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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, spezifisch
einen Cholesterinsensor, der eine schnelle, hochempfindliche, einfache
Bestimmung eines spezifischen Bestandteils in einer Probe durchführen kann.
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Stand der Technik
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Es
wird eine Beschreibung eines Beispiels eines herkömmlichen
Biosensors gegeben, in Bezug auf einen Glukosesensor.
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Bei
einem typischen Glukosesensor wird ein Elektrodensystem einschließlich wenigstens
einer Messelektrode und einer Gegenelektrode auf einer isolierenden
Grundplatte durch ein Verfahren wie etwa Siebdruck gebildet, und
eine Enzymreaktionsschicht einschließlich eines hydrophilen Polymers,
einer Oxidoreduktase und eines Elektronenvermittlers wird auf dem
Elektrodensystem gebildet. Als Oxidoreduktase wird Glukoseoxidase
verwendet; als der Elektronenvermittler wird ein Metallkomplex,
eine organische Verbindung oder ähnliches,
wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat oder ein Chinonderivat
verwendet. Ein Puffer wird, wenn notwendig, zu der Enzymreaktionsschicht
gegeben.
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Wenn
eine Probenlösung
mit einem Substrat auf die Enzymreaktionsschicht in dem Glukosesensor getropft
wird, wird die Enzymreaktionsschicht aufgelöst, um eine Reaktion des Enzyms
mit dem Substrat zu verursachen. Diese Reaktion führt zur
Reduktion des Elektronenvermittlers. Nach Abschluss der Enzymreaktion kann
eine Substratkonzentration in der Probenlösung von einem Wert des Oxidationsstroms
bestimmt werden, welcher erzeugt wird, wenn dieser reduzierte Elektronenvermittler
elektrochemisch oxidiert wird.
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In
diesem Typ von Glukosesensor wird nämlich ein Reduktant des Elektronenvermittlers,
erzeugt als ein Ergebnis der Enzymreaktion, an der Elektrode oxidiert,
um eine Glukosekonzentration aus dem Oxidationsstromwert zu bestimmen.
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In
der Theorie ist ein derartiger Biosensor für die Messung verschiedener
Substanzen unter Verwendung eines Enzyms anwendbar, dessen Substrat
zu messen ist. Wenn zum Beispiel Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase
und Cholesterinesterase als Oxidoreduktase verwendet werden, ist
es möglich,
einen Cholesterinwert in einem Serum zu messen, um als ein diagnostischer
Indikator in verschiedenen medizinischen Institutionen verwendet
zu werden.
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Da
die Enzymreaktion der Cholesterinesterase sehr langsam abläuft, kann
mit einem geeigneten dazugegebenen oberflächenaktiven Stoff, die Aktivität der Cholesterinesterase
verbessert werden, um die für
die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu reduzieren.
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Jedoch
hat der in dem Reaktionssystem vorhandene oberflächenaktive Stoff eine nachteilige
Wirkung auf Hämozyten,
was es unmöglich
macht, das Vollblut selbst zu messen, wie es im Glukosesensor gemacht wird.
Aus diesem Grund gab es einen Vorschlag, dass ein Filterteil in
der Nähe
einer Öffnung
in einem Probenlösungzufuhrweg
für eine
unverzügliche
Zufuhr nur von Plasma mit daraus filtrierten Hämozyten zu dem Sensor vorgesehen
wird.
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Jedoch
enthält
eine typische Enzymreaktionsschicht einen leicht löslichen
Teil und einen schwer löslichen
Teil. Ein Teil entlang der Kante des Probenlösungzufuhrweges ist leicht
zu lösen,
während
der zentrale Teil davon schwer löslich
ist.
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Da
die durch den Filter tretende Probenlösung vornehmlich über die
Kanten des Probenlösungzufuhrweges
fließt,
schließt
sie eine Lüftungsöffnung an
der Endseite des Probenlösungzufuhrweges,
vor der vollständigen
Lösung
des zentralen Teils davon, wobei Blasen in dem zentralen Teil zurückgelassen
werden. In einem derartigen Fall gibt es das Problem, dass die Probenlösung nicht
in einer Menge notwendig für
die Messung in den Probenlösungszufuhrweg
eingebracht wird, wodurch die Enzymreaktion nicht ausreichend abläuft.
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Überdies
gibt es ein weiteres Problem, dass die Blasen, die die Elektrode
bedecken, die wesentliche Reaktionsfläche der Elektrode reduzieren,
was in einem Messfehler resultiert.
