JP2002506436A

JP2002506436A - 治療用ナノスフェア

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Publication number: JP2002506436A
Application number: JP50306999A
Authority: JP
Inventors: スコットウォルシュ; ロナルドルーベンシュタイン; パメラツェットリン; カムレオン
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-11
Publication date: 2002-02-26
Also published as: WO1998056370A2; EP0989849A2; WO1998056370A3; AU8062498A; CA2303268A1; AU749032B2; US6207195B1

Abstract

(57)【要約】 4-フェニル酪酸塩は多くの有益な生物的効果を発揮する。これはある種のプロモーターの転写を誘導すると考えられるとともに、細胞内に異常に局在した蛋白質に対する治療的効果を有する。さらに、これは細胞を発生的に分化させると考えられる。本発明は、細胞内の蛋白質局在の異常を治療する4-フェニル酪酸塩および他の薬物のナノスフェア製剤を提供する。これらの製剤により、投与しようとする薬物に関してより低い濃度が可能となり、コストおよび安全性の両方の利点が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】治療用ナノスフェア発明の技術分野本発明は、ナノ粒子による細胞への薬物および遺伝子の送達に関する。発明の背景嚢胞性線維症（CF）は、特に肺および膵管において、cAMP刺激による上皮表面を介した塩素コンダクタンスに異常がみられることを特徴とする単一遺伝子性の劣性疾患である。臨床的には、この障害は肺気道における粘膜繊毛クリアランスの低下を引き起こし、これが慢性細菌感染および炎症をもたらす。その結果として、患者の平均余命は30年未満に過ぎない。これまでの臨床試験は、嚢胞性線維症の肺治療に関する遺伝子または薬物療法のいずれかに対象を絞ったものであった［7，8］。最も頻度の高いCF変異であるΔF508は、CFTR蛋白質の原形質膜への到達不全をもたらすが、これは蛋白質輸送（protein trafficking）の異常による可能性が高い。4PBAはインビトロでΔF508気管支上皮細胞の原形質膜でのCFTR性塩化物イオンコンダクタンスを回復させる作用をもつことが示されている［10］。発明の概要本発明の1つの目的は、嚢胞性線維症を治療するための固形ナノスフェア（sol id nanosphere）を提供することである。本発明のもう1つの目的は、遺伝子送達のための固形ナノスフェアを提供することである。本発明のもう1つの目的は、嚢胞性線維症を治療するための方法を提供することである。本発明のもう1つの目的は、腫瘍を治療するための方法を提供することである。本発明のもう1つの目的は、尿素回路障害を治療するための方法を提供することである。本発明のさらにもう1つの目的は、β-異常ヘモグロビン症（β-hemoglobinopa thy）を治療するための方法を提供することである。本発明の上記およびその他の目的は、本発明の1つまたは複数の態様によって実現される。本発明の1つの態様では、嚢胞性線維症を治療するための固形ナノスフェアが提供される。本ナノスフェアは、4-フェニル酪酸ナトリウム（4-PBA）を含む。本発明のもう1つの態様では、嚢胞性線維症を治療するための固形ナノスフェアが提供される。本ナノスフェアは以下のものを含む：野生型CFTRをコードする核酸、および ΔF508変異型CFTR蛋白質を活性化する薬物。本発明のさらにもう1つの態様では、遺伝子送達のための固形ナノスフェアが提供される。本ナノスフェアは以下のものを含む： 4-フェニル酪酸ナトリウム（4-PBA）、および遺伝子コード配列と機能的に結合したプロモーターを含み、プロモーターが4-PBAで誘導可能である核酸構築物。本発明のさらにもう1つの態様では、嚢胞性線維症を治療するための方法が提供される。本方法は以下の段階を含む：嚢胞性線維症の患者の肺に対する、4-PBAを含む固形ナノスフェアを含むエアロゾル化された医薬品の投与。本発明のさらにもう1つの態様では、腫瘍を治療するための方法が提供される。本方法は以下の段階を含む：腫瘍に対する、4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品の投与。本発明のもう1つの局面によれば、尿素回路障害を治療するための方法が提供される。本方法は以下の段階を含む：尿素回路障害の患者の肝臓に対する、4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品の投与。本発明のもう1つの局面によれば、β-異常ヘモグロビン症を治療するための方法が提供される。本方法は以下の段階を含む： β-異常ヘモグロビン症の患者の骨髄に対する、4-PBAを含む固形ナノスフェアを含む医薬品の投与。本発明のさらにもう1つの態様では、β-異常ヘモグロビン症を治療するためのもう1つの方法が提供される。本方法は以下の段階を含む： β-異常ヘモグロビン症の患者に対する、4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品の投与。