JP2002281981A - RecAタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法 - Google Patents
RecAタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法Info
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Abstract
鎖核酸の所望する部位に対して選択的に標識を導入する
方法を提供する。 【解決手段】 標識が導入された核酸を製造する方法で
あって、前記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、
RecAタンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同
な第一の核酸プローブとを添加することにより、前記第
一の核酸プローブの一部が前記標的核酸から突出するよ
うに、前記RecAタンパク質を介して前記第一の核酸
プローブを前記標的核酸に結合せしめる工程と;前記標
的核酸に結合した前記RecAタンパク質を前記標的核
酸から解離させる工程と;前記第一の核酸プローブの突
出部分に、標識された第二の核酸プローブをハイブリダ
イズさせることにより、標識が導入された核酸を製造す
る工程とを備えた方法。
Description
核酸を製造する方法に関する。
析における、また、臨床的な遺伝子病の診断および治療
におけるDNAの検出および/または分離に、標識され
た核酸を使用することは非常に有益である。例えば、D
NAチップ(一般的にDNAマイクロアレイとも称され
る)上のDNAプローブとして、PCR時のプライマー
として、また、インサイチュウハイブリダイゼーション
におけるDNAプローブとして使用されている。
ゼ連鎖反応(以下PCRと称す)により合成し、それと
同時若しくは逐次標識すること、または大腸菌等を用い
たクローニングによって生成し、更に修飾を行うことに
よって製造される。
質を具備するプライマーを用いたり、標識物質を具備す
るdNTPを用いて通常のPCRの処理工程を行うこと
によって、合成と同時に標識物質を付加する。或いはP
CRやクローニングにより合成された核酸を化学的に修
飾することによって標識物質を付加した核酸を得ること
が可能である。
する核酸の塩基配列が長い場合、充分な増幅を得られな
いことがある。また、非特異的分子が増幅されてしまう
こと可能性もある。そのような場合、得られた核酸の同
定や精製を行うことが必要であるが、このような操作は
時間も労力も大きい。また、一般的に、PCRは大過剰
のプライマーを使用するものである。従って、例えば、
DNAチップのためのプローブとして使用する場合に
は、バックグラウンドを低くするために残留するプロー
ブを除去することが必要である。
化学的に標識物質を付加する場合には以下のことが問題
となる。例えば、酵素を用いたニックトランスレーショ
ン法により修飾を行う場合、配列中に生じた全てのニッ
クに対して修飾が行われることになるため、特定の部位
を選択的に修飾することが困難である。
ナルトランスフェラーゼを使用し何れか一方の末端のみ
に標識したい場合には、当該酵素により標識物質を二本
鎖の末端に付与した後に、不要な末端の標識物質を制限
酵素によって除去する必要がある。更に、ライゲーショ
ンによる平滑末端に対してアダプターを連結することに
よって一方の末端のみに標識を付与する場合には、付与
工程に先駆けて対象となる一方の末端を平滑末端とし、
他方を付着末端とするか、或いは付与した後に不要な末
端の標識部分を酵素により切除することが必要である。
しかしながら、酵素の部位選択性には限りがあることか
ら、このような酵素による従来の方法によって核酸の特
定部位に選択的に標識を付与することは困難である。ま
た、二本鎖の核酸の場合、その末端は等価であるので、
どちらか一方の末端のみを平滑末端(または付着末端)
とすることは、従来の技術では煩雑な操作と長い時間が
必要である。
発明の目的は、高い部位選択性をもって、且つ簡便に、
二本鎖核酸の所望する部位に対して選択的に標識を導入
する方法を提供することである。
に、本発明は、核酸に標識を導入する方法であって、前
記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、RecAタ
ンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同な第一の核
酸プローブとを添加することにより、前記第一の核酸プ
ローブの一部が前記標的核酸から突出するように、前記
RecAタンパク質を介して前記第一の核酸プローブを
前記標的核酸に結合せしめる工程と;前記標的核酸に結
合した前記RecAタンパク質を前記標的核酸から解離
させる工程と;前記第一の核酸プローブの突出部分に、
標識された第二の核酸プローブをハイブリダイズさせる
ことにより、核酸に標識を導入する工程とを備えた方法
を提供する。
助けるために、図1を参照しながら、本発明の方法の概
略を説明する。
入すべき標的核酸、一般的には標的DNA1に、該DN
Aの一方の末端領域と相同な配列を有する第一のプロー
ブDNA2とRecAタンパク質3とを添加する。Re
cAタンパク質3は、第一のプローブDNA2に結合し
てプローブDNA・RecAタンパク質複合体4を形成
する。続いて、RecAタンパク質は、標的DNA1の
末端領域に存在する第一のプローブDNA2と相同な領
域を検索することにより、第一のプローブDNA2を前
記相同な領域に結合させる。後の工程で、第一のプロー
ブDNA2には、標識された第二のプローブDNA6が
