JP2002159292A

JP2002159292A - 標的物質の分離回収方法

Info

Publication number: JP2002159292A
Application number: JP2000362583A
Authority: JP
Inventors: Masaru Tanaka; 賢田中; Tadashi Samejima; 正鮫島
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2002-06-04

Abstract

(57)【要約】【課題】標的物質を効率よく、高速で分離・回収するこ
とができ、かつ回収された標的物質の純度が高く、機能
低下を招くことのない標的物質の分離回収装置および方
法の提供する。【解決手段】ヌクレオチドの相補鎖間での水素結合によ
る温度依存性の塩基対形成（ハイブリダイズ）および前
記塩基対形成の解離（デハイブリダイズ）を利用するこ
とを特徴とする、標的物質の分離回収装置および方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液や体液などの
生体組織液から、細胞、細胞微細組織、タンパク質など
の標的物質を選択的に分離・回収する方法および装置に
関する。また、本発明は、生体組織液から細菌やウイル
スなどを分離、除去する方法および装置に関する。より
詳しくは、ヌクレオチドの相補的結合を利用して、前記
ヌクレオチドの温度を制御することにより、前記分離・
回収または前記分離・除去を行う方法および装置に関す
る。さらに、本発明は、生体組織液からの標的物質の選
択的な分離、回収に使用するヌクレオチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】特定の細胞を分離・回収する技術は、自
己免疫疾患、ＡＩＤＳおよび移植後の急性拒絶反応防止
等に利用されている。また、ＣＤ３４⁺を発現している
造血系の幹細胞の分離・回収、自己免疫疾患治療を目的
とした自己反応性抗原受容体をもったリンパ球の捕集、
骨髄移植用細胞からのリンパ球の除去などは、造血系の
悪性腫瘍、癌治療等の際に有効に利用される。さらに、
白血病細胞の検出、治療などを代表とする細胞医療にと
って重要な技術である。近年、胚性幹細胞があらゆる臓
器に分化増殖することが示唆され、胚性幹細胞や未分化
細胞、各種分化増殖因子などの細胞や細胞内微細組織に
損傷を与えることなく分離・回収することは再生医療、
遺伝子治療の分野にとって欠かせない技術である。現在
用いられている細胞や細胞内微細組織の分離方法には、
膜分離法、遠心分離法、電気的分離法、標的細胞以外の
細胞を死滅させる方法、標的細胞に親和性を有するリガ
ンドを固定化した担体に、目的細胞を結合させる方法、
磁気ビーズによる分離法等がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これらの技術は、それ
ぞれ細胞の分離に使用する原理による問題点がある。例
えば、膜分離法や遠心分離法は、細胞の大きさや比重の
違いによって分離する方法であるため、白血球、赤血球
及び血小板のように物理的性質に大きな相違がある場合
には分離が可能であるが、白血球の亜集団の分離（例え
ば、Ｔ、Ｂ細胞の分離）など、対象となる物質間での物
理的な差が小さい場合には使用できず、特異性が低い欠
点がある。また、電気的分離法は、電場中の細胞の荷電
特性、誘電特性の違いを利用するものであるが、同じく
細胞の選択性に限界がある。標的細胞以外の細胞を死滅
させる方法は種々検討され、開発されているが、標的細
胞がダメージを受ける場合があり、副作用の原因とな
る。磁気ビーズ法は、細胞混合液を抗体を結合させた磁
気ビーズと共にインキュベートすることにより、目的細
胞を磁気ビーズでラベルし、磁気装置を用いてラベルさ
れていない細胞から、ラベルした細胞を分離する方法で
ある。この方法の場合、ビーズと標的細胞を効率よく結
合させるために長時間のインキュベートが必要であり、
その結果、標的以外の細胞の非特異的な吸着が生じて目
的細胞の純度低下を招く恐れがあり、また、小さな磁気
ビーズに吸着した目的細胞を回収することが困難であ
る。免疫吸着カラム法は、標的細胞の膜抗原に対する抗
体等のリガンドをビーズ等の基材表面に固定化し、これ
をカラムに充填して細胞分離を行うものである。このよ
うな免疫吸着等のリガンド間の相互作用を利用したもの
としては、ビオチン−アビジン間の結合を利用したもの
が開示されているが、ビオチン−アビジン間の結合力が
非常に強いため、分離した細胞を回収することが困難で
あり、回収効率が低下する等の欠点を有する。これらの
方法は、抗体を用いるため、標的細胞への選択性が高い
ことが利点であるが、吸着細胞の回収にプロテアーゼや
パパインなどの酵素を用いるため、回収率が低く、細胞
自体への損傷が大きいという欠点を有している。特開平
６−２６９４９９号には、標的細胞を認識する抗体にヌ
クレオチドを結合させ、細胞混合液と接触処理し、次い
で、前記ヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するヌク
レオチドを固定した水不溶性担体を充填したカラムを通
して細胞を水不溶性担体に吸着させて、目的細胞を分離
する方法が開示されている。なお、特開平６−２６９４
９９号の実施例で用いられているヌクレオチドは１０塩
基からなる。しかし、前記方法は、目的物質の吸着によ
る分離を主眼としたもので、分離後の細胞の回収につい
ては特に検討されていない。そのため、分離した細胞の
回収については、実施例において、カラム中のゲルが動
く程度に手動で軽く振動させてビーズより脱離させると
記載されているのみである。このような物理的振動によ