したがって、本発明は、嚢胞性線維症、尿素回路障害、癌およびβ-異常ヘモグロビン症を含む種々のヒト疾患を治療するための製剤および方法を備えた技術を提供する。図面の簡単な説明図1は、緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子によるトランスフェクションを行った気道上皮細胞のフローサイトメトリーヒストグラムを示している。蛍光強度は、対照（実線―LUL）およびナノスフェア（点線―RLL）で処理した気道に関して測定されている。LULおよびRLLに関してゲートM1の内側にある細胞を陽性として算定される。図2A〜Dは、IB3細胞からの³⁶Cl^-の流出を示している。データは15秒の各期間にわたる塩化物イオンの流出の変化率としてプロットされている。45秒（矢印）以後の各時点で、細胞を刺激するためにフォルスコリンを添加している（○）。非刺激細胞（●）には各時点で、純粋な（plain）リンゲル液のみを与えた。p値は0：45から2：30までの時点で行った順位和検定によって決定される。詳細な説明本発明者らは、ナノスフェアが4-フェニル酪酸塩（4-PBA）などの薬物に関する優れた送達媒体であることを見いだした。このような媒体による製剤はより低用量での使用を可能とし、これは経済的且つより安全である。さらに、エアロゾルの吸入によるこのような製剤の送達は、より高用量を経口摂取するよりも快適である。このような治療法は嚢胞性線維症の患者に対して特に有用である。 4-PBAは、インビトロでΔF508気管支上皮細胞の原形質膜でのCFTR性塩化物イオンコンダクタンスを回復させることが明らかになっている。本製剤のインビボでの使用により、気管支上皮への直接的な送達によってこのような機能を回復させることができる。この効果を有する他の薬物をナノスフェアに封入（encapsul ate）することもできる。さらに、他のCFTR変異体に対してこの効果を及ぼす薬物も用いうる。このような薬物には、ミルリノン、ゲニステイン、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPX）および3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）が含まれる。野生型CFTRをコードする核酸をナノスフェア中に含めることにより、4-PBAの効果を増強させることができる。このため、変異型CFTRの機能を増強させる薬物を送達することに加えて、野生型CFTRも導入される。4-PBAで誘導可能なプロモーターを含む構築物（construct）中に野生型コード配列を導入すれば、さらなる増強が生じる。このような誘導可能なプロモーターには、アデノ随伴ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、γグロブリンプロモーターおよびCFTRプロモーターが含まれる。ナノスフェア中に封入された4-PBAおよび4-PBAで誘導可能なプロモーターを有する構築物の使用は、CFTR遺伝子に限定されない。有利な治療効果を有すると考えられるその他の遺伝子も有利に用いうる。これらにはRB、p53、Bcl2、ADA、γ -グロブリンが非制限的に含まれる。 4-PBAには細胞分化を誘導する作用もある。これは癌を含む増殖性疾患の治療において望ましい性質である。このため、細胞に細胞分化量の4-PBAを効率的に送達するために、4-PBAを含むナノスフェアを腫瘍に対して投与することができる。分化を誘導することにより、腫瘍細胞の急速な増殖を弱めることができる。 4-PBAは尿素回路障害を治療するためにも用いられている。このため、4-PBAを含むナノスフェアは、尿素回路を担う標的細胞に対して有効量の4-PBAを効率的に送達するために用いうる。 4-PBAが、胎児型のものを発現しない細胞内で胎児性ヘモグロビンの発現を誘導することも判明している。このため、胎児性ヘモグロビンの発現を誘導するための有効量を患者または単離された骨髄に対して送達することを目的として、4- PBAを含むナノスフェアを用いることができる。これはβサラセミアおよび鎌状赤血球貧血症などのβ-異常ヘモグロビン症の症例に有用と考えられる。本発明によれば、ゼラチンまたはゼラチンと類似した電荷密度を有するその他の重合体性陽イオン（polymeric cation）が、核酸との複合体化によってナノ粒子を形成するために用いられる。ゼラチンの源は重大ではないと考えられ、これはウシ、ブタ、ヒトまたはその他の動物由来でありうる。典型的には重合体性陽イオンの分子量は19,000〜30,000の範囲である。本発明の重合体性陽イオンとしてはポリ-L-リジンまたはキトサンが特に有用と思われる。重合体性陽イオンおよび核酸のコアセルベーションの誘導には硫酸ナトリウムを用いることが望ましい。コアセルベーションを誘導するためにエタノールを約40から60％の濃度で用いることもできる。ナノスフェア中にその他の薬物およびリソソーム分解剤を組み入れることもできる。必要に応じて、ターゲティング用リガンド（targeting ligand）をナノ粒子の表面に直接結合させること、または「架橋」もしくは「スペーサー」を用いて間接的に付着させることが可能である。ゼラチンのリジン基により提供されるアミノ基のため、ナノ粒子の表面はターゲティング部分の直接結合のために容易に誘導体化しうる。