JP2002218980A - 新規フェリチン - Google Patents
新規フェリチンInfo
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- JP2002218980A JP2002218980A JP2001015096A JP2001015096A JP2002218980A JP 2002218980 A JP2002218980 A JP 2002218980A JP 2001015096 A JP2001015096 A JP 2001015096A JP 2001015096 A JP2001015096 A JP 2001015096A JP 2002218980 A JP2002218980 A JP 2002218980A
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- Japan
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- ferritin
- subunit
- kda
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なフェリチン遺伝子の提供
【解決手段】 ＴＰ（Transit Peptide ）切断後のアミ
ノ末端からの６残基の配列がAla-Ser-Asn-Ala-Pro-Ala
である分子量２８ｋＤａのサブユニットをコードする植
物由来のまたは遺伝子組換えによるフェリチン遺伝子。 【効果】 従来の２８ｋＤａサブユニットと異なり容易
に切断されないため鉄の含有が持続できる。
ノ末端からの６残基の配列がAla-Ser-Asn-Ala-Pro-Ala
である分子量２８ｋＤａのサブユニットをコードする植
物由来のまたは遺伝子組換えによるフェリチン遺伝子。 【効果】 従来の２８ｋＤａサブユニットと異なり容易
に切断されないため鉄の含有が持続できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規フェリチンに関
するものである。
するものである。
【０００２】
【従来の技術】フェリチンは人間を含む高等動物から植
物、細菌等の微生物まで生物界に広く存在する鉄貯蔵タ
ンパク質であり、貯蔵している鉄を他の鉄結合酵素など
に供給すること、および生体に障害を及ぼすような過剰
な無機鉄を取り込み、解毒して細胞を保護することを主
要な生理的役割としている。このタンパク質は非常に巨
大であり（分子量５４０ｋＤａ）、外径が約１３ｎｍも
あり、２４個のサブユニットが対称性を持って積み重な
り、あたかも袋のような構造をしている。この袋状構造
の中に鉄を最大で４５００原子も貯蔵すると推定されて
いる。本発明者らはこのような大量の鉄を貯蔵できるフ
ェリチンの遺伝子を外来遺伝子として植物に導入するこ
とにより、植物の鉄含量を増加させ得ることを見出し、
先に特許出願を行った（特開平９−２０１１９０号公報
参照）。従来の植物フェリチンは１つの遺伝子由来のサ
ブユニット（２８ｋＤａ）から形成されていると考えら
れていた。そして、この２８ｋＤａのサブユニットは鉄
放出時に延長ペプチド（ＥＰ：Extension Peptide ）が
切断されることにより２６．５ｋＤａサブユニットに容
易に転化するとされていた。２８ｋＤａサブユニットが
鉄含有形態であることは報告されているが、２６．５ｋ
Ｄａサブユニットの鉄含有については知られていない。
したがって、鉄を放出してのこの転化がなければより効
率的に植物体に鉄分を貯蔵させることができるものと考
えられる。
物、細菌等の微生物まで生物界に広く存在する鉄貯蔵タ
ンパク質であり、貯蔵している鉄を他の鉄結合酵素など
に供給すること、および生体に障害を及ぼすような過剰
な無機鉄を取り込み、解毒して細胞を保護することを主
要な生理的役割としている。このタンパク質は非常に巨
大であり（分子量５４０ｋＤａ）、外径が約１３ｎｍも
あり、２４個のサブユニットが対称性を持って積み重な
り、あたかも袋のような構造をしている。この袋状構造
の中に鉄を最大で４５００原子も貯蔵すると推定されて
いる。本発明者らはこのような大量の鉄を貯蔵できるフ
ェリチンの遺伝子を外来遺伝子として植物に導入するこ
とにより、植物の鉄含量を増加させ得ることを見出し、
先に特許出願を行った（特開平９−２０１１９０号公報
参照）。従来の植物フェリチンは１つの遺伝子由来のサ
ブユニット（２８ｋＤａ）から形成されていると考えら
れていた。そして、この２８ｋＤａのサブユニットは鉄
放出時に延長ペプチド（ＥＰ：Extension Peptide ）が
切断されることにより２６．５ｋＤａサブユニットに容
易に転化するとされていた。２８ｋＤａサブユニットが
鉄含有形態であることは報告されているが、２６．５ｋ
Ｄａサブユニットの鉄含有については知られていない。
したがって、鉄を放出してのこの転化がなければより効
率的に植物体に鉄分を貯蔵させることができるものと考
えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、より多くの
鉄分を植物に貯蔵させることができるフェリチンを求め
て種々研究した結果、従来のものとは異なるサブユニッ
トを有するフェリチンを見いだして本発明を完成した。
鉄分を植物に貯蔵させることができるフェリチンを求め
て種々研究した結果、従来のものとは異なるサブユニッ
トを有するフェリチンを見いだして本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、容
易に切断されない分子量２８ｋＤａのサブユニットを含
むフェリチン及びフェリチン遺伝子に関する。より具体
的には、植物、特にダイズ由来のフェリチンである。本
発明において「容易に切断されない」とは、従来知られ
ている植物由来のフェリチンの２８ｋＤａサブユニット
が２６．５ｋＤａサブユニットに転化する条件下では切
断されない意味で用いられる。本発明のフェリチン遺伝
子は、トランジット・ペプチド（ＴＰ：Transit Peptid
e ）を除くアミノ末端からの６残基の配列がAla-Ser-As
n-Ala-Pro-Ala である分子量２８ｋＤａのサブユニット
をコードすることを特徴とするものである。また、従来
の大豆フェリチンの２８ｋＤａのサブユニットではカル
ボキシル（Ｃ−）末端残基の２３４番目がアルギニンで
あるのに対して、本発明のフェリチン遺伝子ではロイシ
ンで置換されていることを特徴とする。この相違によ
り、本発明の２８ｋＤａサブユニットは容易に切断され
ない。これら本発明の特定の配列は、遺伝子組換え手法
によって得ることができる。従って本発明は、植物由来
の及び遺伝子組換えによるフェリチン及びフェリチン遺
伝子を包含する。
易に切断されない分子量２８ｋＤａのサブユニットを含
むフェリチン及びフェリチン遺伝子に関する。より具体
的には、植物、特にダイズ由来のフェリチンである。本
発明において「容易に切断されない」とは、従来知られ
ている植物由来のフェリチンの２８ｋＤａサブユニット
が２６．５ｋＤａサブユニットに転化する条件下では切
断されない意味で用いられる。本発明のフェリチン遺伝
子は、トランジット・ペプチド（ＴＰ：Transit Peptid
e ）を除くアミノ末端からの６残基の配列がAla-Ser-As
n-Ala-Pro-Ala である分子量２８ｋＤａのサブユニット
