KR101253505B1 - 철 결합 활성을 갖는 신규한 페리틴 및 이를 암호화하는 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 페리틴, 이를 코딩하는 유전자, 이를 발현하는 발현벡터 및 숙주세포와 이들을 이용한 상기 페리틴의 생합성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 페리틴은 기존에 알려진 다른 페리틴과 달리 단일 서브유닛으로서 구성되어 숙주 세포에서 대량 발현하는데 매우 유리할 뿐만 아니라, 철분 흡수율이 뛰어나고 여러 가지 부작용을 나타내지 않기 때문에 의약산업, 식품산업 및 사료산업 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 페리틴은 기존에 알려진 다른 페리틴과 달리 단일 서브유닛으로서 구성되어 숙주 세포에서 대량 발현하는데 매우 유리할 뿐만 아니라, 철분 흡수율이 뛰어나고 여러 가지 부작용을 나타내지 않기 때문에 의약산업, 식품산업 및 사료산업 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 철 결합 활성을 갖는 신규한 페리틴 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다.
보다 상세하게는 두토막눈썹 참갯지렁이로부터 순수분리 되며, 약 20 kDa의 분자량을 갖는 서브유닛이 24 개로 이루어진 단독 중합체로서 페리틴 및 이 단백질을 암호화 하는 유전자에 관한 것이다.
철은 일반적으로 생물의 활동에 필수 요소로 생체 내에서 호흡에 필수적인 효소의 기능적 구성 성분으로서 헤모글로빈(hemoglobin)과 미오글로빈(myoglobin)의 구성성분, 영양분 연소 및 에너지 생성 과정에 관여하는 전자전달계 단백질의 구성성분, 페리틴(ferritin)과 같은 철 저장 단백질에 결합된 저장 형태 및 트랜스페린(transferrin)에 결합하여 이동 형태 등으로 체내에 존재하여 산소운반, 전자전달 등과 같은 생체 내의 생명 유지에 중요한 역할을 한다. 그 외, 철의 생리학적 기능은 DNA 복제에 필요한 아민류의 합성과 분해에도 관여하는 것으로 알려져 있으며(Dallman, Ann . Rev. Nutr . 6:13-40(1986)), 세포 손상을 일으키는 강력한 활성 산소인 수페록사이드(superoxide)와 페록사이드를 독성이 약한 물질로 전환시켜 주는 superoxide dismutase, catalase, peroxidase 및 glutathione peroxidase 와 같은 항산화 효소의 구성 성분(Basaga, Cell Biol . 68:989-998(1990); Floyd, FASEB J. 4:2587-2597(1990); Sies, Eur . J. Biochem . 215:213-219(1993)) 및 철 운반 단백질인 트랜스페린의 경우도 임파구 증식에 관여함으로서 인체 내 면역 작용에 필수적 요소로 인식되고 있으며(Anderson 등, In Vitro Cell . Develop . Biol . 18:766-774(1982)), 최근에는 페리틴이 핵에도 존재하여 DNA 보호 및 철에 의해 유도된 산화적 손상으로 부터 DNA의 악화를 막아주는 기능을 하는 것으로 보고되고 있다(Thompson 등, J. Cell Sci . 115:2155-2177(2002)). 따라서, 철이 결핍이 되었을 때 적혈구의 감소와 이로 인한 헤모글로빈 수의 감소로 인한 빈혈, 식용부진, 설사, 호흡곤란, 성장 부진 및 질병에 대한 면역력이 감소하는 등 중요한 생리작용을 하고 있는 필수 금속 이온이다. 이와 같이 중요한 요소로 작용하는 철은 동물에 있어서 꾸준한 공급이 요구되지만 철분은 생체내로 흡수될 때 체내 흡수율이 아주 낮아서 그의 이용울이 큰 문제점으로 제기되어 왔다. 현재, 가축에 철분 공급을 위해 시트르산 철(iron citrate), 푸르말산 철(iron fumarate) 및 숙신산 철(ferrous succinate) 등과 같은 유기 철 형태로 제조되어 공급하고 있으나 소화 흡수율 및 경제적인 면에서 많은 문제점을 가지고 있어 철의 흡수 문제점을 개선하기 위하여 효모를 이용한 철 급여 연구들이 시도되고 있다(Halliwell 등, Biochem . J. 219:114(1984); Askwith 등, Cell 76:403-410(1994); Georgatsou 등, Mol . Cell . Biol . 14:3065-3073(1994); Yun 등, J. Biol . Chem . 275:1070910715(2000)). 페리틴(Ferritin)은 세포 내의 대표적인 철 저장 단백질로 말의 비장과 간에서 최초로 분리가 이루어졌으며, 거의 모든 생물 종에 존재하며 지금까지 사람을 포함해서 동물, 식물 및 미생물 등 여러 생물체로부터 분리되었다. 대부분의 척추동물의 페리틴은 24개의 서브유닛으로 이루어진 분자량 약 450 kDa의 단백질로, 분자 중심에 생성된 내공(core)에는 옥시하이드로사이드 폴리머(oxyhydroxie polymer)가 있어 분자 당 헤모글로빈 1,200분자를 생합성할 수 있는 4500개의 철 원자를 결합할 수 있다(Aisen 등, Annu . Rev . Biochem . 49:357-393(1980); Theil 등, J. Biol . Chem . 265:4771-4774(1990); Harrison 등, Biochim . Biophys. Acta 1275:161-203(1996)). 페리틴의 주된 기능은 내공에 철을 Fe3 + 상태로 보유함으로써 철을 함유하는 단백질이 합성될 때 철을 공급하고, 유리된 철에 의한 세포 내 독성으로부터 세포를 보호할 수 있고, 또한 철을 필요로 할 때는 Fe2 + 상태로 환원시켜 공급한다(Baynes 등, Annu . Rev. Nutr . 10:133-148(1990); Theil, E. C., J. Biol . Chem . 265:4771-4774(1990)). 척추동물의 페리틴은 기능적 및 유전적으로 다른 두 가지 형태의 서브유닛, H(heavy/heart)형과 L(light/liver)형으로 구성되어 있으며 조직에 따라 그 조성 비율이 다른 여러 이소페리틴(isoferritin)이 존재한다. L형 서브유닛은 페리틴 분자의 내공을 형성하는데 관여하며, H형 서브유닛은 Fe2 +의 흡수에 필요한 페록시다제(ferroxidase) 활성을 가지고 있어 페리틴 흡수 촉진 및 Fe2 +의 산화 촉진 활성을 가지고 있어 H-rich 페리틴은 철분 운반의 기능이 높은 것으로 추측된다(Lawson 등, FEBS Lett . 