JP2002504354A

JP2002504354A - 癌の治療法

Info

Publication number: JP2002504354A
Application number: JP2000532728A
Authority: JP
Inventors: ヒルマーミークワレニウス; ローレンスアンソニーシーブラ
Original assignee: セライトリミテッド
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2002-02-12
Also published as: DE69907156T2; JP2002504687A; EP1057031A1; CA2321458A1; JP2002504688A; DE69907156D1; WO1999042828A2; JP2002503822A; DE69907152D1; WO1999042821A2; AU749180B2; CA2321438A1; EP1057030B1; US6878526B1; US6521407B1; JP2002504496A; WO1999042090A2; ATE238554T1; DE69907153D1; AU2538099A

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞の放射線感受性を測定する方法およびキットを提供する。【解決手段】細胞またはその抽出液を含有する試料中の(a)p21の発現濃度、またはp21蛋白質の量、および(b)Raf-1の発現濃度、またはRaf-1蛋白質の量を試験する工程を包含する測定方法である。また、（i）Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質の量を調べる手段、および、（ii）p21の発現濃度またはp21蛋白質の量を調べる手段を包含するキットである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、患者が放射線療法に応答するか否かを予測する為に、癌細胞の放射
線感受性を測定する方法に関するものである。更に本発明は、放射線感受性の測
定に有用な抗体を作成する方法、および放射線感受性を測定するキットに関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】

今世紀後半、放射線療法は多くの癌患者の治療に用いられてきたが、治療に対
する応答が殆ど無いか、治療初期のみ応答し、後に再発するといった多くの腫瘍
がなお残存している。放射線療法に対する癌の反応の根拠となるメカニズムを充
分理解することは、どの患者が放射線療法による利益を最も被るのかを予測する
ことが可能になり、更には、放射線療法を用いたヒトの癌治療を改善するメカニ
ズムを選択的に調節するという可能性も包含するものである。

【０００３】内因性放射線感受性の分子レベルでの基礎は長年の間研究されている。研究の
大部分は、DNA二重鎖の切断（dsbs）発生率に反映されるDNA損傷度およびその後
の修復（Kelland等，1988；Schwartz等、1991）、dsbsの細胞内再結合後、DNA中
に残存する損傷（Nunez等、1995；Whitaker等、1995）、およびDNA修復の正確さ
（Powell＆McMillan，1994）に絞られている。しかしながら、DNA損傷に加え、特定の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子は発癌に関与するのみならず、電離放射線
に対する悪性腫瘍細胞の感受性にも影響を及ぼすことが益々明らかになってきた
。

【０００４】この様に癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子は、治療剤に対する悪性腫瘍細胞の感
受性に関与するという証拠が増えるにつれ、放射線療法および／または細胞毒性
化学療法の様に現在有用な治療法に対するヒト癌の治療応答を検討し、予測する
為に、上記遺伝子及び他の遺伝子を用いようとする試みがなされている。しかし
ながら、現在までの研究は通常、治療応答を予測する方法として、単一腫瘍関連
遺伝子の発現を検査することのみが行われていた。選択された遺伝子の発現と内
因性放射線感受性との関係を調べる際、試験の為に選択された遺伝子以外の他の
候補遺伝子も実験結果に影響するのかどうかについては、必ずしも考慮されてい
なかった。

【０００５】各遺伝子の役割に関しては、多くの細胞周期遺伝子およびシグナル導入遺伝子
に着目し、研究されてきた。mycまたはrasの様な優性癌遺伝子を正常細胞系にト
ランスフェクションすると（McKenna等、1991）、dsb誘導率が検出可能な程度変
化しない場合であっても、放射線耐性は増加することが報告されている（Iliaki
s等、1990）。c-fms、v-sis、v-erb-B、v-abl、v-src、v-cot（Fitzgerald等、1
990、Suzuki等、1992、Shimm等、1992）およびc-Raf（Kasid等、1989、Pirollo 等、1989）を含有する幾つかの他の癌遺伝子も、哺乳類細胞における細胞の放射
線感受性を調節することが報告されている。これらの所見が潜在的に臨床的放射
線療法と関連することは、高濃度のRaf-1（c-Raf-1癌原遺伝子の正常蛋白質産物
）がヒトin vitro細胞系における内因性放射線感受性に関連しているという観察
結果によって裏付けられている（Warenius等、1994）。しかしながら、これらの
結果だけで、臨床検査における放射線療法に対する腫瘍の感受性を測定すること
は不充分である。

