JP2002502979A - Troponin assay without interference by heparin - Google Patents

Troponin assay without interference by heparin

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JP2002502979A
JP2002502979A JP2000530804A JP2000530804A JP2002502979A JP 2002502979 A JP2002502979 A JP 2002502979A JP 2000530804 A JP2000530804 A JP 2000530804A JP 2000530804 A JP2000530804 A JP 2000530804A JP 2002502979 A JP2002502979 A JP 2002502979A
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カテリーヌ・クリスティアンヌ・マリ・ラリュ
モーリス・プティトゥ
シルヴィ・マリ−フランス・トランキエ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはＩＴＣトリマーの形態で互いに結合したトロポニンＩ、ＴまたはＣのイムノアッセイ法であって、イムノアッセイがポリブレンの存在下で実施されることを特徴とする方法に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to immunoassays of troponin I (heart or skeleton), T or C, and troponin I, T or C bound together in the form of IT, IC or TC or ITC trimer in a heparin-containing biological sample. A method, wherein the immunoassay is performed in the presence of polybrene.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本発明は、ヘパリンに起因する干渉の回避を可能にする、生物学的媒質中のト
ロポニンをアッセイするための方法に関する。The present invention relates to a method for assaying troponin in a biological medium, which makes it possible to avoid interference caused by heparin.

【０００２】 トロポニンは３つのタンパク質、トロポニンＩ、ＴおよびＣからなる筋原繊維
タンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシ
ンおよびアクチンと相互作用することによって、Ｃａ2+イオンによる筋収縮の調
節に寄与することを可能にする。より詳細には、インパルスが筋肉の運動終板の
レベルに到達すると、活動電位が生成し、これは筋小胞体に伝達されることが知
られている。次いで、Ｃａ2+が細胞質ゾルに放出され、トロポニンＣに結合する
。これはトロポニンＩとトロポニンＣとの間の相互作用の強化を生じさせ、その
結果、トロポニンＩ、Ｔ、Ｃ複合体のコンホメーションの変化を生じさせる。次
いで、アクチン−ミオシン相互作用部位が開放され、これは筋収縮運動を可能に
する。[0002] Troponin is known to be a myofibrillar protein complex consisting of three proteins, troponins I, T and C. This protein complex allows it to contribute to the regulation of muscle contraction by Ca 2+ ions by interacting with myosin and actin. More specifically, it is known that when an impulse reaches the level of the motor endplate, an action potential is generated, which is transmitted to the sarcoplasmic reticulum. Then, Ca 2+ is released into the cytosol and binds to troponin C. This results in an enhanced interaction between troponin I and troponin C, resulting in a change in the conformation of the troponin I, T, C complex. The actin-myosin interaction site is then opened, which allows muscle contraction.

【０００３】 筋肉が不可逆的に損傷されると（それが心筋梗塞後の心筋壊死の間の心筋であ
れ、持続的肉体努力の間の骨格筋であれ）、放出されたトロポニンが血流中に（
より迅速にまたはより迅速でなく）出現する。[0003] When muscle is irreversibly damaged (whether it is myocardium during myocardial necrosis after myocardial infarction or skeletal muscle during sustained physical exertion), released troponin enters the bloodstream. (
Appear more or less quickly).

【０００４】 従って、トロポニンのアッセイ（トロポニンＴのアッセイ（Circulation (199
1), 83, pp. 902-912）またはトロポニンＩのアッセイ（Am. Heart J. (1987),
110, pp.1333-1344およびMolecular Immunology (1992), 29(2), pp.271-278） のいずれか）は、近年、心筋梗塞の初期診断に推奨されている。同様に、心筋梗
塞後の血栓溶解療法の成功を評価するための心臓トロポニンＴのアッセイがBr.
Heart J., (1994), 71, pp. 242-248において、そして骨格筋に対する損傷を評 価するための骨格トロポニンＩのアッセイ（D. Rama et al., Clinical Chemist
ry (1996), 42 No. 12, p. 2033）が提唱されている。種々の心臓および骨格ト ロポニンのアッセイが、今日、種々のヒトおよび動物の病状の診断に非常に有用
な手段であることに留意するべきである。Accordingly, assays for troponin (Troponin T assay (Circulation (199
1), 83, pp. 902-912) or troponin I assay (Am. Heart J. (1987),
110, pp. 1333-1344 and Molecular Immunology (1992), 29 (2), pp. 271-278) have recently been recommended for early diagnosis of myocardial infarction. Similarly, an assay for cardiac troponin T to evaluate the success of thrombolytic therapy after myocardial infarction was described by Br.
Heart J., (1994), 71, pp. 242-248, and an assay for skeletal troponin I to assess damage to skeletal muscle (D. Rama et al., Clinical Chemist
ry (1996), 42 No. 12, p. 2033). It should be noted that various cardiac and skeletal troponin assays are very useful tools today for diagnosing various human and animal conditions.