254:207-210(1989); Stefanini 등, Bioche . 21:2293-2299(1982)). 전통적인 철분 공급원인 황산제일철 등의 무기물 제제는 철분 흡수 효율이 낮고 위염, 소화장애 등 부작용이 심해 철분 결핍증의 주요 대상이 유아 및 임산부임을 고려할 때 사용이 많은 제약점을 갖는다. 이를 대체할 제품은 페리틴으로 철분 결핍성 빈혈의 치료에 쓰이고 있어 무기물 제제보다 부작용이 작고 훨씬 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 현재 국내 및 외국에서 생산되는 페리틴은 소나 말의 비장으로부터 추출한 제품으로 바이러스 및 광우병 등의 위험요소가 있어 현재는 모두 품목허가 취소된 상태로 이를 대체할 제품 개발이 시급한 실정이다. 현재까지 효모 및 대장균에서 유전자 재조합 페리틴의 생산을 위한 다양한 연구가 진행되고 있지만(Park 등. Korean J. Biotechnol. Bioeng . 17:446-451(2002); Lee 등, Biochem . Biophys . Res . Comm . 298:225-229(2002); Chang 등, Korean J. Biotechnol . Bioeng . 19;352-357(2004); Hwang E.H., J. East Asian Soc . Dietary Life 16:93-98(2006); Lee 등, J. Microbiol . Biotechnol . 18:926-932(2008); 특허출원 10-2000-0041859; 특허출원 10-2000-0070806; 특허출원 10-2001-0030975; 및 특허출원 10-2003-0018579), 대부분 페리틴의 이형집합체의 발현에 관한 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 철분 흡수 효율이 높고, 부작용 및 위험 요소가 없는 재조합 페리틴의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 한국의 남해안 갯벌에 서식하고 있는 두토막눈썹 참갯지렁이로부터 유래된 페리틴이 철 결합 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 다른 척추동물 유래의 페리틴과는 달리 단일 서브유닛으로 구성된 단백질임을 확인하고, 이의 아미노산 서열 및 염기서열을 분석하고 이를 숙주 세포에서 대량 발현하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 부작용이 없고 철 결합 활성이 뛰어나며, 단일 서브유닛으로 구성되어 숙주 세포에서 대량 발현이 용이한 신규 페리틴을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페리틴을 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 페리틴을 대량으로 발현할 수 있는 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 페리틴을 포함하는 철분 보충용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 페리틴 발현용 형질전환 세포의 제조방법 및 상기 페리틴 생합성 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 또는 제2서열로 표시되는 철 결합 활성 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 서브유닛(subunit)으로서 포함하는 페리틴(ferritin)을 제공한다.
본 발명자들은 철분 흡수 효율이 높고, 부작용 및 위험 요소가 없는 재조합 페리틴의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 한국의 남해안 갯벌에 서식하고 있는 두토막눈썹 참갯지렁이로부터 유래된 페리틴이 철 결합 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 다른 척추동물 유래의 페리틴과는 달리 단일 서브유닛으로 구성된 단백질임을 확인하고, 이의 아미노산 서열 및 염기서열을 분석하고 이를 숙주 세포에서 대량 발현하여 본 발명을 완성하였다.
상기 서열목록 제1서열은 본 발명의 페리틴 단백질의 일 서브유닛을 나타내는 아미노산 서열이고, 상기 서열목록 제2서열은 페리틴 서브유닛의 활성형(active form) 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 제2서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 철 결합 활성을 나타내는 것으로서, 상기 아미노산 서열을 포함하는 한 그 출처에 관계없이 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 철 결합 활성 폴리펩타이드는 두토막눈썹 참갯지렁이(Perinereis aibuhitensis, 이하 청충이라 함)로부터 유래한 것이며, 보다 바람직하게는 한국의 남해안 갯벌에 서식하고 있는 두토막눈썹 참갯지렁이로부터 유래한 것이다.
본 발명에서 제공하는 신규한 페리틴 단백질은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 그 서브유닛으로 포함하는 것을 그 특징으로 한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 페리틴은 단일 서브유닛(subunit)으로 구성됨을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 24개의 단일 서브유닛으로 구성된다. 본 발명의 페리틴은 기존에 알려진 재조합 페리틴 또는 다른 척추동물 유래의 페리틴과는 달리 단일 서브유닛으로 구성되기 때문에, 이를 숙주 세포에서 대량 발현하여 인공 합성하는데 있어 매우 유리한 장점을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드 서열”은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 변형될 수 있으며 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에서 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간의 간 cDNA 라이브러리로부터 중합연쇄반응으로 클로닝한 것을 사용하거나 말, 소, 돼지, 닭, 지렁이, 갯지렁이 및 식물 유래의 페리틴 유전자를 사용할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열 또는 제4서열로 표시된다.