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Es
ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten
Biosensor zur Verfügung zu
stellen, so dass das Plasma mit daraus filtrierten Hämozyten
unverzüglich
das Elektrodensystem erreicht, um die vorher beschriebenen Nachteile
zu überwinden.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen
Cholesterinsensor mit hoher Genauigkeit und hervorragender Ansprechfähigkeit
zur Verfügung
zu stellen, der Vollblut messen kann.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit: einer
isolierenden Grundplatte; einem Elektrodensystem, welches auf der
Grundplatte vorgesehen ist, und eine Messelektrode und eine Gegenelektrode
hat; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase
und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das
Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Lüftungsöffnung an der
Endseite davon hat; ein Probenzufuhrteil; und einen Filter, welcher
zwischen dem Probenlösungszufuhrweg
und dem Probenzufuhrteil angeordnet ist und Hämozyten filtriert, wo mit diesem
Filter filtriertes Plasma mit Hämozyten
darin in den Probenlösungszufuhrweg
aufgrund von Kapillarität
eingesaugt wird, und dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale Teil
eines sekundären
Seitenteils des Filters in den Probenlösungszufuhrweg mehr als sowohl
das rechte, als auch das linke Ende davon hineinragt.
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Es
ist bevorzugt, dass der sekundäre
Seitenteil des Filters bogenförmig
oder halbkreisförmig
in der Projektion davon ist, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche
die gleiche wie die Oberfläche
davon ist.
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Es
ist bevorzugt, dass der Probenlösungzufuhrweg
eine Breite von nicht mehr als 2,0 mm und der Elektrodensystemabschnitt
des Probenlösungzufuhrweges
eine Höhe
von nicht mehr als 0,2 mm hat.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor Druckteile für das Halten
des primären
Seitenteils des Filters von den oberen und unteren Seiten hat, und
der Abstand dazwischen nicht mehr als 1,5 mm ist.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor Druckteile für das Halten
der sekundären
Seitenteile des Filters von den oberen und unteren Seiten hat und
der Abstand dazwischen nicht mehr als 1,5 mm ist.
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Es
ist bevorzugt, dass der primäre
Seitenteil des Filters eine Breite von nicht mehr als 5,0 mm hat.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor an der Öffnung in
dem Probenlösungzufuhrweg
ein konkaves Teil ausgestattet mit dem oberen Anteil oder dem unteren
Anteil des sekundären
Seitenteils des Filters umfasst.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass in dem Biosensor die Querschnittsfläche des
Probenlösungzufuhrweges kleiner
als die Querschnittsfläche
des primären
Seitenteils des Filters ist.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass in dem Biosensor die Querschnittsfläche des
sekundären
Seitenteils des Filters kleiner als die Querschnittsfläche des
primären
Seitenteils davon ist.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 ist
eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht, die einen Biosensor
gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
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Die 2 ist
eine Längsschnittansicht,
die den Biosensor der 1 veranschaulicht.
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Die 3 ist
eine Draufsicht, die den Biosensor der 1 und 2 veranschaulicht,
mit Ausnahme der Reaktionsschicht und des oberen Deckelelements.
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Die 4 ist
eine vergrößerte Schnittansicht,
die den Hauptteil des Biosensors der 1 bis 3 veranschaulicht.
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Die 5 ist
ein Diagramm, die den Vorgang des Flusses des Plasmas im Probenlösungzufuhrweg erläutert.
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Die 6 ist
ein Diagramm, die die Ansprecheigenschaften des Cholesterinsensors
in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
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Die 7 ist
ein Diagramm, das den Vorgang des Flusses des Plasmas in dem Probenlösungzufuhrweg
in einem herkömmlichen
Beispiel erläutert.
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Bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit: einer
isolierenden Grundplatte; einem Elektrodensystem, welches auf der
Grundplatte vorgesehen ist, und eine Messelektrode und eine Gegenelektrode
hat; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase
und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das
Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Lüftungsöffnung an
der Endseite davon hat; ein Probenzufuhrteil; und einen Filter,
welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg
und dem Probenzufuhrteil angeordnet ist und Hämozyten filtriert, wo mit diesem
Filter filtriertes Plasma mit Hämozyten
darin in den Probenlösungszufuhrweg
aufgrund von Kapillarität
eingesaugt wird, und dadurch gekennzeichnet ist, dass der zentrale
Teil eines sekundären
Seitenteils des Filters in den Probenlösungszufuhrweg mehr als sowohl
das rechte, als auch das linke Ende davon hineinragt.
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Hierbei
besteht der in der vorliegenden Erfindung verwendete Filter aus
einem porösen
Material mit Räumen,
die miteinander in einer dreidimensionalen Art und Weise verbunden
sind. Dieses poröse
Material bewegt Blut von der Probenlösungzufuhrseite in Richtung
der Seite des Probenlösungszufuhrweges
aufgrund von Kapillarität,
und dient zum Filtern von Hämozyten
auf der Grundlage eines Unterschieds in den Zirkulationswiderständen des
Plasmas und der Hämozyten.
Ein Vlies aus einer Faser, wie etwa Glasfaser, Cellulose oder Zellstoff,
Filterpapier oder ein anderes poröses Material, kann als der
Filter eingesetzt werden. Der Filter ist bevorzugt hydrophil.
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In
dem erfindungsgemäßen Biosensor
mit der derartig beschriebenen Struktur werden die Hämozyten, welche
interferierende Substanzen sind, mit dem Filter entfernt, so dass
das Plasma unmittelbar in das Elektrodensystem fließen kann.
