. Na técnica, sabe-se que a luz dispersa lateral reflete informações internas, tais como núcleos ou grânulos de células, e a luz dispersa direta reflete a informação sobre o tamanho da célula.
[0076] Na modalidade, a fonte de luz do citômetro de fluxo não está particularmente limitada e uma fonte de luz que tem um comprimento de onda adequado para excitação do corante fluorescente é selecionada. Por exemplo, um laser semicondutor vermelho, um laser semicondutor azul, um laser de argônio, um laser de He-Ne ou uma lâmpada a arco de mercúrio é usada. Particularmente, uma vez que um laser semicondutor é muito barato em comparação com um laser de gás, este é, portanto, preferível.
[0077] Na modalidade, com referência à informação óptica acima, os parâmetros característicos que refletem a quantidade de DNA contida nas células, o tamanho dos núcleos, o tamanho de células ou similar são extraídos, por exemplo, por meio de análise de formas de onda de sinal. As células cancerosas e atípicas podem ser determinadas usando os parâmetros característicos.
[0078] No método de análise da modalidade, a etapa de análise de ácidos nucleicos em células fixadas pode incluir uma etapa de detecção de um ácido nucleico predeterminado nas células fixadas. Neste caso, é preferível usar uma amostra que contém ácidos nucleicos extraídos das células fixadas como a amostra de medição.
[0079] Na modalidade, o ácido nucleico predeterminado não está particularmente limitado e um ácido nucleico opcional de interesse pode ser detectado. O método de detecção não está particularmente limitado e é, de preferência, um método de hibridização que usa um polinucleotídeo que pode ser especificamente hibridizado ao ácido nucleico predeterminado (sonda ou iniciador), um método de microarranjo, um método de HC, um método de amplificação de ácido nucleico ou similar. Tal polinucleotídeo pode ser DNA ou RNA. Além disso, aqueles versados na técnica podem conceber adequadamente o polinucleotídeo que corresponde à sequência de bases do ácido nucleico predeterminado.
[0080] O termo "pode ser especificamente hibridizado a" usado aqui significa que o polinucleotídeo, como sonda ou iniciador, pode ser hibridizado com o ácido nucleico predeterminado sob condições rigorosas. Aqui, as condições rigorosas são condições onde o polinucleotídeo pode ser hibridizado ao ácido nucleico predeterminado com um elevado nível de detecção em comparação com outros ácidos nucleicos que não o ácido nucleico predeterminado (por exemplo, pelo menos duas vezes mais do que a base). Deverá ser observado que as condições rigorosas são usualmente dependentes da sequência e diferentes em vários ambientes. Em geral, as condições rigorosas são selecionadas de modo que o ponto de fusão térmica (Tm) seja menor em cerca de 5 °C do que o ponto de fusão térmica de uma sequência especifica, em uma intensidade iônica e pH especificados. A Tm é a temperatura na qual 50% do polinucleotídeo complementar à sequência de bases do ácido nucleico predeterminado são hibridizados no estado de equilíbrio (dependendo da intensidade iônica, pH e composição de ácidos nucleicos especificados).
[0081] Na modalidade, a sonda pode ser marcada com qualquer substância de marcação conhecida na técnica. Exemplos da substância de marcação incluem substâncias radioativas, tais como 32P, 35S, 3H e 125I; substâncias fluorescentes, tais como fluoresceína e Alexa Fluor (marca registrada); enzimas, tais como fosfatase alcalina e peroxidase de rábano; haptenos, tal como o grupo 2,4-dinitrofenila, biotina e avidina. Quando da detecção de ácidos nucleicos por meio do método de HC, anticorpos híbridos anti- DNA/RNA são, de preferência, marcados com estas substâncias de marcação. Além disso, quando da detecção de ácidos nucleicos por microarranjos, os ácidos nucleicos em uma amostra de medição são, de preferência, marcados com as substâncias de marcação acima.
[0082] Na modalidade, os ácidos nucleicos podem ser detectados como segue. No método de hibridização, através de detecção de um sinal a partir da sonda marcada especificamente hibridizada a um ácido nucleico predeterminado, o ácido nucleico predeterminado pode ser detectado. No método de microarranjo, onde há um ácido nucleico marcado especificamente hibridizado com uma sonda colocada no microarranjo, através de detecção de um sinal a partir do ácido nucleico marcado, o ácido nucleico predeterminado pode ser detectado. Deverá ser observado que o termo "detecção de um sinal" usado aqui inclui detectar qualitativamente a presença ou ausência de um sinal, quantificar uma intensidade do sinal e detectar semiqualitativamente a intensidade do sinal em uma pluralidade de estágios, tal como "nenhum sinal", "sinal fraco" ou "sinal forte".
[0083] No método de amplificação de ácido nucleico, a solução de reação, após amplificação usando um iniciador complementar à sequência de bases de um ácido nucleico predeterminado, é submetida à eletroforese em gel e a presença ou ausência de um produto amplificado é confirmada. Quando o produto amplificado está presente, o ácido nucleico predeterminado pode ser detectado. Alternativamente, no ensaio PCR em tempo real usando uma substância fluorescente que se intercala no DNA (por exemplo, SYBR (marca registrada) Green I) ou uma sonda TaqMan (marca comercial), através da detecção de um sinal a partir da substância fluorescente ou sonda na solução de reação após ou durante amplificação, o ácido nucleico predeterminado pode ser detectado.
[0084] No método de HC, um híbrido de um ácido nucleico predeterminado (DNA) e uma sonda de RNA especificamente hibridizada ao ácido nucleico é encerrado por um anticorpo em fase sólida e um anticorpo marcado e um sinal a partir do anticorpo marcado é detectado, pelo que o ácido nucleico predeterminado pode ser detectado.