철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 상기한 서열목록 제3서열 또는 제4서열에 한정되지 않으며, 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, degeneracy를 포함하며 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열로서 제1서열 또는 제2서열로 표시되는 아미노산 서열과 100% 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 것이 아니라 하더라도, 그 결과물인 폴리펩타이드가 본 발명의 특징인 단일 서브유닛으로 페리틴을 구성할 수 있는 특성을 구비한 이상 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적 동일성을 갖는다고 할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl . Environ . Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol . Gen . Genet . 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터(예컨대, AprE 프로모터)라도 조절부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 및 pT7 시리즈 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터 및 HIV의 LTR 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및/또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 또는 E. coli HB101와 같은 E. coli 또는 바실러스 서브틸리스이고 보다 바람직하게는 E. coli BL21(DE3) 또는 바실러스 서브틸리스이다.
상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 그리고 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포를 포함한다. 또한, 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포도 숙주 세포로 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 포함하는 철분 보충용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 포함하는 철분결핍 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 폴리펩타이드는 상술한바와 같이 철 결합 활성이 뛰어난 단일 서브유닛으로서 페리틴 단백질을 구성하므로 이를 숙주 세포에서 대량 발현하는데 매우 유리할 뿐만 아니라, 무기물 철분 제제와 달리 철분 흡수율이 뛰어나고 여러 가지 부작용을 나타내지 않기 때문에 의약산업, 식품산업 및 사료산업 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물을 제공되는 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예컨대 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)를 포함하며 향미제로서는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 식품 조성물은 철분 보충용 기능성 식품을 제조하는 데 사용된다. 기능성식품이란 식품의약품안전청에서 개별인정을 통하여 약리 효과가 인정되는 식품을 의미한다.
상기 기능성식품은 본 발명의 유효성분인 본 발명의 철 결합 활성 폴리펩타이드 또는 이를 서브유닛으로 포함하는 페리틴 단백질을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
본 발명의 기능성식품에 있어 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드 또는 이를 서브유닛으로 포함하는 페리틴 단백질의 첨가량은, 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 상기 기능성식품이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 경우 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 100 중량%, 바람직하기로는 1 내지 100 중량%의 범위로 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물이 철분결핍 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사료 첨가용 조성물로 제조되는 경우, 사료의 품질을 개선하거나 가축의 건강 및 활동을 향상시킬 목적으로 첨가되는 영양분 등 기타 통상적으로 사용되는 첨가물을 추가적으로 포함할 수 있으며, 예컨대, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 철 결합 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 발현벡터로 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 페리틴 발현용 형질전환 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 철 결합 활성 폴리펩타이드를 발현하는 형질전환 세포의 제조방법은 재조합 숙주세포를 이용하여 상술한 철 결합 활성 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이므로 상술한 내용과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서, 숙주 세포로의 “형질전환” 및/또는 “형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4)) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press)(1989)). 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 형질감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용될 수 있다((Shaw et. al, Gene, 23:315(1983), 국제 공개특허 WO 89/05859). 또한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다(Graham et .al,, Virology, 52:456-457(1978)). 포유동물 숙주 세포로의 형질전환의 일반적인 방법 및 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 반 솔링겐(Van Solingen) 등의 문헌(J. Bact.,130:946(1977)) 및 히시아오(Hsiao) 등의 문헌(Proc . Natl . Acad . Sci .( USA ), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 페리틴 발현용 형질전환 세포의 제조방법은 청충으로부터 총 세포 RNA 를 추출·정제하는 단계; 상기 추출·정제된 RNA로부터 mRNA를 정제하는 단계; 상기 정제한 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 제조된 cDNA 라이브러리로부터 페리틴의 잘 보존된 서열을 바탕으로 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 제작하고, 중합연쇄반응에 의해 클로닝하고 상기 클로닝된 유전자가 페리틴 유전자임을 자동 염기서열 분석기에 의해 확인하는 단계; 클로닝된 페리틴 유전자가 도입된 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 페리틴 발현벡터를 발현용 균주에 형질전환시켜 재조합 균주를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기와 같이 제조한 형질전환 세포는 그 유전자를 발현시켜 페리틴을 다량으로 생산시킬 수 있으며, 이렇게 생산한 재조합 페리틴은 이를 유효성분으로 포함하는 철분 강화제, 사료 첨가제 또는 식품 첨가제 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기에서 상술한 형질전환 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생합성 하는 단계; 및 (b) 상기 생합성된 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는 페리틴의 생합성 방법을 제공한다.
본 발명의 철 결합 활성 폴리펩타이드 과발현용 형질전환 세포의 배양은 당업계에 공지된 통상의 배양 방법에 의해 배양될 수 있으며, 바람직하게는 단계 (a)는 발현 유도제(예컨대, IPTG) 존재 하에서 실시될 수 있다.
상기 형질전환 세포 내에서 생합성된 철 결합 활성 폴리펩타이드 또는 페리틴을 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 분리 또는 정제 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: B. Aurousseau et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 57(3):1558-9331( 1980); Frank C. Magne et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 34(3):127-129(1957)).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 신규한 페리틴, 이를 코딩하는 유전자, 이를 발현하는 발현벡터 및 숙주세포와 이들을 이용한 상기 페리틴의 생합성 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 페리틴은 기존에 알려진 다른 페리틴과 달리 단일 서브유닛으로서 구성되어 숙주 세포에서 대량 발현하는데 매우 유리할 뿐만 아니라, 철분 흡수율이 뛰어나고 여러 가지 부작용을 나타내지 않기 때문에 의약산업, 식품산업 및 사료산업 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 Ferr-F1 프라이머와 Ferr-R1 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응한 결과를 나타내는 1% 아가로즈 겔 전기영동 사진이다.
