JP2002502421A - 血栓障害の処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、発作、静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、血管形成術またはステント配置後の急性閉鎖、および末梢血管手術の結果としての血栓症を含むがこれらに限られない様々な血栓障害を有する患者を処置する方法を提供する。この処置は、アスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレル、

Description

【発明の詳細な説明】 血栓障害の処置方法 本発明は、医科学の分野、特に抗血小板剤と組み合せた活性化ヒトプロテイン Ｃによる血栓障害の処置に関する。 プロテインＣは、セリンプロテアーゼであり、凝固カスケードにおいてＶａ因 子およびＶＩＩＩａ因子を不活化することで止血の調節において役割を担う天然 に存在する抗凝固物質である。ヒトプロテインＣは、２鎖チモーゲン（２-chain zymogen)として循環し、これがin vivoでトロンビンとリン脂質表面上のトロン ボモジュリンにより活性化され、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を生じる。 血液凝固は、プロ凝固機構と抗凝固機構との間のバランスによって調節される 非常に複雑な過程である。このバランスが、正常な止血の状態か、または発作、 心筋梗塞および静脈血栓症などの現象につながる異常な病的な血栓形成の状態か の、いずれかを決定する。フィブリンの生成と、血小板の活性化とその後の凝集 という、２つの主要な因子がこのバランスを制御している。両方の過程を制御す る決定的な因子は、酵素トロンビンの生成であり、それによって凝固カスケード のそれ以降の活性化が起きる。トロンビンは、血小板を凝集し、循環しているフ ィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変換するプロ凝固酵素であり、血餅の形 成をもたらす。トロンビンはまた、プロテインＣチモーゲンを活性化プロテイン Ｃに活性化し、今度は活性化プロテインＣがトロンビンの生成を阻害するので、 強力な抗凝固物質として機能する。したがって、トロンビン生成のフィードバッ ク調節を通じて、ａＰＣは、恐らく血栓症に対する保護をもたらす血液凝固の最 も重要な下方調節物質として機能する。 止血の制御におけるプロテインＣの重要な役割は、ヘテロ接合欠損症、プロテ インＣ耐性（例えば、共通Ｖ因子ライデン変異に起因する）および未処置のホモ 接合プロテインＣ欠損症の致命的結末における、血栓形成の速度の増加によって 典型的に示される。ヒトの活性化プロテインＣは、血漿由来のものと組換え体の いずれも、静脈血栓症と動脈血栓症の両方の様々な動物モデルにおいて、有効で 安全な抗血栓剤であることが証明されている。 現在の臨床的実施においては、血栓疾患の予防と処置の両方における効力に関 して、例えばアスピリン（ＡＳＡ）を使用する血小板阻害がよく報告されている 。さらに、心筋梗塞や発作などの状態においては、血小板阻害は治療の標準とな っている。しかし、ＡＳＡのような抗血小板剤の使用は、出血の危険性を高め、 薬剤の投与量と処置の継続時間を制限する。フィブリン形成におけるトロンビン の効果をブロックするために、ヘパリンは、応急処置の状況における標準的な抗 凝固剤として今も存在している。しかしながら、ヘパリンは治療指数が狭く、特 に抗血小板剤と組み合せると、相当の出血の危険性を伴う。 アスピリンと合成トロンビン阻害剤、組織プラスミノーゲン活性化因子、また はモノクローナル抗血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体による組み合せ治 療が、イヌ冠状動脈血栓症モデルにおいて研究されてきた[Yasudaら，J．Am．Co ll．Cardiol.，16:714-22(1990)]。これら試薬と組み合せたアスピリンは、出血 時間を遅延したが、冠状動脈の再閉塞は阻止しなかった。さらに、ａＰＣと、組 織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、またはストレプトキナーゼなど の血栓溶解剤について、組み合せ治療が提案された［Griffinら，米国特許第５ ，３５０，５７８号］。しかし、これらの組み合せが成功することは証明されて いない。したがって、血栓障害を処置するための有効な治療法を同定する必要性 が今なお存在している。 