をコードすることを特徴とするものである。また、従来
の大豆フェリチンの２８ｋＤａのサブユニットではカル
ボキシル（Ｃ−）末端残基の２３４番目がアルギニンで
あるのに対して、本発明のフェリチン遺伝子ではロイシ
ンで置換されていることを特徴とする。この相違によ
り、本発明の２８ｋＤａサブユニットは容易に切断され
ない。これら本発明の特定の配列は、遺伝子組換え手法
によって得ることができる。従って本発明は、植物由来
の及び遺伝子組換えによるフェリチン及びフェリチン遺
伝子を包含する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の「容易に切断されない」
フェリチンの２８ｋＤａサブユニットの確認のために以
下の各実験を行った。 Ａ．実験方法 １．自然の大豆フェリチンの精製 乾燥大豆種子（Kitano−shiki 変種）500gを粉砕機によ
り細粉化した。大豆種子粉は、１mM ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）と１０mM ２−ＭＥ（２−メルカプ
トエタノール）含有の５０mM Tris-HCl バッファーに懸
濁し、均質化し、10,000×ｇで10分間遠心分離した。上
清を20％飽和の硫酸アンモニュウムで分画した。琥珀色
の沈殿物を遠心分離により集め、５０mM Tris-HCl (pH
7.5)バッファー中で透析した。透析後の試料は、前もっ
て１mM ＥＤＴＡ含有の５０mMTris-HClバッファーで平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（Toyopearl ）（ＴＯＳ
ＯＨ社）コラムに付加した。コラムは０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム含有のバッファーで洗浄され、琥珀色のフェリ
チンが溶離された。大豆フェリチンを含有する該溶液
は、再度２０％飽和の硫酸アンモニュウムで分画した。
遠心分離により集められた上清は、ブチルトヨパール
（ＴＯＳＯＨ社）コラムに付加し、２０−０％飽和密度
勾配の硫酸アンモニウムにより溶離された。大豆フェリ
チンを含有する画分はプールされ、１ mM ＥＤＴＡ含有
の５０ｍＭ Tris-HCl バッファー(pH 7.5)中で透析さ
れ、Ｑ−セファロースコラム（Amersham-Pharmacia社）
に付加された。蛋白は０から０．７Ｍ密度勾配の塩化ナ
トリウムにより溶離された。大豆フェリチン含有の画分
はプールされ、濃縮され、最終的には２０ｍＭ Tris-HC
l （pH 7.5）バッファーで平衡化したスーパーデックス
７５ｐｇゲル濾過コラム（Amersham-Pharmacia社）に付
加された。
フェリチンの２８ｋＤａサブユニットの確認のために以
下の各実験を行った。 Ａ．実験方法 １．自然の大豆フェリチンの精製 乾燥大豆種子（Kitano−shiki 変種）500gを粉砕機によ
り細粉化した。大豆種子粉は、１mM ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）と１０mM ２−ＭＥ（２−メルカプ
トエタノール）含有の５０mM Tris-HCl バッファーに懸
濁し、均質化し、10,000×ｇで10分間遠心分離した。上
清を20％飽和の硫酸アンモニュウムで分画した。琥珀色
の沈殿物を遠心分離により集め、５０mM Tris-HCl (pH
7.5)バッファー中で透析した。透析後の試料は、前もっ
て１mM ＥＤＴＡ含有の５０mMTris-HClバッファーで平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（Toyopearl ）（ＴＯＳ
ＯＨ社）コラムに付加した。コラムは０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム含有のバッファーで洗浄され、琥珀色のフェリ
チンが溶離された。大豆フェリチンを含有する該溶液
は、再度２０％飽和の硫酸アンモニュウムで分画した。
遠心分離により集められた上清は、ブチルトヨパール
（ＴＯＳＯＨ社）コラムに付加し、２０−０％飽和密度
勾配の硫酸アンモニウムにより溶離された。大豆フェリ
チンを含有する画分はプールされ、１ mM ＥＤＴＡ含有
の５０ｍＭ Tris-HCl バッファー(pH 7.5)中で透析さ
れ、Ｑ−セファロースコラム（Amersham-Pharmacia社）
に付加された。蛋白は０から０．７Ｍ密度勾配の塩化ナ
トリウムにより溶離された。大豆フェリチン含有の画分
はプールされ、濃縮され、最終的には２０ｍＭ Tris-HC
l （pH 7.5）バッファーで平衡化したスーパーデックス
７５ｐｇゲル濾過コラム（Amersham-Pharmacia社）に付
加された。
【０００６】アポ・フェリチンは従来知られている方法
により得た。精製されたフェリチンは、１％チオグリコ
ール酸含有の50mM ヒープス（Hepes ）／ＮａＯＨ・バ
ッファー(pH 7.0)中で透析され、続いて連続的に０．１
％と０％チオグリコレート含有ヒープス・バッファーに
て透析した。その後蛋白は13g/リッターのChilex-100
（Bio-Rad 社）及び０．２Ｍ塩化ナトリウム含有のヒー
プス・バッファー中で透析し、最後に脱イオン水中で透
析した。精製された蛋白濃度は蛋白アッセイキット（Bi
o-Rad 社）とデンシトメーター（Pharmacia 社）により
決定した。
により得た。精製されたフェリチンは、１％チオグリコ
ール酸含有の50mM ヒープス（Hepes ）／ＮａＯＨ・バ
ッファー(pH 7.0)中で透析され、続いて連続的に０．１
％と０％チオグリコレート含有ヒープス・バッファーに
て透析した。その後蛋白は13g/リッターのChilex-100
（Bio-Rad 社）及び０．２Ｍ塩化ナトリウム含有のヒー
プス・バッファー中で透析し、最後に脱イオン水中で透
析した。精製された蛋白濃度は蛋白アッセイキット（Bi
o-Rad 社）とデンシトメーター（Pharmacia 社）により
決定した。
【０００７】２．アミノ酸配列分析 大豆フェリチン・サブユニットは、１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離さ
れ、ＰＶＤＦ膜に転移された。膜は２％（Ｖ／Ｖ）酢酸
に溶解した０．１％のポンソー−Ｓ（Sigma 社）により
染色された。膜上の２個所の特徴的なバンドが各々膜か
ら切り取られた。両蛋白のアミノ末端アミノ酸配列は、
アプライド・バイオシステムのモデル４７７Ａパルス−
液体アミノ酸配列分析器（シークエンサー）による自動
化エドマン分解した。２６．５ｋＤａサブユニットのカ
ルボキシル（Ｃ−）末端アミノ酸配列は、このサブユニ
ットをリジルエンドペプチダーゼにより消化し、Ｃ−末
端を含有するペプチド断片はＤＩＴＣ−ガラス（ＳＩＧ
ＭＡ）により単離した。その後、Ｃ−末端断片の配列を
自動化エドマン分解により決定した。
リルアミドゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離さ
れ、ＰＶＤＦ膜に転移された。膜は２％（Ｖ／Ｖ）酢酸
に溶解した０．１％のポンソー−Ｓ（Sigma 社）により
染色された。膜上の２個所の特徴的なバンドが各々膜か
ら切り取られた。両蛋白のアミノ末端アミノ酸配列は、
アプライド・バイオシステムのモデル４７７Ａパルス−