【０００５】 種々の心臓トロポニンを評価するために、血液試料（血清、血漿または全血）
が通常使用される。しかし、この選択は使用する方法によって制限され得る。な
ぜなら、血清はトロポニン評価用の特定の方法（例えば、トロポニンＴの迅速な
評価のための方法）に不適切な生物学的試料であること、および全血は常に定量
的アッセイの実施を可能にすることが知られているからである。ヘパリン含有血
漿を用いて実施するイムノアッセイに関して、使用する方法の性能が非常に高い
場合でさえ、さほど信頼性が高くない結果がしばしば得られる。一般に、血漿中
のトロポニン濃度がさほど高くない場合に、この問題に遭遇する（P.O. Colliso
n et al., Ann. Clin. Biochem., (1995), 32, pp. 454-458）。実際、血液試料
中のヘパリンの存在は種々のイムノアッセイの間に干渉し得、従ってかなり最終
結果を、そしてそれによって医師の臨床診断を修飾し得ることが知られている。
現在、トロポニンのアッセイは重篤な疾患の診断またはモニターのために実施さ
れており、これには非常に正確な結果を得ることが必要とされる。その結果、ヘ
パリン含有材料（ヘパリン処理したチューブなど）の使用は、血液試料の採集お
よびイムノアッセイの実施の両方についてしばしば回避されるべきである。[0005] Blood samples (serum, plasma or whole blood) to evaluate various cardiac troponins
Is usually used. However, this choice can be limited by the method used. Because serum is a biological sample unsuitable for certain methods for troponin evaluation (eg, a method for rapid evaluation of troponin T), and whole blood always allows for the performance of quantitative assays Because it is known to do so. For immunoassays performed with heparin-containing plasma, less reliable results are often obtained, even if the performance of the method used is very high. Generally, this problem is encountered when plasma troponin levels are not very high (PO Colliso
n et al., Ann. Clin. Biochem., (1995), 32, pp. 454-458). Indeed, it is known that the presence of heparin in a blood sample can interfere during various immunoassays, and thus can significantly alter the end result, and thereby the physician's clinical diagnosis.
Currently, assays for troponin are performed for the diagnosis or monitoring of serious diseases, which require very accurate results. As a result, the use of heparin-containing materials (such as heparinized tubes) should often be avoided for both collecting blood samples and performing immunoassays.

【０００６】 さらに、血管形成術前または心筋梗塞後あるいは特定の心臓血管症状の処置の
間に、多量のヘパリンを患者に投与し、この処置はしばしば２４時間を越えて延
長される。投与される用量に依存して、投与の１時間後の血漿中のヘパリン濃度
は０．１〜２ＩＵ／ｍｌで変動し得る。患者の処置に起因する血液試料中のヘパ
リンの存在は、トロポニンのアッセイについて主な問題を構成する。In addition, large amounts of heparin are administered to patients prior to angioplasty or after a myocardial infarction or during the treatment of certain cardiovascular conditions, the treatment often being extended for more than 24 hours. Depending on the dose to be administered, the concentration of heparin in plasma 1 hour after administration can vary from 0.1 to 2 IU / ml. The presence of heparin in blood samples due to patient treatment constitutes a major problem for troponin assays.

【０００７】 ヘパリナーゼＩ、Ｌ−ヒスチジン、硫酸プロタミン、カチオン交換樹脂などの
ようなヘパリンを分解または捕獲し得る多数の製品が知られている。これらの製
品は生物学においてヘパリンのインヒビターとして一般に使用されている。しか
し、イムノアッセイの間のこれらの使用は常にヘパリンに起因する干渉の排除を
可能にするわけではなく、そしてしばしばイムノアッセイの間のその存在がさら
なる干渉を生じさせ得る（E.W. Nielsen et al., J. Immunological Methods, (
1994), 173, pp. 245-251）。[0007] Numerous products are known that can degrade or capture heparin, such as heparinase I, L-histidine, protamine sulfate, cation exchange resins and the like. These products are commonly used in biology as inhibitors of heparin. However, their use during immunoassays does not always allow for the elimination of interference due to heparin, and their presence during immunoassays can often cause further interference (EW Nielsen et al., J. et al. Immunological Methods, (
1994), 173, pp. 245-251).