る回収は、回収効率が低く、また、担体と細胞との衝突
等により、細胞が損傷し、その機能が低下するという問
題を有する。また、ヌクレオチドはその片末端、もしく
は両末端が固定化されると、立体障害により、相補鎖と
の二重らせん体の融解温度が大幅に低下する。特に、相
補鎖が３０塩基対以下の場合、十分なハイブリダイゼー
ションを形成することができず、細胞の分離・回収効率
が低下する。このため優れた分離・回収を行うには、分
離工程および回収工程のいずれもが、高い効率であるこ
とが要求され、そのため、要求される条件が非常に限定
される。本発明は、上記のような欠点を改良し、標的物
質を効率よく、高速で分離・回収することができ、かつ
回収された標的物質の純度が高く、機能低下を招くこと
のない標的物質の分離回収方法及び装置を提供すること
を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題を考慮し、検討
した結果、本発明者らは以下の発明に到達した。すなわ
ち、標的物質の分離・回収に、ヌクレオチドの相補鎖間
での水素結合による温度依存性の塩基対形成（ハイブリ
ダイズ）および前記塩基対形成の解離（デハイブリダイ
ズ）を利用することで、上記問題点を解決されることを
見出した。具体的には、本発明は下記の内容により達成
される。（１）標的物質含有液と、相補鎖長が３０以上であり、
標的物質のリガンドと結合した第１のヌクレオチドとを
混合して、前記標的物質を前記リガンドを介して前記第
１のヌクレオチドのリガンドと結合させる工程と、第１
の温度にて、前記標的物質と結合した第１のヌクレオチ
ドと、前記第１ののヌクレオチドに対してハイブリダイ
ズ可能な塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であり、担
体に固定された第２のヌクレオチドとを接触させ、前記
標的物質と結合させた第１のヌクレオチドと前記第２の
ヌクレオチドとをハイブリダイズさせて、前記標的物質
を分離する工程と、第２の温度にして、前記ハイブリダ
イズさせた第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドを
デハイブリダイズさせて、前記標的物質を回収する工程
を含むことを特徴とする標的物質の分離回収方法。（２）前記標的物質のリガンドと前記第１のヌクレオチ
ドとを別体として、前記標的物質含有液と混合させ、前
記標的物質のリガンドと前記第１のヌクレオチドを結合
させることを特徴とする（１）の標的物質の分離回収方
法。（３）前記標的物質を前記リガンドを介して前記第１の
ヌクレオチドと結合させる工程の後に、前記標的物質と
結合しなかった前記第１のヌクレオチドを除去する工程
をさらに含む（１）または（２）の標的物質の分離回収
方法。（４）前記標的物質を分離する工程の際に、ハイブリダ
イズしなかった前記第１のヌクレオチドを除去する工程
をさらに含む（１）ないし（３）の標的物質の分離回収
方法。（５）標的物質含有液と、相補鎖長が３０以上であり、
標的物質のリガンドと結合した第１のヌクレオチドと、
前記第１のヌクレオチドに対してハイブリダイズ可能な
塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であり、標的物質の
リガンドと結合した第２のヌクレオチドとを混合して、
前記標的物質を前記リガンドを介して前記第１のヌクレ
オチドと前記第２のヌクレオチドに各々結合させる工程
と、第１の温度にて、前記標的物質と結合した前記第１
のヌクレオチドと、前記標的物質と結合した前記第２の
ヌクレオチドとを接触させ、ハイブリダイズさせて、ヌ
クレオチドの凝集体を得る工程と、第２の温度にして、
前記ヌクレオチドの凝集体をデハイブリダイズさせて、
前記標的物質を回収する工程を含むことを特徴とする標
的物質の分離回収方法。（６）前記標的物質のリガンド、前記第１のヌクレオチ
ドおよび前記第２のヌクレオチドを別体として、前記標
的物質含有液に混合して、前記標的物質のリガンドを前
記第１のヌクレオチドおよび前記第２のヌクレオチドに
各々結合させることを特徴とする（５）の標的物質の分
離回収方法。（７）前記第２の温度が、前記第１の温度より高い温度
である（１）ないし（６）の標的物質の分離回収方法。（８）前記第１の温度が１〜２０℃の範囲の温度であ
り、前記第２の温度が２５〜４０℃の範囲の温度である
（１）ないし（７）の標的物質の分離回収方法。（９）入口と出口を有するカラムと、相補鎖長が３０以
上であり、標的物質のリガンドと結合した第１のヌクレ
オチドと、前記第１のヌクレオチドに対してハイブリダ
イズ可能な塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であり、
前記カラムにつめられた担体に固定された第２のヌクレ
オチドと、前記カラム内の温度を調節する手段よりなる
標的物質の分離回収装置。（１０）相補鎖長が３０以上であり、標的物質のリガン
ドと結合した第１のヌクレオチドと、第１の温度でハイ
ブリダイズし、第２の温度でデハイブリダイズする、相
補鎖長が３０以上の第２のヌクレオチドからなる１対の
ヌクレオチド。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の好適な実施の形
態について詳細に説明する。本発明の第１の態様は、互
いに相補的な塩基配列を有する１対のヌクレオチドの温
度依存性のハイブリダイズおよびデハイブリダイズを利
用した標的物質含有液からの標的物質の分離回収方法で
あって、末梢血、リンパ液、骨髄液、臍帯血等の回収必
要成分または除去対象成分である細胞または細胞微細組
織を含んだ液から、細胞または細胞微細組織である回収
必要成分または除去対象成分のいずれかを分離・回収す
ることを目的とする。