例えば、カルボジイミドを誘導体化剤として用いることができる。または、ターゲティング用リガンドをナノスフェアと間接的に結合させるために、アビジン-ビオチンおよびポリエチレングリコールなどのスペーサー（分子およびターゲティング用リガンド上の誘導体化部分を連結するもの）を用いることもできる。ビオチンはアビジンに対して高い親和性（k_aはほぼ10¹⁵M^-1）を有するため（Hazudaら、1990、インターロイキン1β前駆体のプロセシングおよび炎症性疾患（Processing of precursor interleukin 1 beta and inflammatory disease）、J．Biol．Chem.、265：6318〜22、Wilchekら、1990、アビジン-ビオチン技術に対する手引き（Introduction to avidin-biotin technology）、Meth ods InEnzymology、184：5〜13）、ビオチン化抗体および／またはその他のビオチン化リガンドはアビジンで覆われたナノスフェアの表面と効率的に結合しうる。配向選択的なIgGの結合は、Fc部分に認められるオリゴ糖基の箇所で抗体をビオチン化することによって達成される（O'Shannessyら、1984、オリゴ糖部分との結合による免疫グロブリンの新たな標識手順（A novel procedure for labeli ng immunoglobulins by conjugation to oligosaccharides moieties）、Immuno l．Lett.、8：273〜277）。このデザインは、有効な結合部位の総数を保ちながら、付着した抗体のマクロファージなどのFc受容体保持細胞に対する免疫原性を低下させるために役立つ。当技術分野で知られている通り、アビジン-ビオチン架橋以外のスペーサーも用いうる。例えば、免疫グロブリン分子のFc部分をナノ粒子と結合させるために、ナノ粒子をブドウ球菌プロテインAでコーティングすることができる。連結分子またはターゲティング用リガンドのナノ粒子との架橋は、ナノ粒子の安定性を向上させるため、さらには連結分子またはターゲティング用リガンドをナノ粒子に共有的に付着させるために用いられる。架橋の程度はミクロスフェアからの核酸の放出速度に直接的な影響を及ぼす。架橋は、グルタルアルデヒド、 EDC（l-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド）、DCC（N,N'- ジシクロヘキシルカルボジイミド）、カルボキシル結合（ペプチド結合）、DSS （ジスクシニミジルスベレート）、SPDP（N-スクリニミジル3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート）、ビス(スルホスクシニミジル)スベレート、ジメチルスベリミデートなどのカルボジイミドを用いて達成しうる。本発明に係るターゲティング用リガンドは、体内で特定の種類の細胞と結合する任意の分子である。これらは、それに対する細胞受容体が存在する任意の種類の分子でありうる。細胞受容体は特定の細胞種のみで発現することが好ましい。用いうるターゲティング用リガンドの例には、ホルモン、抗体、細胞接着分子、糖類、薬物および神経伝達物質がある。本発明のナノ粒子には、優れた負荷（loading）特性がある。典型的には、本発明の方法に従うことにより、核酸を少なくとも5％（w／w）有するナノ粒子を得ることができる。負荷量は核酸が10または15％を上回ることが好ましい。しばしば核酸が20または30％を上回るが40または50％未満であるナノ粒子を得ることができる。典型的には、95％を上回る核酸のナノ粒子への封入効率を実現することができる。本発明の方法には、重合体性陽イオンおよび核酸のコアセルベーションが含まれる。この過程は正に荷電した重合体性陽イオンと負に荷電した核酸との相互作用に依存するため、これは複雑コアセルベーション過程とみなしうる。しかし、硫酸ナトリウム（またはエタノール）は相転移を誘発することによってコアセルベーション反応を誘発するため、これは単純コアセルベーション反応ともみなせると考えられる。核酸はコアセルベーション混合物中に1ng／mlから500μg／ml の範囲の濃度で存在する。核酸は長さが少なくとも約1〜3kbであることが望ましいが、これより小さな分子も用いうる。硫酸ナトリウムは7から43mMの範囲で存在する。ゼラチンまたはその他の重合体性陽イオンはコアセルベーション混合物中に約2から7％の範囲で存在する。興味がもたれるナノ粒子送達系には、調製の簡単さ、費用対効果の高さ、核酸負荷レベル、放出制御能、保存安定性および成分の免疫原性といった因子間の微妙なバランスが必要である。本明細書に記載される遺伝子および薬物送達系は、リポソーム系を含むその他の微粒子送達系と比べて多くの利点を提供すると思われる。不安定性、搭載レベルの低さおよび放出制御能という問題は、重合体性ナノ粒子系によってより適切に解決される。ゼラチンは、その生体適合性およびインビボでの酵素による分解性のため、外科用組織接着剤（Weinschelbaum,ら、19 92、本来の大動脈弁の保存および生物的接着剤の使用による急性A型解離性大動脈瘤の外科治療。