레인 M: 1 kb 래더 DNA 분자량 마커
레인 1: 0 ng 청충 mRNA
레인 2: 50 ng 청충 mRNA
레인 3: 100 ng 청충 mRNA 를 주형으로하여 중합효소 연쇄반응한 생성물 화살표는 1 Kb 의 페리틴 cDNA 밴드를 나타낸다.
도 2는 중합효소 연쇄반응에서 얻은 1 Kb DNA 단편의 염기 서열 및 이 서열로 유도된 아미노산 서열이다.
도 3은 청충 유래 성숙 페리틴의 아미노산 서열이다.
도 4는 청충 유래 성숙 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 대장균 발현용 플라스미드(pT7-Fer)의 모식도이다.
도 5는 청충 유래 성숙 페리틴 유전자가 클로닝되어 있는 pT7-Fer가 도입된 대장균 형질전환체에 IPTG를 첨가하여 배양함으로써 유도된 페리틴을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: IPTG 유도전
레인 2: IPTG 유도후 1시간
레인 3: IPTG 유도후 2시간
레인 4: IPTG 유도후 4시간
화살표는 발현 유도된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 6은 청충 유래 성숙 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 바실러스 발현용 플라스미드(pHPS-Fer)의 모식도이다.
PaprE 및 SS_AprE: AprE 프로모터 및 AprE 단백질 분비 시그널 서열
Ori322 및 Rep(pTA): 각각 E coli에서 플라스미드 복제에 필요한 복제원점 및 Bacillus Subtili에서 플라스미드 복제에 필요한 복제원점(replication origin)
Cm 및 Em: 각각 chloroamphenicol 및 erythromycin의 저항성을 갖는 선별마커(selection marker)이다.
도 7은 청충 유래 성숙 페리틴 유전자가 클로닝되어 있는 pHPS-Fer가 도입된 바실러스 형질전환체를 배양함으로써 유도된 페리틴을 SDS-PAGE(A) 및 Western blotting(B)으로 분석한 사진이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: 접종 전
레인 2: 배양 후 12시간
레인 3: 배양 후 24시간
화살표는 발현된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 8은 청충 유래 재조합 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 pHPS-Fer가 도입된 바실러스 형질전환체로부터 24 시간 동안 배양하여 생산된 재조합 페리틴의 native PAGE(A) 및 철 결합 활성을 철 staining (B)으로 분석한 사진이다. 화살표는 발현된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 8은 재조합 페리틴 단백질의 철 결합 활성 염색 결과를 분석한 사진이다.
레인 M: 1 kb 래더 DNA 분자량 마커
레인 1: 0 ng 청충 mRNA
레인 2: 50 ng 청충 mRNA
레인 3: 100 ng 청충 mRNA 를 주형으로하여 중합효소 연쇄반응한 생성물 화살표는 1 Kb 의 페리틴 cDNA 밴드를 나타낸다.
도 2는 중합효소 연쇄반응에서 얻은 1 Kb DNA 단편의 염기 서열 및 이 서열로 유도된 아미노산 서열이다.
도 3은 청충 유래 성숙 페리틴의 아미노산 서열이다.
도 4는 청충 유래 성숙 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 대장균 발현용 플라스미드(pT7-Fer)의 모식도이다.
도 5는 청충 유래 성숙 페리틴 유전자가 클로닝되어 있는 pT7-Fer가 도입된 대장균 형질전환체에 IPTG를 첨가하여 배양함으로써 유도된 페리틴을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: IPTG 유도전
레인 2: IPTG 유도후 1시간
레인 3: IPTG 유도후 2시간
레인 4: IPTG 유도후 4시간
화살표는 발현 유도된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 6은 청충 유래 성숙 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 바실러스 발현용 플라스미드(pHPS-Fer)의 모식도이다.
PaprE 및 SS_AprE: AprE 프로모터 및 AprE 단백질 분비 시그널 서열
Ori322 및 Rep(pTA): 각각 E coli에서 플라스미드 복제에 필요한 복제원점 및 Bacillus Subtili에서 플라스미드 복제에 필요한 복제원점(replication origin)
Cm 및 Em: 각각 chloroamphenicol 및 erythromycin의 저항성을 갖는 선별마커(selection marker)이다.
도 7은 청충 유래 성숙 페리틴 유전자가 클로닝되어 있는 pHPS-Fer가 도입된 바실러스 형질전환체를 배양함으로써 유도된 페리틴을 SDS-PAGE(A) 및 Western blotting(B)으로 분석한 사진이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: 접종 전
레인 2: 배양 후 12시간
레인 3: 배양 후 24시간
화살표는 발현된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 8은 청충 유래 재조합 페리틴의 유전자가 클로닝되어 있는 pHPS-Fer가 도입된 바실러스 형질전환체로부터 24 시간 동안 배양하여 생산된 재조합 페리틴의 native PAGE(A) 및 철 결합 활성을 철 staining (B)으로 분석한 사진이다. 화살표는 발현된 성숙 페리틴 밴드를 나타낸다.