【０００６】別の研究結果によれば、p53腫瘍抑制遺伝子の突然変異と細胞放射線耐性の増加との間には正の相関関係があることが、げっ歯類の腫瘍細胞およびヒトの腫瘍
細胞において（Fan等、1994、Radford 1994、Zhen等、1995、Xia等、1995、Lee およびBernstein，1993）、並びに突然変異p53（mp53）遺伝子をトランスフェク
トした正常細胞において（Pardo等、1994、Bristow等、1994、Kawashima等、199
5）認められている。パブリックドメインの研究によれば、乳癌、肺癌、卵巣癌の様な通常の癌の約50％に認められるp53腫瘍抑制遺伝子の突然変異が、細胞毒性剤または放射線照射に対する耐性に関与していることが示唆されている。しか
しながら、多くの研究がなされているにもかかわらず、現時点では、p53遺伝子のみの突然変異を検出することにより、患者の癌が、放射線療法に応答し易いか
どうかを、許容し得る程度の確実性で予測する為に用いることができる様な良好
な臨床試験法は未だ提供されていない。腫瘍の応答とp53の状態とを比較する臨床病理学的研究の結果には大きな相違が見られる為、現時点では、p53突然変異またはp53蛋白質の過剰発現のみによって、ヒトの癌が放射線療法に応答し易いかどうかを予測するには不充分であるという結論に達している。

【０００７】癌遺伝子および癌抑制遺伝子は、細胞周期のチェックポイントにおいて放射線
誘導ブロックを介して照射された細胞の進行に影響を及ぼすことによって内因性
放射線感受性を調節することが多くの報告で示唆されている。電離放射線を照射
した後、p53により媒介されるG1/Sの遅延は、相対的放射線感受性と相関する細胞周期撹乱の重要な尺度として提案されている（Kastan等、1991、McIlwrath等、1994；Siles等（1996）。また、mycおよびras（McKenna等、1991）の様な優性
癌遺伝子、またはSV40（Su＆Little、1993）の発現が、放射線耐性および照射後
に同時に起こるG2/Mチェックポイント遅延の増加の双方を誘発することが知られ
ている。更に、正常なc-Raf-1癌原遺伝子の蛋白質産物は、19ヒトin vitro 細胞
系において放射線感受性に関連することが知られている（Warenius等、1994）。
近年、上記19細胞系のうちの6細胞系において、以前に観察されたRaf-1/放射線感受性の関連性は極めて強く、G2/Mの細胞周期チェックポイントで放射線誘発ブ
ロックから如何に迅速に細胞が離脱できるかに関係していることが明らかになっ
た。正常Raf-1蛋白質の発現が増加する放射線感受性ヒト癌細胞は、Raf-1の発現
が低い放射線耐性細胞よりも迅速に、2Gy照射によって誘発されるG2/Mブロックから離脱する（Warenius等、1996）。正常なc-Raf癌原遺伝子のRaf-1蛋白質産物
が多く発現することは放射線感受性に関連している。しかしながら、Raf-1と放射線感受性との関係はそれ自体、臨床上有用な予測試験の根拠となる程、強いも
のではない。同様のことは、単一遺伝子の作用を治療の成功と相関させる他の試
みにも当てはまる。

【０００８】残念なことに、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が相互作用して、ヒト癌細胞の
放射線感受性表現型に影響を及ぼすかどうか、或いはどの様にして相互作用する
のかどうかについては、殆ど知られていない。しかしながら、REF（ラット胚腺維芽細胞）の様な他の哺乳類細胞を用いたトランスフェクション実験によれば、
単一優性癌遺伝子のみを発現する細胞よりも、優性＋協同作用性の癌遺伝子を発
現する細胞の方が、放射線耐性が一層増加することが分かった（McKenna等、199
0、Su＆Little 1992、Pirollo等、1993）。同様に、多重組込み突然変異p53−pr
o193対立遺伝子でトランスフェクションすることによりREF細胞に誘導された放射線耐性は、突然変異p53遺伝子をH‐rasで同時にトランスフェクトした場合に比べ、遥かに大きかった（Bristow等，1994）。