本発明は、血栓症の処置におけるａＰＣと抗血小板剤との組み合せを初めて記 載するものである。したがって、本発明は、血栓障害の処置のための、抗血小板 剤と組み合せたａＰＣの使用を提供する。この組み合せ治療は、発作、心筋梗塞 、不安定狭心症、血管形成術またはステント配置後の急性閉鎖、および末梢血管 手術の結果としての血栓症を含むがこれらに限られない、様々な血栓障害におい て増大した効力をもたらす。さらに、ａＰＣと抗血小板剤の組み合せは、ａＰＣ と抗血小板剤の両方の投与量の減少を可能にし得る相乗作用をもたらす。組み合 せ治療における薬剤の投与量の減少は、今度は、組み合せ抗凝固／抗血小板治療 においてよく観察される出血傾向の増大といった副作用の減少をもたらす。 本発明は、その処置を必要とする患者における血栓障害を処置する方法であっ て、該患者に薬学的有効量の活性化プロテインＣを抗血小板剤と組み合せて投与 することを含む方法を提供する。さらに、本発明は、その処置を必要とする患者 における血栓障害を処置する方法であって、該患者に、薬学的有効量の抗血小板 剤と活性化プロテインＣを、活性化プロテインＣの血漿レベルが１０ｎｇ／ｍＬ 〜１００ｎｇ／ｍＬ未満に達するように投与することを含む方法を提供する。 ここで開示し特許請求される本発明の意図に関して、次の用語を以下とおり定 義する。 ａＰＣまたは活性化プロテインＣは、組換え体かまたは血漿由来のものである 。ａＰＣにはヒトプロテインＣが含まれ、好ましくはヒトプロテインＣであるが 、ａＰＣには他の種由来のものまたはプロテインＣタンパク質分解活性、アミド 分解活性、エステル分解活性および生物学的活性（抗凝固活性またはプロフィブ リン分解活性）を有する誘導体も含まれ得る。プロテインＣ誘導体の例は、本明 細書の一部を構成するGerlitzら，米国特許第５，４５３，３７３号およびFoste rら，米国特許第５，５１６，６５０号に記載されている。 ＡＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間 ＨＰＣ：ヒトプロテインＣチモーゲン ｒ-ｈＰＣ：原核細胞、真核細胞またはトランスジェニック動物において産生 した組換えヒトプロテインＣチモーゲン。 ｒ-ａＰＣ：in vitroのｒ-ｈＰＣの活性化により、または原核細胞、真核細胞 もしくはトランスジェニック動物に由来するプロテインＣの活性化形態の直接の 分泌により産生した、組換えヒト活性化プロテインＣ［Cottingham,ＷＯ９７／ ２００４３］であって、例えば、チモーゲンとしてヒト腎２９３細胞から分泌し た後精製され、本明細書の一部を構成するYanら，米国特許第４，９８１，９５ ２号に示されている当業者によく知られた技術によって活性化されたものが含ま れる。 チモーゲン：分泌した、不活性な形態の、１本鎖または２本鎖のプロテインＣ を意味する。 抗血小板剤−血小板の凝集能力を減じる、１またはそれ以上の、単独または組 み合せ形態の薬剤。当分野で理解され、認識されている薬剤には、例えば、本明 細書の一部を構成するRemington，The Science and Practice of Pharmacy，第 １９版，Vol II，Pages 924-25，Mack Publishing Co.，において引用されてい るものが含まれる。そのような薬剤には、アスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレ ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが含まれるがこれらに限られない。 処置：疾患、状態または障害と闘うことを目的とした、患者の管理と世話を表 現し、症状もしくは合併症の発生を阻止し、症状もしくは合併症を軽減し、また は疾患、状態もしくは障害を取り除くための本発明の化合物の投与を含む。 継続点滴：特定の時間の間、溶液の静脈内への導入を実質的に連続して継続す ること。 ボーラスインジェクション：約１２０分間までの間にわたる、決められた量（ ボーラスと呼ばれる）での薬物の注入。 薬学的有効量：哺乳類における血栓障害を阻害することが可能な、本発明の化 合物の量を示す。本発明にしたがって投与する化合物の具体的な投与量は、勿論 、投与する化合物、処置する特定の状態、および同様の考慮すべき事柄を含む、 その症例を取り巻く特定の状況を評価する主治医によって決定される。 血栓障害：血管内の血餅の形成または存在に関連する、またはそれにより影響 を及ぼされる障害。