도 8은 재조합 페리틴 단백질의 철 결합 활성 염색 결과를 분석한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> 청충으로부터 mRNA 분리
본 발명에서는 페리틴의 아미노산 서열을 결정하기 위해 먼저 청충(두토막눈썹 참갯지렁이, Perinereis aibuhitensis, 여수 근교 갯벌 서식)으로부터 mRNA를 분리하여 이를 역전사반응시켜 cDNA를 제조하였다. 이를 위해 먼저 청충의 장 조직을 분리한 후 샘부르크 등의 방법(Sambrook 등 Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)을 변형하여 mRNA를 분리하였다. 구체적으로, 청충으로부터 분리한 장 조직 1 g에 10 ㎖의 변성 용액(4 M 구아니디움 이소티오시아네이트, 25 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0, 0.5% 사코실 및 0.1 M 2-머캅토에탄올)을 넣은 후 얼음 하에서 파쇄하고, 5,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액에 동량의 페놀과 클로로포름을 넣어 4 내지 5회 반복 추출하여 단백질을 제거하고, 상기 단백질 제거된 상등액에 2 M 초산 나트륨과 이소프로필 알콜(isopropanol, Sigma, USA)을 첨가하여 총 세포 RNA 침전물을 회수하여 여기에 DEPC(diethylpyrocarbonate, Sigma, USA)로 처리한 증류수를 첨가해 RNA 침전물을 녹여 RNA를 수득하였다. 올리고 dT(oligo-dT) 셀룰로스컬럼(Collaborative Biomedical Products, USA)을 사용하여 샘부르크 등의 방법에 따라 이렇게 수득된 총 세포 RNA로부터 mRNA를 정제하였다. 정제한 mRNA 용액을 260 nm와 280 nm의 파장에서 각각 흡광도를 측정하여 RNA의 양과 순도를 결정한 후 cDNA 합성을 위한 역전사 반응의 주형으로 사용하였다.
<실시예 2> 청충의 cDNA 라이브러리 제조
상기 실시예 1에서 청충으로부터 분리한 mRNA를 이용해 cDNA 라이브러리 합성키트(BD Science, USA)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. cDNA 라이브러리 제조 방법은 제조사의 방침에 따라 수행하였다. cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 프라이머로는 하기의 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. cDNA의 제조는 구체적으로, 상기 실시예 1에서 분리한 mRNA 5 ㎍, 서열번호 5로 기재되는 CDS3' 프라이머(5' ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30NN 3', 10 uM) 1 ㎕, 서열번호 6으로 기재되는 CDS5' 프라이머(5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG 3', 10 uM) 1 ㎕, 적당량의 DEPC 처리된 물을 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응한 후 25 mM NaOH 1 ㎕를 가하여 68℃에서 30분 동안 방치시켜 mRNA의 2차 구조를 제거하였다. 2차 구조가 제거된 상기 반응물 11 ㎕, DEPC 처리된 물 71 ㎕, 10 X 반응 완충용액 10 ㎕, 10 mM dNTP 혼합용액 2 ㎕, 서열번호 5로 기재되는 CDS3' 프라이머(10 uM) 2 ㎕, 서열번호 7로 기재되는 5' PCR 프라이머(5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3', 10 uM) 2 ㎕, 중합효소(Advantage 2 polymerase, 50X) 2 ㎕를 가하여 최종 부피가 100 ㎕가 되게 한 후 95℃에서 1분, 72℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 1분, 68℃에서 10분 동안 반응을 3번 반복하여 이중 나선의 cDNA를 합성하고 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의해 합성된 cDNA를 회수하였다.
cDNA 라이브러리 제조를 쉽게 하기 위하여 회수한 cDNA를 79 ㎕의 DEPC 처리한 물에 녹이고, 10 ㎕의 10X Sfi I 반응 완충용액, 1 ㎕의 BSA 용액(10 ㎍/㎕) 및 10 ㎕의 Sfi I(10 U/㎕, Promega, USA)를 가한 뒤 50℃에서 2시간 동안 반응시켜 합성된 cDNA의 5' 말단 및 3' 말단에 Sfi I 제한 효소 자리가 생성되도록 하였다. Sfi I 으로 처리한 cDNA 용액을 크로마스핀-400 컬럼(BD Bioscience, USA)에 전개하여 컬럼으로부터 빠져나오는 용액을 1 방울씩 받아 cDNA의 크기별로 회수하여 0.5 kb 이상 되는 크기의 cDNA 만을 모았다. 상기 cDNA는 에탄올 침전에 의해 회수한 후 침전물을 7 ㎕의 멸균 수에 녹였다. 위의 cDNA 용액 1 ㎕, Sfi I 제한 효소로 처리한 람다 트리플렉스2 벡터(500 ng/㎕)(BD Science, USA) 1 ㎕, 10X 라이게이션 완충 용액 0.5 ㎕, 증류수 2 ㎕ 및 라이게이즈 효소 0.5 ㎕를 가하여 총 부피가 5 ㎕가 되게 하여 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 상기 회수된 cDNA가 람다 트리플렉스2 벡터의 Sfi I 제한효소 인식부위에 삽입되도록 하였다.
다음으로, 제조사의 지침에 따라 시험관내 패키징(In vitro packaging, GigaPackII, Stratagene, USA) 반응을 시킨 다음, 이를 대장균 XL1-Blue MRF' 균주(Invitrogen, USA)에 감염시켰다. 상기 감염된 대장균을 탑 아가로즈와 섞어 IPTG와 X-Gal이 잘 도포된 한천배지 위에 플레이팅하여 37℃에서 배양하여 플라크를 형성하도록 하였다. 형성된 전체 플라크 수 및 흰 플라크의 수를 측정하여 재조합 플라크(white color)의 생성 효율을 확인하여 플라크 형성능(titer)을 결정하였다. 안정하고 높은 타이터를 갖는 라이브러리를 만들기 위해 재조합 파지를 한천 플레이트(150 mm) 당 50,000 플라크 정도가 형성 되도록 숙주 세포에 감염하여 증폭한 후 SM 용액(5.8 g NaCl, 2 g MgSO4, 1M Tris-HCl 50 ㎖, pH 7.5, 2% 젤라틴 2 ㎖/리터)을 사용하여 재조합 파지들을 추출하여 타이터를 결정하고(1x106 pfu), DMSO를 첨가하여 -80℃에 보관하였다. 또한, 이 초기 cDNA 라이브러리를 다시 숙주세포에 감염시켜 2 x 1011 pfu로 플라크를 증폭시켰다.