【０００６】本発明において細胞とは、動物、植物を問
わずすべての細胞を指すが、具体的には、胚性幹細胞、
造血幹細胞、血小板、マクロファージ、樹状細胞、単核
球、好中球、血管内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、
心筋細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、膵
ラ島細胞などの機能細胞、癌細胞、白血病細胞などの腫
瘍細胞、新型コレラ、Ｏ−１５７、レジオネラなどの細
菌、ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルスなどの微生物、ウイ
ルス性疾患原因物質等が挙げられる。細胞内微細組織と
は、細胞内または細胞内から細胞外へ放出された細胞増
殖因子等の生理活性物質を指し、具体的には、肝成長因
子（ＨＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、血小板由来成長
因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧ
Ｆ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン増殖因
子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧ
Ｆ）などやそれぞれのファミリー等が挙げられる。

【０００７】本発明の第１の態様の方法では、前記互い
に相補的等のハイブリダイズ可能な塩基配列を有する１
対のヌクレオチドのうちの１つのヌクレオチド（以下、
「第１のヌクレオチド」という。）には、目的とする細
胞又は細胞内微細組織（以下、「標的物質」という。）
を認識する物質、すなわち標的物質を特異的に結合する
物質が結合されている。このような標的物質を認識する
物質としては、抗原−抗体、酵素−基質、各種生理活性
物質とそのレセプターといった特異的相互作用に基づく
リガンドをはじめ、高次構造、静電的相互作用、疎水性
相互作用等の非特異的相互作用を考慮して設計、合成さ
れた超分子構造体等が挙げられる。前記、標的物質を認
識する物質は、特定の標的物質を認識することができれ
ば、特に限定されない。例えば、抗体を用いる場合、モ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれを用い
てもよい。また、細胞認識部位として、細胞膜にアンカ
リングすることが知られている、コレステロール基や長
鎖アルキル基などの疎水性基を有する物質を用いてもよ
い。ヌクレオチドとリガンドとの結合は、公知の化学反
応を用いた方法で達成できるが、両者の結合の間にスペ
ーサや二種類以上の化合物よりなる結合が存在していて
も良い。標的物質に対して親和性を有するリガンドを結
合できる官能基をヌクレオチドの末端または鎖内に有し
ていれば良く、結合に必要な官能基として、アミノ基、
カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水
物基、サクシニルイミド基、塩素原子、アルデヒド基、
エポキシ基、アミド基などがあげられる。例えば、ヌク
レオチド中や末端に導入したアミノ基と抗体中のカルボ
キシル基をカルボジイミド法により縮合させる方法、ビ
オチン化抗体と末端または鎖内をビオチン化したヌクレ
オチドとの結合部に（ストレプト）アビジンを用いても
良い。ここで、ヌクレオチドとリガントとは、予め結合
させてあってもよく、または別体として標的物質含有液
と混合し、混合液中で結合させてもよい。この場合、結
合の形成は、リガンドと標的物質との結合の形成の前後
いずれであってもよい。ヌクレオチドとリガンドを予め
結合させた場合、両者の結合の形成が保証され、結合し
ていないヌクレオチドおよびリガンドの発生が少なく、
両者の有効利用を図ることができる。一方、両者を別体
で標的物質含有液に混合させる場合、ヌクレオチドとリ
ガンドを結合する工程を別に設ける必要がない。

【０００８】温度依存性のハイブリダイズ、デハイブリ
ダイズに用いる１対のヌクレオチドは、互いに相補的等
のハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、後述する第１
の温度でハイブリダイズし、第２の温度でデハイブリダ
イズするものであれば、いずれであってもよい。天然の
ヌクレオチドであってもよく、また、人工のヌクレオチ
ドであってもよい。

【０００９】天然のヌクレオチドでは、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）については、アデニン−チミン、またはグ
アニン−シトシンが互いに相補的であり、二重らせん構
造中で特異的な塩基対を形成することが知られている。
同様に、リボ核酸（ＲＮＡ）では、アデニン−ウリジ
ン、シトシン−イトシン、またはシトシン−グアニンが
互いに相補的であり、二重らせん構造中で特異的な塩基
対を形成することが知られている。これら互いに相補的
な塩基対を有するヌクレオチド間では、ハイブリダイゼ
ーションを形成する。また、シトシン−グアニン−シト
シン、チミン−アデニン−チミンなどの三重らせん構造
を形成する塩基対を有するヌクレオチドを用いても良
い。