ハイブリダイズされるので、第一のプローブDNA2
は、標的DNA1の終末端から突出するように標的DN
A1に結合している。
工程では、標的DNA1の一方の末端領域に、RecA
タンパク質3を介して第一のプローブDNA2が結合
し、標的DNA1の末端領域に三本鎖DNA構造5が形
成される。
とにより、第一のプローブDNA2に結合したRecA
タンパク質3を除去する。第一のプローブDNA2が末
端領域に結合している場合には、RecAタンパク質3
を除去した後でも三本鎖DNA構造5が維持される。第
二の工程において、三本鎖DNA構造5からRecAタ
ンパク質3を除去することにより、第一のプローブDN
A2の突出部分に第二のプローブ6を容易にハイブリダ
イズさせることが可能となる。
の突出部分に、標識された第二のプローブ6をハイブリ
ダイズさせることにより、標的核酸の末端領域に標識を
導入する。標識を強固に結合するために、第二のプロー
ブ6は、必要に応じて、標的核酸の末端領域にライゲー
トさせることが好ましい。第二のプローブ6をライゲー
トさせた後には、第一のプローブDNA2は不要となる
ので、標的DNA1から解離させてもよい。
に示されている具体的な反応や構造等は、あくまでも理
解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、
実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり
得る。すなわち、本発明者らは、いかなる特定の理論に
も拘泥しない。
パク質を用いて、標識が導入された核酸を製造する方法
を提供する。
成される三本鎖構造が特定の条件下、即ち、標的核酸の
末端領域に形成される場合である場合では、前記三本鎖
構造からRecAタンパク質を解離させた後にも前記三
本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づい
てなされたものである。尚、RecAタンパク質、及び
RecAタンパク質を介して三本鎖構造が形成されるこ
とは公知である。しかしながら従来使用の方法では、6
0マー程度の短いプローブを用いた場合、形成された三
本鎖からはじき出されてしまう問題があった。従って、
本発明はこの問題点を解決する手段を見出したことによ
って達成されたものである。
る。
は、まず、標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、R
ecAタンパク質と、前記標識を導入すべき標的核酸中
の末端領域と相同な第一の核酸プローブとを添加する。
の単純ヌクレオチド及び/又は修飾ヌクレオチドからな
るポリヌクレオチドであり得る。標的核酸は、本方法の
実施者が自由に選択することができる。標的核酸は、典
型的には、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNA等
のDNA、並びにmRNA、全RNA、hnRNA、及
び合成RNA等のRNAである。「単純ヌクレオチド」
には、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウ
ラシルが含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、例え
ば、イノシン、アセチルシチジン、メチルアデノシン、
メチルグアノシンを含むリン酸エステル等が含まれる。
した未処置の試料、例えば、ゲノムDNA、mRNA、
プラスミドを含む生物試料であり得る。また、「標的核
酸を含む試料」は、前記未処置の試料に対して様々な操
作又は処理を行った試料であり得る。このような操作又
は処理は、核酸抽出操作、増幅操作、制限酵素、リガー
ゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼを含む酵素による処
理、及び遺伝子工学の領域において周知であるその他の
処理、並びにこれらの組み合わせであり得る。
タノール沈殿であり得るが、これらに限定されない。
その変法、例えば、逆転写PCR、逆PCR、5‘RA
CE、3’RACEであり得る。
工的に調製した核酸を含有する試料、又は該試料に前記
各処理を施すことによって調製された試料であってもよ
い。
料」は、遺伝子のクローニングの各段階で得られる試
料、例えば、DNAライブラリー、標的mRNAを含む
試料、1st strand cDNAを含む試料、ア
ダプターが付加された1ststrand cDNAを
含む試料、PCR産物がその中にサブクローニングされ
たプラスミドを含む試料であり得る。
質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する
領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることに
より、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質
を意味する。RecAタンパク質は、相同的組換え、D
NAの修復、又は大腸菌のSOS遺伝子の発現等に関与
することが知られている。RecAタンパク質の中で
は、大腸菌やλファージのRecAタンパク質が最も有
名である。しかしながら、大腸菌のRecAタンパク質
に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌
以外の生物にも広く分布していることが知られており、
これらのタンパク質は、一般に、RecA類似タンパク
質と呼称されている。本明細書において、「RecAタ
ンパク質」には、大腸菌やλファージのRecAタンパ
ク質のみならず、RecA類似タンパク質も含まれる。
また、RecA活性を有するRecAタンパク質の一部
