JP2002502979A - ヘパリンによる干渉なしのトロポニンアッセイ - Google Patents
ヘパリンによる干渉なしのトロポニンアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはＩＴＣトリマーの形態で互いに結合したトロポニンＩ、ＴまたはＣのイムノアッセイ法であって、イムノアッセイがポリブレンの存在下で実施されることを特徴とする方法に関する。
Description
【０００１】 本発明は、ヘパリンに起因する干渉の回避を可能にする、生物学的媒質中のト
ロポニンをアッセイするための方法に関する。
ロポニンをアッセイするための方法に関する。
【０００２】 トロポニンは３つのタンパク質、トロポニンＩ、ＴおよびＣからなる筋原繊維
タンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシ
ンおよびアクチンと相互作用することによって、Ｃａ2+イオンによる筋収縮の調
節に寄与することを可能にする。より詳細には、インパルスが筋肉の運動終板の
レベルに到達すると、活動電位が生成し、これは筋小胞体に伝達されることが知
られている。次いで、Ｃａ2+が細胞質ゾルに放出され、トロポニンＣに結合する
。これはトロポニンＩとトロポニンＣとの間の相互作用の強化を生じさせ、その
結果、トロポニンＩ、Ｔ、Ｃ複合体のコンホメーションの変化を生じさせる。次
いで、アクチン−ミオシン相互作用部位が開放され、これは筋収縮運動を可能に
する。
タンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシ
ンおよびアクチンと相互作用することによって、Ｃａ2+イオンによる筋収縮の調
節に寄与することを可能にする。より詳細には、インパルスが筋肉の運動終板の
レベルに到達すると、活動電位が生成し、これは筋小胞体に伝達されることが知
られている。次いで、Ｃａ2+が細胞質ゾルに放出され、トロポニンＣに結合する
。これはトロポニンＩとトロポニンＣとの間の相互作用の強化を生じさせ、その
結果、トロポニンＩ、Ｔ、Ｃ複合体のコンホメーションの変化を生じさせる。次
いで、アクチン−ミオシン相互作用部位が開放され、これは筋収縮運動を可能に
する。
【０００３】 筋肉が不可逆的に損傷されると（それが心筋梗塞後の心筋壊死の間の心筋であ
れ、持続的肉体努力の間の骨格筋であれ）、放出されたトロポニンが血流中に（
より迅速にまたはより迅速でなく）出現する。
れ、持続的肉体努力の間の骨格筋であれ）、放出されたトロポニンが血流中に（
より迅速にまたはより迅速でなく）出現する。
【０００４】 従って、トロポニンのアッセイ（トロポニンＴのアッセイ（Circulation (199
1), 83, pp. 902-912）またはトロポニンＩのアッセイ（Am. Heart J. (1987),
110, pp.1333-1344およびMolecular Immunology (1992), 29(2), pp.271-278） のいずれか）は、近年、心筋梗塞の初期診断に推奨されている。同様に、心筋梗
塞後の血栓溶解療法の成功を評価するための心臓トロポニンＴのアッセイがBr.
Heart J., (1994), 71, pp. 242-248において、そして骨格筋に対する損傷を評 価するための骨格トロポニンＩのアッセイ（D. Rama et al., Clinical Chemist
ry (1996), 42 No. 12, p. 2033）が提唱されている。種々の心臓および骨格ト ロポニンのアッセイが、今日、種々のヒトおよび動物の病状の診断に非常に有用
な手段であることに留意するべきである。
1), 83, pp. 902-912）またはトロポニンＩのアッセイ（Am. Heart J. (1987),
110, pp.1333-1344およびMolecular Immunology (1992), 29(2), pp.271-278） のいずれか）は、近年、心筋梗塞の初期診断に推奨されている。同様に、心筋梗
塞後の血栓溶解療法の成功を評価するための心臓トロポニンＴのアッセイがBr.
