JP2002176984A - 遺伝子発現を局所的に制御する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 刺激誘導性プロモーターを導入した宿主
に対して局所的に刺激を与えることによって、宿主にお
ける遺伝子発現を局所的に制御する方法を提供する。 【効果】 本発明により、例えば植物体上に視覚的に
識別可能な模様を描くことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子発現を局所
的に制御する方法に関する。本発明は特に、植物体上に
視覚的に識別可能な模様を描く方法、及び刺激により視
覚的に識別可能な模様を局所的に発現してなる形質転換
植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組み換えにより特定の遺伝子を高
発現させ、花弁の色や葉の色を変えることが可能である
ことは知られている（Lloyd AMら, (1992) Science 25
8, 1773-1775; Holton TAら, (1993) Nature 366, 276-
279）。また、花色を決定する内在遺伝子にトランスポ
ゾンを挿入することにより花弁に復帰変異のパッチ状セ
クターを生じさせ、ある種の模様を生じさせることも可
能である（Sommer Hら, (1988) Mol. Gen. Genet. 211,
49-55）。更に、外来遺伝子によるコサプレッション
（cosuppression）が細胞の状態により不均一に生じる
ことを利用してペチュニアの花弁の外側のみ、あるいは
内側のみに花色を生じさせた報告がある(van der Krol
(1990) Plant Cell 2, 291-299)。

【０００３】一方、エンドウのもやしの緑化時に素早く
mRNAが誘導される遺伝子としてELIP2（Early Light Ind
ucible Protein）が同定されている（Scharnhorst Cら,
(1984) Plant Mol Biol 4, 241-245）。その後、オオ
ムギ、シロイヌナズナ、ランソウ等においてもELIP遺伝
子が存在することが明らかになり、強光、UV、乾燥等の
ストレスで発現誘導されることが示された（Adamska I
(1997) Physiol. Plant. 100, 794-805）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、こうい
った方法において生じる模様を人為的に細工することは
非常に困難であり、現在のところそのような報告例は無
い。植物体上、例えば葉や花弁において、文字や記号等
の模様を人為的に描くことができれば、花や観葉植物、
また果実等の商品に付加価値をつけることが可能であ
り、市場において大きな需要を見込むことができる。ま
た、動物等においても、遺伝子発現を局所的に制御する
ことは従来行われていなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記実情に鑑み、本発明
者等は、遺伝子工学的手法により植物体上に局所的に模
様をつけるべく種々検討を行った結果、植物体における
発現の有無を可視化し得るレポーター遺伝子と特定の刺
激に応答するプロモーターを組み合わせることで好適な
結果が得られることを見出した。この特定の刺激に応答
するプロモーターを用い、動物等の植物以外の宿主にお
いても遺伝子発現を局所的に制御することが可能である
ことを見出し、本発明を完成するに到った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１
０）を提供する。 （１） 刺激誘導性プロモーターを導入した宿主に対し
て局所的に刺激を与えることによって、宿主における遺
伝子発現を局所的に制御する方法。 （２） 宿主が植物である、上記（１）に記載の方法。 （３） 植物体上に視覚的に識別可能な模様を描く方法
であって、以下の（ａ）〜（ｃ）： （ａ）植物において視覚的に識別可能な発現をし得る遺
伝子の上流に刺激誘導性プロモーターを機能的に連結し
て発現ベクターに組み込み、（ｂ）該発現ベクターを植
物細胞に導入して形質転換植物を得、（ｃ）該形質転換
植物に対して局所的に刺激を与える、ことを含む、上記
方法。 （４） 刺激誘導性プロモーターが強光、紫外線、及び
／又は接触刺激によって遺伝子発現を誘導するものであ
る、上記（１）〜（３）に記載の方法。 （５） 刺激誘導性プロモーター及び植物において視覚
的に識別可能な発現をし得る遺伝子を含むことを特徴と
する発現ベクター。