[0085] Na modalidade, as células extraídas do colo do útero são fixadas na solução conservante de células. Como um ácido nucleico predeterminado, um ácido nucleico derivado de papiloma vírus humano (HPV) pode ser detectado nas células. A infecção pelo HPV faz com que o DNA do HPV seja incorporado no DNA genômico das células hospedeiras. Assim, quando o ácido nucleico derivado de HPV é detectado em células extraídas do colo do útero de um indivíduo, pode ser determinado que o indivíduo está infectado com o HPV.
[0086] O HPV é classificado em 100 ou mais tipos de subtipos. Na modalidade, o HPV alvo de detecção não está particularmente limitado e pode ser opcionalmente selecionado a partir de subtipos conhecidos. Por exemplo, um ácido nucleico derivado de HPV de tipo alto risco que se acredita ter uma grande possibilidade de provocar câncer cervical pode ser detectado. Exemplos do HPV de tipo alto risco incluem HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68, HPV- 73 e HPV-82.
[0087] O método de detecção do ácido nucleico derivado de HPV pode ser adequadamente selecionado a partir de métodos de detecção conhecidos. Por exemplo, o ácido nucleico derivado de HPV pode ser detectado por meio do método de amplificação de ácido nucleico usando um iniciador capaz de amplificar o DNA genômico do HPV alvo de detecção. Além disso, o ácido nucleico derivado de HPV pode ser detectado por meio do método de hibridização ou o método de HC usando uma sonda que pode ser especificamente hibridizada com o DNA genômico do HPV. Deverá ser observado que aqueles versados na técnica podem conceber apropriadamente um iniciador e uma sonda que correspondem à sequência de bases do DNA genômico do HPV. De modo a detectar o ácido nucleico derivado de HPV, pode ser usado um kit de detecção de HPV comercialmente disponível.
[0088] As células fixadas na solução conservante de células da modalidade podem ser submetidas não apenas ao método de análise de ácidos nucleicos, mas também ao método de análise do tamanho e forma das células, núcleos ou similar. Ao analisar o tamanho e a forma das células, núcleos ou similar, por exemplo, podem ser usados um citômetro de fluxo e um microscópio.
[0089] Quando usando o citômetro de fluxo, a informação de luz dispersa e informação de fluorescência são obtidas ao permitir que as células com núcleos fluorescentes corados passem através de uma célula de fluxo e irradiando as respectivas células com luz.Com base em cada informação, as células anormais podem ser detectadas. Como o citômetro de fluxo, por exemplo, pode ser usado um dispositivo descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2015/0104786 (a Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2015/0104786 é aqui incorporada por referência). Além disso, um analisador de célula esfoliativo comercialmente disponível LC-1000 (Sysmex Corporation) pode ser usado.
[0090] Além disso, pode ser usado um citômetro de fluxo que tem uma função de captura de imagem. Imagiologia das respectivas células que fluem através da célula de fluxo é realizada e um patologista ou similar observa as células que sofreram imagiologia, deste modo, permitindo a detecção de células anormais.
[0091] Quando se usa um microscópio, por exemplo, as células são analisadas de uma maneira tal que as células fixadas na solução conservante de células da modalidade são coradas, as células são esfregadas em uma lâmina de vidro e, então, as células são observadas com um microscópio. Na observação microscópica, o patologista ou similar pode observar as células com o microscópio. Uma imagem corada é fotografada com um microscópio que tem uma função de captura de imagem e o patologista ou similar pode observar a imagem obtida. O processo de esfregar as células sobre a lâmina de vidro pode ser executado manualmente pelo patologista ou similar ou pode ser realizado automaticamente usando um equipamento de preparação de amostras. Como que o dispositivo de preparação da amostra, um dispositivo descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.240.606 pode ser usado (a Patente dos Estados Unidos N° 5.240.606 é aqui incorporada por referência). Além disso, pode ser usado um dispositivo de preparação de amostra comercialmente disponível, tal como um processador ThinPrep (marca registrada).
[0092] A presente invenção inclui ainda o uso da solução conservante de células para armazenar células. Além disso, a presente invenção também inclui o uso da solução conservante de células para a preparação de células fixadas. Além disso, a presente invenção também inclui o uso da solução conservante de células para análise de células. As células a serem fixadas, armazenadas ou analisadas são as mesmas conforme aquelas descritas acima. A composição da solução conservante célula é a mesma conforme aquela descrita acima.
[0093] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos exemplos, no entanto, a presente invenção não está limitada aos exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[0094] As células foram armazenadas em solução conservante de células da modalidade e, então, a estabilidade ao armazenamento do DNA nas células foi examinada. Para fins de comparação, a mesma análise foi realizada usando uma solução conservante de células comercialmente disponível.
1. Materiais (1-1) Solução Conservante de Células
[0095] Uma solução conservante de células foi preparada por meio de mistura de metanol (Wako PureChemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (KishidaChemicalCo., Ltda.) de modo a ter a composição indicada na Tabela 1 abaixo (daqui em diante dita também como "solução conservante de células do Exemplo 1"). Na preparação da solução conservante de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO Laboratories) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. Uma solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. A solução conservante de células tinha um pH de 6,7. Como a solução conservante de células comercialmente disponível, Preserv Cyt (marca registrada) (Hologic, Inc.) foi usada. Embora a composição detalhada da Preserv Cyt (marca registrada) não esteja publicamente disponível, ela é conhecida por ser um tampão aquoso que contém metanol como um componente principal. De acordo com a análise da composição usando o espectrofotômetro de emissão ICP (SII Nanotechnology Inc.), íons de metal divalentes não foram detectados na Preserv Cyt (marca registrada).
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(1-2) Células
[0096] Como as células a serem armazenadas na solução conservante de células, foram usadas linhagens de células de câncer cervical humano HeLa (adquiridas a partir da American Type Culture Collection (ATCC)). As células HeLa foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM: Sigma-Aldrich Co. LLC) que contém soro fetal bovino a 10% (FBS: HyClone Laboratories, Inc.) a 37 °C em uma atmosfera de 5% deCO2.