Heart J., (1994), 71, pp. 242-248において、そして骨格筋に対する損傷を評 価するための骨格トロポニンＩのアッセイ（D. Rama et al., Clinical Chemist
ry (1996), 42 No. 12, p. 2033）が提唱されている。種々の心臓および骨格ト ロポニンのアッセイが、今日、種々のヒトおよび動物の病状の診断に非常に有用
な手段であることに留意するべきである。
【０００５】 種々の心臓トロポニンを評価するために、血液試料（血清、血漿または全血）
が通常使用される。しかし、この選択は使用する方法によって制限され得る。な
ぜなら、血清はトロポニン評価用の特定の方法（例えば、トロポニンＴの迅速な
評価のための方法）に不適切な生物学的試料であること、および全血は常に定量
的アッセイの実施を可能にすることが知られているからである。ヘパリン含有血
漿を用いて実施するイムノアッセイに関して、使用する方法の性能が非常に高い
場合でさえ、さほど信頼性が高くない結果がしばしば得られる。一般に、血漿中
のトロポニン濃度がさほど高くない場合に、この問題に遭遇する（P.O. Colliso
n et al., Ann. Clin. Biochem., (1995), 32, pp. 454-458）。実際、血液試料
中のヘパリンの存在は種々のイムノアッセイの間に干渉し得、従ってかなり最終
結果を、そしてそれによって医師の臨床診断を修飾し得ることが知られている。
現在、トロポニンのアッセイは重篤な疾患の診断またはモニターのために実施さ
れており、これには非常に正確な結果を得ることが必要とされる。その結果、ヘ
パリン含有材料（ヘパリン処理したチューブなど）の使用は、血液試料の採集お
よびイムノアッセイの実施の両方についてしばしば回避されるべきである。
が通常使用される。しかし、この選択は使用する方法によって制限され得る。な
ぜなら、血清はトロポニン評価用の特定の方法（例えば、トロポニンＴの迅速な
評価のための方法）に不適切な生物学的試料であること、および全血は常に定量
的アッセイの実施を可能にすることが知られているからである。ヘパリン含有血
漿を用いて実施するイムノアッセイに関して、使用する方法の性能が非常に高い
場合でさえ、さほど信頼性が高くない結果がしばしば得られる。一般に、血漿中
のトロポニン濃度がさほど高くない場合に、この問題に遭遇する（P.O. Colliso
n et al., Ann. Clin. Biochem., (1995), 32, pp. 454-458）。実際、血液試料
中のヘパリンの存在は種々のイムノアッセイの間に干渉し得、従ってかなり最終
結果を、そしてそれによって医師の臨床診断を修飾し得ることが知られている。
現在、トロポニンのアッセイは重篤な疾患の診断またはモニターのために実施さ
れており、これには非常に正確な結果を得ることが必要とされる。その結果、ヘ
パリン含有材料（ヘパリン処理したチューブなど）の使用は、血液試料の採集お
よびイムノアッセイの実施の両方についてしばしば回避されるべきである。
【０００６】 さらに、血管形成術前または心筋梗塞後あるいは特定の心臓血管症状の処置の
間に、多量のヘパリンを患者に投与し、この処置はしばしば２４時間を越えて延
長される。投与される用量に依存して、投与の１時間後の血漿中のヘパリン濃度
は０．１〜２ＩＵ／ｍｌで変動し得る。患者の処置に起因する血液試料中のヘパ
リンの存在は、トロポニンのアッセイについて主な問題を構成する。
間に、多量のヘパリンを患者に投与し、この処置はしばしば２４時間を越えて延
長される。投与される用量に依存して、投与の１時間後の血漿中のヘパリン濃度
は０．１〜２ＩＵ／ｍｌで変動し得る。患者の処置に起因する血液試料中のヘパ
リンの存在は、トロポニンのアッセイについて主な問題を構成する。
【０００７】 ヘパリナーゼＩ、Ｌ−ヒスチジン、硫酸プロタミン、カチオン交換樹脂などの
ようなヘパリンを分解または捕獲し得る多数の製品が知られている。これらの製
品は生物学においてヘパリンのインヒビターとして一般に使用されている。しか
し、イムノアッセイの間のこれらの使用は常にヘパリンに起因する干渉の排除を
可能にするわけではなく、そしてしばしばイムノアッセイの間のその存在がさら
なる干渉を生じさせ得る（E.W. Nielsen et al., J. Immunological Methods, (
1994), 173, pp. 245-251）。
ようなヘパリンを分解または捕獲し得る多数の製品が知られている。これらの製
品は生物学においてヘパリンのインヒビターとして一般に使用されている。しか
し、イムノアッセイの間のこれらの使用は常にヘパリンに起因する干渉の排除を
可能にするわけではなく、そしてしばしばイムノアッセイの間のその存在がさら
なる干渉を生じさせ得る（E.W. Nielsen et al., J. Immunological Methods, (
1994), 173, pp. 245-251）。
【０００８】 種々のトロポニンのイムノアッセイの間のヘパリンに起因する干渉を回避する
ことが可能であることがここに見出された。本発明によって、ヘパリン処理され
たかまたはヘパリンを用いて処置された患者から得られた生物学的試料に対する
トロポニンのアッセイを、非常に高い精度で、血流中に見出される真の値を低下
させることなく実施することが可能となり、これは使用する免疫学的方法に依存
しない。
ことが可能であることがここに見出された。本発明によって、ヘパリン処理され
たかまたはヘパリンを用いて処置された患者から得られた生物学的試料に対する
トロポニンのアッセイを、非常に高い精度で、血流中に見出される真の値を低下
させることなく実施することが可能となり、これは使用する免疫学的方法に依存
しない。
【０００９】 本発明は、より詳細には、ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心
臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の
形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔま
たはＣの免疫学的アッセイ法であって、免疫学的アッセイがヘキサジメトリンブ