【０００７】（６） 上記（５）に記載の発現ベクター
を含有することを特徴とする形質転換植物。 （７） 刺激により視覚的に識別可能な模様を局所的に
発現してなる形質転換植物。 （８） 上記（３）または（４）に記載の方法によって
得られることを特徴とする、上記（７）に記載の形質転
換植物。 （９） 刺激により視覚的に識別可能な模様を局所的に
発現し得る形質転換植物。 （１０） 刺激が強光、紫外線、及び／又は接触刺激で
あることを特徴とする、上記（６）から（９）のいずれ
かに記載の形質転換植物。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、宿主における遺伝子発
現を局所的に制御する方法、特に、植物体上に視覚的に
識別可能な模様を描く方法を提供する。本発明の方法が
適用できる植物は、局所的発現が視覚的に識別可能とな
るものであれば良く、また単子葉植物及び双子葉植物の
いずれであっても良く、特に限定されるものではない。
模様を描くべき植物体の部分としては、葉、花弁、果実
等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、シクラメン、ペチュニア、チューリップ、バ
ラ、カーネーション等の花類の花弁、ポインセチア、ツ
タ等の観葉植物の葉、蕪、レタス等の野菜類及びリン
ゴ、バナナ、ミカン等の果物類の果実等に模様をつける
ために当該植物を使用することができる。

【０００９】「視覚的に識別可能」であるとは、人間の
視覚によって識別できることをいい、具体的には導入さ
れた遺伝子が発現した部分と発現していない部分の色、
すなわち色相、彩度、及び／又は明度の相違が視覚によ
って識別できることをいう。

【００１０】「模様」とは、植物体上で識別できるアル
ファベット等の文字、記号、図形、並びに縞柄、水玉等
の一般的に模様であると認識されるものを含み、特に限
定するものではない。例えば、輪郭が明確で文字等とし
て判別できる模様、及び輪郭は不明瞭であるが全体とし
て何らかの模様であると認識できる模様等はいずれも本
明細書における模様として含むことができる。従って、
本発明の一態様は、後述する実施例に記載のように明ら
かに文字として認識できる模様を描く方法であって、場
合によってはそれによって何らかのメッセージを伝える
方法とすることもできる。また、別の態様として、例え
ばカスミソウ等の小花に局所的に刺激を与えることによ
って、１本の枝で複数の色を有する個体を得ることもで
きる。

【００１１】植物において視覚的に識別可能な発現をし
得る遺伝子としては、特に限定されるものではないが、
例えばアントシアニン合成を誘導するカルコン合成酵素
CHSやCSL1の遺伝子、クロロフィルを分解するクロロフ
ィラーゼ遺伝子等の、発現が直接視覚的に識別できる遺
伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺
伝子、アントシアニン合成遺伝子等の、基質に対する作
用の結果、視覚的に識別できるようになる遺伝子、フィ
トエン不飽和化酵素遺伝子のアンチセンス等の、宿主と
なる植物の内在性遺伝子の発現を抑制することによって
視覚的に識別できるようになる遺伝子等が挙げられる。
遺伝子はまた、FLAG、His、myc等のタグを付加したもの
であっても良く、融合タンパク質をコードするものであ
っても良い。

【００１２】本発明において使用できる刺激誘導性プロ
モーターは、強光、紫外線、接触刺激等の、局所的にか
けることができる刺激（ストレス）によって制御下の遺
伝子の発現を誘導するプロモーターである。ここで、
「強光刺激」とは、光合成能を超える程の光であって、
例えば200〜2000μE/m²/s以上の光の３０分間程度以上
の照射をいう。また、紫外線刺激とは、100〜400nmの波
長を有する紫外線の数秒間以上の照射をいう。本発明に
おいて好適に使用できるプロモーターとして、例えば本
発明者等が見出したELIP2プロモーター（配列番号
３）、熱刺激によって遺伝子発現を誘導するヒートショ
ックプロモーター、接触刺激によって遺伝子発現を誘導
するTCHプロモーター（Touch-induced genes,TCH1-3）
等が挙げられる。また、ELIP2プロモーターの機能領域
を含む配列番号３で示すヌクレオチド配列の断片であっ
ても良く、例えば配列番号３で示すヌクレオチド配列に
おいて、下流側300個の連続したヌクレオチド配列を含
む配列を使用しても良い。また、該ヌクレオチド配列に
対して、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換及び
／又は付加された配列であって、強光ストレス及び／又
は葉緑体破壊により遺伝子発現を誘導し得る配列を用い
ても良い。ここで、「数個」とは、部位特異的突然変異
誘発法等の周知の方法によって欠失、置換及び／又は付
加が可能な程度のヌクレオチド数を意味する。