【０００９】極く最近（Warenius等、1994,1996）では、野生型p53に関してRaf-1蛋白質を測定することにより、放射線感受性の予測試験の根拠となる可能性のある相関関
係が得られることが分かった。この関連性は、定量的ウエスタンブロットにより
Raf-1蛋白質を測定することにより明らかになった。しかしながら、ウエスタンブロットは高価であり、時間も労力もかかる。更に、多数の細胞が必要である。
従って、この様な特定条件は、ルーチンの臨床試験として現実的でない。臨床検
査では、ウエスタンブロットで用いられている様に100万個以上の細胞ホモジネートを測定するのではなく、個々の細胞蛋白質濃度を測定できる方が好ましい。
腫瘍細胞中のRaf蛋白質の発現を正常細胞中のRaf蛋白質の発現と判別できること
も重要である。これには、フローサイトメトリー試験において異数状態ではなく
倍数状態に基づいて細胞を選別する能力、または、組織学的基準により結合組織
、血管浸潤性白血球または壊死領域から腫瘍領域を識別できる様な組織切片上で
、組織学的に観察できる個々の細胞中のRaf蛋白質を測定する能力が必要とされる。

【００１０】残念なことに、ウエスタンブロットで試験した場合、現在使用できるRafに対する抗体は全て、48kD分子上の関連しないエピトープと交差反応する（図１を参
照）。Raf-1は72〜74kDの分子であり、ウエスタンブロットで識別でき、別途、測定することができる。しかしながら、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化
学の様なRaf-1細胞試験法では、関連しない48kD分子と適切な72〜74kD分子とを識別することができない。ウエスタンブロットでは、48kD蛋白質は72kD蛋白質よ
りも遥かに多く検出される為、48kD蛋白質は72kDのRaf癌原遺伝子の断片ではないと考えられる。

【００１１】この様に上記技術水準に基づいたとしても、現時点では、ヒト癌細胞における
癌遺伝子、癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の突然変異状態または蛋白質産物の
発現量を測定することが、薬剤および／または放射線治療に臨床的腫瘍が応答す
るかどうかについて、信頼性の高い臨床試験の根拠を提供する指標は未だ提供さ
れていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は、上記問題点を解決し、癌細胞が放射線療法に応答するか否か
を予測する為の臨床試験法として使用可能な試験法を提供することにある。また
、本発明の目的は、より安価な診断試験を実施し得るRaf-1蛋白質に特異的な抗体を提供することにある。更に本発明の目的は、上記抗体を用い、２種以上の腫
瘍関連遺伝子の特性を同時に測定することによって、癌細胞が放射線療法に応答
するか否かを予測する方法を提供することにある。

【００１３】

【発明の構成】

従って、本発明は細胞の放射線感受性を測定する方法を提供するものであり、
該方法は、細胞またはその抽出液を含有する試料中、（a）p21の発現濃度またはp21蛋白質の量；および、（b）Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質の量を調べる工程を包含するものである。

【００１４】上記工程（ａ）および（b）を実施する順序は特に限定されない。即ち、工程（ａ）の後に工程（b）を行っても良いし、或いは工程（b）の後に工程（a）を行っても良い。

【００１５】本発明はまた、Raf-1蛋白質に特異的な抗体であって、且つ、Raf-1蛋白質を含
有する細胞中に共存する48ｋD蛋白質と交差反応しない抗体を作成する方法に関するものである。上記方法は、48ｋD蛋白質上に存在しないRaf-1蛋白質のエピト
ープを含有するかその一部を成すペプチドを形成する工程、および該ペプチドに
対する抗体を調製する工程を包含するものである。本発明は更に、Raf-1蛋白質に特異的な抗体であって、且つ、Raf-1蛋白質を含有する細胞中に共存する48ｋD
蛋白質と交差反応しない抗体を作成する方法に関するものである。上記方法は更
に、Raf-1蛋白質および48ｋD蛋白質に特異的な抗体で動物を免疫し、やはり48ｋ
D蛋白質上に存在するRaf-1蛋白質の潜在的エピトープ部位をマスクする工程、お
よびマスクされたRaf-1蛋白質に対する抗体を得る工程を包含するものである。

【００１６】更に本発明、細胞の放射線感受性を測定するキットを提供するものであり、該
キットは、（i）Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質の量を調べる手段；および、（ii）p21の発現濃度またはp21蛋白質の量を調べる手段を包含する。

【００１７】特に本発明は、p21蛋白質濃度が（例えばウエスタンブロットによって）確認されている細胞において、C‐Raf-1プロト癌遺伝子のRaf-1蛋白質産物の濃度を測定し、これにより、腫瘍の放射線感受性を判断して、放射線療法が患者にとっ
て適切な治療法であるかどうかを決定することに関するものである。p21蛋白質濃度が上昇した（すなわち、p21発現量が上昇した）細胞系では、Raf-1発現濃度
が高い程、電離放射線に対する腫瘍の感受性は高くなる。