液体アミノ酸配列分析器（シークエンサー）による自動
化エドマン分解した。２６．５ｋＤａサブユニットのカ
ルボキシル（Ｃ−）末端アミノ酸配列は、このサブユニ
ットをリジルエンドペプチダーゼにより消化し、Ｃ−末
端を含有するペプチド断片はＤＩＴＣ−ガラス（ＳＩＧ
ＭＡ）により単離した。その後、Ｃ−末端断片の配列を
自動化エドマン分解により決定した。
【０００８】３．大豆からの新規フェリチン遺伝子ｃＤ
ＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニング ジーンバンク（遺伝子銀行）に登録済みの大豆ＥＳＴ
（発現配列タグ:Expressed Sequence Tag ）配列(AW185
525, AI966037, AW397605, AI443722, AI900240)をプラ
イマーの設計に使用した。５’race (rapid amplificat
ion of cDNA ends) と３’raceは、発芽後１週間の種苗
から抽出した総ＲＮＡを鋳型（テンプレート）とする製
造方法にて実施した。Ｌサブユニットをコードする標的
配列に関する１０個の候補配列を決定した。
ＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニング ジーンバンク（遺伝子銀行）に登録済みの大豆ＥＳＴ
（発現配列タグ:Expressed Sequence Tag ）配列(AW185
525, AI966037, AW397605, AI443722, AI900240)をプラ
イマーの設計に使用した。５’race (rapid amplificat
ion of cDNA ends) と３’raceは、発芽後１週間の種苗
から抽出した総ＲＮＡを鋳型（テンプレート）とする製
造方法にて実施した。Ｌサブユニットをコードする標的
配列に関する１０個の候補配列を決定した。
【０００９】４．組換え体大豆フェリチンの準備 大豆フェリチンの成熟部分をコードするＤＮＡ配列は、 (a) プライマー−ＴＰ（5'-GCGCATATGTCAACGGTGCCTCTCAC-3'）と (b) Ｃ（5'-GCGGGATCCTAATCASAGAAGTCTTTG-3' ） を使用するＰＣＲ（ポリメレースチェーン反応）で増幅
した。−ＴＰ及びＣは各々ＮｄｅＩサイト（位置）及び
ＢａｍＨＩサイトを含んでいた。そこで得られたＴＰ配
列を含有しない断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩにより消化
し、発現ベクターｐＥＴ３ａ（Novagen ）上のＮｄｅＩ
とＢａｍＨＩ間に挿入して、プラスミドｐＥＳＦを得
た。発現プラスミドｐＥＳＦは Escherichia coli （大
腸菌）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株に形質転換され
た。発現プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ株は、３７℃で
アンピシリン(50 μg/ml) 補助ＬＢ（Luria-Bertani ）
培地で培養した。Ａ600 （吸光度）＝０．６まで増殖し
た時に、最終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し
た。細菌は遠心により収穫し、蛋白はバッグバスター
（BugBuster ）蛋白抽出試薬(Novagen) により抽出し
た。完全な成熟領域を含む組換え体フェリチンの精製過
程も自然フェリチンと同様である。
した。−ＴＰ及びＣは各々ＮｄｅＩサイト（位置）及び
ＢａｍＨＩサイトを含んでいた。そこで得られたＴＰ配
列を含有しない断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩにより消化
し、発現ベクターｐＥＴ３ａ（Novagen ）上のＮｄｅＩ
とＢａｍＨＩ間に挿入して、プラスミドｐＥＳＦを得
た。発現プラスミドｐＥＳＦは Escherichia coli （大
腸菌）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株に形質転換され
た。発現プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ株は、３７℃で
アンピシリン(50 μg/ml) 補助ＬＢ（Luria-Bertani ）
培地で培養した。Ａ600 （吸光度）＝０．６まで増殖し
た時に、最終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し
た。細菌は遠心により収穫し、蛋白はバッグバスター
（BugBuster ）蛋白抽出試薬(Novagen) により抽出し
た。完全な成熟領域を含む組換え体フェリチンの精製過
程も自然フェリチンと同様である。
【００１０】５．大豆フェリチンのデグラデーション
（減成）実験 大豆の葉２００ｍｇを抽出バッファー［５０mM K2PO
4 、１０mM ２−ＭＥ、0.1 ％TritonＸ-100、0.1 ％サ
ルコシン）１ｍＬと海砂で均質化し、12000 ｒｐｍで遠
心分離して可溶性蛋白質を抽出した。上清を大豆フェリ
チンの減成実験に使用した。組換えフェリチンと自然の
フェリチンの各１５０ｎｇを葉抽出液２０μｌに加え、
室温でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＶ
ＤＦ膜に電気ブロットした後、蛋白質の免疫検出を行っ
た。大豆フェリチン（％）サブユニットに対して抗血清
が上昇した。大豆フェリチン抗体でのブロットの検出を
ビオニチル化ホースラディシュ・パーオキシダーゼと結
合したアンチ−ラビットＩｇＧシープ・イムノグロブリ
ンを用いて行った。シグナルの視認化にはイムノステイ
ン（Immunostain ）ＨＲＰ−1000（コニカ社）を用い
た。
（減成）実験 大豆の葉２００ｍｇを抽出バッファー［５０mM K2PO
4 、１０mM ２−ＭＥ、0.1 ％TritonＸ-100、0.1 ％サ
ルコシン）１ｍＬと海砂で均質化し、12000 ｒｐｍで遠
心分離して可溶性蛋白質を抽出した。上清を大豆フェリ
チンの減成実験に使用した。組換えフェリチンと自然の
フェリチンの各１５０ｎｇを葉抽出液２０μｌに加え、
室温でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＶ
ＤＦ膜に電気ブロットした後、蛋白質の免疫検出を行っ
た。大豆フェリチン（％）サブユニットに対して抗血清
が上昇した。大豆フェリチン抗体でのブロットの検出を
ビオニチル化ホースラディシュ・パーオキシダーゼと結
合したアンチ−ラビットＩｇＧシープ・イムノグロブリ
ンを用いて行った。シグナルの視認化にはイムノステイ
ン（Immunostain ）ＨＲＰ−1000（コニカ社）を用い
た。
【００１１】６．鉄の取り込み及び放出の測定 自然の大豆フェリチン及び組換え体フェリチンによる鉄
取り込み反応は、室温でFe2+/ フェリチン・モル比 1,0
00（１ｍＭ硫酸第一鉄と０．１μＭフェリチン) により
１００ｍＭ Hepes ／ＮａＯＨ・バッファー（pH 7.0）
で実施した。フェリチンへの鉄取り込みは吸光度３１０
ｎｍで測定した。鉄遊離実験では、自然大豆及び組換え
体のアポ・フェリチン( 各々２μＭ）は、０．２Ｍ塩化
ナトリウムを含有する０．１Ｍ ＭＯＰＳに溶解された