2. Exame de Estabilidade ao Armazenamento do DNA (2-1) Armazenamento de Células
[0097] Células HeLa em cultura foram coletadas por meio de um método comum e calculadas. Células HeLa (1 x 106 células) foram adicionadas a 12 mL da solução conservante de células do Exemplo 1 ou 12 mL de uma solução conservante de células comercialmente disponível que tinha sido distribuída em um tubo de plástico com volume de 15 mL (Labcon), deste modo, imergindo as células na solução conservante de células. Estas células foram armazenadas sob a condição de temperatura de 1 °C ou 31 °C durante 2 semanas, 1 mês ou 2 meses. Deverá ser observado que, na prática clínica, as células são geralmente armazenadas no congelador (a cerca de 4 °C). A temperatura de "1 °C" (isto é, a condição de temperatura definida neste exemplo) é mais baixa do que aquela do congelador. Neste exemplo, o experimento foi igualmente realizado em uma temperatura maior do que a temperatura ambiente (31 °C) de modo a averiguar se a solução conservante de células poderia ser usada em temperatura ambiente na prática clínica. (2-2) Extração de DNA
[0098] Uma amostra que contém células HeLa e uma solução conservante foi centrifugada a 10000 rpm durante 1 minuto e o sobrenadante foi removido. O DNA foi extraído a partir das células coletadas usando o kit QIAamp DNA Mini (fabricado pela QIAGEN). A operação específica foi realizada de acordo com o manual anexo ao kit. Como controle, o DNA foi extraído da mesma maneira conforme descrito acima a partir das células HeLa que tinham sido imersas na solução conservante de células do Exemplo 1 ou na solução conservante de células comercialmente disponível durante 3 horas (daqui em diante ditas também como "células imediatamente após fixação"). (2-3) Eletroforese
[0099] A absorbância de cada uma das soluções de DNA foi medida usando um espectrofotômetro (Nanodrop2000, fabricado pela Thermo Fisher Scientific) e as concentrações de DNA foram obtidas. As amostras para eletroforese em gel de agarose foram preparadas a partir das soluções de DNA, de modo que a quantidade de DNA contida em cada uma das amostras fosse de 500 ng/coluna. As amostras resultantes foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 0,5%.
3. Resultados
[00100] A Figura 1 mostra os resultados de eletroforese. Conforme mostrado na Figura 1, quando a solução conservante de células comercialmente disponível foi usada, o comprimento de uma sequência de nucleotídeos no DNA obtido a partir das células armazenadas durante um determinado período foi menor do que no DNA obtido a partir das células imediatamente após fixação. Isto indica que o DNA foi degradado. Isto mostra que, no caso da solução conservante de células comercialmente disponível, o DNA não foi adequadamente mantido durante armazenamento. Portanto, é sugerido que, no caso de uso da solução conservante de células comercialmente disponível, a análise de DNA de células armazenadas não pode ser apropriadamente realizada. Entretanto, quando a solução conservante de células do Exemplo 1 foi usada, o comprimento de uma sequência de nucleotídeos no DNA obtido a partir das células armazenadas sob quaisquer condições de temperatura durante quaisquer períodos de armazenamento foi quase o mesmo que o comprimento de uma sequência de nucleotídeos no DNA obtido a partir das células imediatamente após fixação. Portanto, é sugerido que, quando a solução conservante de células do Exemplo 1 é usada, a análise do DNA pode ser realizada de forma adequada, mesmo após armazenamento das células durante um determinado período.
EXEMPLO 2
[00101] A estabilidade ao armazenamento do DNA nas células foi examinada por meio de armazenamento das células na solução conservante de células do Exemplo 1 e, então, detecção de um ácido nucleico predeterminado no DNA das células (ácido nucleico derivado de HPV). Para comparação, Preserv Cyt (marca registrada, Hologic, Inc.), isto é, a solução conservante de células comercialmente disponível, foi usada para executar a mesma análise. 1. Exame de Estabilidade ao Armazenamento de DNA na Solução Conservante de Células Comercialmente Disponível (1-1) Armazenamento de Células
[00102] Células cervicais (oito amostras) foram extraídas a partir do colo do útero de oito indivíduos. As oito amostras foram, respectivamente, adicionadas a 12 mL de Preserv Cyt (marca registrada) e as células foram imersas na solução conservante de células. As amostras foram divididas em três partes iguais para se obter alíquotas 1 a 3. A alíquota 1 foi submetida à detecção de ácido nucleico descrita depois, imediatamente após adição à solução conservante de células (imediatamente após fixação). A alíquota 2 foi submetida à detecção de ácido nucleico descrita posteriormente após armazenamento a 1 °C durante 1 mês ou 2 meses. A alíquota 3 foi submetida à detecção de ácido nucleico descrita posteriormente, após armazenamento a 31 °C durante 1 mês ou 2 meses. O número de amostra de cada uma das amostras e as condições de armazenamento são mostrados na Tabela 2.
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(1-2) Detecção de Ácido Nucleico
[00103] No Exemplo 2, o ácido nucleico derivado de HPV, o qual infectou as células cervicais, foi detectado por meio do método de captura híbrida (HC). Como o pré-tratamento do método de HC, o DNA das células contido em cada uma das alíquotas foi extraído usando o Kit de conversão HC2 Amostra (Produto No. 5127-1220, QIAGEN). A operação específica foi realizada de acordo com o manual anexo ao estojo. O kit de detecção de DNA de HPV (HPV DNA "QIAGEN" HCII (Produto No. 618915, Qiagen)) foi usado para detectar o ácido nucleico derivado de HPV no DNA obtido a partir de cada uma das alíquotas. A operação específica foi realizada de acordo com o manual anexo ao kit.