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Das
bedeutet, dass weil der zentrale Teil des sekundären Seitenteils des Filters
in den Probenlösungzufuhrweg
mehr als sowohl das rechte als auch das linke Ende des sekundären Teils
hineinragt, fließt
das Plasma vornehmlich in den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges.
Da dieses Plasma vollständig
die Reagenzschicht, wie etwa eine Reaktionsschicht und eine hydrophile
Polymerschicht, die in dem zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges
aufgebracht sind, kann das filtrierte Plasma unmittelbar in den
Probenlösungzufuhrweg
fließen,
ohne Blasen in den zentralen Teil zurückzulassen.
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Normalerweise
wird die Reaktionsschicht durch Entwickeln und Trocknen einer wässrigen
Lösung
des Reagenz geformt. Beeinträchtigt
durch die Tatsache, dass der zentrale Teil einer derartigen Reaktionsschicht dicker
als deren Ende wird, fließt
die Probenlösung
(Plasma) in den dünneren
Teil (Ende) der Reaktionsschicht in dem Probenlösungzufuhrweg, und füllt die
Lüftungsöffnung auf,
vor der vollständigen
Lösung
des zentralen Teils der Reaktionsschicht.
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Im
Gegensatz dazu, wird erfindungsgemäß das Hereinragen des zentralen
Teils des sekundären
Seitenteils des Filters in den Probenlösungzufuhrweg den vornehmlichen
Fluss der Probenlösung
in den zentralen Teil des Probenlösungszufuhrweges erlauben.
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Es
ist zu beachten, dass: der primäre
Seitenteil des Filters sich auf einen Teil bezieht, einschließlich dem
Punkt, der zuerst im Kontakt mit der Probenlösung nach dem Auftropfen davon
auf den Biosensor gerät und
diese dann absorbiert; der sekundäre Seitenteil des Filters bezieht
sich auf einen Teil einschließlich
dem Punkt von welchem die Probenlösung (Plasma) in Richtung des
inneren des Probenlösungzufuhrweges
geht.
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Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete Elektronenvermittler kann
ausgewählt
werden aus Kaliumferricyanid, einer Redoxverbindung mit Elektronentransferfähigkeit
zu und aus Oxidoreduktase, wie etwa Cholesterinoxidase, oder ähnliche.
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Oxidoreduktase
ist ein Enzym, dessen Substrat zu messen ist. Glukoseoxidase wird
in einen Sensor angewendet, bei dem Glukose der zu messende Gegenstand
ist. Für
die Messung eines Cholesterinwerts in Blutserum, das als ein diagnostischer
Indikator zu verwenden ist, wird das Enzym Cholesterinoxidase für die Katalyse
einer Oxidationsreaktion von Cholesterin, oder das Enzymcholesterinesterase
für die
Katalyse des Vorgangs der Umwandlung von Cholesterindehydrogenase
und Cholesterinester zu Cholesterin verwendet. Da die Enzymreaktion
der Cholesterinesterase langsam abläuft, kann mit einem geeigneten
oberflächenaktiven
Stoff die Aktivität
der Cholesterinesterase verbessert werden, um die für die Gesamtreaktion
erforderliche Zeit zu reduzieren.
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Der
Elektronenvermittler und die Oxidoreduktase werden auf oder in der
Nähe des
Elektrodensystems in dem Sensor aufgebracht. In einem Sensor, welcher
mit der Grundplatte vorgesehen mit dem Elektrodensystem kombiniert
ist und ein Deckelelement umfasst, welches den Probenlösungzufuhrweg
für eine
Zufuhr der Probenlösung
zu dem Elektrodensystem zwischen der Grundplatte und dem Sensor
bildet, kann der Elektronenvermittler und die Oxidoreduktase an
der Stelle angeordnet werden, wie etwa dem Teil, welcher zu dem Probenlösungzufuhrweg
oder der Öffnung
in dem Probenlösungzufuhrweg
exponiert ist.
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Wo
immer die Stelle ist, ist es bevorzugt, dass die eingebrachte Probenlösung die
Reaktionsschicht leicht lösen
kann und dann an dem Elektrodensystem ankommt. Es ist ebenfalls
bevorzugt, die hydrophile Polymerschicht in Kontakt mit der oberen
Fläche
des Elektrodensystems zu bilden, um die Elektrode zu schützen und
zu vermeiden, dass die gebildete Reaktionsschicht abgelöst wird.
Anstelle der Bildung der hydrophilen Polymerschicht auf dem Elektrodensystem
kann sie als die Grundlage der Reaktionsschicht gebildet werden, oder
das hydrophile Polymer kann in der Grundreaktionsschicht enthalten
sein.
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Der
in der Reaktionsschicht enthaltene Elektrodenvermittler wird bevorzugt
von dem oberflächenaktiven
Stoff für
die Erhöhung
ihrer Löslichkeit
getrennt. Ebenfalls wird die Reaktionsschicht einschließlich des Elektrodenvermittlers
bevorzugt von dem Enzym Cholesterinesterase getrennt, welches die
Oxidationsreaktion von Cholesterin katalysiert, für den Zweck
der Konservierung der Stabilität.
