CN115869418B - 一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒、其制备方法和应用 - Google Patents
一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒、其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒、其制备方法和应用。本发明将具有抗血清蛋白黏附的两性离子型的多肽片段、特异性招募血清白蛋白的硬脂酸片段、以及具有肿瘤细胞特异性靶向能力的多肽片段同时修饰在金纳米颗粒表面制备得到一种主动靶向金纳米颗粒,用于提高对肿瘤组织和肿瘤细胞的特异性靶向能力。所述调控血清蛋白冠形成的多肽‑硬脂酸包括依次相连的连接段、支撑段、抗蛋白吸附段和白蛋白招募段;所述靶向多肽能够与肿瘤相关抗原CD36特异性结合。本发明的主动靶向金纳米颗粒为体内肿瘤靶向效率的提升提供了一种可行的方法和技术。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域,具体涉及一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒、其制备方法和应用。
背景技术
药物的靶向递送是目前生物医学领域最重要的研究课题之一。由于各种生物屏障的阻碍,传统的小分子药物在体内通常呈现非特异性分布特点,病灶部位的药物蓄积量相对较低。纳米载体可以通过被动靶向或者主动靶向策略提高药物分子在病灶部位的浓度,改善其在体内的空间和时间分布,有望实现高效低毒的治疗。截至2020年,共有50余种纳米药物已成功获得临床应用。
通过在纳米载药体系表面引入能与肿瘤细胞表面高表达受体特异性结合的配体如抗体、核酸适配体和多肽,可以增强纳米药物识别肿瘤细胞的能力。其中,多肽分子由于其具备突出的靶点亲和力、可多样化设计、免疫原性低等优点,具有作为药物载体和肿瘤细胞抗原的靶向配体等广泛应用前景。由于多肽分子的分子量较小,纳米载药体系表面可以修饰多个多肽配体分子,即使在靶蛋白密集、隐蔽的情况下也可以具有高亲和力和高特异性。除了作为靶向配体之外,多肽分子自身还可以作为药物,具有良好的疗效、安全性和耐受性。因此,将纳米材料与生物活性多肽结合制备得到多肽修饰的纳米颗粒可以协同发挥两者优势,克服了单种材料的应用局限性,是极具临床应用前景的策略。
然而,当纳米颗粒进入生物体系中后会和血清中各种蛋白质发生相互作用,其表面形成一层蛋白冠。不同种类的纳米颗粒表面蛋白冠组分差别很大,通常导致纳米颗粒原有的粒径、分散度及表面电荷发生变化,很大程度影响其原有生物活性和功能,最终决定了纳米颗粒在血液中的循环时间、体内免疫***对纳米颗粒的响应机制以及纳米颗粒最终代谢过程。现有技术表明,靶向多肽介导的纳米药物递送***表面形成的蛋白质冠会干扰靶向配体与其受体的结合能力,纳米颗粒的特异性靶向能力降低甚至丧失,可能导致其药效远低于预期。
在影响纳米颗粒表面蛋白冠形成,生物相容性和免疫清除效率的各种因素中,表面电荷和疏水性尤为重要。现有技术中使用了聚乙二醇(PEG) 来修饰纳米颗粒表面以减少其表面的蛋白质吸附,增加其体内循环时间。 PEG能够中和表面电荷,增加表面亲水性,并提供一定的空间位阻,为纳米粒子提供了一层保护层,减少各种非特异性蛋白质的吸附。然而,在一些研究中也发现,PEG涂层通过阻碍细胞与纳米颗粒的识别与结合,导致细胞对纳米颗粒的摄取量降低,不利于药效的发挥。由于调理素(如免疫球蛋白和补体蛋白等)在纳米颗粒表面的吸附会增强体内网状内皮***对其的识别和吞噬,导致纳米颗粒会被快速清除。因此,研究人员通过生物相容性好的多肽或蛋白质在纳米颗粒表面的修饰以减少调理素的吸附,提高其血液循环时间。血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白,在人体中的半衰期为19天。作为反调理素之一,纳米颗粒表面白蛋白冠的包被能够防止其它蛋白质的附着并提高纳米颗粒的生物稳定性,如结合型白蛋白紫杉醇纳米粒已被应用于临床并产生了比游离紫杉醇更优的抗肿瘤治疗效果。
基于此,我们聚焦于血清蛋白冠对多肽介导的纳米颗粒的特异性靶向能力的影响,通过金纳米颗粒与多肽-硬脂酸(EK-fat)、Pep2多肽的化学偶联,调控血清蛋白冠的组成,构建了能够在血清环境中仍然保持对肿瘤细胞特异性靶向能力的金纳米颗粒,并在荷瘤小鼠体内中表现出更高的肿瘤部位积累效率,为发展肿瘤靶向治疗策略提供了一种新的思路。
发明内容
因此,本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷,提供一种恢复由于血清蛋白冠形成而降低或丧失的主动靶向型纳米颗粒靶向性能的策略,以及基于该策略构建的金纳米颗粒的制备方法和应用。所述金纳米颗粒可实现多种功能,在特异性招募血清白蛋白并抵御其它血清蛋白黏附的同时,保持对肿瘤相关抗原CD36的特异性靶向能力,提高金纳米颗粒在体外或体内血清环境中对高表达CD36的肿瘤细胞或组织的靶向递送效率。
在阐述本发明内容之前,定义本文中所使用的术语如下:
术语“CD36”是指:肿瘤相关抗原CD36。
术语“EK序列”是指:SEQ ID NO:2所列出的氨基酸序列。
术语“Pep2”是指:SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列。
术语“Au-Pep2”是指:多肽SEQ ID NO:5修饰的金纳米颗粒。
术语“Au-Pep2-EK”是指:多肽SEQ ID NO:2和多肽SEQ ID NO:5共同修饰的金纳米颗粒。