ロミド（ポリブレン）の存在下で実施されることを特徴とする方法に関する。
臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の
形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔま
たはＣの免疫学的アッセイ法であって、免疫学的アッセイがヘキサジメトリンブ
ロミド（ポリブレン）の存在下で実施されることを特徴とする方法に関する。
【００１０】 トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、Ｉ
ＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合された
トロポニンＩ、ＴまたはＣのイムノアッセイの間に使用されるポリブレンの量は
使用するイムノアッセイに従って変動し得る。有利には、［使用ポリブレンのモ
ル濃度／分析しようとする試料中に存在するヘパリンのモル濃度］比は１〜１０
００であってもよい。アッセイに依存して、これはより詳細には、３０〜３００
、好ましくは６０〜１８０、あるいは１〜１０、好ましくは４〜１０のみであっ
てもよい。
ＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合された
トロポニンＩ、ＴまたはＣのイムノアッセイの間に使用されるポリブレンの量は
使用するイムノアッセイに従って変動し得る。有利には、［使用ポリブレンのモ
ル濃度／分析しようとする試料中に存在するヘパリンのモル濃度］比は１〜１０
００であってもよい。アッセイに依存して、これはより詳細には、３０〜３００
、好ましくは６０〜１８０、あるいは１〜１０、好ましくは４〜１０のみであっ
てもよい。
【００１１】 ポリブレンを、ヘパリンを含有しているかまたは含有している可能性のある生
物学的試料に直接添加してもよく、緩衝液、結合試薬溶液などのようなイムノア
ッセイ試薬の１つに添加してもよい。ポリブレンを、イムノアッセイの間に使用
する緩衝液に添加することが好ましい。緩衝液なる用語は、血漿試料と同時に存
在する、イムノアッセイの第１段階の間に使用されるいずれかの溶液を包含する
。洗浄溶液はこの用語から除外される。
物学的試料に直接添加してもよく、緩衝液、結合試薬溶液などのようなイムノア
ッセイ試薬の１つに添加してもよい。ポリブレンを、イムノアッセイの間に使用
する緩衝液に添加することが好ましい。緩衝液なる用語は、血漿試料と同時に存
在する、イムノアッセイの第１段階の間に使用されるいずれかの溶液を包含する
。洗浄溶液はこの用語から除外される。
【００１２】 本発明を、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー
（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組
み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの評価を可能にするいずれかの免疫学的方
法を用いて実施してもよい。
（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組
み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの評価を可能にするいずれかの免疫学的方
法を用いて実施してもよい。
【００１３】 本発明によれば、生物学的試料中のトロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、Ｔま
たはＣ、あるいはそのダイマーまたはトリマーのアッセイを可能にし、ポリブレ
ンを使用してヘパリンに起因する干渉を排除する免疫酵素法が好ましい。これら
の方法の中で、サンドイッチ型の方法が好ましい。サンドイッチ型の方法を１以
上の段階（２段階、３段階など）で実施してもよく、この方法に２個以上のモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用してもよい。
たはＣ、あるいはそのダイマーまたはトリマーのアッセイを可能にし、ポリブレ
ンを使用してヘパリンに起因する干渉を排除する免疫酵素法が好ましい。これら
の方法の中で、サンドイッチ型の方法が好ましい。サンドイッチ型の方法を１以
上の段階（２段階、３段階など）で実施してもよく、この方法に２個以上のモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用してもよい。
【００１４】 トロポニンＩの測定を可能にする免疫酵素法は既に知られている。C. Larue e
t al.（Mol. Immunol. (1992), 29(2), pp. 271-278およびClin. Chem. (1993),
39/6, pp. 972-979）は、酵素的可視化のために色素原性基質であるテトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）−Ｈ2Ｏ2を使用する免疫酵素アッセイのサンドイッチ型
の方法を記載している。可視化の後、吸光度の読み取りを４５０ｎｍで実施する
。著者らによる検出限界は０．２μｇ／ｌである。この方法を使用するアッセイ
キットは市販されている（Sanofi Dioagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette,
France）。このキットの検出限界は０．０３〜０．０４μｇ／ｌのオーダーで ある（J. Mair et al., Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19-38）。
t al.（Mol. Immunol. (1992), 29(2), pp. 271-278およびClin. Chem. (1993),
39/6, pp. 972-979）は、酵素的可視化のために色素原性基質であるテトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）−Ｈ2Ｏ2を使用する免疫酵素アッセイのサンドイッチ型
の方法を記載している。可視化の後、吸光度の読み取りを４５０ｎｍで実施する
。著者らによる検出限界は０．２μｇ／ｌである。この方法を使用するアッセイ