【００１３】ELIP2は上記のようなストレス条件下で発
現し、何らかの形で光合成明反応を担う反応中心を保護
する役割を担っていると考えられている。本発明者等は
このELIP2の発現様式に着目し、ELIP2の発現を制御する
と想定される5'プロモーター領域に強光並びに葉緑体破
壊に対して応答する制御領域が存在することを明らかに
し、この領域を用いることで下流に配置した遺伝子の発
現に強光誘導性並びに葉緑体破壊による誘導性を持たせ
ることが可能であることを示した。

【００１４】上記ELIP2プロモーターの特徴は、 １）刺激の与え方に恣意性が高い、及び ２）シグナルに細胞自律性があり、刺激を受けた細胞の
みが刺激応答を行い、刺激を受けた細胞が刺激を受けな
い細胞にシグナル伝達を行うことがない、という点であ
る。これら２つの特徴を有するプロモーターは本発明の
方法に特に好適に用いられる。

【００１５】すなわち上記プロモーターは、強光刺激に
よって下流の遺伝子の発現を誘導するものであるが、室
内光下では刺激を受けず、積極的に強光を与えて初めて
応答するものであり、また刺激を与える場所や形に関し
て技術的な制約が少ない、という利点を有するものであ
る。ホルモン処理等と比較して、強光処理は刺激を与え
る上で自由度が高く、局所的に刺激を与えることを目的
とする場合等に非常に有利である。細胞間シグナルがな
いことからも、植物体上に局所的に発現を誘導させて視
覚的に識別可能な模様を描く場合に、輪郭がくっきりし
た模様を描くことができる。

【００１６】刺激誘導性プロモーターと上記遺伝子と
は、機能的に連結して発現ベクターに組み込むことが必
要である。当業者であれば、プロモーターと遺伝子の機
能的連結は通常行うことであるが、具体的には下流に配
置する遺伝子の翻訳開始コドンがプロモーターの下流に
くる最初のATGになるように行う。発現ベクターにプロ
モーター及び遺伝子を挿入するには、まず、プロモータ
ー及び遺伝子に場合によって適当な制限酵素部位を付加
した後に制限酵素で切断し、発現ベクターの制限酵素部
位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方
法等が採用される。

【００１７】本発明で使用する発現ベクターは、宿主中
で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラ
スミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター
等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、大腸菌
由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pU
C119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来の
プラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラ
スミド（例えばYEp13、YCp50等）等が挙げられ、ファー
ジベクターとしてはλファージ（Charon4A、Charon21
A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げら
れる。更に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイル
ス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用い
ることもできる。本発明においては、特にpUC119、pBIN
19等が好適に用いられる。該発現ベクターには、刺激誘
導性プロモーター及び上記遺伝子の他、当分野において
通常使用される翻訳エンハンサー等の調節配列、選択マ
ーカー等を適宜組み込むことができる。

【００１８】上記発現ベクターを、次いで宿主となる細
胞に本発明のプロモーターが機能し得るように導入して
形質転換体を得る。宿主としては、植物及び動物のいず
れであっても良く、特に限定されるものではないが、植
物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物
を以下のようにして得ることができる。

【００１９】形質導入する植物細胞は、任意の細胞、例
えば植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、
種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木
部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれでも良く、特
に限定されない。

【００２０】植物の形質転換は当分野において通常用い
られる方法であれば良く、特に限定されるものではない
が、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーシ
ョン法、パーティクルガン法、PEG法等を用いることが
できる。

【００２１】アグロバクテリウム法を用いる場合は、例
えば構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテ
リウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）に導入し、この株を減
圧浸潤法（Bechtoldら、(1993) C. R. Acad. Sci. Ser.
III Sci. Vie, 316, 1194-1199）等に従って宿主の無
菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができ
る。アグロバクテリウム感染により、カルスや根、葉片
等を形質転換することが可能である。

【００２２】減圧浸潤法は、例えば植物の花序をアグロ
バクテリウム懸濁液に浸して数分間減圧処理し、その後
普通に生育させて生じた種子の中に形質転換されたもの
が含まれる方法である。エレクトロポレーション法を用
いる場合は、例えばパルスコントローラーを備えたエレ
クトロポレーション装置により、電圧500〜600V、1000
μF、20msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する
ことができる。

【００２３】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
ても良く、切片を調製した後に使用しても良く、あるい
はプロトプラストを調製して使用しても良い。このよう
に調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBIOLISTIC PO
S 1000/He; BioRad等）を用いて処理することができ
る。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は10
00〜1100psi程度の圧力、5〜10cm程度の距離で行う。