术语“Au-Pep2-EK-fat”是指:多肽SEQ ID NO:1和多肽SEQ ID NO:5 共同修饰的金纳米颗粒。
术语“HepG2”是指:人源肝癌细胞系,同时也是高表达CD36的肿瘤细胞系。
术语“U937”是指:人源组织细胞淋巴瘤细胞,同时也是低表达CD36 的肿瘤细胞系。
术语“PBS缓冲液”是指:磷酸缓冲液。
术语“FBS”是指:胎牛血清。
术语“MS”是指:小鼠血清。
术语“Tris-Hcl缓冲液”是指:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
术语“w/v”是指:质量浓度。
术语“v/v”是指:体积比。
为实现上述目的,本发明的第一方面提供了一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒由多肽-硬脂酸和特异性靶向多肽与金纳米颗粒偶联形成;其中:
所述多肽-硬脂酸由两性离子型多肽和硬脂酸共价偶联形成;和/或
所述特异性靶向多肽为具有肿瘤细胞特异性靶向能力的多肽片段,且能特异性靶向肿瘤相关抗原CD36;
优选地,所述两性离子型多肽为抗血清蛋白黏附的两性离子型的多肽片段;和/或
优选地,所述硬脂酸为特异性招募血清白蛋白的脂肪链片段。
根据本发明第一方面的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其中,所述多肽-硬脂酸的序列包括连接段、支撑段、抗蛋白吸附段和血清白蛋白招募段;其中:
所述连接段的多肽序列包括半胱氨酸,优选为包括一个半胱氨酸C;
所述支撑段的多肽序列包括脯氨酸,优选为包括四个脯氨酸PPPP;
所述抗蛋白吸附段的多肽序列包括交错的谷氨酸E和赖氨酸K,优选为包括EKEKEK;和/或
所述血清白蛋白招募段的多肽序列包括长链脂肪酸,优选为包括硬脂酸fat;
优选地,所述多肽-硬脂酸的序列为SEQ ID NO:1。
根据本发明第一方面的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其中,所述特异性靶向多肽包括连接段、支撑段和靶向段;其中:
所述连接段的多肽序列包括半胱氨酸,优选为包括两个半胱氨酸CC;
所述支撑段的多肽序列包括脯氨酸,优选为包括四个脯氨酸PPPP;和 /或
所述靶向段的多肽序列为SEQ ID NO:3;
优选地,所述特异性靶向多肽的序列为SEQ ID NO:4;和/或标记所述特异性靶向多肽的荧光探针选自以下一种或多种:FITC探针、罗丹明b探针、Cy5.5探针,最优选为FITC探针;
更优选地,当标记所述特异性靶向多肽的荧光探针为FITC探针时,所述荧光探针标记的特异性靶向多肽的序列为SEQ ID NO:5。
根据本发明第一方面的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其中,所述金纳米颗粒的粒径为10~200nm,优选为10~50nm,进一步优选为30nm;和/或
所述金纳米颗粒的形状为球形。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒的方法,将所述多肽-硬脂酸偶联到所述金纳米颗粒表面,分离纯化,再将所述特异性靶向多肽偶联到金纳米颗粒表面,分离纯化,得到能够调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸修饰的主动靶向金纳米颗粒,即为所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒;
优选地,所述方法的具体步骤为:
(1)将多肽-硬脂酸、特异性靶向多肽和金纳米颗粒分别配置成多肽- 硬脂酸溶液、特异性靶向多肽溶液和金纳米颗粒胶体;
(2)将步骤(1)配置的多肽-硬脂酸溶液与金纳米颗粒胶体共混,涡旋至混合均匀,静置反应得到第一混合液;
(3)将步骤(2)反应完成后的第一混合液,离心去除上清液,再重悬,离心去除上清液,洗涤,得到多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒;
(4)将步骤(1)配置的特异性靶向多肽溶液与步骤(3)制备的多肽 -硬脂酸修饰的金纳米颗粒共混,涡旋至混合均匀,静置反应得到第二混合液;和
(5)将步骤(4)反应完成后的第二混合液,离心去除上清液,再重悬,离心去除上清液,洗涤,得到能够调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸修饰的主动靶向金纳米颗粒,即为所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒。
根据本发明第二方面的方法,其中,所述步骤(1)中:
所述多肽-硬脂酸溶液的溶剂选自以下一种或多种:超纯水、PBS缓冲液、Tris-Hcl缓冲液;
所述特异性靶向多肽溶液的溶剂为超纯水或PBS缓冲液;和/或
所述金纳米颗粒胶体的溶剂为超纯水;
优选地,所述多肽-硬脂酸溶液的浓度为1μM~10μM,更优选为1μM ~5μM,最优选为2μM;
所述特异性靶向多肽溶液的浓度为50μM~250μM,更优选为80 μM~150μM,最优选为100μM;和/或
所述金纳米颗粒胶体中金颗粒的金含量为0.005%~0.15%w/v,最优选为0.01%w/v。
根据本发明第二方面的方法,其中,所述步骤(2)中:
所述多肽-硬脂酸溶液与所述金纳米颗粒胶体的体积比为1:10~30,优选为1:15~25,更优选为1:19;
所述静置反应的时间为12~40h,优选为20~36h,最优选为24h;和/ 或