キットは市販されている（Sanofi Dioagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette,
France）。このキットの検出限界は０．０３〜０．０４μｇ／ｌのオーダーで ある（J. Mair et al., Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19-38）。
【００１５】 別のトロポニンＩ用免疫酵素法は、Bodor et al.によって記載されている。こ
の方法は、１．５〜３．１μｇ／ｌのオーダーの濃度のトロポニンＩの検出を可
能にする（Bodor et al., Clin. Chem. (1992), 38/11, pp. 2203-2214; Adams
J. et al., Circulation (1993), 88(1), pp. 101-106）。このアッセイは、酵 素的可視化のために、アルカリホスファターゼ用の色素原性基質であるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを使用し、測定は４０５ｎｍにおいて実施する。
の方法は、１．５〜３．１μｇ／ｌのオーダーの濃度のトロポニンＩの検出を可
能にする（Bodor et al., Clin. Chem. (1992), 38/11, pp. 2203-2214; Adams
J. et al., Circulation (1993), 88(1), pp. 101-106）。このアッセイは、酵 素的可視化のために、アルカリホスファターゼ用の色素原性基質であるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを使用し、測定は４０５ｎｍにおいて実施する。
【００１６】 特許出願ＷＯ ９６／２２５３５も、心臓トロポニンＩの定量的アッセイを可
能にするサンドイッチ型免疫酵素アッセイ法を記載している。この方法は、酵素
的可視化のために、ジアシルヒドラジンの誘導体から選択される化学ルミネセン
ス性基質、すなわち１，２−ジオキセタンの誘導体を使用し、手動システム（診
断アッセイキット）または自動化システムのいずれかによって実施し得る。この
実施態様によれば、１段階アッセイまたは２段階アッセイのいずれかを実施する
ことが可能である。
能にするサンドイッチ型免疫酵素アッセイ法を記載している。この方法は、酵素
的可視化のために、ジアシルヒドラジンの誘導体から選択される化学ルミネセン
ス性基質、すなわち１，２−ジオキセタンの誘導体を使用し、手動システム（診
断アッセイキット）または自動化システムのいずれかによって実施し得る。この
実施態様によれば、１段階アッセイまたは２段階アッセイのいずれかを実施する
ことが可能である。
【００１７】 トロポニンＩの自動化定量的アッセイに使用され、Dade Diagnostics, Munich
, Germanyによって販売されている免疫酵素法も知られている（L.P. Kuhr et al
., Eur. J. Chem. Clin. Biochem. (1997), 35(5), p.399-404）。
, Germanyによって販売されている免疫酵素法も知られている（L.P. Kuhr et al
., Eur. J. Chem. Clin. Biochem. (1997), 35(5), p.399-404）。
【００１８】 トロポニンＴの免疫酵素アッセイを可能にするキットも市販されている。これ
はBoehringer Mannheim, Mannheim, Germanyによって販売されているキット「Tr
oponin T / ES 300 Analyzer」である（N. Genser et al., Clin. Chem. Acta (
1997), 265, pp. 207-217; H. Baum et al., Clin. Chem. (1997), 43/10, p. 1
877-1977）。
はBoehringer Mannheim, Mannheim, Germanyによって販売されているキット「Tr
oponin T / ES 300 Analyzer」である（N. Genser et al., Clin. Chem. Acta (
1997), 265, pp. 207-217; H. Baum et al., Clin. Chem. (1997), 43/10, p. 1
877-1977）。
【００１９】 特許出願ＷＯ ９６／３３４１５も、生物学的媒質中のトロポニンＩおよびＴ
、またはトロポニンＩ、Ｃおよび／もしくはＴの複合体の量の評価を可能にする
サンドイッチ型イムノアッセイ法を記載している。
、またはトロポニンＩ、Ｃおよび／もしくはＴの複合体の量の評価を可能にする
サンドイッチ型イムノアッセイ法を記載している。
【００２０】 骨格トロポニンＩの免疫酵素アッセイのための方法は、Rama et al., Clin. C
hem, (1996), 42 No. 2, p. 2033によって記載されている。
hem, (1996), 42 No. 2, p. 2033によって記載されている。
【００２１】 上記で引用した、個々の、ダイマーのまたはトリマーのタンパク質としてのト
ロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣの評価のための免疫酵素法は例と
して挙げたものであり、当業者に公知のトロポニン用免疫酵素法の網羅的なリス
トを構成するものではない。
ロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣの評価のための免疫酵素法は例と
して挙げたものであり、当業者に公知のトロポニン用免疫酵素法の網羅的なリス
トを構成するものではない。
【００２２】 本発明による方法は上記のようにいずれの型のトロポニン用免疫学的方法にも
適用することができる。
適用することができる。
【００２３】 例えば、本発明による方法は、イムノアッセイ（例えば、C. Larue et al., L
'information cardiologique (1991) Vol. XV No. 1, pp. 17-21によって記載さ
れるような）および蛍光イムノアッセイ（L. Bellanger et al., Clin. Chem. (