【００２４】形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュー
ト、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官
培養に用いることが可能であり、また従来知られている
植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オ
ーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン
酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与等により植物
体に再生させることができる。

【００２５】培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS
基本培地（Murashige, T. & Skoog,F. (1962) Physiol.
Plant. 15:473）、LS基本培地（Linsmaier, E. M. & S
koog, F. (1965) Physiol. Plant. 18:100）、プロトプ
ラスト培養培地（LS培地を改変したもの）等を用いるこ
とにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培
養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。

【００２６】本発明の方法はまた、大腸菌等のエッシェ
リヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudom
onas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メ
リロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属
する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizo
saccharomyces pombe）等の酵母、COS細胞、CHO細胞等
の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞等を宿主として
実施することもできる。大腸菌、酵母等を宿主とする場
合は、本発明の発現ベクターが該細菌中で自律複製可能
であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム結
合配列、発現制御を目的とする遺伝子、転写終結配列に
より構成されていることが好ましい。

【００２７】大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）DH5α、HB101等が挙げられ、
枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス等が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。本発明の
発現ベクターの細菌への導入方法は、特に限定されるも
のではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Co
henら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110(197
2)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【００２８】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス（Pichea pas
tris）等が用いられる。本発明の発現ベクターの酵母へ
の導入方法は、特に限定されるものではなく、例えばエ
レクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リ
チウム法等が挙げられる。

【００２９】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞等が用いられる。本発明の発現ベク
ターの動物細胞への導入方法は、特に限定されるもので
はないが、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カ
ルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。動物
細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地
又はこれらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が
挙げられる。培養は、通常、５％CO₂存在下、37℃で１
〜30日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペ
ニシリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。

【００３０】昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞等
が用いられる。本発明の発現ベクターの昆虫細胞への導
入方法は、特に限定されるものではないが、例えばリン
酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレ
ーション法等が挙げられる。

【００３１】ベクターが宿主中に導入されたことの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、ベクターを導入した宿主からDNAを調製
し、DNA特異的プライマーを設計して常法によりPCRを行
うことができる。PCRの後、増幅産物についてアガロー
スゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は
キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR
Green液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとし
て検出することにより、形質転換されたことを確認する
ことができる。また、予め蛍光色素等により標識したプ
ライマーを用いてPCRを行って増幅産物を検出すること
もできる。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物
を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認
する方法を用いても良い。本発明の方法は、上記のよう
にして得られた形質転換植物に対して局所的に刺激を与
えることを含む。

【００３２】局所的に刺激を与える方法としては、例え
ば導入した遺伝子の発現をさせたい部分のみに刺激を与
える方法、発現をさせない部分を遮蔽した後に全体的に
刺激を与える方法等が挙げられる。強光や紫外線による
刺激であれば、例えば、植物の場合にはステンレスシー
トやアルミシールを切り抜いて植物体を覆い、その上か
ら強光等の刺激を与える、あるいは強光照射装置からの
出力が希望の模様の形になるようにして植物体に照射す
る、あるいは光ファイバーや顕微照射光等を用いて照射
エリアを限定する等の方法が挙げられる。また接触刺激
であれば、針や印鑑のようなもので被検体に特定の形に
接触を与える方法が挙げられる。

【００３３】本発明はまた、刺激により視覚的に識別可
能な模様を局所的に発現してなる形質転換植物に関す
る。刺激としては、上記強光、紫外線、及び／又は接触
刺激等を単独または組み合わせて使用することができ
る。

【００３４】第一の態様において、本発明の形質転換植
物は、上記の発現ベクター、すなわち、刺激誘導性プロ
モーター及び植物において視覚的に識別可能な発現をし
得る遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクターを含有
することを特徴とする。

【００３５】また、別の態様において、本発明の形質転
換植物は、刺激により視覚的に識別可能な模様を局所的
に発現してなる形質転換植物である。本発明の形質転換
植物は、例えば上記の本発明の方法によって得ることが
できる。