【００１０】天然ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）と同
様にハイブリダイズすることが知られている人工ヌクレ
オチドとしては、核酸合成機で人工的に合成したＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）、ｐｏｌ
ｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）・ｐｏｌｙ
（Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｇ）などの公知の
物質が例示できる。また、ペプチドヌクレオチド（ＰＮ
Ａ）、ポリビニルアデニン、ポリビニルチミン、ポリビ
ニルグアニン、ポリビニルシトシン、ポリビニルウラシ
ルなどや、活性エステル法により、ポリリジンやポリエ
チレンイミンの側鎖アミノ基に核酸塩基を導入した人工
ヌクレオチドなど、また、メタ（アルキル）骨格などの
合成ポリマーの主鎖に、直接またはスペーサ−を介して
核酸塩基を結合させたものが例示できる。特にメタ（ア
ルキル）骨格などの人工ヌクレオチドを用いれば、耐熱
性が向上するため、滅菌可能で、低コストの分離・回収
装置の作製が可能となる。

【００１１】本発明の方法において、ヌクレオチドの組
み合わせは、互いに相補的な塩基配列を有していれば特
に限定されず、天然ヌクレオチド対人工ヌクレオチド、
天然ヌクレオチド対天然ヌクレオチド、人工ヌクレオチ
ド対人工ヌクレオチドの何れの組み合わせを用いてもよ
い。ここでヌクレオチドの組み合わせは、完全に相補的
である必要はなく、ハイブリダイズおよびデハイブリダ
イズを本発明の方法において適切に行うことができるの
であれば、部分的に相補的な塩基配列を形成しないミス
マッチ配列を有していてもよい。また、ヌクレオチドが
回文構造である場合、以下に示すように、１つヌクレオ
チドが相補的な塩基配列を形成する。なお、下記の塩基
配列は回文構造の塩基配列を例示したものであり、本発
明のヌクレオチドはこれに限定されない。５’…ＴＣＣ
ＧＧＡ…３’３’…ＡＧＧＣＣＴ…５’この場合、１つ
のヌクレオチドで１対がヌクレオチドを構成でき工程上
簡便である。

【００１２】本発明において、ヌクレオチドの長さ、よ
り具体的には、相補鎖の長さは特に限定されないが、標
的物質が細胞の場合、細胞の最表面は、脂質の二分子膜
をマトリックスとして、タンパク質や多糖によって１０
〜２０ｎｍの厚さで覆われているため、細胞の表面部分
でヌクレオチドがハイブリダイズする際には、立体障害
が生じる。また、ヌクレオチドはその片末端、もしくは
両末端が固定化されると、相補鎖とで形成される二重ら
せん体の融解温度が大幅に低下し、３０塩基対未満で
は、十分なハイブリダイズができない。したがって、良
好なハイブリダイズを行うためには、相補鎖の鎖長が少
なくとも３０塩基対以上が好ましい。より好ましくは５
０塩基対以上の鎖長である。上限は特には限定されない
が、あまり長いものは取り扱いにくいので、５００塩基
対以下が好ましい。

【００１３】本発明の方法において、ヌクレオチドがハ
イブリダイズする第１の温度およびデハイブリダイズす
る第２の温度は特に限定されないが、好ましくは、第２
の温度は第１の温度よりも高い温度である。この場合、
本発明の方法による標的物質の分離回収工程中に、ヌク
レオチドの意図しないデハイブリダイズが防止され、標
的物質の適切な分離・回収を行うことができる。なお、
第１の温度は好ましくは１℃から２０℃であり、より好
ましくは４℃から１０℃である。一方、第２の温度は好
ましくは２５℃から４０℃である。より好ましくは３５
℃から３８℃である。上述したように、第２の温度は第
１の温度よりも高い温度であることが好ましく、また、
回収の際、デハイブリダイズの温度が４０℃を超える
と、標的細胞に損傷を与える恐れがあり、人間の体温付
近で解離が起こることが好ましいからである。

【００１４】ここで第１および第２の温度は、ヌクレオ
チドの相補鎖長または相補鎖を構成する塩基配列により
調節することができる。相補鎖長が増加すると、鎖に含
まれる相補関係にある塩基配列が増加するため、一般に
解離温度が上昇する。一方、相補鎖を構成する塩基配列
に関しては、相補的な塩基配列であるグアニン−シトシ
ンは三重結合、相補的な塩基配列ではないアデニン−シ
トシンは二重結合によりそれぞれ水素結合を形成するた
め、例えば同じ相補鎖長の場合、相補鎖中にグアニン−
シトシンの含量が多いほど、相補鎖の解離温度が上昇
し、アデニン−シトシンの含量が多いほど、相補鎖の解
離温度が下降する。したがって、鎖長が長く（１００塩
基対以上）、相補鎖の解離温度が高いヌクレオチドを用
いる場合、相補鎖の塩基配列でのアデニン−シトシン含
量を多くし、部分的に相補的な塩基対を形成しないミス
マッチ配列を導入しても良い。

【００１５】以上のように、ヌクレオチドは必要とされ
る解離温度に応じて、鎖長または構成する塩基配列を適
宜選択することができ、また、担体への導入効率や標的
物質のリガンドとの適合性の観点から、構成する塩基配
列を適宜選択してもよい。なお、ヌクレオチドに天然ヌ
クレオチドを用いる場合、必要とされる鎖長または塩基
配列を得るためには、エンドヌクレアーゼ、エキソヌク
レアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の制限酵素を添加
して、ヌクレオチドを切断してもよい。