所述静置反应的温度为20~30℃,优选为22~27℃,最优选为25℃。
根据本发明第二方面的方法,其中,所述步骤(4)中:
所述特异性靶向多肽溶液与多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒的体积比为1:10~30,优选为1:15~25,更优选为1:19;
所述静置反应的时间为12~40h,优选为20~36h,最优选为24h;和/ 或
所述静置反应的温度为20~30℃,优选为22~27℃,最优选为25℃。
根据本发明第二方面的方法,其中,所述步骤(3)和所述步骤(5) 中:
所述离心的转速为10,000~20,000r/min,优选为12,000~15,000r/min,最优选为13,000r/min;
所述离心的时间为10~30min,优选为10~20min,最优选为15min;
所述离心的温度为20~30℃,优选为22~27℃,最优选为25℃;
所述重悬的溶剂选自以下一种或多种:超纯水、PBS缓冲液、Tris-Hcl 缓冲液,最优选为超纯水;和/或
所述洗涤的次数为1~5次,优选为1~3次,最优选为2次。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒或按照第二方面所述的方法制备的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒在制备用于***的药物中的应用;
优选地,所述肿瘤的相关抗原为表达或过量表达肿瘤标志物CD36。
本发明的多肽序列如SEQ ID NO.1-5所示:
SEQ ID NO:1:CPPPPEKEKEK-fat(由于多肽列表计算机可读载体无法识别-fat,SEQ ID NO.1以说明书此处记载的序列为准)。
SEQ ID NO:2:CPPPPEKEKEK。
SEQ ID NO:3:RRGTIAFDNWVDTGTRVYD。
SEQ ID NO:4:RRGTIAFDNWVDTGTRVYDPPPPCC。
SEQ ID NO:5:FITC-RRGTIAFDNWVDTGTRVYDPPPPCC(由于多肽列表计算机可读载体无法识别FITC-,SEQ ID NO:5以说明书此处记载的荧光探针FITC-标记的的序列为准)。
根据本发明的一个具体的实施例,本发明提供了一种能够调控血清蛋白冠形成的主动靶向金纳米颗粒,用于提高体内肿瘤靶向效率。能够调控血清蛋白冠形成的主动靶向金纳米颗粒由抗血清蛋白黏附的两性离子型的多肽片段、特异性招募血清白蛋白的硬脂酸片段、以及具有肿瘤细胞特异性靶向能力的多肽片段与金纳米颗粒偶联形成。
所述多肽-硬脂酸能够恢复纳米颗粒由于血清蛋白冠的形成而降低甚至丧失的靶向能力。其由连接段、支撑段、抗血清蛋白黏附段和白蛋白招募段依次相连构成。各个肽段之间相互配合,保障了多肽片段的生物活性以及稳定性。
其中,所述连接段的多肽序列包括半胱氨酸,半胱氨酸的侧基提供了硫醇基团与金纳米颗粒之间形成金硫键以偶联。
优选地,所述连接段为一个半胱氨酸,提供锚定于金颗粒表面的能力,同时还具有一定被其它硫醇基团取代的能力。
优选地,所述支撑段的多肽序列包括四个脯氨酸(PPPP)。其能够保多肽在修饰到金纳米颗粒表面时在垂直于表面而不是侧躺于表面。此外,还提供了一定柔性的转角以便于多肽链自由伸展以更好地发挥其生物学功能。
优选地,所述抗蛋白吸附段包括多个交错的谷氨酸(E)和赖氨酸(K)。含有正负电荷的两亲性离子型多肽交错相连,其整体保持电中性,其带电荷的侧基与水分子之间通过静电相互作用形成一层水化层从而抵御各类蛋白的吸附。
优选地,所述抗蛋白吸附段包括EKEKEK。
优选地,所述血清白蛋白招募段包括长链脂肪酸。利用白蛋白与脂肪酸的高亲和力结合位点,通过将多肽与长链脂肪酸相连接来招募血清白蛋白。
优选地,所述血清白蛋白招募段包括硬脂酸(fat)。
综合以上几点,本发明中所述抗血清蛋白干扰多肽的序列为SEQ ID NO:1。
另一方面,本发明中所述的特异性靶向多肽,由连接段、支撑段和靶向段依次相连构成。
其中,所述连接段的多肽序列包括半胱氨酸。
优选地,所述连接段为两个半胱氨酸(CC),两个半胱氨酸为多肽提供了更强的锚定于纳米金颗粒表面的能力,同时使其能够通过硫醇基的置换取代部分偶联到纳米金颗粒表面的SEQ ID NO:1多肽。该方法的优势在于,若将两种多肽同时与金纳米颗粒反应,则其通常会依据“相似相溶”原理在金纳米颗粒表面以不同的组装模式,形成不同的结构。具体组装结构与金纳米颗粒的尺寸,形貌以及多肽的长度,亲疏水性等性质有关,难以得到均匀分布的多肽修饰层。
优选地,所述支撑段的多肽序列包括四个脯氨酸(PPPP)。
优选地,所述靶向段包括RRGTIAFDNWVDTGTRVYD,该多肽序列与肿瘤标志物CD36具有特异性的高结合亲和力。
优选地,所述特异性靶向肽的序列为 RRGTIAFDNWVDTGTRVYDPPPPCC。
荧光探针标记的靶向序列为: FITC-RRGTIAFDNWVDTGTRVYDPPPPCC。
此外,本发明中所述金纳米颗粒的粒径为10~200nm,球形;优选为 10~50nm,球形;进一步优选为30nm,球形。
本发明还提供上述能够调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸修饰的主动靶向金纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
将多肽-硬脂酸偶联到金纳米颗粒表面,分离纯化,再将特异性靶向多肽偶联到金纳米颗粒表面,分离纯化,得到所述能够抵御血清蛋白冠干扰的主动靶向金纳米颗粒。