【００１８】 Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質濃度の上昇は、例えば前述したウエスタン
ブロットの様な方法のうち任意の適切な方法で測定することができる。正常値を
超え、有用な放射線感受性を示すに充分な水準まで蛋白質濃度または発現が上昇
していると考えられる点は、ヒト細胞系におけるRaf-1の通常濃度に関する文献の教示内容に基づけば、当業者には明らかである（European Journal of Cancer
, B Oral Oncology, 1995, Nov.,31B(6), 384-391参照）。この点は、特定の癌細胞および対象患者に応じて、本発明の方法を実施する者の判断により決定され
る。

【００１９】 p21の発現またはp21蛋白質の濃度は、適切な方法によって測定することができ
る。特にp21はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり、これは、ウエスタンブロット、免疫細胞化学法、またはより新しい開発技術、例えば、p21mRNAの相対量を測定する等の方法によって検出することができる。p21発現が有効に上昇しないか、またはp21蛋白質濃度が有効に上昇しないと考えられる点は、ヒト細胞系におけるp21蛋白質の通常濃度に関する文献の記載に基づき、当業者ならば容易に知ることができる（Oncogene、1995、11巻、2021-2028；Oncogene、1996、1
2巻（6）、1319‐13243）。

【００２０】添付図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明するが、これは例示に過ぎな
い。

【００２１】放射線感受性、細胞周期の進行と、Raf-1およびp21の機能との間に観察されて
いる関連性を説明するメカニズムは未だ不明であるが、検出可能な（好ましくは
上昇した）p21濃度を示すヒト癌細胞において、Raf-1と放射線感受性との間に密
接な関連性があるということは、臨床放射線感受性に関する2重パラメーターRaf
-1/p21試験の開発を可能にするものである。

【００２２】臨床試験では、患者の腫瘍由来生検材料において、Raf-1発現濃度の測定と組合せて、p21の発現濃度またはp21蛋白質の濃度を測定することが必要である。

【００２３】 Raf-1発現濃度の測定は、Raf-1蛋白質の量を測定することによって行う。Raf-
1蛋白質濃度は、免疫細胞化学法またはフローサイトメトリー（FCM）によって測
定することができる。従来、後者の方法では、既存の抗体が非Raf-1蛋白質と交差反応するという問題があった。現時点では、ウエスタンブロット上で極めて大
量に存在するが非関連性の48kD蛋白質とも交差反応しないRaf-1に対する抗体を入手することはできない。免疫細胞化学法またはFCMの様な方法では、非特異的結果を与えるのみである。これには、非関連性の48kD種からRaf-1（72〜74kD蛋白質）を分離する為に、ウエスタンブロットにおいて電気泳動の様なある種の分
子分離法が必要である。ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーの様なカ
ラムクロマトグラフィー法が適切である。高速液体クロマトグラフィーまたはキ
ャピラリー電気泳動法も、分離方法として有用である。これらは全て、その後に
免疫検定法を行っても良い。Raf-1蛋白質に対するRNAアプタマーの開発を含め、
別の特異的認識手段を採用することも考えられる。しかしながら、これらの方法
は全て、時間がかかり高価であり、臨床試験としては不適切である。Raf-1に特異的な抗体が使用できれば、分離を必要としない診断試験の実施が可能である。