【００３６】あるいは、本発明は、刺激により視覚的に
識別可能な模様を局所的に発現し得る形質転換植物も提
供する。この型の形質転換植物は、例えば植物において
視覚的に識別可能な発現をし得る遺伝子の上流に刺激誘
導性プロモーターを機能的に連結して発現ベクターに組
み込み、該発現ベクターを植物細胞に導入することによ
って得ることができる。この段階において、該形質転換
植物は刺激を与える前の状態であり、外観上野生型の植
物と識別することができない。この状態の形質転換植物
は、販売者及び消費者の希望に応じ、販売店や消費者の
手元で局所的に刺激を与えることで任意に模様を描くこ
とができる。この態様において使用できる刺激として
は、例えば強光刺激、紫外線刺激、接触刺激等が挙げら
れる。

【００３７】下記実施例において詳細に説明する本発明
の方法の一例は、刺激誘導性プロモーターとしてELIP2
プロモーターを用い、下流に配置する遺伝子をルシフェ
ラーゼ遺伝子とするものである。この場合、強光照射に
よってルシフェラーゼの発現を局所的に誘導した後、基
質であるルシフェリンを噴霧等することによって、強光
処理した部分で発光させることができる。

【００３８】刺激誘導性プロモーターとしてELIP2プロ
モーターを用い、下流に配置する遺伝子を、葉を赤色化
するアントシアニン合成を誘導するカルコン合成酵素CH
S遺伝子とする場合には、強光照射によってカルコン合
成酵素の発現を誘導し、カルコン合成酵素を活性化する
ことによってアントシアニン合成活性が上昇してアント
シアニンが蓄積するため、強光照射した部分を赤色に染
めることができる。

【００３９】刺激誘導性プロモーターとしてELIP2プロ
モーターを用い、下流に配置する遺伝子を、カロテノイ
ド合成酵素の一種、フィトエン不飽和化酵素をコードす
る遺伝子のアンチセンスRNAとする場合には、強光照射
によってアンチセンスRNAの発現が誘導され、その細胞
に含まれる葉緑体の光感受性が高まり、通常の生育条件
下で葉緑体破壊が生じ、白色になる。従って、強光照射
した部分を白色に変えることができる。

【００４０】刺激誘導性プロモーターとして接触刺激に
よって遺伝子発現を誘導するTCHプロモーター（Touch-i
nduced genes,TCH1-3）を用いる場合には、TCHの発現制
御領域を同定し、その領域を含むようなキメラコンスト
ラクトを作製することによって、接触刺激による系を構
築することが可能である。

【００４１】更にまた、例えば動物細胞及び植物細胞に
対する顕微注入技術を利用して、特定の細胞だけに導入
した遺伝子を発現させ、周囲の細胞への影響を解析した
り、特定の遺伝子をGFP融合タンパク質等の可視化でき
る形態にして特定の細胞に導入し、該細胞で発現した融
合タンパク質が細胞間移行をするか否かを解析したりす
ることが可能である。従って本発明は、基礎科学の分野
においても非常に有用性の高いものである。

【００４２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明は以下の実施例の限定されるものではない。 ［実施例１］ PELIP2::LUCコンストラクトの作成 GenBankを検索して、シロイヌナズナELIP2遺伝子（Hedd
ad M.及びAdamska I.(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 97, 3741-3746）がATFCA1コンティグに入っているこ
とがわかった。この遺伝子の翻訳開始コドンの上流-2か
ら-2072塩基の領域をプライマーELIP-FSAL(5'-CGC GTC
GAC ATA ATA TTT ATT TAT TTA GTG ATT C-3'：配列番号
１)及びプライマーELIP-RSAL(5'-CGC GTC GAC TGA TTA
GGT TTT CTA AAA GCC GA-3'：配列番号２)を用いてシロ
イヌナズナゲノムDNAを鋳型にして常法によりPCR反応を
行った。PCR反応の条件 ゲノムDNA 1μg プライマー 各0.2μM dNTP 各0.35mM 1xバッファー（ベーリンガーExpandHiFiderityキット） 酵素 0.5μl/50μl反応液