具体地,首先分别制备SEQ ID NO:1多肽溶液,SEQ ID NO:5多肽溶液和金纳米颗粒(稳定的胶体)。使用超纯水或磷酸缓冲液(PBS)将所述多肽配置成多肽溶液与金纳米颗粒(胶体)反应。所述SEQ ID NO:1多肽和SEQ ID NO:5多肽均可按现有常规技术人工合成,也可外购商品化产品,例如由安徽省国平药业有限公司合成的多肽或FITC标记的多肽,纯度为98%。所述金纳米颗粒可由现有常规技术(种子生长法)制备,也可外购商品化产品,例如由英国BBI公司,提供不同尺寸的金纳米颗粒。
本发明的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒可以具有但不限于以下有益效果:
1、本发明的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒可恢复由于血清蛋白冠的形成而丧失的纳米颗粒的靶向性能,在特异性招募血清白蛋白并抵御其它血清蛋白黏附的同时,保持对肿瘤相关抗原CD36的特异性靶向能力,提高金纳米颗粒在体外或体内血清环境中对高表达CD36的肿瘤细胞或组织的靶向递送效率。
2、相较于现有技术,本发明提供的金纳米颗粒同时修饰了调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸片段以及具有特异性靶向能力的多肽片段,在血清环境中依然保持对高表达CD36的细胞(HepG2)较高的亲和力(图4)。并在小鼠模型中增加了金纳米颗粒在肿瘤部位的积累效率(图5)。
3、相较于现有技术,本发明所述SEQ ID NO:5多肽与高表达CD36的细胞(HepG2)具有较高的亲和力,与低表达CD36的细胞(U937)具有较低的亲和力,说明其可以特异性靶向肿瘤相关抗原CD36(图1),但在血清环境中SEQ ID NO:5靶向CD36抗原的能力受到抑制(图2)。修饰有 SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒对高表达CD36的细胞HepG2具有优良的亲和力,但在血清环境中由于金颗粒表面蛋白冠的形成导致其亲和力大大降低(图3)。
4、利用所述策略构建的金纳米颗粒操作步骤简单,并可推广到不同的靶向多肽序列以及纳米颗粒。所述方法能够构建调控血清蛋白冠形成的多肽介导的主动靶向金纳米颗粒,为体内肿瘤靶向效率的提升提供了一种可行的方法和技术。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1示出了本发明实施例2中SEQ ID NO:5多肽与CD36阳性细胞系 HepG2以及CD36阴性细胞系U937的结合能力。
图2示出了本发明实施例3中在不同浓度胎牛血清中SEQ ID NO:5多肽与HepG2细胞的结合能力。
图3示出了本发明实施例4中修饰有SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒与CD36阳性细胞系HepG2分别在PBS以及10%(v/v)FBS环境中的结合能力。
图4示出了本发明实施例5中修饰了SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:5 多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在磷酸缓冲液,胎牛血清,小鼠血清环境中的结合能力。
图5示出了本发明实施例6中修饰了SEQ ID NO:1多肽以及SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒在小鼠皮下肿瘤模型中的蓄积效率。
图6示出了本发明的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚,在上下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下:
材料:
SEQ ID NO:5多肽,多肽-硬脂酸(SEQ ID NO:1),均购于安徽省国平药业有限公司。
金纳米颗粒,购于英国BBI公司。
试剂:
磷酸缓冲液(PBS),购自美国赛默飞世尔公司。
胎牛血清(FBS),购自美国赛默飞世尔公司。
小鼠血清(MS),购自亚科因(武汉)生物技术有限公司。
仪器:
流式细胞仪,购自美国BD公司,型号Accuri C6。
电感耦合等离子体质谱仪,购自美国PerkinElmer公司,型号NexION 300X。
离心机,购自美国赛默飞世尔公司,型号Scientific SorvallLegend Micro17R。
实施例1
本实施例用来说明本发明能够调控血清蛋白冠形成的主动靶向金纳米颗粒的制备方法。
(1)用超纯水配制浓度为2μM的SEQ ID NO:1多肽溶液。与浓度为 0.01%w/v的30nm金纳米颗粒以1:19的体积比共同混合均匀,涡旋,最终SEQ ID NO:1多肽反应浓度为0.1μM,于室温下静置24h。
(2)上述反应完成后,将混合溶液离心,去除上清。再加入超纯水重悬,离心,去除上清。总共洗涤两次。离心条件为13,000r/min,15min, 25℃。最后用等量超纯水重悬。
(3)用PBS配制浓度为100μM的SEQ ID NO:5多肽溶液,与上述修饰有SEQ ID NO:1多肽的金纳米颗粒以1:19的体积比共同混合均匀,涡旋,最终SEQ ID NO:5多肽反应浓度为5μM,于室温下静置24h。
(4)上述反应完成后,将混合溶液离心,去除上清。再加入超纯水重悬,离心,去除上清。总共洗涤两次。离心条件为13,000r/min,15min, 25℃。完成后用等量超纯水重悬,即得本发明所述能够调控血清蛋白冠形成的主动靶向金纳米颗粒。