【００２４】本発明に用いられる抗体を製造する第1の方法では、DNAおよび蛋白質の遺伝子
配列を決定できる様、48kD交差反応エピトープの単離及び同定が必要である。こ
の情報を用いて、48kD蛋白質の配列を全長Rafプロト癌遺伝子蛋白質配列と比較することにより、48kD蛋白質を共有しない全長プロト癌遺伝子蛋白質上のエピト
ープを選択することができる。これは、NCTC2544の様な高濃度のRaf-1および48k
D蛋白質を有する細胞系を用いることにより達成できる（図１を参照）。大量の細胞溶解物を調製し、48kD蛋白質を精製する。上記精製は、免疫沈降法、または
、発明者等により調整されたモノクローナル抗体を用いるか若しくは市販の抗Ra
f-1抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができるが、これらは共に、72〜74kDおよび48kDの蛋白質の双方に強く結合することがウェ
スタンブロットによって判明しているものである。モノクローナル抗体産生細胞
は、Balb/Cマウスの腹水中に、アフィニティークロマトグラフィー用に高収率で
増殖させた。この腹水より得られた抗体を、アフィニティーカラム調製用に用い
る臭化シアンセファクリルおよび抗体セファクリルと反応させた。NTCT細胞の細
胞溶解物をアフィニティーカラムに載せ、非特異的物質を洗浄して除去した後、
同じエピトープを共有し、カラム上の抗体に結合した48kDおよび72〜74kDの分子
を低pHで溶出した。次に、免疫沈降物またはアフィニティークロマトグラフィー
カラムの溶出液を濃縮した後、蛋白質の推定を行い、ウエル当たり150μgを、分
子マーカーと共に10〜20の隣接するウエル上で、10％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。次に48kDのバンドを切出し、可能な限り長いアミノ酸配列
をN末端から（またはC末端から）決定した。ペプチド配列を用いて、遺伝子配列
がN-（またはC-）末端において蛋白質配列と合致する（特定のアミノ酸をコード
する際、縮重も認められる）プライマーを調製した。一連のPCRは、48kDの長さのDNAが得られるまで反復した。次に、これを配列決定した。48kDと72〜74kDの全長Raf-1プロト癌遺伝子との間の配列を比較することにより、48kD蛋白質上には存在しない72〜74kDのRafプロト癌遺伝子蛋白質の潜在的エピトープから合成ペプチドを合理的に設計することが可能となった。独特の合成ペプチドを用いる
ことにより、Raf-1蛋白質には反応するが48kD蛋白質には反応しないポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製することができる。これらの抗体は、
フロー若しくは共焦点顕微鏡のサイトメトリー、および／または免疫蛍光法若し
くは免疫細胞化学法において有用である。

【００２５】本発明に用いられる抗体を製造する第2の方法では48kD蛋白質に対する抗体に加えて、Raf蛋白質で動物を免疫することが必要である。例えば、72〜74kD全長のRaf-1蛋白質（細菌中の発現ベクター内のDNA配列より製造される）を、従来よ
り入手可能な抗Raf-1抗体（48kD蛋白質と交差反応する）と共に予備加温し、得られた免疫複合体を遠心分離で分離した後、動物（例えばマウス）に注射するか
、或いは、抗Raf-1（抗48kD蛋白質）抗体および全長72〜74kDのRaf-1蛋白質を別
々に同じ動物に注射する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、免
疫原として全長72〜74kDのRafプロト癌遺伝子蛋白質を用いて調製した。上記蛋白質は、発現ベクター内の組換えRaf-1によって調製した。48kD蛋白質に対する抗体は、市販の抗体を用いた。その機能は、48kD蛋白質と交差反応するRaf蛋白質上の潜在的エピトープ部位を把握することにある。この様にしてマスクされた
Raf蛋白質免疫原は、48kD蛋白質に比べ、全長72〜74kDのRafプロト癌遺伝子蛋白
質を認識する抗体の産生をより選択的に促進することができる。

【００２６】オリゴヌクレオチドアレー mRNA濃度の測定は多くの方法で行うことができる。逆転写を用いてポリ‐A担持mRNAをcDNAに容易に変換することができ、この方法は本発明を説明する実施例
の中でも記載する。逆転写酵素PCR（RTPCR）法では単一RNAの量を測定することはできるが、精度は比較的低い。オリゴヌクレオチドアレーは比較的新しい核酸
分析方法であり、突然変異分析、ハイブリダイゼーションによる配列決定および
mRNA発現の分析が可能である。この様なアレーの構築方法（例えばA.C.Pease等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91, 5022‐5026, 1994；U.MaskosおよびE.M.Souther
n、Nucleic Acids Research 21, 2269‐2270,1993；E.M.Southern等、Nucleic A
cids Research 22, 1368‐1373,1994）が開発されており、更に別の方法も検討されている。mRNAの発現濃度を測定し、この様なRNAの突然変異を検出するアレーは現在開発中であり、これらは本発明で提案する診断試験の好適な実施態様を
提供するものである。