新鮮な硫酸第一鉄(1 mM)を添加することにより鉱化し、
続いて室温で２時間培養し、その後に一晩４℃で放置し
た。鉄遊離はナトリウムアスコルビン酸塩とフェロジン
（ferrozine ）を各々最終濃度１ｍＭと４ｍＭになるよ
うに添加することにより反応を開始した。アスコルビン
酸塩はフェリチン殻からの鉄の還元型遊離を促進すると
報告されている。外来性Fe2+は、日立紫外線分光光度計
(Hitachi, Tokyo, Japan) を用いて、波長５６０ｎｍで
のＦｅ2+／ferrozine 複合体の吸光度により測定した。
取り込み反応は、室温でFe2+/ フェリチン・モル比 1,0
00（１ｍＭ硫酸第一鉄と０．１μＭフェリチン) により
１００ｍＭ Hepes ／ＮａＯＨ・バッファー（pH 7.0）
で実施した。フェリチンへの鉄取り込みは吸光度３１０
ｎｍで測定した。鉄遊離実験では、自然大豆及び組換え
体のアポ・フェリチン( 各々２μＭ）は、０．２Ｍ塩化
ナトリウムを含有する０．１Ｍ ＭＯＰＳに溶解された
新鮮な硫酸第一鉄(1 mM)を添加することにより鉱化し、
続いて室温で２時間培養し、その後に一晩４℃で放置し
た。鉄遊離はナトリウムアスコルビン酸塩とフェロジン
（ferrozine ）を各々最終濃度１ｍＭと４ｍＭになるよ
うに添加することにより反応を開始した。アスコルビン
酸塩はフェリチン殻からの鉄の還元型遊離を促進すると
報告されている。外来性Fe2+は、日立紫外線分光光度計
(Hitachi, Tokyo, Japan) を用いて、波長５６０ｎｍで
のＦｅ2+／ferrozine 複合体の吸光度により測定した。
【００１２】上記各実験により下記の結果が得られた。 Ｂ．結果 １．乾燥種子からの大豆フェリチンの単離 大豆フェリチンは、乾燥種子から二段階の陰イオン交換
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー，及び
ゲル濾過により精製した。大豆フェリチンは、各々のク
ロマトグラフ段階で単一ピークとして溶離した。しかし
ながら精製されたフェリチンには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動）分析によると、分子量が２８ｋＤａと２６．
５ｋＤａだと推定される二つのバンドを認めた（図１
Ａ）。これ等のバンドの密度分析によると、精製された
フェリチンは２８ｋＤａと２６．５ｋＤａのサブユニッ
トを殆ど等量（２８ｋＤａ／２６．５ｋＤａ比が１／
１．０９と推定された）含んでいることを示した。精製
された大豆フェリチンからは、分子量が約５５０−５６
０ｋＤａ（図１Ｂ）だと推定される単一バンドのみが検
出された。
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー，及び
ゲル濾過により精製した。大豆フェリチンは、各々のク
ロマトグラフ段階で単一ピークとして溶離した。しかし
ながら精製されたフェリチンには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動）分析によると、分子量が２８ｋＤａと２６．
５ｋＤａだと推定される二つのバンドを認めた（図１
Ａ）。これ等のバンドの密度分析によると、精製された
フェリチンは２８ｋＤａと２６．５ｋＤａのサブユニッ
トを殆ど等量（２８ｋＤａ／２６．５ｋＤａ比が１／
１．０９と推定された）含んでいることを示した。精製
された大豆フェリチンからは、分子量が約５５０−５６
０ｋＤａ（図１Ｂ）だと推定される単一バンドのみが検
出された。
【００１３】図１Ａにおいて、精製された大豆フェリチ
ンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、ＣＢＢ( クー
マシー・ブリリアント・ブルー : Coomassie Brilliant
Blue)により染色された（レーン１）。図１Ｂは大豆フ
ェリチンの非変性ＰＡＧＥ分析結果を示す図で、レーン
１は、大豆種子から精製された自然の大豆フェリチン、
レーン２は、大腸菌にて発現された組換え体大豆フェリ
チンを示し、蛋白マーカー（Ｍ）は分子質量を表す。
ンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、ＣＢＢ( クー
マシー・ブリリアント・ブルー : Coomassie Brilliant
Blue)により染色された（レーン１）。図１Ｂは大豆フ
ェリチンの非変性ＰＡＧＥ分析結果を示す図で、レーン
１は、大豆種子から精製された自然の大豆フェリチン、
レーン２は、大腸菌にて発現された組換え体大豆フェリ
チンを示し、蛋白マーカー（Ｍ）は分子質量を表す。
【００１４】２．両サブユニットのアミノ酸配列分析 両方のサブユニットのアミノ（Ｎ−）末端からの６残基
を決定した。２８ｋＤａサブユニットの配列はAla-Ser-
Asn-Ala-Pro-Ala であり、２６．５ｋＤａサブユニット
はAla-Ser-Thr-Val-Pro-Leu であった。両方のサブユニ
ットの決定済みＮ−末端配列は互いに異なっており、ま
た２８ｋＤａサブユニットは今迄報告されていない新規
な配列であった。更に６残基目以降のＮ−末端配列もま
た、２８ｋＤａサブユニットは新規なサブユニットであ
ることを示唆していた（図２）。２８ｋＤａと２６．５
ｋＤａのバンドは完全に分離可能で、両方のサブユニッ
トの配列プロフィールには汚染ピークは検出されなかっ
た。他方、２６．５ｋＤａサブユニットのＮ−末端配列
は、既知配列のＥＰ領域の配列と同一であった。２６．
５ｋＤａサブユニットのＮ−末端配列分析から、移送ペ
プチドは既知報告によるカルボキシル側４９番目残基の
アラニンでは無くて、カルボキシル側の４８番目残基の
システインで開裂されていた（図２参照）。ここでは、
２８ｋＤａと２６．５ｋＤａとを各々Ｌ（大）サブユニ
ットとＳ（小）サブユニットと定義する。
を決定した。２８ｋＤａサブユニットの配列はAla-Ser-
Asn-Ala-Pro-Ala であり、２６．５ｋＤａサブユニット
はAla-Ser-Thr-Val-Pro-Leu であった。両方のサブユニ
ットの決定済みＮ−末端配列は互いに異なっており、ま
た２８ｋＤａサブユニットは今迄報告されていない新規
な配列であった。更に６残基目以降のＮ−末端配列もま
た、２８ｋＤａサブユニットは新規なサブユニットであ
ることを示唆していた（図２）。２８ｋＤａと２６．５
ｋＤａのバンドは完全に分離可能で、両方のサブユニッ
トの配列プロフィールには汚染ピークは検出されなかっ
た。他方、２６．５ｋＤａサブユニットのＮ−末端配列
は、既知配列のＥＰ領域の配列と同一であった。２６．
５ｋＤａサブユニットのＮ−末端配列分析から、移送ペ
プチドは既知報告によるカルボキシル側４９番目残基の
アラニンでは無くて、カルボキシル側の４８番目残基の
システインで開裂されていた（図２参照）。ここでは、
２８ｋＤａと２６．５ｋＤａとを各々Ｌ（大）サブユニ
ットとＳ（小）サブユニットと定義する。
【００１５】図２の大豆フェリチンのサブユニットの演
繹されたアミノ酸配列を示す図において、上の配列は、
既に知られている配列と同じであるＳサブユニットのア
ミノ酸配列を示し、。下の配列は、本発明によるＬサブ
ユニットのアミノ酸配列を示す。矢印はＳサブユニット
の開裂サイト（Proteolytic cleavage）を示す。また、
実線で囲まれた部分はＮ−末端配列解析により決定され