1997), Vol. 43 No. 6, p. S159, No. 240）の間に適用してもよい。
'information cardiologique (1991) Vol. XV No. 1, pp. 17-21によって記載さ
れるような）および蛍光イムノアッセイ（L. Bellanger et al., Clin. Chem. (
1997), Vol. 43 No. 6, p. S159, No. 240）の間に適用してもよい。
【００２４】 ヘパリンに起因する干渉を回避するための、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格
）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリ
マー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学
的アッセイの間のポリブレンの使用は本発明の一部を形成する。
）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリ
マー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学
的アッセイの間のポリブレンの使用は本発明の一部を形成する。
【００２５】 本発明はまた、イムノアッセイ試薬の中にポリブレンを含む、トロポニンＩ（
心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）
の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔ
またはＣのイムノアッセイ用キットに関する。
心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）
の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔ
またはＣのイムノアッセイ用キットに関する。
【００２６】 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限
定するものではない。
定するものではない。
【００２７】 実施例Ｉ ヘパリン過負荷血清および血漿を使用した心臓トロポニンＩのアッセイ −
種々のヘパリンインヒビターでの試料の処理 トロポニンＩを含有している可能性のあるヒト血清にヘパリンを過負荷させ、
ヘパリンなしの血清の一部をコントロールとして貯蔵し、同時にアッセイした。
種々のヘパリンインヒビター（ヘパリンリチウム）、特に、ヘパリナーゼＩ（フ
ラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来ヘパリナーゼ
Ｉ、Sigma ref. H 2519）、Ｌ−ヒスチジン（Sigma ref. H 8000）、硫酸プロタ
ミン（サケ由来硫酸プロタミン グレードＸ、Sigma ref. P 4020）、アンチト ロンビンＩＩＩ（ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩ、Sigma ref. A 7388） 、カチオン交換樹脂ＱＳＦＦ（Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref
. 17051001）およびＤＥＡＥ（DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech
ref. 17070901）を試験した。
種々のヘパリンインヒビターでの試料の処理 トロポニンＩを含有している可能性のあるヒト血清にヘパリンを過負荷させ、
ヘパリンなしの血清の一部をコントロールとして貯蔵し、同時にアッセイした。
種々のヘパリンインヒビター（ヘパリンリチウム）、特に、ヘパリナーゼＩ（フ
ラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来ヘパリナーゼ
Ｉ、Sigma ref. H 2519）、Ｌ−ヒスチジン（Sigma ref. H 8000）、硫酸プロタ
ミン（サケ由来硫酸プロタミン グレードＸ、Sigma ref. P 4020）、アンチト ロンビンＩＩＩ（ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩ、Sigma ref. A 7388） 、カチオン交換樹脂ＱＳＦＦ（Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref
. 17051001）およびＤＥＡＥ（DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech
ref. 17070901）を試験した。
【００２８】 免疫酵素アッセイに使用した自動化システムはBeckmanによって販売されてい るシステムであるAccessRイムノアッセイシステムである。使用キットは同社か ら販売されているAccess-Troponin Iキットである。
【００２９】 アッセイを以下のように実施する： アッセイしようとする試料５０μｌ、４ｍｇ／ｍｌのマウス免疫グロブリン溶
液２５μｌ、ヘパリンインヒビターを含有する０．１Ｍコハク酸溶液１０μｌお
よび８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−アルカリホスファタ
ーゼ結合体（濃度：５μｇ／ｍｌ）５０μｌをアッセイウェルに導入する。
液２５μｌ、ヘパリンインヒビターを含有する０．１Ｍコハク酸溶液１０μｌお
よび８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−アルカリホスファタ
ーゼ結合体（濃度：５μｇ／ｍｌ）５０μｌをアッセイウェルに導入する。
【００３０】 ５分間３７℃でインキュベートした後、１１Ｅ１２マウス抗心臓トロポニンＩ
モノクローナル抗体を共有結合させた５μｌの鉄ラテックスビーズ（Rhone Poul
enc ref. MI-070/60）をそこに導入する。
モノクローナル抗体を共有結合させた５μｌの鉄ラテックスビーズ（Rhone Poul
enc ref. MI-070/60）をそこに導入する。