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Es
gab einen Vorschlag, dass in einem Biosensor für Messung eines Blutzuckerspiegels
eine lipidhaltige Schicht gebildet wird, um eine Schicht gebildet
auf dem Elektrodensystem oder ähnlichem
abzudecken, um das Einbringen der Probenlösung in die Reaktionsschicht
zu erleichtern (z. B. japanische offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 2-062952). In dem erfindungsgemäßen Biosensor für die Messung
von Cholesterin ist es bevorzugt, einen Teil der Reaktionsschicht
durch Gefriertrocknen zu bilden, oder den oberflächenaktiven Stoff auf dem Deckelelement
selbst zu fixieren. Die Verwendung einer derartigen Struktur eliminiert
die Notwendigkeit für
die Bildung einer Lipidschicht.
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Das
Beispiel für
das hydrophile Polymer enthält
wasserlösliche
Cellulosederivate, wie etwa Ethylzellulose, Hydroxypropylcellulose
oder Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol,
Gelatine, Polyacrylsäure
und deren Salze, Stärke
und deren Derivate, Polymere von Maleinsäureanhydrid oder deren Salze,
Polyacrylamid, Methacrylatharz und Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat.
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Der
oberflächenaktive
Stoff kann ausgewählt
werden aus n-Octyl-β-D-Thioglucosid,
Polyethylenglucolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-Maltosid,
Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurodeoxycholat,
N,N-bis(3-D-Glukonamidpropyl)deoxycholamid
und Polyoxyethylen (10) Octylphenylether.
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Wenn
ein Lipid verwendet wird, kann bevorzugt ein amphipathisches Phospholipid,
wie etwa Lecithin, Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin
verwendet werden.
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Als
das Messverfahren für
den Oxidationsstrom ist ein 2-Elektrodensystem bestehend aus nur
einer Messelektrode und einer Gegenelektrode und ein 3-Elektrodensystem
mit einer Referenzelektrode anwendbar, und in dem 3-Elektrodensystem
ist eine genauere Messung möglich.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Verwendung von
spezifischen Ausführungsformen
beschrieben, mit Bezugnahme auf die Zeichnungen.
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Die 1 ist
eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht, die einen Biosensor
in Übereinstimmung
mit einer bevorzugten Ausführungsform
veranschaulicht.
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Eine
isolierende Grundplatte 1 wird aus einem isolierenden Harz,
wie etwa Polyethylenterephthalat, hergestellt. Auf der oberen Fläche der
linken Seite der Grundplatte 1 in der 1 wird
eine Silberpaste durch Siebdruck aufgedruckt, um die Leitungen 2 und 3 und
die Grundlage eines Elektrodensystems zu bilden. Eine leitfähige Kohlenstoffpaste
einschließlich
eines Bindeharzes wird weiterhin auf die Grundplatte 1 gedruckt,
um ein Elektrodensystem einschließlich einer Messelektrode 4 und
einer Gegenelektrode 5 zu bilden.
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Ebenfalls
wird eine isolierende Paste in einem spezifischen Bereich gedruckt,
um eine isolierende Schicht 6 zu bilden. Die isolierende
Schicht 6 hält
die exponierten Flächen
der Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 konstant
und bedeckt teilweise die Leitungen 2 und 3.
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Die
Grundplatte 1 umfasst ferner eine Öffnung 7 an dem rechten
Seitenteil davon. Ein halbkreisförmiges
Teil 9 auf der Elektrodensystemseite der Öffnung 7 hat
im Wesentlichen die Form eines Halbkreises in einer Projektion davon,
die sich der flachen Fläche
nähert,
welche die gleiche ist, wie die Oberfläche der Grundplatte, um so
das Ende des sekundären
Seitenteils des folgenden erwähnten
Filters 10 zu lokalisieren. Ein rechteckig konkaves Teil 8 wird
neben dem Halbkreisteil 9 vorgesehen.
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Ein
Abstandshalter 11, der mit der Grundplatte 1 kombiniert
wird, umfasst einen Schlitz 12, für die Bildung des im folgenden
erwähnten
Probenlösungzufuhrweges
auf der linken und einen Öffnung 15 auf
der rechten, welche identisch zu der Öffnung 7 in der Grundplatte 1 geformt
ist. Die Öffnung 15 umfasst
einen halbkreisförmigen
Teil 19 auf der linken und einen rechteckigen konkaven
Teil 14 daneben.
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Ein
oberer Hilfsdeckel 21 umfasst: eine Lüftungsöffnung 22, die mit
der Endseite des Schlitzes 12 in dem Abstandshalter 11 verbunden
ist; eine Öffnung 25,
die mit der rechten Hälfte
der Öffnung 15 in
dem Abstandshalter 11 und mit der rechten Hälfte der Öffnung 7 in
der Grundplatte 1 verbunden ist; und eine Öffnung 24,
die mit dem konkaven Abschnitten 14 und 8 der Öffnungen 15 bzw. 7 verbunden
ist; und einen trennenden Teil 26 für die Trennung der Öffnungen 24 und 25.