の断片であってもよい。
本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではな
く、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な
領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるという
ことは、RecAタンパク質を介して特異的な三本鎖構
造を形成し得る程度に、両核酸が同一であるか、又は類
似していることを意味する。「類似」とは、例えば、二
つの塩基配列が少なくとも60%、好ましくは80%、
より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の
同一性であり得る。
有しているので、前記試料に、RecAタンパク質及び
相同な第一の核酸プローブを添加すると、該第一の核酸
プローブは、標的核酸の一方のストランド中に存在する
相同な部分に結合する。
していないときには、該領域が末端領域に位置するよう
に標的核酸の一部を切除してから、本発明の方法を適用
すればよい。あるいは、一度環状の核酸にしてから、特
定領域が末端領域にくるように再び切断してもよい。ま
た、標的核酸が、環状の核酸であるときには、三本鎖核
酸を形成させる前に、又は形成させた後に、所望の処理
を施すべき領域が末端領域に位置するように環状の標的
核酸を切断すればよい。
端領域」とは、標的核酸の終末端と標的核酸の終末端か
ら400番目、より好ましくは200番目、より好まし
くは150番目、より好ましくは100番目、より好ま
しくは80番目、さらに好ましくは60番目、さらに好
ましくは50番目、さらに好ましくは40番目、さらに
好ましくは20番目、さらに好ましくは10番目の塩基
との間に位置する領域(各終末端を含む)を意味する。
出末端(一般的に、付着末端とう称す)のうち何れでも
よい。
の核酸プローブは、少なくとも20塩基以上、より好ま
しくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、
最も好ましくは50塩基以上の長さを有する。以下の実
験例に詳述されているように、第一の核酸プローブが短
すぎると、三本鎖構造が安定に形成されないので、標的
核酸の長さに応じた適切な長さを有する第一の核酸プロ
ーブを使用しなければならない。
いて、標識された第二の核酸プローブがハイブリダイズ
される。それ故、第一の核酸プローブの一部が、標的核
酸から、好ましくは5ヌクレオチド以上、より好ましく
は10ヌクレオチド以上突出するように、標的核酸に結
合しなければならない。第一の核酸プローブの一部は、
該プローブの中間部分であってもよく、末端部分であっ
てもよい。ここで、中間部分とは、終末端を含まないプ
ローブの一部であり、末端部分とは、終末端を含むプロ
ーブの一部である。
は、所望に応じて、任意の配列であり得る。
記第一の核酸プローブが、RecAタンパク質を介して
標的核酸に結合する場合、第一の核酸プローブの方向性
によっては三本鎖構造が形成されないことがある。従っ
て、本発明の方法を実施するには、適切な方向性を有す
る核酸プローブを使用する必要がある。典型的には、三
本鎖構造を形成させるべき末端領域において5’末端を
有するストランドと相同な配列を有する核酸プローブを
使用すれば、三本鎖構造が形成される。
構造の両末端のうち外側(すなわち、標的核酸の終末端
側)に存在する末端が、標的核酸の終末端から100番
目の塩基、より好ましくは50番目の塩基、さらに好ま
しくは20番目の塩基、さらに好ましくは10番目の塩
基よりも外側に位置することが好ましい。
在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質な
ので、前記試料中にATPが存在すると相同的組換えが
進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。従っ
て、本発明の方法を実施する場合には、少なくとも三本
鎖核酸を形成させているときと、三本鎖核酸を形成させ
た後には、試料中にATPが4.8mM以上存在しては
ならならない。好ましくは、ATPの濃度は、0.48
mM以下であり、ATPが試料中に存在しないことが最
も好ましい。
形成させるためには、ATPの機能を代替し得る物質、
例えば、ATP−γSのようなATP類似体を添加しな
ければならない。
核酸に結合したRecAタンパク質を解離させる工程を
実施する。本工程において、標的核酸からRecAタン
パク質を解離させることによって、続く最後の工程で、
標識された第二の核酸プローブの第一のプローブへのハ
イブリダイゼーションが容易になる。
造は、RecAタンパク質が該領域から解離しても維持
される。それ故、本工程において、前記標的核酸からR
ecAタンパク質を解離させれば、RecAタンパク質
を介さずに形成された三本鎖構造が得られる。
は、フェニール/クロロホルムまたはフェノール単独を
添加する等の除タンパク操作、SDSのような界面活性
剤の添加、タンパク質分解酵素の添加、またはSDS+
分解酵素の添加のような簡易な操作によって行い得る。
ブの前記突出部分に、標識された第二の核酸プローブを
ハイブリダイズさせれば、標識が導入された核酸が得ら
れる。
使用される検出可能な標識および特異的に分離すること
が可能な標識であればよい。例えば、検出可能な標識
は、検出可能であればどのような標識であってもよく、
例えば、蛍光物質や化学発光物質等の発光物質、放射性
同位体、酵素、ハプテン、抗原及び抗体等を使用でき
る。また、「特異的に分離することが可能な標識」と
は、互いに高親和性を有し特異的に結合する結合対の一