<실시예 3> 청충 페리틴 유전자의 염기서열 분석 및 이로부터 번역되는 아미노산 서열의 분석
본 발명은 청충 페리틴을 발현하는 유전자를 상기의 실시예 2에서 제조한 청충의 cDNA 라이브러리에서 중합연쇄반응 방법으로 증폭한 후에 클로닝하고 증폭된 페리틴 유전자는 대장균의 플라스미드인 pGEM T easy 플라스미드(Promega, USA)에 삽입하였다. 상기 실시예 2에서 제조한 청충 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 서열번호 8로 기재되는 Fer-F1 프라이머(5' AAAACTTTGATATCGACTGTATCTTGGGAC 3', 10 uM) 및 서열번호 9로 기재되는 Fer-R1 프라이머(5' CTCTTGACCTTATAGGTAGGTCATCTA 3', 10 uM) 쌍으로 하여 중합효소 연쇄반응을 시켰다. 이때, 중합효소 연쇄반응은 상기 기재된 프라이머를 각각 1 pmole 농도로 첨가하였으며, 10X 반응 완충용액, 0.5 mM dNTP, Taq DNA 중합효소 1-2 unit를 넣고 95℃에서 5분간 전처리 하고, 이후에 95℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 2분의 연속 반응을 30회 반복하여 DNA를 증폭한 후에, 72℃에서 10분간 처리하여 반응을 마무리 지었다. 중합 연쇄반응 방법 후 1% 아가로즈 젤(TAE 완충용액) 전기영동으로 DNA 절편의 생산을 확인하고(도 1), 상기 증폭된 약 1 Kb 크기의 DNA 절편을 겔로부터 분리하여, 이를 pGEM-T easy 플라스미드에 서브클로닝하고 그의 염기서열을 결정한 뒤 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 알아보았다. 그 결과, 클로닝된 페리틴은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가짐을 알 수 있었으며, 전체 DNA의 크기는 1027 bp로 개방해독틀(open reading frame)의 크기는 종료서열(TAA)를 포함하여 서열번호 4로 기재되는 522 bp이다. 본 발명에서 결정한 페리틴의 염기서열을 블라스트로 분석한 결과, 5’ 위치의 번역되지 않는 부분(5’-UTR)은 철 조절 단백질(iron regulatory protein)이 결합할 수 있도록 stem-loop 구조를 형성하는 iron response element 서열(서열 22-50번)을 가진다(도 2). 청충 유래의 페리틴 전구체는 서열번호 1로 기재되는 173개의 아미노산으로 구성되어 있으며(도 3), N-말단 부분에 16개의 아미노산으로 이루어진 분비서열 펩티드를 가지며 활성형 페리틴의 N-말단은 17번째 아미노산인 아스파트산(Asp)을 갖는 156개의 아미노산으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 서열번호 1로 기재되는 페리틴의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, 여러 종의 페리틴과 아미노산 서열의 유사성을 보였다. 구체적으로, 흰이빨참갯지렁이(Periserrula leucophryna) 87%, 소진드기( Rhipicephalus microplus) 83%, 빗갯지렁이(Pectinaria gouldii) 80%, 참굴(Crassostrea gigas) 79%, 우렁이(Lymnaea stagnalis) 79%, 갯민숭달팽이(Aplysia californica) 76%, 진주조개(Pinctada fucata) 76%, 꼬막(Tegillarca granosa) 76%, 붉은 지렁이(Eisenia andrei) 76%, 창고기(Branchiostoma lanceolatum) 76%, 오분자기(Haliotis diversicolor) 75%, 백합(Meretrix meretrix) 72%, 가리맛조개(Sinonovacula constricta) 75%, 개구리 64%, 사람 H 사슬 64%, 쥐 H 사슬 63%, 소 H 사슬 63%, 돼지 H 사슬 60%, 강낭콩 56% 및 초파리 36%의 아미노산 서열 유사성을 나타냄을 확인하였다. 이에, 본 발명의 청충 유래의 페리틴은 기존의 페리틴 단백질과 서열 상동성이 적어 신규한 페리틴 임을 알 수 있었다.
<
실시예
4> 페리틴의
대장균에서
발현용 플라스미드 구축
본 발명에서 분석된 청충의 페리틴 유전자가 클로닝 되어있는 플라스미드로부터 서열번호 2로 기재되는 활성형 페리틴을 대량 생산하기 위하여 중합효소 연쇄 반응을 수행함으로써 활성형 페리틴을 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이 때, 각 프라이머는 강력한 T7 프로모터를 갖는 pT7-7 플라스미드(Tabor S and Richardson C, A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc Natl Acad Sci USA, 262:10741078(1985))에 삽입이 잘 되도록 5'-말단에 Nde I, 3'-말단에 Hind III 제한 효소 자리를 갖게끔 서열번호 10으로 기재되는 Ferr-T7F 프라이머(5' GGGGCATATGGAAGCAGGCATCAACAAACAGATCAAC 3' , 10 uM) 및 서열번호 11로 기재되는 Ferr-T7R 프라이머(5' CCCCAAGCTTTTAGCTGTCAAGGTCTTTGTCGAAGG 3', 10 uM)를 합성하였다. 상기의 Ferr-T7F 프라이머의 밑줄친 부분은 Nde I 제한효소 인식부위 서열이고, Ferr-T7R 프라이머의 밑줄친 부분은 Hind III 제한효소 인식부위 서열이다. 상기 Ferr-T7F 및 Ferr-T7R로 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행해 증폭된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동한 후 DNA 용출 키트를 사용하여 유전자를 순수하게 분리하였다. 상기 분리된 청충 유래 성숙 페리틴 유전자 및 발현용 플라스미드 pT7-7를 Nde I 및 Hind III 로 각각 처리하고 아가로즈 겔 전기영동한 후 DNA 용출 키트를 사용하여 각각을 순수하게 분리하였다. 분리한 플라스미드와 성숙 페리틴 유전자를 삼부르크 등의 방법에 따라 DNA 단편을 라이게이션하고 형질전환하였다. 형질전환용 세포 E. coli BL21(DE3)(Invitrogen, USA) 100 ㎕에 라이게이션 반응된 DNA 0.1 내지 0.5 ㎍을 첨가하여 얼음에 30분간 방치한 후 42℃에서 1.5분간 열 충격을 주고, 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 앰피실린(50 ㎍/㎖), IPTG 및 X-gal이 첨가된 엘비 아가 평판 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양하여 형질 전환체들을 얻었다. 형질 전환된 대장균은 항생제가 첨가된 엘비 액체배지에 접종하여 배양하고, 그 배양액의 일부를 취하여 알칼라인 용해 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 클로닝된 부위의 제한효소로 절단하여 페리틴 DNA 단편이 도입되었는지를 확인하였다. 이렇게 하여 성숙 페리틴 유전자가 도입된 발현용 벡터를 “pT7-Fer”로 명명하였다(도 4).