血栓障害には、発作、心筋梗塞、不安定狭心症、血管形成術 またはステント配置後の急性閉鎖、および末梢血管手術の結果としての血栓症が 含まれるがこれらに限られない。 本発明は、好ましくは、抗血小板剤と組み合せた活性化プロテインＣによる血 栓障害の処置に関する。そのような組み合せにおいて使用されるａＰＣは、既知 の方法にしたがって製剤化して、薬学的に有用な組成物を製造することができる 。ａＰＣを、適当な投与量を約２４時間〜約１４４時間にわたる継続点滴として 注入することにより、非経口的に投与して有効な形態でのａＰＣの血流内への送 達を確実にする。 抗血小板剤による処置に関して、投与するａＰＣの量は、約４ｍｇ／７０ｋｇ ／２４時間〜１６０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０ ．１ｍｇ／ｍ²〜４ｍｇ／ｍ²もしくは２μｇ／ｋｇ／時間〜９６μｇ／ｋｇ／時 間 である。より好ましくは、投与するａＰＣの量は、約４ｍｇ／７０ｋｇ／２４時 間〜１２０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０．１ｍｇ ／ｍ²〜３ｍｇ／ｍ²もしくは２.４μｇ／ｋｇ／時間〜７２μｇ／ｋｇ／時間で ある。投与するａＰＣのさらに好ましい量は、約４ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間〜 ８０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０．１ｍｇ／ｍ² 〜２ｍｇ／ｍ²もしくは２.４μｇ／ｋｇ／時間〜４８μｇ／ｋｇ／時間である。 さらに好ましくは、投与するａＰＣの量は、約４ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間〜６ ０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０.１ｍｇ／ｍ²〜１ .５ｍｇ／ｍ²もしくは２.４μｇ／ｋｇ／時間〜３６μｇ／ｋｇ／時間である。 さらに好ましくは、投与するａＰＣの量は、約１０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間〜 ５０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０.２５ｍｇ／ｍ² 〜１.２５ｍｇ／ｍ²もしくは６μｇ／ｋｇ／時間〜３０μｇ／ｋｇ／時間である 。さらに好ましくは、投与するａＰＣの量は、約２０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間 〜４０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あるいは等価な表示である０.５ｍｇ／ｍ² 〜１.０ｍｇ／ｍ²もしくは１２μｇ／ｋｇ／時間〜２４μｇ／ｋｇ／時間である 。投与するａＰＣの最も好ましい量は、約４０ｍｇ／７０ｋｇ／２４時間か、あ るいは等価な表示である１．０ｍｇ／ｍ²もしくは２４μｇ／ｋｇ／時間である 。抗血小板治療剤とともに投与する適当なａＰＣの投与量は、改善された効力ま たはいずれか一方のまたはその両方の薬剤の投与量の減少をもたらす。 投与するａＰＣの量から得られる血漿範囲は、２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍ Ｌ未満である。好ましい血漿範囲は、約２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬである 。最も好ましい血漿範囲は、約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍＬさらにより好 ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。 別法として、ａＰＣを、１時間あたり適当な投与量の３分の１をボーラスイン ジェクションとして注入し、次いで１時間投与量の残り３分の２を継続点滴とし て１時間投与し、次いで、２４時間で投与される適当な投与量をもたらす適当な 投与量を２３時間継続点滴することにより投与する。 「〜と組み合せて」なる語は、抗血小板剤をａＰＣとともに、同時または逐次 的な投与のいずれか、またはその組み合せを意味する。ａＰＣと組み合せた血小 板阻害剤の投与は、発作、静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、血管形成術ま たはステント配置後の急性閉鎖、および末梢血管手術の結果としての血栓を含む がこれらに限られない様々な血栓障害において増大した効力をもたらす。