JP2002202283A - バイオセンサ - Google Patents
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Abstract
るようにフィルタを改良して、全血を測定対象とするバ
イオセンサを提供する。 【解決手段】 絶縁性の基板、前記基板上に設けられた
測定極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素
と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反
応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給
路、試料液供給部、および前記試料液供給路と試料供給
部との間に設けられた、血球をろ過するフィルタを具備
し、前記フィルタで血球をろ過された血漿が毛細管現象
によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバ
イオセンサにおいて、フィルタの二次側の中央部を、左
右両端部より試料液供給路内へ突出させる。
Description
いて、迅速、高感度、かつ簡便に定量することができる
バイオセンサ、特にコレステロールセンサに関する。
ンサについて説明する。代表的なものとして、絶縁性の
基板上にスクリーン印刷等の方法により、少なくとも測
定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系上
に、親水性高分子、酸化還元酵素および電子メディエー
タを含む酵素反応層を形成したものがある。酸化還元酵
素にはグルコースオキシダーゼが、また電子メディエー
タにはフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キ
ノン誘導体などの金属錯体や有機化合物などがそれぞれ
用いられる。酵素反応層には、必要に応じて緩衝剤が加
えられる。このバイオセンサの酵素反応層上に、基質を
含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して、酵素
と基質が反応し、この反応に伴い電子メディエータが還
元される。酵素反応終了後、この還元された電子メディ
エータを電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液中
の基質濃度を求めることができる。
反応の結果生じた電子メディエータの還元体を電極で酸
化し、その酸化電流値からグルコース濃度を求める。こ
のようなバイオセンサは、測定対象物質を基質とする酵
素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的に
は可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロール
オキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼお
よびコレステロールエステラーゼを用いれば、各種医療
機関で診断指針に用いられる血清中のコレステロール値
を測定することができる。コレステロールエステラーゼ
の酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤
を添加することにより、コレステロールエステラーゼの
活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮するこ
とができる。しかし、反応系に界面活性剤が含まれるこ
とから、界面活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、グル
コースセンサのように全血そのものを測定することは不
可能である。
センサに供給するために、試料液供給路の開口部付近に
ろ過部を設ける提案がなされている。しかし、試薬層に
は、一般に溶解しやすい部分と溶解し難い部分がある。
溶解しやすい部分は、試料液供給路の縁に沿う部分で、
中央部は溶解し難い。フィルタを通過した試料液は、試
料液供給路の縁を優先的に流れるため、中央部分が完全
に溶け終わっていないにもかかわらず、試料液が試料液
供給路の終端側の空気孔を塞いでしまい、中央部分に気
泡が残る。そのような場合は、測定に必要な量の試料液
が試料液供給路内へ導入されず、酵素反応が十分進行し
ない。また、電極上を気泡が覆うことで電極の実質的な
反応面積が縮小され、測定誤差が生じる。
な不都合をなくし、血球をろ過された血漿が迅速に電極
系に達するように改良したバイオセンサを提供すること
を目的とする。本発明は、高精度で応答性が優れ、全血
を測定対象とするコレステロールセンサを提供すること
を目的とする。
は、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極と対
極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メデ
ィエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含
み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料供給
部、および前記試料液供給路と試料供給部との間に設け
られた、血球をろ過するフィルタを具備し、前記フィル
タで血球をろ過された血漿が毛管現象によって前記試料
液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであっ
て、前記フィルタの二次側の中央部が、左右両端部より
前記試料液供給路内へ突出していることを特徴とする。
前記フィルタの二次側部分は、前記基板の表面と同じ平
面への投影図において、弧状または半円形に形成されて
いることが好ましい。前記試料液供給路の断面積は、前
記フィルタの一次側の断面積より小さいことが好まし
い。そのようにするには、前記試料液供給路の幅を2.