Ein oberer Deckel 31 umfasst eine Lüftungsöffnung 32 bzw. eine Öffnung 35,
die mit der Lüftungsöffnung 22 und
der Öffnung 25 in
dem oberen Hilfsdeckel 21 verbunden sind.
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Ein
unterer Hilfsdeckel 41 umfasst eine Öffnung 44 entsprechend
der Öffnung 24 in
dem oberen Hilfsdeckel 21. Ein unterer Hilfsdeckel 51 wird
aus einer flachen Platte hergestellt.
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Der
vorher erwähnte
obere Deckel 31, der obere Hilfsdeckel 21, der
Abstandshalter 11, der untere Hilfsdeckel 41 und
der untere Deckel 51 werden aus Polyethylenterephthalat
hergestellt, wie in dem Fall mit der Grundplatte 1.
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Der
Filter 10 wird aus einem Glasfaserfilterpapier hergestellt
und in der Projektion davon, die sich der Planfläche der Grundfläche nähert, welche
die gleiche wie die Grundplatte 1 ist, umfasst er einen
trapezförmigen
Teil 10a mit einem oberen Saum vom 2 mm, einem unteren
Saum von 4 mm und einer Höhe
von 5 mm und einem halbkreisförmigen
Teil 10b mit einem Radius von 1 mm, die den oberen Saum
des trapezförmigen Teils 10a verbinden.
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Dieser
Sensor wird hergestellt durch Bildung einer Reaktionsschicht auf
einem vorbestimmten Element, wie im folgenden beschrieben, Anordnen
des unteren Hilfsdeckels 41 auf den unteren Deckel 51 und Anordnen
der Grundplatte 1 auf dem unteren Hilfsdeckel 41,
so dass die linke Kante der isolierenden Schicht 6 der
Grundplatte 1 an der linken Kante des unteren Hilfsdeckels 41 ausgerichtet
wird. Der Filter 10 wird dann auf den unteren Hilfsdeckel 41 gesetzt,
so dass der sekundäre
Seitenteil, nämlich
die linke Kante, des Filter 10 in den halbkreisförmigen Teil 9 der
Grundplatte 1 und den halbkreisförmigen Teil 19 des
Abstandshalters 11 passt. Auf diesen Elementen werden nacheinander
der Abstandshalter 11, der obere Hilfsdeckel 21 und
der obere Deckel 31 kombiniert. Hierbei ermöglicht die
Laminierung der Grundplatte 1, des Abstandshalters 11, der
Hilfsdeckel 21 und 41 und der Deckel 31 und 51 in
einer derartigen Positionsanordnung gezeigt durch die gestrichelten
Linien in der 1, die Herstellung eines derartigen
Sensors, wie in der 2 gezeigt.
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In
dem Filter 10 presst der trennende Teil 26 des
oberen Hilfsdeckels 21 und des unteren Deckels 41 die
untere Saumseite, nämlich
den primären
Seitenteil des trapezförmigen
Abschnitts 10a, von den oberen und unteren Seiten. Der
obere Hilfsdeckel 21 und der untere Hilfsdeckel 41 pressen
ebenfalls das Ende des sekundären
Seitenteils von den oberen und unteren Seiten. Die Öffnung 35 in
dem oberen Deckel 31, die Öffnung 25 in dem oberen
Hilfsdeckel 21, der rechte Seitenteil der Öffnung 15 in
dem Abstandshalter 11 und der rechte Seitenteil der Öffnung 7 in
der Grundplatte 1 sind miteinander verbunden, um ein konkaves
Teil zu bilden, dessen Grund der untere Hilfsdeckel 41 ist.
Dieser konkave Teil dient als ein Probenzufuhrteil.
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Die Öffnung 24 in
dem oberen Hilfsdeckel 21, die Öffnung 44 in dem unteren
Hilfsdeckel 41 und die konkaven Teile 14 und 8 der Öffnungen 15 und 7,
welche der Öffnung 24 und
der Öffnung 44 entsprechen, bilden
einen Raum, der den Filter 10 umgibt. Da dieser Raum vorhanden
ist, ist es möglich,
die Hämozyten daran
zu hindern, durch die Oberflächen
des oberen Hilfsdeckels 21, des unteren Hilfsdeckels 41 usw.,
welche den Filter halten, in das Elektrodensystem zu fließen, anstatt
durch den Filter zu treten.
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Der
durch den Schlitz 12 in dem Abstandshalter 11 zwischen
der Grundplatte 1 und dem oberen Hilfsdeckel 21 gebildete
Raum bildete einen Probenlösungzufuhrweg.
Das Ende dieses Probenlösungzufuhrweges ist
mit der Außenseite über die
Lüftungsöffnungen 22 und 32 verbunden.