さらに 、相乗作用によって、組み合せ抗凝固剤／抗血小板治療においてよく観察される 出血傾向の増大といった副作用を減少する薬剤の投与量を減らす能力が、組み合 せ治療においてもたらされる。 用いられる抗血小板剤および適当な投与量レベルは、当分野において理解され 、認識されている。当業者は、血栓障害を処置するための薬学的有効量を達成す るため、各々の抗血小板剤について使用する適当な投与量レベルを認識する。本 発明の下、使用するに適当な抗血小板剤には、臨床的に認識されており、商業的 に入手可能な薬剤、例えばアスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレル、ＲｅｏＰｒ ｏ アンタゴニストなどが含まれるがこれらに限られない。ａＰＣと組み合せて投与 する抗血小板剤アスピリン（ＡＳＡ）の量は、約１０ｍｇ〜１０００ｍｇであり 、１日１回投与する。ａＰＣと組み合せて投与する抗血小板剤チクロピジンの量 は、約５０ｍｇ〜１２５０ｍｇであり、１日２回投与する（Ｂ.Ｉ.Ｄ.）。ａＰ Ｃと組み合せて投与する抗血小板剤ジピリダモールの量は、約１５ｍｇ〜５００ ｍｇであり、１日４回投与する。ａＰＣと組み合せて投与する抗血小板剤クロピ ドグレルの量は、約４０ｍｇ〜１０００ｍｇであり、１日１回投与する。ａＰＣ と組み合せ ｇ／ｋｇ／分〜１μｇ／ｋｇ／分であり、１２時間の点滴として投与する。別法 と にてボーラスインジェクションとして投与することができる。さらに、ＲｅｏＰ ２時間の点滴として投与することができる。ａＰＣと組み合せて使用するＩＩｂ ／ＩＩＩａアンタゴニストの量は、用いる具体的な薬剤に依存して約０.１ｍｇ ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである（例えば、本明細書の一部を構成するFisher ら，米国特許第５，６１８，８４３号を参照）。当業者は、薬学的有効量を達成 するために使用するための適当な投与量レベルを決定することができる。 抗血小板剤と組み合せたａＰＣは、抗血小板剤単独の抗血栓効果を改善する。 したがって、この組み合せ治療は、ａＰＣの治療投与量を減らすことができると 同時に、血栓症の治療的処置に必要な抗血小板剤の投与量を減らすことができ、 それによって、抗血小板剤の高投与量による、出血傾向、毒性および一般的な副 作用といった合併症を回避することができる。 製造例１ ヒトプロテインＣの製造 組換えヒトプロテインＣ（ｒＨＰＣ）は、本明細書の一部を構成するYan，米 国特許第４，９８１，９５２号に記載されているような当業者によく知られた技 術により、ヒト腎２９３細胞において製造した。ヒトプロテインＣをコードして いる遺伝子は、本明細書の一部を構成するBangら，米国特許第４，７７５，６２ ４号に開示され、クレームされている。２９３細胞中でヒトプロテインＣを発現 させるために用いるプラスミドは、本明細書の一部を構成するBangら，米国特許 第４，９９２，３７３号に開示されているプラスミドｐＬＰＣであった。プラス ミドｐＬＰＣの構築は、本明細書の一部を構成する欧州特許公開公報第０４４５ ９３９号、およびGrinnellら，1987，Bio/Technology 5:1189-1192にも記載され ている。簡単には、プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、次いで、安 定な形質転換体を同定し、継代培養し、無血清培地で増殖させる。発酵後、精密 ろ過により無細胞培地を得た。 本明細書の一部を構成するYan，米国特許第４，９８１，９５２号の技術を適 合させることにより、培養液からヒトプロテインＣを分離した。不純物を除いた 培地をＥＤＴＡ中４ｍＭとし、次いで、陰イオン交換樹脂（Fast-Flow Q，Pharm acia）に吸着させた。４カラム容量の２０mMトリス、２００mM NaCl（ｐＨ７.４ ）、および２カラム容量の２０mMトリス、１５０mM NaCl（ｐＨ７.４）で洗浄し 、次いで、結合した組換えヒトプロテインＣチモーゲンを２０mMトリス、１５０ mM NaCl、１０mM CaCl₂（ｐＨ７.４）で溶出した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により判断した溶出タンパク質の純度は溶出後９５％以上であった 。 