【００３１】 ８Ｅ１および１１Ｅ１２マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体はTrop
onin Iキットの一部である。
onin Iキットの一部である。
【００３２】 混合物を３６秒間３７℃でインキュベートし、次いで鉄ラテックスビーズを磁
場を利用して分離する。トリス緩衝液（ｐＨ８）を用いて洗浄を実施し、次いで
２００μｌのLumi-PhosR 530基質を添加する。この基質はまた、Access-Troponi
n Iキットの一部である。
場を利用して分離する。トリス緩衝液（ｐＨ８）を用いて洗浄を実施し、次いで
２００μｌのLumi-PhosR 530基質を添加する。この基質はまた、Access-Troponi
n Iキットの一部である。
【００３３】 可視化を３７℃で実施し、反応によって生成したルミネセンスをルミノメータ
ーを用いて測定する。
ーを用いて測定する。
【００３４】 分析の総時間は１５分間である。
【００３５】 較正系列用に、ヒト心臓トロポニンＩの溶液を使用する。
【００３６】 ０〜５０μｇ／ｌの濃度に対応する較正系列を調製する。
【００３７】 この研究の結果を以下の表Ｉ〜ＶＩに示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】 この研究の結果は、使用したヘパリンインヒビターもカチオン交換樹脂もヘパ
リンに起因する干渉の阻害を可能にしないことを実証する。さらに、硫酸プロタ
ミンＩはバックグラウンドノイズの実質的な増加を引き起こすことが観察された
（表ＩＩＩにおいて言及していない結果）。
リンに起因する干渉の阻害を可能にしないことを実証する。さらに、硫酸プロタ
ミンＩはバックグラウンドノイズの実質的な増加を引き起こすことが観察された
（表ＩＩＩにおいて言及していない結果）。
【００４５】 実施例ＩＩ ヘパリンに起因する干渉を回避するためにポリブレンを使用した免疫酵素キッ
トを用いた心臓トロポニンＩのアッセイ イムノアッセイに、Troponin I Pasteurキット（Sanofi Diagnostics Pasteur
, Marnes-la-Coquette, France）を使用した。アッセイを以下のように実施する
： ポリブレンを含み、０．２％のTweenR 20、非特異的マウス免疫グロブリンお よび０．１％のKathonRを含有するコハク酸緩衝液１５０μｌ、１１Ｅ１２マウ ス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−ペルオキシダーゼ結合体５０μｌ、
ならびにアッセイしようとする試料または較正系列に使用する標準溶液２００μ
ｌを、８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体でコートしたポリス
チレンチューブ中に導入する。
トを用いた心臓トロポニンＩのアッセイ イムノアッセイに、Troponin I Pasteurキット（Sanofi Diagnostics Pasteur
, Marnes-la-Coquette, France）を使用した。アッセイを以下のように実施する
： ポリブレンを含み、０．２％のTweenR 20、非特異的マウス免疫グロブリンお よび０．１％のKathonRを含有するコハク酸緩衝液１５０μｌ、１１Ｅ１２マウ ス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−ペルオキシダーゼ結合体５０μｌ、
ならびにアッセイしようとする試料または較正系列に使用する標準溶液２００μ
ｌを、８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体でコートしたポリス
チレンチューブ中に導入する。
【００４６】 較正系列用に、０〜１．７４μｇ／ｌの精製ヒト心臓トロポニンＩを含有する
ヒト血清を使用する。
ヒト血清を使用する。
【００４７】 混合物を正確に１５分間水平に振とうしながら室温でインキュベートし、次い
でチューブを以下のように洗浄する： − チューブの内容物を容器に注ぎ、チューブを吸収性ペーパーでぬぐう、 − ０．１％のTweenR 20および０．３％のKathonを含有する０．１Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ６．８）１ｍｌを添加することによって洗浄を実施し、その間、洗浄
溶液の温度を８℃以下に維持する。 この工程を４回反復する。
でチューブを以下のように洗浄する： − チューブの内容物を容器に注ぎ、チューブを吸収性ペーパーでぬぐう、 − ０．１％のTweenR 20および０．３％のKathonを含有する０．１Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ６．８）１ｍｌを添加することによって洗浄を実施し、その間、洗浄
溶液の温度を８℃以下に維持する。 この工程を４回反復する。
【００４８】 洗浄を実施、いかなる微量の洗浄に使用した溶液も除去した後、テトラメチル
ベンジジン１部ならびに４％のＤＭＳＯおよび０．０３％の過酸化水素を含有す
るクエン酸緩衝液１００部からなる混合物６００μｌを使用して酵素的可視化を
実施する。
ベンジジン１部ならびに４％のＤＭＳＯおよび０．０３％の過酸化水素を含有す
るクエン酸緩衝液１００部からなる混合物６００μｌを使用して酵素的可視化を
実施する。
【００４９】 混合物を室温、暗所に１５分間放置し、λ＝４５０ｎｍにおける吸光度を測定
する。
する。
【００５０】 この研究の結果を表ＶＩＩに示す。
【００５１】
【表７】
【００５２】 表ＶＩＩの結果は、ポリブレンがヘパリンに起因する干渉の回避を可能にする
ことを実証する。Troponin I Pasteuryキット（Sanofi Diagnostics Pasteur, M
arnes-la-Coquette, France）を用いてトロポニンＩのアッセイを実施する場合 、試料中に存在するヘパリンのモル濃度より１０倍高いモル濃度が必要である。
ことを実証する。Troponin I Pasteuryキット（Sanofi Diagnostics Pasteur, M
arnes-la-Coquette, France）を用いてトロポニンＩのアッセイを実施する場合 、試料中に存在するヘパリンのモル濃度より１０倍高いモル濃度が必要である。