たＬサブユニットのＮ−末端３２残基を示し、破線で囲
まれた部分はリジルエンドペプチダーゼによる消化によ
り形成された第１７番断片を示す。この断片はＳサブユ
ニットのカルボキシル末端に位置している。
繹されたアミノ酸配列を示す図において、上の配列は、
既に知られている配列と同じであるＳサブユニットのア
ミノ酸配列を示し、。下の配列は、本発明によるＬサブ
ユニットのアミノ酸配列を示す。矢印はＳサブユニット
の開裂サイト（Proteolytic cleavage）を示す。また、
実線で囲まれた部分はＮ−末端配列解析により決定され
たＬサブユニットのＮ−末端３２残基を示し、破線で囲
まれた部分はリジルエンドペプチダーゼによる消化によ
り形成された第１７番断片を示す。この断片はＳサブユ
ニットのカルボキシル末端に位置している。
【００１６】次いで、開裂サイトを検知するために、Ｓ
サブユニットのカルボキシル（Ｃ−）末端アミノ酸配列
を分析した。Ｃ−末端残基を含むペプチド断片の配列
は、Ser-Glu-Tyr-Val-Ala-Gln-Leu-Arg-Arg であった
（図２）。この配列は既に知られている大豆フェリチン
配列にも認められるが、Ｃ−末端残基は２３４番目のア
ルギニンだと決定したが、これは大豆フェリチン配列の
Ｃ−末端に関する既存の報告からは１８残基上流に位置
していた。これ等のデータは、大豆種子フェリチン中の
Ｓサブユニットは、Ｃ−末端１７残基の蛋白質分解性の
開裂を伴うことを示した。
サブユニットのカルボキシル（Ｃ−）末端アミノ酸配列
を分析した。Ｃ−末端残基を含むペプチド断片の配列
は、Ser-Glu-Tyr-Val-Ala-Gln-Leu-Arg-Arg であった
（図２）。この配列は既に知られている大豆フェリチン
配列にも認められるが、Ｃ−末端残基は２３４番目のア
ルギニンだと決定したが、これは大豆フェリチン配列の
Ｃ−末端に関する既存の報告からは１８残基上流に位置
していた。これ等のデータは、大豆種子フェリチン中の
Ｓサブユニットは、Ｃ−末端１７残基の蛋白質分解性の
開裂を伴うことを示した。
【００１７】３．新規フェリチン・サブユニットのアミ
ノ酸配列 新しく同定された大豆フェリチンのＬサブユニットに対
するｃＤＮＡは、ＰＣＲを基本とする戦略によりクロー
ン化した。ｃＤＮＡ配列から演繹されたアミノ酸配列
を、既存の報告例と一緒に図２に示す。前駆体からＴＰ
が解離したＬサブユニットの成熟領域は、２０９残基か
ら構成されており、これはＳサブユニット（２０２残基
から成る）に比較して７残基長かった。Ｌサブユニット
の成熟領域のアミノ酸配列は、Ｓサブユニットと８２％
の相同性を示した。成熟領域の高い相同性に反して、Ｔ
Ｐ配列はＬ及びＳ間で配列の低い相同性（４１％）しか
示さなかった。成熟領域の配列では、演繹されたヘリカ
ル領域（ＡからＥヘリックス（Helix ））では、ＢとＣ
へリックスを結合するループ領域では比較的に変異して
いたが、Ｌ及びＳサブユニット間では高い相同性が保た
れていた；即ちヘリカル、ループ及びＥＰ領域のアミノ
酸配列の相同性は、各々９０％、８１％及び６３％であ
った。結果を表１に示す。
ノ酸配列 新しく同定された大豆フェリチンのＬサブユニットに対
するｃＤＮＡは、ＰＣＲを基本とする戦略によりクロー
ン化した。ｃＤＮＡ配列から演繹されたアミノ酸配列
を、既存の報告例と一緒に図２に示す。前駆体からＴＰ
が解離したＬサブユニットの成熟領域は、２０９残基か
ら構成されており、これはＳサブユニット（２０２残基
から成る）に比較して７残基長かった。Ｌサブユニット
の成熟領域のアミノ酸配列は、Ｓサブユニットと８２％
の相同性を示した。成熟領域の高い相同性に反して、Ｔ
Ｐ配列はＬ及びＳ間で配列の低い相同性（４１％）しか
示さなかった。成熟領域の配列では、演繹されたヘリカ
ル領域（ＡからＥヘリックス（Helix ））では、ＢとＣ
へリックスを結合するループ領域では比較的に変異して
いたが、Ｌ及びＳサブユニット間では高い相同性が保た
れていた；即ちヘリカル、ループ及びＥＰ領域のアミノ
酸配列の相同性は、各々９０％、８１％及び６３％であ
った。結果を表１に示す。
【００１８】 注）両方のサブユニットのアミノ酸配列は８部分を互いに比較した。 ＴＰ: 移送ペプチド ＥＰ：延長ペプチド
【００１９】Ｌサブユニットは、Ｃ−末端に５残基（そ
の内の４残基は塩基性又は酸性アミノ酸である電荷残
基）からなる延長部を持っていた。フェロオキシダーゼ
・サイトだと考えられる全ての残基は、両方のサブユニ
ットに保存されていた。鉄(III)-チロシン(tyrosinate)
複合体を形成すると考えられているチロシン残基もま
た、保存されていた。しかしながら、Ｓサブユニットの
配列では、カルボキシル側が開裂される２３１番目のア
ルギニン残基は、Ｌタイプのサブユニットではロイシン
により置換されていた。この置換により、Ｌサブユニッ
トはカルボキシル末端開裂を受けなくなっていると考え
られる。上記したように、大豆Ｓサブユニットの場合に
カルボキシル側が開裂されるアルギニン残基が、ＣＰ３
配列にも認められた。
の内の４残基は塩基性又は酸性アミノ酸である電荷残
基）からなる延長部を持っていた。フェロオキシダーゼ
・サイトだと考えられる全ての残基は、両方のサブユニ
ットに保存されていた。鉄(III)-チロシン(tyrosinate)
複合体を形成すると考えられているチロシン残基もま
た、保存されていた。しかしながら、Ｓサブユニットの
配列では、カルボキシル側が開裂される２３１番目のア
ルギニン残基は、Ｌタイプのサブユニットではロイシン
により置換されていた。この置換により、Ｌサブユニッ
トはカルボキシル末端開裂を受けなくなっていると考え
られる。上記したように、大豆Ｓサブユニットの場合に
カルボキシル側が開裂されるアルギニン残基が、ＣＰ３
配列にも認められた。
【００２０】４．大豆フェリチンＳサブユニットのデグ
ラデーション 大豆フェリチンＳサブユニットの成熟全領域を E. col
i で発現した。非変性ＰＡＧＥ( ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動）（図１Ｂ参照）及びゲル濾過分析による
と、組換え体大豆フェリチンも自然蛋白と同様に２４量
体に集合できることを示していた。組換え体Ｓサブユニ
ットのホモポリマーを大豆の葉抽出物と培養したものの
結果を図３に示す。Ｓサブユニットの約半分は１０分以
内に２６．５ｋＤａ型へと開裂された。しかしながら１
時間の培養の後には、２８ｋＤａ型は消失し、少量の２
６．５ｋＤａ型のみ検出できた。２時間後には、２６．
５ｋＤａ型は完全に分解していて検出できなかった。他
方、Ｓ及びＬサブユニットを殆ど等量含有する自然の大
豆フェリチンでは、２８ｋＤａ型は存在しなかったが、
培養２時間後にも２６．５ｋＤａ型を検出することがで
きた。この実験では抗Ｓサブユニット抗体を使用してい
るので、自然のフェリチンのＬサブユニットは完全には
検出できなかった。
ラデーション 大豆フェリチンＳサブユニットの成熟全領域を E. col
i で発現した。非変性ＰＡＧＥ( ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動）（図１Ｂ参照）及びゲル濾過分析による
と、組換え体大豆フェリチンも自然蛋白と同様に２４量
体に集合できることを示していた。組換え体Ｓサブユニ
ットのホモポリマーを大豆の葉抽出物と培養したものの