該タンパク質のさらなる精製は、該タンパク質溶液をNaCl中３Ｍとし、次いで ２０ｍＭトリス、３Ｍ NaCl、１０mM CaCl₂（ｐＨ７．４）で平衡化した疎水性 相互作用樹脂(Toropearl Phenyl 650M,TosoHaas)に吸着させた。CaCl₂を含まな い平衡緩衝液２カラム容量で洗浄した後、組換えヒトプロテインＣを２０mMトリ ス（ｐＨ７.４）で溶出した。 残留カルシウムを除去して活性化するために溶出タンパク質を調製した。組換 えヒトプロテインＣを金属アフィニティカラム(Chelex-100，Bio-Rad)に通して カルシウムを除去し、再度陰イオン交換体（Fast Flow Q，Pharmacia）に結合さ せた。これら両カラムを直列に配列し、２０ｍＭトリス、１５０mM NaCl、５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化した。タンパク質を流した後、Chelex-100カラ ムを同じ緩衝液１カラム容量で洗浄し、次いで、そのカラムをカラムの配列から 外した。陰イオン交換カラムを平衡緩衝液３カラム容量で洗浄し、次いで、０. ４Ｍ NaCl、２０mMトリス−アセテート（ｐＨ６.５）で溶出した。組換えヒトプ ロテインＣおよび組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度をＵＶ２８０ ｎｍの吸光度によって測定した（それぞれ、Ｅ^0.1%＝１.８１または１.８５）。 製造例２ 組換えヒトプロテインＣの活性化 ウシトロンビンを、４℃にて、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）の存在下で、 活性化CH-Sepharose ４Ｂ(Pharmacia)とカップリングさせた。カップリング反応 は、約５０００単位トロンビン／ｍＬの樹脂を用いてカラムにすでに充填した樹 脂により行った。トロンビン溶液をカラムに約３時間循環させ、次いでＭＥＡを ０.６ｍＬ／Ｌの循環溶液濃度になるよう加えた。ＭＥＡ含有溶液をさらに１０ 〜１２時間循環させて、樹脂上の非反応アミンが確実に完全にブロックされるよ うにした。ブロッキング後、トロンビンがカップリングした樹脂を１０カラム容 量の１Ｍ NaCl、２０ｍＭトリス（ｐＨ６.５）で洗浄して非特異的に結合したタ ンパク質をすべて除去し、活性化緩衝液で平衡化し、次いで活性化反応に用いた 。 精製ｒｈＰＣをＥＤＴＡ中５ｍＭとし（あらゆる残留カルシウムをキレート化 するために）、２０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）または２０ｍＭトリスーアセテー ト（ｐＨ６.５）で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。この物質を３７℃にて、５ ０mM NaClと、２０mMトリス（ｐＨ７.４）または２０ｍＭトリスーアセテート（ ｐＨ６.５）のいずれかを用いて平衡化したトロンビンカラムに通した。流速を 、ｒｈＰＣとトロンビン樹脂の接触時間が約２０分間となるように調整した。排 出液を回収し、速やかにそのアミド分解活性をアッセイした。その物質がａＰＣ の確立された標準品と比べて比活性（アミド分解）を有しないときは、ｒｈＰＣ が完全に活性化されるようにトロンビンカラムを再生した。次いで、該物質を上 記２０mM緩衝液（ｐＨが７．４〜６．０のいずれか）で１：１に希釈し（自己分 解を防ぐためにより低いｐＨが好ましい）、次の加工工程を待つ間、ａＰＣを低 濃度に維持した。 浸出したトロンビンのａＰＣ物質からの除去は、ａＰＣを、１５０mM NaClを 含む活性化緩衝液（２０mMトリス（ｐＨ７.４）、または好ましくは、２０mMト リス−アセテート（ｐＨ６.５））で平衡化した陰イオン交換樹脂（Fast Flow Q ,Pharmacia）と結合させることにより行う。トロンビンをカラムに通し、２０mM 平衡緩衝液の２〜６カラム容量で洗浄中に溶出する。結合したａＰＣを５mMトリ ス−アセテート（ｐＨ６.５）または２０mMトリス（ｐＨ７.４）中の０.４Ｍ Na C1を用いる階段勾配により溶出した。より高容量でカラムを洗浄することにより 、ドデカペプチドのより完全な除去を促した。このカラムから溶出した物質を凍 結溶液中（−２０℃）または凍結乾燥粉末として保存した。 ａＰＣのアミド分解活性（ＡＵ）は、Beckman DU-7400ダイオードアレイ分光 光度計を用い、Kabi Vitrumから購入した合成基質H-D-Phe-Pip-Arg-p-ニトロア ニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニトロアニリンの遊離により測定した。