方であればよく、例えば、アビジン若しくはストレプト
アビジンとビオチンの何れか一方、抗原と抗体のどちら
か一方等である。標識は、第二の核酸プローブ中の何れ
の部分に存在してもよく、例えば、プローブの末端、又
はプローブの内部に標識することができる。
つのプローブにおいて複数の標識、即ち、2以上の標識
を具備させてもよい。
の核酸プローブの突出部分と相補的な塩基配列を有す
る。しかしながら、前記突出部分とハイブリダイズする
ことができれば、第一の核酸プローブの突出部分と完全
に相補的な塩基配列でなくてもよい。また、第二の核酸
プローブは、前記突出部分より短くてもよく、あるいは
長くてもよい。
るが、以下に示すように、これらの各操作を改変した操
作を行ってもよく、さらに、上記各操作に新たな操作を
適宜付加してもよい。
て、第二の核酸プローブを標的核酸にライゲートする操
作を挙げることができる。第二の核酸プローブを標的核
酸の一方のストランドの終末端にライゲートすれば、標
識が強固に導入された核酸を得ることができる。ライゲ
ーションは、典型的には、リガーゼ等の酵素によってな
し得る。
に結合している第一の核酸プローブを標的核酸から解離
させて三本鎖構造を解消させる操作を行ってもよい。三
本鎖構造を解消させるためには、例えば、熱処理、アル
カリ処理、酵素処理(例えば、DNAポリメラーゼ処理
等)を使用し得る。あるいは、三本鎖構造を解消しやす
くするために、予め第一の核酸プローブに変異を導入し
ておくことも有用である。変異が導入された核酸プロー
ブは、標的核酸への結合性が弱いために三本鎖構造を解
消させやすい。
後に、標的核酸を一本鎖にする操作を行ってもよい。標
的核酸を一本鎖にするためには、例えば、アルカリ処
理、熱処理等の周知の方法を使用することができる。
して複数回繰り返して行い、1つの核酸に複数の標識を
導入することも可能である。複数回繰り返して行う場
合、好ましくは、第1の実施の後に得られた核酸におけ
る三本鎖構造を解消し、その後で第2の実施をする。こ
れにより、所望する複数の部位に所望する標識を導入す
ることが可能である。これらの各操作によって得られる
何れの核酸も本発明の範囲に属する。本発明の態様にお
いて得られた核酸は、例えば、サザンハイブリダイゼー
ション法のプローブおよびDNAチップのプローブ等と
して使用することができる。また、本核酸は、遺伝子の
直接クローニングに使用してもよい。
二本鎖DNA分子として使用してもよい。または、一部
三本鎖構造を有した二本鎖DNA分子若しくは二本鎖D
NA分子として使用し、使用工程の途中で、通常のDN
A変性条件下で変性することにより一本鎖DNA分子と
してもよい。或いは、同様に変性することにより、標識
された一本鎖DNA分子、未標識一本鎖DNA分子、ま
たはそれらの混合物として使用してもよい。使用者の所
望に応じて自由に使用することが可能である。一部三本
鎖構造を有した二本鎖DNA分子または二本鎖DNA分
子として扱えば、標識されたストランドに蓋がされてい
る状態なので、他の核酸との不要なハイブリダイゼーシ
ョンや、一本鎖DNAにおける相補的配列による不要な
結合を防ぐことができて扱いやすい。
NA分子または二本鎖DNA分子の標識物質を利用して
DNAチップを製造した場合、従来のものに比較して非
常に高密度にDNAプローブを具備するDNAを容易に
製造することが可能である。それにより、ハイブリダイ
ゼーションの効率は向上する。また、上記の分子からな
るプローブを標識物質を利用して支持体に固定した後
で、未標識のストランドを取り除くことによって得られ
るDNAチップは、相手鎖による立体障害を受けずに、
効率よくハイブリダイゼーションが実施できる。
のDNAに標識を入れることが可能であり、且つその標
識は、DNA片側鎖の末端付近または非末端領域に限定
して入れることができる。従って、当該標識を指標とし
て、直接的に、特定のDNA分子の存否を検出すること
も可能だある。そのような標識プローブも本発明の範囲
に含まれるものである。
によって作成された標識核酸、標識核酸が固定化された
担体も提供される。
は、固体担体上で直接にDNAを合成する方法や、点着
により静電気的に固体担体上にDNAを固定化する方法
である。しかしながら、前記の直接に合成する方法で
は、多くて10bpのDNAを固相化できるに過ぎな
い。また、静電気的によって固体担体上にDNAを固定
化する方法は、固定されるDNAの密度を高めることが
困難である。更に、こうして得られたDNAチップは、
固体担体に対するDNAの結合力が弱く、反復使用する
ことは難しい。更にまた、DNAチップ上でとることの
できるDNAの構造に起因して、安定なハイブリダイゼ
ーションが達成され難い。
製造された核酸が固定化された担体は、上記のような従
来の方法で生じた問題を解決する。即ち、長い塩基配列
を有する核酸を固定化することが可能であり、固定され
るDNAの密度を高くすることが可能であり、且つ安定
したハイブリダイゼーションが達成される。
は、担体表面にアミノ基を形成する方法、または核酸に
導入された標識と特異的に結合する物質を担体表面に配
置する方法等が挙げられる。
れ自身公知の方法であり、例えば、シラン処理によりア
ミノ基を形成し、必要な箇所にマスクを施した後、光反
応によって標識核酸を固定化することが可能である。
面に配置する方法では、例えば、標識核酸に含まれる標
識としてビオチンを用い、且つ担体表面にアビジンまた
はストレプトアビジンを配置し、それらを特異的に結合
させることにより達成できる。本発明の標識された核酸
を使用することによって、高集積率で標識核酸を固定化
することが可能である。このような効果は、核酸の末端
に導入された標識部分のみによってプローブが担体に固