(1-3) Resultados
[00104] Os resultados são mostrados nas Figuras 2A e 2B. Nas figuras, o eixo vertical indica um logaritmo da intensidade de quimioluminescência medida por meio do método de HC (valor de índice HC2), "0 dia" sobre um eixo horizontal indica que o período de armazenamento é o dia zero (imediatamente após fixação) e "1m/2m" indica que o período de armazenamento é de 1 mês ou 2 meses. Conforme mostrado na Figura 2A, o valor do índice HC2 da alíquota 2 tendeu a ser reduzido em comparação com o valor do índice HC2 da alíquota 1. Conforme mostrado na Figura 2B, o valor do índice HC2 da alíquota 3 foi reduzido em comparação com o valor do índice HC2 da alíquota 1. Estes resultados revelam que as células cervicais extraídas dos indivíduos foram armazenadas na solução conservante de células comercialmente disponível a 1 °C ou 31 °C durante 1 mês ou durante 2 meses, de modo que os ácidos nucleicos nas células foram degradados.
2. Exame de Estabilidade ao Armazenamento de DNA em Solução Conservante de Células da Modalidade (2-1) Armazenamento de Células
[00105] Células cervicais (doze amostras) foram extraídas a partir do colo do útero de doze indivíduos que eram diferentes dos oito indivíduos acima. As doze amostras foram, respectivamente, adicionadas a 12 mL da solução conservante de células do Exemplo 1 e, assim, as células foram imersas na solução conservante de células. As amostras foram divididas em três partes iguais para se obter alíquotas 1 a 3. As células foram coletadas a partir da fração 1, imediatamente após adição à solução conservante de células (imediatamente após fixação) e as células coletadas foram armazenadas a -60 °C. 2 meses depois, a detecção de ácido nucleico descrita posteriormente foi realizada sobre as células coletadas a partir da alíquota 1, bem como as células das alíquotas 2 e 3. A alíquota 2 foi submetida à detecção de ácido nucleico descrita posteriormente após armazenamento a 1 °C durante 2 meses. A alíquota 3 foi submetida à detecção de ácido nucleico descrita posteriormente após armazenamento a 31 °C durante 2 meses. O número de amostra de cada uma das amostras e as condições de armazenamento são mostradas na Tabela 3.
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(2-2) Detecção de Ácidos Nucleicos
[00106] Da mesma maneira conforme descrito acima, o ácido nucleico derivado de HPV que infectou células cervicais foi detectado por meio do método de captura híbrida (HC). O pré-tratamento do método de HC e a detecção do ácido nucleico através do método de HC foram realizados usando o kit HC2 Sample Conversion (QIAGEN) e o kit HPV DNA "QIAGEN" HCII (QIAGEN), respectivamente. A operação específica foi realizada de acordo com o manual em anexo a cada kit.
(2-3) Resultados
[00107] Os resultados são mostrados nas Figuras 3A e 3B. Nas figuras, o eixo vertical indica a intensidade de quimioluminescência medida por meio do método de HC (valor de índice HC2), "0 dia" sobre um eixo horizontal indica que o período de armazenamento é o dia zero (imediatamente após fixação) e "2m" indica que o período de armazenamento é de 2 meses. Conforme mostrado na Figura 3A, o valor do índice HC2 da alíquota 2 foi quase equivalente ao valor de índice HC2 da alíquota 1.Conforme mostrado na Figura 3B, o valor do índice HC2 da alíquota 3 foi reduzido em comparação com o valor do índice HC2 da alíquota 1. Estes resultados revelam que, mesmo que as células cervicais extraídas dos indivíduos tenham sido armazenadas na solução conservante de células do Exemplo 1 a 1 °C ou 31 °C durante 2 meses, os ácidos nucleicos nas células puderam ser adequadamente preservados.
EXEMPLO 3
[00108] Foi examinado se as células armazenadas na solução conservante de células do Exemplo 1 eram adequadas para coloração de espécimes celulares. Para comparação, as células armazenadas em Preserv Cyt (marca registrada, Hologic, Inc.), isto é, a solução conservante de células comercialmente disponível, foram usadas.
1. Coloração das Células Armazenadas em Solução Conservante de Células Comercialmente Disponível
[00109] As células extraídas do colo uterino dos indivíduos foram suspensas em 20 mL de Preserv Cyt (marca comercial registrada) e deixadas repousar em temperatura ambiente durante 2 dias. O sistema de preparação de lâmina ThinPrep2000 (Hologic, Inc.) foi usado para produzir uma lâmina com as células a partir da suspensão de células aderida à mesma. A operação específica foi realizada de acordo com o manual de operação do dispositivo. A lâmina produzida foi corada com corante Papanicolaou de acordo com o procedimento mostrado na Tabela 4 abaixo.
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2. Coloração de Células Armazenadas em Solução Conservante de Célula da Modalidade
[00110] As células extraídas do colo do útero dos indivíduos foram suspensas em 20 mL da solução conservante de células do Exemplo 1 e deixadas repousar em temperatura ambiente durante 2 dias. Então, a suspensão de células foi centrifugada a 800 g durante 10 minutos e o sobrenadante foi removido. 200 μL de água deionizada foram adicionados ao precipitado de modo a fornecer uma suspensão. Então, a quantidade total da suspensão resultante foi adicionada à câmara (BD Settling Chamber, Becton, Dickinson and Company) instalada na lâmina de vidro (BD SurePath PreCoat Slide, Becton, Dickinson and Company) e deixada repousar durante 10 minutos. Então, as células sobre a lâmina foram fixadas com etanol a 95%. A lâmina produzida foi corada com corante Papanicolaou de acordo com o procedimento apresentado na Tabela 4 acima.