【０００８】 種々のトロポニンのイムノアッセイの間のヘパリンに起因する干渉を回避する
ことが可能であることがここに見出された。本発明によって、ヘパリン処理され
たかまたはヘパリンを用いて処置された患者から得られた生物学的試料に対する
トロポニンのアッセイを、非常に高い精度で、血流中に見出される真の値を低下
させることなく実施することが可能となり、これは使用する免疫学的方法に依存
しない。[0008] It has now been found that it is possible to avoid interference due to heparin between various troponin immunoassays. According to the present invention, the assay of troponin on biological samples obtained from patients treated with heparin or treated with heparin, with very high precision, reduces the true value found in the bloodstream And this is independent of the immunological method used.

【０００９】 本発明は、より詳細には、ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心
臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の
形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔま
たはＣの免疫学的アッセイ法であって、免疫学的アッセイがヘキサジメトリンブ
ロミド（ポリブレン）の存在下で実施されることを特徴とする方法に関する。The invention more particularly relates to the formation of troponin I (heart or skeleton), T or C, and the form of dimer (IT, IC or TC) or trimer (ITC) in a heparin-containing biological sample. An immunoassay for troponin I, T or C combined in form with each other, wherein the immunological assay is performed in the presence of hexadimethrin bromide (polybrene).

【００１０】 トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、Ｉ
ＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合された
トロポニンＩ、ＴまたはＣのイムノアッセイの間に使用されるポリブレンの量は
使用するイムノアッセイに従って変動し得る。有利には、［使用ポリブレンのモ
ル濃度／分析しようとする試料中に存在するヘパリンのモル濃度］比は１〜１０
００であってもよい。アッセイに依存して、これはより詳細には、３０〜３００
、好ましくは６０〜１８０、あるいは１〜１０、好ましくは４〜１０のみであっ
てもよい。[0010] Troponin I (heart or skeleton), T or C, and dimers (IT, I
The amount of polybrene used during the troponin I, T or C immunoassay combined with each other in the form of (C or TC) or in the form of a trimer (ITC) can vary according to the immunoassay used. Advantageously, the ratio [molarity of polybrene used / molarity of heparin present in the sample to be analyzed] is between 1 and 10
00 may be used. Depending on the assay, this is more particularly between 30 and 300
, Preferably 60 to 180, or 1 to 10, preferably 4 to 10.

【００１１】 ポリブレンを、ヘパリンを含有しているかまたは含有している可能性のある生
物学的試料に直接添加してもよく、緩衝液、結合試薬溶液などのようなイムノア
ッセイ試薬の１つに添加してもよい。ポリブレンを、イムノアッセイの間に使用
する緩衝液に添加することが好ましい。緩衝液なる用語は、血漿試料と同時に存
在する、イムノアッセイの第１段階の間に使用されるいずれかの溶液を包含する
。洗浄溶液はこの用語から除外される。[0011] Polybrene may be added directly to a biological sample containing or possibly containing heparin and added to one of the immunoassay reagents, such as buffers, binding reagent solutions, and the like. May be. Preferably, polybrene is added to the buffer used during the immunoassay. The term buffer encompasses any solution used during the first stage of the immunoassay, which is present at the same time as the plasma sample. Wash solutions are excluded from this term.

【００１２】 本発明を、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー
（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組
み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの評価を可能にするいずれかの免疫学的方
法を用いて実施してもよい。The present invention relates to troponin I (heart or skeleton), T or C, and troponin I, T or C combined with each other in the form of a dimer (IT, IC or TC) or a trimer (ITC). It may be performed using any immunological method that allows for evaluation.

【００１３】 本発明によれば、生物学的試料中のトロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、Ｔま
たはＣ、あるいはそのダイマーまたはトリマーのアッセイを可能にし、ポリブレ
ンを使用してヘパリンに起因する干渉を排除する免疫酵素法が好ましい。これら
の方法の中で、サンドイッチ型の方法が好ましい。サンドイッチ型の方法を１以
上の段階（２段階、３段階など）で実施してもよく、この方法に２個以上のモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用してもよい。According to the present invention, it is possible to assay for troponin I (heart or skeleton), T or C, or a dimer or trimer thereof in a biological sample and to eliminate interference caused by heparin using polybrene The preferred immunoenzymatic method is preferred. Among these methods, a sandwich type method is preferable. The sandwich-type method may be performed in one or more steps (two steps, three steps, etc.), and two or more monoclonal or polyclonal antibodies may be used in the method.