定されているために得られる効果である。従って、本発
明の担体を使用すれば、検出試料中の標的核酸とプロー
ブとを安定してハイブリダイズすることが可能である。
また、前述ではビオチンとアビジンとを用いた例を示し
たが、これに限定されるものではない。ここで使用する
「結合対」の語は、相互に結合を形成しうる構成員を意
味し、本発明のプローブを固体支持体に固定化しうるも
のであれば、互いに高親和性で結合する物質の何れかで
あっても、官能基であっても、分子の一部若しくは残基
であってもよい。一般的には、結合対は、生物学的な特
異的結合を相互に形成しうる可能基または分子の一部若
しくは残基、或いは化学的に共有結合を形成しうる官能
基または分子の一部若しくは残基であってもよい。かよ
うな共有結合は、例えば、二官能性の有機化合物由来の
スペーサーを介して形成されるようなものであってもよ
い。生物学的な特異的結合を形成する結合対としては、
これに限定するものではないが、例えば、ビオチン類と
アビジン類、抗原(または抗原決定基)と抗体、オリゴ
糖とレクチン、等の組み合わせを使用することが可能で
ある。本発明の態様に従って製作されるDNAの固定化
された固体支持体をDNAチップとして使用する場合に
は、ビオチン類とアビジン類を選択することが好まし
い。即ち、ビオチン類とアビジン類を使用すると、ハイ
ブリダイゼーション操作において精度よく反復使用が可
能であり、更に、固定化したDNAを剥がして回収する
ことが容易である。従って、固体支持体の再利用が可能
である。ビオチン類としては、例えば、ビオチン、ビオ
シチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、およびア
ビジンと安定な複合体を形成しうるこれらの誘導体等か
ら選択して使用してよい。一方、アビジン類としては、
例えば、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチ
ンと安定な複合体を形成しうるこれらの改変体から選択
して使用してよい。ここで、「安定な複合体を形成しう
る」とは、ビオチン−アビジン複合体の解離定数(10
−15M)に近似する解離定数を有する複合体を形成す
ることができることを意味する。また、「改変体」と
は、天然由来のアビジンまたはストレプトアビジンの修
飾体若しくは断片、またはそれらの組換え体を意味す
る。また、結合対のどちらを標識として使用してよく、
従って、どちらを担体表面に配置してもよい。化学的に
共有結合を形成しうる官能基または分子の一部若しくは
残基も、タンパク質や核酸を固相に共有結合を介して固
定化するのに使用できる。本発明において、使用できる
化学的に共有結合を形成しうる官能基または分子の一部
若しくは残基は、当該固定に一般的に使用されるもので
あればよい。例えば、アミノ基、水酸基、スルフヒドリ
ル基、カルボキシル基、イソシアネート基およびチオイ
ソシアネート基等、並びにこれらの基を含む原子団等で
ある。アミノ基を担持するDNAを提供する場合、例え
ば、置換反応における基質として、dNTPの一部にN
6−(6−アミノヘキシル)dATPを用いることもで
きる。上記の結合対のうち、核酸プローブ中の標識とし
て使用するのに好ましいものは、相同的組換えに悪影響
を及ぼさないものである。例えば、ビオチン類、結合対
の一員、例えば、イソシアネート若しくはチオイソシア
ネート基またはこれらを官能基として有する原子団(例
えば、C1−16の酸素原子で中断されてもよいアルキ
レン鎖等)を挙げることができる。また、イソシアネー
ト若しくはチオイソシアネート基またはこれらを官能基
として有する原子団は、アミノ基を表面に担持する固体
支持体を容易に得ることが可能である。標識核酸を固定
化すべき担体は特に限定されず、例えば、シリコン基
板、ニトロセルロース製やナイロン製等のフィルター、
ポリプロピレンやポリエチレン製等のマイクロタイター
プレート、スライドガラス等のガラス板を挙げることが
できるが、これらに限定されない。従って、標識核酸が
固定化された担体には、いわゆるDNAチップやマイク
ロアレイと称される核酸固定化担体が含まれるが、これ
らに限定されるものではない。また、結合対間の相互の
結合形成に悪影響を及ぼさないものであれば、天然物質
または合成樹脂等を問わずどの様な材質であってもよ
く、どのような形状であってもよい。また、固体支持体
の取りうる形状は、上記の例に限るものではなく、例え
ば、平板、マイクロウェル、ビーズおよびスティック等
であってもよい。
質であることが好ましい。また、操作の便宜上、固体支
持体は磁性体や電極の形態に加工されてもよい。
をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本
発明の範囲を限定することを意図するものではない。
制限酵素SnaBIで直鎖状にしたものと、そのターゲ
ットDNAの末端部位の配列を持つ60merのオリゴ
ヌクレオチド1を用意した。オリゴヌクレオチドは、T
4Polynucleotide kinaseと[γ
−32P]ATPを用いて、32Pで5′末端を標識し
た。ターゲットDNAと標識オリゴヌクレオチド1との
間の三本鎖形成反応は、1pmolの標識オリゴヌクレ
オチド1、3.0μgのRecAタンパク質、4.8m
M ATP−γS、200ngのターゲットDNAを、
20mM酢酸マグネシウム、30mM酢酸トリス(pH
7.2)中で、37℃で30分間保温した。反応後に、
0.5%(W/Vol)SDS、0.7mg/mlプロ
ティナーゼKを加え、37℃で30分間保温することに
より、除タンパクを行った。その半分量について、1%
アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にゲルをエチ