6年間の追跡調査（Surgical treatment of acute type A diss ecting aneurysm with preservation of the native aortic valve and use of biologic glue．Follow-up to 6 years）、J．Thorac．Cardiovase．Surg.、130 ：369〜74）から、定量的免疫組織化学アッセイ（Izumiら、1990、野外でのハンセン病の血清診断のための新規ゼラチン粒子凝集試験（Novel gelatin particle agglutination test for serodiagnosis of leprosy in the field）、J．Clin ical Microbiol.、28：525〜9）および薬物送達用担体（Tabataら、1991、マウス腫瘍細胞のインビボでの増殖に対する組換えα-インターフェロン-ゼラチン結合体の効果（Effects of recombinant alpha-interferon-gelatin conjugate on in vivo murine tumor cell growth）、Cancer Res.、51：5532〜8）までの範囲にわたり、生物的使用の機会はますます増加している。詳細に検討がなされているポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体などの他の合成重合体系と比べ、ナノ粒子製剤の条件が温和であることも魅力的である。合成重合体性ナノ粒子の製剤化に用いられる溶媒蒸発およびホットメルト技術とは異なり、複雑コアセルベーションには有機溶媒との接触および加熱はいずれも必要でない。また、核酸などの生体高分子を封入するには、受動的溶媒捕捉によるものだけでなく、直接的な電荷間相互作用によるものも特に適している。 10kbを上回る遺伝子を送達することができないウイルス性ベクターとは異なり、本発明のナノ粒子送達系にはこのようなサイズの制限はない。1kbと10kbとの間、5kbと15kbとの間、または10kbと50kbとの間の核酸分子を用いることができる。一般に、考えられる標的の範囲は、例えば静脈内または動脈内、皮下、腹腔内、髄腔内などの注射経路に応じて決まる。全身注入の場合、この送達系の特異性は標的と血流を流れるナノ粒子との接触可能性（accessibility）によって影響され、この接触可能性は粒子のサイズの範囲によって影響される。粒子のサイズはコアセルベーション混合物の温度、成分の濃度およびpHによって影響される。例えばショ糖勾配超遠心処理などによって粒子をサイズ別に分画することもできる。サイズが3、2または1μm未満である粒子が望ましい。150nm未満の粒子は、大部分の血管壁の内面にある開窓部を通過して間質空間に到達しうる。このような状況下では、ターゲティングを行いうる細胞の範囲は広い。ターゲティングを行いうる細胞の一覧を簡略に示せば、肝シヌソイドの実質細胞、結合組織の線維芽細胞、膵ランゲルハンス島の細胞、心筋細胞、腸の主細胞および壁細胞、骨の骨細胞および軟骨細胞、ケラチノサイト、末梢神経系の神経細胞、腎および肺の上皮細胞などが含まれる。サイズが0.2ミクロンを上回る粒子の標的は主に血管の構成要素に限定されると考えられる。この場合には、標的となりうる細胞の種類には、赤血球、白血球（すなわち単球、マクロファージ、BおよびTリンパ球、好中球、ナチュラルキラー細胞、前駆細胞、マスト細胞、好酸球）、血小板および内皮細胞が含まれる。皮下注射の場合、標的となりうる細胞の種類には、結合組織中に存在するすべての細胞（例えば、線維芽細胞、マスト細胞など）、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイトおよび筋細胞が含まれる。髄腔内注射の場合、標的となりうる細胞の種類には、ニューロン、グリア細胞、アストロサイトおよび血液脳関門内皮細胞が含まれる。腹腔内注射の場合、標的となりうる細胞の種類には、マクロファージおよび好中球が含まれる。。現在、尿素回路障害に対して4-PBAは経口用錠剤として投与される。１日20gが処方される。本明細書で提供されるナノ粒子製剤を用いると、投与量を実質的に減らすことができる。望ましい投与量は単回または分割投与で1日当たり10から1 00μgである。しかし、1μgから20mgまでの範囲の投与量を用いることが可能である。ナノスフェア中にあるDNAは、0.1mgから50mgまでの範囲で投与することができる。局所投与またはターゲティングがなされたナノスフェアを用いる場合には、より少量のDNAも用いうる。全身投与を用いる場合には、より多い量が望ましいと考えられる。肺に投与する場合、特に嚢胞性線維症に対しては、エアロゾル投与が望ましい投与様式であると考えられる。任意の噴霧用装置を用いることができるが、定量吸入器が最も好都合である。腫瘍の治療には、例えば注射または移植により、ナノスフェアを直接投与することができる。または、静脈内、腹腔内、皮下または経口投与を用いることもできる。投与が全身性であれば、腫瘍または臓器に対するターゲティング用リガンドが望ましい。尿素回路障害の治療には、ナノスフェアを上記の通りに全身性に送達することも、または肝臓に対して直接送達することもできる。骨髄はエクスビボで治療することができ、治療した骨髄を患者の体内に再注入することができる。または、インビボでの骨髄の治療のためにナノスフェアを全身性に投与することもできる。