【００４３】得られた産物をSalIで消化し、ルシフェラ
ーゼ遺伝子を含有するp6GLUC（Aoyama T.及びChua N.H.
(1997) Plant J. 11, 605-612）のSalI部位へ導入し
た。得られたプラスミドをScaI/PvuIIで消化し、ELIP
2::LUCを含む断片を回収し、Klenow酵素を用いて平滑末
端にした後、pUC119（J. Sambrookら, "Molecular Clon
ing", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor）のSmaI部位へ導入した。得られた
プラスミド（yy211）をHindIIIで消化し、ELIP2の翻訳
開始点より-2から-1907塩基までの領域（配列番号３）
を含むELIP2プロモーターとLUCレポーターとの融合遺伝
子を含むHindIII断片を回収し、バイナリーベクター（S
LJ755I5）のHindIIIへ導入した。得られたプラスミド
（yy210）はBASTA耐性遺伝子並びにELIP2プロモーター
（PELIP2）/LUCレポーター融合遺伝子（図１）をT-DNA
内に持つ。

【００４４】［実施例２］ シロイヌナズナの形質転換 実施例１で得られたプラスミドyy210をアグロバクテリ
ウムGV3101pMP90（C. Konczら, Plant Molecular Biolo
gy Manual, S. B. Gelvin & R. A. Schilperoort編, B
2:1-22, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 199
4）へ導入し、このアグロバクテリウムをシロイヌナズ
ナへ減圧湿潤法により感染させた。シロイヌナズナの独
立した形質転換体#52、#58、#62、#69、#72、#75を育成
し、T2世代の種子を得た。得られたELIP2::LUCラインの
植物は強光処理によりルシフェラーゼ由来の発光が誘導
される。

【００４５】［実施例３］実施例２で得られた植物の葉
に文字を描いた。ELIP2::LUCラインのシロイヌナズナの
葉（発芽後１ヶ月程度の個体のもの）を２枚切り取り、
ショ糖1%、0.8%寒天を含むGMプレートに置き、5mMルシ
フェリン（0.1％TrintonX100を含む）をスプレー処理
し、翌日２枚のプレートのうち片方に「Ｙ」の文字の形
に強光処理した。具体的には、ステンレスシートを
「Ｙ」の形にくり抜き、葉を上からシートで覆い、上か
ら強光照射した。強光処理にはクセノン光源にフィルタ
ー処理を行い、紫外部及び熱線部を除く400-700nmの波
長を含む150W/m²の強光を３時間照射して行った。

【００４６】強光処理した芽生え並びに処理しなかった
芽生えに5mMルシフェリン（0.1%TrintonX100を含む）を
スプレーし、Argusカメラシステム（浜松フォトニク
ス、浜松）を用いてin vivoのルシフェラーゼ発光を計
測した（Millar AJら, (1992) Plant Mol. Biol. Rep.
10, 324-337）。

【００４７】その結果、無処理の葉（図２左）からは殆
どルシフェラーゼ発光が認められなかったが、「Ｙ」の
文字の形に強光処理を行った葉（図２右）からは「Ｙ」
の文字の形に発光が認められた。図２上は処理に用いた
ELIP2::LUC葉の写真、下はそのルシフェラーゼ活性によ
る発光イメージを示す。