ジウムブロミド染色し、DNAの写真を記録した。その
結果を図2(B)に示す。ゲルをろ紙の上に載せてゲル
乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをと
り、標識プローブからのシグナルをX線フィルム上に記
録した。その結果を図2(A)のレーン1に示す。
面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、
λDNAを制限酵素HindIII で切断し、T4Pol
ynucleotide kinaseと[γ−
32P]ATPを用いて、32Pで5′末端標識したも
のである。レーン2は、RecAを加えないで反応を行
った以外は、レーン1と同じである。レーン3は、AT
P−γSを加えないで反応を行った以外は、レーン1と
同じである。レーン4は、RecAとATP−γSを加
えないで反応を行った以外はレーン1と同じである。レ
ーン5は、32P標識オリゴヌクレオチド2を用いて反
応を行った以外はレーン1と同じである。レーン6は、
32P標識オリゴヌクレオチド3を用いて反応を行った
以外はレーン1と同じである。レーン7は、ターゲット
DNAとして、pBR322DNAを制限酵素ScaI
で切断したものを用いたことと、その末端部位の配列を
もつ32P標識オリゴヌクレオチド3を用いたこと以外
は、レーン1と同じ反応を行ったものである。
ccattaaacg ggtaaaatac-3' オリゴヌクレオチド2の配列 5'-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctt
tagtcct caaagcctct-3' オリゴヌクレオチド3の配列 5'-cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg ctt
ttctgtg actggtgagt-3'。
ように、三本鎖形成には、全ての反応成分が反応に加え
る必要がある。また、そのとき用いるオレゴヌクレオチ
ドは、オリゴヌクレオチド1のような配列方向性を持っ
た配列を持ったものを用いる必要がある。
配列方向性 図3(A)のレーン1は、図2(A)のレーン1と同じ
反応を行ったものである。レーン2は、32P標識オリ
ゴヌクレオチド2を用いた以外は、レーン1と同じ反応
を行ったものである。レーン3は、標識オリゴヌクレオ
チド4を用いた以外は、レーン1と同じ反応を行ったも
のである。レーン4は、標識オリゴヌクレオチド5を用
いた以外は、レーン1と同じ反応を行ったものである。
(B)は(A)と同じアガロースゲルの、DNA全染色
写真を示す。
トDNAの両末端部位で三本鎖形成が可能であり、その
とき用いるオリゴヌクレオチドは、ターゲットの両末端
配列の一方の方向を持った配列でなければならない。
cttcgta gtggcattac-3' オリゴヌクレオチド5の配列 5'-gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cga
aagaata cactaaaaca-3' 。
長さ 図4(A)のレーン1は、オリゴヌクレオチド6を用い
たこと以外は、図2(A)のレーン1と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン2は、図2(A)のレーン1と同
じ反応を行った結果を示す。レーン3は、レーン1で用
いたオリゴヌクレオチドの5′末端部位を30mer削
った標識オリゴヌクレオチド7を用いた以外は、レーン
1と同じ反応を行ったものである。レーン4は、レーン
1で用いたオリゴヌクレオチドの5′末端部位を40m
er削った標識オリゴヌクレオチド8を用いた以外は、
レーン1と同じ反応を行ったものである。レーン5は、
レーン1で用いたオリゴヌクレオチドの5′末端部位を
50mer削った標識オリゴヌクレオチド9を用いた以
外は、レーン1と同じ反応を行ったものである。レーン
6は、レーン1で用いたオリゴヌクレオチドの5′末端
部位を60mer削った標識オリゴヌクレオチド10を
用いた以外は、レーン1と同じ反応を行ったものであ
る。レーン7は、レーン1で用いたオリゴヌクレオチド
の5′末端部位を70mer削った標識オリゴヌクレオ
チド11を用いた以外は、レーン1と同じ反応を行った
ものである。図4(B)は、泳動後にゲルをエチジウム
ブロミド染色し、DNAの写真を記録した結果を示す。
tttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -3' オリゴヌクレオチド7の配列 5'- aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg gg
taaaatac -3' オリゴヌクレオチド8の配列 5'- actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -
3' オリゴヌクレオチド9の配列 5'- gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -3' オリゴヌクレオチド10の配列 5'- ccattaaacg ggtaaaatac -3’ オリゴヌクレオチド11の配列 5'-ggtaaaatac -3’。
なオリゴヌクレオチドの長さは、望むべくは、40me
r以上が必要であることがわかる。
列の位置関係 図5(A)のレーン1は、図2(A)のレーン1と同じ
反応を行ったものである。レーン2は、ターゲットDN
Aの末端10塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴ
ヌクレオチド12を用いた以外は、レーン1と同じ反応