【００１４】 トロポニンＩの測定を可能にする免疫酵素法は既に知られている。C. Larue e
t al.（Mol. Immunol. (1992), 29(2), pp. 271-278およびClin. Chem. (1993),
39/6, pp. 972-979）は、酵素的可視化のために色素原性基質であるテトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）−Ｈ2Ｏ2を使用する免疫酵素アッセイのサンドイッチ型
の方法を記載している。可視化の後、吸光度の読み取りを４５０ｎｍで実施する
。著者らによる検出限界は０．２μｇ／ｌである。この方法を使用するアッセイ
キットは市販されている（Sanofi Dioagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette,
France）。このキットの検出限界は０．０３〜０．０４μｇ／ｌのオーダーで ある（J. Mair et al., Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19-38）。[0014] Immunoenzymatic methods which allow the measurement of troponin I are already known. C. Larue e
t al. (Mol. Immunol. (1992), 29 (2), pp. 271-278 and Clin. Chem. (1993),
39/6, pp. 972-979) is described a method of the sandwich type immunoenzymatic assay using tetramethylbenzidine (TMB) -H 2 O 2 is a chromogenic substrate for the enzymatic visualizing I have. After visualization, an absorbance reading is performed at 450 nm. The detection limit by the authors is 0.2 μg / l. Assay kits using this method are commercially available (Sanofi Dioagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette,
France). The detection limit of this kit is on the order of 0.03-0.04 μg / l (J. Mair et al., Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19-38).

【００１５】 別のトロポニンＩ用免疫酵素法は、Bodor et al.によって記載されている。こ
の方法は、１．５〜３．１μｇ／ｌのオーダーの濃度のトロポニンＩの検出を可
能にする（Bodor et al., Clin. Chem. (1992), 38/11, pp. 2203-2214; Adams
J. et al., Circulation (1993), 88(1), pp. 101-106）。このアッセイは、酵 素的可視化のために、アルカリホスファターゼ用の色素原性基質であるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを使用し、測定は４０５ｎｍにおいて実施する。Another immunoenzymatic method for Troponin I has been described by Bodor et al. This method allows the detection of troponin I at concentrations on the order of 1.5 to 3.1 μg / l (Bodor et al., Clin. Chem. (1992), 38/11, pp. 2203-2214; Adams
J. et al., Circulation (1993), 88 (1), pp. 101-106). This assay uses p-nitrophenyl phosphate, a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, for enzymatic visualization and measurements are performed at 405 nm.

【００１６】 特許出願ＷＯ ９６／２２５３５も、心臓トロポニンＩの定量的アッセイを可
能にするサンドイッチ型免疫酵素アッセイ法を記載している。この方法は、酵素
的可視化のために、ジアシルヒドラジンの誘導体から選択される化学ルミネセン
ス性基質、すなわち１，２−ジオキセタンの誘導体を使用し、手動システム（診
断アッセイキット）または自動化システムのいずれかによって実施し得る。この
実施態様によれば、１段階アッセイまたは２段階アッセイのいずれかを実施する
ことが可能である。The patent application WO 96/22535 also describes a sandwich-type immunoenzymatic assay which allows a quantitative assay for cardiac troponin I. This method uses a chemiluminescent substrate selected from derivatives of diacyl hydrazine, ie, a derivative of 1,2-dioxetane, for enzymatic visualization, and either a manual system (diagnostic assay kit) or an automated system Can be implemented. According to this embodiment, it is possible to perform either a one-step assay or a two-step assay.

【００１７】 トロポニンＩの自動化定量的アッセイに使用され、Dade Diagnostics, Munich
, Germanyによって販売されている免疫酵素法も知られている（L.P. Kuhr et al
., Eur. J. Chem. Clin. Biochem. (1997), 35(5), p.399-404）。Used for automated quantitative assays of troponin I, Dade Diagnostics, Munich
Also known is the immunoenzymatic method marketed by Dr., Germany (LP Kuhr et al.
., Eur. J. Chem. Clin. Biochem. (1997), 35 (5), p.399-404).

【００１８】 トロポニンＴの免疫酵素アッセイを可能にするキットも市販されている。これ
はBoehringer Mannheim, Mannheim, Germanyによって販売されているキット「Tr
oponin T / ES 300 Analyzer」である（N. Genser et al., Clin. Chem. Acta (
1997), 265, pp. 207-217; H. Baum et al., Clin. Chem. (1997), 43/10, p. 1
877-1977）。[0018] Kits that enable immunoenzymatic assays for troponin T are also commercially available. This is the kit “Tr” sold by Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany.
oponin T / ES 300 Analyzer ”(N. Genser et al., Clin. Chem. Acta (
1997), 265, pp. 207-217; H. Baum et al., Clin. Chem. (1997), 43/10, p. 1
877-1977).

【００１９】 特許出願ＷＯ ９６／３３４１５も、生物学的媒質中のトロポニンＩおよびＴ
、またはトロポニンＩ、Ｃおよび／もしくはＴの複合体の量の評価を可能にする
サンドイッチ型イムノアッセイ法を記載している。Patent application WO 96/33415 also discloses troponins I and T in biological media.
Or a sandwich-type immunoassay that allows the assessment of the amount of a complex of troponin I, C and / or T.