【００５３】 実施例ＩＩＩ 自動化システムを用いた心臓トロポニンＩのアッセイ 免疫酵素アッセイに使用する自動化システムはBeckmanから販売されているAcc
essRイムノアッセイシステムである。イムノアッセイ法は実施例Ｉに記載のもの
である。
essRイムノアッセイシステムである。イムノアッセイ法は実施例Ｉに記載のもの
である。
【００５４】 ヘパリンを含有する５人の患者由来の血漿を分析した。この研究の結果を表Ｖ
ＩＩＩに示す。トロポニンＩのアッセイについて上記した自動化システムを使用
した場合、試料中に存在するヘパリン１モル当り６０〜１２０モルのポリブレン
を使用することが必要であることがこの研究から明らかである。
ＩＩＩに示す。トロポニンＩのアッセイについて上記した自動化システムを使用
した場合、試料中に存在するヘパリン１モル当り６０〜１２０モルのポリブレン
を使用することが必要であることがこの研究から明らかである。
【００５５】
【表８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モーリス・プティトゥ フランス、エフ−75645パリ・セデックス 13、リュ・デュ・ジャヴロ65番 (72)発明者 シルヴィ・マリ−フランス・トランキエ フランス、エフ−69003リヨン、リュ・デ ュ・プロフェサー・フロランス６番 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 CA25 CB26 DA36 DA77 FB01 FB03 FB07
Claims (9)
- 【請求項１】 ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心臓もしく
は骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはト
リマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学的
アッセイ法であって、該免疫学的アッセイがポリブレンの存在下で実施されるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が１〜１０００であることを特徴とする、請
求項１記載のトロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー
ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合され
たトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学的アッセイ法。 - 【請求項３】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が１〜１０、好ましくは４〜１０であること
を特徴とする、請求項１または２記載の免疫学的アッセイ法。 - 【請求項４】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が３０〜３００、好ましくは６０〜１８０で
あることを特徴とする、請求項１または２記載の免疫学的アッセイ法。 - 【請求項５】 免疫学的アッセイの第１段階の間にポリブレンが使用溶液に
添加されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダ
イマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み
合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣのアッセイが免疫酵素法である、請求項１〜
５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 免疫酵素法がサンドイッチ型であることを特徴とする請求項
１〜６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 ヘパリンに起因する干渉を回避するための、トロポニンＩ（
心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形
態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣ
の免疫学的アッセイの間のポリブレンの使用。 - 【請求項９】 イムノアッセイ試薬の中にポリブレンを含む、トロポニンＩ
（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの
形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔまたは
Ｃのイムノアッセイ用キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR98/01367 | 1998-02-05 | ||
| FR9801367A FR2774473B1 (fr) | 1998-02-05 | 1998-02-05 | Procede de dosage des troponines dans des milieux biologiques permettant d'eviter les interferences dues a l'heparine |
| PCT/FR1999/000198 WO1999040442A1 (fr) | 1998-02-05 | 1999-02-01 | Dosage des troponines sans interferences dues a l'heparine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002502979A true JP2002502979A (ja) | 2002-01-29 |
Family
ID=9522644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000530804A Pending JP2002502979A (ja) | 1998-02-05 | 1999-02-01 | ヘパリンによる干渉なしのトロポニンアッセイ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1051623A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002502979A (ja) |