0mm以下、試料液供給路の電極系を有する部分の高さ
を0.2mm以下とするのが好ましい。
る空隙部を有する多孔体からなり、この多孔体は毛管現
象により血液を前記試料供給部側から試料液供給路側へ
移動させるが、血漿と血球との流通抵抗の差により血球
をろ過する作用を有する。このフィルタには、ガラス繊
維、セルロース、パルプなどの好ましくは親水性の繊維
から成る不織布、ろ紙、その他の多孔質体が用いられ
る。
と反応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供
給路と、試料供給部との間に設けられた、血球をろ過す
るフィルタを具備し、前記フィルタで血球をろ過された
血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引さ
れるようにしたバイオセンサにおいて、前記フィルタの
二次側の中央部が、左右両端部より前記試料液供給路内
へ突出していることを特徴とする。この構成により、妨
害物質である血球をフィルタにより除去し、速やかにセ
ンサの電極系へ血漿を流入させることができる。すなわ
ち、フィルタの二次側の中央部が、左右両端部より試料
液供給路内へ突出していることにより、試料液供給路の
中央部分を優先的に流れることで、中央部分の試薬層を
完全に溶解するので、気泡を試料液供給路の中央部分に
残すことなく、速やかに試料液供給路に濾過された血漿
を流入させることができる。反応層は、通常試薬の水溶
液を展開し、乾燥することにより形成される。そのよう
な反応層は、中央部分は端部よりも厚みが厚くなること
も影響して、試料液は反応層の薄い部分から流入し、中
央部分が溶解する前に血漿が空気孔を塞ぐこととなる。
本発明によれば、フィルタの二次側の中央部が試料液供
給路内へ突出させたことにより、中央部分へ優先的に試
料液を流入させることが可能となる。
は、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールオキ
シダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレ
ドックス化合物から選択することができる。酸化還元酵
素は、測定対象物を基質とする酵素であり、グルコース
を測定対象とするセンサでは、グルコースオキシダーゼ
を用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロー
ル値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒
する酵素コレステロールオキシダーゼまたはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼとコレステロールエステルをコレ
ステロールに変化させる過程を触媒する酵素コレステロ
ールエステラーゼを用いる。コレステロールエステラー
ゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性
剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼ
の活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮する
ことができる。
近傍の位置に配置する。電極系を設けた基板に組み合わ
されて基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供
給路を形成するカバー部材を有するセンサでは、前記試
料液供給路に露出する部分や試料液供給路の開口部など
に設けることができる。いずれの位置であっても、導入
された試料液によって反応層が容易に溶解して電極系に
到達できることが好ましい。電極を保護し、形成される
反応層の剥離を抑制するために、電極系上に接して親水
性高分子層が形成されることが好ましい。また、電極系
以外でも、反応層を形成する際の下地として親水性高分
子層が形成されるか、または最下層の反応層に親水性高
分子が含まれることが好ましい。電子メディエータを含
む層は、溶解性を高めるために、界面活性剤と分離する
ことが好ましい。また、保存安定性のために、コレステ
ロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールエステ
ラーゼと分離することが好ましい。血糖値を測定するバ
イオセンサでは、試料液が反応層へ導入されるのを容易
にするため、電極系上に形成された層などを被覆するよ
うに、脂質を含む層を形成する例がある(たとえば特開
平2−062952号公報)。本発明のコレステロール
を測定するバイオセンサでは、反応層の一部が凍結乾燥
法により形成されるか、カバー部材自体に界面活性剤が
固定化される構成をとるのが好ましく、そのような構成
にすると、脂質層はなくてもよい。親水性高分子として
は、水溶性セルロース誘導体、特にエチルセルロース、
ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースの他、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ゼラチン、ポリアクリル酸およびその塩、デンプ
ンおよびその誘導体、無水マレイン酸の重合体およびそ
の塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、ポリ