結果を図３に示す。Ｓサブユニットの約半分は１０分以
内に２６．５ｋＤａ型へと開裂された。しかしながら１
時間の培養の後には、２８ｋＤａ型は消失し、少量の２
６．５ｋＤａ型のみ検出できた。２時間後には、２６．
５ｋＤａ型は完全に分解していて検出できなかった。他
方、Ｓ及びＬサブユニットを殆ど等量含有する自然の大
豆フェリチンでは、２８ｋＤａ型は存在しなかったが、
培養２時間後にも２６．５ｋＤａ型を検出することがで
きた。この実験では抗Ｓサブユニット抗体を使用してい
るので、自然のフェリチンのＬサブユニットは完全には
検出できなかった。
【００２１】図３の組換え体及び自然の大豆フェリチン
のデグラデーションを示す図において、上記のとおり組
換え体及び自然の大豆フェリチンは、大豆の葉抽出物中
で培養されたもので、フェリチン・サブユニットは抗Ｓ
サブユニット抗体により検出された。図中、レーン１は
大豆の葉抽出物、レーン２は１５０ｎｇの組換え体Ｓサ
ブユニット、レーン２からレーン８は１５０ｎｇの組換
え体Ｓサブユニットを葉抽出物とそれぞれ０、１、１
０、３０、６０及び１２０分間培養した後のＳサブユニ
ット、レーン９は１５０ｎｇの自然の大豆フェリチン、
レーン１０及び１１は、１５０ｎｇの自然のフェリチン
を葉抽出物と各々６０及び１２０分間培養したもの結果
を示す。
のデグラデーションを示す図において、上記のとおり組
換え体及び自然の大豆フェリチンは、大豆の葉抽出物中
で培養されたもので、フェリチン・サブユニットは抗Ｓ
サブユニット抗体により検出された。図中、レーン１は
大豆の葉抽出物、レーン２は１５０ｎｇの組換え体Ｓサ
ブユニット、レーン２からレーン８は１５０ｎｇの組換
え体Ｓサブユニットを葉抽出物とそれぞれ０、１、１
０、３０、６０及び１２０分間培養した後のＳサブユニ
ット、レーン９は１５０ｎｇの自然の大豆フェリチン、
レーン１０及び１１は、１５０ｎｇの自然のフェリチン
を葉抽出物と各々６０及び１２０分間培養したもの結果
を示す。
【００２２】５．鉄取り込み及び遊離 Ｃ−末端欠失の鉄取り込み及び遊離に及ぼす影響を研究
するために、自然の大豆フェリチン（５０％Ｌ）と、組
換え体フェリチンの鉄取り込み及び遊離を試験した。自
然の大豆フェリチンは、２８ｋＤａと２６．５ｋＤａと
の両方のサブユニットを等量持っていたが、組換え体
は、Ｃ−末端の配列を含むサブユニットの成熟領域全域
から成っていた。Ｃ−末端が欠失しているＳサブユニッ
トの２６．５ｋＤａ型は、２４量体には集合しなかっ
た。組換え体及び自然の大豆フェリチンの両方とも鉄取
り込み活性を示した（図４Ａ）。連続曲線（プログレッ
ション・プロット）によると、自然の大豆フェリチンの
取り込み率は、全ての構成サブユニットはフェロオキシ
ダーゼ・サイトを保有しているにも係らず、組換え体よ
り取り込み率が低かった。両方の取り込み率はFe(II)自
動酸化率（コントロール）よりも高かった。
するために、自然の大豆フェリチン（５０％Ｌ）と、組
換え体フェリチンの鉄取り込み及び遊離を試験した。自
然の大豆フェリチンは、２８ｋＤａと２６．５ｋＤａと
の両方のサブユニットを等量持っていたが、組換え体
は、Ｃ−末端の配列を含むサブユニットの成熟領域全域
から成っていた。Ｃ−末端が欠失しているＳサブユニッ
トの２６．５ｋＤａ型は、２４量体には集合しなかっ
た。組換え体及び自然の大豆フェリチンの両方とも鉄取
り込み活性を示した（図４Ａ）。連続曲線（プログレッ
ション・プロット）によると、自然の大豆フェリチンの
取り込み率は、全ての構成サブユニットはフェロオキシ
ダーゼ・サイトを保有しているにも係らず、組換え体よ
り取り込み率が低かった。両方の取り込み率はFe(II)自
動酸化率（コントロール）よりも高かった。
【００２３】フェリチンからの還元的遊離率も評価した
（図４Ｂ）。自然及び組換え体フェリチンの鉄核形成反
応は、一晩４℃でフェリチン／鉄モル比１／５００で、
硫酸第一鉄をFe(II)源として培養して実施した。フェリ
チン外殻の外側の第一鉄（Fe(II)）原子はフェロジンに
結合されるので、この複合体の吸光度を測定した。Fe(I
I)/ferrozine複合体の量は、どの時間コースを見ても組
換え体よりも、自然の大豆フェリチンの方が多かった。
両方のサブユニット間の鉄遊離率の差は、計算上はｔ検
定でｐ＝０．０５により統計的に有意であり、Ｃ−末端
１６残基の開裂が蛋白外殻からの鉄遊離を促進している
ことが示された。
（図４Ｂ）。自然及び組換え体フェリチンの鉄核形成反
応は、一晩４℃でフェリチン／鉄モル比１／５００で、
硫酸第一鉄をFe(II)源として培養して実施した。フェリ
チン外殻の外側の第一鉄（Fe(II)）原子はフェロジンに
結合されるので、この複合体の吸光度を測定した。Fe(I
I)/ferrozine複合体の量は、どの時間コースを見ても組
換え体よりも、自然の大豆フェリチンの方が多かった。
両方のサブユニット間の鉄遊離率の差は、計算上はｔ検
定でｐ＝０．０５により統計的に有意であり、Ｃ−末端
１６残基の開裂が蛋白外殻からの鉄遊離を促進している
ことが示された。
【００２４】図４Ａは、大豆フェリチンの鉄取り込み反
応の連続曲線プロットを示すグラフで、０．１Ｍフェリ
チン・サブユニット及び０．１ｍＭ硫酸第一鉄含有の
０．１Ｍヒープス−Ｎａ、ｐＨ７．０中で実施した各フ
ェリチンの結果を示す。コントロールは自動酸化率を示
す。図４Ｂは、集合されたフェリチンでのサブユニット
の共存の影響を示すグラフである。自然（Native）及び
組換え体（Recombinant ）フェリチン（２μＭ）は、
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）と０．２Ｍ塩化ナト
リウム中に溶解した１ｍＭ硫酸第一鉄と混合することに
より試験管中で鉱化した。鉱化されたフェリチンからの
鉄遊離は、内部の鉄からの還元的遊離を促進するため
に、１ｍＭフェロジンと４ｍＭナトリウム・アスコルビ
ン酸塩の添加により開始された。遊離された鉄は、Fe2+
／ferrozine 複合体の吸光度を５６０ｎｍにてモニター
することにより検出した。結果は３回の実験から得た。
応の連続曲線プロットを示すグラフで、０．１Ｍフェリ
チン・サブユニット及び０．１ｍＭ硫酸第一鉄含有の
０．１Ｍヒープス−Ｎａ、ｐＨ７．０中で実施した各フ
ェリチンの結果を示す。コントロールは自動酸化率を示
す。図４Ｂは、集合されたフェリチンでのサブユニット
の共存の影響を示すグラフである。自然（Native）及び
組換え体（Recombinant ）フェリチン（２μＭ）は、
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）と０．２Ｍ塩化ナト
リウム中に溶解した１ｍＭ硫酸第一鉄と混合することに
より試験管中で鉱化した。鉱化されたフェリチンからの
鉄遊離は、内部の鉄からの還元的遊離を促進するため
に、１ｍＭフェロジンと４ｍＭナトリウム・アスコルビ
ン酸塩の添加により開始された。遊離された鉄は、Fe2+
／ferrozine 複合体の吸光度を５６０ｎｍにてモニター
することにより検出した。結果は３回の実験から得た。
【００２５】本発明において、本発明者らは、大豆フェ
リチンの２つの異なったポリペプチド鎖を検出し、新規
なサブユニットをコードするｃＤＮＡを単離した。本発
明によって大豆種子では二種類の違ったフェリチンが殆
ど等量共存することが証明された。片方のサブユニット
は分子量２８ｋＤａの既知のアミノ酸配列だったが、Ｃ