实施例2
本实施例用来说明本发明的SEQ ID NO:5多肽与CD36阳性细胞系 HepG2以及CD36阴性细胞系U937的结合能力。
利用流式细胞术来检测SEQ ID NO:5多肽和不同肿瘤标志物CD36表达量细胞系的结合能力。
(1)收获对数生长期的细胞并分装进1.5mL离心管中,每管大约50 万个细胞,30μL。用PBS分别配制浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、 10、20、50、100、200μM的SEQ ID NO:5多肽溶液,分别加入30μL至收集了细胞的离心管,使得最终反应浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、 2.5、5、10、25、50、100μM。空白对照组不加多肽而是加入等量PBS缓冲液,用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀,在37℃下孵育1.5h。
(2)孵育完成后,将细胞加入1mL PBS缓冲液重悬,离心(1000r/min, 3min),弃去上清,再加入等量PBS缓冲液重悬细胞,离心,洗涤过程重复两遍以去除非特异性结合的多肽,最后用200μL的PBS缓冲液重悬细胞,得到测试样品。
图1示出了本发明实施例1的SEQ ID NO:5多肽与CD36阳性细胞系 HepG2以及CD36阴性细胞系U937的结合能力。如图1所示,高表达CD36 的细胞系HepG2与SEQ ID NO:5多肽的结合能力很强(Kd值约为2.1 μM),而低表达CD36的细胞系U937与SEQ ID NO:5多肽的结合能力相对弱很多(Kd值约为17.6μM)。说明SEQ ID NO:5多肽对CD36具有特异性的结合能力。
实施例3
本实施例用来说明不同浓度胎牛血清中SEQ ID NO:5多肽与HepG2细胞的结合力。
与实施例2相同,实施例2利用流式细胞术来检测SEQ ID NO:5多肽和HepG2细胞的结合能力。、
(1)收获对数生长期的细胞并用不同浓度(0.2%、0.5%、1%、2%、 5%、10%、20%、50%、100%)的胎牛血清重悬,分装进1.5mL离心管中,每管30μL,大约50万个细胞。配制浓度为10μM的SEQ ID NO:5多肽溶液,加入30μL至收集了细胞的离心管。其中,100%浓度胎牛血清的实验组的SEQ ID NO:5多肽需要用胎牛血清来配置,其余实验组的SEQ ID NO:5多肽溶液均使用PBS配制。用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀,在37℃下孵育1.5h。
(2)孵育完成后,将细胞加入1mL PBS缓冲液重悬,离心(1000r/min, 3min),弃去上清,然后再加入等量PBS缓冲液重悬细胞,离心,洗涤过程重复两遍以去除非特异性结合的多肽,最后用200μL的PBS缓冲液重悬细胞,得到测试样品。
图2示出了本发明实施例2在不同浓度胎牛血清中SEQ ID NO:5多肽与HepG2细胞的结合能力。如图2所示,10μM的SEQ ID NO:5多肽与 HepG2细胞的结合阳性率能够达到90%以上,但是胎牛血清的加入会抑制这种结合,使得阳性率降低,所加胎牛血清浓度越高,抑制效果越强。
实施例4
本实施例用来说明修饰有SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在PBS以及FBS环境中的结合力测定。
同实施例2和3,利用流式细胞术来检测修饰有SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在PBS以及FBS环境中的结合力。
(1)用PBS配制浓度为100μM的SEQ ID NO:5多肽溶液,与浓度为 0.01%的不同尺寸金纳米颗粒以1:19的体积比共同混合均匀,涡旋,最终 SEQ ID NO:5多肽反应浓度为5μM,于室温下静置24h。
(2)上述反应完成后,将混合溶液离心,去除上清。再加入超纯水重悬,离心,去除上清。总共洗涤两次。离心条件为13,000r/min,15min, 25℃。完成后用等量PBS重悬。
(3)收获对数生长期的细胞并用PBS以及20%胎牛血清重悬,分装进1.5mL离心管中,每管30μL,大约50万个细胞。将上述修饰有SEQ ID NO:5多肽的不同尺寸金纳米颗粒加入30uL至收集了细胞的离心管,使得实验组中最终胎牛血清的添加浓度为10%。用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀,在37℃下孵育1.5h。孵育完成后,将细胞加入1mL PBS缓冲液重悬,离心(1000r/min,3min),弃去上清,然后再加入等量PBS缓冲液重悬细胞,离心,洗涤过程重复两遍以去除非特异性结合的金颗粒,最后用200μL 的PBS缓冲液重悬细胞,得到测试样品。
图3示出了本发明实施例3中修饰有SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒与CD36阳性细胞系HepG2分别在PBS以及FBS环境中的结合能力。如图3所示,在添加了10% FBS后,所有组的阳性率都下降。说明血清蛋白冠的形成抑制了靶向金纳米颗粒与细胞的结合亲和力,降低了纳米颗粒的特异性靶向能力。其中,尺寸为30nm的金纳米颗粒与细胞的结合力最好。
实施例5