【００２７】免疫細胞化学本発明の別の実施態様では、共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察を用いた免疫細胞
化学によってサイクリンD1蛋白質濃度を測定することができる。好ましくは、PC
T／US91／09217、PCT／NL／00081およびPCT／US95／01886に記載された走査シス
テムが用いられる。更に顕微鏡システムでは、複数の蛍光染料を分析できること
が望ましい。実施態様として好ましいのは、p21に対する抗体を1番目の染料で標
識し、Raf-1に対する抗体を2番目の染料で標識し、そして3番目のDNA結合染料を
用いて異数性細胞を選択する方法である。ATが豊富なDNAに結合するHoechst3325
8染料、またはGCが豊富なDNAに結合するクロモマイシンA₃の様なDNA結合染料が適切である。診断試験は下記工程を包含する。

【００２８】・患者から腫瘍の生検材料を取出す。・必要に応じて上記材料を微細切断し、腫瘍部から正常組織を分離する。・下記工程に従って顕微鏡検査用の生検材料を調製する。・Raf-1に対する上記蛍光標識抗体プローブで生検材料を標識する。必要に応じて生検材料は、p21に対する抗体プローブ、およびDNA結合染料で標識する。・標識された細胞を非結合の標識プローブから分離する。・走査共焦点顕微鏡に標識された生検材料を載せ、下記細胞を計数する。・Raf-1を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、Raf-1に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・必要に応じてp21を発現する、即ち、p21に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。或いは上記した通り、p21の発現はmRNAまたはゲノムDNA の分析によって測定される。・必要に応じて、DNA結合蛍光染料からの蛍光強度により検出される染色体増幅を示す。

【００２９】蛍光活性化細胞分類診断試験の別の実施態様は、蛍光活性化細胞分類（FACS）を利用したものであ
る。FACS機器は、蛍光マーカーで標識される細胞に依存した様式で懸濁液中の細
胞を分離する。典型的なFACS装置を以下に記載する。単一のファイル内を移動す
る懸濁液中の細胞は振動ノズルを通過すると、単細胞を含有するか、若しくは全
く含有しない液滴を形成する。この液滴は、レーザー光を通過する。レーザーに
より液滴中の個々の細胞各々から生じた蛍光を測定する。検出器の後方では、懸
濁液中の細胞流は静電気カラー部を通過すると、液滴の表面が荷電する。細胞を
担持した液滴には、正電荷または負電荷が与えられる。液滴中に特定の閾値を超
える強度の蛍光を示す細胞が含まれている場合には、この液滴は、一方の極性の
電荷を獲得する。未標識の細胞は逆の極性の電荷を獲得する。次に、荷電した液
滴が電場により偏向し、その表面電荷に応じて個別の容器内に輸送された液滴を
計数したとき、液滴中に1個より多い細胞を含有するときは、個々の細胞よりも多くの光を散乱するが、これは容易に検出される為、これらは未荷電のままで第
3の廃棄用容器に入る。マルチチャンネル蛍光検出装置は、複数の異なる蛍光標識による標識に基づいて細胞を分離できる様に構築されている。これらは複数の
レーザーを有しており、これが異なる周波数の蛍光を励起することができる結果
、検出器は異なる発光周波数を検出し得る。本試験には、3標識系が適切である。共焦点蛍光顕微鏡用に用いた上記と同様の標識プローブが適切である。診断試
験は下記工程を包含する。

【００３０】・患者から腫瘍の生検材料を取出す工程。・必要に応じて上記材料を微細切断し、腫瘍部から正常組織を分離する工程。・細胞内接着を破壊して単細胞の懸濁液を生成する工程。・Raf-1に対する上記蛍光標識抗体プローブで懸濁細胞を標識する工程。必要に応じて生検材料は、p21に対する抗体プローブおよびDNA結合染料で標識する。・標識された細胞を非結合の標識プローブから分離する工程。・FACS装置に標識された細胞懸濁液を載せ、下記細胞を計数する工程。・Raf-1を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、閾値の「正常」発現を超えて抗Raf-1抗体で標識される。・必要に応じて、p21を発現する、即ち、p21に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・必要に応じて、DNA結合蛍光染料からの蛍光強度により検出される染色体増幅を示す。

【００３１】実施例1 多数の細胞系を選択し、それらのRaf-1蛋白質濃度を調べると共に、それらの放射線感受性についても調べた。p21およびRaf-1発現量は夫々、実質的に標準的
方法に従い、ウエスタンブロットにより測定した。p21が検出不可能であった細胞系の結果を図２に示し、p21濃度が上昇した細胞系の結果を図３に示す。