3. Resultados
[00111] Os resultados são mostrados na Figura 4. Conforme mostrado na Figura 4, as células armazenadas na solução conservante de células da modalidade foi corada com corante Papanicolaou, deste modo, obtendo uma imagem manchada equivalente àquela das células armazenadas na solução conservante de células comercialmente disponível.
EXEMPLO 4
[00112] A relação entre a concentração de íon de magnésio na solução conservante de células e a estabilidade do DNA nas células foi examinada por meio de citometria de fluxo.
1. Materiais (1-1) Solução Conservante de Células
[00113] No Exemplo 4, as soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição listada na Tabela 5 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada solução conservante de células tinha um pH de 6,6.
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[00114] Como as células armazenadas na solução conservante de células, foram usadas linhagens de células de câncer cervical humano HeLa (adquiridas da ATCC). As células HeLa foram cultivadas da mesma maneira conforme no Exemplo 1. (1-3) Reagente e Citômetro de Fluxo
[00115] O KIT GC-SEARCH (SYSMEX CORPORATION) foi usado como uma solução de coloração ou um removedor de RNA. GC-PACK (SYSMEX CORPORATION) foi usado como um diluente. O analisador de células esfoliativo: LC-1000 (SYSMEX CORPORATION) foi usado como um citômetro de fluxo. 2. Armazenamento de Células e Análise por Citometria de Fluxo (FCM)
[00116] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 1 a 4, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas a repousar a 1 °C ou 31 °C durante 24 horas. Cada uma das suspensões de células foi centrifugada a 10000 rpm durante 1 minuto e o sobrenadante foi removido. A 30 μL da solução restante a qual contém as células, 1 mL de um diluente foi adicionado. A mistura resultante foi centrifugada a 10000 rpm durante 1 minuto e o sobrenadante foi removido. A solução de coloração, removedor de RNA e diluente foram adicionados a 30 μL da solução restante a qual contém as células para preparar uma amostra de medição. A amostra de medição resultante foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, as distribuições de frequência (histogramas) foram criadas, onde a área de fluorescência detectada a partir de cada uma das células foi representada graficamente no eixo horizontal e o número de células foi representado graficamente no eixo vertical. Deverá ser observado que a área de fluorescência é um indicador que reflete a quantidade de DNA nas células. 3. Resultados
[00117] A Figura 5 mostra os histogramas da área de fluorescência criada. Aqui, serão descritos os histogramas da área de fluorescência. Sabe-se que dois picos são geralmente observados nos histogramas da área de fluorescência. Especificamente, os picos incluem um pico formado a partir da população de células diploides e um pico formado a partir da população de células crescidas em células tetraploides. A quantidade de DNA nas células crescidas em células tetraploides é mais elevada do que nas células diploides. Em geral, sabe-se que a quantidade de DNA nas células diploides é constante. Portanto, quando o DNA é estável, as áreas de fluorescência nas células diploides se tornam constantes e, assim, um pico das células diploides aparece acentuadamente nos histogramas da área de fluorescência. Entretanto, a área de fluorescência é um indicador que reflete a quantidade de DNA. Portanto, quando a desestabilização de DNA resulta em sua degradação ou fragmentação, a quantidade de DNA nas células diploides se torna menos constante, deste modo, causando uma mudança na área de fluorescência. Como um resultado, o pico das células diploides nos histogramas se torna menos acentuado.
[00118] Conforme mostrado na Figura 5, mesmo se as células foram armazenadas em qualquer uma das soluções conservantes de células 1 a 4 sob a condição de temperatura de 1 °C, as formas do histograma das áreas de fluorescência eram normais. No entanto, quando as células foram armazenadas nas soluções conservantes de células 1, 2 e 3 tendo uma baixa concentração de íons de metal divalente a 31 °C, as formas do histograma eram descontínuas. Entretanto, quando foi usada a solução conservante de células 4 que tem uma concentração de íon de metal divalente de 20 mmol/L, nenhuma forma de histograma descontínua foi confirmada, mesmo sob a condição de temperatura de 31 °C. Consequentemente, é mostrado que a concentração de íon de metal divalente é adequadamente definida, pelo que o DNA é mantido de modo estável mesmo quando armazenado em uma temperatura elevada, de modo similar a quando armazenado em uma baixa temperatura e, assim, é possível evitar que os histogramas sejam descontínuos.
EXEMPLO 5
[00119] A relação entre a concentração de íons de magnésio na solução conservante de células e a estabilidade do DNA em células foi examinada por meio de citometria de fluxo.
1. Materiais
[00120] No Exemplo 5, soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição indicada na Tabela 6 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,6. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
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2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00121] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de célula 5 a 26, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 25 °C durante 4 horas ou a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células do mesmo modo conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Um indicador da estabilidade da forma do histograma foi calculado como segue. Deverá ser observado que o cálculo será descrito com referência à Figura 6. Com base no histograma das células armazenadas na solução conservante de células 14 (com um MgCh em uma concentração de 20 mmol/L) a 25 °C durante 4 horas, foi calculado o modo na área da fluorescência na região da célula diploide. O modo corresponde ao pico conforme indicado por uma seta na Figura 6. A região na qual aparece a célula diploide foi definida da seguinte maneira: o modo na área de fluorescência na região da célula diploide tem um limite mínimo de 75% e o modo na área da fluorescência na região da célula diploide tem um limite máximo de 125%. O coeficiente de variação (CV) da área de fluorescência na região na qual aparece a célula diploide foi calculada e este foi usado como um indicador da estabilidade da forma do histograma. Um coeficiente de variação (CV) maior da área de fluorescência na região indica que o formato do histograma em células diploides é descontínuo.