−2−ヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いるこ
とができる。界面活性剤には、n−オクチル−β−D−
チオグルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシル
エーテル、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルト
シド、ジュークロースモノラウレート、デオキシコール
酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオ
キシコールアミドおよびポリオキシエチレン(10)オ
クチルフェニルエーテルから選択することができる。脂
質としては、使用する場合、レシチン、ホスファチジル
コリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質
で、両親媒性脂質が好適に用いられる。酸化電流の測定
方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照
極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正
確な測定が可能である。
詳細に説明する。図1は好ましい実施の形態に係るバイ
オセンサの分解斜視図である。1は絶縁性樹脂、例えば
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板を示
す。この基板1は、図1における左側の上面に、スクリ
ーン印刷により銀ペーストを印刷してリード2、3およ
び電極系の下地を形成してある。基板1上には、さらに
樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷す
ることにより、測定極4と対極5を含む電極系を形成し
ている。また、特定の領域に絶縁性ペーストを印刷する
ことにより絶縁層6を形成してある。絶縁層6は、測定
極4および対極5の露出部分の面積を一定とし、かつリ
ード2および3を部分的に覆っている。基板1は、さら
に右側部分に開口7を有する。この開口7の電極系側9
は、後述するフィルタ10の二次側先端を位置決めする
ように、基板の表面と同じ平面への投影図において略半
円形になっている。この半円形部9のに隣接して方形の
凹部8が設けられている。前記の基板1に組み合わせる
スペーサ11は、左側に後述の試料液供給路を形成する
ためのスリット12を有し、右側に基板1の開口7と同
じ形状の開口15を有する。開口15は、左側に半円形
部19を有し、これに隣接して方形の凹部14を有す
る。
ット12の終端部側に連通する空気孔22、スペーサ1
1の開口15の右半分、および基板1の開口7の右半分
に連通する開口25、開口15および7の凹部14およ
び8を有する部分と連通する開口24、並びに両開口2
4と25とを仕切る仕切部26を有する。上カバー31
は、上補助カバー21の空気孔22および開口25にそ
れぞれ連通する空気孔32および開口35を有する。補
助下カバー41は、上補助カバー21の開口24に対応
させて開口44を有する。下カバー51は平板からな
る。以上の上カバー31、上補助カバー21、スペーサ
11、下補助カバー41および下カバー51は、基板1
と同様にポリエチレンテレフタレートからできている。
フィルタ10は、ガラス繊維濾紙からなり、基板1と同
じ平面への投影図において、図3のように、上辺が2m
m、下辺が4mmで、高さが5mmの台形部10aとそ
の上辺に連なった半径1mmの半円部10bからなる。
に所定の部材に反応層を形成した後、下カバー51上
に、下補助カバー41をのせ、次いで、基板1をその絶
縁層6の左端が下補助カバー41の左端と一致するよう
に、下補助カバー41上にのせる。そして、フィルタ1
0をその二次側、すなわち左端が基板1の半円形部9お
よびスペーサ11の半円形部19に嵌合するように、下
補助カバー41上にセットする。次に、これらの上に、
スペーサ11、上補助カバー21および上カバー31を
組み合わせる。こうして上記の基板1、スペーサ11、
補助カバー21および41並びにカバー31および51
を図1の一点鎖線で示すような位置関係をもって張り合
わせることにより、図2のようなセンサが組み立てられ
る。フィルタ10は、上補助カバー21の仕切部26お
よび下カバー41により台形部10aの下辺側、すなわ
ち一次側が、また上補助カバー21と下補助カバー41
により二次側の端部がそれぞれ上下から押さえられる。
上カバー31の開口35、上補助カバー21の開口2
5、スペーサ11の開口15の右側部分、および基板1
の開口7の右側部分が連通して、下補助カバー41を底
とする凹部を形成する。この凹部が試料供給部となる。
ー41の開口44、並びにこれらに対応する開口15お
よび開口7の凹部14および8の部分は、フィルタ10
を一回り囲む空隙部を形成する。この空隙部の存在によ
り、フィルタを通過せずにフィルタを保持している上補
助カバー21や下補助カバー41などの表面を伝わって
血球が電極系へ流入することを阻止することができる。
基板1と上補助カバー21との間に、スペーサ11のス
リット12によって形成される空隙部は、試料液供給路
を形成する。この試料液供給路の終端部は、空気孔22