本発明のナノスフェアの製剤化のための賦形剤は、当技術分野で知られた任意のものでよい。典型的には滅菌生理食塩水またはリンゲル液が用いられると考えられる。上記の開示は、本発明を一般的に説明したものである。以下の具体的な実施例を参照することによってより完全な理解を得ることができるが、これは例示を目的としたものに過ぎず、発明の範囲を制限するためのものではない。実施例1 4-PBA ナノスフェアの合成ゼラチン性ナノスフェアは、陽イオン性のゼラチンと陰イオン性のDNAとの電荷間相互作用によって溶液からの相分離が誘発された場合に形成される。この過程はいくつかの因子に依存する：ゼラチンおよびDNAの濃度、プラスミドのサイズおよび配列、温度、混合速度ならびに脱溶媒剤の濃度。4-PBAはナトリウム塩の形態にある荷電分子であるため、これはコアセルベーション過程に大きく関与し、その濃度はナノスフェアのサイズ分布、形態および凝集に影響を及ぼすと考えられる。ナノスフェアの物理的特性を損なわずに用いうると思われる4-PBAの最高濃度を決定するために、4-PBAの濃度が0.1から0.5％（w／v）の範囲でナノスフェアを合成した。0.1から0.4％までの4-PBAから合成されたナノスフェアの外観は小さく球状で、凝集は全く認められなかった。しかし、4-PBAの濃度が0.4％を上回るとナノスフェアは大きくなり始め、形状は幾分歪曲し、軽度の凝集が生じた。このことから、IB3細胞に対するトランスフェクション実験にはすべて0.4％ 4-PBAを用いて作製したナノスフェアを選択した。ナノスフェア 5％ゼラチン（pH5.5）および5mMクロロキンニリン酸の溶液100 μLを、20μgのプラスミドDNAおよび0.1〜0.5％（w／v）の4-フェニル酪酸ナトリウム（4-PBA）を含む溶液（100μL）とボルテックス処理によって混合する。非添加（plain）ナノスフェアは、4-PBAの代わりに4.5mM Na₂SO₄を用いることによって作製される。反応物を0.5mL微量遠心管に入れて20秒間混合する。3段階のシヨ糖勾配（30％、55％および88％）における50,000×gおよび25℃での超遠心処理を8分間行うことにより、ナノスフェアが非反応材料から精製される。次に最上層（反応混合物）を採取し、ナノスフェアをスクロース中に再懸濁する。ヒトホロトランスフェリン（0.25mg／mL、Sigma）および25mMの2-[N-モルホリノ] エタンスルホン酸（MES、pH4.5）をナノスフェア溶液に添加し、室温で5分間インンキュベートする。50μg／mLの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]-カルボジイミド塩酸塩（EDC、Pierce）を加えて、ナノスフェア／トランスフェリン溶液を室温で30分間架橋させる。30mM酢酸ナトリウム（pH5.5）を添加することによって反応を停止させる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に対する透析（300 ,000MWCO）を一晩行うことにより、溶液からスクロース、非結合型トランスフェリンおよび非封入型の4-PBAを除去する。溶液中の封入型DNAの濃度はヘキスト色素H 33258を用いて測定する。ナノスフェアを1.25％トリプシン中で2時間消化し、色素と反応させ、DyNA Quant 200蛍光光度計（Pharmacia）にて測定する。実施例2 4-PBA ナノスフェアによる内因性CFTRの発現誘導数々の研究により、4-PBAがΔF508発現細胞におけるCFTRの発現およびcAMP刺激によるCl^-輸送を誘導しうることが示されている。本発明者らは、ゼラチン性ナノスフェアがΔF508を発現するIB3細胞に対して制御された量の細胞内4-PBAを送達し、CFTRの発現および機能を誘導しうるとの仮説を検証した。5または10μg という2つの異なる投与量でDNAが封入された、4-PBAを含むナノスフェアをIB3細胞とともに4時間インキュベートした。薬物および遺伝子療法の効果を独立に検出するために、プラスミドcDNAに対して緑色蛍光蛋白質（GFP）レポーター遺伝子を用いた［6］。CFTR発現の誘導は抗CFTR抗体染色によって検出されたが、この場合、陽性染色はIB3細胞膜表面に青色が呈色されることが特徴となる。ナノスフェアの投与量を2倍にすることでCFTR発現細胞の比率および発現の全体的強度はいずれも増加するように思われた。さらに、遊離型4-PBAは3日全体にわたり細胞に曝露し、ナノスフェアは4時間の曝露に過ぎなかったにもかかわらず、ナノスフェアによるCFTR誘導は遊離型の4-PBAで処理された細胞よりも高度であった。ナノスフェアにおける4-PBAの負荷レベルは測定していないが、単純な思考実験により、CFTRの誘導がナノスフェア依存的であってナノスフェアの崩壊およびそれに続く4-PBAの培地への放出によるものではないことが示された。ほとんどの薬物のナノスフェア中の負荷レベルは極めて低く、通常は10％未満であることが判明した。クロロキンはDNAの重量に対して2％の負荷レベルでゼラチン性ナノスフェア中にあることが測定された。このため、本発明者らが4-PBAの負荷レベルが50％と極めて高いと仮定したとしても、培地中の濃度は9および18μMといった値に過ぎないと考えられ（それぞれDNAの投与量が5および10μgの場合）、これは遊離型の4-PBAで処理した細胞における濃度の50倍および100倍未満である。