3. Resultados
[00122] Os resultados são mostrados nas Figuras 7A e 7B. Conforme mostrado na Figura 7A, no caso de armazenamento a 25 °C durante 4 horas, mesmo que qualquer uma das soluções conservantes de células com concentrações de cloreto de magnésio na faixa de 0 mmol/L a 200 mmol/L tenha sido usada, o valor de CV na região em que aparece uma célula diploide era baixo. Além disso, quase não foi observada uma alteração no valor de CV em virtude das concentrações de cloreto de magnésio. Entretanto, conforme mostrado nas Figuras 7A e 7B, no caso de armazenamento a 30 °C durante 24 horas, o valor de CV na região em que aparece a célula diploide foi significativamente aumentada quando se usa a solução conservante de células com uma concentração alta ou baixa de cloreto de magnésio. A partir destes resultados, foi confirmado que, quando foram usadas as soluções conservantes de células 11 a 19, isto é, quando a concentração de íon de metal divalente na solução conservante de células era de 6 mmol/L a 82 mmol/L, não houve um efeito de evitar que a forma do histograma fosse descontínua. Conforme descrito acima, a área de fluorescência é um indicador que reflete a quantidade de DNA nas células. Assim, quando a desestabilização de DNA resulta em sua degradação ou fragmentação, a quantidade de DNA nas células diploides se torna menos constante, deste modo, causando uma mudança na área de fluorescência. Como um resultado, a forma do histograma em células diploides é descontínua. Portanto, assume-se que a definição da concentração de íon de metal divalente na solução conservante de células em uma faixa a partir de 6 mmol/L a 82 mmol/L contribui para a estabilização do DNA nas células.
EXEMPLO 6
[00123] A relação entre a concentração de álcool inferior na solução conservante de células e a estabilidade do DNA em células foi examinada por meio de citometria de fluxo. 1. Materiais
[00124] No Exemplo 6, soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida ChemicalCo., Ltda.) de modo a ter a composição indicada na Tabela 7 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,7. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
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2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00125] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 27 a 46, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4. 3. Resultados
[00126] As Figuras 8A, 8B e 8C mostram os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B, quando a concentração de íon de metal divalente na solução conservante de células foi de 10 mmol/L a 60 mmol/L, mesmo se a concentração de metanol (MeOH) fosse de 38% v/v a 48% v/v, as formas de histograma das áreas de fluorescência foram favoravelmente mantidas. Conforme mostrado na Figura 8C, quando a concentração de íon de metal divalente na solução conservante de células foi de 20 mmol/L ou 40 mmol/L, mesmo se a concentração de metanol fosse de 35% v/v ou 50 v/v%, as formas de histograma das áreas de fluorescência foram favoravelmente mantidas.
EXEMPLO 7
[00127] A relação entre o pH da solução conservante de células e a estabilidade do DNA em células foi examinada por meio de citometria de fluxo.
1. Materiais
[00128] No Exemplo 7, soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição indicada na Tabela 8 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células 47 a 50 tinha um pH de 6,4 e cada uma das soluções conservantes de células 51 a 54 tinha um pH de 7,0. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
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2. Armazenamento de Células e Anái se FCM
[00129] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 47 e 54, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4.
3. Resultados
[00130] A Figura 9 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 9, quando a concentração de íon de metal divalente na solução conservante de células foi de 10 mmol/L a 60 mmol/L, mesmo se o pH fosse de 6,4 ou 7,0, as formas do histograma das áreas de fluorescência foram favoravelmente mantidas.
EXEMPLO 8
[00131] A relação entre a concentração de íons cálcio na solução conservante de células e a estabilidade do DNA em células foi examinada por meio de citometria de fluxo usando um íon de cálcio como um íon de metal divalente. 1. Materiais
[00132] No Exemplo 8, soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de cálcio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição indicada na Tabela 9 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,7. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
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2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00133] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 55 a 57, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 1 °C ou 31 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4. 3. Resultados
[00134] A Figura 10 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 10, mesmo que as células tenham sido armazenadas em qualquer uma das soluções conservantes de células 55 a 57 sob a condição de temperatura de 1 °C, as formas do histograma das áreas de fluorescência eram normais. No entanto, quando as células foram armazenadas nas soluções conservantes de células 55 e 56 tendo uma baixa concentração de íons de metal divalente a 31 °C, as formas do histograma eram descontínuas. Entretanto, quando foi usada a solução conservante de células 57 que tem uma concentração de íon de metal divalente de 20 mmol/L, nenhuma forma de histograma descontínua foi confirmada, mesmo se a condição de temperatura era de 31 °C. Consequentemente, foi mostrado que, ajustando a concentração de íons de metal divalente apropriada, o DNA foi mantido de modo estável, mesmo quando armazenado em uma temperatura elevada, de modo similar a quando armazenado em uma baixa temperatura e, assim, é possível evitar que os histogramas sejam descontínuos.
EXEMPLO COMPARATIVO 1
[00135] Conforme para as células armazenadas na solução conservante de células comercialmente disponível, a estabilidade do DNA foi analisada por meio de citometria de fluxo.
1. Materiais
[00136] No Exemplo Comparativo 1, Preserv Cyt (marca registrada, Hologic, Inc.) foi usada como a solução conservante de células comercialmente disponível. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00137] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas em Preserv Cyt (marca registrada). A suspensão de células resultante foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 30 minutos, a 31 °C durante 24 horas ou a 31 °C durante 7 dias. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4.
3. Resultados
[00138] A Figura 11 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 11, no caso de armazenamento em temperatura ambiente durante 30 minutos, a forma do histograma na área de fluorescência era normal. No entanto, no caso de armazenamento a 31 °C durante 24 horas ou 7 dias, as formas do histograma eram descontínuas. Portanto, descobriu-se que a solução conservante de células comercialmente disponível é diferente da solução conservante de células da modalidade e não é adequada para armazenamento sob a condição de temperatura de 31 °C.