【００３２】材料および方法細胞系本分析に用いたヒトin vitro細胞系の生育特性クローン原生試験法は、Wareni
us ら、1994に記載されている。細胞系とその組織学的分類を表１に示す。これらは全て充分成熟しており、多くは数年間in vitroで生育させたものである。細
胞系は寄贈されたものか、当研究室が購入したものである。受領後全て5代継代培養し、液体窒素のバッチ保存用に充分な細胞とした。この期間中、抗生物質を
含有しない培地中で、少なくとも1回継代することにより汚染を防止し、全ての系についてマイコプラズマ試験を実施した。細胞生存試験の為に、細胞を所定の
一次液体窒素バッチから取出し、充分な成熟細胞が得られるまで3〜6代継代培養
した。これらの細胞から得られた追加のバッチは、液体窒素中に凍結した。RT11
2及びH322は、RPMI1640及びMGHU-1で生育させ、Ham' sF12培地で生育させたが、
それ以外の細胞は通常、DMEM培地中に維持した。全ての系に、10％加熱不活性化
ウシ胎児血清(HIFCS)を添加した。

【００３３】

【表１】

【００３４】上記細胞系について、Raf-1濃度、p21濃度と、放射線感受性との間の相関性を
調べた。p21蛋白質濃度が上昇した細胞では、Raf-1蛋白質濃度と放射線感受性の
間に有用な相関関係が見られた。

【００３５】従って、p21蛋白質濃度が上昇した細胞系では、Raf-1濃度が高い程、細胞の放
射線感受性は高くなる（図３を参照）。この様な相関関係は、p21蛋白質が検出されない細胞系では見られなかった（図２を参照）。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、一次抗血清を1/750の希釈倍率で希釈してRaf-1に対するURP‐2653モノクローナル抗体とし、7.5％ゲル上に100μg/50μlの試料蛋白質を負荷したとき、総細胞内蛋白質当たりのRaf-1蛋白量の範囲、特に以下に示す17ヒトin vitr
o細胞系における74kDおよび48kDの蛋白質相対量を示すウエスタンブロットである。

【図２】図２は、p21蛋白質濃度が上昇しない（検出不可能な）細胞系において、SF2と
して測定した放射線感受性とRaf-1量との関係を示すものである。

【図３】図３は、p21蛋白質濃度が上昇する細胞系において、SF2として測定した放射線
感受性とRaf-1量との関係を示すものである。

【符号の説明】

1． KB、経口表皮様癌腫 2． HT29、腺癌、結腸 3． MGH‐U1、膀胱癌 4． HRT18、腺癌、直腸 5． A431、扁平癌、外陰部 6． NCTC2544、皮膚線維芽細胞 7． CORL23、大型細胞肺癌 8． SK-MEL3、黒色腫 9． AT5BIVA、運動失調末梢血管拡張線維芽細胞 10． OAW42、卵巣癌 11． I407、胚腸上皮 12． 2780、卵巣癌 13． HEP-2、扁平癌 14． HX142、神経芽腫 15． RT112、膀胱癌 16． HeLa、扁平癌 17． NCTC2544