これらの結果は、ナノスフェアが高い局所的用量の4-PBAを細胞内に送達することができ、それによって薬物の生物学的利用能を高めうることを強く示すものである。組織培養ヒト気管支上皮細胞系CFBE IB3-1（IB3細胞）はΔF508／W1282Xという遺伝子型を有するが、ΔF508のみが発現される［7，8］。細胞を5％CO₂中および10％ウシ胎児血清を添加したLHC-8培地（Biofluids）中にて37℃で増殖させた。トランスフェクションの18時間前に、6穴培養皿または35mm培養皿中のカバーグラス上に1ウェル当たり細胞100,000個の密度でIB3細胞を播いた。PBSで1回洗った後に培地をトランスフェクション用培地（1％ウシ胎児血清を加えたMEM）と交換した。DNA投与量がこれらのナノスフェアを用いた遺伝子送達に関して用いられる典型的投与量である5または10μgとなるように、0.4％の4-PBAで作製したゼラチン性ナノスフェアをウェルに添加した。対照ウェルには処理を行わないか、1mMの遊離型4-PBAとともにインキュベートを行った。4時間後にトランスフェクション用培地を除去し、通常のIB3増殖培地と交換した。細胞を3日間増殖させた後にCFTR 発現に関してアッセイした。遊離型4-PBAで処理したウェルは、3日間の全体を通じて1mMの濃度（増殖培地中で）に対して曝露させた。 CFTR蛋白質に関する免疫組織化学染色 IB3細胞をPBSで2回洗い、10％ホルマリン中で10分間固定し、95％メタノール中で10分間の透過化処理を行った。細胞を1：500に希釈した抗体169とともに1時間インキュベートした。このウサギポリクローナル抗体は、CFTR蛋白質のアミノ酸残基724〜746にあるRドメイン内の配列と結合する［9］。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した二次抗体（ロバ抗ウサギ抗体の1：1000希釈物、Amersham）とともに細胞を1時間インキュベートした。結合したHRPによって標識された抗体を、濃い青／紫色の陽性染色をもたらすTrueBlue（登録商標）ペルオキシダーゼ基質（KPL）によって検出した。核はNuclear Fast Red（Digene Diagnostics）によって対比染色した。装着したカバーグラスを光学顕微鏡により観察し、写真を撮影した。デジタル化された画像にアドビフォトショップ（Adobe PhotoShop）（v.4.0）を用いてカラー強調を施した。画像はすべて同一の強調手順を用いて処理した。実施例3 4-PBA ナノスフェアによる塩化物イオン流出の誘導ナノスフェアによって送達された4-PBAはIB3細胞においてcAMP刺激によるCl^- 輸送を回復させる（図2A〜D）。5μgのDNA投与量となる4-PBAナノスフェアで処理した細胞では、cAMPアゴニストであるフォルスコリンの刺激によるCl^-流出に統計的に有意な増加が認められた。4-PBA以外のナノスフェアの何らかの成分がC FTR誘導の原因になるか否かを判定するために、非添加ナノスフェアを用いた。非添加ナノスフェアとともにインキュベートしたところ、フォルスコリン刺激および非刺激細胞の間に統計的有意差は認められず、このことは4-PBAのみが観測された効果の原因であることを示している。これらの結果において機能的CFTRの発現が示されたことは、ゼラチン性ナノスフェアが全体的な薬物投与量が比較的わずかでありながら高い局所的投与量の4-PBAを効率よく送達しうることを示している。塩化物イオン流出アッセイ細胞に非添加ナノスフェアまたはDNA投与量が35m m培養皿当たり5μgとなる4-PBAナノスフェアによるトランスフェクションを施した。トランスフェクション3日後の塩化物イオン流出を以前記載された通りに測定した［4，10］。各培養皿を3μCiの³⁶Cl^-を含み、重炭酸塩を含まないリンゲル平衡塩類溶液中にて37℃で2時間インキュベートした。ローディングの後に、細胞を1mLの氷冷リンゲル液で3回、温リンゲル液（37℃）で1回洗った。時間0の時点で、温リンゲル液1mLを添加して直ちに回収し、1mLの新鮮なリンゲル液によって置換した。この溶液を15秒後に回収し、1mLの新鮮なリンゲル液によって置換した。この過程を2・1/2分まで15秒毎に繰り返した。最後に、細胞内に残った³ ⁶ Cl^-をすべて放出させるために0.2N NaOHを添加した。各試料の放射活性は液体シンチレーション計数によって測定した。実施例4 遺伝子トランスフェクションに対する4-PBAの効果 4-PBAがナノスフェアの遺伝子送達能に影響を及ぼさないことを確かめるために、4-PBAを封入したゼラチン性ナノスフェアがIB3細胞をGFP cDNAによりトランスフェクトする能力を測定した。GFPの発現はフローサイトメトリーによって測定した。その結果、4-PBAを有するナノスフェアでは細胞の3.32％でGFP発現が認められたのに対して非添加（4-PBAを含まない）ナノスフェアでは4.07％であり、遺伝子送達が4-PBAの共封入（coencapsulation）による影響を受けないことが示された。しかし、CFTR誘導に関する陽性細胞の比率ははるかに高く（少なくとも50％）、このことから大部分の細胞が効率的にナノスフェアを取り込んだものの、導入されたcDNAを発現したものはわずかな比率に過ぎないことが示された。