【００１６】本発明の第１の態様の方法を実施する上で
の１つの形態では、ヌクレオチドのうち、リガンドと結
合しない側のヌクレオチド（以下、「第２のヌクレオチ
ド」という。）は担体に固定される。この場合、担体に
用いることができる材質は、木綿、麻、セルロース、ア
ガロース、キチン、キトサン等の天然高分子、ナイロ
ン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフ
ィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリ
アミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ
（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリス
チレン、エチレン−ポリビニルアルコール共重合体、ブ
タジエン−アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あ
るいはこれらの混合物が挙げられる。担体の形状は特に
限定されず、例えば、多孔質体、繊維、不織布、粒子、
ビーズ、フィルム、シート、チューブ、中空糸や粉末等
のいずれであっても良い。但し、多孔質体、不織布およ
び粒子の場合、最大孔径または平均孔径は０．１μｍ
（ 0．１×１０³ｎｍ）〜８００μｍ（８００×１０³
ｎｍ）であることが好ましく、より好ましくは、１μｍ
（１×１０³ｎｍ）〜５００μｍ（５００×１０ ³ｎ
ｍ）である。一方、最小口径は、目詰まりを防ぐため、
標的物質の直径以上であることが好ましい。前記の担体
への第２のヌクレオチドの固定は、公知のあらゆる方法
を用いることが可能である。例えば、水酸基、カルボキ
シル基、アミノ基、グリシジル基、イソシアネート基、
アルデヒド基、スルホン酸基、ハロアセチル基、ジスル
フィド基又はチオール基等の官能基を利用して固定化を
行う。また、担体の表面がブロムシアン、カルボニルジ
イミダゾール、トシル、トレシルなどで活性化されてい
ても構わない。これらの官能基を利用して、直接あるい
は縮合剤や架橋剤を用いて結合することが可能である。
第２のヌクレオチドを固定化した担体は、ポリオレフィ
ン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポ
リウレタン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアミド等
のプラスチック製の流入・流出口を有する筒状、円盤
状、円錐状のカラムに充填される。ただし、カラムの形
態はこれに限定されるものではない。なお、担体に固定
化される第２のヌクレオチドの量は、担体１ｍｌ当たり
１〜１０００μｇであり、好ましくは５〜２００μｇで
ある。

【００１７】本発明の第１の態様の方法を実施する上で
の別の１つの形態では、第２のヌクレオチドは固定化さ
れない。すなわち、第２のヌクレオチドは第１のヌクレ
オチドと同様に、標的物質含有液と混合される。そし
て、標的物質を第１のヌクレオチドに結合したリガント
および第２のヌクレオチドに結合したリガンドに各々結
合させた後、前記標的物質を結合させた第１のヌクレオ
チドと標的物質を結合させた第２のヌクレオチドを含む
液を第１の温度にすることにより、第１のヌクレオチド
第２のヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ヌクレオチ
ドの凝集体を形成し、これをろ過等により回収し、その
後、第２の温度にすることにより、前記ヌクレオチドの
凝集体をデハイブリダイズさせ、標的物質を回収する。
なお、本実施形態において、第２のヌクレオチドを標的
物質含有液へ混合する工程を行う時期は特に限定され
ず、第１のヌクレオチドの混合と同時に行ってもよく、
また、第１のヌクレオチドのリガンドと標的物質を結合
させた後であってもよい。

【００１８】さらに、前記実施の形態において、ヌクレ
オチドは、回文構造からなる１つのヌクレオチドであっ
てもよい。ヌクレオチドが前記であれば、全てのヌクレ
オチドに標的物質のリガンドを結合させることができ、
その結果、全てのヌクレオチドを標的物質の回収に使用
することができる。

【００１９】本発明の第１の態様の方法では、標的物質
の回収時に、系中に存在する不要な物質を最小限に抑え
るために、標的物質を結合させる工程の後に、標的物質
のリガンドと結合しなかったヌクレオチドを洗浄する工
程を含めてもよい。また、同様の理由から、ヌクレオチ
ドをハイブリダイズさせる工程に、ハイブリダイズしな
かったヌクレオチドを洗浄する工程を含めてもよい。

【００２０】本発明の第２の態様は、標的物質と標的物
質を認識するリガンドが結合したヌクレオチドを含んだ
標的物質含有液から、標的物質を分離回収する装置であ
る。本発明の第２の態様の装置は、入口と出口を有する
カラムと、前記カラムに詰められた担体に固定された第
１のヌクレオチドと、標的物質のリガンドと結合してお
り、第１のヌクレオチドとハイブリダイズ可能な塩基配
列を有する第２のヌクレオチドと、前記カラム内の温度
を調節するための温度制御手段よりなる。本発明の第２
の態様の装置において、前記カラム、ヌクレオチドを固
定化する担体および固定化の方法は特に限定されず、本
発明の第１の態様の方法において記載した通りである。
本発明の第２の態様の装置において、前記第２のヌクレ
オチドは、標的物質をヌクレオチドに結合させたリガン
ドと結合させた後、前記カラム中で第１のヌクレオチド
と温度依存性のハイブリダイズおよびデハイブリダイズ
を行い、それにより標的物質を分離回収するために、標
的物質含有液に添加する試薬として含まれることが好ま
しい。