本实施例用来说明修饰了SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:1多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在磷酸缓冲液PBS、胎牛血清FBS和小鼠血清 MS环境中的结合能力。
同实施例2至4,利用流式细胞术来检测修饰了SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:1多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在PBS,FBS以及MS环境中的结合力。
(1)用超纯水分别配制浓度为1、2、5、10、15、20μM的SEQ ID NO:1 多肽溶液。与浓度为0.01%w/v的30nm金纳米颗粒以1:19的体积比共同混合均匀,涡旋,最终SEQ ID NO:1多肽反应浓度为0.05、0.1、0.25、 0.5、0.75、1μM,于室温下静置24h。
(2)上述反应完成后,将混合溶液离心,去除上清。再加入超纯水重悬,离心,去除上清。总共洗涤两次。离心条件为13,000r/min,15min, 25℃。最后用等量超纯水重悬。
(3)用PBS配制浓度为100μM的SEQ ID NO:5多肽溶液,与上述修饰有SEQ ID NO:1多肽的金纳米颗粒以1:19的体积比共同混合均匀,涡旋,最终SEQ ID NO:5多肽反应浓度为5μM,于室温下静置24h。
(4)上述反应完成后,将混合溶液离心,去除上清。再加入超纯水重悬,离心,去除上清。总共洗涤两次。离心条件为13,000r/min,15min, 25℃。完成后分别用等量PBS、FBS、MS重悬。
(5)收获对数生长期的细胞并分别用PBS、FBS、MS重悬,分装进 1.5mL离心管中,每管30μL,大约50万个细胞。将30μL上述修饰有SEQ ID NO:5多肽以及SEQ ID NO:1多肽的金纳米颗粒至收集了细胞的离心管。用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀,在37℃下孵育1.5h。孵育完成后,将细胞加入1mL PBS缓冲液重悬,离心(1000r/min,3min),弃去上清,然后再加入等量PBS缓冲液重悬细胞,离心,洗涤过程重复两遍以去除非特异性结合的金颗粒,最后用200μL的PBS缓冲液重悬细胞,得到测试样品。
图4示出了本发明实施例5中修饰了SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:1 多肽的金纳米颗粒与HepG2细胞分别在磷酸缓冲液PBS、胎牛血清FBS和小鼠血清MS环境中的结合能力。如图4所示,SEQ ID NO:1多肽的加入会使得在PBS环境中金纳米颗粒对细胞的结合阳性率略微下降,SEQ ID NO:1多肽浓度越高,下降越明显。但是在FBS以及MS环境中,SEQ ID NO:1多肽的加入提高了金纳米颗粒对细胞的结合,提高效果与SEQ ID NO:1多肽的浓度有关。综合考虑,SEQ ID NO:1多肽浓度为0.1μM,SEQ ID NO:5多肽浓度为5μM的实验组显示出对细胞最高的结合力。
实施例6
本实施例用来说明本发明修饰了SEQ ID NO:1多肽、SEQ ID NO:2多肽以及SEQ IDNO:5多肽的金纳米颗粒在小鼠皮下肿瘤模型中的蓄积效率。
利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)来检测修饰了SEQ ID NO:1多肽、SEQ IDNO:2多肽以及SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒在小鼠肿瘤中的积累效率。
(1)本发明使用实施例1制备的修饰了SEQ ID NO:1多肽以及SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒,,所制得样品用100μL PBS重悬,简称为:Au-Pep2-EK-fat。
(2)另一组实验组使用没有硬脂酸修饰的EK序列,即SEQ ID NO:2,样品制备方法同上,所制得样品简称为:Au-Pep2-EK。
(3)对照组则是只修饰了SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒,没有其余修饰,样品制备方法同实施例3。
(4)收获对数生长期的HepG2细胞重悬于PBS(5×106个/100μL) 并选取4~6周龄的雌性BALB/c裸鼠9只,在其左侧腋窝皮下接种100μL 细胞。在接种肿瘤细胞3周后,肿瘤体积增长至约100mm3时进行实验。将小鼠随机分为三组,分别尾静脉注射100μL Au-Pep2、Au-Pep2-EK、 Au-Pep2-EK-fat悬液,金的给药剂量为5.0mg/kg。在给药后24h的时间点处死小鼠。收集其肿瘤组织至10mL离心管,加入5mL王水,静置过夜以溶解肿瘤组织。
(5)待肿瘤组织完全溶解后,将离心管中的混合液体转移至小烧杯中,置于加热台上加热(230℃),蒸干王水。待王水蒸干后,再加入1mL王水继续蒸干,重复三次以上。从第二次加入王水开始,每次还加入1mL过氧化氢溶液。蒸干操作持续到烧杯中液体呈现无色澄清透明状。
(6)最后一次蒸干后,在小烧杯中加入5mL混酸(1%盐酸+1%硝酸)溶解,并将所得溶液通过0.2μm的滤膜过滤,即得ICP-MS样品。
(7)通过电感耦合等离子体质谱法(NexION 300X,美国PerkinElmer 公司)测定上述样品中金元素的含量。