を行ったものである。レーン3は、ターゲットDNAの
末端20塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴヌク
レオチド13を用いた以外は、レーン1と同じ反応を行
ったものである。レーン4は、ターゲットDNAの末端
30塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴヌクレオ
チド14を用いた以外は、レーン1と同じ反応を行った
ものである。図5(B)は、泳動後にゲルをエチジウム
ブロミド染色し、DNAの写真を記録した結果を示す。
aggaagttt ccattaaacg -3' オリゴヌクレオチド13の配列 5'- acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag ac
tttttcat gaggaagttt -3’ オリゴヌクレオチド14の配列 5'-cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg agg
actaaag actttttcat -3’。
なオリゴヌクレオチド配列は、望むべくは、ターゲット
DNA末端から20ベースまでDNA鎖の内部に入った
配列からはじまるターゲットDNAの配列をもつものが
望ましいことがわかる。
+DNAを制限酵素NotIで直鎖状にしたものと、そ
のターゲットDNAの末端部位の配列を持つオリゴヌク
レオチド15を用意した。ターゲットDNAとオリゴヌ
クレオチド15との間の三本鎖形成反応は、50pmo
lのオリゴヌクレオチド15、5.0μgのRecAタ
ンパク質、4.8mM ATP−γS、200ngのタ
ーゲットDNAを、20mM酢酸マグネシウム、30m
M酢酸トリス(pH7.2)中で、37℃で30分間保
温した。反応後に、0.5%(W/Vol)SDS、
0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃で3
0分間保温することにより、除タンパクを行った。その
後、40μlのTE緩衝液(10mM Tris−HC
l、1mM EDTA)を加え、60μlとして、フェ
ノール・クロロフォルム抽出を1回行った後、S−40
0スピンカラム(アマシャムファルマシアバイオテク社
製)の操作を1回行い、未反応のオリゴヌクレオチド1
5を除去を行った。エタノール沈殿を行い、濃縮させた
DNAを10μlの蒸留水に溶かした後、1pmolの
32P標識オリゴヌクレオチド16、20mM Tri
s−HCl(pH8.3)、25mM KCl、10m
M MgCl2、0.5mM NAD、0.01%Tr
itonX−100、5unit Ampligase
DNA ligaseを加え、50度60分間反応させ
ることによりライゲーション反応を行った。ライゲーシ
ョン反応後に、フェノール・クロロフォルム抽出を1
回、クロロフォルム抽出を1回行った後、エタノール沈
殿を行った。乾燥させたDNAペレットを、8μlの蒸
留水に溶かした後、100mM NaCl、10mM
Tris−HCl、10mM MgCl2、1mM d
ithiothreitol(pH7.4)、10un
it ScaIを加えて、37℃で120分間保温し
た。その半分量について、1%アガロースゲル電気泳動
行い、残り半分については、常法に従って0.7%アル
カリアガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲル
電気泳動後のゲルについては、泳動後にゲルをエチジウ
ムブロミド染色しDNAの写真を記録した。ゲルをろ紙
の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオート
ラジオグラムをとり、標識プローブからのシグナルをX
線フィルム上に記録した。その結果を図6(A)のレー
ン1に示す。レーン2は、ATP−γSを加えないで、
レーン1と同じ反応を行った結果を示す。レーン3は、
Ligaseを加えないで、レーン1と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン4は、オリゴヌクレオチド15を
加えないでレーン1と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン5は、オリゴヌクレオチド15のかわりに、オリゴ
ヌクレオチド17を加えてレーン1と同じ反応を行った
結果を示す。レーン6は、32P標識オリゴヌクレオチ
ド16を三本鎖形成反応時に加えたことと、ライゲーシ
ョンの反応を60度60分間行ったこと以外は、レーン
1と同じ反応を行った結果を示す。図6(B)は、泳動
後にゲルをエチジウムブロミド染色し、DNAの写真を
記録した結果を示す。
分が反応液に含まれる時のみ、もっとも高いターゲット
DNAの標識効率が得られる。また、標識化の方法は、
2つの方法が考えられる。
AGCTCCA CCGCGGTGGCGGCCgc ggc cgc gg -3’ オリゴヌクレオチド16の配列 5'- c cgc ggc cgc-3' オリゴヌクレオチド17の配列 5'-GCCAAGCGCG CAATTAACCC TCACTAAAGG GAACAAAAGC TGG
AGCTCCA CCGCGGTGGCGGCC-3’。
認 図7(A)は、図6と同じサンプルを、0.7%アルカ
リアガロースゲル電気泳動した結果を示す。図7(B)
は、実施例5でライゲーション反応後の制限酵素処理
を、ScaIのかわりに、50mM potassiu
m acetate、20mM tris−aceta
te、10mM magnessiumuacetat
e、1mM dithiothreitol(pH7.