活性 化プロテインＣ１単位は、４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロアニリンに対する吸光 係数９６２０Ｍ^-1ｃｍ^-1を用い、２５℃、ｐＨ７.４で１分間にｐ−ニトロアニ リン１μmolを遊離させるのに要する酵素の量と定義した。 活性化プロテインＣの抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａ ＰＴＴ）凝固アッセイにおける凝固時間の延長を測定することにより決定した。 標準曲線は、希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬラジオイムノアッセイグレードＢＳＡ、 ２０ｍＭトリス（ｐＨ７.４、１５０mM NaCl、０.０２％NaN₃）中で、プロテイ ンＣの濃度範囲１２５−１０００ｎｇ／ｍＬから作製し、試料はこの濃度範囲内 の数希釈に調製した。各試料キュベットに、冷ウマ血漿５０μＬ、および再構成 した活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、Sigma）５０μＬ を加え、３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、各キ ュベットに適切な試料または標準品５０μＬを加えた。試料または標準品の代わ りに希釈緩衝液を用いて基礎凝固時間を決定した。各試料または標準品に３７℃ の３０mM CaCl₂５０μＬを加えた時にフィブロメーター（CoA Screener Hemosta sis Analyzer，American Labor）のタイマーをスタートさせた。試料中の活性化 プロテインＣ濃度は標準曲線の直線回帰方程式から計算した。本明細書で報告し た凝固時間は、標準曲線試料を含め、最低３回反復した平均である。 製造例３ 活性化プロテインＣの製剤化 活性化プロテインＣの安定な凍結乾燥製剤を、約２.５ｍｇ／ｍＬの活性化プ ロテインＣ、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約２０ｍｇ／ｍＬのNaCl、および ５.５よりも高く６.５よりも低いｐＨのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液を 凍結乾燥することを含む製造方法によって製造した。さらに、活性化プロテイン Ｃの安定な凍結乾燥製剤は、約５ｍｇ／ｍＬの活性化プロテインＣ、約３０ｍｇ ／ｍＬのスクロース、約３８ｍｇ／ｍＬのNaCl、および５.５よりも高く６.５よ りも低いpHのクエン酸緩衝液を含む溶液を凍結乾燥することを含む。 ａＰＣ：塩：増量剤（ｗ：ｗ：ｗ）の割合は、凍結乾燥製造法に適した製剤化 における重要な因子である。その割合は、ａＰＣ、塩の選択と濃度、および増量 剤の選択と濃度によって変化する。具体的には、約１の活性化プロテインＣに対 し、塩が約７.６、増量剤が約６の割合が好ましい。 継続点滴による投与に適した活性化プロテインＣの単位投与製剤は、活性化プ ロテインＣ、NaCl、スクロース，およびクエン酸ナトリウム緩衝液を混合するこ とにより製造した。混合したのち、４ｍＬの溶液を単位投与量の容器に移し、 凍結乾燥した。その処置を必要とする患者に約０.０１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約０. ０５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量を投与するのに適した、約５ｍｇ〜約２０ｍｇの 活性化プロテインＣを含む単位投与量容器を密閉し、使用するまで保存した。 実施例１ 血栓症のモルモットＡＶシャントモデル 血小板阻害の臨床的な効力が証明されており、ａＰＣが止血の制御において決 定的な役割を果たすので、ａＰＣとＡＳＡの可能性ある相乗作用を、モルモット 動脈／静脈（ＡＶ）シャント血栓症モデルにおいて試験した。血栓症のこのモデ ルでは、ａＰＣが有効な抗血栓剤であり、血栓形成の用量依存的な阻害を引き起 こすことが証明された。 ａＰＣとアスピリンの効果を調べるために、モルモット（約５００ｇ）を、２ ０ｍｇ／ｋｇのロンパンおよび１２５ｍｇ／ｋｇのケタセットで麻酔し、シャン トを挿入して右頚動脈と左頚静脈とをつないだ。シャントに、血栓形成を刺激す るコットン糸を含ませた。