【００２１】本発明の第２の態様の装置において、カラ
ム内の温度を調節する手段は、カラム内の温度を前記ヌ
クレオチドがハイブリダイズする温度およびデハイブリ
ダイズする温度に調節することができれば特に限定され
ない。例えば、カラムの周囲にヒータを取り付け、カラ
ム内の温度を調節する手段であってよく、また、カラム
内に所定の温度の流体を流入させ、それにより温度を調
節させる手段であってもよい。

【００２２】本発明の第２の態様の装置は、標的物質含
有液を、標的物質のリガンドと結合しており、カラムに
つめられた担体に固定化された第１のヌクレオチドとハ
イブリダイズする第２のヌクレオチドと共に流入させる
ことにより、標的物質を効率よく、かつ損傷を与えるこ
となく分離・回収することができる。また、本発明の装
置は、ハイブリダイズによってカラム内に捕捉された標
的物質が所定の温度でデハイブリダイズされるので、標
的物質の回収と同時に、担体に固定化されたヌクレオチ
ドを容易に再生することができる。

【００２３】本発明の第３の態様は、標的物質のリガン
ドが結合されている相補鎖長が３０以上の第１のヌクレ
オチドと、第１の温度でハイブリダイズし、第２の温度
でデハイブリダイズする相補鎖長が３０以上の第２のヌ
クレオチドからなる１対のヌクレオチドである。本発明
の第３の態様の１対のヌクレオチドは、第１の温度にす
ることにより、互いにハイブリダイズし、第２の温度に
することによりデハイブリダイズされる。このような温
度依存性のハイブリダイズおよびデハイブリダイズをす
るヌクレオチドについては、本発明の第１の態様の方法
で例示した。また、本発明の第３の態様の１対のヌクレ
オチドにおいて、対を成すヌクレオチドのうち、１つの
ヌクレオチドは標的物質のリガンドを結合されている。
これらの特徴により、本発明の第３の態様の１対のヌク
レオチドは、本発明の第１の態様の方法および本発明の
第２の態様の装置に好適に用いることができる。なお、
以下後述する実施例では、本発明の第３の態様の１対の
ヌクレオチドの一例を使用した。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。（実施例１〜３、比較例１、２）本発明の標的物質の分
離回収方法の有効性を確認するために、標的細胞として
ＣＤ４陽性細胞、標的細胞に対して特異的親和性を有す
る物質として抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）を用いて実
験を行った。

【００２５】ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ６ＭＢ（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社製）へのストレプトアビジンの固定化必要量のＣＮ
Ｂｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｍ
Ｂを測りとり、１ｍＭＨＣｌで１５分間膨潤させた
後、１ｍＭＨＣｌ（２００ｍｌ／ｇ）で洗浄した。膨
潤したゲル１ｍｌあたり２０ｍｌのカップリングバッフ
ァー（０．５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ
₃，ｐＨ８〜９，４℃）で簡単に洗浄した。ストレプト
アビジン（和光純薬工業社製）を加えた後、ゲルの懸濁
液をｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ型のミキサーで、所定の
温度においてゆるやかに攪拌した。インキュベートの
後、非結合ストレプトアビジンをｗａｓｈｂｕｆｆｅ
ｒ（０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸バッファ
ー）とカップリングバッファー（１０ｍｌ／ｍｌゲル）
で交互に３回洗浄した。残存活性基をマスクするため
に、０．２Ｍグリシンを含むカップリングバッファーで
洗浄した後、０．１％アジ化ナトリウム入りのＰＢＳで
平衡化した。

【００２６】ビーズへのヌクレオチドの固定化上記のストレプトアビジン固定化ビーズに、あらかじめ
ビオチン化した一本鎖ＤＮＡ（塩基配列は全てアデニン
（Ａ））の鎖長がそれぞれ、７５、５５、３５のＤＮＡ
をそれぞれ、ビーズ１ｍｌあたり５０μｇ〜１００μｇ
固定化した。また、比較例として鎖長が１０のＤＮＡを
同様に固定化した。また、ＤＮＡを固定化していないビ
ーズでの実験も行った。

【００２７】カラムの作製５．０ｍｌシリンジ（テルモ社製）に、あらかじめＥｘ
ｔｒａｎＭＡ０２（ＭＥＲＣＫ）で洗浄したフィルタ
ーを有するカラムに、アビジン（２ｍｇ／ｍｌ）固定化
ビーズを１ｍｌ充填した。