【００２０】 骨格トロポニンＩの免疫酵素アッセイのための方法は、Rama et al., Clin. C
hem, (1996), 42 No. 2, p. 2033によって記載されている。Methods for immunoenzymatic assays for skeletal troponin I are described in Rama et al., Clin.
hem, (1996), 42 No. 2, p. 2033.

【００２１】 上記で引用した、個々の、ダイマーのまたはトリマーのタンパク質としてのト
ロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣの評価のための免疫酵素法は例と
して挙げたものであり、当業者に公知のトロポニン用免疫酵素法の網羅的なリス
トを構成するものではない。The above-cited immunoenzymatic methods for the evaluation of troponin I (heart or skeleton), T or C as individual, dimeric or trimeric proteins are given by way of example and It does not constitute an exhaustive list of known immunoenzymatic methods for troponin.

【００２２】 本発明による方法は上記のようにいずれの型のトロポニン用免疫学的方法にも
適用することができる。The method according to the invention can be applied to any type of immunological method for troponin as described above.

【００２３】 例えば、本発明による方法は、イムノアッセイ（例えば、C. Larue et al., L
'information cardiologique (1991) Vol. XV No. 1, pp. 17-21によって記載さ
れるような）および蛍光イムノアッセイ（L. Bellanger et al., Clin. Chem. (
1997), Vol. 43 No. 6, p. S159, No. 240）の間に適用してもよい。For example, the method according to the invention can be used for immunoassays (for example C. Larue et al., L.
'information cardiologique (1991) Vol. XV No. 1, pp. 17-21) and a fluorescent immunoassay (L. Bellanger et al., Clin. Chem.
1997), Vol. 43 No. 6, p. S159, No. 240).

【００２４】 ヘパリンに起因する干渉を回避するための、トロポニンＩ（心臓もしくは骨格
）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）の形態またはトリ
マー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学
的アッセイの間のポリブレンの使用は本発明の一部を形成する。Combined with each other in the form of troponin I (heart or skeleton), T or C, and dimer (IT, IC or TC) or trimer (ITC) to avoid interference caused by heparin The use of polybrene during a troponin I, T or C immunoassay forms part of the invention.

【００２５】 本発明はまた、イムノアッセイ試薬の中にポリブレンを含む、トロポニンＩ（
心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー（ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣ）
の形態またはトリマー（ＩＴＣ）の形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔ
またはＣのイムノアッセイ用キットに関する。The present invention also provides troponin I (including polybrene in immunoassay reagents).
Heart or skeleton), T or C, and dimer (IT, IC or TC)
I, T combined with each other in the form of
Or a kit for immunoassay of C.

【００２６】 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限
定するものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but these examples do not limit the present invention.

【００２７】 実施例Ｉ ヘパリン過負荷血清および血漿を使用した心臓トロポニンＩのアッセイ −
種々のヘパリンインヒビターでの試料の処理 トロポニンＩを含有している可能性のあるヒト血清にヘパリンを過負荷させ、
ヘパリンなしの血清の一部をコントロールとして貯蔵し、同時にアッセイした。
種々のヘパリンインヒビター（ヘパリンリチウム）、特に、ヘパリナーゼＩ（フ
ラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来ヘパリナーゼ
Ｉ、Sigma ref. H 2519）、Ｌ−ヒスチジン（Sigma ref. H 8000）、硫酸プロタ
ミン（サケ由来硫酸プロタミン グレードＸ、Sigma ref. P 4020）、アンチト ロンビンＩＩＩ（ヒト血漿由来アンチトロンビンＩＩＩ、Sigma ref. A 7388） 、カチオン交換樹脂ＱＳＦＦ（Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref
. 17051001）およびＤＥＡＥ（DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech
ref. 17070901）を試験した。Example I Assay of Cardiac Troponin I Using Heparin Overloaded Serum and Plasma
Treating the sample with various heparin inhibitors Overloading human serum, which may contain troponin I, with heparin,
A portion of serum without heparin was stored as a control and assayed at the same time.
Various heparin inhibitors (lithium heparin), in particular, heparinase I (heparinase I derived from Flavobacterium heparinum, Sigma ref. H 2519), L-histidine (Sigma ref. H 8000), protamine sulfate (derived from salmon) Protamine sulfate grade X, Sigma ref. P 4020), antithrombin III (human plasma-derived antithrombin III, Sigma ref. A 7388), cation exchange resin QSFF (Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech ref.)
17051001) and DEAE (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech)
ref. 17070901).