Das Ende der sekundären
Seite des Filters 10 ist in der Führung des Probenlösungzufuhrweges
eingebunden. Der Querschnitt des Probenlösungzufuhrweges ist rechtwinklig,
dessen kürzere
Seite der Richtung der Höhe
des Probenlösungzufuhrweges
entspricht. Wie aus der 2 ersichtlich, hat die Führung des Probenlösungzufuhrweges
eine Tiefe äquivalent
zu der Dicke der Grundplatte in dem halbkreisförmigen Teil 9 der
Grundplatte 1. Die Führung
des sekundären
Seitenteils des Filters 10, die in diesem Teil beteiligt
ist, ist halbkreisförmig
in der Projektion davon, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche
die gleiche wie die Oberfläche
der Grundplatte 1 ist, und der zentrale Teil ragt in den
Probenlösungzufuhrweg
hinein, wie aus der 3 ersichtlich.
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Das
Beispiel des Filters, dessen Führung
des sekundären
Seitenteils halbkreisförmig
in der Projektion davon ist, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche
die gleiche wie die Oberfläche
der Grundplatte 1 ist, kann einen Filter in dreieckiger
oder „homebase"-Form in der Projektion
davon haben, die sich der Planfläche
der Grundplatte nähert,
welche die gleiche wie die Oberfläche der Grundplatte 1 ist.
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Eine
Reaktionsschicht wird bei der 2 weggelassen,
während
sie in der 4 gezeigt wird. Eine hydrophile
Polymerschicht 17 und eine Reaktionsschicht 18a werden
auf dem Elektrodensystem der Grundplatte 1 gebildet. Eine
Reaktionsschicht 18b wird auf der unteren Flächenseite
des oberen Hilfsdeckels 21 gebildet, welche der Decke des
Probenlösungszufuhrweges
entspricht. Der Abstandshalter 11 wird an den oberen Hilfsdeckel 21 gebunden,
das Ganze wird umgedreht, um das konkave Teil mit dem Schlitz 12 zu
bilden, und eine Lösung
zur Bildung einer Reaktionsschicht wird auf das erhaltene konkave
Teil getropft, gefolgt durch Trocknen, um die Reaktionsschicht 18b zu
bilden.
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Während der
in 1 gezeigte Biosensor unter Verwendung von sechs
Typen von Elementen hergestellt wird, um die Konfiguration davon
leicht verständlich
zu machen, kann der obere Deckel 31 und der obere Deckel 21,
oder ferner einschließend
den Abstandshalter 11, aus einem Element aufgebaut werden.
Der untere Hilfsdeckel 41 und der untere Deckel 51,
oder ferner einschließlich
die Grundplatte 1, kann ebenfalls aus einem Element gebildet
werden.
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Für die Messung
von Cholesterin in Blut unter Verwendung dieses Sensors wird Blut
als eine Probe von der Öffnung 35 in
dem oberen Deckel 31 zu dem konkaven Teil geführt, der
als ein Probenzufuhrteil dient. Das hier zugeführte Blut infiltriert von dem
Ende des primären
Seitenteils des Filters 10 dort hinein. In dem Filter 10 sondert
sich das Plasma von dem Ende des sekundären Seitenteils des Filters
ab, da die Infiltrationsgeschwindigkeit von Hämozyten langsamer als die des
Plasmas ist, welches ein flüssiger
Bestandteil ist. Das abgesonderte Plasma füllt dann den gesamten Probenlösungzufuhrweg
von der Nähe
des Elektrodensystems zu der Lüftungsöffnung 22,
während
ein Reaktionsreagenz, dass auf der Position getragen wird, die das
Elektrodensystem bedeckt, oder auf der Rückfläche des Deckels, unmittelbar
oberhalb des Elektrodensystems.
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Wenn
einmal der gesamte Probenlösungzufuhrweg
mit der Flüssigkeit
gefüllt
ist, wird der Fluss der Flüssigkeit
im Filter 10 ebenfalls gestoppt und folglich werden die
Hämozyten
zu diesem Zeitpunkt in der Position gehalten, ohne an dem Ende des
sekundären
Seitenteils des Filters 10 anzulangen. Dementsprechend ist
der Filter 10 aufgebaut, um einen Unterschied in den Fliesswiderständen des
Plasmas und der Hämozyten in
einem derartigen Umfang zu haben, dass wenn Plasma in einer ausreichenden
Menge zur Füllung
des gesamten Probenlösungzufuhrweges
durch den Filter getreten ist, die Hämozyten nicht den sekundären Seitenteil
des Filters erreichen. Ein Tiefenfilter mit einer Porengröße von etwa
1 bis 7 μm
wird bevorzugt als der Filter der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
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Nach
der beschriebenen Filtration der Hämozyten, läuft eine chemische Reaktion
der durch das Plasma gelösten,
Reaktionsschicht, mit einem zu messenden Bestandteil (Cholesterin
im Falle eines Cholesterinsensors) in dem Plasma ab, und ein Stromwert
in der Elektrodenreaktion wird nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit
gemessen, um den Bestandteil im Plasma zu bestimmen.