実施例5 4-PBA ナノスフェアを用いたインビボ遺伝子送達内因性ウサギCFTRDNAを増幅せずにpSA306 DNAを特異的に増幅することにより、ウサギ気道上皮に対するCFTR遺伝子の送達を判定した。これは、いかなる天然型のCFTR配列にも存在しないpSA306の融合ペプチド領域内にPCRプライマーの1つを選択することによって可能となった。ナノスフェアによる処理を受けたウサギは、生理食塩水対照で処理したウサギと比べ、pSA306 CFTR DNAの存在に関して強い陽性シグナルを示した。DNAは気道上皮細胞において高い比率で認められ、核に高度に局在しているように見えたが、これは送達されたあらゆる内因性遺伝子の発現における重要な段階である。DNAは気道の核に少なくとも28日間にわたり存続した。肺切片の組織学的評価では、気管支周囲および血管周囲の多形核浸潤ならびにリンパ周辺組織の過形成が注目された。CFTR DNA-ゼラチン性ナノスフェアによる処理を受けたウサギは生理食塩水の投与を受けた対照動物とは組織学的に区別不能であり、このことはこの非ウイルス性送達系の安全性を示している。 GFPレポーター遺伝子を用いて遺伝子の発現を評価した。FacScan分析により、 LUL（対照）の気道から擦過採取した細胞の蛍光をRLL（ナノスフェア処理）気道からの擦過細胞と比較した。GFPの発現は、LUL細胞（バックグラウンド蛍光）と対比して、RLLから擦過採取した気道細胞の43％で検出可能である。 4-PBAナノスフェアは、脱溶媒剤としてNa₂SO₄の代わりに0.4％（w／v）4-PBA を用いることによって首尾よく合成された。4-PBAがコアセルベーション過程に関与することは本薬物が共封入されたことを示すが、その負荷レベルにはまだ測定の余地がある。遺伝子および薬物導入の効果を独立に検討しうるように、CFTR 遺伝子の代わりにDd-UF5プラスミドを用いた。これらのナノスフェアによりIB3- 1細胞で認められたトランスフェクションのレベルは5〜10％であり、これは通常のDNA-ゼラチン性ナノスフェアで得られた発現と同等であった。したがって、4- PBAはcDNAの導入および発現とは干渉しない。IB3-1細胞における刺激性塩化物イオンコンダクタンスに対する封入された4-PBAの効果は図2A〜Dに示されている。 4-PBAナノスフェアは、cAMP刺激による塩化物イオンコンダクタンスを遊離型4-P BAで処理した細胞で得られるレベルと同程度に回復させる能力を有した（p値＜0 .05）。４-PBAを含まないナノスフェアでは刺激性塩化物イオンコンダクタンスが認められなかった（p＝0.16）。これらの結果は単一の担体による併用療法が実現可能であることを示すとともに、遺伝子療法または薬物療法のいずれかのみよりもCFにおける塩化物イオンコンダクタンス障害のより有効な治療戦略となることを示唆している。プラスミドインビボトランスフェクションの検出には2つの構築物を用いた。インサイチューDNA PCRおよび組織学的評価にはpSA306 CFTRプラスミドを用いた。これはAAV逆方向末端反復（ITR）と隣接する形でCFTRc DNA配列の全体をコードしており、アミノ末端に天然型CFTRには認められない26アミノ酸の融合ペプチドを含む（MLLIYVHTKNQHTLIDASELFIRPGT）［4］。インビボ遺伝子発現の評価には、RSVによって駆動され、AAV ITRと隣接したGFP構築物であるDd-UF5を用いた［６］。ナノスフェアの合成遺伝子導入のためのナノスフェア（100〜600nm）は、5 ％ブタゼラチン（pH5.5、5mMクロロキン二リン酸）およびDNA（200μg／mL CFTR cDNAを4.5mM Na₂SO₄溶液中に含む）を55℃でボルテックスミキサーによる高速振盪下での複雑コアセルベーションによって形成させた。薬物送達のためのナノスフェアは、Na₂SO₄の代わりに0.4％（w／v）4-PBAを、CFTR cDNAの代わりにGFP cDNAを用いた点を除き、同様にして合成した。ナノスフェアはショ糖勾配に対する超遠心処理によって精製した。ナノスフェアの表面に対するゼラチン架橋ならびにトランスフェリン（1mg／mL）結合は、EDC（0.1mg／mL）を室温で45分間用いることによって達成した。架橋したナノスフェアの溶液を0.4M塩化カルシウム中にて4℃で24時間インキュベートし、リンゲル平衡塩類溶液（pH7.4）中で24 時間の透析（300,000MWCO）を行うことにより精製した。ナノスフェアのインビボ送達 350μgのCFTR cDNAまたは100μgのGFP cDNAを含むほぼ1mgのナノスフェアを有する1mLの量を、ニュージーランドシロウサギの右下葉に小児用気管支鏡を用いて投与した。対照動物にはリンゲル緩衝液または 350μgの遊離型CFTR DNAのいずれかを投与した。ウサギはトランスフェクション後の第7、14および28日に屠殺した。CFTRで処理したウサギから得た肺組織をホルマリン固定し、5μm厚に切片化し、CFTR DNA検出のためのインサイチューPCR 増幅にかけた（Perkin Elmer）。PCR産物の検出にはジゴキシゲニンで標識したプローブを用いた。ナノスフェアに対する何らかの免疫反応の有無に関する組織切片の評価は、ジョンスホプキンス（Johns Hopkins）大学の臨床病理学者であるフレッド・アスキン（Fred Askin）が行った。