| FR (1) | FR2774473B1 (ja) |
| WO (1) | WO1999040442A1 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010513917A (ja) * | 2006-12-22 | 2010-04-30 | ヒューマニタス・ミラソーレ・エス．ピー．エー． | ロングペントラキシンｐｔｘ３の血漿レベルを測定するための方法 |
| JP2011038903A (ja) * | 2009-08-11 | 2011-02-24 | Kanto Chem Co Inc | 水溶性アンモニウムポリマーを含有する検体前処理試薬、および検体前処理方法 |
| WO2012115221A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 心筋トロポニンの測定法 |
| WO2014021387A1 (ja) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | 積水メディカル株式会社 | ラテックス凝集阻害免疫法 |
| WO2017179611A1 (ja) * | 2016-04-13 | 2017-10-19 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 硫酸化多糖類を用いた免疫学的測定法 |
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|---|---|---|---|---|
| EP1320753A2 (en) * | 2000-09-25 | 2003-06-25 | Abbott Laboratories | Methods and kits for decreasing interferences of assay samples containing plasma or serum in specific binding assays by using a large polycation |
| WO2002063302A1 (en) * | 2001-02-07 | 2002-08-15 | Immunomatrix Inc. | A method for reducing heparin interference in diagnostic tests for cardiac troponin |
| CN102426246A (zh) * | 2011-08-31 | 2012-04-25 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 人肌钙蛋白I(Troponin I)定量测定试剂盒及其检测方法 |
| ES2965910T3 (es) * | 2015-10-30 | 2024-04-17 | Phc Corp | Reactivo y método para medir complejo trombina antitrombina |
-
1998
- 1998-02-05 FR FR9801367A patent/FR2774473B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-01 WO PCT/FR1999/000198 patent/WO1999040442A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1999-02-01 JP JP2000530804A patent/JP2002502979A/ja active Pending
- 1999-02-01 EP EP99901673A patent/EP1051623A1/fr not_active Withdrawn
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| CN103380377B (zh) * | 2011-02-25 | 2016-01-27 | 美迪恩斯生命科技株式会社 | 心肌肌钙蛋白的测定方法 |
| CN103380377A (zh) * | 2011-02-25 | 2013-10-30 | 三菱化学美迪恩斯株式会社 | 心肌肌钙蛋白的测定方法 |
| KR20140007449A (ko) | 2011-02-25 | 2014-01-17 | 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤 | 심근 트로포닌의 측정법 |
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| JPWO2014021387A1 (ja) * | 2012-07-31 | 2016-07-21 | 積水メディカル株式会社 | ラテックス凝集阻害免疫法 |
| US10627393B2 (en) | 2012-07-31 | 2020-04-21 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Latex agglutination inhibition immunoassay |
| WO2017179611A1 (ja) * | 2016-04-13 | 2017-10-19 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 硫酸化多糖類を用いた免疫学的測定法 |
| JPWO2017179611A1 (ja) * | 2016-04-13 | 2019-02-21 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 硫酸化多糖類を用いた免疫学的測定法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2774473B1 (fr) | 2000-05-12 |
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