【００２８】細胞分離操作細胞をピペット等で操作するときは、細胞のピペット内
面への非特異的吸着を防ぐために、ＰＢＳ−Ａ（２％ア
ルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含む）でコート
してから細胞を吸い上げた。人新鮮血を５０ｍｌ採血
し、Ｆｉｃｏｌｌ（アマシャムファルマシバイオテク社
製）によって分離した単核細胞成分（Ｔｈ細胞、Ｂ細
胞、単核球等の混合）を、１５ｍｌ遠沈管を用いて、Ｐ
ＢＳ−Ａで２回リンス後、ＰＢＳ−Ａで１．５ｍｌメス
アップした。自動血球計算装置（東亜医用電子株式会社
製、ＳｙｓｍｅｘＮｅ−６０００）を用いて細胞数を
測定した。ビーズに固定化した一本鎖ＤＮＡ（鎖長がそ
れぞれ、７５、５５、３５）に相補的な配列を有するチ
オール末端一本鎖ＤＮＡ（塩基配列は全てチミン
（Ｔ））を抗体のアミノ基と結合させたＤＮＡ結合抗体
を、細胞１×１０⁶個当たり２０μｌ混合し、氷上、遮
光下、３０分間反応させた。ついで、ＰＢＳ−Ａで２回
洗浄し、過剰のＤＮＡ結合抗体を取り除き、ＰＢＳ−Ａ
にサスペンドし、Ｓｙｓｍｅｘを用いて細胞数を測定し
た。１カラムに用いる細胞数を３．５×１０⁴／μｌ個
に調整した。あらかじめ４℃で２０分間インキュベート
しておいたカラムに、上記の細胞懸濁液を１００μｌ
（細胞数３．５×１０⁶個）入れ、４℃で１０分間イン
キュベートした。吸着しなかった細胞を洗浄し、１５ｍ
ｌチューブにプールした（ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈ溶
液）。ついで、３７℃に保温しておいたＰＢＳ−Ａ３
ｍｌで５回洗浄（２ｍｌ／ｍｉｎ）し、プールした（Ｅ
ｌｕｔｉｏｎ溶液）。

【００２９】解析分離・回収前の細胞懸濁液、ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈ
溶液、Ｅｌｕｔｏｎ溶液をスピンダウンし、細胞を４０
０μｌのＰＢＳ−Ａにサスペンドした。自動血球計算装
置（東亜医用電子株式会社製、ＳｙｓｍｅｘＮＥ−６
０００）を用いて細胞数を測定し、細胞１×１０⁶個当
たりＰＥ標識アピジン、ビオチン化ＣＤ３／ＣＤ８抗体
２０μｌを混合し、氷上、遮光条件下で３０分間インキ
ュベートした後フローサイトメーターにより解析を行っ
た。以下の式に従い、ＣＤ４陽性細胞回収率およびＥｌ
ｕｔｉｏｎ溶液中のＣＤ陽性率を算出した。ＣＤ４陽性細胞回収率（％）＝（Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液中
のＣＤ４陽性細胞の数／分離・回収前の細胞懸濁液中の
ＣＤ４陽性細胞の数）×１００Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液中のＣＤ４陽性率（％）＝（Ｅｌｕ
ｔｉｏｎ溶液中のＣＤ４陽性細胞の数／Ｅｌｕｔｉｏｎ
溶液中の総細胞の数）×１００表１にＣＤ４陽性細胞回収率およびＥｌｕｔｉｏｎ溶液
中のＣＤ４回収率を示した。

【００３０】表１からわかるように、相補鎖長が３５以上のもので、
優れた回収率と選択性を示した。相補鎖が１０のもので
は、実施例に比べて回収率と選択性が低下した。ヌクレ
オチドを結合していないビーズでは、標的細胞の回収率
と選択性がさらに低下した。

【００３１】（実施例４、５、比較例３）既報（馬場
ら、アナリティカルケミストリー、６４号、１９２０ペ
ージ、１９９２年）に従って合成したポリ（９−ビニル
アデニン）、ポリ（１−ビニルウラシル）のそれぞれの
平均相補鎖長が１５０、８０の人工ヌクレオチドを用い
て実施例１〜３に従い細胞分離・回収実験を行った。実
施例では、ビーズにポリ（９−ビニルアデニン）、標的
細胞にポリ（１−ビニルウラシル）を結合させた。比較
例として、ビーズと標的細胞に同じポリ（９−ビニルア
デニン）を結合させて実験を行った。結果を表２に示
す。

【００３２】表２から明らかなように、相補的な塩基対を形成する系
では優れた選択性を有するが、相補的な塩基対を形成し
ない系では選択性がなかった。

【００３３】（実施例６）標的物質を凝集物として分離回収する実施例ストレプトアビジンを固定化した直径０．１μｍのポリ
スチレンビーズ（モルキュラープローブ社製）に、実施
例２で用いたビオチン化ＤＮＡ（鎖長５５）をビーズ１
ｍｌ当たり３０μｇ固定化した。このＤＮＡ固定化ビー
ズのＰＢＳ−Ａの懸濁液１００μｌと、実施例２で用い
たＤＮＡ結合抗体（鎖長５５）を結合させたＣＤ４陽性
細胞の懸濁液１００μｌ（細胞数３．５×１０⁶個）と
混合し、４℃でゆっくり攪拌し、３０分間インキュベー
トした。この後、光学顕微鏡にて観察した結果、ビーズ
と細胞の凝集体を確認した。また、上記凝集体にＤＮａ
ｓｅＩ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を溶
解した緩衝溶液（ｐＨ７．５、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、
１％ｇｌｙｃｏｌ）を添加した後、４℃で１０分間イ
ンキュベートした。この後、光学顕微鏡で観察した結
果、ＤＮＡの分解により凝集体が解離することを確認し
た。