<
실시예
5>
대장균에서
재조합 페리틴 단백질 유도 및
SDS
-
PAGE
분석
상기 실시예 4에서 재조합 플라스미드 pT7-Fer로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3)를 암피실린(50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하여 종균으로 사용하였다. 암피실린을 포함하는 100 ㎖의 LB 배지(500 ㎖ 삼각 플라스크)에 상기 종균 1 ㎖을 취하여 접종한 후, 600 nm에서 흡광도가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 키웠다. 단백질의 합성을 유도하기 위하여 IPTG를 1 mM이 되도록 첨가한 다음, 매 시간별로 배양액 1 ㎖을 취하여 단백질 분석을 위한 시료 제조를 위하여 사용하였다. 배양액으로부터 얻어진 균체를 SDS-PAGE 시료 처리 용액(0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 10% 글리세롤 및 0.1% 브로모페놀 블루) 20 ㎕에 현탁하여 100℃에서 5분간 가열하여 세포를 파괴한 후 단백질 분석을 위하여 사용하였다. 단백질 전기영동은 램리등의 방법(Laemmli 1970, Nature , 227, 680-685)으로 수행하였다. 일정한 전기장에서 분리가 끝난 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액(Coomassie brilliant blue)에 넣어 1시간 정도 염색한 후 탈색용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 옮겨 탈색하여 생산된 단백질을 확인하였다. 그 결과, ITPG 유도에 의해 시간이 지남에 따라 본 발명의 페리틴의 발현이 유도됨을 확인하였다(도 5).
<
실시예
6> 페리틴의
바실러스
발현용 플라스미드 구축
본 발명에서 분석된 청충 유래 페리틴을 코딩하는 서열번호 4의 DNA 서열이 클로닝 되어있는 pT7-Fer 플라스미드와 AprE 프로모터 및 세포 밖으로 단백질을 분비하기 위한 신호 서열(Signal sequence)을 갖는 바실러스 형질전환용 pHPS-SP(Cai Heng et al., Expression and secretion of an acid-stable a-amylase gene in Bacillus subtilis by SacB promoter and signal peptide, Biotechnology Letters 27:17311736(2005))을 Nde I과 Eco RI으로 처리하고 전기 영동한 후 DNA 용출 키트로 각각 분리하였다. 분리한 각 페리틴 DNA 단편 및 pHPS-SP DNA 단편을 접합시킨 후, E.coli JM109에 실시예 4와 같이 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여 클로닝된 부위의 제한효소로 절단하여 서열번호 4의 DNA 단편이 도입되었는지를 확인한 후, 상기 형질전환 벡터를 “pHPS-Fer”로 명명하였다(도 6). 형질전환된 대장균으로부터 pHPS-Fer 플리스미드를 분리하고 말로니 등(Mallonee 등 1989, Appl. Environ. Microbiol. 55: 2517-2521)의 방법으로 상기 pHPS-Fer 플리스미드 DNA로 바실러스 균주를 형질전환 하였다. 구체적으로, B. subtilis를 티에스비(TSB, trypsic soy browth) 배지에 접종하고 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 상기 배양액을 12.5 ㎖의 PGY 배지(1.5% 펩톤/0.5% 포도당/0.5% 이스트 추출물)에 1% 되게 접종한 후 600 nm에서 흡광도가 약 0.5에 도달할 때까지 배양하고 12.5 ㎖의 PGY/0.5 M 수크로스 배지와 최종 농도가 10 U/ml 되게 페니실린을 가하고 2시간 동안 더 배양하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 회수한 세포를 2.5 ㎖의 SMMT 용액(0.5M 수크로스/20mM 말레이트/20mM MgCl2/TSB)에 현탁시키고, 최종 농도가 10 mg/㎖되게 리소자임을 가하고 35℃에서 1 시간 반응하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 회수한 세포를 2 ㎖의 SMMT 용액에 현탁시킨 후 0.1 ㎖씩 분주하여 형질 전환용 세포로 사용하였다. 상기의 방법으로 제조한 B. subtilis 형질전환용 세포용액 0.1 ㎖에 0.1 ㎖의 pHPS-Fer 플라스미드 DNA(약 1㎍), 1.5 ㎖의 40% PEG8000 용액을 가한 후 잘 혼합하여 주고 0℃에서 2.5 분간 방치 후 37℃에서 약 5 분 동안 더 배양하였다. 상기 배양액에 5 ㎖의 SMMP(0.5M 수크로스/20mM 말레이트/20mM MgCl2/1.5% 펩톤/0.5% 포도당/0.5% 이스트 추출물) 용액을 가한 후 간단하게 혼합한 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. 상기의 회수한 세포에 1 ㎖의 SMMP 용액을 가한 후 30℃에서 약 30분 동안 배양하고 클로로암페니콜을 포함하는 TSB 아가 플레이트에 도말한 후 37℃에서 2-5 일간 배양하여 형질 전환체들을 얻었다. 형질 전환된 바실러스는 클로로암페니콜이 첨가된 TSB 액체배지에 접종하여 배양하고, 그 배양액의 일부를 취하여 알칼라인 용해 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 클로닝된 부위의 제한효소로 절단하여 페리틴 DNA 단편이 도입되었는지를 확인하였다.