图5示出了本发明实施例6中修饰了SEQ ID NO:1多肽、SEQ ID NO:2 多肽以及SEQID NO:5多肽的金纳米颗粒在小鼠皮下肿瘤模型中的蓄积效率。由图5所示,对照组小鼠的肿瘤组织中的金元素含量明显低于实验组。相比于对照组,修饰有SEQ ID NO:1多肽以及SEQ ID NO:5多肽的金纳米颗粒显示出最佳的肿瘤部位蓄积效率。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒、其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Pro Pro Pro Pro Glu Lys Glu Lys Glu Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Pro Pro Pro Pro Glu Lys Glu Lys Glu Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Arg Gly Thr Ile Ala Phe Asp Asn Trp Val Asp Thr Gly Thr Arg
1 5 10 15
Val Tyr Asp
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Arg Gly Thr Ile Ala Phe Asp Asn Trp Val Asp Thr Gly Thr Arg
1 5 10 15
Val Tyr Asp Pro Pro Pro Pro Cys Cys
20 25
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Ile Thr Cys Arg Arg Gly Thr Ile Ala Phe Asp Asn Trp Val Asp
1 5 10 15
Thr Gly Thr Arg Val Tyr Asp Pro Pro Pro Pro Cys Cys
20 25
Claims (25)
1.一种调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒由多肽-硬脂酸和特异性靶向多肽与金纳米颗粒偶联形成;其中:
所述多肽-硬脂酸由两性离子型多肽和硬脂酸共价偶联形成;并且其中,所述两性离子型多肽为抗血清蛋白黏附的两性离子型的多肽片段;所述硬脂酸为特异性招募血清白蛋白的脂肪酸片段;
所述多肽-硬脂酸的序列由连接段、支撑段、抗蛋白吸附段和血清白蛋白招募段组成;并且其中:所述连接段的多肽序列为一个半胱氨酸C;所述支撑段的多肽序列为四个脯氨酸PPPP;所述抗蛋白吸附段的多肽序列为EKEKEK;所述血清白蛋白招募段的多肽序列为硬脂酸fat;
所述特异性靶向多肽为具有肿瘤细胞特异性靶向能力的多肽片段,且能特异性靶向肿瘤相关抗原CD36;
所述特异性靶向多肽由连接段、支撑段和靶向段组成;并且其中:所述连接段的多肽序列为两个半胱氨酸CC;所述支撑段的多肽序列为四个脯氨酸PPPP;所述靶向段的多肽序列为SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,所述多肽-硬脂酸的序列为SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求1所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于:
所述特异性靶向多肽的序列为SEQ ID NO:4;和/或
标记所述特异性靶向多肽的荧光探针选自以下一种或多种:FITC探针、罗丹明b探针,Cy5.5探针。
4.根据权利要求3所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,标记所述特异性靶向多肽的荧光探针为FITC探针。
5.根据权利要求4所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,当标记所述特异性靶向多肽的荧光探针为FITC探针时,所述荧光探针标记的特异性靶向多肽的序列为SEQ ID NO:5。
6.根据权利要求1所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于:
所述金纳米颗粒的粒径为10~200nm;和/或
所述金纳米颗粒的形状为球形。
7.根据权利要求6所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为10~50nm。
8.根据权利要求7所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为30nm。
9.制备权利要求1至8中任一项所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒的方法,其特征在于:将所述多肽-硬脂酸偶联到所述金纳米颗粒表面,分离纯化,再将所述特异性靶向多肽偶联到金纳米颗粒表面,分离纯化,得到能够调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸修饰的主动靶向金纳米颗粒,即为所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述方法的具体步骤为:
(1)将多肽-硬脂酸、特异性靶向多肽和金纳米颗粒分别配置成多肽-硬脂酸溶液、特异性靶向多肽溶液和金纳米颗粒胶体;
(2)将步骤(1)配置的多肽-硬脂酸溶液与金纳米颗粒胶体共混,涡旋至混合均匀,静置反应得到第一混合液;