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号９８１２１５１．０ (32)優先日平成10年６月５日(1998．6．5) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９８１４５４５．１ (32)優先日平成10年７月３日(1998．7．3) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９０３０３５．５ (32)優先日平成11年２月10日(1999．2．10) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞の放射線感受性を測定する方法であって、該方法は、細
胞またはその抽出液を含有する試料中の (a)p21の発現濃度、またはp21蛋白質の量、および (b)Raf-1の発現濃度、またはRaf-1蛋白質の量を試験する工程を包含するものである測定方法。
【請求項２】 Raf-1 mRNAに対するプローブを用いるか、または、Raf-1蛋白質に特異的な抗体を用いて試験を実施するものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】上記抗体は、試料中のRaf-1蛋白質と共存する48ｋD蛋白質と
交差反応しないものである請求項２に記載の方法。
【請求項４】上記抗体は、48kD蛋白質上に存在しないRaf-1蛋白質のエピトープを含有するかその一部を成すペプチドを形成した後、該ペプチドに対する
抗体を調製することによって得られるものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】上記抗体は、Raf-1蛋白質および48kD蛋白質に特異的な抗体で動物を免疫することにより、48kD蛋白質上に存在するRaf-1蛋白質のエピトープ部位をマスクした後、該マスクされたRaf-1蛋白質に対する抗体を得ることによって得られるものである請求項３に記載の方法。
【請求項６】上記抗体はモノクローナル抗体である請求項４または５に記
載の方法。
【請求項７】上記抗体は標識抗体である請求項２〜６のいずれかに記載の
方法。
【請求項８】上記抗体は蛍光標識である請求項７に記載の方法。
【請求項９】更に、試料を、異数性細胞標識用DNA結合染料と接触させるものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】上記DNA結合染料は、Hoechst 33258染料またはクロモマイ
シンA₃染料である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】上記試料は、細胞の試料である請求項１〜１０のいずれか
に記載の方法。
【請求項１２】細胞計数を行うことにより試験を実施するものである請求
項１１に記載の方法。
【請求項１３】マルチパラメーターフローサイトメトリーを用いて細胞計
数を行うものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】走査型共焦点顕微鏡検査を用いて細胞計数を行うものであ
る請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】蛍光活性化細胞分類法を用いて細胞計数を行うものである
請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】上記細胞計数を行う前に、細胞の試料を微細切断すること
によって正常組織と腫瘍組織を分けるものである請求項１２〜１５のいずれかに
記載の方法。
【請求項１７】上記細胞計数を行う前に、細胞試料中の細胞内接着を破壊
して単細胞の懸濁液を生成するものである請求項１２〜１６のいずれかに記載の
方法。
【請求項１８】 Raf-1蛋白質に特異的な抗体であって、Raf-1蛋白質を含有
する細胞中に共存する48ｋD蛋白質と交差反応しない抗体を作成する方法であって、該方法は、48kD蛋白質上に存在しないRaf-1蛋白質のエピトープを含有するかその一部を成すペプチドを形成する工程、および該ペプチドに対する抗体を調製
する工程を包含する抗体の作成方法。
【請求項１９】 Raf-1蛋白質に特異的な抗体であって、Raf-1蛋白質を含有
する細胞中に共存する48ｋD蛋白質と交差反応しない抗体を作成する方法であって、該方法は、Raf-1蛋白質および48kD蛋白質に特異的な抗体で動物を免疫することにより48kD蛋白質上に存在するRaf-1蛋白質の潜在的エピトープ部位をマスクする工程、および該マスクされたRaf-1蛋白質に対する抗体を得る工程を包含する抗体の作成方法。
【請求項２０】請求項１８または１９に記載の方法によって得られる抗体
。
【請求項２１】 Raf-1蛋白質に特異的な抗体であって、Raf-1蛋白質を含有
する細胞中に共存する48ｋD蛋白質とは交差反応しない抗体。
【請求項２２】モノクローナル抗体である請求項２０または２１に記載の
抗体。
【請求項２３】癌治療用薬剤を選択する方法であって、該方法は、（a）p21が発現しないか、またはp21蛋白質が検出可能な細胞またはその抽出液を含有する試料中のRaf-1発現濃度またはRaf-1蛋白量を調べる工程、並びに（b）Raf-1が過剰に発現するとき、および／またはRaf-1蛋白質が高濃度で存在するときは、電離放射線による治療を選択し、（c)Raf-1が過剰に発現しないとき、および／またはRaf-1蛋白質が実質的に高
濃度で存在しないときは、電離放射線以外の薬剤による治療を選択する工程を包含する方法。
【請求項２４】上記の治療を選択する工程は、工程（c)によって行われ、
上記の電離放射線以外の薬剤は、CDDP等の白金化剤、および／またはタキソール
等のタキサン類を含有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】細胞の放射線感受性を測定するキットであって、該キット
は、（i）Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質の量を調べる手段、および、（ii）p21の発現濃度またはp21蛋白質の量を調べる手段を包含するキット。
【請求項２６】上記のRaf-1蛋白質の量を調べる手段は、Raf-1 mRNに対す
るプローブ、またはRaf-1蛋白質に特異的な抗体を含有するものである請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】上記抗体は、請求項２１〜２３のいずれかに記載の抗体で
ある請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】上記抗体は標識抗体である請求項２６または２７に記載の
キット。
【請求項２９】上記標識は蛍光標識である請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】更に、異数性細胞標識用DNA結合染料を含むものである請求項２５〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】上記DNA結合染料は、Hoechst 33258染料またはクロモマイ
シンA₃染料である請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】細胞の放射線感受性を測定する為に、Raf-1の発現濃度またはRaf-1蛋白質の量を調べる手段を用いる方法。
【請求項３３】細胞の放射線感受性を測定する為に、p21の発現濃度またはp21蛋白質の量を調べる手段を用いる方法。