EXEMPLO 9
[00139] A relação entre a concentração de íons cálcio na solução conservante de células e a estabilidade do DNA em células foi examinada por meio de citometria de fluxo. 1. Materiais
(1-1) Solução Conservante de Células
[00140] No Exemplo 9, as soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de cálcio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição mostrada na Tabela 10 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,6. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
Figure img0013
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00141] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 58 e 64, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4.
3. Resultados
[00142] A Figura 13 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 13, quando as células foram armazenadas nas soluções conservantes de células 60, 61 e 62 que têm concentrações de íons de cálcio de 6, 20 e 82 mmol/L, respectivamente, a 30 °C, as formas do histograma foram favoráveis. Conforme descrito acima, a área de fluorescência é um indicador que reflete a quantidade de DNA nas células. Consequentemente, o fato de que as formas do histograma das áreas de fluorescência são favoráveis significa que o DNA nas células foi mantido de forma estável durante armazenamento. Portanto, é mostrado que, ao ajustar a concentração de íons de cálcio adequadamente, o DNA nas células pode ser mantido de modo estável, mesmo quando armazenado sob a condição de temperatura de 30 °C.
EXEMPLO 10
[00143] As células foram fixadas e armazenadas em uma solução conservante de células que contém tanto íons de magnésio quanto íons de cálcio como íons de metal divalentes. A estabilidade do DNA nas células armazenadas foi examinada por meio de citometria de fluxo. Para comparação, também foi usada uma solução conservante de células não que contém íons de metal divalente.
1. Materiais (1-1) Solução Conservante de Célula
[00144] No Exemplo 10, as soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.), cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) e cloreto de cálcio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição mostrada na Tabela 11 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,7. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
Figure img0014
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00145] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 65 e 66, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4. 3. Resultados
[00146] A Figura 14 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 14, quando as células foram armazenadas na solução conservante de células 65 que não contém nenhum íon de metal divalente a 30 °C, a forma do histograma era descontínua. Entretanto, quando foi usada a solução conservante de células 66 que tem uma concentração total de íons de metal divalentes de 20 mmol/L, a forma do histograma era favorável. Assim, foi mostrado que, usando a solução conservante de células que contém dois tipos de íons de metal divalente em uma concentração apropriada, o DNA nas células pode ser mantido de modo estável, mesmo quando armazenado sob a condição de temperatura de 30 °C.
EXEMPLO 11
[00147] As células foram fixadas e armazenadas em uma solução conservante de células que contém etanol como o álcool inferior. A estabilidade do DNA nas células armazenadas foi examinada por meio de citometria de fluxo. 1. Materiais (1-1) Solução Conservante de Células
[00148] No Exemplo 11, as soluções conservantes de células foram preparadas por meio de mistura de etanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição mostrada na Tabela 12 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. A solução conservante de células tinha um pH de 6,7. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4. TABELA 12
Figure img0015
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00149] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas na solução conservante de células 67. A suspensão de células resultante foi deixada em repouso a 30 °C durante 7 dias. Uma amostra de medição foi preparada a partir da suspensão de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. A amostra de medição resultante foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, um histograma área de fluorescência foi criado da mesma maneira conforme no Exemplo 4. 3. Resultados
[00150] A Figura 15 mostra o histograma da área de fluorescência criado. Conforme mostrado na Figura 15, quando as células foram armazenadas na solução conservante de células 67 que contém etanol como o álcool inferior, a forma do histograma era favorável. Portanto, é sugerido que, usando uma solução conservante de células que contém etanol e um íon de metal divalente em uma concentração apropriada, o DNA nas células pode ser mantido de modo estável, mesmo quando armazenado sob a condição de temperatura de 30 °C.
EXEMPLO COMPARATIVO 2
[00151] A estabilidade do DNA nas células armazenadas na solução conservante de células da modalidade foi comparada com a estabilidade do DNA em células armazenadas na solução conservante de células descrita no Exemplo 5 da Literatura de Patente 1 (Patente dos Estados Unidos N° 5.256.571).
1. Materiais (1-1) Solução Conservante de Células
[00152] Como a solução conservante de células da modalidade, foi usada a solução conservante de células do Exemplo 1. Além disso, como a solução conservante de células descrita no Exemplo 5 da Literatura de Patente 1 (daqui em diante dita também como "solução conservante de células do Exemplo Comparativo 2"), foi preparada uma solução conservante de células com a composição a seguir. As células, reagente e citometria de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4. Solução Conservante de Célula do Exemplo Comparativo 2 acetato de magnésio hexa-hidratado a 1 mM acetato de cálcio mono-hidratado a 2 mM cloreto de potássio a 10 mM cloreto de sódio a 0,1% metanol a 20%
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00153] As células HeLa foram adicionadas a e suspensas na solução conservante de células do Exemplo 1 e a solução conservante de células do Exemplo Comparativo 2, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 7 dias. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4.
3. Resultados
[00154] A Figura 16 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 16, quando as células foram armazenadas na solução conservante de células do Exemplo 1 a 30 °C durante 7 dias, a forma do histograma na área de fluorescência era normal. Entretanto, quando as células foram armazenadas na solução conservante de células do Exemplo Comparativo 2, a forma do histograma era descontínua. Portanto, descobriu-se que a solução conservante de células descrita no Exemplo 5 da Patente dos Estados Unidos N° 5.256.571 é diferente da solução conservante de células da modalidade e não é adequada para o armazenamento sob a condição de temperatura de 30 °C.