<
실시예
7>
바실러스에서
재조합 페리틴 단백질 유도 및
SDS
-
PAGE
분석
상기 실시예 6에서 재조합 플라스미드 pHPS-Fer로 형질 전환된 B. subtilis를 클로로암페니콜을 포함하는 TSB 액체배지에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하여 종균으로 사용하였다. 클로로암페니콜을 포함하는 100 ㎖의 TSB 배지(500 ㎖ 삼각 플라스크)에 상기 종균 1 ㎖을 취하여 접종한 후, 매 시간별로 배양액 1 ㎖을 취하여 원심분리(10,000 X g, 10 min)하여 세포 배양액을 회수하였다. 상기 배양액 0.1 ㎖에 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 잘 혼합한 후 -20℃에서 약 1시간 동안 방치 후 원심분리(13,000 X g, 15 min)하여 침전물을 회수하고 상온에서 30분간 방치하여 잔존하는 에탄올을 제거하고 단백질 분석을 위한 시료 제조를 위하여 사용하였다. 상기 침전물을 SDS-PAGE 시료 처리 용액 20 ㎕에 현탁하여 100℃에서 5분간 가열하고 실시예 5의 방법으로 전기영동하여 본 발명의 페리틴 발현을 확인하였으며(도 7A), 페리틴 항체를 이용하여 항체 면역 블라팅(Western blotting) 한 결과 분자량 약 20 kDa에서 밴드를 나타내어 본 발명의 페리틴 발현을 확인하였다(도 7B).
<
실시예
8> 재조합 페리틴 단백질의 철 결합 활성 염색
상기 실시예 7에서 생산한 재조합 페리틴의 철 결합 활성 여부 문헌(Joo 등, J. Microbiol . 44:54-63(2006))에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 구체적으로 상기 배양액 0.1 ㎖에 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 잘 혼합한 후 -20℃에서 약 1시간 동안 방치 후 원심분리(13,000 X g, 15분)하여 침전물을 회수하고 상온에서 30분간 방치하여 잔존하는 에탄올을 제거하고 철 결합 활성 분석을 위한 시료 제조를 위하여 사용하였다. 상기 침전물을 native PAGE 시료 처리 용액(0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% 글리세롤 및 0.1% 브로모페놀 블루) 20 ㎕에 현탁하고, 전기영동은 램리(Laemmli) 등의 방법으로 수행하였다. 이 때, 사용한 native PAGE 젤 농도는 8%로 하였으며, 전개 용액은 SDS를 제거한 용액을 사용하였으며, 냉장실에서 전기영동을 실시하여, PAGE 젤의 열 발생을 최소화 하였다. 일정한 전기장에서 분리가 끝난 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액(Coomassie brilliant blue)에 넣어 1시간 정도 염색한 후 탈색용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 옮겨 탈색하여 생산된 단백질을 확인하였다(도 8A). 철 결합 활성은 다음의 방법으로 실시하였다. 간단하게 설명하면, 25 ㎖의 용액 A(1 ㎖ HCl/24 ㎖ 증류수)와 25 ㎖의 용액 B(1 g potassium ferricyanide/25 ㎖ 의 증류수)를 혼합한 용액에 PAGE 겔을 조심스럽게 넣고 상온에서 약 15분간 서서히 저어 주어주었다. 이 때, PAGE 겔은 용액에 완전히 잠기도록 하였다. 교반 후, 반응 용액을 버리고 겔을 50 ㎖의 증류수를 가하고 상온에서 약 5분간 서서히 저어 주면서 겔을 세척하였으며, 세척 과정은 3 번 반복하였다. 세척한 겔에 50 ㎖의 기질용액(25 mg 디아미노벤지딘을 50 ㎖의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 용액에 녹인 용액) 및 40 ㎕의 H2O2를 가하고 상온에서 약 30-60분간 서서히 저어 주면서 밴드를 확인하였다. 실험결과 갈색의 밴드가 뚜렷하게 관찰되어 본 발명의 재조합 페리틴의 우수한 철 결합 활성을 확인할 수 있었다(도 8B).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (14)
- 서열목록 제1서열 또는 제2서열로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 철 결합 활성 폴리펩타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 두토막눈썹 참갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)로부터 유래한 것을 특징으로 폴리펩타이드.
- 제 1 항의 폴리펩타이드를 서브유닛(subunit)으로서 포함하는 페리틴(ferritin).
- 제 3 항에 있어서, 상기 페리틴은 단일 서브유닛으로 구성된 것을 특징으로 하는 페리틴.
- 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드.
- 제 5 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열 또는 제4서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드.
- 제 5 항 또는 제 6 항의 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터.
- 제 7 항에 있어서, 상기 발현벡터는 대장균 발현용 플라스미드 또는 바실러스 발현용 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제 7 항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩타이드를 포함하는 철분 보충용 식품조성물.
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩타이드를 포함하는 사료첨가용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 페리틴(ferritin) 발현용 형질전환 세포의 제조방법:
(a) 제 5 항 또는 제 6 항의 뉴클레오타이드를 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오타이드가 삽입된 발현벡터로 세포를 형질전환시키는 단계.
- (a) 제 13 항의 형질전환 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생합성 하는 단계; 및 (b) 상기 생합성된 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는 페리틴(ferritin) 생합성 방법.
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