9)、100μg/ml BSA、10unit Nl
aIVで37度120分間反応させたサンプルを、4.5
%変性ゲル電気泳動した結果を示す。
分が反応液に含まれる時のみ、もっとも高いターゲット
DNAの標識効率が得られ、かつ、ターゲットDNAに
標識プローブが共有結合していることがわかる。
行った結果を示す。レーンMは、DNAサイズマーカー
で、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカ
ーは、λDNAを制限酵素HindIII で切断し、T4
Polynucleotide kinaseと[γ−
32P]ATPを用いて、32Pで5′末端標識したも
のである。レーン2は、RecAを加えないで反応を行
った以外は、レーン1と同じである。レーン3は、AT
P−γSを加えないで反応を行った以外は、レーン1と
同じである。レーン4は、RecAとATP−γSを加
えないで反応を行った以外はレーン1と同じである。図
8(C)は、図8(A)と同じサンプルを、0.7%ア
ルカリアガロースゲル電気泳動した結果を示す。
行った結果を示す。レーン2は、オリゴヌクレオチド1
5を加えないでレーン1と同じ反応を行った結果を示
す。レーン3は、オリゴヌクレオチド15のかわりに、
オリゴヌクレオチド17を加えてレーン1と同じ反応を
行った結果を示す。レーン4は、pBR3 22DNAを
制限酵素ScaI断片の末端配列をもつ32P標識オリ
ゴヌクレオチド3を用いたこと以外は、レーン1と同じ
反応を行ったものである。図9(B)は、泳動後にゲル
をエチジウムブロミド染色し、DNAの写真を記録した
結果を示す。図9(C)は、図9(A)と同じサンプル
を、0.7%アルカリアガロースゲル電気泳動した結果
を示す。
を行った結果を示す。レーン2は、次の反応を行った結
果を示す。ターゲットDNAとしてpBluescri
ptIISK+DNAを制限酵素NotIで直鎖状にした
ものと、そのターゲットDNAの末端部位の配列を持つ
オリゴヌクレオチド15とオリゴヌクレオチド15の末
端から10merの配列に相補的な配列を持つオリゴヌ
クレオチド16を用意した。オリゴヌクレオチド16
は、T4Polynucleotide kinase
と[γ−32P]ATPを用いて、32Pで5′末端を
標識した。ターゲットDNAとオリゴヌクレオチド15
との間の三本鎖形成反応は、5pmolのオリゴヌクレ
オチド15、3.0μgのRecAタンパク質、4.8
mM ATP−γS、200ngのターゲットDNA
を、20mM酢酸マグネシウム、30mM酢酸トリス
(pH7.2)中で、37℃で30分間保温した。さら
に、20mM Tris−HCl(pH8.3)、25
mM KCl 10mM MgCl2 0.5mM N
AD、0.01% TritonX−100、5uni
ts Ampligase DNA Ligase、1
pmolオリゴヌクレオチド16を加え、60℃で60
分間保温した。反応後に、0.5%(W/Vol)SD
S、0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃
で30分間保温することにより、除タンパクを行った。
その半分量について、1%アガロースゲル電気泳動を行
い、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた
後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識プローブか
らのシグナルをX線フィルム上に記録した。図10
(B)は、泳動後にゲルをエチジウムブロミド染色し、
DNAの写真を記録した結果を示す。図101(C)
は、図10(A)と同じサンプルを、0.7%アルカリ
アガロースゲル電気泳動した結果を示す。
認 図11は、実施例9でライゲーション反応後の制限酵素
処理を、ScaIのかわりに、50mM potass
ium acetate、20mM tris−ace
tate、10mM magnessiumu ace
tate、1mM dithiothreitol(p
H7.9)、100μg/ml BSA、10unit
NlaIVで37度120分間反応させたサンプルを、
4.5%変性ゲル電気泳動した結果を示す。
をもって、簡便に且つ短い時間で、二本鎖核酸の所望す
る部位に対して選択的に標識を導入することが可能であ
る。詳しくは、核酸の末端が互いに等価であっても、所
望する末端のみに標識を導入することが可能である。
において必須とされている更なる工程、例えば、得られ
た核酸の同定や目的とする核酸の精製等の工程を行う必
要がない。
Aプローブが高密度に固定されて提供される。
応を示すスキーム。
3.RecAタンパク質 4.プローブDNA・RecAタンパク質複合体
5.三本鎖DNA構造 6.第二のプローブDNA
Claims (4)
- 【請求項1】 標識が導入された核酸を製造する方法で
あって、 前記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、RecA
タンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同な第一の
核酸プローブとを添加することにより、前記第一の核酸
プローブの一部が前記標的核酸から突出するように、前
記RecAタンパク質を介して前記第一の核酸プローブ
を前記標的核酸に結合せしめる工程と;前記標的核酸に
結合した前記RecAタンパク質を前記標的核酸から解
離させる工程と;前記第一の核酸プローブの突出部分
に、標識された第二の核酸プローブをハイブリダイズさ
せることにより、標識が導入された核酸を製造する工程
とを備えた方法。 - 【請求項2】 標識が導入された核酸を製造する方法で
あって、請求項1に記載の各工程に、前記第二の核酸プ
ローブを前記標的核酸にライゲートする工程をさらに備
えた方法。 - 【請求項3】 標識が導入された核酸を製造する方法で
あって、請求項1及び請求項2に記載の各工程に、前記
標的核酸に結合した前記第一の核酸プローブを、前記標
的核酸から解離させる工程をさらに備えた方法。 - 【請求項4】 請求項1〜3の何れか1項に記載の方法
によって製造された核酸を固定化した担体。
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JP2001094183A JP5128031B2 (ja) | 2001-03-28 | 2001-03-28 | RecAタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法 |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998008975A1 (en) * | 1996-08-29 | 1998-03-05 | Daikin Industries, Ltd. | Methods for targeting, enriching, detecting and/or isolating target nucleic acid sequence using reca-like recombinase |
JP2000184887A (ja) * | 1998-10-12 | 2000-07-04 | Aisin Seiki Co Ltd | 標識されたdnaの調製方法 |
-
2001
- 2001-03-28 JP JP2001094183A patent/JP5128031B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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WO1998008975A1 (en) * | 1996-08-29 | 1998-03-05 | Daikin Industries, Ltd. | Methods for targeting, enriching, detecting and/or isolating target nucleic acid sequence using reca-like recombinase |
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