【００２８】 免疫酵素アッセイに使用した自動化システムはBeckmanによって販売されてい るシステムであるAccessRイムノアッセイシステムである。使用キットは同社か ら販売されているAccess-Troponin Iキットである。The automated system used for the immunoenzymatic assay is the Access R immunoassay system, a system sold by Beckman. The kit used is the Access-Troponin I kit sold by the company.

【００２９】 アッセイを以下のように実施する： アッセイしようとする試料５０μｌ、４ｍｇ／ｍｌのマウス免疫グロブリン溶
液２５μｌ、ヘパリンインヒビターを含有する０．１Ｍコハク酸溶液１０μｌお
よび８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−アルカリホスファタ
ーゼ結合体（濃度：５μｇ／ｍｌ）５０μｌをアッセイウェルに導入する。The assay is performed as follows: 50 μl of the sample to be assayed, 25 μl of a 4 mg / ml mouse immunoglobulin solution, 10 μl of a 0.1 M succinic acid solution containing heparin inhibitor and an 8E1 mouse anti-cardiac troponin I monoclonal antibody Introduce 50 μl of alkaline phosphatase conjugate (concentration: 5 μg / ml) into the assay wells.

【００３０】 ５分間３７℃でインキュベートした後、１１Ｅ１２マウス抗心臓トロポニンＩ
モノクローナル抗体を共有結合させた５μｌの鉄ラテックスビーズ（Rhone Poul
enc ref. MI-070/60）をそこに導入する。After 5 minutes incubation at 37 ° C., 11E12 mouse anti-cardiac troponin I
5 μl of iron latex beads (Rhone Poul
enc ref. MI-070 / 60) is introduced there.

【００３１】 ８Ｅ１および１１Ｅ１２マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体はTrop
onin Iキットの一部である。The 8E1 and 11E12 mouse anti-cardiac troponin I monoclonal antibodies were
Part of the onin I kit.

【００３２】 混合物を３６秒間３７℃でインキュベートし、次いで鉄ラテックスビーズを磁
場を利用して分離する。トリス緩衝液（ｐＨ８）を用いて洗浄を実施し、次いで
２００μｌのLumi-PhosR 530基質を添加する。この基質はまた、Access-Troponi
n Iキットの一部である。The mixture is incubated at 37 ° C. for 36 seconds, then the iron latex beads are separated using a magnetic field. Washing is performed with Tris buffer (pH 8), then 200 μl of Lumi-Phos R 530 substrate is added. This substrate is also Access-Troponi
Part of the nI kit.

【００３３】 可視化を３７℃で実施し、反応によって生成したルミネセンスをルミノメータ
ーを用いて測定する。Visualization is performed at 37 ° C., and the luminescence generated by the reaction is measured using a luminometer.

【００３４】 分析の総時間は１５分間である。The total time of the analysis is 15 minutes.

【００３５】 較正系列用に、ヒト心臓トロポニンＩの溶液を使用する。For the calibration series, a solution of human cardiac troponin I is used.

【００３６】 ０〜５０μｇ／ｌの濃度に対応する較正系列を調製する。A calibration series corresponding to a concentration of 0 to 50 μg / l is prepared.

【００３７】 この研究の結果を以下の表Ｉ〜ＶＩに示す。The results of this study are shown in Tables I-VI below.

【００３８】[0038]

【表１】 [Table 1]

【００３９】[0039]

【表２】 [Table 2]

【００４０】[0040]

【表３】 [Table 3]

【００４１】[0041]

【表４】 [Table 4]

【００４２】[0042]

【表５】 [Table 5]

【００４３】[0043]

【表６】 [Table 6]

【００４４】 この研究の結果は、使用したヘパリンインヒビターもカチオン交換樹脂もヘパ
リンに起因する干渉の阻害を可能にしないことを実証する。さらに、硫酸プロタ
ミンＩはバックグラウンドノイズの実質的な増加を引き起こすことが観察された
（表ＩＩＩにおいて言及していない結果）。The results of this study demonstrate that neither the heparin inhibitor nor the cation exchange resin used allows for the inhibition of heparin-induced interference. Furthermore, it was observed that protamine I sulfate caused a substantial increase in background noise (results not mentioned in Table III).