【００３４】

【発明の効果】本発明の標的物質の分離回収方法および
装置は、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションによっ
て、標的物質の分離ができ、小さい温度変化でデハイブ
リダイゼーションさせることで回収ができ、しかも担体
基材との接触部位がほとんどないため、回収するのが容
易になる。そのため、細胞等の損傷が小さくなり、機能
が良好に維持されることとなる。本発明の標的物質の分
離回収方法および装置は、簡便且つ短時間の操作で、標
的とする細胞や細胞内微細組織を、品質、特性等を低下
せずに、分離し、また、高い回収率で回収することがで
きる。このため、多成分の混合溶液から、複雑な操作を
経ることなく、標的物質だけを、迅速に、高選択的に、
ダメージを与えずに効率的に分離回収が行うことができ
る。また、本発明の標的物質の分離回収方法および装置
は、回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞含有液か
ら、目的に応じて、必要細胞または除去対象細胞を選択
的に分離・回収することができる。さらに、本発明の標
的物質の分離回収装置は、デハイブリダイゼーションに
よる標的物質の回収と同時に、担体に固定化されたヌク
レオチドが再生されるため、装置の再生が容易に行え、
保守性に優れている。これらの特徴により、本発明の標
的物質の分離回収方法および装置は、造血幹細胞移植分
野等の細胞医療分野に利用可能であり、また、遺伝子治
療や再生医療の分野においても効果を発揮することとな
る。

フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA09 HA12 4B029 AA09 AA21 BB20 CC03 HA10 4B063 QA01 QQ01 QQ42 QR32 QR56 QR58 QR82 QS15 QS34 QS36 QX02 4B065 AA90X BA22 BA30 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的物質含有液と、相補鎖長が３０以上で
あり、標的物質のリガンドと結合した第１のヌクレオチ
ドとを混合して、前記標的物質を前記リガンドを介して
前記第１のヌクレオチドのリガンドと結合させる工程
と、第１の温度にて、前記標的物質と結合した第１のヌクレ
オチドと、前記第１ののヌクレオチドに対してハイブリ
ダイズ可能な塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であ
り、担体に固定された第２のヌクレオチドとを接触さ
せ、前記標的物質と結合させた第１のヌクレオチドと前
記第２のヌクレオチドとをハイブリダイズさせて、前記
標的物質を分離する工程と、第２の温度にして、前記ハイブリダイズさせた第１のヌ
クレオチドと第２のヌクレオチドとをデハイブリダイズ
させて、前記標的物質を回収する工程を含むことを特徴
とする標的物質の分離回収方法。
【請求項２】前記標的物質のリガンドと前記第１のヌク
レオチドとを別体として、前記標的物質含有液と混合さ
せ、前記標的物質のリガンドと前記第１のヌクレオチド
を結合させることを特徴とする請求項１に記載の標的物
質の分離回収方法。
【請求項３】前記標的物質を前記リガンドを介して前記
第１のヌクレオチドと結合させる工程の後に、前記標的
物質と結合しなかった前記第１のヌクレオチドを除去す
る工程をさらに含む請求項１または２に記載の標的物質
の分離回収方法。
【請求項４】前記標的物質を分離する工程の際に、ハイ
ブリダイズしなかった前記第１のヌクレオチドを除去す
る工程をさらに含む請求項１ないし３のいずれかに記載
の標的物質の分離回収方法。
【請求項５】標的物質含有液と、相補鎖長が３０以上で
あり、標的物質のリガンドと結合した第１のヌクレオチ
ドと、前記第１のヌクレオチドに対してハイブリダイズ
可能な塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であり、標的
物質のリガンドと結合した第２のヌクレオチドとを混合
して、前記標的物質を前記リガンドを介して前記第１の
ヌクレオチドと前記第２のヌクレオチドに各々結合させ
る工程と、第１の温度にて、前記標的物質と結合した前記第１のヌ
クレオチドと、前記標的物質と結合した前記第２のヌク
レオチドとを接触させ、ハイブリダイズさせて、ヌクレ
オチドの凝集体を得る工程と、第２の温度にして、前記ヌクレオチドの凝集体をデハイ
ブリダイズさせて、前記標的物質を回収する工程を含む
ことを特徴とする標的物質の分離回収方法。
【請求項６】前記標的物質のリガンド、前記第１のヌク
レオチドおよび前記第２のヌクレオチドを別体として、
前記標的物質含有液に混合して、前記標的物質のリガン
ドを前記第１のヌクレオチドおよび前記第２のヌクレオ
チドに各々結合させることを特徴とする請求項５に記載
の標的物質の分離回収方法。
【請求項７】前記第２の温度が、前記第１の温度より高
い温度である請求項１ないし６のいずれかに記載の標的
物質の分離回収方法。
【請求項８】前記第１の温度が１〜２０℃の範囲の温度
であり、前記第２の温度が２５〜４０℃の範囲の温度で
ある請求項１ないし７のいずれかに記載の標的物質の分
離回収方法。
【請求項９】入口と出口を有するカラムと、相補鎖長が３０以上であり、標的物質のリガンドと結合
した第１のヌクレオチドと、前記第１のヌクレオチドに対してハイブリダイズ可能な
塩基配列を含む相補鎖長が３０以上であり、前記カラム
につめられた担体に固定された第２のヌクレオチドと、前記カラム内の温度を調節する手段よりなる標的物質の
分離回収装置。
【請求項１０】相補鎖長が３０以上であり、標的物質の
リガンドと結合した第１のヌクレオチドと、第１の温度
でハイブリダイズし、第２の温度でデハイブリダイズす
る、相補鎖長が３０以上の第２のヌクレオチドからなる
１対のヌクレオチド。