−末端１７残基の開裂により２６．５ｋＤａ（Ｓサブユ
ニット）に簡単に転化された。他のサブユニットは新規
なアミノ酸配列を持ち、２８ｋＤａ型（Ｌサブユニッ
ト）として残存していた。アミノ酸配列プロフィールに
よると、Ｓサブユニットは完全に２６．５ｋＤａ型に転
化された。これ等のデータは、２６．５ｋＤａサブユニ
ットは、２８ｋＤａサブユニットのアミノ末端延長ペプ
チド（ＥＰ）の蛋白質分解性の開裂により生成し、２８
ｋＤａと２６．５ｋＤａサブユニットは原則的には同一
であると考えられている既存の仮説には反することであ
った。
リチンの２つの異なったポリペプチド鎖を検出し、新規
なサブユニットをコードするｃＤＮＡを単離した。本発
明によって大豆種子では二種類の違ったフェリチンが殆
ど等量共存することが証明された。片方のサブユニット
は分子量２８ｋＤａの既知のアミノ酸配列だったが、Ｃ
−末端１７残基の開裂により２６．５ｋＤａ（Ｓサブユ
ニット）に簡単に転化された。他のサブユニットは新規
なアミノ酸配列を持ち、２８ｋＤａ型（Ｌサブユニッ
ト）として残存していた。アミノ酸配列プロフィールに
よると、Ｓサブユニットは完全に２６．５ｋＤａ型に転
化された。これ等のデータは、２６．５ｋＤａサブユニ
ットは、２８ｋＤａサブユニットのアミノ末端延長ペプ
チド（ＥＰ）の蛋白質分解性の開裂により生成し、２８
ｋＤａと２６．５ｋＤａサブユニットは原則的には同一
であると考えられている既存の仮説には反することであ
った。
【００２６】大豆の葉抽出物を使用したデグラデーショ
ン実験では、Ｓサブユニットのホモ２４量体は、自然の
大豆フェリチンに比較して不安定であった（図３）。Ｓ
サブユニットの不安定さは、ＳサブユニットのＣ−末端
１７残基を欠失している変異株ではオリゴマーに集合で
きないことから、Ｃ−末端１７残基の開裂に起因すると
思われる。他方、Ｌサブユニットは、Ｃ−末端領域の開
裂には影響を受けず、また葉抽出物では安定であった。
これ等のデータは、Ｌサブユニットは大豆種子ではフェ
リチンの２４量体を安定化することを示した。
ン実験では、Ｓサブユニットのホモ２４量体は、自然の
大豆フェリチンに比較して不安定であった（図３）。Ｓ
サブユニットの不安定さは、ＳサブユニットのＣ−末端
１７残基を欠失している変異株ではオリゴマーに集合で
きないことから、Ｃ−末端１７残基の開裂に起因すると
思われる。他方、Ｌサブユニットは、Ｃ−末端領域の開
裂には影響を受けず、また葉抽出物では安定であった。
これ等のデータは、Ｌサブユニットは大豆種子ではフェ
リチンの２４量体を安定化することを示した。
【００２７】本発明は、２８ｋＤａから２６．５ｋＤａ
型への転化は、Ｃ−末端１７アミノ酸残基の開裂に起因
することを示した。アミノ酸配列の整合データ、及び演
繹された植物フェリチンの三次元構造から、開裂された
１７残基は“Ｅ−へリックス”に相当すると考えられ
る。この“Ｅ−へリックス”は動物などのフェリチン２
４量体において４回対称軸付近でのサブユニット間相互
作用に関与し、狭いチャンネルを形成している。Ｅ−ヘ
リックスの開裂により作られた大きな孔は、鉄が自由に
動き回れるだけの十分な孔径を持っていると期待され
る。自然の大豆フェリチンからの鉄遊離率は、組換え体
の遊離率よりも高い（図４Ｂ）。これ等のデータは、鉄
遊離率はＥ−へリックスの開裂により促進されたことを
示唆した。Ｅ−へリックスの開裂の結果として形成され
る大きな孔は、フェリチンからの鉄遊離の新しい機作を
提供する。
型への転化は、Ｃ−末端１７アミノ酸残基の開裂に起因
することを示した。アミノ酸配列の整合データ、及び演
繹された植物フェリチンの三次元構造から、開裂された
１７残基は“Ｅ−へリックス”に相当すると考えられ
る。この“Ｅ−へリックス”は動物などのフェリチン２
４量体において４回対称軸付近でのサブユニット間相互
作用に関与し、狭いチャンネルを形成している。Ｅ−ヘ
リックスの開裂により作られた大きな孔は、鉄が自由に
動き回れるだけの十分な孔径を持っていると期待され
る。自然の大豆フェリチンからの鉄遊離率は、組換え体
の遊離率よりも高い（図４Ｂ）。これ等のデータは、鉄
遊離率はＥ−へリックスの開裂により促進されたことを
示唆した。Ｅ−へリックスの開裂の結果として形成され
る大きな孔は、フェリチンからの鉄遊離の新しい機作を
提供する。
【００２８】植物フェリチンでは、幾つかの機能的な遺
伝子が発見されている。本発明者らは、成熟過程が既存
のフェリチンとは異なる新規な大豆フェリチンのサブユ
ニットを見出し、この新規なサブユニットは、大豆種子
フェリチンの主要なサブユニットの一つであることを示
した。新規なフェリチンのサブユニットの一次構造は、
既に報告されているサブユニットに近似していた（８２
％の相同性）。しかしながら、成熟過程における違いが
“鉄遊離”の新しい機能の根拠になると認められる。大
豆種子フェリチンは、鉄分子を積極的に取り込んだり遊
離したりすることにより、細胞内での鉄の緩衝装置とし
て機能していると思われるている。２８ｋＤａ及び部分
的に開裂された２６．５ｋＤａサブユニットは、エンド
ウや他のマメ科植物のフェリチンでも検出可能である。
本発明の知見に基づくアミノ酸置換により、大豆のＬサ
ブユニットがＣ−末端残基の蛋白質分解性開裂に影響さ
れなくなるが、この現象は他のマメ科植物のフェリチン
にも適用できる。
伝子が発見されている。本発明者らは、成熟過程が既存
のフェリチンとは異なる新規な大豆フェリチンのサブユ
ニットを見出し、この新規なサブユニットは、大豆種子
フェリチンの主要なサブユニットの一つであることを示
した。新規なフェリチンのサブユニットの一次構造は、
既に報告されているサブユニットに近似していた（８２
％の相同性）。しかしながら、成熟過程における違いが
“鉄遊離”の新しい機能の根拠になると認められる。大
豆種子フェリチンは、鉄分子を積極的に取り込んだり遊
離したりすることにより、細胞内での鉄の緩衝装置とし
て機能していると思われるている。２８ｋＤａ及び部分
的に開裂された２６．５ｋＤａサブユニットは、エンド
ウや他のマメ科植物のフェリチンでも検出可能である。
本発明の知見に基づくアミノ酸置換により、大豆のＬサ
ブユニットがＣ−末端残基の蛋白質分解性開裂に影響さ
れなくなるが、この現象は他のマメ科植物のフェリチン
にも適用できる。
【００２９】本発明を要約すると、フェリチンは大豆で
は少なくともＳとＬの二つのタイプのサブユニットから
構成されている。２８ｋＤａの分子として存在するＬサ
ブユニットは、蛋白外殻の安定性に関与しており、他
方、Ｓサブユニットは、Ｅ−へリックスの開裂により２
６．５ｋＤａ型に転化される。開裂はフェリチンからの
鉄遊離の作用機作に関係する可能性がある。異なった機
能を持つ多種のサブユニットの存在は、大豆以外のマメ
科植物でも発現すると推測される。
は少なくともＳとＬの二つのタイプのサブユニットから
構成されている。２８ｋＤａの分子として存在するＬサ
ブユニットは、蛋白外殻の安定性に関与しており、他
方、Ｓサブユニットは、Ｅ−へリックスの開裂により２
６．５ｋＤａ型に転化される。開裂はフェリチンからの
鉄遊離の作用機作に関係する可能性がある。異なった機
能を持つ多種のサブユニットの存在は、大豆以外のマメ
科植物でも発現すると推測される。
【００３０】
【発明の効果】本発明の遺伝子由来のサブユニットから
形成されるフェリチンは鉄の放出が少なくなり、フェリ