および32によって外部と連通する。試料液供給路の始
端部には、フィルタ10の二次側先端部が入り込んでい
る。試料液供給路は、断面が長方形で、その短辺が高さ
方向となっている。そして、図2からわかるように、試
料液供給路の始端部は、基板1の半円形部9の部分では
基板の厚み分だけ深くなっている。この部分に入り込ん
でいるフィルタ10の二次側先端は、基板1の表面と同
じ平面への投影図が半円形であり、図3からわかるよう
に、中央部が試料液供給路内へ突出している。
応層を示している。基板1の電極系上に、親水性高分子
の層17と反応層18aが形成されている。また、試料
液供給路の天井に相当する上補助カバー21の下面側
に、反応層18bが形成されている。この反応層18b
は、上補助カバー21にスペーサ11を張り合わせ、こ
れを逆さにして、スリット12により形成される凹部
に、反応層形成用液を滴下し、乾燥することにより形成
することができる。図示の例では、センサは、その構造
をわかりやすくするために、6種類の部材から作製され
ているが、上カバー31と上補助カバー21、またはさ
らにスペーサ11を1つの部材で構成されていてもよ
い。また、下補助カバー41と下カバー51、またはさ
らに基板1が1つの部材から構成されていてもよい。
ルを測定するには、試料の血液を上カバー31の開口3
5から試料供給部となる凹部へ供給する。ここに供給さ
れた血液は、フィルタ10の一次側の端部からその内へ
浸透する。フィルタ10内では、血球の浸透速度は液体
成分である血漿より遅いので、血漿がフィルタの二次側
の端部からしみだす。そして、このしみだした血漿は、
電極系を覆う位置またはその直上のカバー裏面に担持さ
れた反応試薬を溶解しながら、電極系近傍からさらに空
気孔22の部分までの試料液供給路全体を満たす。試料
液供給路全体が液体で満たされると、フィルタ10内の
液体の流動も停止し、その時点で、血球はフィルタ10
の二次側の端部に到達せず、その位置に留め置かれる。
したがって、フィルタ10は、血漿が試料液供給路全体
を満たすだけの量が通過してなお血球がフィルタの二次
側に達しない程度に、血漿と血球との流通抵抗の差があ
るように設計される。本発明のフィルタは、孔径1〜7
μm程度のディプスフィルタが好適である。
より溶解された反応層と血漿中の測定成分、コレステロ
ールセンサであればコレステロール、との化学反応が生
じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、
血漿中の成分を定量することができる。図4は、試料液
供給路の電極系近傍における反応層の配置の例を示す。
基板1の電極系上には、親水性高分子のカルボキシメチ
ルセルロースのナトリウム塩(以下単にCMCで表す)
の層17、および反応試薬の例えば電子メディエータを
含む層18aが形成してある。また、上カバー31、上
補助カバー21、およびスペーサ11を組み合わせたカ
バー部材の裏面には、試料液供給路に露出する面に、酸
化還元酵素を含む反応層18bが形成されている。
構成するスリット12の、液が流通する方向に垂直な断
面積は、いずれもフィルタ10の断面積に比べて小さく
してある。そして、フィルタ10は、その全体がほぼ均
一な密度を有するものとしてある。このように、試料液
供給路の断面積をフィルタ10の一次側断面積より小さ
くすることにより、フィルタで血球をろ過された血漿が
毛管現象によって試料液供給路内に迅速に吸引されるよ
うにすることができる。反応層には、一般に溶解しやす
い部分と溶解し難い部分がある。溶解しやすい部分は、
試料液供給路の縁、すなわちスペーサ11のスリット1
2の壁面に沿う部分で、中央部は溶解しにくい。フィル
タを通過した試料液は、スペーサ沿いを優先的に流れる
ため、中央部分が完全に溶け終わっていないにもかかわ
らず、試料液が空気孔を塞いでしまうことがある。フィ
ルタの二次側の中央部が左右両端部より試料液供給路内
へ突出していることにより、試料液供給路内の中央部を
優先的に流れ、これによって気泡を試料液供給路の中央
部分に残すことなく、速やかにセンサ内に血漿を流入さ
せることが可能となる。
流入する過程を説明する図であり、試料液供給路12、
空気孔22(32)およびフィルタ10を平面図で表し
ている。(a)は初期状態であり、(b)はフィルタ1
0で濾過された血漿20が試料液供給路12内に入り始
めた状態を表す。フィルタの二次側の中央部が左右両端
部より試料液供給路内へ突出していることにより、試料
液供給路内の中央部を優先的に流れる様子がわかるであ
ろう。こうして血漿は、空気孔22まで達するので、気
泡を内包した状態となることはない。一方、図7は先端
が平面的な従来のフィルタ10’を用いた場合の血漿の
流れを表している。試料液供給路12’の縁に沿う部分
の試料層が溶解しやすいので、血漿は端の部分で優先的
に流れ、従って、中央に気泡30を内包した状態になり
やすいのである。
ィルタの一次側の幅は5mm以下、厚さは1mm以下が
好ましい。試料液供給路の開口部の幅は2mm以下、高
さは200μm以下が好ましい。また、基板の厚さは、
フィルタ厚さが例えば450μm、試料液供給路の高さ
が100μmの場合、350μm程度が好ましい。
ンサで、反応層18aには電子メディエータが含まれ、
反応層18bにはコレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールエステラーゼおよび界面活性剤が含まれる。こ