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Die 4 stellt
ein Beispiel der Anordnung der Reaktionsschicht in der Nähe des Elektrodensystems des
Probenlösungzufuhrweges
dar. Auf dem Elektrodensystem der Grundplatte 1 wird die
Schicht 17 aus Natriumkarboxymethylzellulose als das hydrophile
Polymer und die Schicht 18a einschließlich des Reaktionsreagenz,
d. h. des Elektrodenvermittlers, gebildet. Auf der Rückfläche des
durch Kombination des oberen Deckels 31, des oberen Hilfsdeckels 21 und
des Abstandshalter 11 sich ergebenen Deckelelements wird
die Reaktionsschicht 18b einschließlich Oxidoreduktase auf der
Oberfläche
gebildet, die zu dem Probenlösungzufuhrweg
exponiert ist.
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In
den 1 bis 4 wird dargestellt, dass jede
Querschnittsfläche
des Schlitzes 12, die den Probenlösungzufuhrweg bildet, welche
vertikal zu der Flussrichtung der Flüssigkeit ist, kleiner als die
Querschnittsfläche
des Filters 10 erzeugt wird. Der Filter 10 ist
so aufgebaut, dass er in Gänze
im Wesentlichen eine gleichförmige
Dichte hat. Durch Erzeugen der Querschnittsfläche des Probenlösungzufuhrweges
kleiner als die Querschnittsfläche
des primären
Seitenteils des Filters 10, wie vorher beschrieben, kann
das Plasma mit den Hämozyten
darin, filtriert mit dem Filter, aufgrund der Kapillarität direkt
in den Probenlösungzufuhrweg eingesaugt
werden.
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Wie
vorher beschrieben, umfasst die Reaktionsschicht im Allgemeinen
einen leicht zu lösenden
Teil und einen schwer zu lösenden
Teil. Die Kante des Probenlösungzufuhrweges,
nämlich
der Teil entlang der Wandfläche
des Schlitzes 12 in dem Abstandshalter 11, ist
leicht zu lösen,
während
der zentrale Teil des Probenlösungzufuhrweges
schwer zu lösen
ist. Da die Probenlösung,
die durch den Filter getreten ist, der vornehmlich entlang des Abstandshalters
fließt,
kann es viele Fälle
geben, wo die Probenlösung
vor vollständiger Lösung des
zentralen Teils die Luftöffnung
füllt.
Das Herausragen des zentralen Teil des sekundären Seitenteils des Filters
in den Probenlösungzufuhrweg
als sowohl die rechten und linken Enden davon, ermöglicht einen
vornehmlichen Fluss der Probenlösung
durch den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges, wodurch das
Plasma unmittelbar in den Sensor ohne Zurücklassen von Blasen durch den
zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges
fließen
kann.
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Die 5 ist
ein Diagramm, das den Vorgang des Flusses des gefilterten Plasmas
in dem Probenlösungzufuhrweg
erläutert,
welches eine Draufsicht zeigt, die den Probenlösungzufuhrweg 12,
die Lüftungsöffnung 22 (32)
und den Filter 10 zeigt. Ein Bezugsbuchstabe (a) zeigt
einen anfänglichen
Zustand an, während ein
Bezugsbuchstabe (b) einen Zustand anzeigt, in welchem das Plasma 20,
das mit dem Filter 10 filtriert wurde, beginnt in den Probenlösungzufuhrweg 12 einzudringen.
Wie aus (b) ersichtlich, ermöglicht
der Vorstoß des
zentralen Teils des sekundären
Seitenteils des Filters, der in dem Probenlösungzufuhrweg mehr als sowohl
in die rechten und linken Enden davon hineinragt, den vornehmlichen
Fluss des Plasmas 20 durch den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges.
Da das Plasma derartig an der Lüftungsöffnung 22 anlangt,
wird der Probenlösungzufuhrweg
nicht in einem Zustand sein, in dem Blasen eingeschlossen sind.
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Auf
der anderen Seite stellt die 7 den Fluss
des Plasmas in dem Fall der Verwendung eines herkömmlichen
Filters 10' dar,
dessen Ende eben ist. Da eine Reagenzschicht des Teils entlang der
Kante des Probenlösungzufuhrweges 12' leicht zu lösen ist,
fließt
das Plasma vornehmlich durch das Ende des Probenlösungzufuhrweges,
es ergibt sich vermutlich ein Zustand, dass der Probenlösungzufuhrweg
Blasen 30 in seinem zentralen Teil enthält.
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In
dem wie dargestellt aufgebauten Biosensor hat der primäre Seitenteil
des Filters bevorzugt eine Breite von nicht mehr als 5 mm und eine
Dicke von nicht mehr als 1 mm. Die Öffnung in dem Probenlösungzufuhrweg
hat bevorzugt eine Breite von nicht mehr als 2 mm und eine Höhe von nicht
mehr als 200 μm.
Wenn Zum Beispiel der Filter eine Dicke von 450 μm und der Probenlösungzufuhrweg
eine Höhe
von 100 μm
hat, hat die Grundplatte bevorzugt eine Dicke von 350 μm.