チン分子中により多くの鉄を蓄積できると容易に推測で
きる。従って、本発明のフェリチン遺伝子を植物に導入
すれば、本発明者らが先に提案した高鉄含量植物の作成
に多大な効果をもたらすことが期待できる。
形成されるフェリチンは鉄の放出が少なくなり、フェリ
チン分子中により多くの鉄を蓄積できると容易に推測で
きる。従って、本発明のフェリチン遺伝子を植物に導入
すれば、本発明者らが先に提案した高鉄含量植物の作成
に多大な効果をもたらすことが期待できる。
【図１】大豆フェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非変性
ＰＡＧ分析の結果を示す図である。 （Ａ）精製された大豆フェリチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析され、ＣＢＢ( クーマシー・ブリリアント・
ブルー : Coomassie Brilliant Blue)により染色され
た。（レーン１） （Ｂ）大豆フェリチンの非変性ＰＡＧＥ分析。 レーン１：大豆種子から精製された自然の大豆フェリチ
ン、 レーン２：Ｅ．ｃｏｌｉにて発現された組換え体大豆フ
ェリチン。 蛋白マーカー（Ｍ）は分子質量を表す。
ＰＡＧ分析の結果を示す図である。 （Ａ）精製された大豆フェリチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析され、ＣＢＢ( クーマシー・ブリリアント・
ブルー : Coomassie Brilliant Blue)により染色され
た。（レーン１） （Ｂ）大豆フェリチンの非変性ＰＡＧＥ分析。 レーン１：大豆種子から精製された自然の大豆フェリチ
ン、 レーン２：Ｅ．ｃｏｌｉにて発現された組換え体大豆フ
ェリチン。 蛋白マーカー（Ｍ）は分子質量を表す。
【図２】大豆フェリチンのサブユニットの演繹されたア
ミノ酸配列を示す図である。 上：既に知られている配列と同じであるＳサブユニット
のアミノ酸配列。 下：本発明によるＬサブユニットのアミノ酸配列。 Ｓサブユニットの開裂サイトは矢印で表示。 実線で囲まれた部分：Ｎ−末端配列解析により決定され
たＬサブユニットのＮ−末端３２残基。 破線で囲まれた部分：リジルエンドペプチダーゼによる
消化により形成された第１７番断片。この断片はＳサブ
ユニットのカルボキシル末端に位置する。
ミノ酸配列を示す図である。 上：既に知られている配列と同じであるＳサブユニット
のアミノ酸配列。 下：本発明によるＬサブユニットのアミノ酸配列。 Ｓサブユニットの開裂サイトは矢印で表示。 実線で囲まれた部分：Ｎ−末端配列解析により決定され
たＬサブユニットのＮ−末端３２残基。 破線で囲まれた部分：リジルエンドペプチダーゼによる
消化により形成された第１７番断片。この断片はＳサブ
ユニットのカルボキシル末端に位置する。
【図３】組換え体及び自然の大豆フェリチンのデグラデ
ーションを示す図である。組換え体及び自然の大豆フェ
リチンは、大豆の葉抽出物中で培養された。フェリチン
・サブユニットは抗Ｓサブユニット抗体により検出され
た。 レーン１：大豆の葉抽出物、レーン２：１５０ｎｇの組
換え体Ｓサブユニット、レーン２から８：１５０ｎｇの
組換え体Ｓサブユニットを葉抽出物とそれぞれ０、１、
１０、３０、６０及び１２０分間培養した後のＳサブユ
ニット。レーン９：１５０ｎｇの自然の大豆フェリチ
ン、レーン１０及び１１：１５０ｎｇの自然のフェリチ
ンを葉抽出物と各々６０及び１２０分間培養したもの。
ーションを示す図である。組換え体及び自然の大豆フェ
リチンは、大豆の葉抽出物中で培養された。フェリチン
・サブユニットは抗Ｓサブユニット抗体により検出され
た。 レーン１：大豆の葉抽出物、レーン２：１５０ｎｇの組
換え体Ｓサブユニット、レーン２から８：１５０ｎｇの
組換え体Ｓサブユニットを葉抽出物とそれぞれ０、１、
１０、３０、６０及び１２０分間培養した後のＳサブユ
ニット。レーン９：１５０ｎｇの自然の大豆フェリチ
ン、レーン１０及び１１：１５０ｎｇの自然のフェリチ
ンを葉抽出物と各々６０及び１２０分間培養したもの。
【図４】（Ａ）大豆フェリチンの鉄取り込み反応の連続
曲線プロットを示すグラフである。 （Ｂ）集合されたフェリチンでのサブユニットの共存の
影響を示すグラフである。
曲線プロットを示すグラフである。 （Ｂ）集合されたフェリチンでのサブユニットの共存の
影響を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 吉原 利一 千葉県我孫子市我孫子1646 財団法人電力 中央研究所 我孫子研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA80 DA01 EA04 GA11 4H045 AA10 BA10 CA33 EA05 FA72 FA74
Claims (6)
- 【請求項１】 容易に切断されない分子量２８ｋＤａの
サブユニットを含むフェリチン。 - 【請求項２】 植物由来の容易に切断されない２８ｋＤ
ａのサブユニットを含む請求項１記載のフェリチン。 - 【請求項３】 植物が大豆である請求項２記載のフェリ
チン。 - 【請求項４】 ＴＰ（Transit Peptide ）切断後のアミ
ノ末端からの６残基の配列がAla-Ser-Asn-Ala-Pro-Ala
である分子量２８ｋＤａのサブユニットをコードするフ
ェリチン遺伝子。 - 【請求項５】 植物由来の請求項４記載のフェリチン遺
伝子。 - 【請求項６】 遺伝子組換えによる請求項４記載のフェ
リチン遺伝子。
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|---|---|---|---|---|
| KR101253505B1 (ko) * | 2010-12-16 | 2013-04-11 | 주식회사 고려비엔피 | 철 결합 활성을 갖는 신규한 페리틴 및 이를 암호화하는 유전자 |
| JP2013537804A (ja) * | 2010-09-08 | 2013-10-07 | チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド | 栄養補助食品およびその使用方法 |
| CN114015700A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-02-08 | 东北农业大学 | 大豆基因GmFER1在植物抗盐胁迫中的应用 |
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2001
- 2001-01-23 JP JP2001015096A patent/JP3932475B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| KR101253505B1 (ko) * | 2010-12-16 | 2013-04-11 | 주식회사 고려비엔피 | 철 결합 활성을 갖는 신규한 페리틴 및 이를 암호화하는 유전자 |
| CN114015700A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-02-08 | 东北农业大学 | 大豆基因GmFER1在植物抗盐胁迫中的应用 |
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