ボーラス＋点滴投与レジメ（０.５ｍｇ／ｋｇボーラ ス＋３ｍｇ／ｋｇ／時間）によりａＰＣを投与して、血栓形成を阻害した。さら に、全血ａＰＴＴを投与レジメの前とその間に行い、循環ａＰＣ血漿レベルを免 疫捕捉アミド溶解アッセィにより測定した。アスピリンを１０ｍｇ／ｋｇで静脈 内投与し、ヘパリンに関する試験においては、３０単位／ｋｇボーラス、次いで ４０単位／ｋｇ／時間の点滴を使用した。左頚静脈の挿管によりボーラス投与を 行い、右頚静脈の挿管により血液採取を行った。連続した時点で血液試料を採取 し、３００ｍＭべンズアミジンHClを含むクエン酸Na₃塩に入れた（１体積のクエ ン酸／ベンズアミジン溶液に対し９体積の血液）。血液を採取した毎に、動物の 血液の体積を塩水で置換した。血漿を遠心により分離し、−２０℃に凍結した。 ａＰＣの血漿濃度を免疫捕捉アミド分解アッセイにより測定した。 ａＰＣと抗血小板剤ＡＳＡの、可能性を秘めた抗血栓の相乗作用を調べるため に、ＡＳＡの投与量を、トロンボキサンＢ２遊離の阻害により測定される、血小 板シクロオキシゲナーゼの完全に近い阻害が得られるように選択した。表１に示 すように、１０ｍｇ／ｋｇのＡＳＡの投与量は、血小板シクロオキシゲナーゼを 効 果的に阻害したが、血栓重量には有意な影響は及ぼさなかった。血栓重量に対す る効果を及ぼさないＡＳＡのこの投与量を用い、ａＰＣと組み合せて実験を行っ た。比較のため、標準的な臨床的抗凝固剤であるヘパリンも比べた。表２に示す ように、ａＰＣおよびヘパリンの投与量を、モデルにおいて大体同じ抗血栓効果 が各々得られるように選択した（それぞれ４５.９および４３.３％阻害）。ＡＳ ＡとａＰＣの組み合せは、ａＰＣ単独で観察されたよりも有意に大きい血栓形成 の阻害をもたらした（ｐ＝０.０１）。対照的に、抗血小板剤ヘパリンとＡＳＡ の組み合せは、ヘパリン単独で観察された阻害と比較して有意に大きい阻害は示 さなかった。これらのデータは、抗血小板剤とａＰＣとの相乗作用を示すもので あり、次のことを示唆している：（ａ）ＡＳＡまたは他の抗血小板剤治療が、ａ ｐｃとの組み合せ治療によって効力の増加を達成するだろうということ、そして （ｂ）抗血小板剤治療の存在の下でａＰＣの治療投与量を減らすことができると いうこと。 表１ モルモットＡＶ−シャントモデルにおける血小板トロンボキサンＢ２遊離およ び血栓重量に対するＡＳＡの効果。このデータは、トロンボボキサンＢ２遊離の 最大に近い阻害にもかかわらず、ＡＳＡが血栓重量に対し効果がなかったことを 示している。 表２ ａＰｃと、ヘパリンではなくＡＳＡとの間の抗血栓相乗作用。 ^★対照に対する％ 実施例２ 血栓症のモルモットＡＶシャントモデルにおげるａＰＣおよびＩＩｂ／ＩＩＩａ アンタゴニストの効果 ａＰＣと代表的な合成ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニストの組み合せ 治療の効果を調べるために、実施例１に記載の血栓症のモルモットＡＶシャント モデルを使用した。Fisherら，米国特許第５，６１８，８４３号に記載されてい るように製造した２−（［６−カルボキシ−ｎ−ヘキシル］カルボキシアミジル ）−５−アミジノベンゾフラントリフルオロ酢酸塩を用いた。ａＰＣとＩＩｂ／ ＩＩＩａアンタゴニストの組み合せは、ａＰＣ単独で観察された阻害よりも有意 に大きい血栓形成の阻害をもたらした（表３）。これらのデータは、ａＰＣと合 成ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの相乗作用を示している。 表３ ａＰＣとＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの抗血栓相乗作用 ^★対照に対する％ 実施例３ 血栓障害の処置におけるａＰＣとアブシキシマブの効果 セプターに結合することにより血小板凝集を阻害する薬剤である。ａＰＣとアブ シキシマブの組み合せ治療は、血液凝固過程を下方調節し、血小板凝集を阻害す ることにより、血栓症の阻害において有効である。アブシキシマブを約０.０５ ｍｇ／ｋｇ〜約１.０ｍｇ／ｋｇでボーラスインジェクションとして投与した後 、約０.０２５μg／ｋｇ／分〜約１μg／ｋｇ／分の継続点滴で１２時間投与す る。ａ ｐｃは、ボーラスインジェクションした後継続点滴により投与するか、または、 約２μｇ／ｋｇ／時間〜約９６μｇ／ｋｇ／時間の約２４〜約１４４時間の継続 点滴として投与する。 