のセンサの作製手順を以下に示す。まず、基板1の電極
系上に、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩
(以下CMCと略す)の0.8wt%水溶液を5μl滴
下し、50℃の温風乾燥機中で10分間乾燥させること
によりCMC層17を形成した。次に、フェリシアン化
カリウム水溶液4μl(フェリシアン化カリウム70m
M相当)をCMC層17上に滴下し、50℃の温風乾燥
機中で10分間乾燥させることにより、フェリシアン化
カリウムを含む層18aを形成した。ノカルジア由来の
コレステロールオキシダーゼ(EC1.1.3.6、以
下ChODと略す)とシュードモナス由来のコレステロ
ールエステラーゼ(EC.3.1.1.13、以下Ch
Eと略す)を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリ
オキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(T
ritonX−100)を添加した。この混合液を、上
カバー31、上補助カバー21、およびスペーサ11を
組み合わせたカバー部材のスリット12の部分に形成さ
れる凹部に1.3μl滴下し、−196℃の液体窒素に
て凍結後、フラスコ内に収納して凍結乾燥機で一晩乾燥
させることにより、1ユニット(U)/センサのコレス
テロールオキシダーゼ、2.5U/センサのコレステロ
ールエステラーゼおよび2wt%の界面活性剤を含む反
応層18bを形成した。
mmであり、従って、試料液供給路における電極系を有
する部分の高さは100mmである。この試料液供給路
の開口部は、基板1の開口7の半円形部9に相当する部
分で、基板1の厚み350mmだけ深くなっている。試
料液供給路の幅は2mmである。フィルタ10は、厚さ
約450μmのガラス繊維ろ紙で、上辺2mm、下辺4
mm、高さ5mmの台形部10aと、台形部の上辺に連
なる半径1mmの半円部10bからなる形に打ちぬい
た。そのフィルタを、図3のように、その先端部分が基
板の凹部7に嵌合するように設置した。この後、前記の
3つの部材からなるカバー部材と、基板1、下補助カバ
ー41および下カバー51を一体化した部材とを接着す
ることにより、コレステロールセンサを作製した。
を開口35から試料供給部に導入し、3分後に対極を基
準にして測定極にアノード方向へ+0.5Vのパルス電
圧を印加し、5秒後に作用極と対極との間に流れる電流
値を測定した。その結果を図6および表1に示す。
によれば、コレステロール濃度と応答値との間に良好な
直線性が得られる。
フィルタにより除去し、気泡を生じることなく、また気
泡を生じたとしても容易に除去することが可能で、血球
除去後の血漿を迅速に電極系へ供給することができる。
従って、応答特性に優れた電気化学的バイオセンサを提
供することができる。
解斜視図である。
平面図である。
る図である。
特性を示す図である。
する過程を説明する図である。
Claims (9)
- 【請求項1】 絶縁性の基板、前記基板上に設けられた
測定極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素
と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反
応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給
路、試料供給部、および前記試料液供給路と試料供給部
との間に設けられた、血球をろ過するフィルタを具備
し、前記フィルタで血球をろ過された血漿が毛管現象に
よって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイ
オセンサであって、前記フィルタの二次側の中央部が、
左右両端部より前記試料液供給路内へ突出していること
を特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項2】 前記フィルタの二次側部分が、前記基板
の表面と同じ平面への投影図において、弧状または半円
形に形成されている請求項1記載のバイオセンサ。 - 【請求項3】 前記試料液供給路の幅が2.0mm以下
である請求項1または2記載のバイオセンサ。 - 【請求項4】 前記試料液供給路の電極系を有する部分
の高さが0.2mm以下である請求項3記載のバイオセ
ンサ。 - 【請求項5】 前記フィルタの一次側部分を上下から保
持する押さえ部を有し、それら押さえ部間の距離が1.
5mm以下である請求項3または4記載のバイオセン
サ。 - 【請求項6】 前記フィルタの二次側部分を上下から保
持する押さえ部を有し、それら押さえ部間の距離が1.
5mm以下である請求項3または4記載のバイオセン
サ。 - 【請求項7】 前記フィルタの一次側の幅が5.0mm
以下である請求項5または6記載のバイオセンサ。 - 【請求項8】 前記試料液供給路の開口端に、前記フィ
ルタの二次側部分の下部に嵌合する凹部を有する請求項
1または2記載のバイオセンサ。 - 【請求項9】 前記試料液供給路の断面積が前記フィル
タの一次側の断面積より小さい請求項1または2記載の
バイオセンサ。
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