EXEMPLO 12
[00155] Células derivadas de tecidos normais foram fixadas e armazenadas em uma solução conservante de células que contém um íon de magnésio. A estabilidade do DNA nas células armazenadas foi examinada por meio de citometria de fluxo. 1. Materiais (1.(1) Solução Conservante de Célula
[00156] No Exemplo 12, as soluções conservantes de célula foram preparadas por meio de mistura de metanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltda.) e cloreto de magnésio (Kishida Chemical Co., Ltda.) de modo a ter a composição mostrada na Tabela 13 abaixo. Na preparação das soluções conservantes de células, água foi usada como solvente e PIPES (DOJINDO LABORATORIES) como um tampão foi adicionado de modo a fornecer uma concentração de 20 mM. A solução aquosa de NaOH foi usada para ajustar o pH. Cada uma das soluções conservantes de células tinha um pH de 6,7.
Figure img0016
Figure img0017
(1-2) Células, Reagente e Citômetro de Fluxo
[00157] Como as células derivadas de tecido normal a serem armazenadas na solução conservante de células, foram usadas linhagens de células endoteliais da veia umbilical humana HUVEC (adquiridas a partir da ATCC). As células HUVEC foram cultivadas da mesma maneira conforme na cultura das células HeLa do Exemplo 1. O reagente e citômetro de fluxo são os mesmos conforme aqueles usados no Exemplo 4.
2. Armazenamento de Células e Análise FCM
[00158] Células HUVEC foram adicionadas a e suspensas nas soluções conservantes de células 68 e 71, respectivamente. As suspensões de células resultantes foram deixadas repousar a 30 °C durante 24 horas. Amostras de medição foram preparadas a partir de suspensões de células da mesma maneira conforme no Exemplo 4. Cada uma das amostras de medições resultantes foi introduzida no citômetro de fluxo e sinais ópticos (um sinal fluorescente e um sinal de luz dispersa direta) foram obtidos. Então, os histogramas da área de fluorescência foram criados da mesma maneira conforme no Exemplo 4.
3. Resultados
[00159] A Figura 17 mostra os histogramas da área de fluorescência criados. Conforme mostrado na Figura 17, quando as células HUVEC foram armazenadas na solução conservante de células 68 não que contém íons de magnésio a 30 °C, a forma do histograma era descontínua. Entretanto, quando as células foram armazenadas em soluções conservantes de células 69, 70 e 71 que têm concentrações de íons de magnésio de 6, 20 e 82 mmol/L, respectivamente, a 30 °C, as formas de histograma foram favoráveis. Consequentemente, é mostrado que, usando a solução conservante de células da modalidade, mesmo quando as células derivadas de tecido normal foram armazenadas sob a condição de temperatura de 30 °C, o DNA nas células pôde ser mantido de forma estável. LISTA DE SINAIS DE REFERÊNCIA 11: recipiente para alojamento de solução conservante de células

Claims (24)

1. Método para conservar células, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de imergir in vitro as células em uma solução conservante de célula compreendendo um álcool inferior que tem de 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, em que a concentração do íon de metal divalente é de 6 mmols/L a 82 mmols/L.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o íon de metal divalente é um íon de metal de elemento do Grupo II.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o íon de metal divalente é pelo menos um selecionado a partir de íon de magnésio e íon de cálcio.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a concentração do íon de metal divalente é de 6 mmols/L a 80 mmols/L.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a concentração do íon de metal divalente é de 10 mmols/L a 60 mmols/L.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o álcool inferior é pelo menos um selecionado a partir de metanol e etanol.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração do álcool inferior é de 20% em volume a 60% em volume.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pH é de 6 a 8.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as células armazenadas na solução conservante de célula são células cervicais, células no corpo uterino, células bucais, células das glândulas mamárias, células da tiroide, células na urina, células no escarro, células de escovação brônquica, células no lavado peritoneal ou células no fluido colômico, as quais são extraídas a partir do corpo vivo ou células incluídas no tecido extraído.
10. Método para produzir uma solução conservante de célula, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de misturar um álcool inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono e um íon de metal divalente em um solvente aquoso, em que a concentração do íon de metal divalente na solução conservante de célula é de 6 mmols/L a 82 mmols/L.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o íon de metal divalente é um íon de metal de elementos do Grupo II.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o íon de metal divalente é pelo menos um selecionado a partir de íon de magnésio e íon de cálcio.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a concentração do íon de metal divalente é de 6 mmols/L a 80 mmols/L.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a concentração do íon de metal divalente é de 10 mmols/L a 60 mmols/L.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o álcool inferior é pelo menos um selecionado a partir de metanol e etanol.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a concentração do álcool inferior na solução conservante de célula é de 20% em volume a 60% em volume.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que a solução conservante de célula tem um pH de 6 a 8.
18. Método para preparar células fixadas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar as células in vitro em contato com uma solução conservante de célula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, de modo a tornar as células fixadas.
19. Método para analisar células, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) colocar as células in vitro em contato com uma solução conservante de célula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, de modo a tornar as células fixadas; e (ii) analisar os ácidos nucleicos nas células fixadas que são obtidas na etapa anterior.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a informação que mostra a quantidade de ácidos nucleicos nas células fixadas é obtida na etapa de análise.
21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de coloração dos ácidos nucleicos nas células fixadas entre a etapa de fixação e a etapa de análise, em que a etapa de análise compreende as etapas de: introdução de células marcadas em um citômetro de fluxo e obtenção de informação óptica a partir das células; e análise dos ácidos nucleicos com base na informação óptica.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de análise compreende uma etapa de detecção de um ácido nucleico predeterminado nas células fixadas.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as células são células extraídas do colo do útero e o ácido nucleico predeterminado é um ácido nucleico derivado de papiloma vírus humano (HPV).
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 18 a 23, caracterizado pelo fato de que as células a serem armazenadas na solução conservante de célula são células cervicais, células no corpo uterino, células bucais, células das glândulas mamárias, células da tiroide, células na urina, células no escarro, células de escovação brônquica, células no lavado peritoneal ou células no fluido colômico, as quais são extraídas a partir do corpo vivo ou células incluídas no tecido extraído.
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