【００４５】 実施例ＩＩ ヘパリンに起因する干渉を回避するためにポリブレンを使用した免疫酵素キッ
トを用いた心臓トロポニンＩのアッセイ イムノアッセイに、Troponin I Pasteurキット（Sanofi Diagnostics Pasteur
, Marnes-la-Coquette, France）を使用した。アッセイを以下のように実施する
： ポリブレンを含み、０．２％のTweenR 20、非特異的マウス免疫グロブリンお よび０．１％のKathonRを含有するコハク酸緩衝液１５０μｌ、１１Ｅ１２マウ ス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−ペルオキシダーゼ結合体５０μｌ、
ならびにアッセイしようとする試料または較正系列に使用する標準溶液２００μ
ｌを、８Ｅ１マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体でコートしたポリス
チレンチューブ中に導入する。Example II Assay of Cardiac Troponin I Using an Immunoenzyme Kit Using Polybrene to Avoid Heparin-Induced Interference The immunoassay includes the Troponin I Pasteur kit (Sanofi Diagnostics Pasteur).
, Marnes-la-Coquette, France). The assay is performed as follows: 150 μl succinate buffer containing polybrene and 0.2% Tween R 20, non-specific mouse immunoglobulin and 0.1% Kathon R , 11E12 mouse anti- 50 μl of cardiac troponin I monoclonal antibody-peroxidase conjugate,
And 200 μl of the standard solution used for the sample to be assayed or the calibration series
1 is introduced into a polystyrene tube coated with 8E1 mouse anti-cardiac troponin I monoclonal antibody.

【００４６】 較正系列用に、０〜１．７４μｇ／ｌの精製ヒト心臓トロポニンＩを含有する
ヒト血清を使用する。For the calibration series, human serum containing 0 to 1.74 μg / l of purified human cardiac troponin I is used.

【００４７】 混合物を正確に１５分間水平に振とうしながら室温でインキュベートし、次い
でチューブを以下のように洗浄する： − チューブの内容物を容器に注ぎ、チューブを吸収性ペーパーでぬぐう、 − ０．１％のTweenR 20および０．３％のKathonを含有する０．１Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ６．８）１ｍｌを添加することによって洗浄を実施し、その間、洗浄
溶液の温度を８℃以下に維持する。 この工程を４回反復する。Incubate the mixture at room temperature with horizontal shaking for exactly 15 minutes, then wash the tube as follows:-Pour the contents of the tube into a container and wipe the tube with absorbent paper;-0 .1% of Tween R 20 and 0.3% of 0.1M phosphate buffer solution containing Kathon a (pH 6.8) 1 ml of washing was carried out by adding, during which the temperature of the wash solution 8 ° C. or less To maintain. This step is repeated four times.

【００４８】 洗浄を実施、いかなる微量の洗浄に使用した溶液も除去した後、テトラメチル
ベンジジン１部ならびに４％のＤＭＳＯおよび０．０３％の過酸化水素を含有す
るクエン酸緩衝液１００部からなる混合物６００μｌを使用して酵素的可視化を
実施する。After performing the washing and removing any traces of the solution used for washing, consist of 1 part of tetramethylbenzidine and 100 parts of citrate buffer containing 4% of DMSO and 0.03% of hydrogen peroxide. Enzymatic visualization is performed using 600 μl of the mixture.

【００４９】 混合物を室温、暗所に１５分間放置し、λ＝４５０ｎｍにおける吸光度を測定
する。The mixture is left in the dark at room temperature for 15 minutes and the absorbance at λ = 450 nm is measured.

【００５０】 この研究の結果を表ＶＩＩに示す。The results of this study are shown in Table VII.

【００５１】[0051]

【表７】 [Table 7]

【００５２】 表ＶＩＩの結果は、ポリブレンがヘパリンに起因する干渉の回避を可能にする
ことを実証する。Troponin I Pasteuryキット（Sanofi Diagnostics Pasteur, M
arnes-la-Coquette, France）を用いてトロポニンＩのアッセイを実施する場合 、試料中に存在するヘパリンのモル濃度より１０倍高いモル濃度が必要である。The results in Table VII demonstrate that polybrene enables the avoidance of interference caused by heparin. Troponin I Pasteury kit (Sanofi Diagnostics Pasteur, M
When performing an assay for troponin I using arnes-la-Coquette, France), a molar concentration of 10 times higher than the molar concentration of heparin present in the sample is required.

【００５３】 実施例ＩＩＩ 自動化システムを用いた心臓トロポニンＩのアッセイ 免疫酵素アッセイに使用する自動化システムはBeckmanから販売されているAcc
essRイムノアッセイシステムである。イムノアッセイ法は実施例Ｉに記載のもの
である。Example III Assay of Cardiac Troponin I Using an Automated System The automated system used for the immunoenzymatic assay is an Acc marketed by Beckman.
The ess R immunoassay system. The immunoassay is as described in Example I.