GFPによる処理を受けたウサギの左上葉（LUL）および右下葉（RLL）から気管支上皮の擦過標本を採取した。これらの上皮細胞を2時間トリプシンで処理し、フローサイトメトリー（FacScan）により発現に関して測定した。塩化物イオン輸送のインビトロでの是正 IB3-1細胞（Δ508／ΔF508）を4-PB A／Dd-UF5ナノスフェアにより4時間処理し、新鮮な培地と交換して3日間増殖させた。細胞に³⁶Cl^-（2μCi）を2時間添加し、新鮮な緩衝液で洗浄した後にフォルスコリンで刺激した。さまざまな時点で培地中に放出された³⁶Cl^-を回収し、計測した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/30 Ａ６１Ｋ 47/30 47/36 47/36 47/42 47/42 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 11/00 11/00 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ルーベンシュタインロナルドアメリカ合衆国メリーランド州ボルティモアウェストモンゴメリーストリート 135 (72)発明者ツェットリンパメラアメリカ合衆国メリーランド州ボルティモアサウスロード 1808 (72)発明者レオンカムアメリカ合衆国メリーランド州エリコットシティーブレコンシャイアロード 10242

Claims

【特許請求の範囲】 1．4-フェニル酪酸ナトリウム（4-PBA）を含む、嚢胞性線維症を治療するための固形ナノスフェア。 2．ポリカチオンおよびポリアニオンのコアセルベーションによって形成される請求項1記載の固形ナノスフェア。 3．ポリカチオンが蛋白質である、請求項2記載の固形ナノスフェア。 4．ポリカチオンがゼラチンである、請求項3記載の固形ナノスフェア。 5．ポリカチオンが多糖類である、請求項2記載の固形ナノスフェア。 6．ポリカチオンがキトサンである、請求項5記載の固形ナノスフェア。 7．ポリアニオンが核酸である、請求項2記載の固形ナノスフェア。 8．DNAが野生型CFTR cDNAである、請求項7記載の固形ナノスフェア。 9．リガンドがナノスフェアと共有結合しており、該リガンドが細胞受容体と結合する、請求項1記載の固形ナノスフェア。 10．野生型CFTRをコードする核酸と、ΔF508変異型CFTR蛋白質を活性化する薬物とを含む、嚢胞性線維症を治療するための固形ナノスフェア。 11．薬物が4-PBAである、請求項10記載の固形ナノスフェア。 12．薬物がミルリノンである、請求項10記載の固形ナノスフェア。 13．薬物がゲニステインである、請求項10記載の固形ナノスフェア。 14．薬物が8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPX）である、請求項 10記載の固形ナノスフェア。 15．薬物が3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）である、請求項10記載の固形ナノスフェア。 16．以下のものを含む、遺伝子送達のための固形ナノスフェア： 4-フェニル酪酸ナトリウム（4-PBA）、および遺伝子コード配列と機能的に結合された、4-PBAで誘導可能であるプロモーターを含む核酸構築物。 17．プロモーターがアデノ随伴ウイルスプロモーターである、請求項16記載の固形ナノスフェア。 18．プロモーターがメタロチオネインプロモーターである、請求項16記載の固形ナノスフェア。 19．プロモーターがγ-グロビンプロモーターである、請求項16記載の固形ナノスフェア。 20．プロモーターがCFTRプロモーターである、請求項16記載の固形ナノスフェア。 21．4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有するエアロゾル化された医薬品を嚢胞性線維症の患者の肺に投与する段階を含む、嚢胞性線維症を治療するための方法。 22．4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品を腫瘍に投与する段階を含む、腫瘍を治療するための方法。 23．4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品を尿素回路障害の患者の肝臓に投与する段階を含む、尿素回路障害を治療するための方法。 24．4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品をβ-異常ヘモグロビン症の患者の骨髄に投与する段階を含む、β-異常ヘモグロビン症を治療するための方法。 25．β-異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球貧血症である、請求項24記載の方法。 26．β-異常ヘモグロビン症がβサラセミアである、請求項24記載の方法。 27．4-PBAを含む固形ナノスフェアを含有する医薬品をβ-異常ヘモグロビン症の患者に投与する段階を含む、β-異常ヘモグロビン症を治療するための方法。 28．β-異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球貧血症である、請求項27の方法。 29．β-異常ヘモグロビン症がβサラセミアである、請求項27記載の方法。