この組み合せ治療によって、より安全且つより有効であり、且つ血栓障害を処 置するに必要なａＰＣとアブシキマブ両方の投与量を減らすという相乗作用がも たらされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 9/08 9/08 9/10 9/10 Ａ６１Ｋ 45:00） //(Ａ６１Ｋ 38/43 37/465 45:00） (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ， ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．その処置を必要とする患者における血栓障害を処置する方法であって、該患 者に薬学的有効量の活性化プロテインＣを抗血小板剤と組み合せて投与すること を含む方法。 ２．患者が、急性血栓性発作、静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、血管形成 術またはステント配置後の急性閉鎖、または末梢血管手術の結果としての血栓症 を患っている、請求項１記載の方法。 ３．投与する活性化プロテインＣの量が、約２μｇ／ｋｇ／時間〜約９６μｇ／ ｋｇ／時間である、請求項２記載の方法。 ４．活性化プロテインＣを約２４〜約１４４時間の継続点滴により投与する、請 求項３記載の方法。 ５．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレル、アブシキシマ ブ、ジピリダモール、チクロピジン、ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニス トまたはそれらの組み合せからなる群から選択される、請求項３記載の方法。 ６．前記抗血小板剤がアスピリン（ＡＳＡ）である、請求項５記載の方法。 ７．前記抗血小板剤がチクロピジンである、請求項５記載の方法。 ８．前記抗血小板剤がクロピドグレルである、請求項５記載の方法。 ９．前記抗血小板剤がアブシキシマブである、請求項５記載の方法。 １０．前記抗血小板剤がジピリダモールである、請求項５記載の方法。 １１．前記抗血小板剤がＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニストである、請 求項５記載の方法。 １２．その処置を必要とする患者における血栓障害を処置する方法であって、該 患者に、薬学的有効量の抗血小板剤と活性化プロテインＣを、活性化プロテイン Ｃ血漿レベルが１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ未満に達するように投与する ことを含む方法。 １３．前記患者が、急性血栓性発作、静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、血 管形成術またはステント配置後の急性閉鎖、または末梢血管手術の結果としての 血栓症を患っている、請求項１２記載の方法。 １４．活性化プロテインＣを約２４〜約１４４時間の継続点滴により投与する、 請求項１２記載の方法。 １５．活性化プロテインＣが最初にボーラスとして、次いで継続点滴として投与 される、請求項１２記載の方法。 １６．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）およびクロピドグレルである、 請求項５記載の方法。 １７．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）およびチクロピジンである、請 求項５記載の方法。 １８．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）およびジピリダモールである、 請求項５記載の方法。 １９．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）およびアブシキマブである、請 求項５記載の方法。 ２０．前記抗血小板剤が、アスピリン（ＡＳＡ）およびＩＩｂ／ＩＩＩａアンタ ゴニストである、請求項５記載の方法。 ２１．血栓障害の処置のための医薬として使用するための、抗血小板剤と組み合 せた活性化プロテインＣ。 ２２．血栓障害が、急性血栓性発作、静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、血 管形成術またはステント配置後の急性閉鎖、または末梢血管手術の結果としての 血栓症である、請求項２１記載の使用。 ２３．活性化プロテインＣの投与量が約２μｇ／ｋｇ／時間〜約９６μｇ／ｋｇ ／時間である、請求項２２記載の使用。