【００４８】

【発明の効果】以上詳述した如く、本発明によって、植
物体上、例えば葉や花弁において、文字や記号等の模様
を人為的に描くことができ、花や観葉植物、また果実等
の商品に付加価値をつけることが可能となった。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A method for locally controlling gene expressions <130> RJH12-080T <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 cgcgtcgaca taatatttat ttatttagtg attc 34 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 cgcgtcgact gattaggttt tctaaaagcc ga 32 <210> 3 <211> 1909 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 aagcttatgt tttgcttgct tggccttgtg gccggctaaa taacctaagt atataatcaa 60 taaattacat aaacgaccgg ataaatcaga acttaattat aatgttaaaa gtaattaaat 120 gaatgatgac cctcgtcgtc tctcctctta aaacacaata atctcataaa tacaattttt 180 atatgaagtc ttcacaaact actataaatt tcccaaagtt gttctctctc tttgtccact 240 cgaagactca tggggataag aaggcactcg tgttatgggc ttcggggctt tttattgttc 300 gccctttcga ggaccttctc acatgtttgg acttttgagt ctaaatgcct tatttcctca 360 cgaatgacgt gaacattttt tcgtcctgaa ctcaaaagta tcaattacac acttcacact 420 actaatggtc aagttttttc gtatttgaaa ctacaaatgt aagtaatata tgcgataaat 480 ttattatcct ctgctagtaa aatccattaa aaaaaactac caatgtgggt gtatgttttc 540 tttcagtata tataaagagt tttcgcagag agcacatatc gatggtggta catcaaatct 600 gatcattcat atctaaataa ttgttgttga gttttctata tgtgtggaac gttagattgc 660 ttaagctaga aattgacaca agagtttgat caccgagttc ctgcctcctg gcctctaacc 720 ggtacgtctc gggtgggaac tgtctcccac aacttttcac tatcaagcaa aaagtattac 780 aagcactaat agaggtttct cttctccttg ttacaaattt agaaattaac tcacacacaa 840 aagacaatag aaaaggagac tataccgaca cgaagactat gcccatatct tcacaattgt 900 gctattattt accgttctaa tctggaaaaa aaaacagcgc acgtaggaga attgggcacg 960 aagacatgaa tgggacacat aaaggatcaa aagagtcatc atgggtctgc catgatgaaa 1020 gttaagaaag ttccaatacg cgcgaaacaa gattgaatgc gacttctctc tataccaaaa 1080 acgaatctcc caagtcccaa gtgaatattg tgagccacta acttgttatt aacattttga 1140 gacaaaaaaa aaatttgtac gtgtttttgc caaacccact tggccatgac caatcagaaa 1200 aagacaagga agatgtgtat ctatgtgtaa tgaggaggcc acgccatcag tttacttgca 1260 cttttccaac tagacgtggc ctctcaccga tctcaacctc actttcctct catttctcaa 1320 attttattgg ctacgtgttt ttgtgtttag cgttcaaccc aaatatcgat atattcttct 1380 ttttttttca catttttaac gatttcgagc aaaataattc gatttatttg tataatttta 1440 atatggtagt tttacaaata atgaaacgaa tgaccaactg atttgttagg tgttacaata 1500 aatatggaaa aaatctcata agtttgaaaa catttattct gaggaaactt tttcttcccc 1560 aaaagaaaaa aaaagtttaa agtggaaaaa agaaaaaaaa ggaataaaaa gtttgaattc 1620 agtttttttc ttttctttga tagatttctt tctacttatt tattactcta ctacacacca 1680 cacaaaaaca aaaataaaat aagtaatcat agtatcccat aaatcagtaa agataaataa 1740 aatccagaaa atactgggcc tatcattttc cttcaccaac tctataaatg aagagataat 1800 cctacagtta cacctcaaac caactccatc tcacttctca agtcttataa tttattcatt 1860 tctctcttct tcatcgatct tcggctttta gaaaacctaa tcagaaatg 1909

【図面の簡単な説明】

【図１】ELIP2::LUCコンストラクトの模式図を示す。

【図２】弱光下で生育したELIP2::LUCラインの葉を
「Ｙ」の文字の形に強光照射（150W/m²、１８０分）し
た前後の写真及びルシフェラーゼ活性による発光イメー
ジを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 FA02 GA11 4B065 AA88Y AA89X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA53

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 刺激誘導性プロモーターを導入した宿主
   に対して局所的に刺激を与えることによって、宿主にお
   ける遺伝子発現を局所的に制御する方法。
2. 【請求項２】 宿主が植物である、請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 植物体上に視覚的に識別可能な模様を描
   く方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）： （ａ）植物において視覚的に識別可能な発現をし得る遺
   伝子の上流に刺激誘導性プロモーターを機能的に連結し
   て発現ベクターに組み込み、（ｂ）該発現ベクターを植
   物細胞に導入して形質転換植物を得、（ｃ）該形質転換
   植物に対して局所的に刺激を与える、ことを含む、上記
   方法。
4. 【請求項４】 刺激誘導性プロモーターが強光、紫外
   線、及び／又は接触刺激によって遺伝子発現を誘導する
   ものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 刺激誘導性プロモーター及び植物におい
   て視覚的に識別可能な発現をし得る遺伝子を含むことを
   特徴とする発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターを含有す
   ることを特徴とする形質転換植物。
7. 【請求項７】 刺激により視覚的に識別可能な模様を局
   所的に発現してなる形質転換植物。
8. 【請求項８】 請求項３または４に記載の方法によって
   得られることを特徴とする、請求項７に記載の形質転換
   植物。
9. 【請求項９】 刺激により視覚的に識別可能な模様を局
   所的に発現し得る形質転換植物。
10. 【請求項１０】 刺激が強光、紫外線、及び／又は接触
    刺激であることを特徴とする、請求項６から９のいずれ
    か１項に記載の形質転換植物。