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Im
Folgenden wird ein Beispiel der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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Beispiel 1
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In
dem vorliegenden Beispiel wurde ein Cholesterinsensor mit den Strukturen
der 1 bis 4 hergestellt, wobei die Reaktionsschicht 18a den
Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 18b Cholesterinoxidase,
Cholesterinesterase und de oberflächenaktiven Stoff enthält.
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Zunächst wurden
5 μl einer
wässrigen
Lösung
mit 0,8 Gew.-% Natriumcarboxymethylcellulose (hiernach einfach als
CMC bezeichnet) auf das Elektrodensystem der Grundplatte 1 getropft,
und mit einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrom von
50°C für 10 Minuten getrocknet,
um die CMC-Schicht 17 als die hydrophile Polymerschicht
zu bilden.
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Als
nächstes
wurden 4 μl
einer wässrigen
Kaliumferricyanidlösung
(entsprechend 70 mA Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 17 getropft
und in der Trockenvorrichtung mit warmem Luftstrom bei 50°C für 10 Minuten
getrocknet, um die Schicht 18a einschließlich Kaliumferricyanid
zu bilden.
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Polyoxyethylen(10)octylphenylether
(TritonX-100) als ein oberflächenaktiver
Stoff wurde zu einer wässrigen
Lösung
hergestellt durch Lösung
von Cholesterinoxidase von Nocardia (EC1.1.3.6) und Cholesterinesterase
von Pseudomonas (EC.3.1.1.13) in Wasser, hergestellt. 1,3 μl der erhaltenen
gemischten Lösung wurde
auf das konkave Teil gebildet auf dem Schlitz 12 in dem
Deckelelement aufgetropft, welches durch Kombination des oberen
Deckels 31, des oberen Hilfsdeckels 21 und des
Abstandshalters 11 erhalten wurde, mit flüssigem Stickstoff
bei –196°C eingefroren
und in einem Kolben in einer Gefriertrockenvorrichtung, über Nacht getrocknet,
um die Reaktionsschicht 18b einschließlich einer Einheit (U)/Sensor
an Cholesterinoxidase, 2,5 U/Sensor Cholesterinesterase und 2 Gew.-%
des oberflächenaktiven
Stoffes zu bilden.
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Der
hier verwendete Abstandshalter hatte eine Dicke von 100 mm und der
Elektrodensystemteil des Probenlösungzufuhrweges
hatte eine Höhe
von 100 mm. Die Öffnung
in diesem Probenlösungzufuhrweg
war ein Teil, der dem halbkreisförmigen
Teil 9 der Öffnung 7 in
der Grundplatte 1 entspricht, mit einer Tiefe äquivalent
zu der Dicke der Grundplatte 1 von 350 mm. Der Probenlösungzufuhrweg
hatte eine Breite von 2 mm.
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Der
Filter 10 wurde unter Verwendung eines Glasfaserfilters
mit einer Dicke von etwa 450 μm
hergestellt. Dieser Filter wurde ausgestanzt, um eine Form zu haben
mit einem trapezförmigen
Teil 10a mit einem oberen Saum von 2 mm, einem unteren
Saum von 4 mm und einer Höhe
von 5 mm und im halbkreisförmigen Teil 10b mit
einem Radius von 1 mm verbunden mit dem oberen Saum des trapezförmigen Teils 10a.
Der erhaltene Filter wurde derartig angeordnet, dass das Ende davon
in den konkaven Abschnitt 7 der Grundplatte passte.
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Nachfolgend
wurde das Deckelement mit den vorher erwähnten drei Elementen an das
Element, hergestellt durch Verbindung der Grundplatte 1,
des unteren Hilfsdeckels 41 und des unteren Deckels 51,
verbunden, um einen Cholesterinsensor herzustellen.
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20 μl Vollblut
als die Probenlösung
wurden in das Probenzufuhrteil dieses Sensors durch die Öffnung 35 gegeben
und drei Minuten nach dem Einführen
wurde eine Pulsspannung von +0,5 V an die Anode der Messelektrode
relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und fünf Sekunden nach dem Anlegen
wurde der Wert des Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und
der Gegenelektrode fließt,
gemessen. Die Ergebnisse sind in der 6 in der
Tabelle 1 gezeigt.
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Wie
aus der 6 ersichtlich, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Sensor
eine hervorragende Linearität
zwischen der Cholesterinkonzentration und dem Antwortwert erhalten
werden.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Biosensor
können
Hämozyten,
welche interferierende Substanzen sind mit einem Filter entfernt
werden, ohne Blasen zu erzeugen und selbst in einem Fall wo Blasen
erzeugt werden, können
sie leicht entfernt werden, was eine unmittelbare Zufuhr von Plasma
mit daraus entfernten Hämozyten
zu dem Elektrodensystem ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung kann daher einen elektrochemischen Biosensor
mit einer hervorragenden Antworteigenschaft zur Verfügung stellen.