(3)将步骤(2)反应完成后的第一混合液,离心去除上清液,再重悬,离心去除上清液,洗涤,得到多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒;
(4)将步骤(1)配置的特异性靶向多肽溶液与步骤(3)制备的多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒共混,涡旋至混合均匀,静置反应得到第二混合液;和
(5)将步骤(4)反应完成后的第二混合液,离心去除上清液,再重悬,离心去除上清液,洗涤,得到能够调控血清蛋白冠形成的多肽-硬脂酸修饰的主动靶向金纳米颗粒,即为所述调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中:
所述多肽-硬脂酸溶液的溶剂选自以下一种或多种:超纯水、PBS缓冲液、Tris-Hcl缓冲液;
所述特异性靶向多肽溶液的溶剂为超纯水或PBS缓冲液;和/或
所述金纳米颗粒胶体的溶剂为超纯水。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中:
所述多肽-硬脂酸溶液的浓度为1μM~10μM;
所述特异性靶向多肽溶液的浓度为50μM~250μM;和/或
所述金纳米颗粒胶体中金颗粒的金含量为0.005%~0.15%w/v。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中:
所述多肽-硬脂酸溶液的浓度为1μM~5μM;
所述特异性靶向多肽溶液的浓度为80μM~150μM;和/或
所述金纳米颗粒胶体中金颗粒的金含量为0.01%w/v。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中:
所述多肽-硬脂酸溶液的浓度为2μM;和/或
所述特异性靶向多肽溶液的浓度为100μM。
15.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中:
所述多肽-硬脂酸溶液与所述金纳米颗粒胶体的体积比为1:10~30;
所述静置反应的时间为12~40h;和/或
所述静置反应的温度为20~30℃。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中:
所述多肽-硬脂酸溶液与所述金纳米颗粒胶体的体积比为1:15~25;
所述静置反应的时间为20~36h;和/或
所述静置反应的温度为22~27℃。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中:
所述多肽-硬脂酸溶液与所述金纳米颗粒胶体的体积比为1:19;
所述静置反应的时间为24h;和/或
所述静置反应的温度为25℃。
18.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中:
所述特异性靶向多肽溶液与多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒的体积比为1:10~30;
所述静置反应的时间为12~40h;和/或
所述静置反应的温度为20~30℃。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中:
所述特异性靶向多肽溶液与多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒的体积比为1:15~25;
所述静置反应的时间为20~36h;和/或
所述静置反应的温度为22~27℃。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中:
所述特异性靶向多肽溶液与多肽-硬脂酸修饰的金纳米颗粒的体积比为为1:19;
所述静置反应的时间为24h;和/或
所述静置反应的温度为25℃。
21.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)和所述步骤(5)中:
所述离心的转速为10,000~20,000r/min;
所述离心的时间为10~30min;
所述离心的温度为20~30℃;
所述重悬的溶剂选自以下一种或多种:超纯水、PBS缓冲液、Tris-Hcl缓冲液;和/或
所述洗涤的次数为1~5次。
22.根据权利要求21所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)和所述步骤(5)中:
所述离心的转速为12,000~15,000r/min;
所述离心的时间为10~20min;
所述离心的温度为22~27℃;
所述重悬的溶剂为超纯水;和/或
所述洗涤的次数为1~3次。
23.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)和所述步骤(5)中:
所述离心的转速为13,000r/min;
所述离心的时间为15min;
所述离心的温度为25℃;和/或
所述洗涤的次数为2次。
24.权利要求1至8中任一项所述的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒或按照权利要求9至23中任一项所述的方法制备的调控血清蛋白冠形成的金纳米颗粒在制备用于***的药物中的应用。
25.根据权利要求24所述的应用,其特征在于,所述肿瘤的相关抗原为表达或过量表达肿瘤标志物CD36。
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