【００５４】 ヘパリンを含有する５人の患者由来の血漿を分析した。この研究の結果を表Ｖ
ＩＩＩに示す。トロポニンＩのアッセイについて上記した自動化システムを使用
した場合、試料中に存在するヘパリン１モル当り６０〜１２０モルのポリブレン
を使用することが必要であることがこの研究から明らかである。[0054] Plasma from five patients containing heparin was analyzed. Table V shows the results of this study.
Shown in III. It is clear from this study that when using the automated system described above for the troponin I assay, it is necessary to use 60-120 moles of polybrene per mole of heparin present in the sample.

【００５５】[0055]

【表８】 [Table 8]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モーリス・プティトゥ フランス、エフ−75645パリ・セデックス 13、リュ・デュ・ジャヴロ65番 (72)発明者 シルヴィ・マリ−フランス・トランキエ フランス、エフ−69003リヨン、リュ・デ ュ・プロフェサー・フロランス６番 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 CA25 CB26 DA36 DA77 FB01 FB03 FB07 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Maurice Petite France, F-75645 Paris Cedex 13, Rue du Javro 65th (72) Inventor Silvi Mari-France Tranquier France, F-69003 Lyon , Ryu deux florencer No.6 F term (reference) 2G045 AA13 AA25 CA25 CB26 DA36 DA77 FB01 FB03 FB07

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヘパリン含有生物学的試料中の、トロポニンＩ（心臓もしく
は骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはト
リマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学的
アッセイ法であって、該免疫学的アッセイがポリブレンの存在下で実施されるこ
とを特徴とする方法。1. Troponin I (heart or skeleton), T or C, and troponin I, T combined with one another in the form of dimeric IT, IC or TC or trimeric ITC in a heparin-containing biological sample. Or the immunological assay of C, wherein said immunological assay is performed in the presence of polybrene. 【請求項２】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が１〜１０００であることを特徴とする、請
求項１記載のトロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマー
ＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合され
たトロポニンＩ、ＴまたはＣの免疫学的アッセイ法。2. The troponin I (heart or skeleton) according to claim 1, wherein the ratio [molarity of polybrene used / molarity of heparin present in the sample to be assayed] is 1 to 1000. ), T or C, and troponin I, T or C immunoassays combined with each other in the form of dimeric IT, IC or TC or in the form of trimeric ITC. 【請求項３】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が１〜１０、好ましくは４〜１０であること
を特徴とする、請求項１または２記載の免疫学的アッセイ法。3. The method according to claim 1, wherein the ratio [molarity of polybrene used / molarity of heparin present in the sample to be assayed] is 1 to 10, preferably 4 to 10. The immunoassay described. 【請求項４】 ［使用ポリブレンのモル濃度／アッセイしようとする試料中
に存在するヘパリンのモル濃度］比が３０〜３００、好ましくは６０〜１８０で
あることを特徴とする、請求項１または２記載の免疫学的アッセイ法。4. The method according to claim 1, wherein the ratio [molarity of polybrene used / molarity of heparin present in the sample to be assayed] is 30 to 300, preferably 60 to 180. The immunoassay described. 【請求項５】 免疫学的アッセイの第１段階の間にポリブレンが使用溶液に
添加されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein polybrene is added to the use solution during the first stage of the immunological assay. 【請求項６】 トロポニンＩ（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダ
イマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み
合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣのアッセイが免疫酵素法である、請求項１〜
５のいずれか１項記載の方法。6. An assay for troponin I (heart or skeleton), T or C, and troponin I, T or C combined with each other in the form of dimeric IT, IC or TC or in the form of trimeric ITC, by immunoenzymatic assays. There is Claim 1
6. The method according to claim 5. 【請求項７】 免疫酵素法がサンドイッチ型であることを特徴とする請求項
１〜６のいずれか１項記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the immunoenzymatic method is a sandwich type. 【請求項８】 ヘパリンに起因する干渉を回避するための、トロポニンＩ（
心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの形
態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、ＴまたはＣ
の免疫学的アッセイの間のポリブレンの使用。8. A method for preventing troponin I (to avoid interference caused by heparin).
Heart or skeleton), T or C and troponin I, T or C combined with each other in the form of dimeric IT, IC or TC or in the form of trimeric ITC
Use of polybrene during immunoassays in the US. 【請求項９】 イムノアッセイ試薬の中にポリブレンを含む、トロポニンＩ
（心臓もしくは骨格）、ＴまたはＣ、およびダイマーＩＴ、ＩＣもしくはＴＣの
形態またはトリマーＩＴＣの形態で互いに組み合されたトロポニンＩ、Ｔまたは
Ｃのイムノアッセイ用キット。9. A troponin I comprising polybrene in an immunoassay reagent.
Kit for immunoassay of troponin I, T or C combined with each other in the form of (heart or skeleton), T or C, and dimeric IT, IC or TC or trimeric ITC.
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